DE102011081524B4 - COATING OF SUBSTRATES WITH A MONOLAGE OF SELF-TEMPERATING PROTEINS - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur Beschichtung eines Substrats mit einer Monolage mindestens eines selbstassemblierenden Proteins mit den Schritten: i. Bereitstellung einer stabilisierten wässrigen Lösung, welche mindestens ein selbstassemblierendes Protein enthält, indem a) das selbstassemblierende Protein in einer wässrigen Lösung bereitgestellt wird, und anschließend b) in Abwesenheit von Substanzen, die zur Spaltung von Disulfidbrücken geeignet sind, eine wässrige Lösung enthaltend mindestens ein ionisches Tensid portionsweise zu der proteinhaltigen Lösung aus a) zugegeben wird, wobei nach der Zugabe die finale Tensidkonzentration cTensid in mol/l in folgendem Bereich liegt:wobei AO,Protein der Oberfläche eines Moleküls des selbstassemblierenden Proteins entspricht, ATKG der Querschnittsfläche der Kopfgruppe des Tensids entspricht und cProtein der Konzentration des selbstassemblierenden Proteins in mol/l entspricht, ii. Inkontaktbringen der Oberfläche des Substrats mit der stabilisierten proteinhaltigen Lösung, wodurch eine proteinhaltige Beschichtung auf dem Substrat erzeugt wird, iii. Entfernen der überstehenden Lösung von dem beschichteten Substrat und/oder Trocknung des beschichteten Substrats.A method of coating a substrate with a monolayer of at least one self-assembling protein comprising the steps of: i. Providing a stabilized aqueous solution containing at least one self-assembling protein by a) providing the self-assembling protein in an aqueous solution, and then b) in the absence of substances suitable for cleaving disulfide bridges, an aqueous solution containing at least one ionic one Surfactant is added in portions to the protein-containing solution from a), wherein after the addition, the final surfactant concentration c-surfactant in mol / l in the following range: wherein AO, protein corresponds to the surface of a molecule of the self-assembling protein, ATKG corresponds to the cross-sectional area of the head group of the surfactant and c protein corresponds to the concentration of the self-assembling protein in mol / l, ii. Contacting the surface of the substrate with the stabilized proteinaceous solution, thereby producing a proteinaceous coating on the substrate, iii. Removing the supernatant solution from the coated substrate and / or drying the coated substrate.
Description
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Beschichtung eines Substrats mit einer Monolage selbstassemblierender Proteine unter Einsatz stabilisierter wässriger Lösungen mit selbstassemblierenden Proteinen sowie dadurch erhältliche Substrate. Verfahren zur Stabilisierung von Lösungen mit selbstassemblierenden Proteinen und die daraus erhältlichen stabilisierten Lösungen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Die Erfindung findet Anwendung in der chemischen Industrie, der Biotechnologie, der Sensorik sowie in der medizinischen Forschung. The invention relates to methods for coating a substrate with a monolayer of self-assembling proteins using stabilized aqueous solutions with self-assembling proteins and substrates obtainable thereby. Methods for stabilizing solutions with self-assembling proteins and the stabilized solutions obtainable therefrom are likewise provided by the invention. The invention finds application in the chemical industry, biotechnology, sensor technology as well as in medical research.
Selbstassemblierende Proteine, wie Hydrophobine oder Surface Layer Proteine (S-Layer Proteine), neigen in wässrigen Lösungen zu einer raschen und unkontrollierbaren Aggregatbildung (der unkontrollierten Zusammenlagerung von Proteinmonomeren zu Multimeren der selbstassemblierenden Proteine), was die Herstellung homogener Schichten der selbstassemblierenden Proteine auf einem Substrat erschwert. In Bezug auf die Erfindung werden im Folgenden selbstassemblierende Proteine auch vereinfacht lediglich als „Proteine“ bezeichnet. Selbstassemblierende Proteine bilden durch Interaktionen der Proteinmoleküle untereinander eine gerichtete Faltung und Assoziation aus (molekulare Selbstassemblierung) und sind durch die Bildung dieser hochgradig geordneten Struktur für verschiedenste Anwendungen in Nanotechnologien nutzbar. Self-assembling proteins, such as hydrophobins or surface layer proteins (S-layer proteins), tend in aqueous solutions to rapid and uncontrollable aggregate formation (the uncontrolled aggregation of protein monomers to multimers of self-assembling proteins), leading to the production of homogeneous layers of self-assembling proteins on a substrate difficult. With reference to the invention, in the following, self-assembling proteins are simply referred to simply as "proteins". Self-assembling proteins form a directed folding and association (molecular self-assembly) through interactions of the protein molecules and can be exploited by the formation of this highly ordered structure for various applications in nanotechnologies.
Zum Aufbau homogener Schichten selbstassemblierender Proteine werden gemeinhin die Langmuir-Blodgett-Methode, die Langmuir-Schäfer Technik oder das „layer-by-layer“ Verfahren genutzt. In diesen Verfahren wird das Substrat in eine Lösung mit Proteinmonomeren getaucht, so dass eine Schicht der Proteinmonomere (Monolage) auf dem Substrat abgelagert wird. Die layer-by-layer Techniken basieren ausschließlich auf der Ausnutzung der Physisorption der Proteinmonomere auf der Substratoberfläche. Es ist daher notwendig, hochreine Proteinmonomere einzusetzen. Da selbstassemblierende Proteine eine starke Neigung zur Aggregatbildung haben, ist eine langfristige Lagerung und Benutzung von bereits hergestellten Proteinlösungen nicht möglich. Ferner ist die Beschichtung von schwer zugänglichen Oberflächen des Substrats (beispielsweise Poren eines Substrats) limitiert, da schwer zugängliche Stellen auf dem Substrat, wie beispielsweise Poren, durch unkontrolliert aggregierende Proteinmonomere verschlossen werden können, so dass weitere Monomere nicht mehr in Poren eindringen können. For the construction of homogeneous layers of self-assembling proteins, the Langmuir-Blodgett method, the Langmuir-Schäfer technique or the "layer-by-layer" method are commonly used. In these methods, the substrate is dipped in a solution with protein monomers so that a layer of the protein monomers (monolayer) is deposited on the substrate. The layer-by-layer techniques are based exclusively on the exploitation of the physisorption of the protein monomers on the substrate surface. It is therefore necessary to use high purity protein monomers. Since self-assembling proteins have a strong tendency to aggregate formation, long-term storage and use of already prepared protein solutions is not possible. Furthermore, the coating of hard-to-reach surfaces of the substrate (for example, pores of a substrate) is limited because difficult to access sites on the substrate, such as pores, can be occluded by uncontrolled aggregating protein monomers so that other monomers can no longer penetrate into pores.
Es sind ferner Verfahren bekannt, um Lösungen von Monomeren selbstassemblierender Proteine zu stabilisieren. Methods are also known for stabilizing solutions of monomers of self-assembling proteins.
Es ist ein Verfahren bekannt, Proteinaggregate durch Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) aufzulösen, ohne die Proteine zu schädigen. Im Hinblick auf Umweltauflagen und die stark ätzenden Eigenschaften von TFA ist diese Methode für industrielle Anwendungen nur sehr bedingt geeignet.A method is known for dissolving protein aggregates by adding trifluoroacetic acid (TFA) without damaging the proteins. With regard to environmental regulations and the highly corrosive properties of TFA, this method is only of limited suitability for industrial applications.
Weiterhin ist aus
Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung einer Monolage eines selbstassemblierenden Proteins auf einem Substrat bereitzustellen. The object of the invention is to provide an improved method for producing a monolayer of a self-assembling protein on a substrate.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Beschichtung eines Substrats mit einer Monolage mindestens eines selbstassemblierenden Proteins (hierin auch „Beschichtungsverfahren“). Das erfindungsgemäße Beschichtungsverfahren umfasst die Schritte:
- i. Bereitstellung einer stabilisierten wässrigen Lösung, welche mindestens ein selbstassemblierendes Protein enthält, indem
a) mindestens ein selbstassemblierendes Protein in einer wässrigen Lösung bereitgestellt wird, und anschließend
b) in Abwesenheit von Substanzen, die zur Spaltung von Disulfidbrücken geeignet sind, eine wässrige Lösung enthaltend mindestens ein ionisches Tensid portionsweise zu der proteinhaltigen Lösung aus a) zugegeben wird, wobei nach der Zugabe die finale Tensidkonzentration cTensid in Mol/l in folgendem Bereich liegt: wobei AO,Protein der Oberfläche eines Moleküls des selbstassemblierenden Proteins entspricht, ATKG der Querschnittsfläche der Kopfgruppe des Tensids entspricht und cProtein der Konzentration des selbstassemblierenden Proteins in Mol/l entspricht,
- ii. Inkontaktbringen der Oberfläche des Substrats mit der stabilisierten proteinhaltigen Lösung, wodurch eine proteinhaltige Beschichtung auf der Oberfläche des Substrats erzeugt wird,
- iii. Entfernen der überstehenden Lösung von dem beschichteten Substrat und/oder Trocknung des beschichteten Substrats.
- i. Providing a stabilized aqueous solution containing at least one self-assembling protein by a) providing at least one self-assembling protein in an aqueous solution, and then b) in the absence of substances which are suitable for the cleavage of disulfide bridges, an aqueous solution containing at least one ionic surfactant is added in portions to the protein-containing solution from a), wherein after the addition, the final surfactant concentration c surfactant in mol / l in the following range lies: where A O, protein corresponds to the surface of a molecule of the self-assembling protein, A TKG corresponds to the cross-sectional area of the head group of the surfactant and c protein corresponds to the concentration of the self-assembling protein in mol / l,
- ii. Contacting the surface of the substrate with the stabilized proteinaceous solution, thereby producing a proteinaceous coating on the surface of the substrate,
- iii. Removing the supernatant solution from the coated substrate and / or drying the coated substrate.
Mit dem erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren ist es möglich, eine geordnete Monolage eines oder mehrerer selbstassemblierender Proteine auf der Oberfläche eines Substrates in einem Verfahrensschritt gezielt zu erzeugen. Unter einer geordneten Schicht oder (geordneten) Monolage wird dabei im Sinne der Erfindung eine Proteinschicht mit homogener Schichtdicke verstanden (relative Standardabweichung der Schichtdicke vorzugsweise maximal 30 %). Dabei entspricht die mittlere Dicke der Schicht der Ausdehnung eines Moleküls des selbstassemblierenden Proteins. With the coating method according to the invention, it is possible to selectively produce an ordered monolayer of one or more self-assembling proteins on the surface of a substrate in one process step. For the purposes of the invention, an ordered layer or (ordered) monolayer is understood to mean a protein layer having a homogeneous layer thickness (relative standard deviation of the layer thickness, preferably a maximum of 30%). The mean thickness of the layer corresponds to the extent of a molecule of the self-assembling protein.
Die Beschichtung auf dem Substrat kann eines oder mehrere unterschiedliche, zur Selbstassemblierung befähigte, Proteine innerhalb der Protein-Monolage enthalten. Es wird dazu eine Vielzahl von Molekülen eines definierten selbstassemblierenden Proteins, vorzugsweise eines S-Layer-Proteins oder Hydrophobins oder daraus generierten Fusionsproteinen, eingesetzt. Alternativ dazu wird eine Mischung verschiedener selbstassemblierender Proteine eingesetzt, beispielsweise eine Mischung eines Fusionsproteins, welches ein S-Layer-Protein enthält, mit dem entsprechenden S-Layer-Protein. Diese Moleküle der selbstassemblierenden Proteine werden zunächst in wässriger Lösung in monomerer Form stabilisiert und anschließend zur Beschichtung des Substrats eingesetzt. The coating on the substrate may contain one or more different proteins capable of self-assembly within the protein monolayer. For this purpose, a multiplicity of molecules of a defined self-assembling protein, preferably an S-layer protein or hydrophobin or fusion proteins generated therefrom, are used. Alternatively, a mixture of different self-assembling proteins is used, for example a mixture of a fusion protein containing an S-layer protein with the corresponding S-layer protein. These molecules of the self-assembling proteins are first stabilized in aqueous solution in monomeric form and then used to coat the substrate.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst eine stabilisierte wässrige Lösung, die das mindestens eine selbstassemblierende Protein enthält, bereitgestellt, wobei die Stabilisierung durch Zugabe zumindest eines Tensids erfolgt. Die Disulfidbrücken der Proteinstruktur werden dabei nicht aufgelöst. Das Tensid dient dazu, Proteinmonomere mit einer Tensidschicht zu umhüllen. Dies erfolgt in Abwesenheit (maximal 0,01 Gew.-% bezogen auf das selbstassemblierende Protein, bevorzugt maximal 0,0001 Gew.-%) von Substanzen, die zur Spaltung von Disulfidbrücken geeignet sind (insbesondere reduzierende Thiole, wie β-Mercaptoethanol, Dithiothreitol oder Dithioerythrit). Das gesamte erfindungsgemäße Beschichtungsverfahren wird in Abwesenheit dieser Substanzen durchgeführt. According to the method of the invention, first of all a stabilized aqueous solution containing the at least one self-assembling protein is provided, the stabilization taking place by addition of at least one surfactant. The disulfide bridges of the protein structure are not dissolved. The surfactant serves to coat protein monomers with a surfactant layer. This is done in the absence (maximum 0.01 wt .-% based on the self-assembling protein, preferably at most 0.0001 wt .-%) of substances which are suitable for the cleavage of disulfide bridges (in particular reducing thiols, such as β-mercaptoethanol, dithiothreitol or dithioerythritol). The entire coating process according to the invention is carried out in the absence of these substances.
Bei der Inkubation der unstabilisierten proteinhaltigen Lösung mit der in mehreren Portionen (in mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei Einzelportionen) dazu zugegebenen tensidhaltigen Lösung gehen die Tenside mit den in der wässrigen Lösung enthaltenen Proteinen eine koordinative Bindung ein, so dass ein Protein-Tensid-Komplex gebildet wird. Durch die Bildung des Protein-Tensid-Komplexes wird die unkontrollierte Bildung von Multimeren der Proteine (Aggregate) unterbunden und die proteinhaltige Lösung stabilisiert. Unter der Stabilisierung ist somit im Sinne der Erfindung die Verhinderung einer unkontrollierten Zusammenlagerung von selbstassemblierenden Proteinen in wässrigen Lösungen zu verstehen. Es ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, stabilisierte Lösungen mit Proteinmonomeren herzustellen. Die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen stabilisierten wässrigen Lösungen sind lagerstabil und mehrfach zur Beschichtung von Substraten verwendbar. Eine durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältliche stabilisierte wässrige Proteinlösung ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. In the incubation of the unstabilized protein-containing solution with the surfactant-containing solution added in several portions (in at least two, preferably at least three individual portions), the surfactants enter into a coordinative bond with the proteins contained in the aqueous solution, so that a protein-surfactant complex is formed. The formation of the protein-surfactant complex prevents the uncontrolled formation of multimers of proteins (aggregates) and stabilizes the protein-containing solution. For the purposes of the invention, stabilization is understood as meaning the prevention of uncontrolled assembly of self-assembled proteins in aqueous solutions. It is possible with the method according to the invention to produce stabilized solutions with protein monomers. The stabilized aqueous solutions obtainable by a process according to the invention are storage-stable and can be used repeatedly to coat substrates. A stabilized aqueous protein solution obtainable by a process according to the invention is likewise provided by the invention.
Vor Zugabe des Tensids beträgt die Konzentration des mindestens einen selbstassemblierenden Proteins in der unstabilisierten wässrigen Lösung (Verfahrensschritt a) bevorzugt mindestens 50 ng/µl, besonders bevorzugt mindestens 90 ng/µl. Die unstabilisierte wässrige Lösung (Verfahrensschritt a), die das mindestens eine selbstassemblierende Protein enthält, weist vorzugsweise einen pH-Wert von 7 bis 9,5 auf. Bevorzugt handelt es sich dabei um eine gepufferte Lösung. Before the addition of the surfactant, the concentration of the at least one self-assembling protein in the unstabilized aqueous solution (method step a) is preferably at least 50 ng / μl, more preferably at least 90 ng / μl. The unstabilized aqueous solution (process step a) containing the at least one self-assembling protein preferably has a pH of 7 to 9.5. This is preferably a buffered solution.
Optional wird die jeweils in a) und/oder b) zugegebene wässrige Lösung vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens filtriert, bevorzugt durch einen Sterilfilter, besonders bevorzugt mit einer Porengröße von 0,1 µm–0,5 µm. Optionally, the aqueous solution added in each of a) and / or b) is filtered prior to carrying out the method according to the invention, preferably by means of a sterile filter, particularly preferably with a pore size of 0.1 μm-0.5 μm.
Es werden im erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren zur Bereitstellung der stabilisierten Proteinlösung ionische Tenside eingesetzt (kationische oder anionische Tenside). Diese Tenside weisen einen einzigen hydrophilen Molekülteil (hierin auch als „Tensidkopfgruppe“ bezeichnet) und einen einzigen hydrophoben Molekülteil auf. Bevorzugt wird das Tensid in einer Konzentration von maximal 30 mmol/l, besonders bevorzugt maximal 15 mmol/l eingesetzt (Verfahrensschritt b). Für die Erzeugung von einer oberflächlichen Proteinmonolage auf dem Substrat wird eine Tensidlösung (in Verfahrensschritt b) eingesetzt, die bevorzugt mindestens 1 mmol/l, weiter bevorzugt maximal 15 mmol/l, weiter bevorzugt maximal 10 mmol/l, des Tensids enthält. In the coating process according to the invention, ionic surfactants (cationic or anionic surfactants) are used to provide the stabilized protein solution. These surfactants have a single hydrophilic moiety (also referred to herein as a "surfactant moiety") and a single hydrophobic moiety. The surfactant is preferably used in a concentration of not more than 30 mmol / l, more preferably not more than 15 mmol / l (process step b). For the production of a superficial protein monolayer on the substrate, a surfactant solution (in process step b) is used which preferably contains at least 1 mmol / l, more preferably at most 15 mmol / l, more preferably at most 10 mmol / l, of the surfactant.
Die tensidhaltige Lösung wird im Verfahrensschritt b) portionsweise zu der proteinhaltigen Lösung zugegeben. Bevorzugt werden mindestens zwei, besonders bevorzugt mindestens vier Einzelportionen der tensidhaltigen Lösung zugegeben. Die portionsweise Zugabe hat den Vorteil, dass die kritische Mizellbildungskonzentration der freien Tenside in der gebildeten Lösung nicht überschritten wird, so dass die Mizellenbildung der Tenside weitgehend unterbunden ist und diese für die Umhüllung der Proteinmonomere bereitstehen. The surfactant-containing solution is added in step b) in portions to the protein-containing solution. At least two, more preferably at least four, individual portions of the surfactant-containing solution are preferably added. The addition in portions has the advantage that the critical micelle formation concentration of the free surfactants in the solution formed is not exceeded, so that the micelle formation of the surfactants is largely prevented and these are available for the coating of the protein monomers.
Mit dem erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren wird nur maximal so viel Tensid zugegeben, wie nötig ist, um die in der Lösung enthaltenen Proteinmoleküle mit einer Bilage des Tensids zu umhüllen. Dafür wird so viel Tensid zu der Lösung aus a) zugegeben, dass die finale Konzentration des Tensids in mol/l nach der Zugabe zur proteinhaltigen Lösung in folgendem Bereich liegt: 
Dabei sind: AO,Protein ... Oberfläche des selbstassemblierenden Proteinmoleküls (Kugeloberfläche), ATKG ... Querschnittsfläche der Tensidkopfgruppe (Kreisfläche), NProtein ... Anzahl der Monomere des selbstassemblierenden Proteins je Liter, NA ... Avogadro-Konstante (NA = 6,022 × 1023 Teilchen/mol), ρrc = 2,05, ρK = 0,774, ρup = 1,5. Here are: A O, Protein ... Surface of the self-assembling protein molecule (spherical surface), A TKG ... Cross-sectional area of the surfactant head group (circular area), N protein ... Number of monomers of the self-assembling protein per liter, N A ... Avogadro Constant (N A = 6.022 × 10 23 particles / mole), ρ rc = 2.05, ρ K = 0.774, ρ up = 1.5.
Mit dem in Gleichung (1) angegebenen Zusammenhang wird berücksichtigt, dass die Tensidmenge, die zur Umhüllung der Proteinmonomere eingesetzt wird, von der verfügbaren Proteinoberfläche und der hydrophilen bzw. hydrophoben Eigenschaften des Proteins abhängt. Das Radienverhältnis ρK des als ideale Kugel vorliegenden Proteinmoleküls mit dem Trägheitsradius RG zum hydrodynamischen Radius des Proteinmoleküls RH beträgt 0,774.The relationship given in equation (1) takes into account that the amount of surfactant used to coat the protein monomers depends on the protein surface available and the hydrophilic or hydrophobic properties of the protein. The radii ratio ρ K of the ideal sphere protein molecule with the radius of gyration R G to the hydrodynamic radius of the protein molecule R H is 0.774.
Ein Grenzbereich berücksichtigt, dass mindestens so viel Tensid zugegeben werden muss, wie vom Übergang eines als ideale Kugel vorliegenden Proteins bis zum vollkommen ungefalteten Protein notwendig ist, wenn ausschließlich hydrophobe Wechselwirkungen des Tensids mit dem Protein vorherrschen (linker Grenzbereich von Formel 1). In diesem Fall beträgt das Radienverhältnis ρup aus dem Trägheitsradius des ungefalteten Proteinmoleküls RG zum hydrodynamischen Radius des Proteinmoleküls RH 1,5.A threshold range takes into account that at least as much surfactant must be added as is necessary from the transition of an ideal sphere protein to completely unfolded protein, if only hydrophobic interactions of the surfactant with the protein predominate (left limit of formula 1). In this case, the radii ratio ρ up from the radius of gyration of the unfolded protein molecule R G to the hydrodynamic radius of the protein molecule R H is 1.5.
Der andere Grenzbereich berücksichtigt, dass maximal so viel Tensid zugegeben wird, wie zum Aufbruch von als random coil vorliegenden Proteinaggregaten notwendig ist, bis die monomere Form des Proteins als ideale Kugel vorliegt, wenn ausschließlich hydrophile Wechselwirkungen des Tensids mit dem Protein vorherrschen (rechter Grenzbereich von Formel 1). In diesem Fall beträgt das Radienverhältnis ρrc aus dem Trägheitsradius des als random coil vorliegenden aggregierten Proteinmoleküls RG zum hydrodynamischen Radius des Proteinmoleküls RH 2,05.The other borderline takes into account that maximally as much surfactant is added as is necessary to break up protein aggregates present as a random coil until the monomeric form of the protein is present as an ideal sphere, if only hydrophilic interactions of the surfactant with the protein predominate (right border region of Formula 1). In this case, the radii ratio ρ rc from the radius of gyration of the random coil present aggregated protein molecule R G to the hydrodynamic radius of the protein molecule R H is 2.05.
Unter Kenntnis der Proteinkonzentration in mol/l in der proteinhaltigen Lösung aus a) 
Die im erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren eingestellte Tensidkonzentration in der stabilisierten proteinhaltigen Lösung (nach Zugabe der tensidhaltigen Lösung zur proteinhaltigen Lösung) in mol/l liegt in dem in Gleichung (3) angegebenen Bereich. The surfactant concentration in the stabilized protein-containing solution (after addition of the surfactant-containing solution to the protein-containing solution) in mol / l in the coating process according to the invention is in the range given in equation (3).
Die Oberfläche des selbstassemblierenden Proteinmoleküls ergibt sich dabei unter einer Betrachtung als Kugel aus der folgenden Gleichung (4), wobei RH,Protein der hydrodynamische Radius des selbstassemblierenden Proteinmoleküls ist: 
Im Anschluss an den Verfahrensschritt b) werden der dabei gebildeten protein- und tensidhaltigen Lösung vorzugsweise positiv geladene Metallionen oder Anionen, bevorzugt in Form einer wässrigen Lösung zugesetzt. Besonders bevorzugt sind zweiwertige Metallionen, insbesondere Erdalkalimetallionen, die in der Form wasserlöslicher Salze eingesetzt werden, vorzugsweise in Form von Chloriden, Nitraten, Carbonaten, Acetaten, Citraten, Gluconaten, Hydroxiden, Lactaten, Sulfaten, Succinaten oder Tartraten. Besonders bevorzugt sind anorganische Anionen, insbesondere Halogenide, Hydroxide, Nitrate, Carbonate, Sulfate, Phosphate aber auch organische Anionen, insbesondere Acetate, Citrate, Succinate oder Tartrate, die als Gegenionen Alkalimetalle aufweisen. Die Konzentration der Metallionen oder Anionen in der wässrigen Lösung beträgt vorzugsweise 0,01 mmol/l bis 10 mmol/l, bevorzugt 0,1 mmol/l bis 5 mmol/l und besonders bevorzugt 0,5 mmol/l bis 2 mmol/l. Dadurch kann vorteilhaft beim Einsatz von Fusionsproteinen, die mindestens eine selbstassemblierende und mindestens eine funktionelle Domäne enthalten, im anschließenden Beschichtungsschritt eine Orientierung der funktionellen Domäne auf die vom Substrat abgewandte Seite unterstützt werden. Following the process step b), the protein and surfactant-containing solution formed is preferably added to positively charged metal ions or anions, preferably in the form of an aqueous solution. Particularly preferred are divalent metal ions, especially alkaline earth metal ions, which are used in the form of water-soluble salts, preferably in the form of chlorides, nitrates, carbonates, acetates, citrates, gluconates, hydroxides, lactates, sulfates, succinates or tartrates. Particular preference is given to inorganic anions, in particular halides, hydroxides, nitrates, carbonates, sulfates, phosphates, but also organic anions, in particular acetates, citrates, succinates or tartrates, which have alkali metals as counterions. The concentration of the metal ions or anions in the aqueous solution is preferably 0.01 mmol / l to 10 mmol / l, preferably 0.1 mmol / l to 5 mmol / l and particularly preferably 0.5 mmol / l to 2 mmol / l , As a result, in the case of the use of fusion proteins which contain at least one self-assembling and at least one functional domain, an orientation of the functional domain to the side remote from the substrate can be advantageously supported in the subsequent coating step.
Das Inkontaktbringen der stabilisierten proteinhaltigen Lösung mit der Oberfläche des Substrats im erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren erfolgt bevorzugt für mindestens 15 min, vorzugsweise für maximal 48 Stunden. Dieser Verfahrensschritt wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 70 °C, besonders bevorzugt oberhalb des Krafft-Punktes (Krafft-Temperatur) des eingesetzten Tensids durchgeführt. Während dieses Verfahrensschritts lagern sich die selbstassemblierenden Proteinmoleküle geordnet in Form einer Monolage auf der Oberfläche des Substrats ab. Anschließend wird die überstehende proteinhaltige Lösung vom Substrat entfernt, indem die Lösung vorzugsweise entweder abgezogen wird oder das beschichtete Substrat getrocknet wird (Entfernung des Lösungsmittels). Wird die proteinhaltige Lösung vom Substrat abgezogen, so wird die beschichtete Substratoberfläche durch mehrmaliges Spülen mit deionisiertem Wasser von überstehenden, nichtgebundenen Proteinmolekülen befreit. Die Trocknung des beschichteten Substrats erfolgt vorzugsweise durch Behandlung mit Kompressionsluft.The contacting of the stabilized protein-containing solution with the surface of the substrate in the coating method according to the invention is preferably carried out for at least 15 minutes, preferably for a maximum of 48 hours. This process step is preferably carried out at a temperature of 15 to 70 ° C, more preferably above the Krafft point (Krafft temperature) of the surfactant used. During this process step, the self-assembling protein molecules deposit in the form of a monolayer on the surface of the substrate. Subsequently, the supernatant proteinaceous solution is removed from the substrate by preferably either stripping the solution or drying the coated substrate (removal of the solvent). If the protein-containing solution is removed from the substrate, the coated substrate surface is freed from excess, unbound protein molecules by repeated rinsing with deionized water. The drying of the coated substrate is preferably carried out by treatment with compressed air.
Für erfindungsgemäße Beschichtungsverfahren sind Substrate verschiedener Struktur geeignet. Besonders vorteilhaft eignet sich das erfindungsgemäße Beschichtungsverfahren auch für poröse Substrate und ermöglicht einen homogenen geordneten Schichtaufbau auch innerhalb des schwer zugänglichen Porensystems. Bevorzugte Substrate sind metallische Substrate, siliziumhaltige Feststoffe (insbesondere Glas oder Siliziumwafer), keramische oder polymere Feststoffe (insbesondere Polytetrafluorethylen). Substrates of various structures are suitable for coating processes according to the invention. Particularly advantageously, the coating method of the invention is also suitable for porous substrates and allows a homogeneous ordered layer structure even within the difficult to access pore system. Preferred substrates are metallic substrates, silicon-containing solids (in particular glass or silicon wafers), ceramic or polymeric solids (in particular polytetrafluoroethylene).
Mit dem erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren wird ein Substrat erzeugt, welches oberhalb der monolagigen proteinhaltigen Beschichtung eine Schicht aufweist, die das oder die Tenside enthält. Die auf der Oberfläche der proteinhaltigen Beschichtung vorliegende tensidhaltige Schicht schützt die Oberfläche der proteinhaltigen Beschichtung und das selbstassemblierende Protein vor thermischer und chemischer Beanspruchung (und wirkt daher als Schutzschicht). Die tensidhaltige Schicht ist bevorzugt durch koordinative Bindung an die Proteinschicht gebunden.The coating method according to the invention produces a substrate which has a layer above the monolayer protein-containing coating which contains the surfactant (s). The surfactant-containing layer present on the surface of the protein-containing coating protects the surface of the protein-containing coating and the self-assembling protein from thermal and chemical stress (and therefore acts as a protective layer). The surfactant-containing layer is preferably bound by coordinate binding to the protein layer.
Für einige Anwendungen ist es erforderlich, die tensidhaltige Schutzschicht zu entfernen um die Zugänglichkeit der Proteine zu gewährleisten. Es wird in einem erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren dafür vorzugsweise die auf der Oberfläche der auf dem Substrat befindlichen proteinhaltigen Beschichtung angeordnete tensidhaltige Schicht entfernt, wobei dafür bevorzugt im Anschluss an den Verfahrensschritt iii):
- – das beschichtete Substrat mehrmals unter mechanischer Einwirkung gewaschen wird und/oder
- – die Tensid-Schicht durch Pufferbehandlung in einer Fällungsreaktion entfernt wird.
- - The coated substrate is washed several times under mechanical action and / or
- - The surfactant layer is removed by buffer treatment in a precipitation reaction.
Das oder die eingesetzten Tenside können entweder aus der im Schritt iii) vom beschichteten Substrat abgezogenen wässrigen Lösung durch bekannte Methoden (beispielsweise durch Fällung) wiedergewonnen werden und können dadurch nach einem Reinigungsschritt erneut verwendet werden. The surfactant or surfactants used can either be recovered from the aqueous solution withdrawn from the coated substrate in step iii) by known methods (for example by precipitation) and can thus be reused after a purification step.
Von der Erfindung ist auch ein Substrat mit einer proteinhaltigen Beschichtung mindestens eines selbstassemblierenden Proteins umfasst. Das erfindungsgemäße Substrat weist
- – auf der Substratoberfläche eine Monolage mindestens eines selbstassemblierenden Proteins auf und
- – auf der Oberfläche der Monolage des mindestens einen selbstassemblierenden Proteins befindet eine weitere Schicht, die mindestens ein ionisches Tensid enthält. Dabei liegt das Tensid mit dem selbstassemblierenden Protein in koordinativer Bindung vor.
- On the substrate surface, a monolayer of at least one self-assembling protein and
- - On the surface of the monolayer of at least one self-assembling protein is another layer containing at least one ionic surfactant. In this case, the surfactant is in coordinative binding with the self-assembling protein.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Substrat durch ein erfindungsgemäßes Beschichtungsverfahren erhältlich. Auf der Substratoberfläche ist somit zunächst die Monolage des mindestens einen selbstassemblierenden Proteins angeordnet und darauf befindet sich eine weitere, tensidhaltige Schicht. Preferably, a substrate according to the invention is obtainable by a coating method according to the invention. The monolayer of the at least one self-assembling protein is thus initially arranged on the substrate surface, and there is a further, surfactant-containing layer thereon.
Von der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Stabilisierung von Monomeren mindestens eines selbstassemblierenden Proteins in einer wässrigen Lösung umfasst (hierin auch „Stabilisierungsverfahren“). Bei dem erfindungsgemäßen Stabilisierungsverfahren wird
- a) mindestens ein selbstassemblierendes Protein mit einer wässrigen Lösung, vorzugsweise einer wässrigen Pufferlösung, versetzt, und anschließend
- b) in Abwesenheit von Substanzen, die zur Spaltung von Disulfidbrücken geeignet sind, eine wässrige Lösung enthaltend mindestens ein ionisches Tensid portionsweise zu der proteinhaltigen Lösung aus a) zugegeben, wobei nach der Zugabe die finale Tensidkonzentration cTensid in mol/l in folgendem Bereich liegt: wobei AO,Protein der Oberfläche eines Moleküls des selbstassemblierenden Proteins entspricht, ATKG der Querschnittsfläche der Kopfgruppe des Tensids entspricht und cProtein der Konzentration des selbstassemblierenden Proteins in mol/l entspricht.
- a) at least one self-assembling protein with an aqueous solution, preferably an aqueous buffer solution added, and then
- b) in the absence of substances which are suitable for the cleavage of disulfide bridges, an aqueous solution containing at least one ionic surfactant added in portions to the protein-containing solution from a), wherein after the addition, the final surfactant concentration c surfactant in mol / l in the following range : where A O, protein corresponds to the surface of a molecule of the self-assembling protein, A TKG corresponds to the cross-sectional area of the head group of the surfactant and c protein corresponds to the concentration of the self-assembling protein in mol / l.
Weitere Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Stabilisierungsverfahrens sind analog zu den Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahrens. Further embodiments of the stabilization method according to the invention are analogous to the embodiments of the coating method according to the invention.
Eine, vorzugsweise durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältliche, stabilisierte wässrige proteinhaltige Lösung, welche mindestens ein selbstassemblierendes Protein und mindestens ein Tensid enthält, ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung (die Bezeichnungen „stabilisierte wässrige Lösung“ und „stabilisierte Monomere in wässriger Lösung“ werden hierin synonym verwendet). Bevorzugt sind stabilisierte Proteinmonomerlösungen.A stabilized aqueous proteinaceous solution, which is preferably obtainable by a process according to the invention and which contains at least one self-assembling protein and at least one surfactant, is likewise provided by the invention (the terms "stabilized aqueous solution" and "stabilized monomers in aqueous solution" are used synonymously herein ). Preference is given to stabilized protein monomer solutions.
Die erfindungsgemäße stabilisierte wässrige Lösung enthält mindestens ein selbstassemblierendes Protein, mindestens ein ionisches Tensid und enthält keine Substanzen, die zur Spaltung von Disulfidbrücken geeignet sind (maximal 0,01 Gew.-% bezogen auf das selbstassemblierende Protein, vorzugsweise maximal 0,0001 Gew.%). In der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung liegen Monomere des selbstassemblierenden Proteins in koordinativer Bindung mit dem ionischen Tensid vor (Protein-Tensid-Komplex). Die Tensidkonzentration cTensid in mol/l in der wässrigen Lösung liegt in folgendem Bereich: 
Dabei entspricht AO,Protein der Oberfläche eines Moleküls des selbstassemblierenden Proteins, ATKG der Querschnittsfläche der Kopfgruppe des Tensids und cProtein der Konzentration des selbstassemblierenden Proteins in mol/l.A O, protein corresponds to the surface of a molecule of the self-assembling protein, A TKG to the cross-sectional area of the head group of the surfactant and c protein to the concentration of the self-assembling protein in mol / l.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen stabilisierten proteinhaltigen Lösung zur Beschichtung von Substratoberflächen mit einer Monolage eines selbstassemblierenden Proteins. The invention also encompasses the use of a stabilized protein-containing solution according to the invention for coating substrate surfaces with a monolayer of a self-assembling protein.
Nachfolgende Ausgestaltungen sind für die Erfindung bevorzugt:
Das selbstassemblierende Protein ist bevorzugt ausgewählt aus Hydrophobinen und Surface Layer Proteinen (S-Layer-Proteinen). Bevorzugte Hydrophobine sind Hydrophobine der Klasse I, vorzugsweise Ccg2 aus Neurospora crassa, oder Hydrophobine der Klasse II, vorzugsweise HFBI oder HFBII aus Trichoderma reesei. Bevorzugte S-Layer-Proteine sind SbsC aus Bacillus stearothermophilus, S13240 aus Bacillus stearothermophilus oder SslA aus Sporosarcina ureae. Subsequent embodiments are preferred for the invention:
The self-assembling protein is preferably selected from hydrophobins and surface layer proteins (S-layer proteins). Preferred hydrophobins are class I hydrophobins, preferably Ccg2 Neurospora crassa, or Class II hydrophobin, preferably HFBI or HFBII, from Trichoderma reesei. Preferred S-layer proteins are SBSC from Bacillus stearothermophilus, S13240 from Bacillus stearothermophilus or SslA from Sporosarcina ureae.
Besonders vorteilhaft ist die Erfindung für funktionalisierte selbstassemblierende Proteine geeignet, da durch den geordneten Schichtaufbau von Monolagen des funktionalisierten selbstassemblierenden Proteins die Zugänglichkeit der Funktionalisierung sichergestellt werden kann. Es ist vorteilhaft möglich, die Beschichtung des Substrats so durchzuführen, dass die Funktionalisierung auf der vom Substrat abgewandten Seite der proteinhaltigen Beschichtung vorliegt.Particularly advantageously, the invention is suitable for functionalized self-assembling proteins, since the accessibility of the functionalization can be ensured by the ordered layer structure of monolayers of the functionalized self-assembling protein. It is advantageously possible to carry out the coating of the substrate so that the functionalization is present on the side of the protein-containing coating remote from the substrate.
Bevorzugt ist das selbstassemblierende Protein daher ein rekombinantes Fusionsprotein, also ein Protein, welches von gentechnisch veränderten Organismen hergestellt wird. Durch Fusion der Gene zweier oder mehr natürlicherweise nicht in dieser Kombination vorliegender Proteindomänen, die üblicherweise über flexible Linkerstrukturen (Linkerpeptide) miteinander verbunden sind, ist durch Expression des fusionierten Gens das rekombinante Fusionsprotein erhältlich. Ein in der Erfindung eingesetztes rekombinantes Fusionsprotein umfasst mindestens zwei Domänen, wobei eine Domäne eine selbstassemblierende Proteindomäne ist (bevorzugt ausgewählt aus den oben genannten selbstassemblierenden Proteinen) und eine Domäne eine funktionelle Domäne ist. Bevorzugte funktionelle Domänen sind fluoreszierende Proteindomänen, katalytische Domänen oder Proteindomänen mit Enzymaktivität. The self-assembling protein is therefore preferably a recombinant fusion protein, ie a protein which is produced by genetically modified organisms. By fusing the genes of two or more protein domains that are not naturally present in this combination, which are usually connected to one another via flexible linker structures (linker peptides), the recombinant fusion protein can be obtained by expression of the fused gene. A recombinant fusion protein employed in the invention comprises at least two domains, one domain being a self-assembling protein domain (preferably selected from the above-mentioned self-assembling proteins) and one domain being a functional domain. Preferred functional domains are fluorescent protein domains, catalytic domains or protein domains with enzyme activity.
Die mindestens ein selbstassemblierendes Protein enthaltende wässrige Lösung, zu der die tensidhaltige Lösung zugegeben wird, enthält in einer Ausführungsvariante Mischungen selbstassemblierender Proteine, vorzugsweise mindestens ein funktionalisiertes selbstassemblierendes Protein in Kombination mit mindestens einem nicht-funktionalisierten selbstassemblierenden Protein. Dadurch wird die Stabilität der proteinhaltigen Beschichtung verbessert. Diese Ausführungsvariante ist besonders für funktionalisierte selbstassemblierende Proteine mit großen funktionellen Domänen vorteilhaft, um die Wechselwirkung zwischen assemblierenden Domänen unterschiedlicher Proteinmoleküle zu ermöglichen. The at least one self-assembling protein-containing aqueous solution to which the surfactant-containing solution is added contains in one embodiment mixtures of self-assembling proteins, preferably at least one functionalized self-assembling protein in combination with at least one non-functionalized self-assembling protein. This improves the stability of the proteinaceous coating. This embodiment variant is particularly advantageous for functionalized self-assembling proteins with large functional domains in order to facilitate the interaction between assembling domains of different protein molecules.
In einem erfindungsgemäßen beschichteten Substrat, welches als selbstassemblierendes Protein rekombinantes Fusionsprotein enthält, ist die funktionelle Domäne des rekombinanten Fusionsproteins bevorzugt auf der vom Substrat abgewandten Seite der proteinhaltigen Beschichtung angeordnet. Die selbstassemblierende Proteindomäne des rekombinanten Fusionsproteins ist auf der dem Substrat zugewandten Seite der proteinhaltigen Beschichtung angeordnet. Die Beschichtung, die mindestens ein Tensid enthält, ist somit in diesem Fall oberhalb der funktionellen Domäne des rekombinanten Fusionsproteins angeordnet. In a coated substrate according to the invention which contains recombinant fusion protein as a self-assembling protein, the functional domain of the recombinant fusion protein is preferably arranged on the side of the protein-containing coating remote from the substrate. The self-assembling protein domain of the recombinant fusion protein is arranged on the substrate-facing side of the protein-containing coating. The coating containing at least one surfactant is thus in this case located above the functional domain of the recombinant fusion protein.
Das Tensid ist ein anionisches oder kationisches Tensid, vorzugsweise ausgewählt aus Natriumdodecylsulfat (SDS) und Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB). The surfactant is an anionic or cationic surfactant, preferably selected from sodium dodecyl sulfate (SDS) and cetyltrimethylammonium bromide (CTAB).
Die Erfindung bietet den Vorteil, stabilisierte Monomerlösungen von selbstassemblierenden Proteinen bereitzustellen, in denen die unkontrollierte Aggregation der Proteine unterbunden ist. Durch gezielte Monomerisierung und Stabilisierung der Lösung können diese zur positionsunabhängigen Beschichtung von Substratoberflächen eingesetzt werden. The invention offers the advantage of providing stabilized monomer solutions of self-assembled proteins in which the uncontrolled aggregation of the proteins is prevented. Through targeted monomerization and stabilization of the solution, these can be used for position-independent coating of substrate surfaces.
Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele soll die Erfindung näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.Reference to the following figures and embodiments, the invention will be explained in more detail, without limiting the invention to these.
Ausführungsbeispiel 1: Expression rekombinanter selbstassemblierender Fusionsproteine in E. coli und Aufreinigung
Es wurden die in Tabelle 1 genannten rekombinanten Fusionsproteine generiert, welche jeweils N-terminal die selbstassemblierende Proteindomäne enthalten und C-terminal eine darin bezeichnete funktionelle Domäne enthalten. Tabelle 1:
Dazu wurden die für die jeweilige Domäne kodierenden DNA Sequenzen mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert und über eine overlap PCR wurde ein Fusionsgen zusammengefügt. Die verwendeten flankierenden Primer enthielten Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonukleasen NdeI und XhoI. Nach Vektor- und Fragmentrestriktion über die entsprechenden Endonukleasen, Ligation und Transformation in Escherichia coli (E. coli) als Wirtsorganismus, wurde die Anwesenheit des Fusionsgens in den generierten Plasmiden überprüft. For this purpose, the DNA sequences coding for the respective domain were amplified by means of polymerase chain reaction (PCR) and a fusion gene was assembled by overlap PCR. The flanking primers used contained recognition sequences for the restriction endonucleases NdeI and XhoI. After vector and fragment restriction via the corresponding endonucleases, ligation and transformation into Escherichia coli (E. coli) as the host organism, the presence of the fusion gene in the generated plasmids was checked.
Für die Produktion des das selbstassemblierende Protein enthaltenden Fusionsproteins, wurden die Plasmide, die das generierte Fusionsgen korrekt enthielten, in den E. coli Stamm SHuffle® T7 Express transformiert. Das Fusionsprotein wird in den Bakterienzellen intrazellulär angereichert. For the production of the self-assembling protein fusion protein containing the plasmids containing the generated fusion correctly, were transformed into the E. coli strain shuffle ® T7 Express. The fusion protein is accumulated intracellularly in the bacterial cells.
Die transformierten E. coli Zellen wurden bei 30 °C kultiviert. Die Expression des Fusionsgens wurde durch Zugabe von 0,4 mM (mmol/l) IPTG induziert. Nach 4–6 h wurden die Zellen mittels Zentrifugation (bei 4000 × g, 4°C, 10 min) pelletiert. Nach zweimaligem Waschen des Zellpellets mit 50 mM Trispuffer (pH 7,5) wurden die Zellen erneut durch Zentrifugation pelletiert. Zum Zellaufschluss wurden die E. coli Zellen einer dreifachen Ultraschallbehandlung (9 cyc., 70%, 4°C, 2 min) und einer anschließenden dreimaligen French Press-Behandlung (20´000 psi) unterzogen. Die aufgeschlossenen Bakterienzellen wurden zweimal mit 50 mM Trispuffer (pH 7,5) gewaschen. Zur Proteinextraktion wurden die aufgeschlossenen Zellen in 1 ml Lysepuffer aufgenommen und bei 23 °C für 30 min inkubiert. Die Reinigung des Fusionsproteins erfolgte mittels Nickelaffinitätschromatographie. Die Elution des Fusionsproteins erfolgte in einem isotyp zusammengesetzten Phosphatpuffer (pH 4,5) mit 250 mM Imidazol. The transformed E. coli cells were cultured at 30 ° C. Expression of the fusion gene was induced by addition of 0.4 mM (mmol / L) IPTG. After 4-6 h, the cells were pelleted by centrifugation (at 4000 x g, 4 ° C, 10 min). After washing the cell pellet twice with 50 mM Tris buffer (pH 7.5), the cells were again pelleted by centrifugation. For cell disruption, the E. coli cells were subjected to a triple sonication (9 cyc., 70%, 4 ° C, 2 min.) Followed by a three-time French Press treatment (20,000 psi). The digested bacterial cells were washed twice with 50 mM Tris buffer (pH 7.5). For protein extraction, the disrupted cells were taken up in 1 ml lysis buffer and incubated at 23 ° C for 30 min. The purification of the fusion protein was carried out by means of nickel affinity chromatography. The elution of the fusion protein was carried out in an isotype phosphate buffer (pH 4.5) with 250 mM imidazole.
Um das Protein in einen aktiven Zustand zu überführen, wurde das erhaltene Eluat gegen das 4000fache Volumen eines Dialysepuffers bei 4 °C für maximal 48 h dialysiert. Zur Dialyse von Hydrophobinen wurde ein Tris-Puffer (50 mM, pH 8,5 mit 1 mM Glutathion reduziert und 0,2 mM Glutathion oxidiert) verwendet. Zur Dialyse von Surface-Layer-Proteinen wurde 10 mM Tris-Puffer (pH 9,0) als Dialysepuffer eingesetzt.To convert the protein to an active state, the resulting eluate was dialyzed against 4000 times the volume of a dialysis buffer at 4 ° C for a maximum of 48 hours. For dialysis of hydrophobins, a Tris buffer (50 mM, pH 8.5 with 1 mM glutathione reduced and 0.2 mM glutathione oxidized) was used. For dialysis of surface-layer proteins, 10 mM Tris buffer (pH 9.0) was used as the dialysis buffer.
Ausführungsbeispiels 2: Erzeugung einer Proteinmonolage auf einem Siliziumwafer
Es wurde eine geordnete Proteinmonolage eines selbstassemblierenden Proteins, wie in Ausführungsbeispiel 1 erhalten, auf einem Siliziumwafer generiert. Dazu wurde das Fusionsprotein HFBI-(XSR5P)3 eingesetzt, welches als selbstassemblierende Domäne ein Klasse I Hydrophobin (HFBI aus Trichoderma reesei) enthält und als funktionelle Domäne ein Human influenza hemaglutinin-Tag enthält.An ordered protein monolayer of self-assembling protein as obtained in
Es wurde zunächst zur Sedimentierung größerer Proteinaggregate eine Zentrifugation durchgeführt (15 min bei 18000 × g, 4°C) und die Proteinkonzentration bestimmt (nach Lowry). Das Sediment wurde in 50 mM Trispuffer pH 8,5 aufgenommen. Es wurde eine Proteinkonzentration von 100 ng/µl eingestellt. Centrifugation was first carried out for sedimentation of larger protein aggregates (15 min at 18,000 × g, 4 ° C.) and the protein concentration was determined (according to Lowry). The sediment was taken up in 50 mM Tris buffer pH 8.5. A protein concentration of 100 ng / μl was set.
Zu dieser proteinhaltigen Lösung wurde eine filtrierte 8 mM Natriumdodecylsulfat (SDS) in vier Einzelportionen über einen Zeitraum von 10 min zugegeben. Für HFBI-(XSR5P)3 betrug die zugegebene Tensidstoffmenge je Liter der auf eine Proteinkonzentration von 100 ng/µl eingestellten Lösung 2 mmol, so dass eine finale Tensidkonzentration von 2 mmol/l in der Lösung eingestellt wurde. To this protein containing solution was added a filtered 8 mM sodium dodecylsulfate (SDS) in four portions over a period of 10 minutes. For HFBI- (XSR5P) 3 , the added amount of surfactant per liter of the solution adjusted to a protein concentration of 100 ng / μl was 2 mmol, so that a final surfactant concentration of 2 mmol / l was set in the solution.
Aus Gleichung (3) ergibt sich eine einzustellende Tensidstoffkonzentration bei einer 100 ng/µl Proteinlösung zwischen 0,5 mmol/l und 5,6 mmol/l. Das selbstassemblierende Fusionsprotein HFBI-(XSR5P)3 hat ein Molekulargewicht von etwa 14000 g/mol. Bei einer Proteinkonzentration von 100 ng/µl in der Lösung beträgt die Konzentration in mol/l entsprechend 7,14·10–6 mol/l. Die Tensidkopfgruppe des eingesetzten SDS-Moleküls weist eine effektive Fläche von ATKG von 0,62 nm2 auf. Das Proteinmolekül weist einen hydrodynamischen Radius RH von 2,7 nm auf. Daraus ergibt sich aus Gleichung (4) eine Proteinoberfläche AO,Protein = 91,6 nm2.From Equation (3), a surfactant concentration to be adjusted at a 100 ng / μl protein solution is between 0.5 mmol / l and 5.6 mmol / l. The self-assembling fusion protein HFBI- (XSR5P) 3 has a molecular weight of about 14000 g / mol. At a protein concentration of 100 ng / μl in the solution, the concentration in mol / l is corresponding to 7.14 · 10 -6 mol / l. The surfactant head group of the SDS molecule used has an effective area of A TKG of 0.62 nm 2 . The protein molecule has a hydrodynamic radius R H of 2.7 nm. This results in equation (4) a protein surface A O, protein = 91.6 nm. 2
Die auf diese Weise erhaltene stabilisierte Lösung war klar und für mindestens fünf Tage bei Lagerung bei 20 °C stabil. The stabilized solution thus obtained was clear and stable for at least five days when stored at 20 ° C.
Die stabilisierte Lösung, die Monomere des selbstassemblierenden Proteins enthält, wurde zur Beschichtung eines Siliziumwafers mit den Kantenlängen 1 × 1 cm eingesetzt. Dazu wurden 100 µl der stabilisierten proteinhaltigen Lösung auf den Siliziumwafer aufgebracht und für mindestens 30 min inkubiert. Anschließend wurde die überstehende Lösung abgezogen und der mit HFBI-(XSR5P)3 beschichtete Siliziumwafer in filtriertem bidestillierten Wasser gewaschen. Die Lagerung des beschichteten Siliziumwafers erfolgte in dem in Ausführungsbeispiel 1 genannten Dialysepuffer. The stabilized solution containing monomers of the self-assembling protein was used to coat a silicon wafer with the
Die abgezogene stabilisierte Proteinlösung konnte anschließend für weitere Beschichtungsverfahren eingesetzt werden.The stripped stabilized protein solution could then be used for further coating processes.
Um die funktionelle Domäne des selbstassemblierenden Fusionsproteins auf dem Substrat zugänglich zu machen, wurde verbleibendes Tensid vom beschichteten Substrat mittels Fällungsreaktion entfernt.In order to access the functional domain of the self-assembling fusion protein on the substrate, remaining surfactant was removed from the coated substrate by precipitation reaction.
Ausführungsbeispiel 3: Charakterisierung der in Ausführungsbeispiel 2 hergestellten Beschichtung mit HFBI-(XSR5P)3 auf einem Siliziumwafer mittels EllipsometrieExemplary Embodiment 3: Characterization of the Coating Using HFBI- (XSR5P) 3 Produced in Embodiment 2 on a Silicon Wafer by Ellipsometry
Der in Ausführungsbeispiel 2 erhaltene beschichtete Siliziumwafer wurde ellipsometrisch untersucht (Multiskop von Firma OPTREL (Berlin)). Es wurde die Änderung der Polarisationsebene eines monochromatischen Laserstrahls (Wellenlänge 632,8 nm) durch Reflexion in einem Winkel von 136° ermittelt. Durch Intensitätsmessung der senkrecht (RS) und parallel (Rp) reflektierten Einfallsebenen des polarisierten Lichtstrahls wurde das Intensitätsverhältnis (ρ) bestimmt. Die ellipsometrischen Winkel Δ und Ψ werden über die FRENSELschen Formeln abgeleitet. Unter Einberechnung der Brechungsindizes der einzelnen Lagen wurde die Schichtdicke der obersten Lage kalkuliert. 
Dabei geben δp und δs die Phasenverschiebung zum Nullpunkt von parallel und senkrecht polarisiertem Licht an. Es wurden die aus der Literatur bekannten optischen Konstanten für Silizium als Substrat und Siliziumdioxid eingesetzt. Als Brechungsindex des Proteinfilms wurde 1,375 eingesetzt. In this case, δ p and δ s indicate the phase shift to the zero point of parallel and perpendicularly polarized light. The optical constants known from the literature for silicon were used as substrate and silicon dioxide. The refractive index of the protein film was 1.375.
Die ermittelte Schichtdicke von HFBI-(XSR5P)3 auf dem Siliziumwafer betrug 13,2 ± 0,2 Å. Dies entspricht den Literaturwerten für eine Monolage des selbstassemblierenden Proteins. The determined layer thickness of HFBI- (XSR5P) 3 on the silicon wafer was 13.2 ± 0.2 Å. This corresponds to the literature values for a monolayer of self-assembling protein.
Die folgende Tabelle 2 zeigt die ellipsometrischen Daten einer Analyse von vier unterschiedlichen Proben (1 bis 4, die unterschiedlichen Werte in den einzelnen Zeilen wurden an unterschiedlichen Messpunkten auf der jeweiligen Probe aufgenommen): Tabelle 2: 
Ausführungsbeispiel 4: Rasterelektronenmikroskopie (REM) eines mit SbsC-(R5P)2 beschichteten SiliziumwafersEMBODIMENT 4 Scanning Electron Microscopy (SEM) of a Sbsc (R5P) 2 Coated Silicon Wafer
Es wurde ein Siliziumwafer analog zu Ausführungsbeispiel 2 mit dem selbstassemblierenden Protein SbsC-(R5P)2 (Tabelle 1) beschichtet. Der erhaltene beschichtete Siliziumwafer wurde mittels REM (Zeiss DSM 982 Gemini) untersucht. Für die Analyse wurde der beschichtete Siliziumwafer getrocknet und anschließend mit einer atomaren Goldschicht bedampft. Die Ergebnisse der REM-Analyse sind in
Ausführungsbeispiel 5: Rasterkraftmikroskopie (AFM) eines mit Ccg2-HA beschichteten SiliziumwafersExemplary Embodiment 5 Atomic Force Microscopy (AFM) of a Ccg2-HA Coated Silicon Wafer
Ein analog zu Ausführungsbeispiel 2 mit Ccg2-HA beschichteter Siliziumwafer wurde im wässrigen Milieu mittels AFM untersucht. Die Ergebnisse der AFM-Analyse sind in
Ausführungsbeispiel 6: Exponierung von funktionellen Domänen bei selbstassemblierenden FusionsproteinenExemplary Embodiment 6: Exposure of Functional Domains to Self-Assembling Fusion Proteins
Mit dem in Ausführungsbeispiel 1 hergestellten selbstassemblierenden Fusionsprotein HFBI-(R5P)2 wurde analog zu Ausführungsbeispiel 2 ein Siliziumwafer mit einer Monolage des Proteins beschichtet. Die Schichtdicke, die ellipsometrisch analog zu Beispiel 3 ermittelt wurde, betrug 13,8 ± 0,4 Å. Im Fusionsprotein ist die funktionelle Domäne, die R5P-Untereinheit des Silaffins mit dem hydrophilen Teil des Hydrophobins fusioniert. With the self-assembling fusion protein HFBI- (R5P) 2 produced in Example 1, a silicon wafer was coated with a monolayer of the protein analogously to Example 2 . The layer thickness, which was determined ellipsometrically analogously to Example 3, was 13.8 ± 0.4 Å. In the fusion protein, the functional domain, the R5P subunit of silaffins, is fused to the hydrophilic part of the hydrophobin.
Es wurde anhand des beschichteten Siliziumwafers mittels Kontaktwinkelmessung überprüft, ob die hydrophile Domäne des selbstassemblierenden Proteins und damit auch die funktionelle Domäne R5P in das Medium, also auf der vom Siliziumwafer abgewandten Seite, orientiert ist. Dazu wurde der Kontaktwinkel in Luft nach der sessile drop Methode bestimmt (Drop Shape Analysis System DSA10, Krüss GmbH, Deutschland). Es wurde der Kontaktwinkel in Grad eines Tropfens von 2 µl deionisiertem Wasser bestimmt. It was checked on the basis of the coated silicon wafer by means of contact angle measurement, whether the hydrophilic domain of the self-assembling protein and thus also the functional domain R5P is oriented in the medium, ie on the side facing away from the silicon wafer. For this purpose, the contact angle in air was determined by the sessile drop method (Drop Shape Analysis System DSA10, Kruss GmbH, Germany). The contact angle in degrees of a drop of 2 μl of deionized water was determined.
Ein mit Ethanol gereinigter, unbeschichteter Siliziumwafer wies einen Kontaktwinkel von θ = 35,2 ± 2° auf. Der mit HFBI-(R5P)2 beschichtete Siliziumwafer weist einen Kontaktwinkel von θ = 56,4 ± 0,7° auf. Dies ist ein deutliches Indiz dafür, dass die hydrophile Domäne in das Medium exponiert ist. An uncoated silicon wafer cleaned with ethanol had a contact angle of θ = 35.2 ± 2 °. The HFBI (R5P) 2 coated silicon wafer has a contact angle of θ = 56.4 ± 0.7 °. This is a clear indication that the hydrophilic domain is exposed in the medium.
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| Genetically Engineered S-Layer Proteins and S-Layer Specific Heteropolysaccharides as Components of a Versatile Molecular ConstructionKit for Applications in Nanobiotechnology. 2008. In: Chemistry and Material Science, Vol. II, S. 55-86. Zusammenfassung * |
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