DE102011050519A1

DE102011050519A1 - Use of alkyl sulfur alkanoic acid derivatives for treating chronic inflammatory diseases e.g. multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, Wegener's granulomatosis and Churg-Strauss syndrome, Crohn's disease

Info

Publication number: DE102011050519A1
Application number: DE102011050519A
Authority: DE
Inventors: Saleh Ibrahim; Susanne Lemcke
Original assignee: Universitaet Rostock
Current assignee: Universitaet Rostock
Priority date: 2011-05-20
Filing date: 2011-05-20
Publication date: 2012-11-22

Abstract

Use of alkyl sulfur alkanoic acid derivatives for treating chronic inflammatory diseases, is claimed. Use of alkyl sulfur alkanoic acid derivatives of formula (R 1>-O-C(=O)-(CH 2) n-S-R 2>) (I) or their salts for treating chronic inflammatory diseases, is claimed. R 1>H or 1-4C-alkyl; R 2>10-18C-alkyl; and n : 1 or 2. ACTIVITY : Antiinflammatory; Neuroprotective; Antiarthritic; Antirheumatic; Dermatological; Immunosuppressive; Antiallergic; Vasotropic; Vasotropic, Antiinflammatory; Gastrointestinal-Gen.; Antiulcer; Antipsoriatic. MECHANISM OF ACTION : None given.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Alkylschwefelalkansäurederivaten und ihren pharmazeutisch verträglichen Salzen zur Behandlung chronisch-entzündlicher Erkrankungen.The invention relates to the use of Alkylschwefelalkansäurederivaten and their pharmaceutically acceptable salts for the treatment of chronic inflammatory diseases.

Chronisch entzündliche Erkrankungen sind durch anhaltende Entzündung gekennzeichnet. In diese Kategorie fallen eine Reihe von Erkrankungen. Die Patienten entwickeln eine chronische entzündliche Erkrankung, weil das Immunsystem eine unangemessene Reaktion auf etwas, dem es ausgesetzt worden ist, zeigt. In einigen Fällen bedeutet dies, dass der Patient eine Autoimmunerkrankung entwickelt, bei der das Immunsystem beginnt, den eigenen Körper anzugreifen. In anderen Fällen erfährt der Patient eine chronische Entzündung als Reaktion auf bestimmte Lebensmittel oder Umweltfaktoren. Chronic inflammatory diseases are characterized by persistent inflammation. This category includes a number of diseases. Patients develop a chronic inflammatory disease because the immune system shows an inappropriate response to something to which it has been exposed. In some cases, this means that the patient develops an autoimmune disease in which the immune system begins to attack one's body. In other cases, the patient experiences chronic inflammation in response to certain foods or environmental factors.

Chronische Entzündungen können erhebliche Schäden verursachen, und es kann zu einer Vielzahl von Problemen, je nachdem wo sie auftreten, kommen. Zu den chronisch-entzündlichen Erkrankungen gehören neben der Multiplen Sklerose (MS), rheumatoide Arthritis (RA), systemischer Lupus erythematodes (SLE), Wegener Granulomatosis (WG), Churg-Strauss Syndrom (CSS), Morbus Crohn (CD Crohn's Disease), Colitis ulcerosa (UC ulcerative colitis), primäre sklerosierende Cholangitis (PSC) und Psoriasis. Chronic inflammation can cause significant damage and can lead to a variety of problems, depending on where they occur. Chronic inflammatory diseases include multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis (RA), systemic lupus erythematosus (SLE), Wegener's granulomatosis (WG), Churg-Strauss syndrome (CSS), Crohn's disease (Crohn's Disease), Ulcerative colitis (UC ulcerative colitis), primary sclerosing cholangitis (PSC) and psoriasis.

Einige dieser Erkrankungen haben eine klare genetische Komponente, die zur Identifikation genutzt werden kann. In anderen Fällen können bestimmte Gene das Risiko der Entwicklung einer Krankheit erhöhen. In wieder anderen Fällen ist der Beginn scheinbar zufällig oder hervorgerufen durch äußere Einflüsse. Some of these diseases have a clear genetic component that can be used for identification. In other cases, certain genes may increase the risk of developing a disease. In other cases the beginning is seemingly coincidental or caused by external influences.

MS gehört zu den entzündlichen Erkrankungen, welche die Degeneration von Nervengewebe verursachen. Insbesondere in der jungen Bevölkerung ist von den neurodegenerativen Erkrankungen MS am häufigsten vertreten. Es handelt sich um eine chronisch-entzündliche Autoimunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Die Krankheit zeichnet sich durch die Zerstörung der Myelinscheiden aus, welche die Axone der Nervenzellen umgeben. Strukturell ist sie durch Infiltration peripherer inflammatorischer Zellen gekennzeichnet, wobei es sich meistens um T- und B-Lymphozyten handelt. Diese Zellen finden sich in der weißen Substanz an lokalen Zerstörungspunkten, wo sie die Myelinscheiden angreifen. Zur Krankheitsursache von MS existieren lediglich einige Vermutungen, dass die genetische Prädisposition eine Rolle beim Verlauf der Krankheit spielen kann. Eine Assoziierung verschiedener Allele und Haplotypen der Region des humanen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC-Region) konnte nachgewiesen werden. Beispielsweise ergibt das HLA-DRB1*15-Allel ein vierfaches relatives Risiko für die Entwicklung von MS (vgl. Miterski B, Jaeckel S, Epplen JT, Pohlau D, Hardt C (1999), Genes Immun. 1: 37–44 ). Gene außerhalb der humanen Leukozytenantigen-Region (HLA-Region), welche sich auf die Empfänglichkeit für MS auswirken können, wurden ebenfalls untersucht. Es wurde angenommen, dass etwa 20–30 Gene außerhalb der HLA-Region relevant für die MS-Pathogenese seien könnten (vgl. Butterfiled RJ, Blankenhorn EP, Roper RJ, Zachary JF, Doerge RW, Teuscher C (2000), Am J. Pathol. 157: 637–645 ; Bergsteinsdottir K, Yang HAT, Petterson U, Holmdahl R (2000), J. Immunol. 164: 1564–1568 ). MS is one of the inflammatory diseases that cause the degeneration of nerve tissue. Especially in the young population MS is the most prevalent neurodegenerative disease. It is a chronic inflammatory autoimmune disease of the central nervous system (CNS). The disease is characterized by the destruction of the myelin sheath surrounding the axons of nerve cells. Structurally, it is characterized by infiltration of peripheral inflammatory cells, most commonly T and B lymphocytes. These cells are found in the white matter at local destruction sites where they attack the myelin sheaths. There are only a few assumptions about the cause of MS that genetic predisposition can play a role in the course of the disease. An association of different alleles and haplotypes of the region of the human major histocompatibility complex (MHC region) could be detected. For example, the HLA-DRB1 * 15 allele results in a fourfold relative risk for the development of MS (cf. Miterski B, Jaeckel S, Epplen JT, Pohlau D, Hardt C (1999), Genes Immun. 1: 37-44 ). Genes outside the human leukocyte antigen region (HLA region) that may affect susceptibility to MS have also been studied. It was assumed that about 20-30 genes outside the HLA region could be relevant for MS pathogenesis (cf. Butterfiled RJ, Blankenhorn EP, Roper RJ, Zachary JF, Doerge RW, Teuscher C (2000), Am J. Pathol. 157: 637-645 ; Bergsteinsdottir K, Yang HAT, Petterson U, Holmdahl R (2000), J. Immunol. 164: 1564-1568 ).

Da die Ursachen der MS bis heute noch nicht genau aufgeklärt sind, können Patienten im Moment nur symptomatisch mit immunmodulatorischen bzw. immunsuppressiven Medikamenten behandelt werden. Unabhängig von der Art des Präparates bzw. der Firma hat jedes auf dem Markt befindendliche Produkt Nebenwirkungen aufzuweisen, zum Beispiel grippeähnliche Symptome bei β-Interferon, Hautirritationen bei Glatirameracetat, Übelkeit und Haarausfall bei Mitoxantron bzw. Depressionen bei Corticosteroiden, die in seltenen Fällen auch zum Abbruch der Therapie führen können. Da es vorkommen kann, dass Patienten nicht auf Therapien ansprechen bzw. primär progrediente Verläufe der MS nach wie vor ein therapeutisches Problem darstellen, ist es nötig, auf diesem Gebiet weiter zu forschen. Since the causes of MS are still not clear to this day, patients can only be treated symptomatically with immunomodulatory or immunosuppressive drugs. Regardless of the type of product or company, every product on the market has side effects, such as flu-like symptoms of β-interferon, skin irritation of glatiramer acetate, nausea and hair loss in mitoxantrone and depression in corticosteroids, which in rare cases also Can lead to discontinuation of therapy. Since it may happen that patients do not respond to therapies or primary progressive courses of MS are still a therapeutic problem, it is necessary to continue research in this area.

Das mitochondriale Entkopplungsprotein UCP2 (Mitochondrial uncoupling protein 2, UCP2) ist ein Mitglied der mitochondrialen Protonen-Transporter-Familie. Nachfolgend wird das UCP2-Protein als „UCP2“ bezeichnet und das entsprechende Gen als „UCP2-Gen“. UCP2 entkoppelt den Protonenzutritt in die Mitochondrien von der ATP-Synthese. Bei der Maus findet sich das UCP2-Gen auf Chromosom 7, beim Menschen auf Chromosom 11. Im Gegensatz zu UCP1 gibt es keine Anzeichen, dass UCP2 eine primäre Rolle bei der Regulation des Energiestoffwechsels spielt. Bei Entzündungen liegt eine Hochregulation des UCP2s vor, wobei das UCP2 eine schützende Funktion ausübt. So konnte beispielsweise am Model der experimentellen autoimmunen Encephalomyelitis (EAE) gezeigt werden (EAE = anerkanntes Tiermodell für MS), dass das UCP2, welches im entzündeten Spinalcord der EAE-Mäuse hochreguliert ist, protektiv wirkt. (vgl. Vogler S, Pahnke J, Rousset S, Ricquier D, Moch H, Miroux B, Ibrahim S, Am. Pathol. 2006, 168: 1570–1575 ). Es besteht die begründete Annahme, dass UCP2 als Regulator der Bildung reaktiver Sauerstoffradikale (Reactive Oxygen Species, ROS) einen Einfluss auf den Entzündungsprozess hat.The mitochondrial uncoupling protein UCP2 (UCP2) is a member of the mitochondrial proton transporter family. Hereinafter, the UCP2 protein is referred to as "UCP2" and the corresponding gene as the "UCP2 gene". UCP2 decouples proton access into the mitochondria from ATP synthesis. In the mouse, the UCP2 gene is found on chromosome 7, in humans on chromosome 11. In contrast to UCP1, there is no indication that UCP2 plays a primary role in the regulation of energy metabolism. In case of inflammation there is an upregulation of the UCP2, whereby the UCP2 exerts a protective function. For example, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model (EAE = approved animal model for MS) showed that UCP2, which is up-regulated in the inflamed spinal cord of EAE mice, has a protective effect. (see. Vogler S, Pahnke J, Rousset S, Ricquier D, Moch H, Miroux B, Ibrahim S, Am. Pathol. 2006, 168: 1570-1575 ). It exists the reasoned assumption that UCP2, as a regulator of the formation of reactive oxygen species (ROS), has an impact on the inflammatory process.

Die Relevanz des UCP2s für MS wird auch durch einen Polymorphismus verstärkt, welcher Auswirkungen auf die Empfänglichkeit für MS hat (vgl. Vogler S, Goedde R, Miterski B, Gold R, Kroner A, Koczan D, Zettl UK, Rieckmann P, Epplen JT, Ibrahim S; J. Mol. Med. (2005) 83: 806–811 ). Die Relevanz des UCP2s bzw. des SNPs an Position 866 des UCP2-Gens wurde auch für andere chronisch-entzündliche Erkrankungen nachgewiesen (vgl. Yu X, Wieczorek S, Franke A, Yin H, Pierer M, Sina C, Karlsen TH, Boberg KM, Bergquist A, Kunz M, Witte T, Gross WL, Epplen JT, Alarcón-Riquelme ME, Schreiber S, Ibrahim SM, Genes and Immunity (2009), 1–5 ).The relevance of UCP2 for MS is also amplified by a polymorphism which has implications for susceptibility to MS (cf. Vogler S, Goedde R, Miterski B, Gold R, Kroner A, Koczan D, Zettl UK, Rieckmann P, Epplen JT, Ibrahim S; J. Mol. Med. (2005) 83: 806-811 ). The relevance of the UCP2 or SNP at position 866 of the UCP2 gene has also been demonstrated for other chronic inflammatory diseases (cf. Kunz M, Witte T, Gross WL, Epplen JT, Alarcón-Riquelme ME, Schreiber S, Ibrahim SM, Genes and Immunity (2009), 1-5 ).

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass eine erhöhte Expression des UCP2s sich positiv auf chronisch-entzündliche Erkrankungen auswirkt. In summary, increased expression of UCP2s has a positive effect on chronic inflammatory diseases.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Mittel zu finden, mit welchem die Expression des UCP2s erhöht werden kann, um so ein Mittel zu haben, mit welchem chronisch-entzündliche Erkrankungen behandelt werden können. The object of the invention was therefore to find a means by which the expression of the UCP2s can be increased so as to have an agent with which chronic inflammatory diseases can be treated.

Diese Aufgabe wird gelöst mit Alkylschwefelalkansäurederivaten und ihren pharmazeutisch verträglichen Salzen gemäß der allgemeinen Formel I

Formel I wobei
n 1 oder 2 ist,
R¹ Wasserstoff oder einen C1-C4-Alkylrest bedeutet und
R² einen C10-C18-Alkylrest darstellt,
welche zur Behandlung chronisch entzündlicher Erkrankungen verwendet werden. This object is achieved with Alkylschwefelalkansäurederivaten and their pharmaceutically acceptable salts according to the general formula I.

Formula I being
n is 1 or 2,
R ^{1 is} hydrogen or a C ¹ -C ⁴ -alkyl radical and
R ^{2 represents} a C 10 -C 18 -alkyl radical,
which are used for the treatment of chronic inflammatory diseases.

Vorzugsweise weisen die Alkylschwefelalkansäurederivate als Rest R1 Wasserstoff auf. Für den Rest R2 sind C12-C16-Alkylreste bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Alkylschwefelalkansäurederivat um Tetradecylschwefelessigsäure (TTA, n = 1, R1 = Wasserstoff und R2 = C14-Alkylrest). Preferably, the Alkylschwefelalkansäurederivate as radical R1 hydrogen. For the radical R 2, C 12 -C 16 -alkyl radicals are preferred. In a preferred embodiment, the Alkylschwefelalkansäurederivat to Tetradecylschwefelessigsäure (TTA, n = 1, R1 = hydrogen and R2 = C14-alkyl radical).

Der Begriff „Alkylschwefelalkansäurederivate“ umfasst die freien Säuren und Ester, sowie deren pharmazeutische verträgliche Salze. Der Ausdruck „Behandlung“ umfasst die direkte Therapie der bereits diagnostizierten Erkrankung (dies bevorzugt), aber auch die Prävention. The term "alkyl sulfuric acid derivatives" includes the free acids and esters, as well as their pharmaceutically acceptable salts. The term "treatment" includes the direct therapy of the disease already diagnosed (this is preferred), but also the prevention.

Es ist bekannt, dass freie Fettsäuren die UCP2-Expression beeinflussen können. Da freie Fettsäuren aber in der Regel über den Fettsäurestoffwechsel oxidiert werden, ist es für einen potentiellen Therapieansatz wichtig, eine modifizierte Fettsäure zu haben, die nicht über die β-Oxidation abgebaut werden kann. Ein abweichendes Verhalten zeigen hier modifizierte Fettsäuren. Die oben genannten Alkylschwefelalkansäurederivate stellen aufgrund des in ihnen enthaltenen Schwelfes solche modifizierten Fettsäuren dar, die nicht über die β-Oxydation metabolisiert werden können. It is known that free fatty acids can affect UCP2 expression. However, since free fatty acids are usually oxidized via fatty acid metabolism, it is important for a potential therapeutic approach to have a modified fatty acid that can not be broken down by β-oxidation. A deviant behavior here show modified fatty acids. The abovementioned Alkylschwefelalkansäurederivate represent such modified fatty acids due to the contained in them, which can not be metabolized via the β-oxidation.

Um den Einfluss der Alkylschwefelalkansäurederivaten, insbesondere TTA, auf die chronisch-entzündliche Erkrankungen zu untersuchen, wurde die EAE als Modell für MS gewählt. Es wurden 20 C57BL/6J Mäuse mit unterschiedlichen TTA Konzentrationen zu unterschiedlichen Zeitpunkten gefüttert. Eine Gruppe wurde bereits 2 Wochen vor der Immunisierung mit jeweils 5 g TTA gefüttert (10 Tiere), die zweite Gruppe erhielt 10 g TTA erst ab dem Tag 14 nach der Immunisierung (10 Tiere), und die dritte Gruppe erhielt Futter ohne TTA (10 Tiere). Die Ergebnisse sind graphisch in gezeigt. Die Stärke der Krankheitssymptome reduziert sich in der 2 Wochen nach der Immunisierung mit 10 g TTA gefütterten Gruppe signifikant (p = 0,015) im Vergleich zu der Kontrollgruppe ohne TTA. Auch die Gruppe, welche mit einer geringeren Menge an TTA schon 2 Wochen vor der Immunisierung gefüttert wurde, zeigte deutlich mildere Krankheitssymptome im Gegensatz zu den Kontrollen. Des weiteren kann die Behandlung mit TTA vor der Immunisierung den Ausbruch der Erkrankung etwas verzögern ( ). Die Inzidenz war in allen 3 Gruppen vergleichbar und lag bei 76,6 %. In order to investigate the influence of Alkylschwefelalkansäurederivaten, in particular TTA, on the chronic inflammatory diseases, the EAE was chosen as a model for MS. Twenty C57BL / 6J mice with different TTA concentrations were fed at different time points. One group was fed with 5 g TTA each 2 weeks prior to immunization (10 animals), the second group received 10 g TTA only from day 14 after immunization (10 animals), and the third group received diet without TTA (10 Animals). The results are graphically in shown. The severity of the disease symptoms was significantly reduced (p = 0.015) in the group fed with 10 g TTA at 2 weeks after immunization, compared to the control group without TTA. The group fed with a lower level of TTA as early as 2 weeks prior to immunization also showed significantly milder disease symptoms in contrast to the group Controls. Furthermore, treatment with TTA prior to immunization may somewhat delay the onset of the disease ( ). The incidence was comparable in all 3 groups and was 76.6%.

Um zu verstehen, warum TTA den Krankheitsverlauf positiv beeinflusst und welchen Effekt diese Fettsäure auf die Immunantwort hat, wurde die Produktion unterschiedlicher Zytokine in TTA behandelten und nicht behandelten UCP2-knockout-Mäusen und Wildtypkontrollen untersucht. Dazu wurden am Tag 28 nach der Immunisierung die Lymphknoten entnommen und die Zytokinmessung durchgeführt. To understand why TTA positively influences the disease process and the effect of this fatty acid on the immune response, the production of different cytokines in TTA-treated and untreated UCP2 knockout mice and wild-type controls was investigated. For this purpose, the lymph nodes were removed on day 28 after the immunization and the cytokine measurement was carried out.

Die Ergebnisse zeigten, dass nur die TNF-α-Produktion in den CD4+ T-Zellen durch die TTA-Behandlung beeinflusst wurde, wohingegen die Produktion der IL-2- und IFN-γ-Zytokine durch die Immunzellen vergleichbar in den mit und ohne TTA behandelten Gruppen war (Daten nicht präsentiert). Die IL-10-Produktion lag unterhalb des Detektionslimits. Wie in zu sehen, nahm die Produktion von TNF-α sowohl in den mit TTA behandelten Wildtypmäusen (p = 0,02) als auch in den mit TTA gefütterten UCP2-knockout-Mäusen (p = 0,001) signifikant ab, so dass man schlussfolgern kann, dass der TTA-Effekt teilweise UCP2-unabhängig ist. The results showed that only TNF-α production in the CD4 + T cells was affected by the TTA treatment, whereas the production of IL-2 and IFN-γ cytokines by the immune cells was comparable in those with and without TTA treated groups was (data not presented). IL-10 production was below the detection limit. As in significantly decreased production of TNF-α in both the TTA-treated wild-type mice (p = 0.02) and in the TTA-fed UCP2 knockout mice (p = 0.001), so that one can conclude that that the TTA effect is partially UCP2-independent.

Außerdem wurden von der Milz abgeleitete T-Lymphozyten von immunisierten Mäusen am Tag 12 nach der Immunisierung mit Concanavalin A (ConA) und Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG 35–55) stimuliert und die T-Zell-Proliferation untersucht. Auch hier zeigte sich ein deutlicher Effekt durch die TTA Behandlung. Wie in dargestellt, war die Thymidininkorporation in mit TTA behandelten C57BL/6J Mäusen geringer als in den nicht mit TTA gefütterten Kontrollen. Die maximale T-Zell Antwort als Resultat der ConA Stimulation zeigte keine Unterschiede zwischen den Gruppen. In addition, spleen-derived T lymphocytes from immunized mice were stimulated on day 12 after immunization with concanavalin A (ConA) and myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG 35-55), and T cell proliferation was examined. Again, there was a significant effect from the TTA treatment. As in Thymidine incorporation was lower in TTA-treated C57BL / 6J mice than in non-TTA-fed controls. The maximum T cell response as a result of ConA stimulation showed no differences between the groups.

Das UCP2 beeinflusst die Produktion von ROS in Immunzellen. Aus diesem Grund sollte auch der Einfluss von TTA auf die ROS-Produktion von CD4+, CD8+ T-Zellen und Makrophagen untersucht werden. Es wurden jeweils 15 C57BL/6J mit 5 g TTA gefütterte (Beginn 2 Wochen vor der Immunisierung bis zum Ende) bzw. nicht gefütterte Tiere immunisiert und die ROS-Produktion im Blut am Tag 10 nach der Immunisierung bestimmt. Wie die zeigt, war die ROS-Produktion in den CD8+ T-Zellen der mit TTA behandelten Tiere signifikant geringer (p = 0,04) als in den Zellen der nicht behandelten Tiere. Auch in den CD4+ T-Zellen der TTA gefütterten Tiere war die Bildung von ROS geringer (p = 0,09) als in der Kontrollgruppe, so dass in diesen Immunzellen TTA einen Einfluss auf die Bildung von Sauerstoffradikalen ausübt. Die ROS Produktion in den Makrophagen hingegen war in den mit TTA gefütterten Tieren vergleichbar mit denen der Kontrollgruppe ( ). UCP2 influences the production of ROS in immune cells. For this reason, the influence of TTA on the ROS production of CD4 +, CD8 + T cells and macrophages should also be investigated. In each case, 15 C57BL / 6J were immunized with 5 g TTA fed (beginning 2 weeks before immunization to the end) or non-fed animals, and ROS production in the blood was determined on day 10 post-immunization. As the showed that ROS production was significantly lower in the CD8 + T cells of the TTA-treated animals (p = 0.04) than in the cells of the untreated animals. Also, in the CD4 + T cells of TTA-fed animals, the formation of ROS was lower (p = 0.09) than in the control group, so that in these immune cells TTA exerts an influence on the formation of oxygen radicals. In contrast, macrophages in ROS production in TTA-fed animals were comparable to those of the control group ( ).

Interessant ist, dass im Krankheitsverlauf der experimentell induzierten Autoimmun-Enzephalomyelitis unterschiedlich starke Expressionen von UCP2 im Rückenmarkgewebe sowie in Lymphknoten nachgewiesen werden konnten, was auf eine unterschiedlich starke Bedeutung des Genes in den verschiedenen Krankheitsphasen schließen lässt. Auch wenn die Veränderungen der UCP2-Expression in den Lymphknoten nicht so deutlich waren wie im Rückenmark, sind sie dennoch signifikant. Da die Expressionsraten von UCP2 in den Lymphknoten jedoch deutlich höher sind als im Rückenmarksgewebe, scheint UCP2 wahrscheinlich auch eine größere Bedeutung in der Immunantwort und weniger im Nervensystem zu haben.It is interesting that in the course of the experiment of experimentally induced autoimmune encephalomyelitis different expressions of UCP2 in the spinal cord tissue as well as in lymph nodes could be detected, which suggests a different importance of the gene in the different disease phases. Although the changes in UCP2 expression in the lymph nodes were not as pronounced as in the spinal cord, they are still significant. However, since the expression levels of UCP2 in the lymph nodes are significantly higher than in the spinal cord tissue, UCP2 probably also seems to have a greater importance in the immune response and less in the nervous system.

Wie gezeigt werden konnte, wurde bei den immunisierten UCP2-defizienten Mäusen ein signifikant härterer Krankheitsverlauf während der EAE beobachtet als bei den Tieren in der Kontrollgruppe. Verbunden mit der stärkeren Erkrankung der UCP2-knockout-Mäuse konnte auch eine höhere Immunantwort in diesen Tieren beobachtet werden. So produzieren die Immunzellen der UCP2-defizienten Mäuse höhere Mengen des pro-inflammatorischen Zytokins TNF-α, was auf eine durch die UCP2-Defizienz ausgelöste gesteigerte Th1-Antwort in diesen Tieren schließen lässt. Außerdem konnte bei den UCP2-defizienten Mäusen eine höhere Infiltration von Mikroglia und T-Zellen in das Rückenmark detektiert werden, was auf eine verstärkte Entzündung in diesem Gewebe hinweist und die stärker ausgeprägten Krankheitssymptome in den UCP2-defizienten Mäusen erklären könnte. Da UCP2 die Produktion von reaktiven oxygenen Verbindungen beeinflussen kann ( Arsenijevic et al., 2000 ; Gilgun-Sherki et al., 2004 ), wurde die Bildung solcher Mediatoren in Immunzellen wie Makrophagen, CD4 und CD8 positiven Zellen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass UCP2 einen signifikanten Einfluss auf die Bildung von reaktiven oxygenen Verbindungen in CD4 und CD8 positiven Zellen hat und über diese Mediatoren maßgeblich die Pathogenese beeinflusst. It could be shown that in the immunized UCP2-deficient mice a significantly harder disease course was observed during the EAE than in the animals in the control group. Combined with the stronger disease of the UCP2 knockout mice, a higher immune response could also be observed in these animals. Thus, the immune cells of UCP2-deficient mice produce higher levels of the pro-inflammatory cytokine TNF-α, suggesting an enhanced Th1 response in these animals induced by UCP2 deficiency. In addition, in the UCP2-deficient mice a higher infiltration of microglia and T cells into the spinal cord could be detected, indicating an increased inflammation in this tissue and could explain the more pronounced disease symptoms in the UCP2-deficient mice. Since UCP2 can influence the production of reactive oxygenated compounds ( Arsenijevic et al., 2000 ; Gilgun-Sherki et al., 2004 ), the formation of such mediators has been studied in immune cells such as macrophages, CD4 and CD8 positive cells. It could be shown that UCP2 has a significant influence on the formation of reactive oxygen compounds in CD4 and CD8 positive cells and significantly influences the pathogenesis via these mediators.

Hinsichtlich der Bildung reaktiver Sauerstoffverbindungen konnte im Fütterungsversuch gezeigt werden, dass die mit TTA gefütterten Mäuse tatsächlich eine deutlich reduzierte Bildung von reaktiven oxygenen Verbindungen in ihren CD8 als auch CD4 positiven T-Zellen aufweisen. Da Sauerstoffradikale die Transkription von Zytokinen beeinflussen können, sollten mit TTA behandelte Tiere auch eine geringere Menge an pro-inflammatorischen Zytokinen aufweisen. TTA konnte aber nur den TNF-α-Gehalt beeinflussen, während die Produktion anderer pro-inflammatorischer Zytokine (IL-2 und IFN-γ) keine Unterschiede aufwies, was eventuell mit der Dosierung von TTA in Zusammenhang stehen könnte. Interessant ist auch, dass in UCP2-defizienten Mäusen der gleiche zytokinsenkende Effekt beobachtet werden konnte, was einen UCP2-unabhängigen Einfluss von TTA auf die Immunantwort vermuten lässt.With regard to the formation of reactive oxygen compounds, it could be shown in the feeding experiment that the TTA-fed mice actually have a markedly reduced formation of reactive oxygen compounds in their CD8 as well as CD4-positive T cells. Since oxygen radicals may affect the transcription of cytokines, TTA-treated animals should also have a lower level of pro-inflammatory cytokines. TTA, however, could only influence the TNF-α content, while the Production of other pro-inflammatory cytokines (IL-2 and IFN-γ) showed no differences, which may be related to the dosage of TTA. Interestingly, in UCP2-deficient mice, the same cytokine-lowering effect was observed, suggesting a UCP2-independent effect of TTA on the immune response.

Fütterungsversuche mit TTA, die einen positiven Einfluss auf die UCP2 Expression ausübt, haben gezeigt, dass sich die Krankheitssymptome der EAE durch die Applikation von TTA mildern lassen. Außerdem beeinflusst TTA die Zytokinproduktion (TNF-α), die T-Zell Proliferation sowie die Bildung von Sauerstoffradikalen. Aufgrund dieser Ergebnisse stellen Alkylschwefelalkansäurederivate, insbesondere TTA ein potentielles Therapeutikum für MS Patienten dar. Da das UCP2 auch bei anderen chronisch-entzündlichen Erkrankungen relevant ist, eignet sich ein Mittel, welches einen positiven Einfluss auf die UCP2-Expression ausübt, ebenfalls zu deren Behandlung. Feeding trials with TTA, which has a positive influence on UCP2 expression, have shown that the symptoms of EAE can be alleviated by the application of TTA. In addition, TTA affects cytokine production (TNF-α), T-cell proliferation and the formation of oxygen radicals. Because of these results, alkyl sulfoalkanoic acid derivatives, especially TTA, are a potential therapeutic for MS patients. Since UCP2 is also relevant in other chronic inflammatory diseases, an agent which has a positive influence on UCP2 expression is also suitable for its treatment.

Daher finden die oben dargestellten Alkylschwefelalkansäurederivate gemäß der allgemeinen Formel I, insbesondere deren bevorzugte Vertreter, höchst bevorzugt TTA, neben der Multiplen Sklerose (MS) ebenfalls Verwendung bei der Behandlung chronisch entzündlicher Erkrankungen, welche ausgewählt sind aus rheumatoider Arthritis (RA), systemischem Lupus erythematodes (SLE), Wegener Granulomatosis (WG), Churg-Strauss Syndrom (CSS), Morbus Crohn (CD, Crohn's Disease), Colitis ulcerosa (UC, ulcerative colitis), primärer sklerosierender Cholangitis (PSC) und Psoriasis. Bevorzugt ist die Verwendung zur Behandlung von MS, RA, SLE, WG, CD und UC, höchst bevorzugt allerdings die Verwendung zur Behandlung von MS.Thus, the alkyl sulfoalkanoic acid derivatives of the general formula I shown above, in particular their preferred representatives, most preferably TTA, in addition to multiple sclerosis (MS) also find use in the treatment of chronic inflammatory diseases selected from rheumatoid arthritis (RA), systemic lupus erythematosus (SLE), Wegener's granulomatosis (WG), Churg-Strauss syndrome (CSS), Crohn's disease (CD), ulcerative colitis (UC, ulcerative colitis), primary sclerosing cholangitis (PSC) and psoriasis. Preferred is the use for the treatment of MS, RA, SLE, WG, CD and UC, most preferably the use for the treatment of MS.

Die Relevanz des UCP2s für MS wird auch durch einen Polymorphismus verstärkt, welcher Auswirkungen auf die Empfänglichkeit für MS hat. Der Einnukleotidpolymorphismus (single nucleotide polymorphism, SNP) an Position 866 in der Promotor-Region des UCP2-Gens ist insofern relevant, dass bei Vorliegen von Guanin an Position 866 weniger UCP2-Protein exprimiert wird und eine höhere Empfänglichkeit für MS vorliegt (UCP2 866 G-Allel). Sofern an dieser Position ein Adenin vorliegt, ist die Empfänglichkeit für MS etwas geringer, da dann mehr UCP2 exprimiert wird (UCP2 866 A-Allel) [vgl. Vogler S, Goedde R, Miterski B, Gold R, Kroner A, Koczan D, Zettl UK, Rieckmann P, Epplen JT, Ibrahim S; J. Mol. Med. (2005) 83: 806–811 ]. Die für MS erzielten Erkenntnisse lassen sich wie oben erwähnt auch direkt auf die anderen, oben genannten chronisch entzündlichen Erkrankungen übertragen. The relevance of UCP2 for MS is also enhanced by a polymorphism that affects susceptibility to MS. The single nucleotide polymorphism (SNP) at position 866 in the promoter region of the UCP2 gene is relevant in that, in the presence of guanine at position 866, less UCP2 protein is expressed and there is higher susceptibility to MS (UCP2 866G allele). If an adenine is present at this position, susceptibility to MS is slightly lower, since then more UCP2 is expressed (UCP2 866 A allele) [cf. Vogler S, Goedde R, Miterski B, Gold R, Kroner A, Koczan D, Zettl UK, Rieckmann P, Epplen JT, Ibrahim S; J. Mol. Med. (2005) 83: 806-811 ]. The findings obtained for MS can also be transferred directly to the other chronic inflammatory diseases mentioned above, as mentioned above.

Das UCP2-Gen, welches bei der Maus auf Chromosom 7 lokalisiert ist, befindet sich beim Menschen auf Chromosom 11 [Chromosom 11: 73,694,254–73,695,254 (forward strand)]. Das Gen selbst ist bekannt, beispielsweise ist es in der GenBank- und der Ensembl-Datenbank gelistet (Homo sapiens GenBank Accession number NM_003355, Ensembl ENSG00000175567). Die Angaben zur Ensembl-Datenbank beziehen sich auf das Ensembl-Release 61 – Feb 2011 . Die Bezeichnung des SNPs an Position 866 gemäß Ensembl-Datenbank ist rs659366 [Chromosom 11:73694754 (forward strand)].The UCP2 gene, which is located in the mouse on chromosome 7, is located on chromosome 11 in humans [chromosome 11: 73,694,254-73,695,254 (forward strand)]. The gene itself is known, for example, it is listed in the GenBank and Ensembl databases (Homo sapiens GenBank Accession number NM_003355, Ensembl ENSG00000175567). The details of the Ensembl database refer to the Ensembl Release 61 - Feb 2011 , The designation of the SNP at position 866 according to the Ensembl database is rs659366 [chromosome 11: 73694754 (forward strand)].

Generell wurde der Einfluss des UCP2 –866G/A Promotorpolymorphismus’ auf die UCP2 Expression in Immunzellen nachgewiesen, indem die Promotoraktivität in Jurkat Zellen, einer etablierten humanen T-Zelllinie als auch in U937 Zellen, einer humanen pro-monozytären Zelllinie in Abhängigkeit vom Genotyp gemessen wurde. Wie in gezeigt, konnte mit Hilfe des Luziferase Assays eine signifikant höhere Expression des pGL3-A Vektors (UCP2 –866A Allel) im Vergleich zum pGL3-G Vektor (UCP2 –866G Allel) sowohl in den Jurkat Zellen (p = 0,028) als auch in der Makrophagenzelllinie gemessen werden (p = 0,029). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das A Allel im UCP2 Promotor die UCP2 Genexpression in Immunzellen erhöht bzw. das G Allel im UCP2 Promotor die Genexpression reduziert. In general, the influence of UCP2 -866G / A promoter polymorphism on UCP2 expression in immune cells was demonstrated by measuring promoter activity in Jurkat cells, an established human T cell line as well as in U937 cells, a human pro-monocytic cell line depending on the genotype has been. As in Using the luciferase assay, a significantly higher expression of the pGL3-A vector (UCP2 -866A allele) was shown in comparison to the pGL3-G vector (UCP2 -866G allele) in the Jurkat cells (p = 0.028) as well as in the Macrophage cell line (p = 0.029). In summary, the A allele in the UCP2 promoter increases UCP2 gene expression in immune cells or the G allele in the UCP2 promoter reduces gene expression.

Um Herauszufinden, ob der SNP an Position 866 auch bei der TTA-Gabe relevant ist, wurden DNA-Konstrukte erzeugt, welche jeweils eine Mutation an dieser Position, d.h. eine andere Base anstelle von Adenin, enthielten. Insbesondere wurde ein DNA-Konstrukt mit einem Guanin anstelle des Adenins an Position 866 erzeugt. Die DNA-Konstrukte wurden mit Hilfe liposomaler Reagenzien in die Zellen eingebracht. Bei anschließender Gabe von TTA zeigte sich, dass die Expression des pGL3-G-Vektors zumindest auf das Expressionsniveau des Expression des pGL3-A Vektors ohne TTA-Gabe gesteigert wurde (Ergebnisse nicht graphisch dargestellt).In order to find out whether the SNP at position 866 is also relevant in TTA administration, DNA constructs were generated which each have a mutation at this position, i. another base instead of adenine. In particular, a DNA construct with a guanine in place of the adenine at position 866 was generated. The DNA constructs were introduced into the cells using liposomal reagents. Subsequent administration of TTA showed that the expression of the pGL3-G vector was increased at least to the expression level of the expression of the pGL3-A vector without TTA administration (results not shown graphically).

Die Gabe der erfindungsgemäßen Alkylschwefelalkansäurederivate wirkt sich also auch aus, wenn anstelle des Adenins an Position 866 des UCP2-Gens eine andere Base, insbesondere ein Guanin, vorliegt. Unter einer „anderen Base“ ist zu verstehen, dass die Basen generell die Nukleobasen Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T) sind und dass der Ausdruck „andere Base“ jeweils die Gruppe der verbleibenden drei Basen umfasst, d.h. die Gruppe der Basen Cytosin, Guanin und Thymin. Die im Vergleich zum normalen Allel geringere UCP2-Produktion bei Vorliegen von Guanin anstelle von Adenin konnte durch Gabe von TTA gesteigert werden. The administration of the alkyl sulfoalkanoic acid derivatives according to the invention thus also has an effect if, instead of the adenine at position 866 of the UCP2 gene, another base, in particular a guanine, is present. By a "different base" is meant that the bases are generally the nucleobases adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and thymine (T), and that the term "other base" is the group of the remaining three Bases, ie the group of bases cytosine, guanine and thymine. The compared to the normal Allele reduced UCP2 production in the presence of guanine instead of adenine could be increased by administration of TTA.

Dementsprechend betrifft die Erfindung auch die Verwendung von Alkylschwefelalkansäurederivaten bzw. deren pharmazeutisch akzeptablen Salzen gemäß Formel I, wobei anhand einer Analyse der Base an Basenposition 866 (rs659366) des humanen UCP2-Gens bestimmt wird, welche Base dort vorliegt. Für den Fall, dass dort eine andere Base anstelle eines Adenins, insbesondere ein Guanin anstelle des Adenins, vorliegt, wird für einen Probanden ein erhöhtes Erkrankungsrisiko zugeordnet/diagnostiziert. Da der SNP an Position 866 für mehrere chronisch-entzündliche Erkrankungen signifikant ist, wird dem Probanden ein erhöhtes Erkrankungsrisiko für chronisch-entzündliche Erkrankungen zugeordnet. Vorzugsweise sind diese wie oben erwähnt MS, RA, SLE, WG, CSS, CD, UC, PSC und Psoriasis. Bevorzugt handelt es sich um MS, RA, SLE, WG, CD und UC, höchst bevorzugt allerdings um MS. In anderen Worten werden die genannten Alkylschwefelalkansäurederivate bevorzugt zur Behandlung dieser Erkrankungen eingesetzt, wenn die genannten Erkrankungen dadurch gekennzeichnet sind, dass ein SNP an Basenposition 866 (rs659366) des humanen UCP2-Gens vorliegt, d.h. wenn an dieser Position eine andere Base als Adenin, vorzugsweise Guanin, vorliegt. In jedem Fall wird bevorzugt eines der oben dargestelltes Alkylschwefelalkansäurederivate gemäß der allgemeinen Formel I, insbesondere deren bevorzugte Vertreter, höchst bevorzugt TTA, verabreicht bzw. eine höhere Menge im Vergleich zu der Menge bei Vorliegen eines Adenins, bereitgestellt bzw. verabreicht. Accordingly, the invention also relates to the use of Alkylschwefelalkansäurederivaten or their pharmaceutically acceptable salts according to formula I, wherein based on an analysis of the base at base position 866 (rs659366) of the human UCP2 gene is determined which base is present there. In the event that there is another base instead of an adenine, in particular a guanine instead of the adenine, there is a subject associated with an increased risk of disease / diagnosed. Since the SNP at position 866 is significant for several chronic inflammatory diseases, the subject is assigned an increased risk of developing chronic inflammatory diseases. Preferably, as mentioned above, these are MS, RA, SLE, WG, CSS, CD, UC, PSC and psoriasis. It is preferably MS, RA, SLE, WG, CD and UC, most preferably, however, MS. In other words, said alkyl-sulfuric acid derivatives are preferably used for the treatment of these diseases, when said diseases are characterized by the presence of a SNP at base position 866 (rs659366) of the human UCP2 gene, i. if a base other than adenine, preferably guanine, is present at this position. In any case, one of the above-described Alkylschwefelalkansäurederivate according to the general formula I, in particular their preferred representatives, most preferably TTA, administered or a higher amount compared to the amount in the presence of an adenine, is preferably provided or administered.

Beschreibung der AbbildungenDescription of the pictures

zeigt den Einfluss von TTA auf den klinischen Verlauf der EAE. Dargestellt ist die klinische Entwicklung der immunisierten C57BL/6J Mäuse, die mit 5 g TTA 2 Wochen vor der Immunisierung behandelt wurden (Kreis), die mit 10 g TTA 2 Wochen nach der Immunisierung gefüttert wurden (Dreieck) und die keine Behandlung mit TTA erfuhren (Quadrat). Statistische Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Mann-Whitney-U Test analysiert (* p < 0,05). shows the influence of TTA on the clinical course of EAE. Shown is the clinical development of the immunized C57BL / 6J mice treated with 5 g TTA 2 weeks prior to immunization (circle) fed with 10 g TTA 2 weeks after immunization (Triangle) and who did not receive treatment with TTA (Square). Statistical differences between the groups were analyzed by the Mann-Whitney-U test (* p <0.05).

zeigt den TTA-Einfluss auf die Zytokinproduktion. Dargestellt ist die Zytokinproduktion in CD4+ T-Zellen von mit TTA behandelten (weiße Balken) und nicht behandelten (graue Balken) UCP2-knockout-Mäusen bzw. Kontrolltieren. Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardabweichungen von 6 Mäusen pro Gruppe. Statistische Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Mann-Whitney-U Test analysiert * = p < 0,05; ** = p < 0,001. shows the influence of TTA on cytokine production. Cytokine production is shown in CD4 + T cells from TTA treated (white bars) and untreated (gray bars) UCP2 knockout mice and control animals, respectively. Shown are the means ± standard deviations of 6 mice per group. Statistical differences between the groups were analyzed by the Mann-Whitney-U test * = p <0.05; ** = p <0.001.

zeigt den Einfluss von TTA auf die T-Zell-Proliferation. Abgebildet ist die T-Zellproliferation von mit TTA behandelten (graue Balken) und nicht behandelten (weiße Balken) mit MOG35-55 immunisierten Wildtypmäusen, Concanavalin A (ConA) stimuliert T-Zellen unspezifisch und diente als Kontrolle für die spezifische Stimulation mit MOG. Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardabweichungen von 6 in Triplikaten gemessenen Mäusen. shows the influence of TTA on T-cell proliferation. T cell proliferation of TTA-treated (gray bars) and untreated (white bars) with MOG35-55 immunized wild-type mice is shown. Concanavalin A (ConA) nonspecifically stimulates T cells and served as a control for specific stimulation with MOG. Shown are the means ± standard deviations of 6 mice measured in triplicates.

zeigt den Einfluss von TTA auf die ROS-Produktion in Immunzellen. Dargestellt ist der Vergleich der ROS-Produktion zwischen den mit TTA gefütterten (weiße Balken) und nicht mit TTA gefütterten (graue Balken) Wildtypmäusen in CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten (A) und Makrophagen (B). Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardabweichungen von jeweils 6 Tieren pro Gruppe. Statistische Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Mann-Whitney-U Test analysiert * = p < 0,05. shows the influence of TTA on ROS production in immune cells. Shown is the comparison of ROS production between TTA-fed (white bars) and non-TTA-fed (gray bars) wild-type mice in CD4 + and CD8 + T lymphocytes (A) and macrophages (B). Shown are the means ± standard deviations of 6 animals per group. Statistical differences between the groups were analyzed by the Mann-Whitney-U test * = p <0.05.

zeigt einen Vergleich der Promotoraktivität in Abhängigkeit des UCP2 Genotyps. Dargestellt ist die relative Luziferaseaktivität des pGL3-G Vektors (UCP2 –866G Allel) und des pGL3-A Vektors (UCP2 –866A Allele) in U937 und Jurkat Zellen von 2 unabhängigen Versuchen, gemessen in Triplikaten. Schwarze Säulen repräsentieren den A/A Genotyp, weiße Säulen den G/G Genotyp. Statistische Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Mann-Whitney-U Test analysiert * = p < 0,05. shows a comparison of promoter activity as a function of the UCP2 genotype. Shown is the relative luciferase activity of the pGL3-G vector (UCP2 -866G allele) and the pGL3-A vector (UCP2 -866A alleles) in U937 and Jurkat cells from 2 independent experiments, measured in triplicates. Black columns represent the A / A genotype, white columns represent the G / G genotype. Statistical differences between the groups were analyzed by the Mann-Whitney-U test * = p <0.05.

ExperimentellesExperimental

Fütterung mit Tetradecylschwefelessigsäure (TTA) Feeding with Tetradecyl Sulfur Acetic Acid (TTA)

Für den Fütterungsversuch mit TTA wurden die entsprechenden TTA Mengen (5 g, 10 g) in 1 l Azeton gelöst und mit 1 kg Futter gemixt. Dieses präparierte Futter wurde so lange unter einem Abzug gelagert, bis das Azeton vollständig evaporiert war. Das Futter für die Kontrollgruppe wurde nur mit Azeton behandelt. Die Ergebnisse sind graphisch in gezeigt. For the feeding experiment with TTA, the corresponding TTA amounts (5 g, 10 g) were dissolved in 1 l of acetone and mixed with 1 kg of feed. This prepared feed was stored under a hood until the acetone had completely evaporated. The feed for the control group was treated with acetone only. The results are graphically in shown.

Zytokinmessung cytokine measurement

Für die Bestimmung der intrazellulären Zytokine wurden die Lymphknoten von immunisierten Mäusen entnommen und wie folgt aufgearbeitet:
Zur Herstellung von Dauerkulturen wurden 1 × 10⁶ Zellen in 1 ml Kulturmedium, dem zuvor 10 % (v/v) inaktiviertes fötales Kälberserum sowie 10 % (v/v) Dimethylsulfoxid zugesetzt wurde, resuspendiert und in Kryoröhrchen überführt. Da sich mit Dimethylsulfoxid die Bildung intrazellulärer Eiskristalle nicht vollständig verhindern lässt, muss der Einfrierprozess möglichst langsam ablaufen. Um das zu erreichen, wurden die Kryoröhrchen in mit Isopropanol gefüllte Einfriergefäße über Nacht bei –80 °C aufbewahrt und erst anschließend in der Gasphase flüssigen Stickstoffs gelagert (Kryokonservierung). For the determination of intracellular cytokines, the lymph nodes were removed from immunized mice and processed as follows:
For the production of permanent cultures, 1 × 10 ⁶ cells were resuspended in 1 ml of culture medium to which 10% (v / v) inactivated fetal calf serum and 10% (v / v) dimethylsulfoxide had previously been added and transferred to cryotubes. Since the formation of intracellular ice crystals can not be completely prevented with dimethylsulfoxide, the freezing process must proceed as slowly as possible. To achieve this, the cryotubes were stored in freezing vessels filled with isopropanol overnight at -80 ° C and then stored in the gas phase of liquid nitrogen (cryopreservation).

Anschließend wurden zur Bestimmung der intrazellulären Zytokine 1 × 10⁶ Zellen pro ml in einer 96-well Zellkulturplatte ausgesät und durch Zugabe von 1 μl Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA, 10 μg/ml) und 1 μl Ionomyzin (0,5 mg/ml) stimuliert. Nach einer Inkubation von 2 h bei 37 °C wurde 10 μg/ml Brefeldin A zugegeben und für weitere 4 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen bei 1.500 g für 5 min zentrifugiert, das Pellet in 500 μl 4 % Paraformaldehyd (4 % PFA in 1 × PBS) gelöst und für eine bessere Fixierung für 5 min bei 37 °C inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit FACS Puffer wurden die Zellen 30 min bei RT in Saponinpuffer (FACS Puffer mit 0,5 % Saponin [w/v]) mit 5 % Mausserum und den Antikörpern (PE gekoppelter TNFα- und IL10-Antikörper, FITC gekoppelter IFNγ- und IL2-Antikörper) inkubiert. Nach einem erneuten Waschschritt mit 500 μl Saponinpuffer sowie anschließend mit 1 ml FACS-Puffer erfolgte die Oberflächenfärbung. Dazu wurden die Zellen mit 50 μl FACS Puffer und 0,5 μl PE-Cy5 konjugiertem CD4-Antikörper für 10 min auf Eis inkubiert. Nach einem Waschschritt mit 1 ml FACS-Puffer wurden die gefärbten Zellen in 500 μl FACS-Puffer gelöst und im FACSscan (Becton Dickinson, USA) gemessen. Die Ergebnisse sind graphisch in gezeigt. Subsequently, to determine the intracellular cytokines, 1 × 10 ⁶ cells per ml were seeded in a 96-well cell culture plate and added by addition of 1 μl phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 10 μg / ml) and 1 μl ionomycin (0 , 5 mg / ml). After incubation for 2 h at 37 ° C, 10 μg / ml Brefeldin A was added and incubated for a further 4 h at 37 ° C. Subsequently, the cells were centrifuged at 1,500 g for 5 min, the pellet was dissolved in 500 μl 4% paraformaldehyde (4% PFA in 1 x PBS) and incubated for 5 min at 37 ° C for better fixation. After washing twice with FACS buffer, the cells were incubated for 30 min at RT in saponin buffer (FACS buffer with 0.5% saponin [w / v]) with 5% mouse serum and the antibodies (PE coupled TNFα and IL10 antibody, FITC-coupled IFNγ and IL2 antibodies). After a further washing step with 500 μl of saponin buffer and then with 1 ml of FACS buffer, the surface was stained. For this purpose, the cells were incubated with 50 μl of FACS buffer and 0.5 μl of PE-Cy5-conjugated CD4 antibody for 10 min on ice. After washing with 1 ml of FACS buffer, the stained cells were dissolved in 500 μl of FACS buffer and measured in FACSscan (Becton Dickinson, USA). The results are graphically in shown.

Proliferationstest proliferation assay

Für die Messung der T-Zell-Proliferation wurde ein [³H]-thymidine-Assay verwendet. Dazu wurde die Milz von immunisierten Wildtyp und knockout-Mäusen am Tag 10 nach der Immunisierung (Zeitpunkt des Krankheitsausbruchs) entnommen und eine Zellsuspension präpariert. Die Aufarbeitung der Milzzellen erfolgte wie oben beschrieben (Kryokonservierung). Es wurden jeweils 2 × 10⁶ Milzzellen in 96-Well-Mikrotiterplatten gesät und mit 5 μg Concanavalin A (ConA, Difco, Detroit, USA) als Positivkontrolle beziehungsweise 30 μg MOG_35-55 (American Peptide Company, Sunnyvale, USA) stimuliert und für 60 h bei 37 °C in einer Wasserdampf gesättigten Atmosphäre mit einem 5 %igen CO₂-Anteil kultiviert. Als Negativkontrolle wurden Zellen ohne in vitro Stimulation mitgeführt. Die Zellen wurden anschließend mit 10 μl ³H-Methylthymidin/Well (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) versetzt und weitere 12 h inkubiert. Dabei entsprachen 10 μl ³H-Methylthymidin 1 μCi. Mit Hilfe des Zellharvesters wurden die Zellen auf Titertek-Glasfaserfilter (Lierbyen, Norwegen) geerntet. Die den einzelnen Wells entsprechenden Filterstücke wurden in Szintillationsfläschen (neo-Lab, Heidelberg) überführt und mit Szintillator (Zinsser Analytic, Frankfurt) gefüllt. Der Einbau des tritiummarkierten Thymidins in die DNA während der Replikationsphase wurde im Counter (Scintillation counter Wallace 1214 Rackbeta, LKB, Bromma, Schweden) bestimmt, da die Messung der über einen bestimmten Zeitraum aufgenommenen Radioaktivität einen indirekten Aufschluss über die proliferative Aktivität der Zellen gibt. Die Ergebnisse sind graphisch in gezeigt. For the measurement of T-cell proliferation, a [ ³ H] -thymidine assay was used. For this purpose, spleens were taken from immunized wild type and knockout mice on day 10 post-immunization (time of onset of disease) and a cell suspension was prepared. The workup of the spleen cells was carried out as described above (cryopreservation). In each case 2 × 10 ⁶ spleen cells were seeded in 96-well microtiter plates and stimulated with 5 μg Concanavalin A (ConA, Difco, Detroit, USA) as a positive control or 30 μg MOG _35-55 (American Peptide Company, Sunnyvale, USA) cultured for 60 h at 37 ° C in a water vapor saturated atmosphere with a 5% CO ₂ content. As a negative control, cells were carried without in vitro stimulation. The cells were then admixed with 10 μl of ³ H-methylthymidine / well (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany) and incubated for a further 12 h. This corresponded to 10 ul ³ H-methylthymidine 1 μCi. Using the cell harvester, the cells were harvested on Titertek glass fiber filters (Lierbyen, Norway). The filter pieces corresponding to the individual wells were transferred to scintillation vials (neo-Lab, Heidelberg) and filled with scintillator (Zinsser Analytic, Frankfurt). The incorporation of tritiated thymidine into the DNA during the replication phase was determined in the counter (scintillation counter Wallace 1214 Rackbeta, LKB, Bromma, Sweden), as the measurement of the radioactivity recorded over a certain period of time gives an indirect indication of the proliferative activity of the cells. The results are graphically in shown.

Bestimmung der Bildung reaktiver Sauerstoffradikale (ROS) Determination of the formation of reactive oxygen radicals (ROS)

Die Bestimmung von Sauerstoffradikalen in unterschiedlichen Zellen erfolgte mit Hilfe von Dihydrorhodamin 123 (DHR), einem sauerstoffsensitivem Reagenz. Durch eine Wasserstoffperoxid abhängige Reaktion wird Dihydrorhodamin 123 oxydiert, wobei fluoreszierendes Rhodamin freigesetzt wird, welches detektiert werden kann. Für die Analyse der Sauerstoffradikale wurden 100 μl Blut von UCP2-Wildtyp- und Knockout-Mäusen entnommen und mit 10 μl 0,1 M EDTA gemischt. Anschließend erfolgte die Lyse durch Zugabe von 1,5 ml Erythrozyten Lysispuffer (Qiagen, Hilden). Nachdem das Lysat in 1 × PBS (130 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 8 mM Na₂HPO₄; 1,7 mM KH₂PO₄; pH 7,2) gewaschen und in 550 μl RPMI Medium aufgenommen wurde, folgte nach Zugabe von DHR (5 nM Endkonzentration) eine Inkubation bei 37 °C für 5 min. Anschließend wurden 0,5 nM Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) zugegeben und für weitere 20 min bei 37 °C inkubiert. Nach einem Waschschritt mit 1 × PBS wurde das Zellpellet in 100 μl FACS Puffer gelöst und die Zellen durch Zugabe von 0,5 μl PE gekoppeltem CD4-, CD8- bzw. CD11b-Antikörper angefärbt. Die Proben wurden für 20 min bei RT inkubiert und im FACScan (Becton Dickinson, USA) gemessen. Die Ergebnisse sind graphisch in gezeigt. The determination of oxygen radicals in different cells was carried out with the aid of dihydrorhodamine 123 (DHR), an oxygen-sensitive reagent. By a hydrogen peroxide dependent reaction dihydrorhodamine 123 is oxidized, releasing fluorescent rhodamine, which can be detected. For oxygen radical analysis, 100 μl of blood from UCP2 wild-type and knockout mice were removed and mixed with 10 μl of 0.1 M EDTA. Subsequently, the lysis was carried out by adding 1.5 ml of erythrocyte lysis buffer (Qiagen, Hilden). After the lysate was washed in 1 × PBS (130 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na ₂ HPO ₄ , 1.7 mM KH ₂ PO ₄ , pH 7.2) and taken up in 550 μl RPMI medium after addition of DHR (5 nM final concentration), incubate at 37 ° C for 5 min. Subsequently, 0.5 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) was added and incubated for a further 20 min at 37 ° C. After a washing step with 1 × PBS, the cell pellet was dissolved in 100 μl FACS buffer and the cells were stained by addition of 0.5 μl PE-coupled CD4, CD8 or CD11b antibody. The samples were incubated for 20 min at RT and measured in FACScan (Becton Dickinson, USA). The results are graphically in shown.

Zellen cell

Es wurden Zelllinien gemäß Tabelle 1 verwendet: Zellinien Beschreibung Medium (Gibco, Eggenstein) Jurkat DSMZ: ACC 282 Humane T-Zelllinie Einzelne oder koloniebildende Suspensionszellen RPMI 1640 U937 ECACC: 85011440 Humane monozytäre Zelllinie Einzelne oder koloniebildende Suspensionzellen RPMI 1640 Tabelle 1 Cell lines according to Table 1 were used: cell lines description Medium (Gibco, Eggenstein) Jurkat DSMZ: ACC 282 Human T cell line Single or colony forming suspension cells RPMI 1640 U937 ECACC: 85011440 Human Monocytic Cell Line Single or colony forming suspension cells RPMI 1640 Table 1

Zellkulturmedien Cell culture media

Für die Kultivierung der Zelllinien wurden sterile Fertigmedien bezogen und durch Zugabe von 10 % (v/v) fötalem Kälberserum sowie 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin (Stammlösung 5000 U/ml) komplementiert. Um eine Komplementaktivität zu verhindern, wurde das fötale Kälberserum vor Gebrauch für 30 min auf 56 °C erhitzt. For the cultivation of the cell lines sterile finished media were purchased and complemented by the addition of 10% (v / v) fetal calf serum and 1% (v / v) penicillin / streptomycin (stock solution 5000 U / ml). To prevent complement activity, the fetal calf serum was heated to 56 ° C for 30 minutes prior to use.

Zellkultivierung cell culture

Die Anzucht der Zellen erfolgte im Brutschrank (Firma Scientic) bei 37 °C und 5 % CO₂-Gehalt in wasserdampfgesättigter Luft. Da die Verdopplungszeit je nach Zelltyp 24–35 h beträgt, wurden die Zellen dreimal wöchentlich passagiert. Die adhärenten Makrophagen wurden vor dem Passagieren mit einem Zellschaber vom Boden der Kulturflasche abgelöst, während die Suspensionszellen für 5 min bei 300 g zentrifugiert und anschließend in Medium resuspendiert wurden. Von der gut durchmischten Zellsuspension wurden 50 μl entnommen und mit dem gleichen Volumen einer Trypanblaulösung (0,1 % Trypanblau in 1 × PBS) versetzt. Ein Aliquot dieses Gemisches wurde anschließend in eine Zählkammer nach Bürker (Brand, Wertheim) pipettiert, in der die Zellen mikroskopisch ausgezählt wurden. Dabei entspricht die Auszählung von 25 Quadranten der Anzahl von Zellen, die sich in 0,1 μl Zellsuspension befinden. Daraus ergibt sich folgende Formel: Zellen/ml = gezählte Zellen × Verdünnungsfaktor × 10⁴. Für eine neue Passage wurden 1–2 × 10⁶ Zellen in eine Zellkulturflasche mit frischem Medium überführt. The cells were grown in the incubator (Scientic) at 37 ° C. and 5% CO ₂ content in steam-saturated air. Since the doubling time is 24-35 h depending on the cell type, the cells were passaged three times a week. The adherent macrophages were detached from the bottom of the culture flask with a cell scraper prior to passage while the suspension cells were centrifuged for 5 min at 300 g and then resuspended in medium. From the well-mixed cell suspension, 50 μl were removed and the same volume of a trypan blue solution (0.1% trypan blue in 1 × PBS) was added. An aliquot of this mixture was then pipetted into a counting chamber according to Bürker (Brand, Wertheim) in which the cells were counted microscopically. The count of 25 quadrants equals the number of cells in 0.1 μl of cell suspension. This results in the following formula: cells / ml = counted cells × dilution factor × 10 ⁴ . For a new passage, 1-2 x 10 ⁶ cells were transferred to a fresh culture cell culture flask.

Transfektiontransfection

Das Einbringen der DNA Konstrukte in die Zellen erfolgte mit Hilfe liposomaler Reagenzien. Bei den Jurkat Zellen wurde die Transfektion mit dem DMRIE-CTM-Reagenz (Invitrogen, Karsuhe) durchgeführt, während für die U937 Zelllinie das Trankfektionsreagenz Fugene 6 (Roche, Mannheim) als erfolgreichste Methode ermittelt werden konnte. Zwei Tage vor der Transfektion wurden 2 × 105 Zellen in 10 cm Zellkulturschalen ausgesät. Für die Transfektion wurde das alte Kulturmedium der zu transfizierenden Zellen entfernt und durch OptiMEM^® Medium ohne Antibiotika ersetzt. Das jeweilige Transfektionsreagenz wurde mit 3 µg des Konstrukts in einem Verhältnis von 3:1 eingesetzt. Nach einer 15 minütigen Inkubation bei RT wurde dieses DNA-Liposomen Gemisch zu den Zellen gegeben, die anschließend bei 37 °C im Brutschrank für 24 h inkubiert wurden. Um ein optimales Wachstum der Zellen zu gewährleisten wurden die Zellen für weitere 24 h auf ein Vollmedium mit FCS überführt.The introduction of the DNA constructs into the cells was carried out using liposomal reagents. The Jurkat cells were transfected with the DMRIE-CTM reagent (Invitrogen, Karsuhe), whereas for the U937 cell line, the poisoning reagent Fugene 6 (Roche, Mannheim) was found to be the most successful method. Two days before transfection, 2 × 10 5 cells were seeded in 10 cm cell culture dishes. For transfection, the old culture medium of the cells to be transfected was removed and replaced with OptiMEM ^® medium without antibiotics. The respective transfection reagent was used with 3 μg of the construct in a ratio of 3: 1. After a 15 minute incubation at RT, this DNA-liposome mixture was added to the cells, which were then incubated at 37 ° C in the incubator for 24 h. To ensure optimal growth of the cells, the cells were transferred to a complete medium with FCS for a further 24 h.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

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Ensembl Release 61 - Feb 2011 [0026]

Claims

Use of Alkylschwefelalkansäurederivaten and their pharmaceutically acceptable salts according to the general formula I.

Wherein n is 1 or 2, R ^{1 is} hydrogen or a C ¹ -C ⁴ -alkyl radical and R ^{2 is} a C 10 -C 18 -alkyl radical, for the treatment of chronic inflammatory diseases.

Use of alkyl sulfuric acid derivatives for the treatment of chronic inflammatory diseases according to claim 1, characterized in that R1 is hydrogen.

Use of alkyl sulfuric acid derivatives for the treatment of chronic inflammatory diseases according to claim 1 or 2, characterized in that R 2 is a C 12 -C 16 -alkyl radical.

Use of alkylsulfur-alkanoic acid derivatives for the treatment of chronic inflammatory diseases according to any one of claims 1 to 3, characterized in that n is 1, R 1 is hydrogen and R 2 is a C 14 -alkyl radical.

Use of alkyl sulfuric acid derivatives for the treatment of chronic inflammatory diseases according to one of claims 1 to 4, characterized in that the chronic inflammatory disease is selected from multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, Wegener's granulomatosis, Churg-Strauss syndrome, Crohn's disease, ulcerative colitis , primary sclerosing cholangitis and psoriasis.

Use of alkylsulfur-alkanoic acid derivatives for the treatment of chronic inflammatory diseases according to claim 5, characterized in that the chronic inflammatory disease is selected from multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, Wegener's granulomatosis, Crohn's disease and ulcerative colitis.

Use of alkyl sulfuric acid derivatives for the treatment of chronic inflammatory diseases according to claim 5 or 6, characterized in that the chronic inflammatory disease is multiple sclerosis.

Use of alkyl sulfuric acid derivatives for the treatment of chronic inflammatory diseases according to any one of claims 1-7, characterized in that first the base at base position 866 (rs659366) of the human UCP2 gene is determined and in case there is another base instead of an adenine , a subject is diagnosed with an increased risk of developing a disease.

Use of Alkylschwefelalkansäurederivaten for the treatment of chronic inflammatory diseases according to claim 8, characterized in that first the base at base position 866 (rs659366) of the human UCP2 gene is determined and in the case where there is a guanine, diagnosed for the subject an increased risk of disease becomes.

Use of alkyl sulfuric acid derivatives for the treatment of chronic inflammatory diseases according to any one of claims 1-7, wherein the disease is characterized in that base base 866 (rs659366) of the human UCP2 gene is another base instead of an adenine.

Use of alkyl sulfuric acid derivatives for the treatment of chronic inflammatory diseases according to claim 10, wherein the disease is characterized in that guanine is present at base position 866 (rs659366) of the human UCP2 gene instead of an adenine.