DE102012014614A1

DE102012014614A1 - Determining concentration of chemotherapeutic agent in biological fluid sample of subject after beginning of administration of the agent to subject, comprises separating proteins of sample, and measuring fluorescence signal of sample

Info

Publication number: DE102012014614A1
Application number: DE201210014614
Authority: DE
Inventors: Jürgen Eckes; Gerhard Pütz; Oliver Schmah
Original assignee: Universitaetsklinikum Freiburg
Current assignee: Universitaetsklinikum Freiburg
Priority date: 2012-07-24
Filing date: 2012-07-24
Publication date: 2014-01-30
Anticipated expiration: 2032-07-25
Also published as: DE102012014614B4

Abstract

Determining concentration of a chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in a biological fluid sample of a subject at a time of 0-60 minutes after the beginning of the administration of the chemotherapeutic agent or its salt to the subject, comprises (i) separating proteins present in the fluid sample by (a) precipitating the proteins with a precipitating reagent, and centrifuging or filtering the fluid sample, (b) dialyzing or (c) carrying out ultrafiltration, and (ii) measuring a fluorescence signal originating from the fluid sample by irradiating with excitation light. Determining concentration of a chemotherapeutic agent comprising doxorubicin, epirubicin, idarubicin, daunorubicin, etoposide, 5-fluorouracil, fludarabine or chlorambucil and its optionally present metabolites in a biological fluid sample of a subject at a time of 0-60 minutes after the beginning of the administration of the chemotherapeutic agent or its salt to the subject, comprises (i) separating proteins present in the fluid sample by (a) precipitating the proteins with a precipitating reagent comprising trichloroacetic acid, methanol, ethanol, acetonitrile and/or zinc sulfate, and centrifuging or filtering the fluid sample, (b) dialyzing or (c) carrying out ultrafiltration, and (ii) measuring a fluorescence signal originating from the fluid sample by irradiating with excitation light, after protein separation. The method does not comprise chromatographic- or electrophoretic steps, or liquid-liquid extraction. Independent claims are also included for: (1) ex-vivo method for determining an optimum individual dosage of the chemotherapeutic agent or its salt, comprising (A) determining the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in at least two biological fluid samples of the subject, by the above method, where the biological fluid sample is collected at different times after beginning the administration of the chemotherapeutic agent or its salt to the subject, and (B) calculating the optimal individual dosing from the data obtained in the step (i), which is to be administered for achieving a predetermined concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in the biological fluid of the subject; and (2) an infusion apparatus for administering the chemotherapeutic agent or its salts to the subject, comprising (i) a reservoir which comprises the chemotherapeutic agent or its salt, (ii) a dosage unit which regulates the addition of the quantity of the chemotherapeutic agent or its salt per unit time, (iii) a delivery unit for administering the chemotherapeutic agent or its salt from the reservoir to the subject, (iv) a recovery unit for obtaining at least one biological fluid sample of the subject, (v) an analysis unit for determining the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in the biological fluid sample using the above method, and (vi) a control unit for controlling the dosage unit depending on specific concentration in the analysis unit.

Description

Im Jahr 2008 betrug die Zahl krebskranker Menschen in Deutschland ca. 1,33 Millionen. Weltweit wurde die Zahl der Krebsfälle im Jahr 2008 auf 12,7 Millionen geschätzt. Chemotherapie ist eine der häufigsten Methoden zur Behandlung von Krebs. Verschiedene Chemotherapeutika, wie z. B. Anthrazykline, werden seit Jahren in der Chemotherapie zur Bekämpfung von vielen verschiedenen Tumoren eingesetzt. Limitierend für die Behandlung sind jedoch häufig die Toxizitäten, die durch die eingesetzten Chemotherapeutika hervorgerufen werden. Ein Beispiel ist die akute und chronische Kardiotoxizität verursacht durch in der Chemotherapie eingesetzte Anthrazykline, deren Wirksamkeit als auch Toxizität vom maximalen Plasmaspiegel (Cmax) abhängig sind.In 2008, the number of cancer patients in Germany was approximately 1.33 million. Worldwide, the number of cancer cases in 2008 was estimated at 12.7 million. Chemotherapy is one of the most common methods of treating cancer. Various chemotherapeutic agents, such as. As anthracyclines, are used for years in chemotherapy for combating many different tumors. However, limiting the treatment is often the toxicities caused by the chemotherapeutic agents used. An example is the acute and chronic cardiotoxicity caused by anthracyclines used in chemotherapy, whose efficacy as well as toxicity are dependent on the maximum plasma level (Cmax).

Die klinische Dosierung von Chemotherapeutika erfolgt häufig nach der Körperoberfläche des Patienten (mg/m²). Die Körperoberfläche des Patienten wird nach einer Näherungsformel abgeschätzt. Diese Dosierungsberechnung berücksichtigt aber nicht den individuellen Stoffwechsel des Patienten, und die Plasmaspiegel zwischen verschiedenen Patienten variieren erheblich, z. B. um den Faktor 5 ( Hempel et al, Peak plasma concentrations of doxorubicin in children with acute lymphoblastic leukemia or non-Hodgkin lymphoma. Cancer Chemother Pharmacol. 49(2), 133–41 (2002) ), trotz Dosisanpassung beruhend auf der Körperoberfläche. Durch Überschreiten der toxischen Plasmakonzentration kann es zu schweren Nebenwirkungen kommen, bei Unterschreiten der therapeutisch notwendigen Dosierung ist der Therapieerfolg eingeschränkt.The clinical dosage of chemotherapeutic agents is often based on the body surface of the patient (mg / m ² ). The body surface of the patient is estimated by an approximate formula. However, this dosage calculation does not take into account the individual metabolism of the patient, and the plasma levels between different patients vary considerably, e.g. B. by a factor of 5 ( Hempel et al, Peak plasma concentrations of doxorubicin in children with acute lymphoblastic leukemia or non-Hodgkin lymphoma. Cancer Chemother Pharmacol. 49 (2), 133-41 (2002) ), despite dose adjustment based on the body surface. Exceeding the toxic plasma concentration can lead to serious side effects; if the dosage required for therapy is undershot, the therapeutic success is limited.

Aufgrund dieser starken Schwankungen im tatsächlichen individuellen Plasmaspiegel hat sich in den letzten Jahren der Forschungsbereich der ”personalisierten Medizin” entwickelt. Durch mehr oder minder umfassende Genanalyse wird versucht, auf die Pharmakokinetik und damit letztendlich auf den Plasmaspiegel eines Patienten zu extrapolieren. Der Plasmaspiegel kann jedoch auch intraindividuell erheblich schwanken (siehe z. B. 3 aus Hempel et al, Peak plasma concentrations of doxorubicin in children with acute lymphoblastic leukemia or non-Hodgkin lymphoma. Cancer Chemother Pharmacol. 49(2), 133–41 (2002) ), so dass die Simulation des Plasmaspiegels sehr ungenau sein kann.Due to these large fluctuations in the actual individual plasma level, the field of research of "personalized medicine" has developed in recent years. More or less comprehensive gene analysis attempts to extrapolate on the pharmacokinetics and ultimately on the plasma level of a patient. However, the plasma level can also fluctuate considerably intraindividually (see, for example, 3 out Hempel et al, Peak plasma concentrations of doxorubicin in children with acute lymphoblastic leukemia or non-Hodgkin lymphoma. Cancer Chemother Pharmacol. 49 (2), 133-41 (2002) ), so that the simulation of the plasma level can be very inaccurate.

Im Gegensatz zu indirekten genetisch basierten Ansätzen zur ”personalisierten Medizin” wäre es daher vorteilhaft, den tatsächlichen Plasmaspiegel zeitnah, am besten noch während der Verabreichung (meist als Infusion) eines Chemotherapeutikums zu messen und basierend auf den Messergebnissen eine optimale individuelle Dosierung zu bestimmen. Es könnte somit ein bestimmter Wirkstoffspiegel als Zielparameter der Chemotherapeutikumdosierung eingestellt werden. Bei Erstellung des Wirkstoffspiegels könnten schwerwiegende Toxizitäten durch eine zu hohe Dosierung und nicht wirksame Therapien durch eine zu niedrige Dosierung vermieden werden. Voraussetzung dafür ist jedoch die Verfügbarkeit eines Verfahrens, mit dem die Plasmakonzentration eines Chemotherapeutikums einfach und schnell, dass heißt z. B. mit möglichst wenig und kurzen Verfahrensschritten, bestimmt werden kann.In contrast to indirect genetically based approaches to "personalized medicine", it would therefore be advantageous to measure the actual plasma level in a timely manner, preferably during administration (usually as infusion) of a chemotherapeutic agent and to determine an optimal individual dosage based on the measurement results. It would thus be possible to set a specific active ingredient level as the target parameter of the chemotherapeutic dosage. When preparing the drug level, serious toxicities could be avoided by overdosing and ineffective therapies by overdosing. The prerequisite for this, however, is the availability of a method by which the plasma concentration of a chemotherapeutic agent simply and quickly, ie z. B. with as few and short steps, can be determined.

In der Literatur beschriebene Verfahren zur z. B. Anthrazyklinbestimmung in Proben sind langwierig, technisch aufwendig und/oder zeigen schlechte Ausbeuten oder hohe Hintergrundsignale. In einem alten Verfahren zur Bestimmung von Adriamycin werden verschiedene langwierige Verfahrensschritte beschrieben, an deren Ende die Messung eines Fluoreszenzsignals steht. Das Verfahren beinhaltet Ausfällungs-, Zentrifugations-, Komplexierungs- und flüssig-flüssig Extraktionsschritte mit Inkubationszeiten, die zum Teil 60 min dauern ( Dusonchet et al, Spectrophotofluorometric characterization of adriamycin a new antitumour drug, Pharmacological Research Communications. 3(1), 55–65 (1971) ). Bachur et al beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung von Daunomycin in Gewebeproben, bei dem die Gewebeproben mit großen Volumina Extraktionsmittel extrahiert werden (Verhältnis Extraktionsmittel/Gewebeprobe: 20/1). Ethanol, Methanol und Trichloressigsäure werden als unbefriedigende Extraktionsmittel beschrieben aufgrund schlechter Ausbeuten oder starker Hintergrundfluoreszenzen. Gemäß Bachur ist 0,3 N HCl-50% Ethanol als Extraktionsmittel zu verwenden. Die Proben sind während des gesamten Verfahrens bei 0–4°C zu halten und das Verfahren beinhaltet einen langen Zentrifugationsschritt von 20 min bei hoher Beschleunigung, bevor Daunomycin über eine Fluoreszenzmessung bestimmt wird ( Bachur et al., Tissue distribution and disposition of daunomycin (NSC-82151) in mice: fluorometric and isotopic methods. Cancer Chemother Rep. 1970 Apr; 54(2): 89–94 ).In the literature described method for z. B. Anthracycline determination in samples are tedious, technically complex and / or show poor yields or high background signals. In an old method for the determination of adriamycin various lengthy process steps are described, at the end of which the measurement of a fluorescence signal is. The method includes precipitation, centrifugation, complexing and liquid-liquid extraction steps with incubation times that sometimes last 60 minutes ( Dusonchet et al, Spectrophotofluorometric characterization of adriamycin a new antitumour drug, Pharmacological Research Communications. 3 (1), 55-65 (1971) ). Bachur et al describes a method for the determination of daunomycin in tissue samples in which the tissue samples are extracted with large volumes of extractant (extractant / tissue sample ratio: 20/1). Ethanol, methanol and trichloroacetic acid are described as unsatisfactory extractants due to poor yields or strong background fluorescence. According to Bachur, 0.3 N HCl-50% ethanol is to be used as extractant. The samples are to be kept at 0-4 ° C throughout the procedure and the procedure involves a long centrifugation step of 20 min at high acceleration before daunomycin is determined via fluorescence measurement ( Bachur et al., Tissue distribution and disposition of daunomycin (NSC-82151) in mice: fluorometric and isotopic methods. Cancer Chemother Rep. 1970 Apr; 54 (2): 89-94 ).

Derzeit erfolgt die Bestimmung von Anthrazyklinen im Plasma gewöhnlich über chromatographische oder elektrophoretische Trennverfahren. Mross et al hat z. B. das Blutplasma von Patienten untersucht, denen Doxorubicin oder Epirubicin verabreicht wurde, und beschreibt eine HPLC-basierte Methode mit Fluoreszenzdetektion nach vorausgehender chromatographischer Extraktion des Blutplasma über eine Sep-Pak C18-Säule ( Mross et al, Pharmacokinetics and Metabolism of Epidoxorubicin and Doxorubicin in Humans J Clin Oncol 6, 517–526 (1988) ). Hempel 1998 und Hempel 2002 haben Proben von Patienten, die mit Doxorubicin behandelt wurden, untersucht und benutzen ein elektrophoretisches Verfahren zur Auftrennung der Proben nach Deproteinierung mit Acetonitril oder flüssig-flüssig Extraktion mit Chloroform ( Hempel et al, Therapeutic drug monitoring of doxorubicin in paediatric oncology using capillary electrophoresis. Electrophoresis 19, 2939–2943 (1998) ; Hempel et al, Peak plasma concentrations of doxorubicin in children with acute lymphoblastic leukemia or non-Hodgkin lymphoma. Cancer Chemother. Pharmacol. 49(2), 133–41 (2002) ). Solche Verfahren sind jedoch teuer, aufwendig bezüglich der benötigten Geräte, und vor allem zeitaufwendig, und daher für eine Routineanwendung im klinischen Alltag nicht geeignet.Currently, the determination of anthracyclines in plasma is usually done by chromatographic or electrophoretic separation methods. Mross et al. B. The blood plasma of patients who were administered doxorubicin or epirubicin, and describes an HPLC-based method with fluorescence detection after prior chromatographic extraction of blood plasma on a Sep-Pak C18 column ( Mross et al, Pharmacokinetics and Metabolism of Epidoxorubicin and Doxorubicin in Humans J Clin Oncol 6, 517-526 (1988) ). Hempel 1998 and Hempel 2002 examined samples of patients treated with doxorubicin and used an electrophoretic method to separate the samples after deproteination with acetonitrile or liquid-liquid extraction with chloroform ( Hempel et al, Therapeutic drug Monitoring of doxorubicin in pediatric oncology using capillary electrophoresis. Electrophoresis 19, 2939-2943 (1998) ; Hempel et al, Peak plasma concentrations of doxorubicin in children with acute lymphoblastic leukemia or non-Hodgkin lymphoma. Cancer Chemother. Pharmacol. 49 (2), 133-41 (2002) ). However, such methods are expensive, expensive in terms of the required equipment, and especially time-consuming, and therefore not suitable for routine use in clinical practice.

Der Mangel an einem schnellen und möglichst einfachen geeigneten Verfahren zur Bestimmung der Plasmakonzentration an z. B. Doxorubicin oder verwandten Chemotherapeutika bedingt, dass derzeit eine routinemäßige Bestimmung des Plasmaspiegels solcher Substanzen nicht angeboten wird.The lack of a fast and simple as possible suitable method for determining the plasma concentration at z. As doxorubicin or related chemotherapeutic agents conditioned that currently a routine determination of the plasma level of such substances is not offered.

Eine Aufgabe der vorliegenden Anmeldung ist es, ein schnelles, einfaches, kostengünstiges, Verfahren zur Bestimmung von Chemotherapeutika in biologischen Flüssigkeiten zu finden, das Nachteile bekannter Bestimmungsverfahren überwindet. Es soll z. B. eine Plasmaspiegelmessung eines Chemotherapeutikums während (d. h. online) oder zumindest zeitnah zu einer i. v. Bolusinjektion oder Infusion von Chemotherapeutika erlauben. Das Verfahren sollte idealerweise in einfacher Umsetzung automatisierbar und miniaturisierbar sein.It is an object of the present application to provide a rapid, simple, inexpensive, method for the determination of chemotherapeutic agents in biological fluids which overcomes disadvantages of known assay methods. It should be z. For example, a plasma level measurement of a chemotherapeutic during (i.e., online) or at least timely to an i.v. v. Allow bolus injection or infusion of chemotherapeutic agents. The method should ideally be automated and miniaturized in a simple implementation.

Es wird ein Verfahren offenbart, das diese Aufgabe löst. Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in einer biologischen Flüssigkeitsprobe eines Individuums zu einem Zeitpunkt zwischen 0 und 60 Minuten nach Beginn der Verabreichung des Chemotherapeutikums oder eines seiner Salze an das Individuum, wobei das Chemotherapeutikum ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Doxorubicin, Epirubicin Idarubicin, Daunorubicin, Etoposid, 5-Fluorouracil, Fludarabin und Chlorambucil,
umfassend

(i) das Abtrennen von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen durch wenigstens einen der Schritte
a) Ausfällen der Proteine mit einem Fällungsreagenz und Zentrifugation oder Filtration der Flüssigkeitsprobe, wobei das Fällungsreagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Trichloressigsäure, Methanol, Ethanol, Acetonitril, Zinksulfat und Mischungen von zwei oder mehr dieser Substanzen,
b) Dialyse oder
c) Ultrafiltration und
(ii) das Messen eines Fluoreszenzsignals, das von der Flüssigkeitsprobe nach Proteinabtrennung bei Bestrahlung mit Anregungslicht ausgeht,

dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren keinen chromatographischen und keinen elektrophoretischen Verfahrensschritt und keine flüssig-flüssig Extraktion umfasst. Alternativ kann im beschriebenen Verfahren das Abtrennen von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen (Schritt (i)) auch durch (d) Ultrazentrifugation erfolgen anstelle der Schritte (a) bis (c) oder zusätzlich zu einem oder mehreren der Schritte (a) bis (c).A method is disclosed which solves this problem. The method of the invention is a method for determining the concentration of a chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in a subject biological fluid sample at a time between 0 and 60 minutes after the administration of the chemotherapeutic agent or one of its salts to the subject, wherein the chemotherapeutic agent is selected from the group consisting of doxorubicin, epirubicin idarubicin, daunorubicin, etoposide, 5-fluorouracil, fludarabine and chlorambucil,
full

(i) separating proteins contained in the fluid sample by at least one of the steps
a) precipitating the proteins with a precipitating reagent and centrifuging or filtering the liquid sample, wherein the precipitating reagent is selected from the group consisting of trichloroacetic acid, methanol, ethanol, acetonitrile, zinc sulfate and mixtures of two or more of these substances,
b) Dialysis or
c) ultrafiltration and
(ii) measuring a fluorescence signal emanating from the fluid sample after protein separation upon irradiation with excitation light,

characterized in that the method comprises no chromatographic and no electrophoretic process step and no liquid-liquid extraction. Alternatively, in the described method, the separation of proteins contained in the liquid sample (step (i)) may also be by (d) ultracentrifugation instead of steps (a) to (c) or in addition to one or more of steps (a) to (c ).

Bei der biologischen Flüssigkeitsprobe handelt es sich in der Regel um eine Flüssigkeitsprobe einer Person, die sich einer Chemotherapie unterzieht. Es kann sich im Einzelfall aber auch um Flüssigkeitsproben von chemotherapeutisch behandelten Tieren handeln. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert einen Wert, den der Arzt des Individuums, das mit einem Chemotherapeutikum oder dessen Salz behandelt wird, in der Entscheidung über die weitere chemotherapeutische Behandlung des Individuums verwerten kann. Das Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in einer biologischen Flüssigkeitsprobe eines Individuums bezieht sich auf eine Anwendung außerhalb des Körpers des Individuums.The biological fluid sample is usually a fluid sample of a person undergoing chemotherapy. In individual cases, however, it may also be liquid samples of chemotherapeutically treated animals. The method of the present invention provides a value that the individual's physician treated with a chemotherapeutic agent or its salt can utilize in deciding on the further chemotherapeutic treatment of the individual. The method for determining the concentration of a chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in a biological fluid sample of an individual refers to an application outside the body of the individual.

Das Chemotherapeutikum oder ein Salz des Chemotherapeutikums kann insbesondere intravenös verabreicht werden. Die Verabreichung des Chemotherapeutikums oder eines Salzes des Chemotherapeutikums erfolgt bevorzugt in einer Ausführungsform als intravenöse Bolusinjektion. In einer anderen Ausführungsform erfolgt die Verabreichung des Chemotherapeutikums oder eines Salzes des Chemotherapeutikums durch Infusion, z. B. über 1 h. Unter einer intravenösen Bolusinjektion wird erfindungsgemäß eine intravenöse Injektion verstanden, die 30 Sekunden oder weniger lange dauert. Dauert die intravenöse Verabreichung länger als 30 Sekunden, wird sie erfindungsgemäß als Infusion bezeichnet. In der vorliegenden Erfindung kann eine Infusion z. B. 30 Minuten dauern oder 1 Stunde oder 2 Stunden. In einer alternativen Ausführungsform kann das Medikament auch lokal, beispielsweise durch eine Spritze an einer bestimmten Stelle, beispielsweise am Tumor verabreicht werden.The chemotherapeutic agent or a salt of the chemotherapeutic agent can in particular be administered intravenously. The administration of the chemotherapeutic agent or of a salt of the chemotherapeutic agent preferably takes place in one embodiment as an intravenous bolus injection. In another embodiment, administration of the chemotherapeutic agent or a salt of the chemotherapeutic agent is by infusion, e.g. B. over 1 h. An intravenous bolus injection is understood according to the invention to mean an intravenous injection lasting 30 seconds or less. If the intravenous administration lasts longer than 30 seconds, it is referred to as infusion according to the invention. In the present invention, an infusion z. Take 30 minutes or 1 hour or 2 hours. In an alternative embodiment, the medicament may also be administered locally, for example by a syringe at a specific site, for example at the tumor.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in einer biologischen Flüssigkeitsprobe bestimmt, wie sie zeitnah zum Beginn der Verabreichung (also z. B. zeitnah zum Beginn der intravenösen Bolusinjektion oder Infusion) des Chemotherapeutikums oder eines Salzes des Chemotherapeutikums vorliegt, d. h. bis zu maximal 60 Minuten nach Beginn der Verabreichung. Der Beginn der Verabreichung kann bestimmt werden durch den ersten Kontakt des Chemotherapeutikums oder dessen Salz mit dem Individuum, dem dieses verabreicht wird, innerhalb eines Behandlungszyklus. Wird dem Individuum z. B. ein Chemotherapeutikum oder dessen Salz über 1 Stunde als Infusion verabreicht, so kann als Beginn der Verabreichung der Zeitpunkt definiert werden, an dem das Individuum den ersten Kontakt mit der Infusionsflüssigkeit hat. Wird ein Individuum mehreren Behandlungszyklen mit einem Chemotherapeutikum oder dessen Salz unterzogen (z. B. eine Infusion des Chemotherapeutikums über 1 Stunde alle 7 Tage über 4 Wochen), so bezieht sich der Begriff des Beginns der Verabreichung auf den jeweiligen Behandlungszyklus mit dem Chemotherapeutikum oder dessen Salz und nicht auf die erste Verabreichung des Chemotherapeutikums oder dessen Salz an das Individuum überhaupt.The method according to the invention determines the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in a biological fluid sample which is present in a timely manner at the beginning of the administration (that is, for example, near the beginning of the intravenous bolus injection or infusion) of the chemotherapeutic agent or of a salt of the chemotherapeutic agent ie up to a maximum of 60 minutes after the start of administration. The beginning of the administration can be determined by the first contact of the chemotherapeutic agent or its salt with the Individual being administered this within a course of treatment. Is the individual z. For example, if a chemotherapeutic agent or its salt is infused over 1 hour, then the time at which the individual has the first contact with the infusion fluid may be defined as the start of administration. When an individual undergoes several cycles of treatment with a chemotherapeutic agent or its salt (eg, infusion of the chemotherapeutic agent for 1 hour every 7 days over 4 weeks), the term of commencement of administration refers to the particular treatment cycle with the chemotherapeutic agent or its Salt and not on the first administration of the chemotherapeutic agent or its salt to the individual at all.

Soll z. B. die Konzentration in einer biologischen Flüssigkeit 10 Minuten nach Beginn einer intravenösen Bolusinjektion bestimmt werden, so kann zu diesem Zeitpunkt (10 Minuten nach Beginn der Verabreichung) dem Individuum eine biologische Flüssigkeitsprobe entnommen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt sodann eine Konzentrationsbestimmung innerhalb kurzer Zeit, so dass schnell ermittelt werden kann, wie die Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite zum Zeitpunkt 10 Minuten nach Beginn der Verabreichung war. In einer Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in einer biologischen Flüssigkeit eines Individuums zu einem Zeitpunkt zwischen 0 und 40 Minuten, oder zwischen 0 und 30 Minuten nach Beginn der Verabreichung des Chemotherapeutikums oder dessen Salz an das Individuum. In einer Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in einer biologischen Flüssigkeit eines Individuums zu einem Zeitpunkt zwischen 0 und 15 Minuten, bevorzugt zwischen 0 und 10 Minuten oder zwischen 0 und 5 Minuten nach Beginn der Verabreichung des Chemotherapeutikums oder dessen Salz an das Individuum.Should z. For example, when the concentration in a biological fluid is determined 10 minutes after the start of an intravenous bolus injection, a biological fluid sample may be taken from the subject at that time (10 minutes after the start of administration). The method according to the invention then permits a concentration determination within a short time, so that it can be quickly determined how the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites was at the time 10 minutes after the beginning of the administration. In one embodiment, the method of the invention relates to a method for determining the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in a biological fluid of an individual at a time between 0 and 40 minutes, or between 0 and 30 minutes after initiation of the administration of the chemotherapeutic agent or its salt to the individual. In one embodiment, the method according to the invention relates to a method for determining the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in a biological fluid of an individual at a time between 0 and 15 minutes, preferably between 0 and 10 minutes or between 0 and 5 minutes after the beginning of the Administration of the chemotherapeutic agent or its salt to the individual.

In einer Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration an Doxorubicin und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in einer biologischen Flüssigkeitsprobe eines Individuums zu einem Zeitpunkt zwischen 0 und 12 Minuten, vorzugsweise zwischen 0 und 6 Minuten nach Beginn der Verabreichung des Chemotherapeutikums oder eines seiner Salze.In one embodiment, the method of the present invention relates to a method for determining the concentration of doxorubicin and its optionally present metabolites in an individual's biological fluid sample at a time between 0 and 12 minutes, preferably between 0 and 6 minutes after initiation of the chemotherapeutic agent or one of its salts.

In einer Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration an Epirubicin und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in einer biologischen Flüssigkeitsprobe eines Individuums zu einem Zeitpunkt zwischen 0 und 12 Minuten, vorzugsweise zwischen 0 und 6 Minuten nach Beginn der Verabreichung des Chemotherapeutikums oder eines seiner Salze.In one embodiment, the method of the invention relates to a method for determining the concentration of epirubicin and its optionally present metabolites in a biological fluid sample of an individual at a time between 0 and 12 minutes, preferably between 0 and 6 minutes after the initiation of the administration of the chemotherapeutic agent or one of its salts.

In einer Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration an Idarubicin und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in einer biologischen Flüssigkeitsprobe eines Individuums zu einem Zeitpunkt zwischen 0 und 12 Minuten, vorzugsweise zwischen 0 und 6 Minuten nach Beginn der Verabreichung des Chemotherapeutikums oder eines seiner Salze.In one embodiment, the method of the invention relates to a method for determining the concentration of idarubicin and its optionally present metabolites in an individual's biological fluid sample at a time between 0 and 12 minutes, preferably between 0 and 6 minutes after initiation of the chemotherapeutic agent or one of its salts.

In einer Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration an Daunorubicin und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in einer biologischen Flüssigkeitsprobe eines Individuums zu einem Zeitpunkt zwischen 0 und 12 Minuten, vorzugsweise zwischen 0 und 6 Minuten nach Beginn der Verabreichung des Chemotherapeutikums oder eines seiner Salze.In one embodiment, the method of the invention relates to a method for determining the concentration of daunorubicin and its optionally present metabolites in a biological fluid sample of an individual at a time between 0 and 12 minutes, preferably between 0 and 6 minutes after the initiation of the administration of the chemotherapeutic agent or one of its salts.

In einer Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration an Etoposid und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in einer biologischen Flüssigkeitsprobe eines Individuums zu einem Zeitpunkt zwischen 0 und 60 Minuten, vorzugsweise zwischen 0 und 45 Minuten nach Beginn der Verabreichung des Chemotherapeutikums oder eines seiner Salze.In one embodiment, the method of the invention relates to a method for determining the concentration of etoposide and its optionally present metabolites in a biological fluid sample of an individual at a time between 0 and 60 minutes, preferably between 0 and 45 minutes after the initiation of the administration of the chemotherapeutic agent or one of its salts.

In einer Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration an 5-Fluorouracil und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in einer biologischen Flüssigkeitsprobe eines Individuums zu einem Zeitpunkt zwischen 0 und 16 Minuten, vorzugsweise zwischen 0 und 8 Minuten nach Beginn der Verabreichung des Chemotherapeutikums oder eines seiner Salze.In one embodiment, the method according to the invention relates to a method for determining the concentration of 5-fluorouracil and its optionally present metabolites in a biological fluid sample of an individual at a time between 0 and 16 minutes, preferably between 0 and 8 minutes after the start of administration of the chemotherapeutic agent or one of his salts.

In einer Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration an Fludarabin und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in einer biologischen Flüssigkeitsprobe eines Individuums zu einem Zeitpunkt zwischen 0 und 5 Minuten, vorzugsweise zwischen 0 und 2,5 Minuten nach Beginn der Verabreichung des Chemotherapeutikums oder eines seiner Salze.In one embodiment, the method of the invention relates to a method for determining the concentration of fludarabine and its optionally present metabolites in a biological fluid sample of an individual at a time between 0 and 5 minutes, preferably between 0 and 2.5 minutes after the beginning of the administration of the chemotherapeutic agent or one of its salts.

In einer Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration an Chlorambucil und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in einer biologischen Flüssigkeitsprobe eines Individuums zu einem Zeitpunkt zwischen 0 und 60 Minuten, vorzugsweise zwischen 0 und 45 Minuten nach Beginn der Verabreichung des Chemotherapeutikums oder eines seiner Salze.In one embodiment, the method of the invention relates to a method for determining the concentration of chlorambucil and its optionally present metabolites in a biological fluid sample of an individual at a time between 0 and 60 minutes, preferably between 0 and 45 minutes after the initiation of the administration of the chemotherapeutic agent or one of its salts.

Metabolite sind Produkte, die durch Umwandlung von Arzneistoffen (Chemotherapeutikum) durch Enzymsysteme mit der Zeit im Körper des Individuums entstehen. Beispielhaft zu nennen sind durch Oxidation oder Reduktion oder molekülspaltende Prozesse wie Hydrolyse aus dem Arzneistoff entstehende Produkte, oder durch Umwandlung in Derivate entstehende Stoffe, indem der Arzneistoff an körpereigene Stoffe gebunden wird (Glucuronsäure-Konjugation, Glucosid-Konjugation, Hippursäuresynthese, Glutamin-Konjugation, Methylierung, Acetylierung). Hauptmetabolite des Doxorubicin im menschlichen Körper sind z. B. Doxorubicinol, sowie die 7-deoxy-Doxorubicin- und 7-deoxy-Doxorubicinolaglycone.Metabolites are products that arise through the conversion of drugs (chemotherapeutic agent) by enzyme systems over time in the body of the individual. By way of example, products resulting from oxidation or reduction or molecule-splitting processes, such as hydrolysis from the drug, or substances that are converted into derivatives by binding the drug to the body's own substances (glucuronic acid conjugation, glucoside conjugation, hippuric acid synthesis, glutamine conjugation, Methylation, acetylation). The main metabolites of doxorubicin in the human body are z. As doxorubicinol, and the 7-deoxy-doxorubicin and 7-deoxy-Doxorubicinolaglycone.

Unter den Messbedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens können bei Bestrahlung mit Anregungslicht neben dem Chemotherapeutikum (das abhängig von den Messbedingungen z. B. auch in protonierter oder deprotonierter Form vorliegen kann) in der biologischen Flüssigkeit gegebenenfalls anwesende Metabolite zum gemessenen Fluoreszenzsignal beitragen, wenn nicht nur das Chemotherapeutikum bei Bestrahlung mit Anregungslicht ein Fluoreszenzsignal ausstrahlt sondern auch anwesende Metabolite des Chemotherapeutikums. Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Konzentrationsbestimmung des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite sind unter dem Begriff Metabolite somit nur solche Metabolite zu verstehen, die unter den Messbedingungen auch zum Fluoreszenzsignal beitragen. Gerade bei Miterfassung aktiver Metabolite ist dies aber kein Nachteil des Verfahrens. Außerdem sind bei einer deutlich geringeren Metabolisierungsrate als der primären Abbaurate des Chemotherapeutikums die Metabolite z. B. zur Bestimmung der maximalen Plasmakonzentration und der primären Abbaurate des Chemotherapeutikums von untergeordneter Bedeutung.Under the measuring conditions of the method according to the invention, optionally irradiated excitation light next to the chemotherapeutic (which may be present in protonated or deprotonated form depending on the measurement conditions) present in the biological fluid metabolites to the measured fluorescence signal, if not only the chemotherapeutic when irradiated with excitation light emits a fluorescent signal but also present metabolites of the chemotherapeutic. In the method according to the invention for determining the concentration of the chemotherapeutic agent and its metabolites which may be present, the term metabolites is therefore to be understood as meaning only those metabolites which also contribute to the fluorescence signal under the measuring conditions. However, this is not a disadvantage of the process, especially with co-detection of active metabolites. In addition, at a much lower rate of metabolism than the primary degradation rate of the chemotherapeutic metabolites z. As for the determination of the maximum plasma concentration and the primary degradation rate of the chemotherapeutic of minor importance.

Im Folgenden wird zum Teil verkürzt nur von der Konzentrationsbestimmung des Chemotherapeutikums in einer biologischen Flüssigkeitsprobe eines Individuums gesprochen anstelle des längeren Ausdrucks der Konzentrationsbestimmung des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite.In the following, in part shortened, only the determination of the concentration of the chemotherapeutic agent in a biological fluid sample of an individual is discussed instead of the longer term determination of the concentration of the chemotherapeutic agent and its metabolites which may be present.

Vorzugsweise handelt es sich bei der biologischen Flüssigkeitsprobe um eine Flüssigkeitsprobe eines Individuums, das mit einer Monochemotherapie behandelt wird, d. h. dass in der Flüssigkeitsprobe nur ein Chemotherapeutikum und gegebenenfalls Metabolite des Chemotherapeutikums vorhanden sind. Vorzugsweise handelt es sich um eine Monotherapie mit Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin oder Daunorubicin, oder ein Salz derer, insbesondere Doxorubicin oder ein Salz des Doxorubicins.Preferably, the biological fluid sample is a fluid sample of an individual treated with monochemotherapy, i. H. that only one chemotherapeutic agent and, if appropriate, metabolites of the chemotherapeutic agent are present in the fluid sample. Preferably, it is a monotherapy with doxorubicin, epirubicin, idarubicin or daunorubicin, or a salt thereof, in particular doxorubicin or a salt of doxorubicin.

Wird in einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Konzentration an Etoposid und dessen gegebenenfalls anwesender Metabolite bzw. von Fludarabin und dessen gegebenenfalls anwesender Metabolite in einer biologischen Flüssigkeitsproben eines Individuums zu einem Zeitpunkt zwischen 0 und 60 Minuten nach Beginn der Verabreichung von Etoposid bzw. Fludarabin oder eines der Salze an das Individuum bestimmt, so kann das Etoposid bzw. Fludarabin selbstverständlich z. B. auch in Form des Etoposidphosphats bzw. in Form des Fludarabinphosphats verabreicht werden.In one embodiment of the method according to the invention, the concentration of etoposide and its optionally present metabolites or of fludarabine and its optionally present metabolites in a biological fluid samples of an individual at a time between 0 and 60 minutes after the start of administration of etoposide or fludarabine or a determined the salts to the individual, the etoposide or fludarabine can of course, for. B. in the form of Etoposidphosphats or in the form of Fludarabinphosphats be administered.

Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft bevorzugt ein Verfahren, wobei das Chemotherapeutikum Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin oder Daunorubicin ist. Bevorzugt ist das Chemotherapeutikum Doxorubicin. In letzterem Fall betrifft das erfindungsgemäße Verfahren somit ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Doxorubicin und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in einer biologischen Flüssigkeitsprobe eines Individuums zu einem Zeitpunkt zwischen 0 und 60 Minuten nach Beginn der Verabreichung von Doxorubicin oder von einem Salz des Doxorubicins, z. B. von Doxorubicinhydrochlorid, an das Individuum.The method according to the invention preferably relates to a method wherein the chemotherapeutic agent is doxorubicin, epirubicin, idarubicin or daunorubicin. The chemotherapeutic agent doxorubicin is preferred. In the latter case, the method according to the invention thus relates to a method for determining the concentration of doxorubicin and its optionally present metabolites in a biological fluid sample of an individual at a time between 0 and 60 minutes after the start of administration of doxorubicin or a doxorubicin salt, e.g. From doxorubicin hydrochloride, to the individual.

In einer Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren, wobei das Chemotherapeutikum oder eines seiner Salze dem Individuum als liposomale Zubereitung verabreicht wird. Bevorzugt ist das Chemotherapeutikum in diesem Fall Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin oder Daunorubicin, insbesondere Doxorubicin. Liposomale Zubereitungen von Chemotherapeutika bzw. deren Salzen sind z. B. bekannt unter den Handelsnamen Caelyx, Doxil oder Myocet.In one embodiment, the method of the invention relates to a method wherein the chemotherapeutic agent or one of its salts is administered to the individual as a liposomal preparation. In this case, the chemotherapeutic agent is preferably doxorubicin, epirubicin, idarubicin or daunorubicin, in particular doxorubicin. Liposomal preparations of chemotherapeutic agents or their salts are z. B. known under the trade names Caelyx, Doxil or Myocet.

Die biologische Flüssigkeitsprobe kann z. B. eine Blutprobe, Serumprobe oder Plasmaprobe sein, vorzugsweise eine Plasmaprobe. Die biologische Flüssigkeitsprobe kann Antikoagulanzien enthalten. Bei der Blut- oder Plasmaprobe kann es sich z. B. um eine mit EDTA antikoagulierte Probe handeln. Wird einem Individuum z. B. 5 Minuten nach Beginn der Verabreichung eines Chemotherapeutikums oder dessen Salz Blut entnommen, kann daraus eine Plasmaprobe gewonnen werden, und die Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in der Plasmaprobe zum Zeitpunkt 5 Minuten nach Beginn der Verabreichung des Chemotherapeutikums kann bestimmt werden.The biological fluid sample may, for. B. a blood sample, serum sample or plasma sample, preferably a plasma sample. The biological fluid sample may contain anticoagulants. In the blood or plasma sample, it may be z. B. may be an EDTA anticoagulated sample. Is an individual z. For example, if blood is withdrawn 5 minutes after the initiation of administration of a chemotherapeutic agent or its salt, a plasma sample can be obtained therefrom and the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in the plasma sample at 5 minutes after initiation of the administration of the chemotherapeutic agent can be determined.

Erfindungsgemäß ist ein Verfahren bevorzugt, wobei das Abtrennen von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen durch Ausfällen der Proteine mit einem Fällungsreagenz und Zentrifugation oder Filtration der Flüssigkeitsprobe erfolgt, wobei das Fällungsreagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Trichloressigsäure, Methanol, Ethanol, Acetonitril, Zinksulfat und Mischungen von zwei oder mehr dieser Substanzen. Besonders bevorzugt erfolgt das Abtrennen von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen im erfindungsgemäßen Verfahren durch Ausfällen der Proteine mit einem Fällungsreagenz wie zuvor beschrieben und Zentrifugation der Flüssigkeitsprobe. Zinksulfat wird als Fällungsreagenz vorzugweise in verdünnter Natronlauge eingesetzt, z. B. 10% w/v Zinksulfat in 0,25 M NaOH. Trichloressigsäure wird als Fällungsreagenz vorzugsweise als wässrige Trichloressigsäurelösung eingesetzt und ist besonders bevorzugt. Es kann z. B. 3 M wässrige Trichloressigsäure eingesetzt werden. In einer Ausführungsform ist das Fällungsreagenz Methanol, Ethanol, Acetonitril oder Trichloressigsäure (z. B. als 3 M wässrige Trichloressigsäure). Sofern Mischungen als Fällungsreagenz benutzt werden, sind Mischungen aus 2 Substanzen bevorzugt, z. B. Zinksulfat (z. B. als 10% w/v Zinksulfat in 0,25 M NaOH)/Methanol. According to the invention, a method is preferred, wherein the separation of proteins contained in the liquid sample is carried out by precipitation of the proteins with a precipitating reagent and centrifugation or filtration of the liquid sample, wherein the precipitating reagent is selected from the group consisting of trichloroacetic acid, methanol, ethanol, acetonitrile, zinc sulfate and Mixtures of two or more of these substances. The separation of proteins contained in the liquid sample is particularly preferably carried out in the process according to the invention by precipitation of the proteins with a precipitation reagent as described above and centrifuging of the liquid sample. Zinc sulfate is used as a precipitant preferably in dilute sodium hydroxide solution, for. B. 10% w / v zinc sulfate in 0.25 M NaOH. Trichloroacetic acid is preferably used as the precipitating reagent as the aqueous trichloroacetic acid solution and is particularly preferred. It can, for. B. 3 M aqueous trichloroacetic acid can be used. In one embodiment, the precipitating reagent is methanol, ethanol, acetonitrile or trichloroacetic acid (eg as 3M aqueous trichloroacetic acid). If mixtures are used as precipitating agent, mixtures of 2 substances are preferred, for. Zinc sulfate (e.g., as 10% w / v zinc sulfate in 0.25M NaOH) / methanol.

Durch das Fällungsreagenz wird eine Präzipitation der Proteine bewirkt. Die im Zusammenhang mit dem Ausfällen von Proteinen beschriebene Zentrifugation oder Filtration dient sodann dazu, die präzipitierten (ausgefällten) Proteine abzutrennen. Dialyse-, Zentrifugations- und Filtrationsverfahren haben gemeinsam, dass sie sich die große Größe bzw. das hohe Gewicht der (ausgefällten) Proteine für deren Abtrennung zu Nutze machen. Durch die Abtrennung der Proteine wird der Hintergrund für die Fluoreszenzmessung minimiert. Das Abtrennen von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen ist ein mit einfachen Mitteln und routinemäßig leicht durchführbarer Verfahrensschritt, der sich z. B. von komplizierteren Bestimmungsverfahren für Chemotherapeutika in biologischen Flüssigkeitsproben unterscheidet, die auf einer (spezifischen) Isolation der Chemotherapeutika aus dem Rest einer Probe basieren (beispielhaft sei eine Isolation von Anthrazyklinen durch Bindung an eine DNA-”Sonde” erwähnt).The precipitation reagent causes precipitation of the proteins. The centrifugation or filtration described in connection with the precipitation of proteins then serves to separate the precipitated (precipitated) proteins. Dialysis, centrifugation and filtration techniques have in common that they take advantage of the large size or weight of the (precipitated) proteins for their separation. By separating the proteins, the background for the fluorescence measurement is minimized. The separation of proteins contained in the liquid sample is a simple and routinely easy to carry out process step, the z. B. distinguishes more complicated determination methods for chemotherapeutic agents in biological fluid samples, which are based on a (specific) isolation of the chemotherapeutic agents from the remainder of a sample (for example, an isolation of anthracyclines by binding to a DNA "probe" mentioned).

Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft z. B. ein Verfahren, wobei das Abtrennen von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen durch Ausfällen der Proteine mit einem Fällungsreagenz und Zentrifugation der Flüssigkeitsprobe erfolgt, wobei das Fällungsreagenz Trichloressigsäure ist.The inventive method relates z. Example, a method wherein the separation of proteins contained in the liquid sample is carried out by precipitation of the proteins with a precipitating reagent and centrifugation of the liquid sample, wherein the precipitating reagent is trichloroacetic acid.

Die Zentrifugation nach Ausfällen der Proteine mit einem Fällungsreagenz im erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Chemotherapeutikums wird vorzugsweise bei 12000 g oder weniger ausgeführt, z. B. 8000–12000 g. Es wurde festgestellt, dass eine Zentrifugation bei 12000 g ausreicht bzw. eine ausgezeichnete Probenvorbereitung für eine anschließende Fluroreszenzmessung aus dem Überstand mit wenig Hintergrundfluoreszenz und hoher Robustheit ermöglicht. Dies ermöglicht auch die Verwendung einer einfachen Tischzentrifuge im erfindungsgemäßen Verfahren, die häufig nicht für eine Zentrifugation bei viel höherer Beschleunigung geeignet ist.The centrifugation after precipitation of the proteins with a precipitating reagent in the method according to the invention for determining the concentration of a chemotherapeutic agent is preferably carried out at 12000 g or less, for. B. 8000-12000 g. It has been found that centrifugation at 12000 g is sufficient or allows excellent sample preparation for subsequent fluorescence measurement from the supernatant with low background fluorescence and high robustness. This also allows the use of a simple benchtop centrifuge in the process according to the invention, which is often not suitable for centrifugation at much higher acceleration.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei das Abtrennen von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen durch Ausfällen der Proteine mit einem Fällungsreagenz und Zentrifugation der Flüssigkeitsprobe erfolgt, wobei das Fällungsreagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Trichloressigsäure, Methanol, Ethanol, Acetonitril, Zinksulfat und Mischungen von zwei oder mehr dieser Substanzen, wird für 2 Minuten oder weniger lange zentrifugiert. In dieser Ausführungsform ist das Fällungsreagenz vorzugsweise Trichloressigsäure. Im erfindungsgemäßen Verfahren, wobei das Abtrennen von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen durch Ausfällen der Proteine mit einem zuvor bezeichneten Fällungsreagenzien erfolgt, vorzugsweise Trichloressigsäure, kann z. B. für 2 min bei 12000 g zentrifugiert werden. Dies gilt insbesondere bei einem Probenvolumen von 1,5 ml oder weniger.In one embodiment of the method according to the invention, wherein the separation of proteins contained in the liquid sample by precipitation of the proteins with a precipitating reagent and centrifugation of the liquid sample, wherein the precipitating reagent is selected from the group consisting of trichloroacetic acid, methanol, ethanol, acetonitrile, zinc sulfate and mixtures of two or more of these substances is centrifuged for 2 minutes or less. In this embodiment, the precipitating reagent is preferably trichloroacetic acid. In the method according to the invention, wherein the separation of proteins contained in the liquid sample by precipitation of the proteins with a previously designated precipitating reagents, preferably trichloroacetic acid, z. B. centrifuged for 2 min at 12000 g. This is especially true for a sample volume of 1.5 ml or less.

Eine kurze Zentrifugationszeit ermöglicht eine sehr schnelle Konzentrationsbestimmung des Chemotherapeutikums in der biologischen Flüssigkeitsprobe, z. B. in einer Blutprobe oder Plasmaprobe und ist besonders vorteilhaft, um z. B. den Blutspiegel oder den Plasmaspiegel eines Chemotherapeutikums bei einem Individuum während (z. B. einer Infusion) oder zeitnah zu der Verabreichung eines Chemotherapeutikums oder dessen Salz bestimmen zu können. Aufgrund der Messergebnisse kann z. B. eine Dosisanpassung bei der Infusion vorgenommen werden oder nach einer Bolusinjektion des Chemotherapeutikums oder seines Salzes kann z. B. nachdosiert werden, falls zu niedrige Blutspiegel oder Plasmaspiegel gemessen werden.A short centrifugation time allows a very rapid determination of the concentration of the chemotherapeutic agent in the biological fluid sample, eg. B. in a blood sample or plasma sample and is particularly advantageous to z. B. to determine the blood level or the plasma level of a chemotherapeutic agent in an individual during (eg, an infusion) or promptly to the administration of a chemotherapeutic agent or its salt. Due to the results can be z. B. a dose adjustment in the infusion be made or after a bolus injection of the chemotherapeutic agent or its salt may, for. B. be metered, if too low blood levels or plasma levels are measured.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Konzentrationsbestimmung eines Chemotherapeutikums bei Raumtemperatur, d. h. 15–25°C durchgeführt. Eine Kühlung, z. B. auf 0–4°C, der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeitsproben während der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist nicht notwendig und wird deshalb bevorzugt auch nicht ausgeführt. Dies ermöglicht es wiederum das Verfahren einfach und unkompliziert zu halten und dennoch eine zuverlässige Bestimmung der Chemotherapeutikumskonzentration in einer biologischen Flüssigkeitsprobe zu erreichen.Preferably, the inventive method for determining the concentration of a chemotherapeutic agent at room temperature, d. H. 15-25 ° C performed. A cooling, z. B. to 0-4 ° C, the biological fluid samples to be examined during the implementation of the method according to the invention is not necessary and is therefore preferably not carried out. This, in turn, makes it possible to keep the procedure simple and straightforward while still achieving a reliable determination of the chemotherapeutic concentration in a biological fluid sample.

In einer Ausführungsform kann mit der Abtrennung von in der biologischen Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen auch gleichzeitig ein Abtrennen von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Zellen erfolgen. Es wurde überraschend gefunden, dass auf einen der Proteinabtrennung vorgeschalteten separaten Schritt der Zellabtrennung aus einer biologischen Flüssigkeitsprobe, z. B. Zellabtrennung aus einer Blutprobe zum Erhalt einer Plasmaprobe, verzichtet werden kann, um die Chemotherapeutikumskonzentration bestimmen zu können. Erfindungsgemäß wird unter einer Blutprobe bevorzugt eine Vollblutprobe verstanden. In one embodiment, the separation of proteins contained in the biological fluid sample can also be carried out at the same time a separation of cells contained in the fluid sample. It has surprisingly been found that a separate step of cell separation from a biological fluid sample upstream of the protein separation, for. B. cell separation from a blood sample to obtain a plasma sample, can be omitted to determine the chemotherapeutic agent concentration. According to the invention, a blood sample is preferably understood as a whole blood sample.

In einer Ausführungsform kann die biologische Flüssigkeitsprobe, z. B. Blutprobe, direkt mit dem Fällungsreagenz, bevorzugt Trichloressigsäure, versetzt werden. (vgl. 8). Es ist auch möglich, die biologische Flüssigkeitsprobe, z. B. Blutprobe, vor dem gleichzeitigen Abtrennen von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen und Zellen, mit einem Puffer, z. B. 10 mM Natriumhydrogenphosphat/140 mM Natriumchlorid zu verdünnen. Durch das gleichzeitige Abtrennen von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen und Zellen kann das Verfahren noch schneller und einfacher durchgeführt werden. Um aus der bestimmten Chemotherapeutikumkonzentration in der Blutprobe besser auf die Chemotherapeutikumkonzentration im Plasma des Individuums umrechnen zu können, kann vor Beginn der Verabreichung des Chemotherapeutikums der Hämatokrit des Individuums bestimmt werden, und mit Hilfe dessen die Berechnung der Plasmakonzentration des Individuums erfolgen. In einer Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren, wobei die biologische Flüssigkeitsprobe eine Blutprobe ist.In one embodiment, the biological fluid sample, e.g. B. blood sample, directly with the precipitating reagent, preferably trichloroacetic acid, are added. (see. 8th ). It is also possible to use the biological fluid sample, e.g. B. blood sample, before the simultaneous separation of proteins and cells contained in the liquid sample, with a buffer, for. B. 10 mM sodium hydrogen phosphate / 140 mM sodium chloride to dilute. By simultaneously separating proteins and cells contained in the fluid sample, the process can be performed even faster and easier. In order to be able to better convert from the determined chemotherapeutic concentration in the blood sample to the chemotherapeutic concentration in the individual's plasma, the hematocrit of the individual can be determined before the administration of the chemotherapeutic agent and with the help of which the calculation of the plasma concentration of the individual can be carried out. In one embodiment, the method of the invention relates to a method wherein the biological fluid sample is a blood sample.

1 und 2 zeigen beispielhaft die Eignung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Konzentrationsbestimmung für 5-Fluorouracil, Chlorambucil, Fludarabin, Etoposid, Doxorubicin bzw. Epirubicin. 1 and 2 show by way of example the suitability of the method according to the invention for determining the concentration of 5-fluorouracil, chlorambucil, fludarabine, etoposide, doxorubicin or epirubicin.

Es wurde gefunden, dass die Hintergrundfluoreszenz der Flüssigkeitsprobe nach der Abtrennung von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen im erfindungsgemäßen Verfahren gering ist, so dass eine schnelle und einfache fluorometrische Konzentrationsbestimmung von Chemotherapeutika in der Flüssigkeitsprobe erfolgen kann. 3 zeigt beispielhaft die niedrige Hintergrundfluoreszenz von Flüssigkeitsproben nach Abtrennung von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen. Dies ist überraschend und dem Stand der Technik nicht zu entnehmen, da dort apparativ, zeitlich und/oder in der Durchführung aufwendigere Trennverfahren beschrieben werden, bevor eine fluorometrische Konzentrationsbestimmung der Chemotherapeutika erfolgt.It has been found that the background fluorescence of the liquid sample after the separation of proteins contained in the liquid sample in the method according to the invention is low, so that a fast and simple fluorometric determination of the concentration of chemotherapeutic agents in the liquid sample can be made. 3 shows by way of example the low background fluorescence of liquid samples after separation of proteins contained in the liquid sample. This is surprising and can not be deduced from the state of the art, since more complex separation processes are described there in terms of apparatus, time and / or performance before a fluorometric concentration determination of the chemotherapeutic agents takes place.

Die Tatsache, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch über eine gute Robustheit verfügt, ergibt sich ferner aus 4. Es wurde gefunden, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Konzentrationsbestimmung von Chemotherapeutika selbst bei Verwendung von Plasmaproben von verschiedenen Probanden zu einer guten Übereinstimmung der Ergebnisse führt.The fact that the method according to the invention also has good robustness is also apparent 4 , It has been found that the method according to the invention for determining the concentration of chemotherapeutic agents, even when using plasma samples from different subjects, leads to a good agreement of the results.

Aus 5 ist auch die niedrige Varianz des erfindungsgemäßen Verfahrens an verschiedenen Messtagen ersichtlich und damit die Zuverlässigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens.Out 5 is also the low variance of the method according to the invention at different measuring days visible and thus the reliability of the method according to the invention.

Es ist aber auch möglich, falls gewünscht, das individuelle Hintergrundsignal in der biologischen Flüssigkeitsprobe, z. B. Plasmaprobe, eines einzelnen Patienten zu berücksichtigen. Dazu kann von dem Patienten, in dessen biologischer Flüssigkeitsprobe die Konzentration eines Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite erfindungsgemäß bestimmt werden soll, z. B. unmittelbar vor Verabreichung des Chemotherapeutikums oder dessen Salz eine Flüssigkeitsprobe (z. B. Plasmaprobe) gewonnen werden (sogenannte Nullprobe) und deren Fluoreszenz bestimmt werden, nachdem die Nullprobe den gleichen Verfahrensschritten unterzogen wurde, wie die Flüssigkeitsprobe (im Beispiel: Plasmaprobe), die nach Verabreichung des Chemotherapeutikums entnommen wird und in der die Konzentration des Chemotherapeutikums bestimmt werden soll. Die Differenz des Messsignals zwischen der Nullprobe und der Flüssigkeitsprobe nach Verabreichung des Chemotherapeutikums oder dessen Salz kann dann auf das Chemotherapeutikums und dessen gegebenenfalls anwesende Metabolite zurückgeführt werden.But it is also possible, if desired, the individual background signal in the biological fluid sample, for. As a plasma sample, to consider a single patient. For this purpose, the patient in whose biological fluid sample the concentration of a chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites should be determined according to the invention, for. B. immediately prior to administration of the chemotherapeutic agent or its salt a liquid sample (eg plasma sample) are obtained (so-called blank) and their fluorescence can be determined after the blank sample was subjected to the same process steps as the liquid sample (in the example: plasma sample), which is taken after administration of the chemotherapeutic agent and in which the concentration of the chemotherapeutic agent to be determined. The difference in the measurement signal between the blank sample and the liquid sample after administration of the chemotherapeutic agent or its salt can then be attributed to the chemotherapeutic agent and its metabolites, if present.

Vorzugsweise sind in der pharmazeutischen Formulierung, mit der das Chemotherapeutikum oder dessen Salz verabreicht wird, keine Substanzen enthalten, die in der biologischen Flüssigkeitsprobe des Individuums bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Messbedingungen neben dem Chemotherapeutikum oder gegebenenfalls dessen anwesenden Metabolite auch zum Fluoreszenzsignal beitragen. Sollten zum Messsignal beitragende Substanzen vorhanden sein, so sollten solche Substanzen nur in einer solchen Menge vorhanden sein, dass sie im erfindungsgemäßen Verfahren unter den gewählten Messbedingungen nur zu weniger als als 1% des gemessenen Fluoreszenzsignals der Flüssigkeitsprobe beitragen nach Abzug eines eventuellen Fluoreszenzsignals einer Nullprobe.Preferably, in the pharmaceutical formulation with which the chemotherapeutic agent or its salt is administered, no substances contained in the biological fluid sample of the individual when performing the method according to the invention under measurement conditions in addition to the chemotherapeutic agent or optionally its present metabolites also contribute to the fluorescence signal. If substances contributing to the measurement signal are present, then such substances should be present only in such an amount that they only contribute to less than 1% of the measured fluorescence signal of the liquid sample under the selected measurement conditions after deduction of a possible fluorescence signal of a blank sample.

6a zeigt beispielhaft einen Vergleich des Hintergrundsignals von Flüssigkeitsproben, die nach Abtrennen von mit einem erfindungsgemäß genannten Fällungsreagenz ausgefällten Proteinen aus biologischen Flüssigkeitsproben erhalten wurden. Ein Vergleich gegenüber dem nicht erfindungsgemäßen 0,3 M HCl/Ethanol 1:1 (v/v) zeigt die überraschend geringe Hintergrundfluoreszenz von Flüssigkeitsproben, die mit den in der vorliegenden Erfindung benutzten Fällungsreagenzien behandelt wurden. Eine niedrigere Hintergrundfluoreszenz ermöglicht es z. B. geringe Chemotherapeutikumskonzentrationen gut in biologischen Flüssigkeitsproben bestimmen zu können. Die Fällung mit Trichloressigsäure als Fällungsreagenz mit einer anschließenden optionalen Verdünnung der Flüssigkeitsprobe mit Wasser ist besonders vorteilhaft bezüglich einer niedrigen Hintergrundfluoreszenz bzw. eines vorteilhaft hohen Verhältnisses aus von der Chemotherapeutikum-haltigen Flüssigkeitsprobe ausgehenden Fluoreszenzintensität und Hintergrundfluoreszenz. 6a shows by way of example a comparison of the background signal of liquid samples obtained after separation of proteins precipitated with a precipitation reagent according to the invention from biological fluid samples. One Comparison to the non-inventive 0.3 M HCl / ethanol 1: 1 (v / v) shows the surprisingly low background fluorescence of liquid samples treated with the precipitating reagents used in the present invention. A lower background fluorescence makes it possible, for. B. to be able to determine low chemotherapeutic concentrations well in biological fluid samples. The precipitation with trichloroacetic acid as precipitating reagent with a subsequent optional dilution of the liquid sample with water is particularly advantageous with regard to a low background fluorescence or an advantageously high ratio of fluorescence intensity and background fluorescence emanating from the chemotherapeutic fluid sample.

Vorteilhaft für die Bestimmung von geringen Chemotherapeutikumskonzentrationen in biologischen Flüssigkeitsproben ist das erfindungsgemäße Verfahren auch insofern als dass das Fällungsreagenz, gegebenenfalls nach Verdünnung mit Wasser oder als Lösung in Wasser oder verdünnter Natronlauge, in einem Volumenverhältnis von nur 1:4 oder sogar in einem geringeren Volumenverhältnis zum Volumen der biologischen Flüssigkeitsprobe verwendet werden kann. Es kann z. B. in einem Volumenverhältnis von 1:5 oder in einem noch geringeren Volumenverhältnis zum Volumen der biologischen Flüssigkeitsprobe verwendet werden. Es kann z. B. auch in einem Volumenverhältnis von 1:10 zum Volumen der biologischen Flüssigkeitsprobe oder in einem noch geringeren Volumenverhältnis verwendet werden.Advantageously for the determination of low chemotherapeutic concentrations in biological fluid samples, the inventive method is also insofar as the precipitating reagent, optionally after dilution with water or as a solution in water or dilute sodium hydroxide, in a volume ratio of only 1: 4 or even in a lower volume ratio to Volume of the biological fluid sample can be used. It can, for. B. in a volume ratio of 1: 5 or in an even lower volume ratio to the volume of the biological fluid sample can be used. It can, for. B. also be used in a volume ratio of 1:10 to the volume of the biological fluid sample or in an even lower volume ratio.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Konzentrationsbestimmung von Chemotherapeutika, z. B. von Anthrazyklinen wie Doxorubicin, und deren gegebenenfalls anwesenden Metaboliten in einer Plasmaprobe ist das Fällungsreagenz wässrige 3 M Trichloressigsäure. Diese wird vorzugsweise im Volumenverhältnis 1:4 bis 1:5 zur Plasmaprobe eingesetzt, welche z. B. nach Verabreichung eines Anthrazyklinderivats wie z. B. Doxorubicin oder dessen Salz an das Individuum gewonnen wird. In einer anderen Ausführungsform wird sie im Volumenverhältnis 1:4 oder weniger, z. B: 1:10 oder weniger zur Plasmaprobe eingesetzt. Die Flüssigkeitsprobe kann optional nach der Abtrennung der gefällten Proteine durch Zentrifugation oder Filtration mit Wasser verdünnt werden, bevor die Messung des Fluoreszenzsignals erfolgt.In a preferred embodiment of the method according to the invention for determining the concentration of chemotherapeutic agents, for. B. of anthracycline such as doxorubicin, and their optionally present metabolite in a plasma sample, the precipitating reagent is aqueous 3 M trichloroacetic acid. This is preferably used in a volume ratio of 1: 4 to 1: 5 for the plasma sample, which z. B. after administration of an anthracycline derivative such. As doxorubicin or its salt is recovered to the individual. In another embodiment, it is in the volume ratio 1: 4 or less, z. B: 1:10 or less used for the plasma sample. The liquid sample may optionally be diluted after separation of the precipitated proteins by centrifugation or filtration with water before the measurement of the fluorescence signal.

In einer Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Konzentrationsbestimmung von Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin und Daunorubicin in einer biologischen Flüssigkeitsprobe gerichtet, wobei das Abtrennen von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen durch Ausfällen und Zentrifugation bei 12000 g oder weniger für 2 Minuten oder weniger erfolgt, wobei das Fällungsreagenz Trichloressigsäure ist und wobei die biologische Flüssigkeitsprobe während der Durchführung des Verfahrens nicht gekühlt wird, z. B. auf 0–4°C, und wobei Trichloressigsäure als wässrige Lösung in einem Volumenverhältnis von 1:4 oder weniger zum Volumen der biologischen Flüssigkeitsprobe verwendet wird. In dieser Ausführungsform wird die Flüssigkeitsprobe zur Messung des Fluoreszenzsignals vorzugsweise mit Anregungslicht bestrahlt, das eine Wellenlänge im Bereich von 470–475 nm hat und das Messen des Fluoreszenzsignals kann z. B. bei einer Wellenlänge von 555 nm erfolgen.In one embodiment, the present invention is directed to a method for determining the concentration of doxorubicin, epirubicin, idarubicin and daunorubicin in a biological fluid sample, wherein the separation of proteins contained in the fluid sample by precipitation and centrifugation is at 12000 g or less for 2 minutes or less wherein the precipitating reagent is trichloroacetic acid and wherein the biological fluid sample is not cooled during the performance of the method, e.g. To 0-4 ° C, and wherein trichloroacetic acid is used as the aqueous solution in a volume ratio of 1: 4 or less to the volume of the biological fluid sample. In this embodiment, the liquid sample for measuring the fluorescence signal is preferably irradiated with excitation light having a wavelength in the range of 470-475 nm and the measurement of the fluorescence signal may be e.g. B. at a wavelength of 555 nm.

7 zeigt ferner, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch dann zur Konzentrationsbestimmung verwendet werden kann, wenn die Plasmaprobe ein liposomal verkapseltes Anthrazyklin bzw. dessen Salz enthält, wie hier am Beispiel dargestellt, in dem einer Plasmaprobe liposomal verkapseltes Doxorubicin HCl zugegeben wurde, bevor nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Konzentrationsbestimmung durchgeführt wurde. 7 shows that the method according to the invention can also be used for concentration determination if the plasma sample contains a liposomally encapsulated anthracycline or its salt, as shown here by the example in which liposome-encapsulated doxorubicin HCl was added to a plasma sample, before using the method according to the invention the concentration determination was carried out.

Zum erfindungsgemäßen Verfahren zur Konzentrationsbestimmung von Chemotherapeutika gehören auch ein Verfahren, bei dem keine weiteren Schritte zur Abtrennung oder Auftrennung der Flüssigkeitsprobe in einzelne Bestandteile oder Gruppen von Bestandteilen vorgenommen werden nach der Abtrennung von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen sowie ein Verfahren, wobei keine weiteren Schritte zur Abtrennung oder Auftrennung der Flüssigkeitsprobe in einzelne Bestandteile oder Gruppen von Bestandteilen vorgenommen werden mit Ausnahme des Schrittes zum Abtrennen von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen. Dies spiegelt die besondere Einfachheit des Verfahrens wieder, das auf wenigen Verfahrensschritten beruht. Vorzugsweise werden mit Ausnahme des Fällungsreagenz und gegebenenfalls einer Verdünnung der Flüssigkeitsprobe mit einem Fällungsreagenz oder Wasser im erfindungsgemäßen Verfahren auch keine weiteren Reagenzien zur Flüssigkeitsprobe hinzugegeben. Gegebenenfalls ist es auch bevorzugt, dass zur Flüssigkeitsprobe mit Ausnahme des Fällungsreagenz und einer Verdünnung der Flüssigkeitsprobe mit einem Puffer und/oder Wasser im erfindungsgemäßen Verfahren keine weiteren Reagenzien zur Flüssigkeitsprobe hinzugeben werden. Es ist auch möglich, dass zur Flüssigkeitsprobe mit Ausnahme des Fällungsreagenz desweiteren nur noch Wasser oder ein Mittel zur pH-Einstellung zugegeben wird und diese Zugabe nach dem Abtrennen von in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Proteinen erfolgt. Es kann z. B. NaOH oder Wasser hinzugegeben werden, darüberhinaus werden jedoch keine weiteren Reagenzien zugegeben.The method according to the invention for determining the concentration of chemotherapeutic agents also includes a method in which no further steps are carried out for separating or separating the liquid sample into individual constituents or groups of constituents after the separation of proteins contained in the liquid sample and a method, wherein no further steps for Separation or separation of the liquid sample into individual constituents or groups of constituents is carried out, with the exception of the step of separating proteins contained in the liquid sample. This reflects the particular simplicity of the process, which is based on a few process steps. Preferably, with the exception of the precipitation reagent and optionally a dilution of the liquid sample with a precipitating reagent or water in the process according to the invention, no further reagents are added to the liquid sample. Optionally, it is also preferred that no further reagents are added to the fluid sample with the exception of the precipitating reagent and dilution of the fluid sample with a buffer and / or water in the method of the invention. It is also possible that, in addition to the precipitating reagent, only water or a pH-adjusting agent is added to the liquid sample and this addition takes place after the separation of proteins contained in the liquid sample. It can, for. As NaOH or water are added, moreover, however, no further reagents are added.

8 zeigt die Eignung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Konzentrationsbestimmung am Beispiel von Doxorubicin, wobei die biologische Flüssigkeitsprobe eine Blutprobe ist. Die Blutprobe wurde nach Entnahme vom Individuum lediglich mit einem Puffer verdünnt, bevor ein Fällungsreagenz zugegeben wurde und Zellen und Proteine abgetrennt wurden. Die Messung der Fluoreszenz erfolgte aus dem Überstand nach Verdünnung. Dies demonstriert wiederum die besondere Einfachheit des erfindungsgemäßen Verfahrens. 8th shows the suitability of the method according to the invention for determining the concentration on the example of doxorubicin, wherein the biological fluid sample is a blood sample. The blood sample, after removal from the subject, was only diluted with a buffer before a precipitating reagent was added and cells and proteins were separated. The fluorescence was measured from the supernatant after dilution. This in turn demonstrates the particular simplicity of the process of the invention.

Aufgrund der Einfachheit des Verfahrens ist dieses auch auf einer miniaturisierten Messeinheit durchführbar. Eine solche Messeinheit benötigt nur geringe Mengen einer biologischen Flüssigkeitsprobe des Patienten, was zu einer Entlastung des Patienten führt. Eine solche Messeinheit kann z. B. über eine Lanzette mit einer Probenaufnahmekapillare verfügen, so dass von der Fingerkuppe eine kleine Blutmenge gewonnen werden kann. Aus dem Blut kann über bekannte Methoden eine Plasmaprobe gewonnen werden (siehe z. B. US2009107909 ) und die Plasmaprobe kann dann auf der miniaturisierten Messeinheit mit einer dort bereits deponierten kleinen Menge Trichloressigsäure, z. B. 3 M wässrige Trichloressigsäure, gemischt werden. Über Zentrifugation der miniaturisierten Messeinheit können die ausgefällten Proteine z. B. abgetrennt werden und ein vom Überstand ausgehendes Fluoreszenzsignal kann bei Bestrahlung mit Anregungslicht mit einer Detektionseinheit direkt gemessen werden. Die Messeinheit kann auch so aufgebaut sein, dass direkt mit einer Blutprobe als biologischer Flüssigkeitsprobe auf der miniaturisierten Messeinheit gearbeitet wird, indem mit einer Lanzette mit einer Probenaufnahmekapillare eine kleine Blutprobe vom Individuum gewonnen wird, die dann mit einer kleinen Menge bereits deponierter Trichloressigsäure, z. B. 3 M wässrige Trichloressigsäure, auf der Messeinheit vermischt wird. Durch Zentrifugation der Messeinheit können dann ausgefällte Proteine und Zellen aus der Flüssigkeitsprobe abgetrennt werden und die Fluoreszenzmessung kann wie zuvor beschrieben erfolgen. Das Verhältnis der Volumina der vordeponierten Trichloressigsäure zur biologischen Flüssigkeitsprobe kann z. B. 1:4 oder 1:5 sein, wodurch das Gesamtvolumen der Probe klein gehalten werden kann, was besonders vorteilhaft für ein miniaturisiertes Verfahrens ist.Due to the simplicity of the process, this can also be carried out on a miniaturized measuring unit. Such a measuring unit requires only small amounts of a biological fluid sample of the patient, which leads to a relief of the patient. Such a measuring unit can, for. B. have a lancet with a sample receiving capillary, so that a small amount of blood can be obtained from the fingertip. From the blood, a plasma sample can be obtained by known methods (see, for example, US Pat. US2009107909 ) and the plasma sample can then on the miniaturized measuring unit with a small amount of trichloroacetic acid already deposited there, z. B. 3 M aqueous trichloroacetic acid, are mixed. About centrifugation of the miniaturized measuring unit, the precipitated proteins z. B. be separated and emanating from the supernatant fluorescent signal can be measured directly when irradiated with excitation light with a detection unit. The measuring unit may also be constructed to work directly with a blood sample as a biological fluid sample on the miniaturized measuring unit by obtaining a small blood sample from the individual with a lancet containing a sample receiving capillary, which is then filled with a small amount of already deposited trichloroacetic acid, e.g. B. 3 M aqueous trichloroacetic acid is mixed on the measuring unit. By centrifuging the measuring unit, precipitated proteins and cells can then be separated from the liquid sample and the fluorescence measurement can be carried out as described above. The ratio of the volumes of the predeposited trichloroacetic acid to the biological fluid sample can, for. B. 1: 4 or 1: 5, whereby the total volume of the sample can be kept small, which is particularly advantageous for a miniaturized process.

In einer Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren, wobei das Chemotherapeutikum Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin oder Daunorubicin ist, und wobei die Flüssigkeitsprobe mit Anregungslicht bestrahlt wird, das eine Wellenlänge im Bereich von 430–510 nm hat, und wobei das Messen des Fluoreszenzsignals bei einer Wellenlänge im Bereich von 530–600 nm erfolgt. Die Flüssigkeitsprobe kann z. B. mit Anregungslicht bestrahlt werden, das eine Wellenlänge im Bereich von 470–475 nm hat und das Messen des Fluoreszenzsignals kann z. B. bei einer Wellenlänge von 555 nm erfolgen. Bevorzugt wird zur Messung ein Fluoreszenzspektrophotometer verwendet, wobei sowohl für das Anregungslicht als auch für die Messung des Fluoreszenzsignals Schlitzweiten von 10 nm oder weniger, z. B. von 1–10 nm eingesetzt werden.In one embodiment, the method of the invention relates to a method wherein the chemotherapeutic agent is doxorubicin, epirubicin, idarubicin, or daunorubicin, and wherein the liquid sample is irradiated with excitation light having a wavelength in the range of 430-510 nm, and wherein measuring fluorescence signal at a wavelength in the range of 530-600 nm. The liquid sample may, for. B. irradiated with excitation light having a wavelength in the range of 470-475 nm and the measurement of the fluorescence signal can, for. B. at a wavelength of 555 nm. Preferably, a fluorescence spectrophotometer is used for the measurement, wherein both for the excitation light and for the measurement of the fluorescence signal slot widths of 10 nm or less, z. B. of 1-10 nm can be used.

Ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren, wobei das Chemotherapeutikum 5-Fluorouracil, Chlorambucil, Fludarabin oder Etoposid ist, ist Anregungslicht der Wellenlänge im Bereich von 245–270 nm bevorzugt und das Messen des Fluoreszenzsignal erfolgt vorzugsweise bei einer Wellenlänge im Bereich von 330–360 nm. Es kann zur Messung ein Fluoreszenzspektrophotometer verwendet werden, wobei sowohl für das Anregungslicht als auch für die Messung des Fluoreszenzsignals Schlitzweiten von 10 nm oder weniger, z. B. von 1–10 nm eingesetzt werden.If the method according to the invention is a method wherein the chemotherapeutic agent is 5-fluorouracil, chlorambucil, fludarabine or etoposide, excitation light of the wavelength in the range of 245-270 nm is preferred and the fluorescence signal is preferably measured at a wavelength in the range of 330-360 nm A fluorescence spectrophotometer can be used for measurement, with slot widths of 10 nm or less, for example for the excitation light as well as for the measurement of the fluorescence signal, e.g. B. of 1-10 nm can be used.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Fluoreszenzspektrophotometer verwendet, wobei sowohl für das Anregungslicht als auch für die Messung des Fluoreszenzsignals Schlitzweiten von 2,5 nm eingesetzt werden.In one embodiment of the method according to the invention, a fluorescence spectrophotometer is used, wherein slot widths of 2.5 nm are used both for the excitation light and for the measurement of the fluorescence signal.

Es ist auch möglich das Fluoreszenzsignal der zu vermessenden Flüssigkeitsprobe zu verstärken, z. B. durch eine Einstellung auf einen bestimmten pH nach Proteinabtrennung. Dies ist im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wenn das Chemotherapeutikum Etoposid, 5-Fluorouracil oder Chlorambucil ist, und kann durch Zugabe von NaOH zu der Flüssigkeitsprobe nach der Proteinfällung mit Trichloressigsäure und Abtrennung der Proteine erfolgen, wohingegen die Konzentrationsbestimmung von Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin oder Daunorubicin sowie Fludarabin vorzugsweise in der trichloressigsauren Flüssigkeitsprobe stattfindet. Durch die Messung im Sauren wird die Fluoreszenzintensität des Doxorubicins und der anderen Anthrazyklinderivate sowie von Fludarabin erhöht bzw. erst ermöglicht. Eine Verstärkung des Fluoreszenzsignals kann auch durch die Wahl eines bestimmten Fällungsreagenzes erreicht werden. Da das erfindungsgemäße Verfahren einfach gehalten werden soll, werden jedoch vorzugsweise keine Reagenzien zur Flüssigkeitsprobe gegeben die z. B. durch Komplexbildung oder chemische Reaktion mit dem Chemotherapeutikum zu einer Verstärkung des Fluoreszenzsignals führen können.It is also possible to amplify the fluorescence signal of the liquid sample to be measured, e.g. By adjusting to a certain pH after protein separation. This is preferred in the method of the invention when the chemotherapeutic agent is etoposide, 5-fluorouracil or chlorambucil and may be by addition of NaOH to the fluid sample after protein precipitation with trichloroacetic acid and separation of the proteins, whereas concentration determination of doxorubicin, epirubicin, idarubicin or daunorubicin and fludarabine preferably takes place in the trichloroacetic liquid sample. By measuring in acid, the fluorescence intensity of doxorubicin and the other anthracycline derivatives and of fludarabine is increased or only made possible. An enhancement of the fluorescence signal can also be achieved by the choice of a specific precipitating reagent. Since the process according to the invention should be kept simple, however, preferably no reagents are added to the liquid sample, e.g. B. by complexation or chemical reaction with the chemotherapeutic agent can lead to an amplification of the fluorescence signal.

In einer Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren, dass die Intensität des Fluoreszenzsignals, das von der Flüssigkeitsprobe eines Individuums im erfindungsgemäßen Verfahren ausgeht, mit der Intensität von Fluoreszenzsignalen einer standardisierten Konzentrationskurve des Chemotherapeutikums verglichen wird. Es wird also eine standardisierte Konzentrationskurve des Chemotherapeutikums erstellt, dessen Konzentration in der Flüssigkeitsprobe des Individuums bestimmt werden soll. Soll z. B. die Doxorubicinkonzentration in einer Plasmaprobe eines Patienten bestimmt werden, dem Doxorubicin (z. B. als Doxorubicinhydrochlorid) verabreicht wurde, kann eine standardisierte Doxorubicinkonzentrationskurve mit Plasma des Individuums, welches dem Patienten z. B. unmittelbar vor der Doxorubicinverabreichung entnommen wurde, oder mit Plasma von Plasmadonatoren, die keiner Arzneitherapie unterliegen, hergestellt werden. Diesem zuvor entnommenen Plasma oder dem entnommenen Plasma von Donatoren können zur Herstellung sogenannter verschiedener ”Standards” verschiedene bekannte Mengen Doxorubicin (z. B. als Doxorubicinhydrochlorid) zugesetzt werden, und die Standards werden dann dem gleichen Verfahren unterzogen wie die eigentliche Flüssigkeitsprobe des Individuums, in der die Doxorubicinkonzentration bestimmt werden soll. Es kann auch ein Standard hergestellt werden, dem kein Doxorubicin zugesetzt wird entsprechend einer Nullprobe zur Bestimmung des Hintergrundsignals. Die Intensität des Fluoreszenzsignals der Flüssigkeitsprobe wird dann mit den Fluoreszenzsignalen der Standards bzw. der daraus gebildeten standardisierten Konzentrationskurve verglichen und die Konzentration der Flüssigkeitsprobe wird als Gehalt an Chemotherapeutikum (im Beispiel hier: Doxorubicin) angegeben. Die Angabe als Gehalt an Chemotherapeutikum (im Beispiel hier: Doxorubicin) erfolgt auch dann, wenn das von der Flüssigkeitsprobe ausgehende Fluoreszenzsignal nicht vollumfänglich vom Chemotherapeutikum (im Beispiel hier: Doxorubicin) verursacht werden sollte, sondern z. B. von gegebenenfalls in der Flüssigkeitsprobe anwesenden Metaboliten (im Beispiel hier: Doxorubicinmetaboliten) mitverursacht wird.In one embodiment, the determination method according to the invention comprises that the intensity of the fluorescence signal emanating from the fluid sample of an individual in the method according to the invention, with the intensity of fluorescence signals of a standardized Concentration curve of the chemotherapeutic agent is compared. Thus, a standardized concentration curve of the chemotherapeutic agent is created, the concentration of which is to be determined in the fluid sample of the individual. Should z. For example, if the doxorubicin concentration is determined in a plasma sample from a patient to which doxorubicin has been administered (eg, as doxorubicin hydrochloride), a standardized plasma doxorubicin concentration curve can be obtained from the subject, e.g. B. was taken just before doxorubicin administration, or with plasma from plasma donors, which are not subject to drug therapy produced. To this previously collected plasma or plasma from donors may be added various known amounts of doxorubicin (eg, as doxorubicin hydrochloride) to produce so-called "different" standards, and the standards are then subjected to the same procedure as the actual liquid sample of the individual the doxorubicin concentration should be determined. It is also possible to prepare a standard to which no doxorubicin is added according to a blank sample to determine the background signal. The intensity of the fluorescence signal of the liquid sample is then compared with the fluorescence signals of the standards or the standardized concentration curve formed therefrom, and the concentration of the liquid sample is stated as content of chemotherapeutic agent (in this example: doxorubicin). The indication as content of chemotherapeutic agent (in the example here: doxorubicin) also takes place when the fluorescence signal emanating from the fluid sample is not completely caused by the chemotherapeutic agent (in the example here: doxorubicin), but z. B. of optionally present in the liquid sample metabolites (in the example here: doxorubicin metabolites) is caused.

Das vorgestellte Verfahren erlaubt eine schnelle und einfache Messung der Konzentration eines Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in einer biologischen Flüssigkeitsprobe, z. B. in einer Plasmaprobe. Von den Messergebnissen ausgehend kann dann umgehend reagiert werden und auf eine Zielkonzentration des Chemotherapeutikums im Plasma eingestellt werden. Die vorliegende Anmeldung betrifft daher auch ein ex-vivo Verfahren zur Bestimmung einer optimalen individuellen Dosierung eines Chemotherapeutikums oder eines seiner Salze, wobei das Chemotherapeutikum ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Daunorubicin, Etoposid, 5-Fluorouracil, Fludarabin und Chlorambucil,
umfassend

(i) die Bestimmung der Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite nach einem Verfahren wie weiter oben beschriebenen in zwei oder mehr biologischen Flüssigkeitsproben eines Individuums, wobei die biologischen Flüssigkeitsproben zu verschiedenen Zeitpunkten nach Beginn der Verabreichung des Chemotherapeutikums oder eines seiner Salze an das Individuum bei diesem entnommen werden, und
(ii) die Berechnung der optimalen individuellen Dosierung aus den Daten des Schrittes (i), die zum Erreichen einer vorbestimmten Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in der biologischen Flüssigkeit des Individuums zu verabreichen ist.

The presented method allows a quick and easy measurement of the concentration of a chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in a biological fluid sample, eg. B. in a plasma sample. Starting from the measurement results, it is then possible to react promptly and to adjust to a target concentration of the chemotherapeutic agent in the plasma. The present application therefore also relates to an ex-vivo method for determining an optimal individual dosage of a chemotherapeutic agent or one of its salts, wherein the chemotherapeutic agent is selected from the group consisting of doxorubicin, epirubicin, idarubicin, daunorubicin, etoposide, 5-fluorouracil, fludarabine and chlorambucil,
full

(i) determining the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites by a method as described above in two or more biological fluid samples of an individual, the biological fluid samples at different time points after administration of the chemotherapeutic agent or one of its salts to the individual to be taken from this, and
(ii) the calculation of the optimal individual dosage from the data of step (i) to be administered to reach a predetermined concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in the biological fluid of the individual.

Vorzugsweise handelt es sich bei der biologischen Flüssigkeitsprobe um eine Plasmaprobe. Durch das Verabreichen einer Teildosis oder Testdosis als z. B. intravenöse Bolusinjektion und die vorzugsweise zeitnahe Bestimmung z. B. der Plasmakonzentration können die individuellen pharmakokinetischen Parameter des Patienten in die Berechnung einer in einem Behandlungszyklus zu verabreichenden gesamten Dosis eines Chemotherapeutikums miteinbezogen werden. Die zunächst verabreichte Teildosis oder Testdosis sollte unterhalb der erwarteten optimalen individuellen Dosierung des Chemotherapeutikums liegen, die auch als optimale individuelle gesamte Dosis oder ”volle” Dosierung für den Behandlungszyklus bezeichnet werden kann. Anhand der erhaltenen Messwerte kann dann die volle Dosierung berechnet werden, die in dem Behandlungszyklus verabreicht werden muss, damit beim Patienten z. B. eine vorbestimmte Plasmakonzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite erreicht wird. Wenn der Patient dann die volle Dosierung erhalten hat, kann die Plasmakonzentration zur Kontrolle mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Konzentrationsbestimmung noch einmal nachgemessen werden.Preferably, the biological fluid sample is a plasma sample. By administering a partial dose or test dose as z. B. intravenous bolus injection and preferably timely determination z. For example, the plasma concentration, the individual pharmacokinetic parameters of the patient may be included in the calculation of a total dose of a chemotherapeutic agent to be administered in a treatment cycle. The initially administered partial dose or test dose should be below the expected optimal individual dose of the chemotherapeutic agent, which may also be referred to as the optimal individual total dose or "full" dosage for the treatment cycle. On the basis of the measured values obtained, it is then possible to calculate the full dose that must be administered in the treatment cycle in order to allow the patient, for example, to receive a full dose. B. a predetermined plasma concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites is achieved. If the patient has then received the full dose, the plasma concentration can be re-measured for control with the method for determining the concentration according to the invention again.

Bei einer Infusion des Chemotherapeutikums oder seines Salzes kann z. B. aus dem Anstieg der Plasmakonzentration, beispielsweise durch Messung der Plasmakonzentration in 2 oder 3 oder 4 oder mehr, oder auch 5 oder 6 oder mehr Flüssigkeitsproben des Individuum, die jeweils im Abstand von einigen Minuten, z. B. 5–10 Minuten, nach Beginn der Infusion genommen werden, und der bekannten Infusionsrate des Chemotherapeutikums bzw. dessen Salz (infundierte Stoffmenge je Zeiteinheit) die Peakplasmakonzentration zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Beginn der Infusion berechnet werden bzw. der Zeitpunkt, wann eine gewünschte Plasmakonzentration erreicht ist. Die Flüssigkeitsproben können z. B. auch in einem Abstand von 2–5 Minuten genommen werden. Bis zum berechneten Zeitpunkt kann dann z. B. weiter infundiert werden, um eine effektive aber wenig toxische Chemotherapie zu erreichen. Zum berechneten Zeitpunkt hat das Individuum dann seine optimale individuelle Dosierung erhalten und die Infusion kann abgebrochen werden, und der Plasmaspiegel gegebenenfalls zur Kontrolle mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Konzentrationsbestimmung noch einmal gemessen werden. Zur Berechnung der individuellen Elimination aus dem Plasma kann z. B. auf die klassischen Modelle und Formeln zur Berechnung der Pharmakokinetik der entsprechenden Substanz zurückgegriffen werden. Nach Bestimmung der individuellen pharmakokinetischen Parameter kann mit diesen Parametern auf der einen Seite und der Infusionsrate auf der anderen Seite auf die zu erreichende Plasmakonzentration extrapoliert werden.In an infusion of the chemotherapeutic agent or its salt may, for. B. from the increase in plasma concentration, for example by measuring the plasma concentration in 2 or 3 or 4 or more, or even 5 or 6 or more fluid samples of the individual, each at intervals of a few minutes, z. B. 5-10 minutes, are taken after the start of the infusion, and the known infusion rate of the chemotherapeutic or its salt (infused amount per unit time), the peak plasma concentration at a certain time after the start of the infusion are calculated or the time when a desired Plasma concentration is reached. The liquid samples may, for. B. also be taken at a distance of 2-5 minutes. Then by the calculated time z. B. be further infused to achieve an effective but less toxic chemotherapy. At the calculated time, the individual has then received his optimal individual dosage and the infusion can be discontinued, and the plasma level, if necessary, be measured once more for control with the method of determining concentration according to the invention. To calculate the individual elimination from the plasma z. For example, the classical models and formulas for calculating the pharmacokinetics of the corresponding substance can be used. After determination of the individual pharmacokinetic parameters, these parameters on the one hand and the infusion rate on the other hand can be extrapolated to the plasma concentration to be achieved.

Die Anflutungskinetik ergibt sich aus einer konstanten Infusionsrate und einer Elimination erster Ordnung, gewöhnlich entsprechend der Verteilung ins Gewebe. Die Änderung der Plasmakonzentration c des Chemotherapeutikums über die Zeit t während einer Infusion kann durch die Differentialgleichung 1 beschrieben werden:

The inflow kinetics results from a constant infusion rate and a first-order elimination, usually according to the distribution into the tissue. The change in the plasma concentration c of the chemotherapeutic agent over time t during an infusion can be described by the differential equation 1:

Die Konstante k_inf ist der Quotient aus infundierter Stoffmenge je Zeiteinheit und dem Plasmavolumen. Die Konstante r entspricht der primären Abbaurate, wobei der Abbau von der Konzentration abhängt. Die lineare Differentialgleichung 1 mit der Anfangsbedingung c(0) = 0 hat Gleichung 2 als eindeutige Lösung.The constant k _inf is the quotient of infused amount of substance per unit time and the plasma volume. The constant r corresponds to the primary degradation rate, the degradation depending on the concentration. The linear differential equation 1 with the initial condition c (0) = 0 has Equation 2 as a unique solution.

Die Chemotherapeutikumkonzentration im Plasma zum Zeitpunkt t nach Beginn der Infusion ist durch c(t) gegeben. Die Konstanten k_inf und r können aus den ersten gemessenen Werten, d. h. z. B. aus den gemessenen Plasmakonzentrationen in 2 oder 3 oder 4 oder mehr biologischen Flüssigkeitsproben des Individuums, die jeweils im Abstand von einigen Minuten nach Beginn der Infusion genommen wurden, über eine entsprechende Regressionsanalyse ermittelt werden. Die nicht lineare Regressionsanalyse kann z. B. iterativ erfolgen unter Zuhilfenahme bekannter Algorithmen, z. B. des Levenberg-Marquardt-Algorithmus, wobei die angepassten Koeffizienten eine minimale quadratische Fehlerabweichung aufweisen sollten. Alternativ kann k_inf z. B. auch graphisch aus den ersten 2–3 Werten, die linear verlaufen sollten, ermittelt werden, und aus den späteren Werten wird dann mit dem bekannten k_inf die Konstante r berechnet (siehe Gleichung 2).The chemotherapeutic concentration in the plasma at time t after the beginning of the infusion is given by c (t). The constants k _inf and r can be determined from the first measured values, ie, for example, from the measured plasma concentrations in 2 or 3 or 4 or more biological fluid samples of the individual taken at intervals of a few minutes after the start of the infusion Regression analysis are determined. The non-linear regression analysis can, for. B. iteratively done with the aid of known algorithms, eg. The Levenberg-Marquardt algorithm, where the adjusted coefficients should have a minimum quadratic error deviation. Alternatively, k _inf z. Also graphically from the first 2-3 values, which should be linear, are determined, and from the later values, the constant r is then calculated with the known k _inf (see equation 2).

Um den Zeitpunkt τ zu bestimmen, an dem die gewünschte Plasmakonzentration c_Ziel erreicht wird und an dem die Infusion abgebrochen werden kann, kann Gleichung 2 nach t aufgelöst werden (Gleichung 3)

In order to determine the time τ at which the desired plasma concentration c _{target is} reached and at which the infusion can be stopped, equation 2 can be solved for t (equation 3)

Die vorliegende Erfindung betrifft daher in einer Ausführungsform auch ein ex-vivo Verfahren zur Bestimmung einer optimalen individuellen Dosierung eines Chemotherapeutikums oder eines seiner Salze, wobei das Chemotherapeutikum ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Daunorubicin, Etoposid, 5-Fluorouracil, Fludarabin und Chlorambucil, umfassend die Bestimmung der Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite nach einem wie weiter oben beschriebenen Verfahren in mindestens 2, bevorzugt mindestens 3 oder stärker bevorzugt mindestens 4 biologischen Flüssigkeitsproben, vorzugsweise Plasmaproben, eines Individuums, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Beginn einer Infusion des Chemotherapeutikums oder eines seiner Salze bei dem Individuum entnommen werden, und die Berechnung der optimalen individuellen Dosierung aus den gemessenen Konzentrationen, die zum Erreichen einer vorbestimmten Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in der biologischen Flüssigkeit des Individuums zu verabreichen ist. Die Bestimmung der Chemotherapeutikumskonzentration kann z. B. auch in 5 oder mehr biologischen Flüssigkeitsproben erfolgen. Sie kann z. B. auch in 6 oder mehr biologischen Flüssigkeitsproben erfolgen. Beispielsweise können einem Individuum die biologischen Flüssigkeitsproben im Abstand von 2–5 Minuten oder 5–10 Minuten nach Beginn der Infusion entnommen werden und darin jeweils die Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite bestimmt werden.The present invention therefore also relates, in one embodiment, to an ex vivo method for determining an optimal individual dosage of a chemotherapeutic agent or one of its salts, wherein the chemotherapeutic agent is selected from the group consisting of doxorubicin, epirubicin, idarubicin, daunorubicin, etoposide, 5-fluorouracil Fludarabine and chlorambucil comprising determining the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites by a method as described above in at least 2, preferably at least 3 or more preferably at least 4 biological fluid samples, preferably plasma samples, from an individual at different times Beginning of an infusion of the chemotherapeutic agent or one of its salts are taken in the individual, and the calculation of the optimal individual dosage from the measured concentrations, which are used to reach a predetermined concentration of Che motherapeutikums and its optionally present metabolites in the biological fluid of the individual to administer. The determination of chemotherapeutic agent concentration may, for. B. also be carried out in 5 or more biological fluid samples. You can z. B. also be carried out in 6 or more biological fluid samples. For example, an individual may be sampled biologically at 2-5 minutes or 5-10 minutes after initiation of infusion, and the concentration of the chemotherapeutic agent and any metabolites that may be present therein determined.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Chemotherapeutikabestimmung in Flüssigkeitsproben eines Individuums lässt sich aufgrund seiner schnellen und einfachen Durchführbarkeit auch in einer Vorrichtung zur Verabreichung von Chemotherapeutika anwenden. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine Infusionsapparatur zur Verabreichung eines Chemotherapeutikums oder eines seiner Salze an ein Individuum, wobei die Infusionsapparatur als Bestandteile

(i) ein Reservoir,
(ii) eine Dosierungseinheit,
(iii) eine Abgabeeinheit,
(iv) eine Gewinnungseinheit,
(v) eine Analyseneinheit, und
(vi) eine Steuereinheit

umfasst, wobei das Reservoir das Chemotherapeutikum oder eines seiner Salze enthält, die Dosierungseinheit die Zugabe der Menge des Chemotherapeutikums oder dessen Salz pro Zeiteinheit reguliert, die aus dem Reservoir über die Abgabeeinheit dem Individuum verabreicht wird, die Gewinnungseinheit eine oder mehrere biologische Flüssigkeitsprobe(n) des Individuums gewinnt, in der Analyseneinheit die Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in der oder in den biologischen Flüssigkeitsproben bestimmt wird, die Steuerungseinheit die Regulierung der Dosierungseinheit steuert in Abhängigkeit von der oder den in der Analyseneinheit bestimmten Konzentration(en), und wobei die Bestimmung der Konzentration(en) des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in der Analyseneinheit nach einem Verfahren wie weiter oben beschrieben durchgeführt wird. Eine solche Infusionsapparatur ist beispielhaft in 9 dargestellt.The inventive method for chemotherapeutic determination in fluid samples of an individual can also be used in a device for administering chemotherapeutic agents because of its quick and easy practicability. The present invention therefore also relates to an infusion apparatus for administering a chemotherapeutic agent or one of its salts to an individual, wherein the infusion apparatus as constituents

(i) a reservoir,
(ii) a dosage unit,
(iii) a dispensing unit,
(iv) a recovery unit,
(v) an analysis unit, and
(vi) a control unit

wherein the reservoir contains the chemotherapeutic agent or one of its salts, the dosage unit regulates the addition of the amount of the chemotherapeutic agent or its salt per unit of time administered to the individual from the reservoir via the delivery unit, the recovery unit comprises one or more biological fluid sample (s) the individual wins, in the analysis unit, the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in or in the biological fluid samples is determined, the control unit controls the regulation of the dosage unit depending on the or in the analysis unit determined concentration (s), and wherein the determination of the concentration (s) of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in the analysis unit is carried out by a method as described above. Such an infusion apparatus is exemplary in 9 shown.

Mit der erfindungsgemäß beanspruchten Infusionsapparatur kann die Bestimmung der Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite außerhalb des Körpers des Individuums erfolgen oder auch innerhalb.With the infusion apparatus claimed according to the invention, the determination of the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites can take place outside the body of the individual or even within.

In einer Ausführungsform der Infusionsapparatur gewinnt die Gewinnungseinheit bis maximal 60 min nach Beginn der Verabreichung zeitlich versetzt mehrere biologische Flüssigkeitsproben. Sowohl die Gewinnung der biologischen Flüssigkeitsproben als auch die Konzentrationsbestimmung in den Flüssigkeitsproben kann diskontinuierlich erfolgen. In einer anderen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Infusionsapparatur eine Infusionsapparatur, wobei die Gewinnungseinheit die biologische Flüssigkeitsprobe kontinuierlich gewinnt und die Analyseneinheit so gestaltet ist, dass die Bestimmung der Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in der Flüssigkeitsprobe kontinuierlich erfolgt.In one embodiment of the infusion apparatus, the recovery unit recovers a plurality of biological fluid samples offset in time up to a maximum of 60 minutes after the beginning of the administration. Both the recovery of the biological fluid samples and the concentration determination in the fluid samples can be carried out batchwise. In another embodiment, the infusion apparatus according to the invention is an infusion apparatus, wherein the extraction unit continuously extracts the biological fluid sample and the analysis unit is designed so that the determination of the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in the fluid sample is continuous.

Eine Kalibrierung der Infusionsapparatur kann z. B. unmittelbar vor Beginn der Infusion mit der Chemotherapeutikumlösung bekannter Konzentration aus dem Reservoir und dem Plasma des Individuums individuell durchgeführt werden.A calibration of the infusion apparatus can, for. B. are performed individually before the start of the infusion with the chemotherapeutic solution of known concentration from the reservoir and the plasma of the individual.

In der erfindungsgemäßen Infusionsapparatur kann die Steuerung der Regulierung der Dosierungseinheit durch die Steuereinheit in Abhängigkeit eines vorbestimmten Sollwerts für die Konzentration erfolgen. Nachdem der behandelnde Arzt des Individuums z. B. vor Beginn des Behandlungszyklus einen Sollwert der Plasmakonzentration des Chemotherapeutikums festgelegt hat, der in dem Behandlungszyklus bei dem Individuum erreicht werden soll, erfolgt in der erfindungsgemäßen Infusionsapparatur durch die Steuereinheit die Steuerung der Regulierung der Dosierungseinheit in Abhängigkeit von der oder den in der Analyseneinheit bestimmten Konzentration(en) und in Abhängigkeit von dem vorbestimmten Sollwert für die Plasmakonzentration. Dies geschieht ohne Einwirkung eines Arztes. Die Infusionsapparatur kann voll automatisiert sein. Abhängig von den gemessenen Werten und dem Sollwert kann automatisch die Zugabe der Menge des Chemotherapeutikums oder dessen Salz pro Zeiteinheit über die Dosierungseinheit reguliert werden, die aus dem Reservoir über die Abgabeeinheit dem Individuum verabreicht wird und die Infusion über die Dosierungseinheit z. B. beendet werden, sobald in der Analyseneinheit eine Konzentration bestimmt wird, die einer vorbestimmten Konzentration (Sollwert) entspricht.In the infusion apparatus according to the invention, the control of the regulation of the dosage unit by the control unit in dependence on a predetermined target value for the concentration can take place. After the treating physician of the individual z. B. has set a target value of the plasma concentration of the chemotherapeutic prior to the start of the treatment cycle, which is to be achieved in the treatment cycle in the individual is carried out in the infusion apparatus according to the invention by the control unit, the regulation of the dosage unit depending on or in the analysis unit Concentration (s) and in dependence on the predetermined setpoint for the plasma concentration. This happens without the intervention of a doctor. The infusion apparatus can be fully automated. Depending on the measured values and the target value, the addition of the amount of chemotherapeutic agent or its salt per unit time can be automatically regulated via the dosage unit administered to the individual from the reservoir via the delivery unit and the infusion via the dosage unit e.g. B. be terminated as soon as a concentration is determined in the analysis unit, which corresponds to a predetermined concentration (target value).

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Infusionsapparatur steuert die Steuerungseinheit die Dosierungseinheit derart, dass die Verabreichung des Chemotherapeutikums oder dessen Salz beendet wird, sobald in der Analyseneinheit eine Konzentration bestimmt wird, die einer vorbestimmten Konzentration entspricht.In a particularly preferred embodiment of the infusion apparatus, the control unit controls the dosage unit such that the administration of the chemotherapeutic agent or its salt is terminated as soon as a concentration is determined in the analysis unit, which corresponds to a predetermined concentration.

In einer anderen Ausgestaltung der Infusionsapparatur steuert die Steuerungseinheit die Dosierungseinheit derart, dass die Verabreichung des Chemotherapeutikums oder dessen Salz beendet wird, sobald eine bestimmte Dosierung verabreicht wurde, die nach dem zuvor beschriebenen Verfahren zur Bestimmung einer optimalen individuellen Dosierung bestimmt wurde.In another embodiment of the infusion apparatus, the control unit controls the dosage unit to terminate the administration of the chemotherapeutic agent or its salt once a particular dosage has been administered which has been determined by the method described above for determining an optimal individual dosage.

Die erfindungsgemäße Infusionsapparatur kann auch eine Infusionsapparatur sein, wobei die Steuerungseinheit die Dosierungseinheit derart steuert, dass die Zugabe der Menge des Chemotherapeutikums oder dessen Salz pro Zeiteinheit hochreguliert wird, die aus dem Reservoir über die Abgabeeinheit dem Individuum verabreicht wird, wenn in 2 aufeinanderfolgenden Bestimmungen der Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in der Analyseneinheit die zweite Bestimmung eine niedrigere Konzentration ergibt als die erste.The infusion apparatus according to the invention may also be an infusion apparatus, wherein the control unit controls the dosage unit to up-regulate the addition of the amount of chemotherapeutic agent or its salt per unit of time administered to the individual from the reservoir via the delivery unit when in 2 consecutive determinations Concentration of the chemotherapeutic agent and its possibly present metabolites in the analysis unit gives the second determination a lower concentration than the first.

Die erfindungsgemäße Infusionsapparatur kann z. B. auch eine Infusionsapparatur sein, wobei die biologische Flüssigkeitsprobe eine Plasmaprobe ist, die die Gewinnungseinheit, welche eine Trenneinheit umfasst, gewinnt, indem durch die Trenneinheit von Blut des Individuums eine Plasmaprobe abgetrennt wird, die der Analyseneinheit zugeführt wird, und die Analyseneinheit eine Proteinabtrennungseinheit und eine Detektionseinheit umfasst, wobei in der Proteinabtrennungseinheit in der Plasmaprobe enthaltenen Proteine abgetrennt werden, und wobei mit der Detektionseinheit das Fluoreszenzsignal gemessen wird, das von der Plasmaprobe nach Proteinabtrennung bei Bestrahlung mit Anregungslicht ausgeht. Die Abtrennung der Proteine kann z. B. nach Fällung mit Trichloressigsäure erfolgen. In einem Beispiel einer kontinuierlich arbeitenden Infusionsapparatur ist die Trenneinheit z. B. derart gestaltet, dass die Blutzellen von Blut des Individuums kontinuierlichen über einen Filter abgetrennt werden und so eine kontinuierliche Plasmaprobe gewonnen wird, und die Proteinabtrennungseinheit die durch Fällungsreagenzzugabe ausgefällten Proteinen aus der Plasmaprobe ebenfalls kontinuierlich über einen Filter oder eine kontinuierliche Zentrifuge abtrennt und die nachgeschaltete Detektionseinheit die Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in der Flüssigkeitsprobe kontinuierlich bestimmt.The infusion apparatus according to the invention can, for. Example, also be an infusion apparatus, wherein the biological fluid sample is a plasma sample, the winning unit, which comprises a separation unit wins by a plasma sample by the separation unit of blood of the individual is separated, which is supplied to the analysis unit, and the analysis unit comprises a protein separation unit and a detection unit, wherein proteins contained in the protein separation unit in the plasma sample are separated, and wherein the detection unit, the fluorescence signal is measured from the plasma sample after protein separation upon irradiation with Excitation light goes out. The separation of the proteins may, for. B. after precipitation with trichloroacetic acid. In an example of a continuously operating infusion apparatus, the separation unit is z. B. designed so that the blood cells of blood of the individual are separated continuously via a filter and a continuous plasma sample is obtained, and the protein separation unit also separates the precipitate added by the addition of precipitated protein from the plasma sample continuously through a filter or a continuous centrifuge and the downstream Detection unit continuously determines the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in the liquid sample.

In einer anderen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Infusionsapparatur eine Infusionsapparatur, wobei die biologische Flüssigkeitsprobe eine Blutprobe ist, die nach der Gewinnung in der Gewinnungseinheit der Analyseneinheit zugeführt wird, und die Analyseneinheit eine Proteinabtrennungseinheit und eine Detektionseinheit umfasst, wobei in der Proteinabtrennungseinheit in der Blutprobe enthaltenen Proteine und gleichzeitig auch Zellen abgetrennt werden, und wobei mit der Detektionseinheit das Fluoreszenzsignal gemessen wird, das von der Flüssigkeitsprobe nach Protein- und Zellabtrennung bei Bestrahlung mit Anregungslicht ausgeht. Auch hier kann die Abtrennung der Proteine z. B. nach Fällung mit Trichloressigsäure erfolgen. Die Zellen der Blutprobe werden bei der Abtrennung der Proteine mit abgetrennt. In einem weiteren Beispiel einer kontinuierlich arbeitenden Infusionsapparatur wird die Blutprobe kontinuierlich gewonnen, und in der Proteinabtrennungseinheit wird Fällungsreagenz zugesetzt und ausgefällte Proteine und Zellen werden aus der Blutprobe ebenfalls kontinuierlich über einen Filter oder eine kontinuierliche Zentrifuge abgetrennt und die nachgeschaltete Detektionseinheit bestimmt kontinuierlich die Konzentration des Chemotherapeutikums und seiner gegebenenfalls anwesenden Metabolite in der Flüssigkeitsprobe.In another embodiment, the infusion apparatus according to the invention is an infusion apparatus, wherein the biological fluid sample is a blood sample which is supplied to the analysis unit after recovery in the recovery unit, and the analysis unit comprises a protein separation unit and a detection unit, wherein proteins contained in the protein separation unit in the blood sample and at the same time cells are separated, and wherein the detection unit, the fluorescence signal is measured, which emanates from the liquid sample after protein and cell separation upon irradiation with excitation light. Again, the separation of proteins z. B. after precipitation with trichloroacetic acid. The cells of the blood sample are separated during the separation of the proteins. In another example of a continuous infusion apparatus, the blood sample is continuously recovered and precipitation reagent is added in the protein separation unit and precipitated proteins and cells are also continuously separated from the blood sample via a filter or continuous centrifuge and the downstream detection unit continuously determines the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in the fluid sample.

Die vorliegende Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel und die Figuren, in denen die Ergebnisse des Beispiels zusammengefasst sind, weiter erläutert:The present invention is further illustrated by the following example and the figures, which summarize the results of the example:

Figurencharacters

1(a)–(d) zeigt die Bestimmung der Fluoreszenzintensität (RFU, relative fluorescent units) von (a) 5-Fluorouracil, (b) Chlorambucil, (c) Fludarabin oder (d) Etoposid enthaltenden Flüssigkeitsproben (verschiedene Konzentrationen). Humanes mit EDTA antikoaguliertes Plasma wurde jeweils mit entsprechenden Mengen einer Lösung des entsprechenden Chemotherapeutikums versetzt (Etoposid und Fludarabin wurden in Form des Etoposidphoshats bzw. des Fludarabinphosphats eingesetzt) und die Fluoreszenzintensitäten wurden gemessen nach Zugabe von Trichloressigsäure zu der Flüssigkeitsprobe als Fällungsreagenz und Abtrennung der ausgefällten Proteine durch Zentrifugation. Bei den Flüssigkeitsproben zu (a), (b) und (d) wurde den Flüssigkeitsproben vor der Fluoreszenzmessung jeweils NaOH zugesetzt, bei den Flüssigkeitsproben zu (c) wurde Wasser zugesetzt. In den Messungen zu 1(a)–(c) betrug die Exzitationsschlitzweite/Emissionsschlitzweite 10 nm/10 nm, in der Messung zu 1(d) 2,5 nm/2,5 nm. 1 (a) - (d) shows the determination of the fluorescence intensity (RFU) of (a) 5-fluorouracil, (b) chlorambucil, (c) fludarabine or (d) etoposide-containing fluid samples (various concentrations). In each case, EDTA-anticoagulated plasma was supplemented with appropriate amounts of a solution of the corresponding chemotherapeutic agent (etoposide and fludarabine were used in the form of etoposide phosphate and fludarabine phosphate, respectively), and the fluorescence intensities were measured after addition of trichloroacetic acid to the liquid sample as a precipitating reagent and separation of the precipitated proteins by centrifugation. For the liquid samples of (a), (b) and (d), respectively, NaOH was added to the liquid samples prior to the fluorescence measurement, and water was added to the liquid samples of (c). In the measurements too 1 (a) - (c) the excitation slit width / emission slit width was 10 nm / 10 nm, in the measurement too 1 (d) 2.5 nm / 2.5 nm.

2 zeigt die Bestimmung der Fluoreszenzintensität von Doxorubicin und Epirubicin enthaltenden Flüssigkeitsproben (verschiedene Konzentrationen). Doxorubicin- bzw. Epirubicinhydrochlorid wurden zu humanem Plasma gegeben und die Fluoreszenz wurde nach Fällung der Proteine mit Trichloressigsäure (TCA) und Zentrifugation gemessen (n = 4). Dargestellt sind die Mittelwerte und die Standardabweichung der einzelnen Datenpunkte. 2 shows the determination of the fluorescence intensity of doxorubicin and epirubicin-containing fluid samples (various concentrations). Doxorubicin or epirubicin hydrochloride were added to human plasma and fluorescence was measured after precipitation of the proteins with trichloroacetic acid (TCA) and centrifugation (n = 4). Shown are the mean values and the standard deviation of the individual data points.

3 zeigt die Hintergrundfluoreszenz nach Fällung der Plasmaproteine. Plasma wurde mit Trichloressigsäure versetzt, die Flüssigkeitsproben wurden zentrifugiert und die Fluoreszenz wurde bei einer Anregungswellenlänge von 470 nm und einer Emissionswellenlänge von 555 nm gemessen. Dargestellt ist der Mittelwert und die Standardabweichung aus 10 individuellen Plasmaproben. 3 shows the background fluorescence after precipitation of the plasma proteins. Trichloroacetic acid was added to the plasma, the fluid samples were centrifuged and the fluorescence was measured at an excitation wavelength of 470 nm and an emission wavelength of 555 nm. Shown is the mean and standard deviation of 10 individual plasma samples.

4 zeigt einen Vergleich der Fluoreszenzintensitäten bei verschiedenen Probanden. Plasmaproben von 10 verschiedenen Probanden wurden mit entsprechenden Mengen einer 1 mM Doxorubicinhydrochloridlösung versetzt und wie beschrieben behandelt. Fluoreszenzintensitäten wurden bei 470/555 nm; Exzitationsschlitzweite/Emissionsschlitzweite 10 nm/10 nm gemessen. 4 shows a comparison of the fluorescence intensities in different subjects. Plasma samples from 10 different subjects were spiked with appropriate amounts of a 1 mM doxorubicin hydrochloride solution and treated as described. Fluorescence intensities were at 470/555 nm; Excitation slot width / emission slot width 10 nm / 10 nm measured.

5 zeigt die Varianz der Doxorubicinbestimmung an verschiedenen Messtagen. Die Messungen wurden an verschiedenen Tagen über einen Zeitraum von 1 Jahr mit unterschiedlichen Plasmamischungen durchgeführt. Die Fällung der Proteine erfolgte wie beschrieben mit TCA. Die ausgefällten Proteine wurden durch Zentrifugation abgetrennt. 5 shows the variance of the doxorubicin determination on different measurement days. The measurements were carried out on different days over a period of 1 year with different plasma mixtures. The precipitation of the proteins was carried out as described with TCA. The precipitated proteins were separated by centrifugation.

6(a) zeigt die Hintergrundfluoreszenz von humanem Plasma nach Proteinfällung mit erfindungsgemäßen Fällungsreagenzien bzw. nach Behandlung mit 0,3 M HCl/Ethanol 1:1 (v/v) und Zentrifugation. Das Protein aus humanem Plasma (gepoolt) wurde mit verschiedenen Methoden gefällt, zentrifugiert und anschließend wurde die Fluoreszenz bei 475/555 nm (Anregung/Emissionswellenlänge) gemessen (n = 6). Das erfindungsgemäße Fällungsreagenz bzw. 0,3 M HCl/Ethanol 1:1 (v/v) wurde im Verhältnis 2:1 (v/v) (1000 μl Fällungsreagenz: 500 μl Flüssigkeitsprobe) mit der Plasmaprobe gemischt bzw. bei der Verwendung von TCA als 3 M wässrige Lösung wurde erst mit 100 μl 3 M TCA gefällt, dann entsprechend mit Wasser oder Acetonitril verdünnt, um ein Endvolumen von 1,5 ml zu erreichen. Verwendet wurden Methanol, Ethanol, und Acetonitril (AcCN), 3 M TCA (mit anschließender Verdünnung der Probe mit Wasser), 3 M TCA (mit anschließender Verdünnung der Probe mit Acetonitril), Zinksulfat (10% w/v in 0,25 M NaOH) gemischt mit Methanol (1:2 v/v) [Mix1]. 6(b) zeigt die Doxorubicinfluoreszenz nach Fällung von Plasmaprotein und Zentrifugation. Humanes Plasma, das 50 μM Doxorubicin als Hydrochlorid enthielt, wurde mit den unter 6(a) beschriebenen Fällungsreagenzien behandelt, zentrifugiert und anschließend wurde die Fluoreszenz bei 475/555 nm (Anregung/Emissionswellenlänge) gemessen (n = 6). 6 (a) shows the background fluorescence of human plasma after protein precipitation with precipitating reagents according to the invention or after treatment with 0.3 M HCl / ethanol 1: 1 (v / v) and centrifugation. The protein from human plasma (pooled) was precipitated by various methods, centrifuged and then the fluorescence at 475/555 nm (excitation / emission wavelength) was measured (n = 6). The precipitation reagent according to the invention or 0.3 M HCl / ethanol 1: 1 (v / v) was mixed with the plasma sample in the ratio 2: 1 (v / v) (1000 μl precipitating reagent: 500 μl liquid sample) or when using TCA as a 3 M aqueous solution was first precipitated with 100 μl of 3 M TCA, then diluted appropriately with water or acetonitrile to reach a final volume of 1.5 ml. Methanol, ethanol, and acetonitrile (AcCN), 3 M TCA (followed by dilution of the sample with water), 3 M TCA (followed by dilution of the sample with acetonitrile), zinc sulfate (10% w / v in 0.25 M) were used NaOH) mixed with methanol (1: 2 v / v) [Mix1]. 6 (b) shows doxorubicin fluorescence after precipitation of plasma protein and centrifugation. Human plasma containing 50 .mu.M doxorubicin as the hydrochloride, was with the under 6 (a) treated precipitating reagents, centrifuged and then the fluorescence at 475/555 nm (excitation / emission wavelength) was measured (n = 6).

7 zeigt die Bestimmung der Fluoreszenzintensität von humanen Plasmaproben, denen pegyliertes liposomales Doxorubicinhydrochlorid (Caelyx) zugegeben wurde. Pegyliertes liposomales Doxorubicinhydrochlorid wurde zu humanem Plasma gegeben und die Fluoreszenz wurde nach Fällung der Proteine mit TCA und Zentrifugation wie beschrieben gemessen (n = 7). 7 shows the determination of the fluorescence intensity of human plasma samples to which pegylated liposomal doxorubicin hydrochloride (Caelyx) was added. Pegylated liposomal doxorubicin hydrochloride was added to human plasma and fluorescence was measured after precipitation of the proteins with TCA and centrifugation as described (n = 7).

8 zeigt die Konzentrationsbestimmung von Doxorubicin in einer Blutprobe. Vollblut wurde mit verschiedenen Mengen Doxorubicinhydrochlorid versetzt. Es wurde 3 M TCA zur Flüssigkeitsprobe gegeben und die ausgefällten Proteine und Zellen wurden durch Zentrifugation abgetrennt. Anschließend wurde die Fluoreszenz im verdünnten Überstand gemessen. 8th shows the concentration determination of doxorubicin in a blood sample. Whole blood was spiked with various amounts of doxorubicin hydrochloride. 3 M TCA was added to the fluid sample and the precipitated proteins and cells were separated by centrifugation. Subsequently, the fluorescence in the diluted supernatant was measured.

9 zeigt eine automatische über die Plasmakonzentration gesteuerte Infusionsapparatur. 9 shows an automatic plasma concentration controlled infusion device.

10 zeigt die Konzentrationsbestimmung von Doxorubicin und seiner Hauptmetabolite. Doxorubicinhydrochlorid, Doxorubicinolcitrat sowie die 7-deoxy-Aglycone von Doxorubicin bzw. Doxorubicinol wurden zu humanem Plasma gegeben und die Fluoreszenz wurde nach Fällung der Proteine mit TCA und Zentrifugation wie beschrieben gemessen (n = 3). 10 shows the concentration determination of doxorubicin and its major metabolites. Doxorubicin hydrochloride, doxorubicinol citrate, and doxorubicin or doxorubicinol 7-deoxy aglycones were added to human plasma and fluorescence was measured after precipitation of the proteins with TCA and centrifugation as described (n = 3).

Beispiel 1example 1

Probenvorbereitung und MessungSample preparation and measurement

Für die in den 1–5, 7 und 10 dargestellten Ergebnisse wurden jeweils 1 ml humanes Plasma (EDTA antikoaguliert) welchem gegebenenfalls verschiedene Mengen des jeweiligen Chemotherapeutikums oder dessen Salz zugesetzt wurden, mit 250 μl einer 3 M Trichloressigsäurelösung gemischt. Die Lösung wurde 2 min bei 12000 g zentrifugiert. Vom Überstand wurden 750 μl abgenommen, mit 1500 μl H₂O dest. oder mit 1500 μl 1 M NaOH wenn angegeben, versetzt und die Hintergrundfluoreszenz bzw. Konzentration des Chemotherapeutikums wurde durch Fluoreszenzmessung bestimmt. Für 1 sind die jeweiligen Wellenlängenpaare (Anregung/Emission) angegeben, bei allen andern Figuren wurde bei einer Anregung von 470 nm und einer Emission von 555 nm gemessen. Wenn nicht anders angegeben betrug die Exzitationsschlitzweite/Emissionsschlitzweite 10 nm/10 nm.For those in the 1 - 5 . 7 and 10 In each case, 1 ml of human plasma (EDTA anticoagulated), to which various amounts of the respective chemotherapeutic agent or its salt have been added, were mixed with 250 μl of a 3 M trichloroacetic acid solution. The solution was centrifuged for 2 min at 12000 g. From the supernatant 750 .mu.l were removed, distilled with 1500 .mu.l H ₂ O. or with 1500 μl of 1 M NaOH if indicated, and the background fluorescence or concentration of the chemotherapeutic agent was determined by fluorescence measurement. For 1 the respective pairs of wavelengths (excitation / emission) are indicated, in all other figures measurements were made with an excitation of 470 nm and an emission of 555 nm. Unless otherwise stated, the excitation slot width / emission slot width was 10 nm / 10 nm.

Für die in 6 dargestellten Ergebnisse wurde das humane Plasma (EDTA antikoaguliert) von 5–7 freiwilligen Spendern gepoolt. Ein Teil des Plasmas wurde mit verschiedenen erfindungsgemäßen Fällungsreagenzien bzw. mit 0,3 M HCl/Ethanol 1:1 (v/v) behandelt, der andere Teil des Plasmas wurde mit Doxorubicinhydrochlorid versetzt (Endkonzentration im Plasma 50 μM) und anschließend erfindungsgemäß gefällt. Es wurden jeweils 500 μl Plasma mit 1 ml Fällungsreagenz bzw. 0,3 M HCl/Ethanol 1:1 (v/v) versetzt, bei der Verwendung von TCA wurde erst mit 100 μl TCA gefällt, dann entsprechend mit Wasser oder Acetonitril verdünnt, um ein Endvolumen von 1,5 ml zu erreichen. Anschließend wurde 2 min lang bei 12000 g zentrifugiert. Die nach der Fällung der Proteine verbleibende Fluoreszenz wurde gemessen (475/555 nm, Exzitationsschlitzweite/Emissionsschlitzweite 10 nm/10 nm) (n = 6). Neben 0,3 M HCl/Ethanol 1:1 (v/v) wurden folgende erfindungsgemäße Fällungsreagenzien untersucht: Methanol, Ethanol, und Acetonitril, 3 M TCA (mit anschließender Verdünnung der Probe mit Wasser), 3 M TCA (mit anschließender Verdünnung der Probe mit Acetonitril), Zinksulfat (10% w/v in 0,25 M NaOH) gemischt mit Methanol (1:2 v/v) [Mix1].For the in 6 Human plasma (EDTA anticoagulated) was pooled by 5-7 volunteer donors. A portion of the plasma was treated with various precipitating reagents according to the invention or with 0.3 M HCl / ethanol 1: 1 (v / v), the other part of the plasma was treated with doxorubicin hydrochloride (final concentration in plasma 50 μM) and then precipitated according to the invention. In each case, 500 μl of plasma were admixed with 1 ml of precipitation reagent or 0.3 M HCl / ethanol 1: 1 (v / v), TCA was first precipitated with 100 μl of TCA, then diluted with water or acetonitrile, respectively. to reach a final volume of 1.5 ml. It was then centrifuged for 2 minutes at 12000 g. The fluorescence remaining after precipitation of the proteins was measured (475/555 nm, excitation slot width / emission slot width 10 nm / 10 nm) (n = 6). In addition to 0.3 M HCl / ethanol 1: 1 (v / v), the following precipitating reagents according to the invention were investigated: methanol, ethanol, and acetonitrile, 3 M TCA (with subsequent dilution of the sample with water), 3 M TCA (with subsequent dilution of the Sample with acetonitrile), zinc sulfate (10% w / v in 0.25 M NaOH) mixed with methanol (1: 2 v / v) [Mix1].

Bei der Bestimmung von Doxorubicin aus einer Blutprobe (8) wurden 500 μl humanes Blut (Vollblut mit EDTA antikoaguliert) mit 500 μl Puffer pH 7,4 (10 mM Natriumhydrogenphosphat/140 mM Natriumchlorid) versetzt, der verschiedene Mengen an Doxorubicinhydrochlorid enthielt. Es wurden 500 μl 3 M TCA zugesetzt und gemischt. Anschließend wurde 2 min lang bei 12000 g zentrifugiert. Vom Überstand wurde 1 ml abgenommen und mit 2 ml Wasser verdünnt. Die Fluoreszenz wurde bei 470/555 nm gemessen; Exzitationsschlitzweite/Emissionsschlitzweite 10 nm/10 nm.In the determination of doxorubicin from a blood sample ( 8th ) 500 ul human blood (whole blood with EDTA anticoagulated) with 500 ul buffer pH 7.4 (10 mM sodium hydrogen phosphate / 140 mM sodium chloride) containing different amounts of doxorubicin hydrochloride. 500 μl of 3 M TCA were added and mixed. It was then centrifuged for 2 minutes at 12000 g. From the supernatant 1 ml was removed and diluted with 2 ml of water. The fluorescence was at 470/555 nm measured; Excitation slot width / emission slot width 10 nm / 10 nm.

Alle Fluoreszenzmessungen wurden mit dem Gerät Luminescence-spektrometer LS 50 (PerkinElmer LAS GmbH, Rodgau, Deutschland) durchgeführt.All fluorescence measurements were carried out with the LS 50 luminescence spectrometer (PerkinElmer LAS GmbH, Rodgau, Germany).

ErgebnisResult

Die Konzentrationen der verschiedenen Chemotherapeutika können mit dem beschriebenen Verfahren sehr gut in biologischen Flüssigkeitsproben bestimmt werden. Aus den 1 und 2 sind in den beschriebenen Konzentrationsbereichen des jeweiligen Chemotherapeutikums lineare Verläufe des Fluoreszenzsignals ersichtlich. Für Doxorubicin ist z. B. eine Kalibrierung einer Messkurve im Bereich von 0,1 bis 50 μM möglich. Liposomales Doxorubicin lässt sich mit der beschriebenen Methode ebenfalls sehr gut bestimmen, da die liposomale Hülle durch die Fällung mit TCA zerstört wird (7).The concentrations of the various chemotherapeutic agents can be determined very well in biological fluid samples by the described method. From the 1 and 2 In the described concentration ranges of the respective chemotherapeutic, linear courses of the fluorescence signal can be seen. For doxorubicin z. B. a calibration of a waveform in the range of 0.1 to 50 uM possible. Liposomal doxorubicin can also be determined very well with the method described, since the liposomal shell is destroyed by the precipitation with TCA ( 7 ).

Durch die Proteinfällung wird der Hintergrund für die Fluoreszenzmessung minimiert (3). Die niedrigste Hintergrundfluoreszenz und das beste Verhältnis zwischen Fluoreszenzintensität und Hintergrundfluoreszenz zeigt die Fällungsmethode mit TCA und anschließender Verdünnung mit H₂O (dest) (6). Aufgrund der geringen Hintergrundfluoreszenz können auch geringe Konzentrationen an Chemotherapeutikum bestimmt werden. Die Methode verfügt zudem über eine gute Robustheit und die Messergebnisse variieren auch bei Verwendung von Flüssigkeitsproben von verschiedenen Spendern und an verschiedenen Tagen kaum (4 und 5). Wie in 8 gezeigt, kann eine Bestimmung direkt aus Vollblut erfolgen.Protein precipitation minimizes the background for fluorescence measurement ( 3 ). The lowest background fluorescence and the best ratio between fluorescence intensity and background fluorescence shows the precipitation method with TCA and subsequent dilution with H ₂ O (dest) ( 6 ). Due to the low background fluorescence, even low concentrations of chemotherapeutic agent can be determined. The method also has a good robustness and the measurement results vary even when using liquid samples from different donors and on different days ( 4 and 5 ). As in 8th A determination can be made directly from whole blood.

10 zeigt, dass Metabolite des Doxorubicins (Doxorubicinol, 7-deoxy-Doxorubicinaglycon, 7-deoxy-Doxorubicinolagylcon) durch das erfindungsgemäße Verfahren zwar zum Teil miterfasst werden (Doxorubicinol ist ein aktiver Metabolit, der durch das Verfahren miterfasst wird, wohingegen die Erfassung der inaktiven Aglykone aufgrund der geringen Empfindlichkeit gering ist). Zur Bestimmung der maximalen Plasmakonzentration und der primären Abbaurate sind die Metabolite jedoch von untergeordneter Bedeutung, da die Metabolisierungsrate deutlich geringer als die sehr schnelle primäre Abbaurate ist. Die Plasmakonzentration von Doxorubicin fällt innerhalb relativ kurzer Zeit um 2 Größenordnungen. Vermutlich ist aber die Peakplasmakonzentration für die beobachteten Toxizitäten und die Wirksamkeit von entscheidender Bedeutung ( El-Kareh AW, Secomb TW, A Mathematical Model for Comparison of Bolus Injection, Continous Infusion, and Liposomal Delivery of Doxorubicin to Tumor Cells. Neoplasia 2000; 2(4): 325–338 ; Ishisaka T et al, A precise pharmacodynamic study showing the advantage of a marked reduction in cardiotoxicity in continuous infusion of doxorubicin. Leuk Lymphoma. 2006; 47(8): 1599–607 ), und die vorgestellte Methode erlaubt eine schnelle und sichere Einstellung des Plasmaspiegels, da sie automatisiert/miniaturisiert eine sehr schnelle Analyse gestattet. 10 shows that metabolites of doxorubicin (doxorubicinol, 7-deoxy-doxorubicin aglycone, 7-deoxy-doxorubicinol agoncone) may be partially detected by the method of the invention (doxorubicinol is an active metabolite co-detected by the method, whereas detection of inactive aglycones low due to the low sensitivity). However, to determine the maximum plasma concentration and the primary degradation rate, the metabolites are of minor importance, since the metabolization rate is significantly lower than the very fast primary degradation rate. The plasma concentration of doxorubicin falls within a relatively short time by 2 orders of magnitude. However, the peak plasma concentration is probably crucial for the observed toxicities and efficacy ( El-Kareh AW, Secomb TW, A Mathematical Model for Comparison of Bolus Injection, Continuous Infusion, and Liposomal Delivery of Doxorubicin to Tumor Cells. Neoplasia 2000; 2 (4): 325-338 ; Ishisaka T et al, A precise pharmacodynamic study showing the advantage of a marked reduction in cardiotoxicity in continuous infusion of doxorubicin. Leuk lymphoma. 2006; 47 (8): 1599-607 ), and the presented method allows a fast and safe adjustment of the plasma level, as it allows automated / miniaturized very fast analysis.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

US 2009107909 [0052]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

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Hempel et al, Peak plasma concentrations of doxorubicin in children with acute lymphoblastic leukemia or non-Hodgkin lymphoma. Cancer Chemother Pharmacol. 49 (2), 133-41 (2002) [0003]
Dusonchet et al, Spectrophotofluorometric characterization of adriamycin a new antitumour drug, Pharmacological Research Communications. 3 (1), 55-65 (1971) [0005]
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El-Kareh AW, Secomb TW, A Mathematical Model for Comparison of Bolus Injection, Continuous Infusion, and Liposomal Delivery of Doxorubicin to Tumor Cells. Neoplasia 2000; 2 (4): 325-338 [0093]
Ishisaka T et al, A precise pharmacodynamic study showing the advantage of a marked reduction in cardiotoxicity in continuous infusion of doxorubicin. Leuk lymphoma. 2006; 47 (8): 1599-607 [0093]

Claims

A method for determining the concentration of a chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in a biological fluid sample of an individual at a time between 0 and 60 minutes after the administration of the chemotherapeutic agent or one of its salts to the subject, wherein the chemotherapeutic agent is selected from the group consisting of Doxorubicin, epirubicin, idarubicin, daunorubicin, etoposide, 5-fluorouracil, fludarabine and chlorambucil comprising i) separating proteins contained in the fluid sample by at least one of the steps a) precipitating the proteins with a precipitating reagent and centrifuging or filtering the fluid sample the precipitating reagent is selected from the group consisting of trichloroacetic acid, methanol, ethanol, acetonitrile, zinc sulfate, and mixtures of two or more of these substances, b) dialysis or c) ultrafiltration, and ii) measuring a fluorescence signal, v on the liquid sample after protein separation on irradiation with excitation light emanates, characterized in that the method comprises no chromatographic and no electrophoretic process step and no liquid-liquid extraction.

The method of claim 1, wherein the chemotherapeutic agent is doxorubicin, epirubicin, idarubicin or daunorubicin.

A method according to claim 1 or 2, wherein the chemotherapeutic agent or one of its salts is administered to the individual as a liposomal preparation.

The method of any of claims 1-3, wherein the biological fluid sample is a blood sample, serum sample or plasma sample.

The method of any one of claims 1-4, wherein the separation of proteins contained in the fluid sample is accomplished by precipitating the proteins with a precipitating reagent and centrifuging or filtering the liquid sample, wherein the precipitating reagent is selected from the group consisting of trichloroacetic acid, methanol, ethanol, acetonitrile , Zinc sulfate and mixtures of two or more of these substances.

A method according to any one of claims 1-5, wherein the separation of proteins contained in the liquid sample is carried out by precipitation of the proteins with a precipitating reagent and centrifugation of the liquid sample, wherein the precipitating reagent is trichloroacetic acid.

The method of any one of claims 1-6, wherein no further steps are taken to separate or separate the fluid sample into discrete components or groups of components, with or without the removal of proteins contained in the fluid sample.

The method of any one of claims 1-7, wherein the chemotherapeutic agent is doxorubicin, epirubicin, idarubicin, or daunorubicin and wherein the liquid sample is irradiated with excitation light having a wavelength in the range of 430-510 nm and wherein measuring the fluorescence signal at one wavelength in the Range of 530-600 nm.

The method of any one of claims 1-8, wherein the method comprises comparing the intensity of the fluorescence signal emanating from the fluid sample with the intensity of fluorescence signals of a standardized concentration curve of the chemotherapeutic agent.

Ex vivo method for determining an optimal individual dosage of a chemotherapeutic agent or a salt thereof, wherein the chemotherapeutic agent is selected from the group consisting of doxorubicin, epirubicin, idarubicin, daunorubicin, etoposide, 5-fluorouracil, fludarabine and chlorambucil, full (i) determining the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites by a method of claims 1-9 in two or more biological fluid samples of an individual, wherein the biological fluid samples at different times after starting the administration of the chemotherapeutic agent or one of its salts to the Individual be taken from this, and (ii) the calculation of the optimal individual dosage from the data of step (i) to be administered to reach a predetermined concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in the biological fluid of the individual.

An infusion apparatus for administering to a subject a chemotherapeutic agent or a salt thereof, the infusion apparatus comprising (i) a reservoir, (ii) a dosage unit, (iii) a delivery unit, (iv) a recovery unit, (v) an assay unit, and ( vi) a control unit wherein the reservoir contains the chemotherapeutic agent or one of its salts, the dosage unit regulates the addition of the amount of the chemotherapeutic agent or its salt per unit of time administered to the individual from the reservoir via the delivery unit, the recovery unit comprises one or more biological fluid sample (s) the individual wins, in the analysis unit, the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in or in the biological fluid samples is determined, the control unit controls the regulation of the dosage unit depending on the or in the analysis unit determined concentration (s), and wherein the determination of the concentration (s) of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in the analysis unit according to a method of claims 1-9 is performed.

The infusion apparatus of claim 11, wherein the recovery unit continuously acquires the biological fluid sample and the assay unit is configured to continuously determine the concentration of the chemotherapeutic agent and its optionally present metabolites in the fluid sample.

Infusion apparatus according to claim 11 or 12, wherein the control unit controls the dosage unit such that the administration of the chemotherapeutic agent or its salt is terminated as soon as a concentration is determined in the analysis unit, which corresponds to a predetermined concentration.

The infusion apparatus of any one of claims 11-13, wherein the control unit controls the dosage unit to up-regulate the addition of the amount of chemotherapeutic agent or its salt per unit of time administered to the individual from the reservoir via the delivery unit when in 2 consecutive determinations Concentration of the chemotherapeutic agent and its possibly present metabolites in the analysis unit gives the second determination a lower concentration than the first.

An infusion apparatus according to any one of claims 11-14, wherein the biological fluid sample is a plasma sample which extracts the recovery unit comprising a separation unit by separating a plasma sample supplied by the blood separation unit of the subject to the analysis unit and the analysis unit a protein separation unit and a detection unit, wherein proteins contained in the protein separation unit in the plasma sample are separated, and wherein the detection unit is used to measure the fluorescence signal emanating from the plasma sample after protein separation upon irradiation with excitation light.