DE102011086568A1

DE102011086568A1 - Amplifying signals in heterogeneous binding assays based on donor or receptor complex, comprises adding particle of first particle class and particle of second particle class to donor or receptor complex and optionally repeating steps

Info

Publication number: DE102011086568A1
Application number: DE201110086568
Authority: DE
Inventors: Peter Miethe; Marko Pietraszczyk
Original assignee: fzmb Forschungszentrum fur Medizintechnik und Biotechnologie GmbH; fzmb GmbH Forschungszentrum fur Medizintechnik und Biotechnologie
Current assignee: fzmb Forschungszentrum fur Medizintechnik und Biotechnologie GmbH; fzmb GmbH Forschungszentrum fur Medizintechnik und Biotechnologie
Priority date: 2010-11-17
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2012-05-24

Abstract

Amplifying signals in heterogeneous binding assays based on a donor or receptor complex (1) made of a receptor molecule (10) and a donor molecule (20), which is bound by the receptor molecule, comprises: (a) forming donor or receptor complex; (b) adding at least one particle of a first particle class to the donor or receptor complex, where at least one particle of first particle class (n) is coupled with the donor or receptor complex, the particles of the first particle class further comprises binding site; and (d) optionally repeating the steps, preferably the step (b) and (c) at least once. Amplifying signals in heterogeneous binding assays based on a donor or receptor complex (1) made of a receptor molecule (10) and a donor molecule (20), which is bound by the receptor molecule, comprises: (a) forming donor or receptor complex; (b) adding at least one particle of a first particle class to the donor or receptor complex, where at least one particle of first particle class (n) is coupled with the donor or receptor complex, the particles of the first particle class further comprises binding site, which can couple to at least one particle of a second particle class (m), where n is a natural number, which is >= 2, and the particle of a second particle class comprises binding site, which can couple to at least one particle of the first particle class, where m is a natural number, which is >= 2; (c) adding at least one particle of a second particle class; and (d) optionally repeating the steps, preferably the step (b) and (c) at least once.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verstärkung von Signalen in heterogenen Bindungsassays auf Basis von Donator/Rezeptorkomplexen, insbesondere Ligand-Rezeptorkomplexen.The present invention relates to a method for amplifying signals in heterogeneous binding assays based on donor / receptor complexes, in particular ligand-receptor complexes.

Heterogene Bindungsassays sind in Form von Enzyme Linked Immuno Sorbent Assays (ELISA) sehr weit verbreitet. Bei ihnen werden Konjugate bestehend aus einem Detektionsantikörper und einem Enzym, vorzugsweise Meerettichperoxididase oder alkalische Phosphatase eingesetzt um nach Zugabe eines Substrates ein kolorimetrisch, fluorimetrisch oder luminometrisch gut detektierbares Signal zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die gute Sensitivität die beispielsweise bei Proteinen Nachweisgrenzen im Bereich von einigen pg/ml zulässt. Ihr Hauptnachteil ist die Störanfälligkeit, insbesondere die starke Temperaturabhängigkeit der Enzymreaktion und die Notwendigkeit die benötigten Reagenzien (Konjugate, Substrate) bei 4°C zu lagern. Diese Nachteile können umgangen werden, wenn an Stelle des Enzymkonjugates ein Farbstoffkonjugat eingesetzt wird. Insbesondere in Form von Goldpartikel-Antikörper oder Farbpartikel-Antikörper Konjugaten lassen sich damit einfache und gut zu lagernde heterogene Testsysteme herstellen. Zu den bekanntesten Bauformen können die in US-A-6,485,982 offenbarten lateral flow Teststreifen oder Testsäulen WO-A-92/05442 , WO-A-94/09365 oder WO-A-95/19569 gezählt werden. Ein Nachteil dieser Formate ist ihre geringe Sensitivität, die bei Proteinen nur Nachweisgrenzen im Bereich von ca. 1 ng/ml zulässt.Heterogeneous binding assays are very widespread in the form of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). In them, conjugates consisting of a detection antibody and an enzyme, preferably horseradish peroxididase or alkaline phosphatase are used in order to obtain a colorimetrically, fluorimetrically or luminometrically well detectable signal after addition of a substrate. The main advantage of this technique is the good sensitivity which, for example, allows for protein detection limits in the range of a few pg / ml. Their main disadvantage is the susceptibility, in particular the strong temperature dependence of the enzyme reaction and the need to store the required reagents (conjugates, substrates) at 4 ° C. These disadvantages can be avoided if a dye conjugate is used instead of the enzyme conjugate. In particular, in the form of gold-particle antibodies or color-particle-antibody conjugates, it is thus possible to produce simple and easily stored heterogeneous test systems. Among the best known types can be found in US-A-6,485,982 disclosed lateral flow test strips or test columns WO-A-92/05442 . WO-A-94/09365 or WO 95/19569 be counted. A disadvantage of these formats is their low sensitivity, which only allows detection limits in the range of about 1 ng / ml for proteins.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren anzugeben, mit dem es gelingt die Empfindlichkeit der Analytik mit heterogenen Assays zu erhöhen, ohne eine enzymatische Verstärkungsreaktion einsetzen zu müssen.The invention is based on the object of specifying a method with which it is possible to increase the sensitivity of the analysis with heterogeneous assays, without having to use an enzymatic amplification reaction.

Gelöst wird diese Aufgabe gemäß der Erfindung durch ein Verfahren zur Verstärkung von Signalen in heterogenen Bindungsassays auf Basis von Donator/Rezeptorkomplexen, wobei

– in einem ersten Schritt ein Donator/Rezeptorkomplex 1, gebildet wird,
– danach in einem zweiten Schritt mindestens ein Partikel einer ersten Partikelklasse zu dem gebildeten Donator/Rezeptorkomplex 1 gegeben wird,
– der mindestens eine Partikel der ersten Partikelklasse an den Donator/Rezeptorkomplex 1 koppelt und
– der mindestens eine an den Donator/Rezeptorkomplex 1 gekoppelte Partikel der ersten Partikelklasse n ≥ 2, wobei n eine natürliche Zahl ist, weitere Bindungsstelle aufweist, an die mindestens ein Partikel einer zweiten Partikelklasse koppeln kann,
– der Partikel der zweiten Partikelklasse seinerseits mindestens m ≥ 2, wobei m eine natürliche Zahl ist, Bindungsstellen aufweist an die mindestens ein Partikel der ersten Partikelklasse koppeln kann,
– in einem dritten Schritt mindestens ein Partikel der zweiten Partikelklasse zugegeben wird und
– gegebenenfalls die Schritte, insbesondere der zweite und dritte Schritt, mindestens einmal wiederholt werden.

This object is achieved according to the invention by a method for amplifying signals in heterogeneous binding assays based on donor / receptor complexes, wherein

- In a first step, a donor / receptor complex 1 , is formed,
- Then in a second step, at least one particle of a first particle class to the donor / receptor complex formed 1 is given
- The at least one particle of the first particle class to the donor / receptor complex 1 couples and
- the at least one to the donor / receptor complex 1 coupled particles of the first particle class n ≥ 2, where n is a natural number, has a further binding site to which at least one particle of a second particle class can couple,
The particle of the second particle class is in turn at least m ≥ 2, where m is a natural number, has binding sites to which at least one particle of the first particle class can couple,
- In a third step, at least one particle of the second particle class is added and
If appropriate, the steps, in particular the second and third steps, are repeated at least once.

Erfindungsgemäß wird unter dem Begriff Donator eine chemische Entität, insbesondere ein Molekül oder Molekülverband verstanden, der mit einem Rezeptor, der ebenfalls eine chemische Entität, insbesondere ein Molekül oder Molekülverband ist, eine starke Wechselwirkung ausübt. Diese Wechselwirkung führt zu der Ausbildung einer Koppelung zwischen Donator und Rezeptor. Die Kopplung ist eine spezifische Wechselwirkung deren Spezifität insbesondere durch die zur Charakterisierung von chemischen Komplexen verwendeten Größen erfassbar ist. Dies ist beispielsweise die Dissoziationskonstante K_D (reziprok zur Assoziationskonstanten), die sich aus dem Massenwirkungsgesetz ergibt. Generell gilt, je kleiner K_D, desto stärker ist die Bindung zwischen den den Komplex bildenden Komponenten Donator und Rezeptor. Typische Dissoziationskonstanten, die bei Bindung von Antikörpern vom IgG-Typ auftreten, liegen im Bereich von 10^–4–10^–11 M, für das Donator-Rezeptor-Paar Biotin/Avidin liegt die Wechselwirkung im Bereich von 10^–14 und 10^–15 M. Diese kann z. B. durch elektrostatische Wechselwirkungen oder solche die durch Polarisierungen (Wasserstoffbrückenbindungen) entstehen, aber auch durch sogenannte van der Waals Attraktionen vermittelt werden. Oftmals werden diese Wechselwirkungen auch durch komplementäre Strukturelemente an der Oberfläche der jeweiligen Moleküle oder Molekülverbände ermöglicht. Dabei kann, je nach Betrachtungsweise, auch der Donator ein Rezeptor des Rezeptormoleküls sein. Dies wir deutlich beim Vergleich der Donator/Rezeptorpaare Avidin/Biotin, bei dem jeweils einer der Partner als Donator für den anderen, dann den Rezeptor darstellenden Part fungiert. Üblicherweise wird ein niedrigmolekularer Donator in Komplexen mit sehr großen Molekülen, beispielsweise Enzymen oder Neurorezeptoren, als Ligand bezeichnet.According to the invention, the term donor is understood to mean a chemical entity, in particular a molecule or molecular structure, which interacts strongly with a receptor, which is likewise a chemical entity, in particular a molecule or a group of molecules. This interaction leads to the formation of a coupling between donor and receptor. The coupling is a specific interaction whose specificity can be detected in particular by the variables used for the characterization of chemical complexes. This is, for example, the dissociation constant K _D (reciprocal to the association constant), which results from the law of mass action. Generally, the smaller K _D , the stronger the binding between the complex-forming components donor and receptor. Typical dissociation constants that occur upon binding of IgG-type antibodies are in the range of 10 ^-4 -10 ^-11 M, for the donor-receptor pair biotin / avidin, the interaction is in the range of 10 ^-14 and 10 ^-15 M. This can be z. As by electrostatic interactions or those caused by polarization (hydrogen bonds), but also by so-called van der Waals attractions are taught. Often, these interactions are also made possible by complementary structural elements on the surface of the respective molecules or molecular assemblies. Depending on the viewpoint, the donor may also be a receptor of the receptor molecule. This is clearly shown in the comparison of the donor / receptor pairs avidin / biotin, in which one of the partners acts as a donor for the other, then the receptor-representing part. Usually, a low molecular weight donor in complexes with very large molecules, for example, enzymes or neuroreceptors, is called a ligand.

Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt insbesondere einen Immunkomplex als Donator/Rezeptorkomplex 1. Darunter wird ein Komplex aus einem Liganden, der ein Hapten oder Antigen sein kann und einem Molekül, das in der Immunreaktion eines Organismus mit Immunsystem bei der Erkennung von molekularen Strukturen, insbesondere Epitopen eine Rolle spielt, zum Beispiel Antikörper unabhängig von ihrer Klasse, oder Fragment dieser Antikörper, verstanden. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der Zugabe des mindestens einen Partikels der zweiten Partikelklasse im dritten Schritt mindestens ein Partikel einer dritten, von den Partikeln der ersten Partikelklasse unterschiedlichen Partikelklasse zugegeben werden. Dies weist den Vorteil auf, dass eine Kompetition der Partikel der ersten Partikelklassen miteinander ausgeschlossen ist.In particular, the method according to the invention uses an immune complex as donor / receptor complex 1 , Among them is a complex of a ligand, which may be a hapten or antigen and a molecule involved in the immune response of an immune system in the detection of molecular Structures, in particular epitopes, for example, antibodies regardless of their class, or fragment of these antibodies, understood. In one embodiment of the method according to the invention, at least one particle of a third particle class different from the particles of the first particle class may be added to the addition of the at least one particle of the second particle class in the third step. This has the advantage that a competition of the particles of the first particle classes is excluded.

Die Partikel weisen zumindest eine Bindungsstelle auf, die mit einer anderen Bindungsstelle einer anderen Partikelklasse einen Donator-Rezeptor-Komplex ausbilden kann. Dazu werden die Partikel, sofern sie nicht bereits von Natur aus solche Bindungsstellen aufweisen, modifiziert durch chemische Reaktionen, die die entsprechenden Donator- oder Rezeptormoleküle an der Oberfläche der Partikel der unterschiedlichen Partikelklasse binden. So kann beispielsweise an der Oberfläche der Partikelklasse 1 Avidin angeordnet sein, das dann mit dem Immunkomplex bindet, sofern dieser ein biotinylierter ist, wohingegen dann die Partikel der Partikelklasse 2 wiederum mit Biotinmolekülen an ihrer Oberfläche versehen sind, die dann an die Partikel der Partikelklasse 1 binden können.The particles have at least one binding site which can form a donor-receptor complex with another binding site of another particle class. For this purpose, the particles, unless they are inherently such binding sites, modified by chemical reactions that bind the corresponding donor or receptor molecules on the surface of the particles of different particle class. Thus, for example, avidin can be arranged on the surface of the particle class 1, which then binds with the immune complex, provided that it is biotinylated, whereas the particles of particle class 2 are then provided with biotin molecules on their surface, which then adhere to the particles of particle class 1 can bind.

Methoden, um die entsprechenden Donator- und Rezeptoreinheiten an den Partikeln der jeweiligen Partikelklasse zu binden, hängen von der Natur des Partikels und der Natur der Donator/Rezeptormoleküle, die zu koppeln sind, ab. Dem Fachmann steht dazu ein Arsenal von verschiedenen Möglichkeiten zur Verfügung, um jeweils für das entsprechende Problem geeignete Lösungen zu finden. Sofern die chemische Natur der Donator/Rezeptormoleküle dies zulässt, können diese bereits direkt an der Oberfläche der Partikel gekoppelt werden, es besteht aber auch die Möglichkeit, diese über sogenannte Spacer an der Oberfläche der Partikel zu binden. Sind die Partikel chemisch mehr oder weniger inert, kann in vorgelagerten Schritten die Oberfläche der Partikel chemisch aufbereitet werden, um Bindungen mit den insbesondere organischen Molekülen des Typs der Donatoren/Rezeptoren zu ermöglichen oder man kann die chemisch inerten Partikel mit modifizierbaren Beschichtungen versehen.Methods for binding the appropriate donor and receptor moieties to the particles of the particular particle class depend on the nature of the particle and the nature of the donor / receptor molecules to be coupled. The skilled person has at his disposal an arsenal of various possibilities in order to find suitable solutions for the respective problem. If the chemical nature of the donor / receptor molecules allows this, they can already be coupled directly to the surface of the particles, but it is also possible to bind them via so-called spacers on the surface of the particles. If the particles are chemically more or less inert, the surface of the particles can be chemically treated in upstream steps in order to allow bonds with the particular organic molecules of the donor / receptor type, or the chemically inert particles can be provided with modifiable coatings.

Erfindungsgemäß können in einer Ausführungsform n und m jeweils > 2, insbesondere 3–10 sein. Bei n, m = 2 bildet sich eine lineare Verstärkung und bei n, m = 3 bereits eine flächige Verstärkung aus.According to the invention, in one embodiment, n and m can each be> 2, in particular 3-10. At n, m = 2 a linear amplification is formed and at n, m = 3 already a planar amplification.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung weisen die Partikel der ersten und zweiten Partikelklasse ungefähr die gleiche Größe oder unterschiedliche Größe auf. Typischerweise können Nanopartikel oder Biopolymere verwendet werden. Die Partikelgröße ist von der jeweils verwendeten Sorte und/oder von dem jeweiligen Assay zugrunde liegenden Bedingungen abhängig und kann vom Fachmann mittels seiner durchschnittlichen Kenntnisse angepasst und gewählt werden. Typischerweise können die Partikel eine mittlere Größe von 5 nm bis 5 μm aufweisen, wobei dabei eine annähernd sphärische Form angenommen wird. Sollten die Partikel eine sehr unregelmäßige Form aufweisen sind diese Werte als deren größte Ausdehnung in einer Raumrichtung anzusehen. Erfindungsgemäß können als Partikel der Partikelklasse organische oder anorganische Partikel oder Kombinationen davon eingesetzt werden.In another embodiment of the invention, the particles of the first and second particle classes have approximately the same size or different size. Typically, nanoparticles or biopolymers can be used. The particle size depends on the particular type used and / or on the conditions underlying the respective assay and can be adapted and selected by the person skilled in the art by means of his average knowledge. Typically, the particles may have a mean size of 5 nm to 5 μm, assuming an approximately spherical shape. If the particles have a very irregular shape, these values should be regarded as their largest extension in a spatial direction. According to the invention, particles of the particle class may be organic or inorganic particles or combinations thereof.

Als anorganische Partikel können im erfindungsgemäßen Verfahrens insbesondere Goldpartikel, magnetische Partikel, oder als organische Partikel, Partikel aus Polymeren und Biopolymeren, z. B. Latex, Proteine, insbesondere fluoreszierende Proteine wie Phycoerythrin, Phycocyanin, oder Zellulosederivate, Dextranderivate eingesetzt werden.As inorganic particles in the process according to the invention, in particular gold particles, magnetic particles, or as organic particles, particles of polymers and biopolymers, for. As latex, proteins, in particular fluorescent proteins such as phycoerythrin, phycocyanin, or cellulose derivatives, dextran derivatives are used.

Typische Partikel sind Goldpartikel mit mittleren Durchmessern von 5–50 nm, insbesondere 10–20 nm, Latexpartikel mit Farbstoff oder Fluoreszenzfarbstoff in einer Polymermatrix mit mittleren Durchmessern von 10 nm–4 μm, insbesondere 100 nm–400 nm), Farbstoffdispersionen mit Partikeln mit mittleren Durchmessern von 100 nm–500 nm, wie sie in WO-A-97/19354 offenbart sind, Magnetpartikel mit mittleren Durchmessern in einer Größe von 10 nm–4 μm, insbesondere 40 nm–400 nm oder Polymere, insbesondere Biopolymere wie Proteine insbesondere fluoreszierende Proteine wie Phycoerythrin, Phycocyanin, oder Zellulosederivate, Dextranderivate.Typical particles are gold particles with mean diameters of 5-50 nm, in particular 10-20 nm, latex particles with dye or fluorescent dye in a polymer matrix with average diameters of 10 nm-4 .mu.m, in particular 100 nm-400 nm), dye dispersions with particles having medium Diameters of 100 nm-500 nm, as in WO 97/19354 Magnetic particles having a mean diameter in a size of 10 nm-4 .mu.m, in particular 40 nm-400 nm or polymers, in particular biopolymers such as proteins, in particular fluorescent proteins such as phycoerythrin, phycocyanin, or cellulose derivatives, dextran derivatives.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Partikel der ersten, zweiten und/oder dritten Partikelklasse detektierbar.In a further embodiment of the method according to the invention, the particles of the first, second and / or third particle class are detectable.

Die freien Bindungsstellen der ersten und zweiten Partikelklassen können in einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wechselseitig durch ein Ligand/Rezeptorpaar als Donator/Rezeptorpaar gebildet werden. So kommen beispielsweise als wechselseitige Ligand/Rezeptorpaare Avidin/Streptavin, Protein A/IgG, insbesondere der F_C Teil von IgG, Lektin/Oligosaccarid, Polymerbindungsdomaine/Biopolymer, anti Hapten-Antikörper/Hapten oder Kombinationen davon in Betracht.In one embodiment of the method according to the invention, the free binding sites of the first and second particle classes can be mutually formed by a ligand / receptor pair as donor / receptor pair. Thus, for example, as mutual ligand / receptor pairs avidin / streptavin, Protein A / IgG, especially the F _C portion of IgG, lectin / oligosaccharide, polymer binding domain / biopolymer, anti hapten antibody / hapten or combinations thereof.

Die Detektion der detektierbaren Partikel erfolgt insbesondere durch optische Methoden wie Durchlichtphotometrie, Reflektometrie, Fluorimetrie, Luminometrie, Bestimmung der Brechzahl und Doppelbrechung, durch bildgebende Verfahren, durch elektrische Methoden wie Konduktometrie, Potentiometrie, oder magnetische Methoden wie lineare und nichtlineare Suszeptometrie und Relaxometrie auf Basis von Giant Magnetic Resistoren, Hallsensoren, Flux Gate Sensoren, Squids oder Induktionsspulen.The detectable particles are detected in particular by optical methods such as transmitted light photometry, reflectometry, fluorimetry, luminometry, determination of the refractive index and birefringence, by imaging methods, by electrical methods such as conductometry, potentiometry, or magnetic methods such as linear and nonlinear susceptometry and relaxometry based on Giant Magnetic Resistors, Hall Sensors, Flux Gate Sensors, Squids or Induction Coils.

1A zeigt schematisch die Ausbildung eines Immunkomplexes aus auf einer Festphase immobilisiertem Antikörper und einem Liganden. 1A shows schematically the formation of an immune complex of immobilized on a solid phase antibody and a ligand.

1B zeigt schematisch die Bindung eines Partikels der Klasse 1 an den Immunkomplex. Der Partikel der Klasse 1 besitzt Spezifitäten gegen den Analyten (n1 = 4) sowie gegen Partikel der Partikelklasse 2 (n2 = 4). 1B Figure 3 shows schematically the binding of a class 1 particle to the immune complex. The particle of class 1 has specificities against the analyte (n1 = 4) as well as particles of particle class 2 (n2 = 4).

1C zeigt schematisch die Situation, die vorliegt, wenn Partikel der Klasse 2 (m = 8) an das Aggregat gemäß 1B gebunden haben. 1D zeigt schematisch die Situation nach mehrmaligem Durchlaufen des erfindungsgemäßen Verfahrens. 1C schematically shows the situation that exists when Class 2 particles (m = 8) to the aggregate according to 1B have tied. 1D schematically shows the situation after repeated passage through the method according to the invention.

Die 2A–D zeigen die Ausbildung der Verstärkung, die gemäß 1 allgemein beschrieben wurde für eine Ausführungsform, bei der Avidin an den Partikeln der Klasse 1 und Biotin an den Partikeln der Klasse 2 immobilisiert sind.The 2A -D show the training of reinforcement, according to 1 has been described generally for an embodiment in which avidin is immobilized on the class 1 particles and biotin on the class 2 particles.

Die 3A–D zeigen eine zu der Ausführungsform gemäß 2A–2D analoge Durchführung der Verstärkungsreaktion, wobei die Partikel der Klasse 2 als Proteinmoleküle 52 (hier BSA) ausgeführt sind.The 3A D show an embodiment according to the embodiment 2A - 2D analogous performance of the amplification reaction, wherein the particles of class 2 as protein molecules 52 (here BSA) are executed.

Die 4A–D zeigen die Ausbildung der Verstärkung, die gemäß 1 allgemein beschrieben, wurde für eine Ausführungsform, bei der Antikörper gegen FITC und Antikörper gegen den zu bestimmenden Analyten an den Partikeln der Klasse 1 und FITC an den Partikeln der Klasse 2 immobilisiert sind.The 4A -D show the training of reinforcement, according to 1 has been generally described, has been for an embodiment in which antibodies against FITC and antibodies against the analyte to be determined on the particles of class 1 and FITC are immobilized on the particles of class 2.

Die 5A–D zeigen die Ausbildung der Verstärkung, in einem indirekten serologischen Assay zum Nachweis von IgG für eine Ausführungsform, in der drei Partikelklassen zum Einsatz gelangen. Dabei sind Antikörper gegen die F_C-Region eines Antikörpers der den Analyten bindet und Biotin an den Partikeln der Klasse 1, Avidin an Partikeln der Klasse 2 und Biotin an den Partikeln der Klasse 3 immobilisiert.The 5A -D show the formation of the amplification, in an indirect serological assay for the detection of IgG for an embodiment in which three particle classes are used. Antibodies to the F _C region of an antibody that binds the analyte and biotin to the particles of class 1, avidin to particles of class 2 and biotin to the particles of class 3 are immobilized.

Die 6A–D zeigen die Ausbildung der Verstärkung in einem Kompetitionsassay.The 6A -D show the formation of reinforcement in a competition assay.

Die 7A–D zeigen Histogramme der Zunahme der Signale in Abhängigkeit von durchgeführten Zyklen.The 7A -D show histograms of the increase of the signals as a function of performed cycles.

Detaillierte Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention

1A–D zeigt in schematisierter Form eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Das damit verbundene Prinzip beleuchtet den Aufbau des erfindungsgemäßen Verfahrens und dessen Ergebnis. Auf einem Träger 15 sind Rezeptormoleküle 10 immobilisiert, die mit einem Donatormolekül 20 einen Donator-/Rezeptorkomplex 1 ausbilden können. Dieser Rezeptor/Donatorkomplex 1 besteht aus dem Rezeptor 10 und Donator 20. Danach wird in einem zweiten Schritt ein Partikel 40 an dessen Oberfläche ebenfalls Rezeptormoleküle 41 immobilisiert sind, die mit dem Donator 20 eine Bindung eingehen können, versetzt. Die Partikel 40 der Partikelklasse 1 binden mithin an den Donator-/Rezeportkomplex. Die Partikel 40 der Partikelklasse 1 weisen neben den Rezeptormolekülen 10 Gruppen 16 auf, die mit komplementären Gruppen 18 auf Partikeln 50 der Partikelklasse 2 in Wechselwirkung treten können. Die auf dem Partikel 40 der Partikelklasse 1 angeordneten zusätzlichen Rezeptormoleküle 10, die mit den komplementären am Partikel 50 der Klasse 2 immobilisierten Molekülen, quasi Donatorenmoleküle 20, in Wechselwirkung treten können, sorgen für eine dauerhafte Wechselwirkung zwischen den Partikeln 40 der Klasse 1 und den Partikeln 50 der Klasse 2. Danach sorgt die weitere Zugabe von Partikeln 40 der Klasse 1, die mit freien Donatoren Molekülen 18 auf den Partikeln 50 der Partikelklasse 2 Wechselwirken für eine weitere Verstärkung des gebildeten Multipartikelkomplexes. Dabei wirken die Moleküle 18 der Partikelklasse 2 praktisch als Rezeptoren für die im vorigen Schritt noch als Rezeptoren auf den Partikeln 40 der Partikelklasse 2 bezeichneten, in diesem Schritt allerdings als Donatoren 20 wirkenden Molekülen. 1A D shows in diagrammatic form an embodiment of the present invention. The associated principle illuminates the structure of the method according to the invention and its result. On a carrier 15 are receptor molecules 10 immobilized with a donor molecule 20 a donor / receptor complex 1 can train. This receptor / donor complex 1 consists of the receptor 10 and donor 20 , Thereafter, in a second step, a particle 40 on its surface also receptor molecules 41 immobilized with the donor 20 can bind, offset. The particles 40 of particle class 1 thus bind to the donor / Rezeportkomplex. The particles 40 the particle class 1 have next to the receptor molecules 10 groups 16 on that with complementary groups 18 on particles 50 Particle class 2 can interact. The on the particle 40 Particle class 1 arranged additional receptor molecules 10 that are complementary to the particle 50 Class 2 immobilized molecules, quasi donor molecules 20 , interact, ensure a lasting interaction between the particles 40 class 1 and particles 50 class 2. Thereafter provides the further addition of particles 40 Class 1, with free donor molecules 18 on the particles 50 Particle class 2 interacts to further enhance the formed multiparticulate complex. The molecules act here 18 Particle class 2 practically as receptors for the previous step as receptors on the particles 40 Particle class 2, but in this step as donors 20 acting molecules.

Insgesamt lässt sich durch diese Methodik eine Verstärkung eines Signals erzielen, wenn entsprechend markierte Partikel eingesetzt werden. Die Markierung kann dann durch geeignete Detektionsmethoden ausgelesen werden. Overall, this methodology can be used to amplify a signal if appropriately labeled particles are used. The label can then be read by suitable detection methods.

Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens können in den 2–4 verfolgt werden. Der Einfachheit halber wird das Prinzip anhand der Bildung von Immunkomplexen 1 näher erläutert. Dabei kann der Fachmann einfacherweise durch die Ersetzung des Begriffes ”Immunkomplex” durch ”Donator-/Rezeptorkomplex”, die hinter dem Assay gemäß vorliegender Erfindung steckenden allgemeinen Prinzips ohne weiteres erkennen und abstrahieren.Variants of the method according to the invention can be found in the 2 - 4 be followed. For the sake of simplicity, the principle is based on the formation of immune complexes 1 explained in more detail. In this case, the skilled person can easily recognize and abstract by replacing the term "immune complex" by "donor / receptor complex", the general principle behind the assay according to the present invention.

Zunächst wird daher am Beispiel der 1 das System anhand der Konkretisierung eines Immunkomplexes näher erläutert.First, therefore, the example of 1 The system is explained in more detail on the basis of the concretisation of an immune complex.

Die 1A zeigt einen typischen Immunkomplex 1, bei dem ein Fängerantikörper 10 ein Antigen 20 gebunden hat. Der Fängerantikörper 10 ist an einem Träger 15 immobilisiert. Dieser Komplex 1 weist, präsentiert durch das Antigen 20, eine Bindungsstelle für Partikel 40 der Klasse 1 auf.The 1A shows a typical immune complex 1 in which a capture antibody 10 an antigen 20 has tied. The catcher antibody 10 is on a carrier 15 immobilized. This complex 1 points, presented by the antigen 20 , a binding site for particles 40 Class 1.

Im zweiten Schritt entsprechend 1B binden Partikel 40 der Klasse 1 über ihre Antigenspezifität 41 an den Immunkomplex 1. Darüber hinaus besitzen die Partikel 40 der Klasse 1 eine Spezifität 16 gegen Partikel 50 der Klasse 2. In einem dritten Schritt entsprechend 1C binden Partikel 50 der Klasse 2 an Partikel 40 der Klasse 1, durch Wechselwirkung der Spezifität 16 des Partikels 40 mit der Spezifität 18 des Partikels 50. In Abhängigkeit von Stöchiometrie und räumlichen Ausbildung der Bindungspartner entsteht ein Multipartikelkomplex. Durch wechselseitige Zugabe von Markierungen, insbesondere farbige Partikel der Klasse 1 und farbige Partikel der Klasse 2, wird der Komplex 1 entsprechend vergrößert (Siehe 1D).In the second step accordingly 1B bind particles 40 Class 1 on its antigenic specificity 41 to the immune complex 1 , In addition, the particles own 40 Class 1 has a specificity 16 against particles 50 Class 2. In a third step accordingly 1C bind particles 50 Class 2 particles 40 Class 1, by interaction of specificity 16 of the particle 40 with the specificity 18 of the particle 50 , Depending on the stoichiometry and spatial formation of the binding partners, a multiparticulate complex is formed. The addition of labels, in particular Class 1 colored particles and Class 2 colored particles, makes the complex 1 enlarged accordingly (see 1D ).

Der Vorgang kann mehrfach auch unter Einbeziehung von Waschschritten fortgeführt werden. Bei Einsatz von Farbpartikeln ist nach jedem Zugabeschritt eine Erhöhung der Farbintensität zu verzeichnen. Die Nachweismethode ist besonders einfach und vorteilhaft durchzuführen, wenn zur Immobilisierung des Fängerantikörpers 10 dreidimensionale poröse Träger 15 wie Filter oder Sintermaterialien eingesetzt werden und die einzelnen Schritte im Durchfluss in einer Säule oder auf einer Lateralflussmembran (lateral flow membran) durchgeführt werden. Typische Verweil- bzw. Inkubationszeiten für die einzelnen Schritte liegen im Bereich von 10 sec bis 10 min (vorzugsweise 30 s bis 2 min).The process can be continued several times including washing steps. When using color particles, an increase in color intensity is observed after each addition step. The detection method is particularly simple and advantageous to carry out when immobilizing the capture antibody 10 three-dimensional porous carrier 15 how filters or sintered materials are used and the individual steps are carried out in the flow in a column or on a lateral flow membrane. Typical residence or incubation times for the individual steps are in the range of 10 seconds to 10 minutes (preferably 30 seconds to 2 minutes).

In der Variante gemäß 2A–2D werden die Schritte, die in 1A–1D bereits beschrieben worden waren variiert. Auch hier wird zunächst ein Fängerantikörper 10, der auf einen Träger 15 immobilisiert ist, mit einer analytenthaltenden Probe in Kontakt gebracht, worauf sich ein Immunkomplex 1 zwischen dem Fängerantikörper 10 und dem Analyten 20 ausbildet. In einem darauf folgenden Schritt wird der Mischung ein Vermittler, in diesem Fall ein Detektorantikörper 30, der mit Biotin 31 versehen ist, zugefügt.In the variant according to 2A - 2D be the steps in 1A - 1D already described varied. Again, a catcher antibody is first 10 who is on a carrier 15 is immobilized, contacted with an analyte-containing sample, followed by an immune complex 1 between the capture antibody 10 and the analyte 20 formed. In a subsequent step, the mixture becomes an intermediary, in this case a detector antibody 30 that with biotin 31 is added, added.

An den gebildeten Immunkomplex 1 – bestehend aus immobilisiertem Fängerantikörper 10, Analyt 20, Detektorantikörper 30 mit Biotin 31 – bindet dann ein Partikel 40 der Klasse 1, welcher mit Avidin 41 versehen ist.At the formed immune complex 1 - consisting of immobilized capture antibody 10 , Analyte 20 , Detector antibody 30 with biotin 31 - then binds a particle 40 Class 1, which with avidin 41 is provided.

Vorteilhaft ist in dieser Ausführungsform, dass der Partikel der Partikelklasse 1 und der Partikel der Partikelklasse 2 jeweils nur eine Spezifität aufweisen muss, um die Verstärkung hervorzurufen, da der Partikel der Klasse 1 über einen Vermittler, in diesem Fall ein biotinylierter Antikörper 19, an dem Immunkomplex bindet. Generell muss der Mediator ein Molekül sein, das zumindest zwei unterschiedliche Bindungsstellen, zum einen zum Analyten 20 und zum anderen zum Partikel 40 der Klasse 1, aufweist.It is advantageous in this embodiment that the particles of the particle class 1 and the particles of the particle class 2 each only have to have a specificity to cause the gain, since the class 1 particle via a mediator, in this case a biotinylated antibody 19 to which immune complex binds. In general, the mediator must be a molecule that has at least two different binding sites, one to the analyte 20 and on the other to the particle 40 Class 1, has.

2C zeigt die Situation nach Zugabe eines Partikels 50 der Partikelklasse 2, welcher seinerseits mit Biotin 31 versehen ist. Aufgrund der Biotinmarkierung 31 des Partikel 50 der Partikelklasse 2 bindet der Partikel 50 an die bereits vorhandenen Partikel 40 der Klasse 1, die mit dem komplementären Avidin 41 versehen sind, was dann bereits zu einer ersten Verstärkung des auf dem Träger immobilisierten Signals führt. 2C shows the situation after addition of a particle 50 the particle class 2, which in turn with biotin 31 is provided. Due to the biotin label 31 of the particle 50 Particle class 2 binds the particle 50 to the already existing particles 40 of class 1, with the complementary avidin 41 are provided, which then already leads to a first amplification of the immobilized on the carrier signal.

2D zeigt nun in einem weiteren Schritt die Ausbildung eines noch komplexeren Systems, das nach Wiederholung des ersten Schrittes in dem Partikel 40 der Partikelklasse 1, die wiederum mit Avidin 41 markiert sind, entsteht. Die erneute Zugabe der Partikel 40 der ersten Partikelklasse, die mit Avidin 41 markiert sind, führt nun zu einer weiteren Verstärkung des Signals, indem diese Partikel 40 der Partikelklasse 1 an freie Biotinbindungsstellen 31 der im vorigen Schritt gemäß 2C zugegebenen Partikel 50 der Partikelklasse 2 binden. Im Endeffekt ergibt sich eine durch eine Amplifikationsreaktion hervorgerufene Verstärkung des Signals und damit Erhöhung der Detektionsempfindlichkeit. 2D now shows in a further step, the formation of an even more complex system, after repeating the first step in the particle 40 Particle class 1, in turn, with avidin 41 are marked arises. The re-addition of the particles 40 the first particle class containing avidin 41 are marked, now leads to a further amplification of the signal by these particles 40 of particle class 1 to free biotin binding sites 31 in the previous step according to 2C added particles 50 Particle class 2 tie. Ultimately, there is an amplification of the amplification caused amplification of the signal and thus increase the detection sensitivity.

Die 3A–3D veranschaulichen eine Variante der Ausführungsform gemäß 2A–2D, in der anstelle der als Teilchen ausgestalteten Partikel 50 der Partikelklasse 2 ein Protein 52 eingesetzt wird, das mit einer Spezifität zum Partikel 40 der Partikelklasse 2 ausgestattet ist. In diesem Fall handelt es sich um ein biotinyliertes Protein 52, in diesem Falle BSA.The 3A - 3D illustrate a variant of the embodiment according to 2A - 2D in which instead of the particles designed as particles 50 Particle class 2 is a protein 52 is used, with a specificity to the particle 40 Particle class 2 is equipped. In this case, it is a biotinylated protein 52 , in this case BSA.

Eine weitere Variante stellt in den 4A–4D gezeigte Verfahrensweise dar, in der Antikörper 10 als Fängerantikörper auf einem Träger 15 immobilisiert sind. Ein Analyt 20 wird vom Fängerantikörper 10 gebunden, sodass der Immunkomplex 1 sich ausbilden kann. Anders als in 2A beschrieben wird nicht ein weiterer Antikörper, der Beispielsweise mit Biotin 31 markiert werden kann und als Detektionsantikörper 30 wirkt, hinzugegeben, sondern es wird ein Partikel 40 der Partikelklasse 1 zugegeben, auf dessen Oberfläche zwei unterschiedliche Antikörper 45, 48 gebunden sind, wobei der erste Antikörper 45, der an den Partikel 40 der Partikelklasse 1 gebunden ist, an den Immunkomplex 1 bindet. Der Partikel 40 der Partikelklasse 1 weist darüber hinaus noch einen Antikörper 48 auf, der mit Oberflächenmarkierungen 55 auf dem Partikel 50 der zweiten Partikelklasse bindend in Wechselwirkung tritt. Dabei kann der Antikörper 48 beispielsweise gegen FITC 55 gerichtet sein, wohingegen der Antikörper 45 gegen den Analyten 20 nicht an die gleiche Bindungsstelle wie der Fängerantikörper 10 bindet. Nach Ausbildung des in 4C gezeigten Multipartikelkomplexes kann dann in einem weiteren Schritt, wie in 4D gezeigt, wiederum eine Vielzahl der Partikel 40 der Partikelklasse 1, wie in 4B verdeutlicht, zugesetzt werden. Der Antikörper 48 bindet dann an freie Stellen 55 des Partikels 50 der zweiten Partikelklasse, wodurch sich eine weitere Verstärkung des Signals ergibt.Another variant presents in the 4A - 4D shown procedure, in the antibody 10 as a capture antibody on a support 15 are immobilized. An analyte 20 is from the capture antibody 10 bound, leaving the immune complex 1 can train. Unlike in 2A not described another antibody, for example, with biotin 31 can be labeled and as a detection antibody 30 acts, added, but it becomes a particle 40 Particle class 1 added, on the surface of two different antibodies 45 . 48 are bound, with the first antibody 45 that is attached to the particle 40 Particle class 1 is bound to the immune complex 1 binds. The particle 40 Particle class 1 also has an antibody 48 on that with surface markings 55 on the particle 50 the second particle class interacts bindingly. In this case, the antibody 48 for example against FITC 55 be directed, whereas the antibody 45 against the analyte 20 not at the same binding site as the capture antibody 10 binds. After training of in 4C The multiparticulate complex shown can then in a further step, as in 4D shown, in turn, a variety of particles 40 Particle class 1, as in 4B clarified, added. The antibody 48 then binds to vacancies 55 of the particle 50 the second particle class, resulting in a further amplification of the signal.

5 zeigt eine weitere ausführbare Variante unter Verwendung von Partikeln, die drei unterschiedlichen Klassen angehören, wobei zunächst gemäß 5A auf einem Träger 15 ein immobilisiertes Antigen 20 präsentiert wird, an das ein Antikörper 25 aus der zu untersuchenden Probe bindet. Es hat sich diesmal also ein Immunkomplex 1 aus immobilisiertem Liganden 20 und Antikörper 20 aus der Probe gebildet. 5 shows another executable variant using particles belonging to three different classes, first according to 5A on a carrier 15 an immobilized antigen 20 is presented to which an antibody 25 from the sample to be examined. It has an immune complex this time 1 from immobilized ligand 20 and antibodies 20 formed from the sample.

Gemäß 5B bindet an diesen Immunkomplex 1 aus Antikörper 25, Ligand 20, der auf den Träger 15 immobilisiert ist, ein Partikel 40 der Partikelklasse 1. Dieser trägt an seiner Oberfläche Antikörper 60 gegen die F_C-Region von IgG-Antikörpern, die mit dem Antikörper 25 des Immunkomplexes 1 reagieren und darüber hinaus, beispielsweise Biotin 31. Durch den Antikörper 60 vermittelt, bindet der Partikel 40 der Partikelklasse 1 an den am Träger 15 immobilisierten Immunkomplex 1. Die Biotinmarkierungen 31 dienen zur Bindung der Partikel 50 der Partikelklasse 2, die in einem nächsten Schritt zugesetzt werden (siehe 5C). Die bereits vorher beschriebenen Partikel 50 der Partikelklasse 2 tragen an ihrer Oberfläche Avidinmoleküle, die mit den Biotinmolekülen 31 der Partikel 40 der Partikelklasse 1 eine Bindung eingehen und anhaftend ein Netz von Partikeln ausbilden. Gemäß 5D kann zur weiteren Verstärkung des Signals dann eine Partikelklasse 70 zugefügt werden, an deren Oberfläche wiederum Biotinmolküle 31 anhaften und mit freien Avidinmolekülen auf der Oberfläche der Partikel 50 in Wechselwirkung treten.According to 5B binds to this immune complex 1 from antibodies 25 , Ligand 20 who is on the carrier 15 immobilized, a particle 40 Particle class 1. This carries antibodies on its surface 60 against the F _C region of IgG antibodies raised with the antibody 25 of the immune complex 1 react and beyond, such as biotin 31 , By the antibody 60 mediates, binds the particle 40 the particle class 1 at the on the carrier 15 immobilized immune complex 1 , The biotin labels 31 serve to bind the particles 50 Particle class 2, which are added in a next step (see 5C ). The previously described particles 50 Particle class 2 carry avidin molecules on their surface that interact with the biotin molecules 31 the particle 40 Particle class 1 form a bond and form an adherent network of particles. According to 5D can then further amplify the signal a particle class 70 be added to the surface in turn Biotinmolküle 31 attach and with free avidin molecules on the surface of the particles 50 interact.

Gemäß 5D ist die enorme Verstärkung des Signals unmittelbar erkennbar. Dieses Ausführungsbespiel kann eingesetzt werden bei serologischen Tests, in dem entsprechend indikative Antikörper nachgewiesen werden müssen.According to 5D the enormous amplification of the signal is immediately recognizable. This exemplary embodiment can be used in serological tests in which correspondingly indicative antibodies must be detected.

6A–D zeigt das Prinzip eines Kompetitionsassays, der erfindungsgemäß durchführbar ist. 6A D shows the principle of a competition assay which can be carried out according to the invention.

In diesem Ausführungsbeispiel wird auf Grundlage eines immunologischen Kompetetionsassays die Konzentration von Mykotoxin Zearalenon (Zea) aus Getreideextrakten bestimmt. In 6A wird ein mit „freiem” Zea kontaminierter Getreideextrakt mit Zea-Biotin vermischt. Anschließend wird das Gemisch auf eine gesinterte Matrix 16 aus Polyethylen aufgegeben. Dort konkurriert das „freie” Zea 20 mit dem Zea-Biotin um die Bindungsstelle am immobilisierten Antikörper. Prinzipiell bilden können sich zwei Immunkomplexe ausbilden. Immunkomplex A besteht aus Antikörper und Zea-Biotin (10 + 31). Dieser Komplex bildet sich wenn in der Ausgangsprobe kein Mykotoxin vorhanden ist. Immunkomplex B besteht aus Antikörper 10 und „freiem” Zea 20. Dieser Komplex bildet sich wenn Mykotoxin in der Ausgangsprobe vorhanden ist. In den folgenden Schritten gemäß 6B–D werden nur die Immunkomplexe A1 verstärkt. Nach Aufgabe des Partikels 40 der Klasse 1 bindet dieser über sein Streptavidin 41 an das gekoppelte Zea-Biotin 10 + 31. Anschließend bindet das mit Biotin 31 markierte Biopolymer BSA-Biotin 52 an die gebundenen Partikel 40 der Klasse 1. Abschließend wird wieder Partikel der Klasse 1 aufgegeben und bindet an gekoppeltes BSA-Biotin 52. Je nach gewünschter Signalverstärkung bzw. Zyklenzahl wird wechselseitig BSA-Biotin 52 und Partikel 40 der Klasse 1 aufgegeben. Zu beachten ist, dass sich bei dieser Ausführungsvariante die Konzentration an Zearalenon in der Ausgangsprobe indirekt proportional zur Signalstärke verhält. Das heißt, je mehr Mykotoxin im Getreide vorhanden ist desto niedriger ist das messbare bzw. zu verstärkende Signal.In this embodiment, the concentration of mycotoxin zearalenone (Zea) from cereal extracts is determined based on an immunological competition assay. In 6A For example, a cereal extract contaminated with "free" Zea is mixed with zea-biotin. Subsequently, the mixture is applied to a sintered matrix 16 made of polyethylene. There the "free" Zea competes 20 with the zea-biotin around the binding site on the immobilized antibody. In principle, two immune complexes can form. Immune complex A consists of antibody and zea-biotin ( 10 + 31 ). This complex forms when no mycotoxin is present in the original sample. Immune complex B consists of antibodies 10 and "free" Zea 20 , This complex forms when mycotoxin is present in the original sample. In the following steps according to 6B -D only the immune complexes A1 are amplified. After abandonment of the particle 40 Class 1 binds this via its streptavidin 41 to the coupled zea-biotin 10 + 31 , Then it binds with biotin 31 labeled biopolymer BSA-biotin 52 to the bound particles 40 Class 1. Finally, Class 1 particles are returned and bind to coupled BSA-biotin 52 , Depending on the desired signal amplification or number of cycles, BSA-biotin is alternately 52 and particles 40 abandoned the class 1. It should be noted that in this embodiment, the concentration of zearalenone in the Output sample is inversely proportional to signal strength. This means that the more mycotoxin is present in the cereal, the lower the measurable or amplified signal.

Die 7A–D betreffen die grafische Wiedergabe der Tabellenergebnisse der jeweiligen Beispiele 1–4.The 7A -D relate to the graphical representation of the table results of the respective examples 1-4.

Beispiel 1example 1

Detektion von Staphylokokken Enterotoxin B (SEB)Detection of staphylococcal enterotoxin B (SEB)

In dem nachstehenden Verfahren wird beschrieben wie man eine spezifische Signalverstärkung auf einer immunologisch funktionalisierten Oberfläche erzielen kann. Als Grundlage hierfür dient eine auf PE basierende 3 dimensionale zylinderförmige gesinterte Matrix („Fritte”) auf deren Oberfläche Antikörper immobilisiert sind. Diese Antikörper binden spezifisch aus einer Lösung SEB (Staphylokokken Enterotoxin B). Anschließend werden zu diesem Immunkomplex Partikel der Klasse 1 zugegeben. Partikel der Klasse 1 besitzen eine Spezifität (Antikörper) gegen SEB und binden somit an den Immunkomplex. Darüber hinaus besitzen sie auch eine Spezifität gegen Haptene die auf Partikel der Klasse 2 immobilisiert sind. Somit binden in einem Folgeschritt Partikel der Klasse 2 an Partikel der Klasse 1. Es entsteht ein oligomerer Partikelkomplex. Dieser wird durch wechselseitige Zugabe (Cycling) beider Partikelklassen vergrößert. Beide Partikelklassen besitzen eine Eigenabsorbtion bei 525 nm. Diese kann photometrisch vermessen werden. Die optische Dichte wird mit zunehmenden Zyklenzahlen größer und erzeugt eine spezifische Färbung des Filters. Durchführung: Nr. Arbeitsschritt Volumen Reagenz Zeit Messung OD [] 1 Probenaufgabe 750 μl Probe [50 ng/ml SEB bzw. 0 ng/ml SEB] 6 Minuten 2 Cycling 500 μl Partikel der Klasse 1 6 Minuten 3 750 μl Waschpuffer ja 4 500 μl Partikel der Klasse 2 6 Minuten 5 750 μl Waschpuffer optional 6 Wiederholung ab Schritt 2 (1) 750 μl der mit SEB versetzten Probe wird auf die Säule pipettiert und bindet dort spezifisch an dem immobilisierten Antikörper. Die Inkubationszeit von 6 Minuten wird abgewartet.
(2) 500 μl Partikel der Klasse 1 werden aufgegeben. Die Inkubationszeit von 6 Minuten wird abgewartet.
(3) Mit 750 μl Waschpuffer wird überschüssiger Partikel herunter gewaschen.
(4) 500 μl Partikel der Klasse 2 wird aufgegeben und binden an Partikel der Klasse 1. Die Inkubationszeit von 6 Minuten wird abgewartet.
(5) Mit 750 μl Waschpuffer wird überschüssiger Partikel wieder herunter gewaschen.
(6) In Abhängigkeit der gewünschten Zyklenzahl wird mit Schritt 2 wieder begonnen. Ergebnisse OD Zyklen SEB [ng/ml] 1 2 3 4 5 50 0,358 0,664 0,952 1,236 1,407 0 0,047 0,052 0,061 0,078 0,09 The following procedure describes how to achieve specific signal enhancement on an immunologically functionalized surface. The basis for this is a PE-based 3-dimensional cylindrical sintered matrix ("frit") on whose surface antibodies are immobilized. These antibodies bind specifically from a solution SEB (staphylococcal enterotoxin B). Subsequently, class 1 particles are added to this immune complex. Class 1 particles have specificity (antibodies) to SEB and thus bind to the immune complex. In addition, they also have specificity against haptens immobilized on class 2 particles. Thus, in a subsequent step, particles of class 2 bind to particles of class 1. An oligomeric particle complex is formed. This is increased by mutual addition (cycling) of both particle classes. Both particle classes have a self-absorption at 525 nm. This can be measured photometrically. The optical density increases with increasing number of cycles and produces a specific coloration of the filter. Execution: No. step volume reagent Time Measurement OD [] 1 sample application 750 μl Sample [50 ng / ml SEB or 0 ng / ml SEB] 6 minutes 2 Cycling 500 μl Class 1 particles 6 minutes 3 750 μl wash buffer Yes 4 500 μl Class 2 particles 6 minutes 5 750 μl wash buffer optional 6 Repeat from step 2 (1) 750 μl of the sample added with SEB is pipetted onto the column where it binds specifically to the immobilized antibody. The incubation period of 6 minutes is awaited.
(2) 500 μl Class 1 particles are given up. The incubation period of 6 minutes is awaited.
(3) Wash 750 μl of wash buffer with excess particles.
(4) 500 μl Class 2 particles are added and bind to Class 1 particles. The incubation period of 6 minutes is awaited.
(5) With 750 μl wash buffer, excess particles are washed down again.
(6) Depending on the desired number of cycles, step 2 is started again. Results OD cycles SEB [ng / ml] 1 2 3 4 5 50 0.358 0.664 0,952 1,236 1,407 0 0.047 0,052 0,061 0.078 0.09

Siehe 7A Please refer 7A

Beispiel 2 Example 2

Detektion von BoNT/BDetection of BoNT / B

In vergleichbarer Weise wurde das voran beschriebene Verfahren auf den Nachweis von BoNT/B angewendet. Ergebnisse Tabelle BoNT-B mit spezifischen Antikörpern OD Zyklen BONT/B [ng/ml] 1 2 3 4 5 10 0,2 0,413 0,68 0,9 1,3 0 0,04 0,055 0,06 0,063 0,064 Similarly, the method described above was applied to the detection of BoNT / B. Results Table BoNT-B with specific antibodies OD cycles BONT / B [ng / ml] 1 2 3 4 5 10 0.2 0.413 0.68 0.9 1.3 0 0.04 0,055 0.06 0.063 0.064

Siehe 7B Please refer 7B

Beispiel 3Example 3

Detektion von Tetanus-IgG (Pferd) aus Serum nach Ausführungsbeispiel 3Detection of tetanus IgG (horse) from serum according to embodiment 3

In diesem Ausführungsbeispiel wird der Titer an Tetanus-IgG aus Pferdeserum bestimmt. Als Grundlage dient eine 3 dimensionale gesinterte Matrix aus Polyethylen. Auf deren Oberfläche ist Tetanus-Toxoid immobilisiert. Die Tetanus spezifischen IgG aus der Probe binden an das immobilisierte Antigen unter Ausbildung eines Immunkomplexes. An diesen Immunkomplex binden Partikel der Klasse 1 über ihre Spezifität gegen den Fc-Teil des gebundenen Pferde-IgG. Darüber hinaus besitzen die Partikel der Klasse 1 noch eine Biotin Markierung. Partikel der Klasse 2 besitzen eine Avidin Markierung und binden an die Biotin Markierung der Partikel der Klasse 1. Es kommt zur Ausbildung eines Multipartikelaggregates. Dieses kann photometrisch gemessen werden. Zur Verstärkung dieses Aggregates werden Partikel der Klasse 3 hinzu gegeben. Diese Partikel besitzen eine Biotin Markierung und binden an das Avidin der Partikel der Klasse 2. Durch wechselseitige Aufgabe von Partikel der Klasse 2 und Partikel der Klasse 3 entsteht ein spezifisches oligomeres Partikelaggregat, welches photometrisch gemessen wird. Hierbei korreliert die Intensität des gemessen Signals mit dem Tetanus-IgG Titer aus dem Pferdeserum. Durchführung Nr. Arbeitsschritt Volumen Reagenz Zeit Messung OD [] 1 Probenaufgabe 750 μl Probe [0,01 IE/ml Tetanus-IgG bzw. 0 IE/ml Tetanus-IgG] 6 Minuten 2 initiale Detektion 500 μl Partikel der Klasse 1 6 Minuten 3 waschen 750 μl Waschpuffer 4 Cycling 500 μl Partikel der Klasse 2 6 Minuten 5 750 μl Waschpuffer ja 6 500 μl Partikel der Klasse 3 6 Minuten 7 750 μl Waschpuffer optional 8 Wiederholung ab Schritt 4 (1) 750 μl Pferdeserum werden aufgegeben. Tetanus-IgG binden spezifisch an immobilisiertes Tetanus-Toxoid.
(2) 500 μl Partikel der Klasse 1 werden aufgegeben und binden spezifisch an gebundenes Tetanus-IgG.
(3) 750 μl Waschpuffer werden aufgegeben um überschüssigen Partikel der Klasse 1 zu entfernen.
(4) 500 μl Partikel der Klasse 2 werden aufgegeben und binden an Partikel der Klasse 1.
(5) 750 μl Waschpuffer werden aufgegeben um überschüssigen Partikel der Klasse 2 zu entfernen. Die optische Dichte [OD 525 nm] wird gemessen.
(6) 500 μl Partikel der Klasse 3 werden aufgegeben und binden an Partikel der Klasse 2.
(7) 750 μl Waschpuffer werden aufgegeben um überschüssigen Partikel der Klasse 3 zu entfernen.
(8) Je nach gewünschtem Verstärkungsgrad werden die Schritte ab Nr. 4 wiederholt (Cycling) Ergebnisse OD Zyklen Tetanus-IgG Pferd [IE/ml] 1 2 3 4 5 0,01 0,13 0,26 0,58 0,92 1,26 0 0,03 0,036 0,04 0,048 0,054 In this embodiment, the titre is determined from tetanus IgG from horse serum. The basis is a 3-dimensional sintered matrix made of polyethylene. Tetanus toxoid is immobilized on its surface. The tetanus-specific IgG from the sample bind to the immobilized antigen to form an immune complex. Particles of class 1 bind to this immune complex by their specificity against the Fc portion of the bound horse IgG. In addition, the class 1 particles still have a biotin label. Class 2 particles have an avidin label and bind to the biotin label of the class 1 particles. A multiparticulate aggregate is formed. This can be measured photometrically. To enhance this aggregate, particles of class 3 are added. These particles have a biotin label and bind to the avidin of class 2 particles. By interacting class 2 particles and class 3 particles, a specific oligomeric particle aggregate is formed, which is measured photometrically. Here, the intensity of the measured signal correlates with the tetanus IgG titer from the horse serum. execution No. step volume reagent Time Measurement OD [] 1 sample application 750 μl Sample [0.01 IU / ml tetanus IgG or 0 IU / ml tetanus IgG] 6 minutes 2 initial detection 500 μl Class 1 particles 6 minutes 3 to wash 750 μl wash buffer 4 Cycling 500 μl Class 2 particles 6 minutes 5 750 μl wash buffer Yes 6 500 μl Class 3 particles 6 minutes 7 750 μl wash buffer optional 8th Repeat from step 4 (1) 750 μl horse serum are given. Tetanus IgG bind specifically to immobilized tetanus toxoid.
(2) 500 μl Class 1 particles are added and bind specifically to bound tetanus IgG.
(3) 750 μl wash buffer is added to remove excess Class 1 particles.
(4) 500 μl Class 2 particles are added and bind to class 1 particles.
(5) 750 μl of wash buffer are added to remove excess Class 2 particles. The optical density [OD 525 nm] is measured.
(6) 500 μl Class 3 particles are added and bind to class 2 particles.
(7) 750 μl of wash buffer are added to remove excess Class 3 particles.
(8) Depending on the desired degree of reinforcement, the steps from No. 4 are repeated (Cycling) results OD cycles Tetanus IgG horse [IE / ml] 1 2 3 4 5 0.01 0.13 0.26 0.58 0.92 1.26 0 0.03 0,036 0.04 0.048 0.054

Siehe 7C Please refer 7C

Beispiel 4Example 4

Detektion von Zearalenon aus GetreideextraktenDetection of zearalenone from cereal extracts

Durchführung Nr. Arbeitsschritt Volumen Reagenz Zeit Messung OD [λ] 1 Vorinkubation 600 μl 300 μl Probe (freies Zea) + 300 μl Zea-Biotin 6 Minuten 2 Probenaufgabe 600 μl Aufgabe Vorinkubat auf Säule 6 Minuten 3 initiale Detektion 500 μl Partikel der Klasse 1 6 Minuten 4 waschen 750 μl Waschpuffer 5 Cycling 500 μl BSA-Biotin (Biopolymer) 6 Minuten 6 750 μl Waschpuffer ja 7 500 μl Partikel der Klasse 1 6 Minuten 8 750 μl Waschpuffer optional 9 Wiederholung ab Schritt 5 (1) 300 μl einer Probe mit freiem Zearalenon wird mit 300 μl Zea-Biotin gemischt
(2) 600 μl Gemisch (Vorinkubat) werden auf den Filter pipettiert. („Freies” Zea aus Probe konkurriert mit Zea-Biotin um Bindungsstelle am immobilisierten Antikörper
(3) Partikel der Klasse 1 werden aufgegeben und binden spezifisch an Immunkomplex aus Antikörper und Zea-Biotin
(4) Überschüssiger Partikel der Klasse 1 wird herunter gewaschen
(5) BSA-Biotin wird aufgegeben und bindet spezifisch an Partikel der Klasse 1
(6) Überschüssiges BSA-Biotin wird herunter gewaschen.
(7) Partikel der Klasse 1 wird aufgegeben und bindet an BSA-Biotin
(8) Überschüssiger Partikel der Klasse 1 wird herunter gewaschen
(9) Je nach gewünschter Zyklenzahl/Verstärkung werden die Schritte ab Nr. 5 wiederholt. Ergebnisse OD Zyklen Zearalenon [ng/ml] 1 2 3 4 5 200 0,15 0,17 0,24 0,39 0,55 0 1,1 1,5 1,7 1,9 2 execution No. step volume reagent Time Measurement OD [λ] 1 preincubation 600 μl 300 μl sample (free Zea) + 300 μl Zea-biotin 6 minutes 2 sample application 600 μl Task Pre-incubate on column 6 minutes 3 initial detection 500 μl Class 1 particles 6 minutes 4 to wash 750 μl wash buffer 5 Cycling 500 μl BSA biotin (biopolymer) 6 minutes 6 750 μl wash buffer Yes 7 500 μl Class 1 particles 6 minutes 8th 750 μl wash buffer optional 9 Repeat from step 5 (1) 300 μl of a sample of free zearalenone is mixed with 300 μl of zea-biotin
(2) 600 μl of mixture (pre-incubate) are pipetted onto the filter. ("Free" Zea from sample competes with Zea-biotin for binding site on immobilized antibody
(3) Class 1 particles are abandoned and bind specifically to the immune complex of antibody and zea-biotin
(4) Excess Class 1 particles are washed down
(5) BSA biotin is abandoned and binds specifically to class 1 particles
(6) Excess BSA-biotin is washed down.
(7) Class 1 particles are abandoned and bind to BSA-biotin
(8) Excess Class 1 particles are washed down
(9) Depending on the desired number of cycles / amplification, the steps from no. 5 are repeated. Results OD cycles Zearalenone [ng / ml] 1 2 3 4 5 200 0.15 0.17 0.24 0.39 0.55 0 1.1 1.5 1.7 1.9 2

Ergebnisse in 7D veranschaulichtResults in 7D illustrates

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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WO 94/09365 A [0002]
WO 95/19569 A [0002]
WO 97/19354 A [0012]

Claims

Method for amplifying signals in heterogeneous binding assays on the basis of a donor / receptor complex ( 1 ) from a receptor molecule ( 10 ) and a donor molecule ( 20 ) derived from the receptor molecule ( 10 in which, in a first step, the donor / receptor complex ( 1 ), - then in a second step at least one particle of a first particle class to the donor / receptor complex formed ( 1 ), - the at least one particle of the first particle class to the donor / receptor complex ( 1 ) and - the at least one to the donor / receptor complex ( 1 ) coupled particles of the first particle class n ≥ 2, where n is a natural number, further binding site to which at least one particle of a second particle class can couple, - the particles of the second particle class in turn at least m ≥ 2, where m is a natural number , Binding sites has to which at least one particle of the first particle class can couple, - added in a third step, at least one particle of the second particle class and - optionally the steps, in particular the second and third steps, at least once repeated.

The method of claim 1, wherein after the addition of the at least one particle of the second particle class in the third step of claim 1, at least one particle of a third, different from the particles of the first particle class particle class is added.

Method according to claim 1 or 2, wherein n and m are each> 2, in particular 3, 4, 5.

Method according to at least one of the preceding claims, wherein the particles of the first and second particle class have approximately the same size or different size.

Method according to at least one of the preceding claims, wherein the particle size have an average size of 5 nm to 5 microns.

Method according to at least one of the preceding claims, wherein particles of the particle class organic or inorganic particles or combinations thereof are used.

A method according to claim 5, wherein as inorganic particles gold particles magnetic particles, or as organic particles particles of polymers and biopolymers, such as latex, proteins, in particular fluorescent proteins such as phycoerythrin, phycocyanin, or cellulose derivatives, dextran derivatives are used.

Method according to at least one of claims 3 to 6, wherein gold particles having an average diameter of 5-50 nm, in particular 10-20 nm, latex particles with dye or fluorescent dye in a polymer matrix having an average diameter of 10 nm-4 .mu.m, in particular 100 nm -400 nm, dye dispersions with particles having a mean diameter of 100 nm-500 nm, magnetic particles with a mean diameter of 10 nm-4 .mu.m, in particular 40 nm-400 nm or polymers, in particular biopolymers such as proteins, in particular fluorescent proteins such as phycoerythrin, phycocyanin , or cellulose derivatives, dextran derivatives are used.

Method according to at least one of the preceding claims, wherein the particles of the first, second and / or third particle class are detectable.

Method according to at least one of the preceding claims, wherein the free binding sites of the first and second particle classes are mutually formed by a ligand / receptor pair.

The method of claim 10, wherein the mutual ligand / receptor pair is formed by avidin / streptavin, protein A / IgG, especially the F _c portion of IgG, lectin / oligosaccharide, polymer binding domain / biopolymer, anti hapten antibody / hapten or combinations thereof.

The method of claim 9, wherein the detection of the detectable particles by spectroscopic methods, such as transmitted light, reflectometry, fluorometry, luminometry, refractive index and birefringence, by imaging methods, by electrical methods such as conductometry, potentiometry, or magnetic methods such as linear and non-linear susceptometry and relaxometry based on Giant Magnetic Resistors, Hall Sensors, Flux Gate Sensors, Squids or Induction Coils.

Method according to at least one of the preceding claims, wherein the donor / receptor complex ( 1 ) is an immune complex.