DE102012013860A1 - New trypanosome, useful e.g. as vaccine for treating humans and/or animals against e.g. malaria, does not comprise complete functional genome, preferably trypanosome with reduced, incomplete parasitic trypanosomal DNA - Google Patents

New trypanosome, useful e.g. as vaccine for treating humans and/or animals against e.g. malaria, does not comprise complete functional genome, preferably trypanosome with reduced, incomplete parasitic trypanosomal DNA Download PDF

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Abstract

Trypanosome, which does not comprise a complete functional genome, preferably trypanosome with reduced, incomplete parasitic trypanosomal DNA, is new. ACTIVITY : Antimalarial; Protozoacide. No biological data given. MECHANISM OF ACTION : Vaccine.

Description

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Die einzelligen Trypanosomen (Klasse Kinetoplastida) sind die Erreger der Afrikanischen Schlafkrankheit, die unbehandelt tödlich verläuft. Das Stadium I (Hämolymphatische Phase; Lymphknotenschwellung) bleibt zunächst oft unerkannt. Nach dem Biss einer infizierten Tsetsefliege beträgt das Risiko etwa 1:100. Nach Monaten tritt in der Regel das Stadium II (Meningoenzephalitische Phase) auf. Bei der insgesamt rascher und virulenter verlaufenden Infektion mit T. b. rhodesiense kann dies auch bereits nach wenigen Wochen der Fall sein. Das Stadium II geht mit zunehmenden Verwirrungszuständen, Koordinations- und Schlafstörungen, Krampfanfällen, Apathie und Gewichtsverlust einher. Im Endstadium fallen die Patienten in einen kontinuierlichen Dämmerzustand, der der Krankheit ihren Namen gegeben hat. Im Liquor cerebrospinalis ist eine Zellvermehrung nachweisbar. Letztlich endet die Krankheit tödlich ( Dönges, 1988 ; Winkle, 2005 ). Dies liegt insbesondere daran, dass Trypanosomen wegen des ständigen Wechsels ihres variablen Oberflächenglykoproteins VSG, das die gesamte Oberfläche der Zelle bedeckt, dem Immunsystem entgehen und VSG-erkennende Antikörper gezielt über den hydrodynamischen Fluss der schwimmenden Trypanosomen von der Zelloberfläche entfernt werden ( Engstler et al., 2007 ). Sie vermehren sich deshalb schließlich ungebremst, was ohne Behandlung zum Tode der infizierten Menschen führt. Der Ansatz unserer Erfindung ist es, gerade diese Eigenschaften medizinisch zu nutzen. Insbesondere sollen Trypanosomen als Vehikel für nützliche medizinische Interventionen genutzt werden, vorausgesetzt, es gelingt, ihre Vermehrung zu unterbinden und jede parasitäre Aktivität auszuschalten.The unicellular trypanosomes (class Kinetoplastida) are the causative agents of African sleeping sickness, which is deadly if left untreated. Stage I (hemolymphatic phase, lymph node swelling) initially remains often unrecognized. After the bite of an infected tsetse fly, the risk is about 1: 100. After months, stage II (meningoencephalitic phase) usually occurs. In the overall faster and more virulent infection with T. b. This can be the case after only a few weeks. Stage II is associated with increasing states of confusion, coordination and sleep disorders, seizures, apathy and weight loss. In the final stage, the patients fall into a continuous twilight state, which has given the disease its name. In the cerebrospinal fluid, a cell proliferation is detectable. Ultimately, the disease ends fatally ( Dönges, 1988 ; Winkle, 2005 ). This is due in particular to the fact that trypanosomes escape the immune system due to the constant change of their variable surface glycoprotein VSG, which covers the entire surface of the cell, and VSG-recognizing antibodies are specifically removed from the cell surface via the hydrodynamic flow of the floating trypanosomes ( Engstler et al., 2007 ). Therefore, they multiply unchecked, which leads to the death of infected people without treatment. The approach of our invention is to use these properties medically. In particular, trypanosomes are to be used as vehicles for useful medical interventions, provided that they succeed in suppressing their multiplication and in eliminating any parasitic activity.

Die Erfindung betrifft damit Aspekte der synthetischen Biologie, nämlich die Erzeugung von modifizierten Organismen mit dem Ziel, eine medizinische günstige Verwendung zu erreichen. Wir wollen parasitische Trypanosomen, deren DNA spezifisch reduziert wurde, als therapeutische oder diagnostische Systeme in Mensch bzw. Tier einsetzen. Ein Ausführungsbeispiel verwendet hierzu ein DNAse-Gen, das durch ein induzierbares, molekularbiologisches Konstrukt in den Trypanosomen exprimiert wurde. Nach Induktion des Gens und Produktion des DNA-zerstörenden Enzyms, werden mittels Zellsortierung DNA-arme Trypanosomen isoliert. Diese können weiter transformiert und modifiziert werden und stehen dann für diagnostische und therapeutische Anwendungen als selbst bewegliche, vom Immunsystem nicht erkannte Vehikel zur Verfügung (therapeutisches System, z. B. Generierung einer Malariavakzine).The invention thus relates to aspects of synthetic biology, namely the production of modified organisms with the aim of achieving a medicinally favorable use. We want to use parasitic trypanosomes whose DNA has been specifically reduced as therapeutic or diagnostic systems in humans or animals. One embodiment uses for this purpose a DNAse gene expressed in the trypanosomes by an inducible molecular biology construct. After induction of the gene and production of the DNA-destroying enzyme, DNA-poor trypanosomes are isolated by cell sorting. These can be further transformed and modified and are then available for diagnostic and therapeutic applications as a self-agile, immune system-unrecognized vehicle (therapeutic system, eg, generation of a malaria vaccine).

Stand der Technik und technisches ProblemState of the art and technical problem

Therapeutische Vektorsysteme wurden schon vielfach untersucht ( Fu et al., 2009 ). Das bekannteste ist die Verpackung von Pharmaka in Liposomen ( Heurtault et al., 2010 ). Diese Darreichungsform erlaubt es, auch komplexere Kombinationen von Wirkstoffen in Liposomen zu konzentrieren ( Alam et al., 2010 ; Presumey et al., 2010 ). Zahlreiche weitere therapeutische Systeme sind bekannt, beispielsweise Adenviren ( Yamamoto und Curiel, 2010 ), die inhaliert werden, oder transkutane Systeme (Wirkstoffpflaster; Kim et al., 2008 ). Dennoch ist es bis heute nicht möglich, therapeutische Systeme längere Zeit im Blutstrom zu halten; sie werden dort schnell durch körpereigene Abwehr und weitere Prozesse entfernt, was ihren Einsatz prinzipiell limitiert ( Chye et al., 2010 ).Therapeutic vector systems have been studied many times ( Fu et al., 2009 ). The best known is the packaging of pharmaceuticals in liposomes ( Heurtault et al., 2010 ). This dosage form makes it possible to concentrate even more complex combinations of active substances in liposomes ( Alam et al., 2010 ; Presumey et al., 2010 ). Numerous other therapeutic systems are known, for example adenoviruses ( Yamamoto and Curiel, 2010 ), which are inhaled, or transcutaneous systems (drug patches; Kim et al., 2008 ). Nevertheless, it is still not possible to keep therapeutic systems in the bloodstream for a long time; they are quickly removed by the body's own defense and other processes, which limits their use in principle ( Chye et al., 2010 ).

Lösung: Hier setzt unsere Erfindung ein, denn Trypanosomen sind optimale Vehikel wenn es darum geht, länger unerkannt im Blutstrom zu verweilen. Zudem bringen sie eigene aktive und auch steuerbare Beweglichkeit mit. Von einem relativ neuen Forschungsfeld, der synthetischen Biologie, kommt der Ansatz Organismen nur mit einem minimalem Genom auszustatten, um damit zu gewährleisten, dass nur die essentiellen Überlebensgene vom Organismus selbst kommen und die übrigen Genomteile dann nach Wunsch ersetzt werden, um zusätzliche medizinisch oder biotechnologisch gewünschte Leistungen zu erreichen. Dies ist aber zurzeit nur für sehr kleine bakterielle Lebewesen möglich ( Gibson et al., 2010 ). Bei Trypanosomen wären zur Genomreduktion sicher tausende von Gendeletionen nötig, wobei aber die grundlegende Technologie für solche Wunschknockouts bereits vorliegt ( Sienkiewicz et al., 2010 ; Coustou et al., 2010 ).Solution: This is where our invention comes in, because trypanosomes are optimal vehicles when it comes to lingering undetected in the bloodstream for longer. They also bring their own active and controllable mobility. From a relatively new field of research, synthetic biology, the approach is to provide organisms with only a minimal genome to ensure that only the essential survival genes come from the organism itself and the remaining genome parts are then replaced as desired, to additional medical or biotechnological to achieve desired performances. However, this is currently only possible for very small bacterial creatures ( Gibson et al., 2010 ). With trypanosomes, thousands of gene deletions would certainly be necessary for genome reduction, but the basic technology for such desired knockouts already exists ( Sienkiewicz et al., 2010 ; Coustou et al., 2010 ).

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Erfindungsgemäß wird die Elimination der unnötigen Gene der Trypanosomen wesentlich umfassender und radikaler gelöst:
Transgene Trypanosomen beinhalten ein Konstrukt mit induzierbarem Promotor, bei Zugabe des Induktors im Kulturmedium (z. B. optimiertes Standardkulturmedium für Trypanosomen ( Coustou et al., 2010 )) wird dann ein Protein induziert (z. B. durch Tetrazyklin-induzierbare T7-Promotoren), welches jede weitere Vermehrung der Trypanosomen unterbindet. Sie bleiben erfindungsgemäß am Leben und sind aktiv beweglich, aber zu keiner weiteren Teilung fähig (letzteres kann weiter modifiziert werden; wichtig ist aber, dass die Trypanosomen kein ungehemmtes, parasitäres Teilungspotential mehr haben). Zahlreiche genetische Konstrukte sind zur Erzielung dieser Verwendung denkbar, z. B. wie hier offenbart, durch Verwendung der Induktion von Apoptose in den Trypanosomen ( Haines et al., 2009 ) oder selbstverständlich durch Produktion eines tödlichen Toxins ( Rosenkranz und Wink, 2008 ).According to the invention, the elimination of the unnecessary genes of the trypanosomes is solved much more comprehensively and more radically:
Transgenic trypanosomes include an inducible promoter construct upon addition of the inducer in the culture medium (eg, optimized standard trypanosomal culture medium ( Coustou et al., 2010 )), a protein is then induced (eg, by tetracycline-inducible T7 promoters), which inhibits any further proliferation prevents the trypanosomes. They remain alive according to the invention and are actively mobile, but are not capable of further division (the latter can be further modified, but it is important that the trypanosomes no longer have an unrestrained, parasitic division potential). Numerous genetic constructs are conceivable for achieving this use, e.g. As disclosed herein, by using the induction of apoptosis in the trypanosomes ( Haines et al., 2009 ) or, of course, by production of a deadly toxin ( Rosary and Wink, 2008 ).

Ausführungsbeispiel: Dagegen ist aber im Ausführungsbeispiel die erfindungsgemäße Induktion einer DNAse (1, Genkonstrukt zur Erzeugung DNA-armer Trypanosomen) eine besonders einfache und wirkungsvolle Methode, sämtliche genetische Information aus dem Zellkern der Trypanosomen zu entfernen. Das schematisch skizzierte Konstrukt pTbDNAse integriert in den transkriptionell inaktiven ribosomalen Spacer des trypanosomalen Genoms. Die Expression des Inserts (hier eine DNAse-GFP-Fusion) wird durch einen Tetrazyklin-induzierbaren T7-Promoter getrieben. Das Fusionsgen ist von in Trypanosomen besonders potenten UTRs flankiert. Mit Hilfe eines Neomycin-Resistenzgens wird auch stabile genomische Integration selektiert. Der transkriptionelle Readthrough in andere Genombereiche wird durch T7-Terminatoren verhindert. Dieses Konstrukt wird in Trypanosomen transfiziert und induzierbar zu DNA-armen führen. Die DNA-armen Trypanosomen überleben bis zu einem Tag und sind für einige Stunden noch aktiv beweglich. Die Kern-DNA-Spezifität wird durch ein nukleares Lokalisationssignal im Konstrukt erreicht; mitochondriale DNA wird nicht beschädigt. Da zunächst weiterhin mRNA und alle anderen Komponenten in der Zelle vorliegen, sind die Trypanosomen noch mehrere Stunden bis einen Tag aktiv beweglich und steuer- bzw. dirigierbar, sterben dann aber rasch ab, da kein Protein nachproduziert werden kann.By way of contrast, however, in the exemplary embodiment, the induction according to the invention of a DNAse ( 1 , Gene construct for generating DNA-poor trypanosomes) a particularly simple and effective method to remove all genetic information from the nucleus of the trypanosomes. The schematically outlined construct pTbDNAse integrates into the transcriptionally inactive ribosomal spacer of the trypanosomal genome. The expression of the insert (here a DNAse-GFP fusion) is driven by a tetracycline inducible T7 promoter. The fusion gene is flanked by UTRs that are particularly potent in trypanosomes. With the help of a neomycin resistance gene also stable genomic integration is selected. Transcriptional readthrough to other genome regions is prevented by T7 terminators. This construct is transfected into trypanosomes and inducibly lead to DNA-poor. The DNA-poor trypanosomes survive up to one day and are still actively mobile for a few hours. Core DNA specificity is achieved by a nuclear localization signal in the construct; Mitochondrial DNA is not damaged. Since initially mRNA and all other components are present in the cell, the trypanosomes are still active for several hours to a day and can be controlled or regulated, but then die quickly, since no protein can be reproduced.

Für eine therapeutische oder diagnostische Nutzung werden DNAse-positive Trypanosomen aus der Kultur mit einem Cell-Sorter selektiert, so dass in Versuchstiere bzw. Patienten nur Trypanosomen gelangen, bei denen die DNA im Zellkern bereits erheblich oder vollständig zerstört wurde, so dass keine parasitäre Gefahr mehr von ihnen ausgeht. Dies wird zudem durch Tierversuche nachgewiesen.For therapeutic or diagnostic use, DNAse-positive trypanosomes are selected from the culture with a cell sorter so that only trypanosomes are obtained in experimental animals or patients in which the DNA in the nucleus has already been significantly or completely destroyed, so that no parasitic danger more of them goes out. This is also demonstrated by animal experiments.

Weitere Ausgestaltung der ErfindungFurther embodiment of the invention

Das Ausführungsbeispiel nutzt und exprimiert also das Fremdprotein des Konstrukts in Trypanosomen. Das Konstrukt und die DNAse exprimierenden Trypanosomen werden über GFP (1) und einen Cell-Sorter erkannt und sortiert. Dies gelingt recht zuverlässig (eigene Ergebnisse). 2 demonstriert hierzu die gezielte Expression von Fremdproteinen und GFP markierte Trypanosomen. 3 illustriert die induzierte Zerstörung eines einzelnen Gens (Topoisomerase II) in Trypanosomen.The embodiment thus utilizes and expresses the foreign protein of the construct in trypanosomes. The construct and the DNAsexpressing trypanosomes are transfected via GFP ( 1 ) and a cell sorter detected and sorted. This succeeds quite reliably (own results). 2 demonstrates the targeted expression of foreign proteins and GFP-labeled trypanosomes. 3 illustrates the induced destruction of a single gene (topoisomerase II) in trypanosomes.

Detaillierte Beschreibung der Figuren: 2 (Zeichnung) stellt fluoreszierende Trypanosomen, die gezielt Fremdproteine exprimieren, dar: Die Zellen wurden mit einem Konstrukt transfiziert, welches ein GFP-Gen mit einem mitochondrialen Lokalisationssignal enthält. (A) Die resultierende, transgene Zelllinie zeigt die typische Morphologie des fluoreszierenden Mitochondriums (M); (N = Nukleus, K = Kinetoplast). (B)(C) Hier wurde die mitochondriale Marker-Zelllinie mit zwei unterschiedlichen neuen trypanoziden Wirkstoffen behandelt. Es zeigen sich in beiden Fällen drastische Veränderungen des mitochondrialen Phänotyps, was Hinweise auf den Wirkort der Substanzen geben könnte ( Hiltensberger et al., 2012 )Detailed description of the figures: 2 (Drawing) depicts fluorescent trypanosomes targeting foreign proteins: The cells were transfected with a construct containing a GFP gene with a mitochondrial localization signal. (A) The resulting transgenic cell line shows the typical morphology of the fluorescent mitochondrion (M); (N = nucleus, K = kinetoplast). (B) (C) Here, the mitochondrial marker cell line was treated with two different new trypanocidal drugs. In both cases, drastic changes of the mitochondrial phenotype are evident, which could give indications of the site of action of the substances ( Hiltensberger et al., 2012 )

3 verdeutlicht die induzierte Zerstörung eines Gens in Trypanosomen. Trypanosomen wurden mit einem Konstrukt transfiziert, das gezielt ein spezifisches Gen in Trypanosomen eliminiert (andere Zielrichtung, anderes Konstrukt als hier offenbart). (A) Nach Induktion der Genexpression durch Gabe von Tetrazyklin wird die mRNA des Topoisomerase II-Gens gezielt zerstört. Dies führt nach 96 Stunden zu einem Absterben der Parasiten. (B) Die Analyse der transgenen Trypanosomen ergab drastische Veränderungen im mitochondrialen Genom (sechs Schemazeichnungen): Vor Induktion lässt sich die mitochondriale DNA als Punkt (Pfeil in der Schemazeichnung links oben) in der Zelle erkennen. Bereits nach 48 Stunden ist das mitochondriale Genom nur noch schwer erkennbar (Pfeile in der Schemazeichnung rechts oben) und bereits nach 72 Stunden ist es vollständig verschwunden (Schemazeichnungen unten skizzieren 72, 96 und 120 Stunden nach Induktion des Topoisomerase II Genkonstruktes). 3 illustrates the induced destruction of a gene in trypanosomes. Trypanosomes were transfected with a construct that specifically eliminates a specific gene in trypanosomes (different targeting, different construct than disclosed herein). (A) After induction of gene expression by administration of tetracycline, the mRNA of the topoisomerase II gene is deliberately destroyed. This leads to a death of the parasites after 96 hours. (B) The analysis of the transgenic trypanosomes revealed drastic changes in the mitochondrial genome (six diagrams): Before induction, the mitochondrial DNA can be recognized as a dot (arrow in the upper left of the diagram) in the cell. Already after 48 hours, the mitochondrial genome is difficult to recognize (arrows in the diagram on the top right) and it has completely disappeared after 72 hours (sketch below, 72, 96 and 120 hours after induction of the topoisomerase II gene construct).

Erwünschte genetische Information kann nun außerdem in den Trypanosomen über spezielle DNA Konstrukte eingeschleust werden, die durch geeignete Methylierung etc. gegen die induzierte DNAse resistent sind. Auf diese Weise kann man dann ein sehr interessantes minimales Genom erzeugen, nämlich eines, das die transgenen Trypanosomen für eine genau definierte Zeit und ein exakt vorhersagbares Funktionsspektrum überleben lässt. Dies ist auch theoretisch von hohem Interesse, da es wieder zeigt, dass die Definition eines minimalen Genoms sehr umweltabhängig ist und wir hier mit minimalen Genomen arbeiten, die nur noch wenig erwünschte Funktionen der Trypanosomen aufrecht erhalten, aber weit unter der für eine erfolgreiche Replikation nötigen genetischen Information liegen.Desired genetic information can now also be introduced into the trypanosomes via specific DNA constructs that are resistant to the induced DNAse by appropriate methylation, etc. In this way, one can then generate a very interesting minimal genome, one that allows the transgenic trypanosomes to survive for a well-defined time and an accurately predictable spectrum of functions. This is also theoretically of great interest because it shows once again that the definition of a minimal genome is very environmentally dependent and we are working with minimal genomes that have little to do with it maintain desirable functions of the trypanosomes but are well below the genetic information necessary for successful replication.

Vorteile und Nutzungsmöglichkeiten der DNA-armen Trypanosomen (Tabelle 1):Advantages and uses of DNA-poor trypanosomes (Table 1):

  • a) Beispielsweise kann man die Trypanosomen ein Wunschprotein exprimieren lassen und dies sehr rasch im Blutstrom verteilen. Ebenso gilt das für ein Wunschtoxin (Antibiotikum, Zytostatikum, Hormon, Antikoagulans wie Streptokinase etc.). Dabei kann das effiziente Sekretionssystem der Trypanosomen (für VSG) mit Gewinn genutzt werden.a) For example, one can have the trypanosomes express a protein of interest and distribute this very quickly in the bloodstream. This also applies to a desired toxin (antibiotic, cytostatic, hormone, anticoagulant such as streptokinase etc.). The efficient secretion system of trypanosomes (for VSG) can be used profitably.
  • b) Eine wichtige Hauptanwendung ist die Herstellung eines Malariaimpfstoffes. Sehr vorteilhaft ist insbesondere die folgende Strategie: Expression der beiden Oberflächenproteine MSP1 (merozoitenspezifische) und AMA1 (hochpolymorph). Gegen Malaria ( Hill, 2011 ) sind auch die transmissionsblockierenden Proteine Pfs25 und Pfs230C interessant, ein anderes gutes Target für diese Anwendung unserer Erfindung ist PfRH5. Diese werden in die Oberfläche integriert. Die Trypanosomen stimulieren stark das Immunsystem durch die Expression der Proteine, sind aber außerdem auch hinreichend lang genug im Blutstrom.b) An important main application is the production of a malaria vaccine. In particular, the following strategy is very advantageous: Expression of the two surface proteins MSP1 (merozoite-specific) and AMA1 (highly polymorphic). Against malaria ( Hill, 2011 ), the transmission-blocking proteins Pfs25 and Pfs230C are interesting, another good target for this application of our invention is PfRH5. These are integrated into the surface. The trypanosomes strongly stimulate the immune system through the expression of the proteins, but are also sufficiently long enough in the bloodstream.
  • c) Veterinärmedizinische Anwendung: African Animal Trypanosomiasis (AAT): Eine ganze Reihe von Trypanosomen parasitieren in Pferden, Schweinen, Ziegen und besonders in Rindern. Die Übertragung kann durch die Tsetsefliege oder auch mechanisch erfolgen. Die Tierseuche Nagana ist ein immenses ökonomisches Problem in Afrika ( Magez et al., 2010 ). In Kenia und Uganda sind bis zu 50% der Rinder mit Trypanosomen infiziert. Die Tiere sterben an progressiver Auszehrung. Auch hier können spezifische Trypanosomenproteine oder für Trypanosomen toxische Peptide in unseren DAT exprimiert werden. Der Vorteil wäre, dass die Applikation unproblematisch und risikolos, aber genauso effizient wie bei einer Lebendvakzine wäre. Ein besonderer Vorteil ist die klar definierte, kurze Lebensdauer der DAT, die ein ungewolltes Infektionsrisiko sicher ausschließt.c) Veterinary use: African Animal Trypanosomiasis (AAT): A large number of trypanosomes parasitize in horses, pigs, goats and especially in cattle. The transmission can be done by the tsetse fly or mechanically. The animal disease Nagana is a huge economic problem in Africa ( Magez et al., 2010 ). In Kenya and Uganda, up to 50% of cattle are infected with trypanosomes. The animals die from progressive wasting. Again, specific trypanosome proteins or trypanosome-toxic peptides can be expressed in our DAT. The advantage would be that the application would be unproblematic and risk-free, but just as efficient as a live vaccine. A particular advantage is the clearly defined, short life of the DAT, which safely excludes an unwanted infection risk.

Die Anwendung auf tierpathogene Trypanosomen erlaubt das Funktionsprinzip zu testen und die antitrypanosomalen Effekte zu quantifizieren (siehe b und c).

  • d) Wichtig ist auch, dass die DNA-armen Trypanosomen über Chemotaxis intelligent steuerbar sind. Beispielsweise kann man sie mit Chemoattraktanten (spezifische Zytokine, vgl. Boyanova et al., 2012 ) an einen Thrombus dirigieren und über eine exprimierte Streptokinase einen Thrombus nur an dieser Stelle intelligent auflösen lassen.
  • e) Außerdem kann die Bewegung der DNA-armen Trypanosomen auch von außen, etwa durch Expression von GFP (grün leuchten) oder andere Marker (optisches oder anderes Signal) direkt verfolgt werden. Über Rezeptoren der Trypanosomen (z. B. unter „d”) sind diese aber auch direkt steuerbar.
  • f) Die DNA-armen Trypanosomen können aber auch durch Einbringen von geeigneten Genen auch mit Wunschsensoren ausgestattet werden, z. B. einen pH-, Sauerstoff- oder Redoxsensor (vgl. Design von zwei Komponentensystemen hierfür, Krüger et al., 2012 ) oder aber Rezeptoren für Tumormarker, Gefäßzustandsmarker (z. B. Zytokine), lymphatische oder neurobiologische Marker. Die physiologische Kartierung des Patienten erfolgt dann entsprechend der Trypanosomenverteilung.
  • g) Das Potential solcher neuer therapeutischer bzw. diagnostischer Systeme ist enorm. Diese DNA-armen Trypanosomen kann man mit allen anderen modernen molekularbiologischen Optionen für neue Therapien bestens kombinieren (Ribozyme ( Win et al., 2008 ), Onkolytischen Viren (z. B. Zhang et al., 2009 ), Aptamere ( Adler et al., 2008 ) etc.).
  • h) Sehr interessant ist auch die Tatsache, dass Trypanosomen über ihre variablen Oberflächenglykoproteine alle bindenden Antikörper des Immunsystems endozytieren (ehe diese Antikörper die Immunantworten des Wirtes auslösen können). Prinzipiell können alle internalisierten Antikörper für eine schnelle Analyse des aktuellen Antikörper-Status genutzt werden und mittels GFP oder anderen Indikatoren angezeigt werden. Dies kann z. B. für den Nachweis von Autoantikörpern wie antinukleäre Faktoren genutzt werden.
  • i) Selbstverständlich können die DNA-armen Trypanosomen auch zur Elimination von Wildtyp Trypanosomen genutzt werden. Eine Möglichkeit ist mit einem Genkonversions-Konstrukt (z. B. DP DE 10 2006 021 51 684 ).
The application to animal pathogenic trypanosomes allows to test the functional principle and to quantify the antitrypanosomal effects (see b and c).
  • d) It is also important that the DNA-poor trypanosomes are intelligently controlled via chemotaxis. For example, they can be mixed with chemoattractants (specific cytokines, cf. Boyanova et al., 2012 ) to a thrombus and intelligently dissolve a thrombus only at this site using an expressed streptokinase.
  • e) In addition, the movement of the DNA-poor trypanosomes can also be directly monitored from the outside, for example by expression of GFP (green light) or other markers (optical or other signal). Via receptors of the Trypanosomen (eg under "d") these are however also directly controllable.
  • f) The DNA-poor trypanosomes can also be equipped by introducing appropriate genes with desire sensors, z. B. a pH, oxygen or redox sensor (see Design of two component systems for this, Krüger et al., 2012 ) or receptors for tumor markers, vascular state markers (eg cytokines), lymphatic or neurobiological markers. The physiological mapping of the patient then takes place according to the distribution of trypanosomes.
  • g) The potential of such new therapeutic or diagnostic systems is enormous. These DNA-poor trypanosomes can be optimally combined with all other modern molecular biology options for new therapies (ribozyme ( Win et al., 2008 ), Oncolytic viruses (e.g. Zhang et al., 2009 ), Aptamers ( Adler et al., 2008 ) Etc.).
  • h) Very interesting is also the fact that trypanosomes endocytose all binding antibodies of the immune system via their variable surface glycoproteins (before these antibodies can trigger the immune responses of the host). In principle, all internalized antibodies can be used for rapid analysis of the current antibody status and displayed using GFP or other indicators. This can be z. B. be used for the detection of autoantibodies such as antinuclear factors.
  • i) Of course, the low-DNA trypanosomes can also be used for the elimination of wild-type trypanosomes. One possibility is with a gene conversion construct (eg, DP DE 10 2006 021 51 684 ).

Tabelle 1: Anwendungen – DNA-arme Trypanosomen (DAT) können u. a. verwendet werden für: Anwendung Modifikation der DAT Expression eines therapeutischen Proteins Transformation mit Proteinexpressionskonstrukt Vakzine Spezifische Expression in DAT stark stimulierender Proteine gegen den Erreger. Malariavakzine Sehr geeignet hierfür sind MSP1, AMA1, EMP1, Pfs25, Pfs230C, PfRH5 zur Erzielung einer Malariavakzine mit nachhaltiger Wirkung. Trypanosomenvakzine Dies kann zum einen Menschen vor der Schlaf-Krankheit schützen, noch schneller ist aber der Schutz von Tieren zu erzielen. Steuerung von DAT über Chemotaxis Nutzung von natürlicher DAT-Chemotaxis, Nutzung eines Rezeptorexpressionskonstruktes Monitoring der DAT Verteilung GFP oder anderes Fluoreszens- bzw. Markerkonstrukt in DAT transformieren Zusätzliche Sensoren für DAT Transformation von DAT mit Sensorkonstrukt Therapeutische Modifikationen Einbringen von Konstrukten mit Ribozymen, onkolytischen Viren, Aptameren Immunstatus-Screen Einbringen eines Indikatorkonstruktes für interessierende gescreente Antikörper Trypanosomen-Elimination DAT mit Genkonversionskonstrukt, mit Toxin Table 1: Applications - DNA poor trypanosomes (DAT) can be used for: application Modification of the DAT Expression of a therapeutic protein Transformation with protein expression construct vaccine Specific expression in DAT strongly stimulating proteins against the pathogen. malaria vaccine Very suitable for this purpose are MSP1, AMA1, EMP1, Pfs25, Pfs230C, PfRH5 for achieving a malaria vaccine with lasting effects. Trypanosomenvakzine This can, on the one hand, protect people from sleeping sickness, but the protection of animals is even faster. Control of DAT via chemotaxis Use of natural DAT chemotaxis, use of a receptor expression construct Monitoring the DAT distribution Transform GFP or other fluorescence or marker construct into DAT Additional sensors for DAT Transformation of DAT with sensor construct Therapeutic modifications Introduction of constructs with ribozymes, oncolytic viruses, aptamers Immune status screen Introducing an indicator construct for screened antibodies of interest Trypanosome Elimination DAT with gene conversion construct, with toxin

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Claims (2)

Hauptanspruch 1: Trypanosomen, die kein vollständig funktionsfähiges Genom haben, nämlich Trypanosomen mit gezielt reduzierter, unvollständiger parasitärer trypanosomaler DNA (im Folgenden mit „Verminderung” bezeichneter Prozess) werden für Therapie und/oder Diagnostik bei Mensch und/oder Tier genutzt. Nebenanspruch 1.1: Dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Verminderung über ein eingeschleustes Konstrukt in den Trypanosomen erzielt wird, z. B. über eine induzierbare oder nicht induzierbare DNAse. Nebenanspruch 1.2: Dadurch gekennzeichnet, dass die Verminderung der DNA vor Verabreichung an Menschen/Patienten oder zu untersuchende oder zu behandelnde Tiere über eine unabhängige Methode, z. B. Durchflusszytometrie, überprüft und verifiziert wird. Nebenanspruch 1.3: Dadurch gekennzeichnet, dass die nach Nebenanspruch 1.1 und 1.2 behandelten Trypanosomen ihre DNA nicht mehr replizieren können und dadurch unschädlich werden. Nebenanspruch 1.4: Dadurch gekennzeichnet, dass in die in Nebenanspruch 1.1–1.3 beschriebenen Trypanosomen nun spezifische Gene, die gegen das Konstrukt geschützt sind, transfiziert werden. Nebenanspruch 1.5: Dadurch gekennzeichnet, dass die in Hauptanspruch 1 und Nebenanspruch 1.1–1.4 beschriebenen Trypanosomen nun günstige Gene erhalten (etwa GFP oder andere Marker- oder Sensor- oder Rezeptorproteine) und das diese diagnostisch genutzt werden können. Nebenanspruch 1.6: Dadurch gekennzeichnet, dass die in Hauptanspruch 1 und Nebenanspruch 1.1–1.4 beschriebenen Trypanosomen nun günstige Gene erhalten (etwa Toxine oder Streptokinase) und das diese therapeutisch genutzt werden können (etwa auch mit spezifischer Lenkung, etwa durch Nutzung von Chemotaxis in diesen Trypanosomen). Nebenanspruch 1.7: Dadurch gekennzeichnet, dass die Expression von Proteinen in den DAT genutzt wird, um einen besonders wirkungsvollen Impfstoff herzustellen, der zum Beispiel Menschen oder bestimmte Tiere gegen Malaria oder Trypanosomen besser schützt.Main claim 1: Trypanosomes that do not have a fully functional genome, namely trypanosomes with targeted reduced, incomplete parasitic trypanosomal DNA (hereafter referred to as "diminution" process) are used for therapy and / or diagnosis in humans and / or animals. Nebenanspruch 1.1: Characterized in that the DNA reduction is achieved via an introduced construct in the trypanosomes, z. B. via an inducible or non-inducible DNAse. Nebenanspruch 1.2: Characterized in that the reduction of the DNA prior to administration to humans / patients or animals to be examined or treated by an independent method, eg. B. flow cytometry, checked and verified. Nebenanspruch 1.3: Characterized in that the treated by Nebenanspruch 1.1 and 1.2 trypanosomes can no longer replicate their DNA and are harmless. Nebenanspruch 1.4: Characterized in that in the trypanosomes described in subclaim 1.1-1.3 now specific genes that are protected against the construct are transfected. Nebenanspruch 1.5: Characterized in that the main claim 1 and subclaim 1.1-1.4 described trypanosomes now get cheap genes (such as GFP or other marker or sensor or receptor proteins) and that they can be used diagnostically. Nebenanspruch 1.6: Characterized in that described in main claim 1 and subclaim 1.1-1.4 trypanosomes now get cheap genes (such as toxins or streptokinase) and this can be used therapeutically (about with specific guidance, such as by using chemotaxis in these trypanosomes ). Subclaim 1.7: Characterized in that the expression of proteins in the DAT is used in order to produce a particularly effective vaccine which, for example, better protects humans or certain animals against malaria or trypanosomes. Hauptanspruch 2: Dadurch gekennzeichnet, dass die Erzeugung von Organismen wie in Hauptanspruch 1 beschrieben und insbesondere an Trypanosomen wie etwa im zugehörigen Nebenanspruch 5 ausgeführt erstmals minimale Genome als besonders stark minimiert nur bezüglich einer erstrebten Funktion oder einem Funktionsmodul aus mehreren Genen beschreibt, ohne die Notwendigkeit von eigener aktiver Replikation des verwendeten Organismus (diese im Gegenteil aus medizinischen Gründen nicht zulässt) und auch von anderen „grundlegenden” Modulen aus Genen (z. B. für die Synthese von Ribosomen oder das Zytoskelett) Abstand genommen werden kann, was erst die breite Nutzung von Organismen aus der synthetischen Biologie für biotechnologische Anwendungen (Proteinexpression, intelligent gesteuerte molekularbiologische Prozesse, Nanofactories) möglich macht.Main claim 2: characterized in that the generation of organisms as described in main claim 1 and in particular to trypanosomes such as in the accompanying dependent claim 5 executed first minimal genomes as particularly strongly minimized only with respect to a desired function or a functional module of several genes describes without the need from active replication of the used organism (on the contrary, it does not allow it for medical reasons) and also from other "basic" modules of genes (eg for the synthesis of ribosomes or the cytoskeleton), which is only the broad one Use of organisms from synthetic biology for biotechnological applications (protein expression, intelligently controlled molecular biology processes, nanofactories).
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