DE102011050490B4

DE102011050490B4 - Force sensor and its use for determining cell forces

Info

Publication number: DE102011050490B4
Application number: DE102011050490.7A
Authority: DE
Inventors: Philipp Paulitschke; Doris Heinrich; Felix Keber
Original assignee: Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU
Current assignee: Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2011-05-19
Publication date: 2020-08-13
Anticipated expiration: 2031-05-20
Also published as: DE102011050490A1

Abstract

Kraftsensor (24) zur Verwendung an lebenden Zellen (10) oder Kleinsttieren, der Folgendes umfasst:eine Mehrzahl von säulenförmigen Elementen (12), die jeweils mit einem unteren Ende (22a) an einem Substrat (26) befestigt sind und ein oberes, freies Ende (22b) haben,wobei die säulenförmigen Elemente (22) und das Substrat (26) aus einem Festkörpermaterial bestehen,der Säulenquerschnitt am oberen Ende (22b) größer ist als am unteren Ende (22a), und der Durchmesser am unteren Ende (22a) kleiner als 500 nm ist.Force sensor (24) for use on living cells (10) or small animals, comprising: a plurality of columnar elements (12), each of which is attached to a substrate (26) by a lower end (22a) and an upper, free one End (22b), wherein the columnar elements (22) and the substrate (26) consist of a solid material, the column cross-section at the upper end (22b) is larger than at the lower end (22a), and the diameter at the lower end (22a) ) is smaller than 500 nm.

Description

Gebiet der ErfindungField of invention

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der medizinischen oder biologischen Analytik. Insbesondere betrifft sie einen hochauflöseriden Kraftsensor zur Messung von Kräften, die von Zellen oder Kleinsttieren ausgeübt werden.The present invention is in the field of medical or biological analysis. In particular, it relates to a high-resolution force sensor for measuring forces exerted by cells or small animals.

Hintergrund der Erfindung und Stand der TechnikBackground of the Invention and Prior Art

Das Verständnis zellulärer Dynamik, insbesondere der Zellmigration, ist von weitreichender und grundlegender Bedeutung, da sie unmittelbar auf eine Vielzahl von biologischen und medizinischen Prozessen Einfluss hat, beispielsweise die Angiogenese, Gewebedynamik, Immunreaktionen, Wundheilung oder Tumormetastasierung. Die Zellbewegung wird durch das sogenannte Zytoskelett kontrolliert, das aus dynamisch auf- und abbaubaren, dünnen, fadenförmigen Zellstrukturen besteht. Die Zellkräfte werden typischerweise durch Polymerisation von Aktin-Mikrofilamenten und durch sogenannte Myosin-Motoren generiert, die sich schrittweise wie eine lineare Ratsche entlang bereits gebildeter Aktin-Mikrofilamente ausbreiten.Understanding cellular dynamics, especially cell migration, is of far-reaching and fundamental importance as it has a direct impact on a large number of biological and medical processes, for example angiogenesis, tissue dynamics, immune reactions, wound healing or tumor metastasis. Cell movement is controlled by the so-called cytoskeleton, which consists of thin, thread-like cell structures that can be dynamically built up and broken down. The cell forces are typically generated by polymerizing actin microfilaments and by so-called myosin motors, which gradually spread like a linear ratchet along actin microfilaments that have already formed.

Das Verständnis von Zellkräften ist daher der Schlüssel zu einer Vielzahl medizinischer und biologischer Fragestellungen. In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Untersuchungsmethoden vorgeschlagen, um Zellkräfte zu messen. Beispielsweise lassen sich Zellkräfte im pN-Bereich mithilfe optischer Pinzetten (siehe Chen, C.S.J. Cell, Sci. 2008, 121, 3285-92 Pt 20 ) oder mithilfe von Mikropipetten (siehe Discher, D.E. et al., Science 2005, 310 (5751) 1139-43 ) ermitteln. Diese Methoden lassen jedoch nur die Ermittlung punktuell auftretender Kräfte zu.Understanding cell forces is therefore the key to a variety of medical and biological issues. In recent years, a number of test methods have been proposed to measure cell forces. For example, cell forces in the pN range can be measured using optical tweezers (see Chen, CSJ Cell, Sci. 2008, 121, 3285-92 Pt 20 ) or with the help of micropipettes (see Discher, DE et al., Science 2005, 310 (5751) 1139-43 ) determine. However, these methods only allow the determination of punctiform forces.

Zur Analyse der Gesamtheit von Kräften, die beispielsweise während der Zellmigration auftreten, wurde die sogenannte Bead-Zytometrie vorgeschlagen. Dabei werden fluoreszente Nano-Teilchen (sogenannte Nano-Beads) in einem Gel eingebettet und die Verschiebung der Nano-Teilchen während der Zellmigration verfolgt, wodurch Information bezüglich der Verformung des gesamten Substrates infolge der Zellkräfte erhalten wird. Die Präzision der Verfolgung der Nano-Partikel ist aufgrund ihres Lichtpunktcharakters außerordentlich hoch und gestattet eine Auflösung der gemessenen Kräfte im pN-Bereich (siehe Yoshiaki Iwadate und Shigehiko Yumura. Molecular dynamics and forces of a motile cell simultaneously visualized by tirf and force microscopies. BioTechniques, 44:739-750, 2008 ). Nachteilig hierbei ist jedoch, dass die Herstellung homogener Gele relativ anspruchsvoll ist, und das die beobachteten Kräfte sich über das gesamte Gel verteilen, wodurch sich die Auswertung der Kräfte relativ schwierig gestaltet.So-called bead cytometry has been proposed for analyzing the totality of forces that occur, for example, during cell migration. Here, fluorescent nano-particles (so-called nano-beads) are embedded in a gel and the displacement of the nano-particles during cell migration is tracked, whereby information is obtained regarding the deformation of the entire substrate as a result of cell forces. The precision of the tracking of the nano-particles is extremely high due to their light point character and allows a resolution of the measured forces in the pN range (see Yoshiaki Iwadate and Shigehiko Yumura. Molecular dynamics and forces of a motile cell simultaneously visualized by tirf and force microscopies. BioTechniques, 44: 739-750, 2008 ). The disadvantage here, however, is that the production of homogeneous gels is relatively demanding, and that the observed forces are distributed over the entire gel, making the evaluation of the forces relatively difficult.

Ein weiteres bekanntes Messverfahren verwendet einen Kraftsensor, der eine Vielzahl von vertikalen Säulen auf einem horizontalen Substrat umfasst. Die Säulen und das Substrat bestehen aus Polydimethylsiloxat (PDMS), d.h. einem Elastomer-Material. Der Aufbau und die Verwendung dieses Elastomer-Kraftsensors ist in Olivia du Roure et al., Force mapping in epithelial cell migration, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica, 102(7):2390-2395, 2005 und in K. Maniura et al., Fabrication of elastomer pillar arrays with modulated stiffness for cellular force measurements, J. Vac. Sci. Technol. B, 26(6):1071-1023, 2008 beschrieben. Bei diesen Kraftmessungen befanden sich die Zellen stets auf den Oberflächen mehrerer benachbarter Säulen. Allerdings hat sich herausgestellt, dass bei diesem Kraftsensor die Kalibrierung der Kräfte schwieriger ist als man ursprünglich gedacht hatte. Insbesondere hat sich herausgestellt, dass eine Verbiegung des Substrates selbst nicht unerheblich zu der Ablenkung der Säulen beiträgt, und dass daher aus einer gemessenen Säulen-Auslenkung nicht ohne Weiteres auf die Größe der zugrundeliegenden Kraft geschlossen werden kann, siehe hierzu Ingmar Schoen et al., Probing cellular traction forces by micropillar arrays: Contribution of substrate warping to pillar deflection, Nano Letters, 10(5):1823-1830, May 2010.Another known measuring method uses a force sensor that comprises a plurality of vertical columns on a horizontal substrate. The pillars and the substrate are made of polydimethylsiloxate (PDMS), ie an elastomer material. The structure and use of this elastomer force sensor is in Olivia du Roure et al., Force mapping in epithelial cell migration, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica, 102 (7): 2390-2395, 2005 and in K. Maniura et al., Fabrication of elastomer pillar arrays with modulated stiffness for cellular force measurements, J. Vac. Sci. Technol. B, 26 (6): 1071-1023, 2008 described. In these force measurements, the cells were always on the surfaces of several adjacent columns. However, it turned out that with this force sensor the calibration of the forces is more difficult than originally thought. In particular, it has been found that a bending of the substrate itself contributes not insignificantly to the deflection of the pillars and that therefore the magnitude of the underlying force cannot be readily deduced from a measured pillar deflection, see Ingmar Schoen et al., Probing cellular traction forces by micropillar arrays: Contribution of substrate warping to pillar deflection, Nano Letters, 10 (5): 1823-1830, May 2010.

Ferner lassen sich Zellkräfte im Piconewton-Bereich mit Hilfe von Nanodrähten messen, vgl. Hällström, Nano Lett., 2010, 10(3), pp 782-787 . Allerdings sind die Nanodrähte aufgrund ihrer geometrischen Abmessungen (Radius von etwa 20 nm) aufgrund der Beugungsbegrenzung nicht direkt in einem optischen Mikroskop detektierbar. Außerdem ist das Herstellen von Nanodrähten verhältnismäßig kostenintensiv.Furthermore, cell forces in the piconewton range can be measured with the help of Measure nanowires, cf. Hällström, Nano Lett., 2010, 10 (3), pp 782-787 . However, due to their geometrical dimensions (radius of around 20 nm), due to the diffraction limitation, the nanowires cannot be detected directly in an optical microscope. In addition, the production of nanowires is relatively expensive.

Somit besteht immer noch Bedarf nach einem Kraftsensor, mit dem sich Zellkräfte präzise und reproduzierbar ermitteln lassen.Thus there is still a need for a force sensor with which cell forces can be determined precisely and reproducibly.

Zusammenfassung der ErfindungSummary of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Kraftsensor und dessen Herstellungsverfahren anzugeben, mit dem sich Kräfte von Zellen und Kleinstlebewesen präzise und reproduzierbar ermitteln lassen.The invention is based on the object of specifying a force sensor and its production method with which the forces of cells and microorganisms can be determined precisely and reproducibly.

Diese Aufgabe wird durch einen Kraftsensor nach Anspruch 1 und ein Herstellungsverfahren nach Anspruch 13 gelöst. Ferner schlägt die vorliegende Erfindung eine vorteilhafte Verwendung des Kraftsensors nach Anspruch 15 vor. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.This object is achieved by a force sensor according to claim 1 and a manufacturing method according to claim 13. The present invention further proposes an advantageous use of the force sensor according to claim 15. Advantageous further developments are given in the dependent claims.

Der Kraftsensor der Erfindung umfasst eine Mehrzahl von säulenförmigen Elementen, die jeweils mit einem unteren Ende an einem Substrat befestigt sind und ein freies oberes Ende haben. Die säulenförmigen Elemente und das Substrat bestehen aus einem Festkörpermaterial. Ferner ist der Säulenquerschnitt am oberen Ende größer als am unteren Ende, und der Durchmesser am unteren Ende kleiner ist als 500 nm. The force sensor of the invention comprises a plurality of columnar elements each having a lower end attached to a substrate and a free upper end. The columnar elements and the substrate are made of a solid material. Furthermore, the column cross-section is larger at the upper end than at the lower end, and the diameter at the lower end is smaller than 500 nm.

Der Kraftsensor der Erfindung unterscheidet sich somit von dem oben beschriebenen PDMSbasierten Kraftsensor dadurch, dass anstelle eines Elastomers hier ein Festkörpermaterial verwendet wird. Das Festkörpermaterial kann beispielsweise amorph, kristallin oder polykristallin sein und insbesondere durch ein Metall oder ein Halbleiter-Material gebildet werden. Ferner zeichnen sich die Säulen des erfindungsgemäßen Kraftsensors durch eine unterkehlige Gestalt aus, bei der der Säulenquerschnitt am oberen Ende größer als am unteren Ende ist.The force sensor of the invention thus differs from the above-described PDMS-based force sensor in that a solid material is used here instead of an elastomer. The solid material can be amorphous, crystalline or polycrystalline, for example, and in particular be formed by a metal or a semiconductor material. Furthermore, the columns of the force sensor according to the invention are characterized by a lower throat shape, in which the column cross-section is larger at the upper end than at the lower end.

Die Erfinder haben festgestellt, dass sich mit diesem Sensoraufbau eine präzisere und besser reproduzierbare Kraftmessung erzielen lässt als nach dem Stand der Technik. Durch Verwendung des Festkörpermaterials können Verformungen im Substrat, wie sie bei elastomeren Kraftsensoren auftreten, im Wesentlichen ausgeschlossen werden. Da der Querschnitt der Säulen am unteren Ende lediglich 500 nm oder weniger beträgt, führen bereits sehr kleine Kräfte im pN-Bereich zu einer feststellbaren Auslenkung derselben. Die Tatsache, dass sich der Säulenquerschnitt vom oberen Ende bis zum unteren Ende verjüngt hat ferner den Vorteil, dass die Verformung zu überwiegenden Teilen im Bereich des unteren Endes der Säule stattfindet, die Säule also durch Krafteinwirkung der Zellen im wesentlichen gekippt, aber nicht verbogen wird. Dies bedeutet, dass der (messbaren) Verschiebung des oberen Endes der Säule mit guter Genauigkeit ein zugehöriges Drehmoment entspricht, welches von der Zelle auf die Säule ausgeübt wird. Man beachte, dass eine solche Zuordnung nicht möglich ist, wenn sich das Substrat in unkontrollierter Weise verformt, oder wenn sich die Säule selbst in unkontrollierter Weise verbiegt.The inventors have found that with this sensor structure a more precise and more reproducible force measurement can be achieved than according to the prior art. By using the solid material, deformations in the substrate, such as those that occur with elastomer force sensors, can essentially be ruled out. Since the cross-section of the columns at the lower end is only 500 nm or less, even very small forces in the pN range lead to a detectable deflection of the same. The fact that the column cross-section tapers from the upper end to the lower end also has the advantage that the deformation takes place predominantly in the area of the lower end of the column, i.e. the column is essentially tilted but not bent by the force of the cells . This means that the (measurable) displacement of the upper end of the column corresponds with good accuracy to an associated torque which is exerted by the cell on the column. It should be noted that such an assignment is not possible if the substrate is deformed in an uncontrolled manner or if the column itself bends in an uncontrolled manner.

Aus dem Drehmoment kann dann die Zellkraft ermittelt werden, indem man dieses durch den Hebelarm dividiert, Wenn die Zellen auf den oberen Enden der Säulen angeordnet sind, entspricht der Hebelarm der Säulenlänge. Wenn die Zellen sich hingegen zwischen den Säulen befinden, wie im Rahmen dieser Offenbarung ebenfalls vorgeschlagen wird, verkürzt sich der Hebelarm entsprechend. Auch in diesem Fall können jedoch zumindest Minimalwerte der Kraft angegeben werden (denen der maximale Hebelarm unterstellt wird), und es können relative Kräfte ermittelt werden (unter der Annahme, dass die (unbekannten) Hebelarme etwa gleich lang sind). Schließlich ist es aber auch möglich, den aktuellen Hebelarm zumindest näherungsweise im Experiment zu bestimmen, wie unten näher erläutert wird.The cell force can then be determined from the torque by dividing this by the lever arm. If the cells are arranged on the upper ends of the columns, the lever arm corresponds to the column length. If, however, the cells are located between the columns, as is also proposed in the context of this disclosure, the lever arm is shortened accordingly. In this case too, however, at least minimum values of the force can be specified (to which the maximum lever arm is assumed), and relative forces can be determined (assuming that the (unknown) lever arms are approximately the same length). Finally, it is also possible to determine the current lever arm at least approximately in the experiment, as will be explained in more detail below.

Ein weiterer Vorteil der sich nach unten verjüngenden Gestalt der Säulen besteht darin, dass trotz eines verhältnismäßig geringen Querschnitts im Bereich des unteren Endes, der für die geringe Rückstellkraft bzw. Fehlerkonstante der Säule verantwortlich ist, ein verhältnismäßig großer Querschnitt im Bereich des oberen Endes zur Verfügung gestellt werden kann, der für die Detektion der Auslenkung der Säulen vorteilhaft ist.Another advantage of the downward tapering shape of the columns is that despite a relatively small cross section in the area of the lower end, which is responsible for the low restoring force or error constant of the column, a relatively large cross section is available in the area of the upper end can be made, which is advantageous for the detection of the deflection of the columns.

In einer vorteilhaften Weiterbildung ist der Durchmesser im unteren Ende der Säule kleiner als 200 nm, vorzugsweise sogar kleiner als 100 nm. Dadurch lassen sich sehr kleine Rückstellkräfte hinsichtlich der Verkippung der säulenförmigen Elemente erzielen, und somit auch sehr geringe Zellkräfte messen.In an advantageous development, the diameter in the lower end of the column is less than 200 nm, preferably even less than 100 nm. This allows very small restoring forces to be achieved with regard to the tilting of the columnar elements, and thus very small cell forces to be measured.

In einer vorteilhaften Weiterbildung haben die säulenförmigen Elemente die Form eines auf dem schmalen Ende stehenden Kegelstumpfes, dessen halber Öffnungswinkel 0,5° bis 7°, vorzugsweise 1° bis 3° beträgt. Unter dem „halben Öffnungswinkel“ wird der Winkel zwischen der Kegelachse und einer Mantellinie des Kegelstumpfes verstanden, die sich durch den Schnitt einer die Kegelachse erhaltenden Ebene mit der Mantelfläche ergibt.In an advantageous further development, the columnar elements have the shape of a truncated cone standing on the narrow end, half the opening angle thereof 0 , 5 ° to 7 °, preferably 1 ° to 3 °. The “half opening angle” is understood to mean the angle between the cone axis and a surface line of the truncated cone, which results from the intersection of a plane containing the cone axis with the surface area.

Vorzugsweise gilt für die Federkonstante k der Säulen: $k = \frac{F}{Δ x} \leq 10 m N / m, b e s o n d e r s v o r z u g w e i s e \leq 1 m N / m$

wobei Δx die Auslenkung des oberen Endes des säulenförmigen Elementes in horizontaler Richtung und F eine horizontale Kraft ist, die am oberen Ende des säulenförmigen Elementes angreift. Derart geringe Federkonstanten erlauben wiederum die Messung äußerst geringer Kräfte.The following preferably applies to the spring constant k of the columns:

k = \frac{F}{Δ x} \leq 10 m N / m, b e s O n d e r s v O r e.g. u G w e i s e \leq 1 m N / m

where Δx is the deflection of the upper end of the columnar element in the horizontal direction and F is a horizontal force acting on the upper end of the columnar element. Such low spring constants in turn allow extremely low forces to be measured.

In einer vorteilhaften Weiterbildung ist das Material des Kraftsensors GaAs, Si, SiN oder SiO₂. Hierbei handelt es sich um Materialien, die in der Halbleitertechnologie standardmäßig verwendet werden. Für die Zwecke der Erfindung ist dies - neben den geeigneten mechanischen Eigenschaften dieser Materialien - deshalb von Bedeutung, weil auf die ausgereiften Herstellungsverfahren aus der Halbleiterindustrie zurückgegriffen werden kann. Daher können unter Verwendung an sich bekannter Verfahren aus der Halbleitertechnologie Nanostrukturen mit äußerster Präzision und Reproduzierbarkeit hergestellt werden, und dies zu äußerst günstigen Kosten.In an advantageous development, the material of the force sensor is GaAs, Si, SiN or SiO ₂ . These are materials that are used as standard in semiconductor technology. For the purposes of the invention, this is important - in addition to the suitable mechanical properties of these materials - because the sophisticated manufacturing processes from the semiconductor industry can be used. Therefore, using methods known per se from semiconductor technology, nanostructures can be produced with extreme precision and reproducibility, and this at extremely low cost.

Vorzugsweise hat das Festkörpermaterial piezoelektrische Eigenschaften. Aufgrund von piezoelektrischen Eigenschaften erschließt sich neben der optischen Mikroskopabbildung eine weitere Detektionsmethode, da aufgrund von Verbiegungen der Säule elektrische Spannungsfelder erzeugt werden, welche Aufschluss über die Stärke der Verbiegung liefert. Ein Beispiel für ein geeignetes piezoelektrisches Material ist GaAs. The solid material preferably has piezoelectric properties. Due to piezoelectric properties, in addition to the optical microscope image, a further detection method is available, since electrical voltage fields are generated due to bending of the column, which provides information about the strength of the bending. An example of a suitable piezoelectric material is GaAs.

Vorzugsweise ist das Festkörpermaterial des Kraftsensors biokompatibel, so dass die Zellen oder Kleinstlebewesen nicht durch Kontakt mit dem Material beeinträchtigt werden. Alternativ kann die den Zellen auszusetzende Oberfläche des Kraftsensors zumindest teilweise behandelt oder beschichtet sein, um eine Biokompatibilität herzustellen, z.B. mit einer Flüssigbeschichtung oder mit einer isotropen Materialabscheidung (z.B. mit einer PECVD-Anlage).The solid material of the force sensor is preferably biocompatible, so that the cells or microorganisms are not impaired by contact with the material. Alternatively, the surface of the force sensor to be exposed to the cells can be at least partially treated or coated to provide biocompatibility, e.g. with a liquid coating or with an isotropic material deposition (e.g. with a PECVD system).

In einer vorteilhaften Weiterbildung beträgt die Länge der Säulen zwischen 1 µm und 50 µm, vorzugsweise zwischen 4 µm und 12 µm und besonders vorzugsweise zwischen 4 µm und 10 µm. Die am besten geeignete Länge hängt von der Größe der untersuchten Zellen und von der zugrundeliegenden biologischen oder medizinischen Fragestellung ab. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Kraftsensors besteht darin, dass er sich ohne großen zusätzlichen Aufwand in einer Vielzahl unterschiedlicher Konfigurationen herstellen lässt, wie unten anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert wird, so dass es auch unter ökonomischen Gesichtspunkten möglich ist, eine Vielzahl von unterschiedlich konfigurierten Kraftsensoren für unterschiedliche Zelltypen oder Experimente anzubieten.In an advantageous further development, the length of the columns is between 1 μm and 50 μm, preferably between 4 μm and 12 μm and particularly preferably between 4 μm and 10 μm. The most suitable length depends on the size of the cells examined and on the underlying biological or medical issue. A particular advantage of the force sensor according to the invention is that it can be produced in a large number of different configurations without much additional effort, as will be explained in more detail below using an exemplary embodiment, so that it is also possible from an economic point of view to use a large number of differently configured force sensors for to offer different cell types or experiments.

Vorzugsweise sind die säulenförmigen Elemente in einer rechteckigen oder hexagonalen Gitterstruktur auf dem Substrat angeordnet, wobei die Differenz aus Gitterkonstante des Gitters und dem Querschnitt der Säule am unteren Ende, das heißt der Zwischenraum zwischen benachbarten Säulen, vorzugsweise zwischen 1 µm und 10 µm beträgt. Die am besten geeignete Periode hängt von der Größe der untersuchten Zellen und von der zugrundeliegenden biologischen oder medizinischen Fragestellung ab.The columnar elements are preferably arranged in a rectangular or hexagonal lattice structure on the substrate, the difference between the lattice constant of the lattice and the cross section of the column at the lower end, i.e. the space between adjacent columns, being preferably between 1 μm and 10 μm. The most suitable period depends on the size of the examined cells and on the underlying biological or medical problem.

Ferner beträgt die Anzahl der säulenförmigen Elemente auf dem Kraftsensor vorzugsweise mindestens 25, besonders vorzugsweise mindestens 100 und noch bevorzugter mindestens 1000.Furthermore, the number of the columnar elements on the force sensor is preferably at least 25 , particularly preferably at least 100 and even more preferably at least 1000.

Wie oben erwähnt hängt die ideale Säulenhöhe und Gitterkonstante in der Regel von der Größe der zu untersuchenden Zellen ab. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis von Säulenhöhe und mittlerem Zelldurchmesser 0,75 bis 2,0, vorzugsweise 0,8 bis 1,5.As mentioned above, the ideal column height and lattice constant usually depend on the size of the cells to be examined. In a preferred embodiment, the ratio of column height and mean cell diameter is 0.75 to 2.0, preferably 0.8 to 1.5.

Zusätzlich oder alternativ beträgt die Differenz aus der Gitterkonstante des Gitters und dem Querschnitt des säulenförmigen Elementes am unteren Ende das 0,4 bis 2,0-fache, vorzugsweise das 0,5 bis 1,5-fache des mittleren Zelldurchmessers.Additionally or alternatively, the difference between the lattice constant of the lattice and the cross section of the columnar element at the lower end is 0.4 to 2.0 times, preferably 0.5 to 1.5 times the mean cell diameter.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Herstellen eines Kraftsensors nach einer der oben beschriebenen Ausführungsformen aus einem Festkörpermaterial-Substrat, bei dem die Zwischenräume zwischen auszubildenden säulenförmigen Elementen in das Substrat geätzt werden. Dabei kommt vorzugsweise ein Plasma-Ätzverfahren zur Anwendung.The invention further relates to a method for producing a force sensor according to one of the above-described embodiments from a solid material substrate, in which the intermediate spaces between columnar elements to be formed are etched into the substrate. A plasma etching process is preferably used here.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform

- wird eine Fotomaske auf das Substrat aufgebracht,
- wird die Fotomaske durch Elektronenstrahl-Lithographie oder optischer Lithographie entsprechend der Struktur der oberen Enden der herzustellenden säulenförmigen Elemente belichtet und anschließend entwickelt, um die Fotomaske zu strukturieren,
- werden die Bereiche des Substrats, die den oberen Enden der auszubildenden säulenförmigen Elemente entsprechen, mit einer Maske, insbesondere einer Metallmaske bedeckt, und
- wird das Plasma-Ätzverfahren so durchgeführt, dass sich nach unten verjüngende säulenförmige Elemente ausgebildet werden.

In a particularly preferred embodiment

- a photo mask is applied to the substrate,
the photomask is exposed by electron beam lithography or optical lithography according to the structure of the upper ends of the columnar elements to be produced and then developed in order to structure the photomask,
the areas of the substrate which correspond to the upper ends of the columnar elements to be formed are covered with a mask, in particular a metal mask, and
the plasma etching process is carried out in such a way that downwardly tapering columnar elements are formed.

Durch Verwendung der Elektronenstrahl-Lithographie können ohne nennenswerten apparativen Mehraufwand beliebige Gitterformen, Gitterkonstanten und Säulendurchmesser hergestellt werden. Ferner kann die Länge der säulenförmigen Elemente einfach durch die Ätztiefe festgelegt werden. Somit können ohne nennenswerte zusätzliche Kosten Kraftsensoren unterschiedlicher Gestalt hergestellt werden, die ideal auf bestimmte Zelltypen bzw. -größen oder biologische bzw. medizinische Fragestellungen abgestimmt sind. Dies ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber bekannter Kraftsensoren, die aus einem Elastomer-Material gegossen werden und bei denen für jeden neuen Kraftsensortyp eine neue Form hergestellt werden muss. Aufgrund der invertierten Verjüngung sind Strukturabmessungen unterhalb der lithographischen Auflösungsgrenze (Radius < 30 nm) herstellbar, wie dies auch bei epitaxisch gewachsenen Nanodrähten möglich ist.By using electron beam lithography, arbitrary grid shapes, grid constants and column diameters can be produced without significant additional expenditure on equipment. Furthermore, the length of the columnar elements can be determined simply by the etching depth. In this way, force sensors of different shapes can be produced without significant additional costs, which are ideally matched to specific cell types or sizes or biological or medical issues. This is a significant advantage over known force sensors that are cast from an elastomer material and for which a new shape has to be produced for each new type of force sensor. Due to the inverted taper, structure dimensions below the lithographic resolution limit (radius <30 nm) can be produced, as is also possible with epitaxially grown nanowires.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Kraftsensors nach einer der oben beschriebenen Ausführungsformen zur Messung von Zellkräften. Bei dieser Verwendung ist der Abstand zwischen Säulen ausreichend groß, dass sich die Zellen zumindest teilweise in den Zwischenräumen zwischen den Säulen aufhalten können. Im Stand der Technik ist nach Kenntnis der Erfinder bisher nur eine Kraftmessung von Zellen bekannt, die sich auf den oberen Enden mehrerer benachbarter säulenförmiger Elemente bewegen. Wenn sich die Zellen jedoch, wie hier vorgeschlagen, zwischen den säulenförmigen Elementen befinden, können zusätzliche und weitere Informationen über das Zellverhalten ermittelt werden. Beispielsweise erhält die Kraftmessung eine weitere räumliche Komponente, nämlich eine Höhenkomponente, d.h. eine Komponente in Längsrichtung der säulenförmigen Elemente. Somit erhält die Kraftmessung, die im beschriebenen Stand der Technik grundsätzlich zweidimensional war, eine dritte räumliche Komponente.The present invention also relates to the use of a force sensor according to one of the embodiments described above for measuring cell forces. When used in this way, the distance between columns is large enough that the Cells can reside at least partially in the spaces between the columns. In the prior art, to the knowledge of the inventors, so far only a force measurement of cells is known which move on the upper ends of several adjacent columnar elements. If, however, as suggested here, the cells are located between the columnar elements, additional and further information about the cell behavior can be determined. For example, the force measurement receives a further spatial component, namely a height component, ie a component in the longitudinal direction of the columnar elements. The force measurement, which was basically two-dimensional in the prior art described, thus receives a third spatial component.

Ferner bilden die säulenförmigen Elemente in dieser Ausführungsform anschaulich gesprochen ein „Labyrinth“ für die Zelle, durch das bestimmte Bewegungen der Zellen vorgegeben und gleichzeitig die auftretenden Kräfte gemessen werden können. Der Informationsgehalt, der mithilfe eines derartigen „dreidimensionalen“ Kraftsensors erzielt werden kann, geht daher über denjenigen eines üblichen, „zweidimensionalen“ Kraftsensors hinaus.Furthermore, the columnar elements in this embodiment form, clearly speaking, a “labyrinth” for the cell, through which certain movements of the cells can be specified and the forces which occur can be measured at the same time. The information content that can be obtained using such a “three-dimensional” force sensor therefore goes beyond that of a conventional, “two-dimensional” force sensor.

Vorzugsweise wird die Auslenkung der säulenförmigen Elemente und die Bewegung der Zellen mithilfe eines optischen Mikroskops beobachtet. Dabei werden vorzugsweise mindestens zwei Fokussierungsebenen des Mikroskops verwendet, von denen eine obere Ebene der Ebene entspricht, in der die oberen Enden der säulenförmigen Elemente liegen, und eine untere Fokussierungsebene zwischen der oberen Ebene und dem Substrat liegt, um eine Abbildung von Zellen zu gestatten, die sich zwischen den säulenförmigen Elementen befinden. Anhand der Verwendung dieser zwei Fokussierungsebenen lässt sich unter anderem feststellen, ob sich die Zellen auf oder zwischen den säulenförmigen Elementen befinden.The deflection of the columnar elements and the movement of the cells are preferably observed with the aid of an optical microscope. At least two focussing planes of the microscope are preferably used, of which an upper plane corresponds to the plane in which the upper ends of the columnar elements lie, and a lower focussing plane lies between the upper plane and the substrate in order to allow cells to be displayed. which are located between the columnar elements. Using these two levels of focus, one of the ways in which it can be determined is whether the cells are on or between the columnar elements.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die aktuelle Auslenkung der säulenförmigen Elemente durch Licht ermittelt, das von deren oberen Enden reflektiert wird, während die Position und/oder Konfiguration der Zellen durch Fluoreszenzlicht bestimmt wird.In a preferred embodiment, the current deflection of the columnar elements is determined by light which is reflected from their upper ends, while the position and / or configuration of the cells is determined by fluorescent light.

In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform wird das Licht, welches zur Detektion der Auslenkung der säulenförmigen Elemente verwendet wird, gleichzeitig auch für die Anregung der Fluoreszenz in den Zellen verwendet. Mit anderen Worten wird Licht eingestrahlt, von dem ein Teil von den oberen Enden der säulenförmigen Elemente reflektiert wird und ein weiterer Teil zur Anregung der Fluoreszenz dient. Dadurch können beide Funktionen, Detektion der Auslenkung der säulenförmigen Elemente und Anregung der Fluoreszenz mit nur einer Lichtquelle bewerkstelligt werden. Da das Fluoreszenzlicht stets langwelliger ist als das Anregungslicht, bedeutet dies ferner, dass das Fluoreszenzlicht und das von den oberen Enden der säulenförmigen Elemente reflektierte Licht unterschiedliche Wellenlängen haben. Somit kann das vom Kraftsensor empfangene Licht in unterschiedliche Farbkanäle aufgespaltet werden, so dass die Fluoreszenz und die Reflektion an den säulenförmigen Elementen trotz Verwendung einer teilweise identischen Optik getrennt beobachtet werden können.In a particularly advantageous embodiment, the light that is used to detect the deflection of the columnar elements is also used to excite the fluorescence in the cells. In other words, light is irradiated, part of which is reflected by the upper ends of the columnar elements and a further part serves to excite the fluorescence. As a result, both functions, detection of the deflection of the columnar elements and excitation of the fluorescence can be carried out with just one light source. Since the fluorescent light always has a longer wavelength than the excitation light, this also means that the fluorescent light and the light reflected from the upper ends of the columnar elements have different wavelengths. The light received by the force sensor can thus be split into different color channels so that the fluorescence and the reflection on the columnar elements can be observed separately despite the use of partially identical optics.

In einer vorteilhaften Weiterbildung wird der Ort, an dem eine Zelle eine Kraft auf ein säulenförmiges Element ausübt, ermittelt, indem die Fokussierungsebene in Längsrichtung der Säule variiert wird, und interne Prozesse der Zelle, insbesondere die Aktinpolymerisation beobachtet werden.In an advantageous development, the location at which a cell exerts a force on a columnar element is determined by varying the focal plane in the longitudinal direction of the column and observing internal processes of the cell, in particular actin polymerization.

In dieser Weiterbildung kann konkret die vertikale Höhe des Angriffspunkts der Kraft ermittelt und bei der Analyse berücksichtigt werden. Dies gestattet insbesondere, den Hebelarm der Zellkraft zu ermitteln, so dass aus der Auslenkung des säulenförmigen Elementes, die an sich zumindest näherungsweise ein Drehmoment repräsentiert, ein Absolutwert einer Kraft berechnet werden kann.In this development, the vertical height of the point of application of the force can specifically be determined and taken into account in the analysis. This makes it possible in particular to determine the lever arm of the cell force so that an absolute value of a force can be calculated from the deflection of the columnar element, which in itself at least approximately represents a torque.

In einer vorteilhaften Weiterbildung wird hierzu ein Spinning-Disc-Konfokalmikroskop verwendet, welches das Durchscannen unterschiedlicher Fokussierungsebenen mit einer Zeitauflösung im Millisekundenbereich gestattet.In an advantageous further development, a spinning disc confocal microscope is used for this purpose, which allows different focusing planes to be scanned with a time resolution in the millisecond range.

FigurenlisteFigure list

Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, in der die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert wird. Darin zeigen:

1 (a) eine schematische Darstellung einer lebenden Zelle in einer natürlichen extrazellulären Matrix;
1 (b) eine schematische Darstellung einer lebenden Zelle, die zwischen den säulenförmigen Elementen eines Kraftsensors nach der Erfindung angeordnet ist;
2 eine schematische Darstellung der Wechselwirkung einer Zelle mit einer exemplarischen Säule eines Kraftsensors nach einer Weiterbildung der Erfindung;
3 (a)-3 (c) Elektronenmikroskop-Aufnahmen von erfindungsgemäßen Kraftsensoren;
4 den schematischen Aufbau eines Mikroskops, das zur Kraftmessung mit dem Kraftsensor der Erfindung eingerichtet ist; und
5 (a)-5 (d) eine Abfolge von schematischen Darstellungen, die ein Herstellungsverfahren für einen Kraftsensor nach der Erfindung illustrieren.

Further advantages and features of the invention emerge from the following description, in which the invention is explained using an exemplary embodiment with reference to the accompanying drawings. Show in it:

1 (a) a schematic representation of a living cell in a natural extracellular matrix;
1 (b) a schematic representation of a living cell, which is arranged between the columnar elements of a force sensor according to the invention;
2 a schematic representation of the interaction of a cell with an exemplary column of a force sensor according to a development of the invention;
3 (a) -3 (c) Electron microscope images of force sensors according to the invention;
4th the schematic structure of a microscope which is set up for force measurement with the force sensor of the invention; and
5 (a) -5 (d) a sequence of schematic representations illustrating a manufacturing method for a force sensor according to the invention.

Beschreibung einer bevorzugten AusführungsformenDescription of a preferred embodiment

1(a) ist eine schematische Darstellung einer Zelle 10 in einer natürlichen extrazellulären Matrix 12. Die Zelle 10 hat einen Zellkern 14 und ein Zytoskelett mit astralförmig angeordneten Mikrotubuli 16 und einem Aktin-Kortex 18. Die natürliche extrazelluläre Matrix 12 kann man sich als Mikro-Topographie vorstellen, die mit Nanostrukturen, schematisch unter Bezugszeichen 20 dargestellt, bedeckt ist. Quantitative Experimente können nur schwer in natürlicher Umgebung durchgeführt werden, während Untersuchungen auf ebenen Flächen den wichtigen mechanischen Stimulus vernachlässigen, der sich in der natürlichen Umgebung ergibt. 1 (a) Figure 3 is a schematic representation of a cell 10 in a natural extracellular matrix 12th . The cell 10 has a nucleus 14th and a cytoskeleton with astral-shaped microtubules 16 and an actin cortex 18th . The natural extracellular matrix 12th can be imagined as a micro-topography with nanostructures, schematically under reference numbers 20th shown is covered. Quantitative experiments are difficult to perform in a natural environment, while studies on flat surfaces neglect the important mechanical stimulus that arises in the natural environment.

1 (b) ist eine schematische Darstellung der Zelle 10, die zwischen säulenförmigen Elementen 22 eines Kraftsensors 24 angeordnet ist, die im Folgenden einfach als „Säulen“ bezeichnet werden. Bei dem Kraftsensor 24 sind die Säulen 22 mit ihrem unteren Ende 22a an einem Substrat 26 befestigt. Das obere Ende 22b der Säulen 22 ist frei, so dass sich die Säulen aus ihrer senkrechten Ruhelage verkippen können, wenn die Zelle 10 eine Kraft auf diese ausübt. Nach diesem Prinzip werden die Zellkräfte lokal, d. h. am Orte der jeweils betreffenden Säule 22, gemessen. 1 (b) Figure 3 is a schematic representation of the cell 10 standing between columnar elements 22nd a force sensor 24 which are simply referred to as “pillars” in the following. With the force sensor 24 are the pillars 22nd with their lower end 22a on a substrate 26th attached. The top end 22b of the pillars 22nd is free so that the columns can tilt from their vertical rest position when the cell 10 exerts a force on them. According to this principle, the cell forces are local, ie at the location of the relevant column 22nd , measured.

Die Säulen 22 des Kraftsensors 24 haben daher eine doppelte Funktion, indem sie einerseits die Zellkraft durch das Ausmaß Verkippung aus ihrer Ruhelage anzeigen, andererseits aufgrund ihrer Rückstellkraft eine extrazelluläre Matrix für die Zelle 10 simulieren und daher ähnliche mechanische Stimuli für die Zelle bereitstellen, wie dies in der natürlichen Umgebung der Fall wäre.The columns 22nd of the force sensor 24 therefore have a double function: on the one hand, they display the cell force through the degree of tilting from its rest position, and on the other hand, an extracellular matrix for the cell due to their restoring force 10 simulate and therefore provide similar mechanical stimuli for the cell as it would in the natural environment.

In 2 ist das Funktionsprinzip der Kraftmessung anhand einer einzelnen Säule 22 näher dargestellt. Wie in 1 (b) und 2 zu sehen ist, hat eine jede Säule 22 eine konische Gestalt, bei der das untere Ende 22a einen geringeren Durchmesser hat, als das obere Ende 22b. Bei dem Kraftsensor 24 der Erfindung beträgt der Durchmesser am unteren Ende 22a einer jeden Säule 22 stets 500 nm oder weniger, in bevorzugten Ausführungsformen lediglich 200 oder sogar 100 nm oder weniger. Dies hat zur Folge, dass die Säule 22 sich vornehmlich im Bereich des unteren Endes 22a zur Seite biegt, wenn die Zelle 10 eine horizontale Kraft F_cell auf die Säule 22 ausübt, während die Verformung der Säule 22 in einem oberen Abschnitt vergleichweise gering ist. Die Messgröße bei dem Kraftsensor 24 ist die Auslenkung Δx des oberen Abschnittes 22b der Säule, der näherungsweise ein Drehmoment entspricht, das von der Zelle 10 auf die Säule 22 ausgeübt wird. Um die tatsächlich angreifende Kraft zu bestimmen, muss das Drehmoment durch den Hebelarm dividiert werden. Wie aus 2 zu ersehen ist, hängt der Hebelarm von der Höhe z über dem Substrat 26 ab, in der die Zelle 10 gegen die Säule 22 schiebt (oder an dieser zieht). Verfahren zum Ermitteln des Hebelarmes werden unten skizziert. Allerdings können auch ohne explizite Ermittlung des Hebelarms z relative Kräfte bestimmt werden (unter der Annahme, dass der Hebelarm in den Vergleichsfällen ähnlich sein wird), und es kann stets eine Untergrenze für die Kraft angegeben werden, wenn nämlich für den Hebelarm die maximal mögliche Länge angenommen wird, die in 2 als z₀ bezeichnet ist und der Länge der Säule 22 entspricht.In 2 is the functional principle of force measurement using a single column 22nd shown in more detail. As in 1 (b) and 2 can be seen, each column has 22nd a conical shape with the lower end 22a has a smaller diameter than the upper end 22b . With the force sensor 24 of the invention is the diameter at the lower end 22a of each pillar 22nd always 500 nm or less, in preferred embodiments only 200 or even 100 nm or less. As a result, the pillar 22nd mainly in the area of the lower end 22a bends to one side when the cell 10 a horizontal force F _cell on the column 22nd exercises while the deformation of the column 22nd is comparatively low in an upper section. The measured variable for the force sensor 24 is the deflection Δx of the upper section 22b of the column, which corresponds approximately to a torque that is exerted by the cell 10 on the pillar 22nd is exercised. To determine the force actually acting, the torque must be divided by the lever arm. How out 2 can be seen, the lever arm depends on the height z above the substrate 26th from where the cell 10 against the pillar 22nd pushes (or pulls). Procedures for determining the lever arm are outlined below. However, relative forces can also be determined without explicitly determining the lever arm z (assuming that the lever arm will be similar in the comparison cases), and a lower limit can always be specified for the force, namely if the maximum possible length for the lever arm is believed to be in 2 denoted as z ₀ and the length of the column 22nd corresponds.

Die Auslenkung der Säule 22 aus ihrer Ruhelage wird zweckmäßigerweise durch Licht detektiert, welches von der Oberfläche bzw. Stirnfläche 22c der Säule 22 an deren oberen Ende 22b reflektiert wird.The deflection of the column 22nd from their rest position is appropriately detected by light, which from the surface or end face 22c the pillar 22nd at their upper end 22b is reflected.

Um verhältnismäßig kleine Zellkräfte im pN-Bereich messen zu können, ist die Federkonstante k der Säulen, definiert als $\frac{F}{Δ x},$

verhältnismäßig gering und beträgt weniger als 10 nm/m, vorzugsweise 1 mN/m.In order to be able to measure relatively small cell forces in the pN range, the spring constant k of the columns is defined as

\frac{F}{Δ x},

relatively low and is less than 10 nm / m, preferably 1 mN / m.

Derartig geringe Federkonstanten können dadurch erzielt werden, dass die Säulen 22 wie gesagt an ihrem unteren Ende 22a einen geringen Durchmesser haben. Der Säulendurchmesser nimmt jedoch, wie oben erwähnt und in 1 (b) und 2 gezeigt in Richtung auf das obere Ende 22b zu. Dies hat zum einen den Vorteil, dass die Säulen 22 im oberen Bereich steifer werden und daher dort nur geringförmig verbiegen. Somit ist es möglich, die Auslenkung Δx des oberen Endes 22b der Säule 22 zumindest näherungsweise mit einem Drehmoment in Verbindung zu bringen. Ein weiterer Vorteil dieser Form besteht darin, dass die obere Stirnfläche 22c der Säule 22 vergleichsweise groß gewählt werden kann, was im Hinblick auf die optische Detektion der Auslenkung über eine Reflektion von dieser Stirnfläche 22c vorteilhaft ist.Such low spring constants can be achieved in that the columns 22nd as I said at its lower end 22a have a small diameter. However, as mentioned above and in 1 (b) and 2 shown towards the top 22b to. On the one hand, this has the advantage that the pillars 22nd become stiffer in the upper area and therefore only bend slightly there. Thus, it is possible to reduce the deflection Δx of the upper end 22b the pillar 22nd at least approximately to bring in connection with a torque. Another advantage of this shape is that the top face 22c the pillar 22nd can be selected to be comparatively large, which in view of the optical detection of the deflection via a reflection from this end face 22c is advantageous.

Das Material des Kraftsensors 24 ist erfindungsgemäß ein Festkörpermaterial, beispielsweise ein kristallines oder polykristallines oder amorphes Material, aber kein Elastomer wie dies aus dem Stand der Technik bekannt ist. Dadurch kann eine Verformung des Substrates 26 infolge der Zellkraft ausgeschlossen werden, die bei elastomeren Materialien auftreten kann und Schwierigkeiten bei der Kalibration solcher Kraftsensoren bereitet.The material of the force sensor 24 is according to the invention a solid material, for example a crystalline or polycrystalline or amorphous material, but not an elastomer as is known from the prior art. This can cause deformation of the substrate 26th due to the cell force which can occur with elastomeric materials and which causes difficulties in the calibration of such force sensors.

Bei dem Festkörpermaterial kann es sich beispielsweise um ein Metall oder ein Halbleitermaterial bzw. ein Oxid eines solchen handeln. Besonders bevorzugte Materialien sind GaAs, Si, SiN oder SiO₂. The solid material can be, for example, a metal or a semiconductor material or an oxide of such a material. Particularly preferred materials are GaAs, Si, SiN or SiO ₂ .

Weiterhin ist das Material des Kraftsensors vorzugsweise biokompatibel und insbesondere für die Zellen nicht toxisch. Die Erfinder haben festgestellt, dass GaAs trotz der Toxizität von Arsen biokompatibel ist, weil dieses von den Zellen zumindest nicht in schädlichen Dosen aufgenommen wird. Alternativ kann die Oberfläche des Kraftsensors zumindest teilweise behandelt oder beschichtet werden, um eine Biokompatibilität herzustellen.Furthermore, the material of the force sensor is preferably biocompatible and, in particular, not toxic to the cells. The inventors have found that, despite the toxicity of arsenic, GaAs is biocompatible because it is at least not absorbed by the cells in harmful doses. Alternatively, the surface of the force sensor can be at least partially treated or coated in order to produce biocompatibility.

3 (a) bis 3 (c) zeigen Elektronenmikroskopbilder von erfindungsgemäßen Kraftsensoren 24, bei denen als Festkörpermaterial GaAs verwendet wurde. 3 (a) zeigt einen Kraftsensor 24, bei dem die Säulen 22 in einem rechteckigen, im gezeigten Ausführungsbeispiel quadratischen Gitter mit einer Gitterkonstante von 2 µm angeordnet sind. 3 (c) zeigt einen Ausschnitt aus einem anderen Kraftsensor 24, bei dem die Gitterkonstante rund 4 µm beträgt. In der Aufnahme von 3 (c) ist ferner die Einhüllende einer Oszillationsbewegung zu erkennen, die durch die gestrichelte Linie 28 hervorgehoben ist. Im Fall von 3 (c) wurde die entsprechende Säule 22 mit einer Frequenz von ungefähr 500 kHz resonant angetrieben. 3 (a) to 3 (c) show electron microscope images of force sensors according to the invention 24 in which GaAs was used as the solid material. 3 (a) shows a force sensor 24 where the pillars 22nd are arranged in a rectangular grid, which is square in the exemplary embodiment shown, with a grid constant of 2 μm. 3 (c) shows a section from another force sensor 24 , in which the lattice constant is around 4 µm. In the recording of 3 (c) the envelope of an oscillatory movement can also be recognized by the dashed line 28 is highlighted. In case of 3 (c) became the corresponding column 22nd resonantly driven at a frequency of approximately 500 kHz.

Die Anzahl von Säulen 22, ihre Länge und Gitterkonstante richtet sich in erster Linie nach der Größe der zu untersuchenden Zellen und der jeweiligen biologischen Fragestellung. Hinsichtlich der geeigneten Gitterkonstante kommt es darauf an, ob erwünscht ist, dass die Zellen sich zwischen den Säulen 22 oder auf den Stirnflächen 22c an den oberen Enden 22b von mehreren benachbarten Säulen 22 befinden.The number of pillars 22nd , their length and lattice constant depend primarily on the size of the cells to be examined and the respective biological problem. With regard to the suitable lattice constant, it depends on whether it is desired that the cells are located between the columns 22nd or on the end faces 22c at the top ends 22b from several neighboring pillars 22nd are located.

In der Praxis hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn die Säulenhöhe von derselben Größenordnung ist wie der mittlere Durchmesser der Zellen. Ein vorteilhaftes Verhältnis von Säulenhöhe und mittlerem Zelldurchmesser beträgt beispielsweise 0,75 bis 2,0, vorzugsweise 0,8 bis 1,5. Die Zwischenräume zwischen benachbarten Säulen 22, d. h. die Differenz aus Gitterkonstante des Gitters und Querschnitt der Säule 22 am unteren Ende 22a beträgt vorteilhafterweise das 0,4 bis 2,0-fache, besonders vorzugsweise das 0,5 bis 1,5-fache des mittleren Zelldurchmessers.In practice it has been found to be advantageous if the column height is of the same order of magnitude as the mean diameter of the cells. An advantageous ratio of column height and mean cell diameter is, for example, 0.75 to 2.0, preferably 0.8 to 1.5. The spaces between adjacent pillars 22nd , ie the difference between the grid constant of the grid and the cross section of the column 22nd at the bottom 22a is advantageously 0.4 to 2.0 times, particularly preferably 0.5 to 1.5 times, the mean cell diameter.

In absoluten Zahlen beträgt die Länge der Säulen vorzugsweise zwischen 3 µm und 15 µm, und besonders vorzugsweise zwischen 4 µm und 12 µm bzw. 4 µm und 10 µm. In der Praxis besonders geeignete Abstände zwischen benachbarten Säulen betragen zwischen 1 und 10 µm.In absolute numbers, the length of the columns is preferably between 3 μm and 15 μm, and particularly preferably between 4 μm and 12 μm or 4 μm and 10 μm. In practice, particularly suitable distances between adjacent columns are between 1 and 10 µm.

In 4 ist eine schematische Ansicht eines Mikroskopaufbaus gezeigt, mit dem die Kraftmessung mithilfe des Kraftsensors 24 der Erfindung auswertbar ist. Mit dem Aufbau von 4 sollen zwei unterschiedliche Signale beobachtet werden, nämlich die Bewegung der Zellen 10 einerseits und die Auslenkung der Säulen 22 andererseits.In 4th is a schematic view of a microscope assembly is shown with which the force measurement using the force sensor 24 the invention can be evaluated. With the construction of 4th two different signals are to be observed, namely the movement of the cells 10 on the one hand and the deflection of the pillars 22nd on the other hand.

Zu diesem Zweck umfasst der Mikroskopaufbau von 4: eine Aufnahme 30 für den Kraftsensor 24, mit einem Teflonrahmen 32 und einer Abdeckung 34, die durch Paraffin-Abstandshalter 36 in ausreichendem Abstand von dem Kraftsensor 24 gehalten wird; und ein Objektiv 38, das unmittelbar an die Abdeckung 34 angrenzend angeordnet ist und von dieser nur durch Immersionsöl 40 getrennt ist. Ferner umfasst sie eine Quecksilberdampflampe 42 und einen Anregungslicht-Filter 44, der aus dem Spektrum der Quecksilberdampflampe 42 das geeignete Fluoreszenzanregungslicht für die Zellen 10 durchlässt. Im Lichtweg des Anregungslichtes ist ein dichroischer Spiegel 46 angeordnet, der das Anregungslicht durch das Objektiv 38 reflektiert und auf die Zellen 10 richtet um deren Fluoreszenz anzuregen.To this end, the microscope assembly includes 4th : a recording 30th for the force sensor 24 , with a Teflon frame 32 and a cover 34 made by paraffin spacers 36 at a sufficient distance from the force sensor 24 is held; and a lens 38 that is directly attached to the cover 34 is arranged adjacent and from this only by immersion oil 40 is separated. It also includes a mercury vapor lamp 42 and an excitation light filter 44 from the spectrum of the mercury vapor lamp 42 the appropriate fluorescence excitation light for the cells 10 lets through. There is a dichroic mirror in the light path of the excitation light 46 arranged that the excitation light through the lens 38 reflected and on the cells 10 aimed to stimulate their fluorescence.

Ferner wird ein Teil des Anregungslichts von den Stirnflächen 22c an den oberen Enden 22b der Säulen 22 reflektiert. Dieses von den Säulenenden 22c reflektierte Anregungslicht, das in dem gezeigten Ausführungsbeispiel blau ist, tritt gemeinsam mit dem von den Zellen 10 emittierten Fluoreszenzlicht (im gezeigten Ausführungsbeispiel grün) durch den dichroischen Spiegel 46 hindurch. Dabei reflektiert der dichroische Spiegel 46 zwar den Großteil des von den Säulenenden 22c reflektierten blauen Lichtes, jedoch reicht die Intensität des durchgelassenen blauen Lichtes immer noch für die Detektion der Ablenkung der Säulen 22 aus. Im Gegenteil ist die Schwächung des reflektierten blauen Lichtes sogar vorteilhaft, um es auf eine ähnliche Intensität abzuschwächen, wie das Fluoreszenzlicht.In addition, some of the excitation light comes from the end faces 22c at the top ends 22b of the pillars 22nd reflected. This from the ends of the pillars 22c reflected excitation light, which is blue in the embodiment shown, occurs together with that from the cells 10 emitted fluorescent light (green in the illustrated embodiment) through the dichroic mirror 46 through. The dichroic mirror reflects 46 although most of the column ends 22c reflected blue light, but the intensity of the transmitted blue light is still sufficient for the detection of the deflection of the pillars 22nd out. On the contrary, the attenuation of the reflected blue light is even advantageous in order to attenuate it to an intensity similar to that of fluorescent light.

Das reflektierte blaue und das grüne Fluoreszenzlicht werden durch eine Tubuslinse 48, eine Blende 50 und eine Kollimatorlinse 52 auf einen weiteren dichroischen Spiegel 54 geleitet, in dem das Licht gemäß der Wellenlänge aufgespalten wird. Das grüne Fluoreszenzlicht wird durch den dichroischen Spiegel 54 durchgelassen und über einen Emissionsfilter 56 und eine Abbildungslinse 58 auf einen ersten Abschnitt eines CCD-Sensors abgebildet.The reflected blue and green fluorescent light are passed through a tube lens 48 , an aperture 50 and a collimator lens 52 on another dichroic mirror 54 in which the light is split according to the wavelength. The green fluorescent light comes through the dichroic mirror 54 passed and through an emission filter 56 and an imaging lens 58 imaged on a first section of a CCD sensor.

Das blaue Reflektionslicht hingegen wird am dichroischen Spiegel 54 reflektiert und über einen weiteren Filter 62 und die Abbildungslinse 58 auf einen zweiten Abschnitt des Bildsensors 60 abgebildet.The blue reflection light, however, is on the dichroic mirror 54 reflected and through another filter 62 and the imaging lens 58 on a second section of the image sensor 60 pictured.

Auf diese Weise lässt sich mit derselben Optik sowohl das Säulenbild als auch das Bild der Zelle ermitteln.In this way, both the column image and the image of the cell can be determined with the same optics.

Mit dem Bildsensor 60 ist eine geeignete Steuerungseinheit (nicht gezeigt) verbunden, die die Bilder der Zellen und der Säulen registriert und die aus den Ablenkungen der Säulen die lokalen Zellkräfte ermittelt. With the image sensor 60 a suitable control unit (not shown) is connected, which registers the images of the cells and the columns and which determines the local cell forces from the deflections of the columns.

Die Fokussierungsebene des Mikroskops von 4 kann auf unterschiedliche Ebenen eingestellt werden. Zum Ermitteln der Position der Säulen wird sie auf die Ebene fokussiert, in der die Stirnflächen 22c der Säulen 22 liegen. Wenn sich die Zellen auf diesen Stirnflächen 22c befinden, sind sie ebenfalls in dieser Fokussierung zu erkennen. Falls die Zellen 10 sich jedoch zwischen den Säulen 22 befinden, wird zur Abbildung der Zellen 10 auf eine Ebene fokussiert, die näher am Substrat 26 liegt.The focusing plane of the microscope from 4th can be set at different levels. To determine the position of the pillars, it is focused on the plane in which the end faces 22c of the pillars 22nd lie. When the cells are on these end faces 22c they can also be recognized in this focus. If the cells 10 however, between the pillars 22nd is used to map the cells 10 focused on a plane that is closer to the substrate 26th lies.

Ferner ist es möglich, die Fokussierung durchzuscannen und so Bilder aus unterschiedlichen Ebenen aufzunehmen. Dadurch können die internen Prozesse der Zelle, insbesondere die Aktinpolymerisation, in z-Richtung ortsaufgelöst beobachtet werden und dadurch Aufschluss über den Ort in z-Richtung erhalten werden, an dem die Zelle 10 eine Kraft auf die Säule 22 ausübt und somit über den Hebelarm ermittelt werden. Hierfür ist insbesondere ein konfokales Spinning-Disk-Fluoreszenz-Mikroskop geeignet.It is also possible to scan through the focus and thus take pictures from different planes. As a result, the internal processes of the cell, in particular actin polymerization, can be observed spatially resolved in the z-direction and information about the location in the z-direction can be obtained at which the cell is located 10 a force on the pillar 22nd exercises and can thus be determined via the lever arm. A confocal spinning disk fluorescence microscope is particularly suitable for this.

In 5 (a) bis 5 (d) ist ein vorteilhafter Prozess zum Herstellen des Kraftsensors 24 schematisch dargestellt. 5 (a) zeigt ein Substrat 26, aus dem ein Kraftsensor 24 hergestellt werden soll, und dessen Oberfläche mit einer Fotomaske 64 beschichtet ist. Mithilfe eines Elektronenstrahls 66 werden durch Elektronenstrahl- oder optische Lithographie die Bereiche 68 belichtet, an denen die Säulen 22 ausgebildet werden sollen (in der gezeigten schematischen Darstellung lediglich vier Säulen).In 5 (a) to 5 (d) is an advantageous process for making the force sensor 24 shown schematically. 5 (a) shows a substrate 26th , from which a force sensor 24 is to be made, and its surface with a photo mask 64 is coated. Using an electron beam 66 the areas are determined by electron beam or optical lithography 68 exposed on which the pillars 22nd are to be formed (only four columns in the schematic illustration shown).

Die Fotomaske wird an den belichteten Stellen 68 entwickelt, so dass er an diesen Stellen 68 unter Verwendung eines Lösungsmittels entfernt werden kann (siehe 5 (b)). Als Fotomaske kann beispielsweise Polymethylmetacrylat verwendet werden.The photo mask is in the exposed areas 68 designed so that he is in these places 68 can be removed using a solvent (see 5 (b) ). Polymethyl methacrylate, for example, can be used as the photomask.

Im Schritt von 5 (b) ist die strukturierte Fotomaske 64 in gewisser Weise das Negativ der erwünschten Struktur. In einer Ultrahochvakuumkammer wird Metall aufgedampft, beispielsweise Nickel. Die Metallschicht liegt nur an den zuvor belichteten Stellen 68 unmittelbar auf dem Substrat 26 auf und bedeckt im übrigen den verbleibenden Teil der Fotomaske 64. Dann wird die Fotomaske 64 entfernt, so dass nur noch die Metallmaske auf dem Substrat 26 verbleibt, die die Bereiche 68, an dem die Säulen 22 ausgebildet werden sollen, vor Erosion schützt.In step of 5 (b) is the patterned photo mask 64 in a way the negative of the desired structure. Metal, for example nickel, is vapor-deposited in an ultra-high vacuum chamber. The metal layer is only on the previously exposed areas 68 directly on the substrate 26th and otherwise covers the remaining part of the photomask 64 . Then the photo mask 64 removed, leaving only the metal mask on the substrate 26th remains that the areas 68 on which the pillars 22nd should be trained, protects against erosion.

Schließlich wird das Substrat 26 durch ein Plasma-Ätzverfahren geätzt, so dass das Material dort, wo es nicht durch die Metallmaske geschützt ist, chemisch mit dem Plasma reagiert. Ferner wird das Plasma in der Darstellung von 5 (d) nach unten beschleunigt, um eine Ätzrichtung vorzugeben. Als vorteilhaft hat sich die Verwendung eines SiCl₄/Ar-Plasmas erwiesen.Finally the substrate becomes 26th etched by a plasma etching process so that the material reacts chemically with the plasma where it is not protected by the metal mask. Furthermore, the plasma is shown in the illustration of 5 (d) accelerated downwards to specify an etching direction. The use of a SiCl ₄ / Ar plasma has proven to be advantageous.

Insbesondere können durch geeignete Steuerung des Ätzvorgangs die oben beschriebenen konisch unterschnittenen Strukturen geätzt werden.In particular, the above-described conically undercut structures can be etched by suitable control of the etching process.

Der besondere Vorteil von Elektronenstrahl-Lithographie besteht darin, dass eine weitaus höhere Auflösung erzielt werden kann als beispielsweise mit optischer Lithographie, deren Auflösung durch die Wellenlänge des verwendeten Lichtes begrenzt ist. Die Elektronen-Lithographie erlaubt eine Auflösung in der Größenordnung von 30 nm (jedoch ca. 5 nm Genauigkeit), so dass äußerst präzise Nanostrukturen herstellbar werden. Jedoch ist dies nicht die Auflösungsbeschränkung, da die Unterkehligkeit die Struktur weiter verkleinert, ie Elektronenstrahl-Lithographie erhöht die Reproduzierbarkeit der Radien.The particular advantage of electron beam lithography is that a much higher resolution can be achieved than, for example, with optical lithography, the resolution of which is limited by the wavelength of the light used. Electron lithography allows a resolution of the order of 30 nm (but approx. 5 nm accuracy), so that extremely precise nanostructures can be produced. However, this is not the resolution limitation, as the sub-throatiness further reduces the size of the structure, ie electron beam lithography increases the reproducibility of the radii.

Anstelle der Elektronenstrahl-Lithographie kann aber auch die sogenannte Nanoimprintmethode verwendet werden.Instead of electron beam lithography, the so-called nanoimprint method can also be used.

Ein besonderer Vorteil des im Zusammenhang mit 5 (a) - (d) beschriebenen Herstellungsverfahrens besteht darin, dass unterschiedlichen Kraftsensoren ohne wesentlichen zusätzlichen apparativen Aufwand hergestellt werden können. Anordnung, Anzahl und Durchmesser der Säulen 22 werden durch das Elektronen-Lithographie-Programm vorgegeben, die Länge der Säulen durch die Ätztiefe. Somit können für eine Vielzahl von Anwendungen speziell geeignete Kraftsensoren hergestellt werden, die beispielsweise auf die verwendeten Zelltypen und die zugrundeliegenden biologischen und medizinischen Fragestellungen abgestimmt sind.A particular benefit of the 5 (a) - (d) described manufacturing method consists in the fact that different force sensors can be manufactured without significant additional equipment expenditure. Arrangement, number and diameter of the columns 22nd are specified by the electron lithography program, the length of the pillars by the etching depth. In this way, specially suitable force sensors can be produced for a large number of applications, which are, for example, tailored to the cell types used and the underlying biological and medical issues.

Die gezeigten und beschriebenen Merkmale können in beliebiger Kombination von Bedeutung sein.The features shown and described can be important in any combination.

BezugszeichenlisteList of reference symbols

1010: Zellecell
1212th: extrazelluläre Matrixextracellular matrix
1414th: ZellkernCell nucleus
1616: MikrotubuliMicrotubules
1818th: Aktin-KortexActin cortex
2020th: NanostrukturenNanostructures
2222nd: säulenförmiges Elementcolumnar element
22a22a: unteres Ende des säulenförmiges Elements 22 lower end of the columnar element 22nd
22b22b: oberes Ende des säulenförmiges Elements 22 upper end of the columnar element 22nd
22c22c: Stirnfläche am oberen Ende 22b des säulenförmiges Elements 22 Face at the top 22b of the columnar element 22nd
2424: KraftsensorForce sensor
2626th: SubstratSubstrate
2828: Einhüllende einer Oszillationsbewegung einer Säule 22 Envelope of an oscillating movement of a column 22nd
3030th: Aufnahme für Kraftsensor 24 Support for force sensor 24
3232: TeflonrahmenTeflon frame
3434: Abdeckungcover
3636: AbstandshalterSpacers
3838: Objektivlens
4040: ImmersionsölImmersion oil
4242: QuecksilberdampflampeMercury vapor lamp
4444: Anregungslicht-FilterExcitation light filter
4646: dichroischer Spiegeldichroic mirror
4848: TubuslinseTube lens
5050: Blendecover
5252: KollimatorlinseCollimator lens
5454: dichroischer Spiegeldichroic mirror
5656: EmissionsfilterEmission filter
5858: AbbildungslinseImaging lens
6060: BildsensorImage sensor
6262: Filterfilter
6464: FotomaskePhoto mask
6868: entwickelte Stellen der Fotomaske 64 developed areas of the photo mask 64

Claims

A force sensor (24) for use on living cells (10) or small animals, comprising: a plurality of columnar elements (12) each of which has a lower end (22a) attached to a substrate (26) and an upper, free end (22b), wherein the columnar elements (22) and the substrate (26) are made of a solid material, the column cross-section at the upper end (22b) is larger than at the lower end (22a), and the diameter at the lower end (22a) is smaller than 500 nm.

Force sensor (24) Claim 1 , in which the diameter at the lower end (22a) of the columnar elements (22) is less than 200 nm, preferably less than 100 nm.

Force sensor (24) Claim 1 or 2 , in which the columnar elements (22) have the shape of a truncated cone standing on the narrow end, the half opening angle of which, defined as the angle between the cone axis and the surface line, is 0.5 ° to 7 °, preferably 1 ° to 3 °.

Force sensor (24) according to one of the preceding claims, in which the following applies to the spring constant k of the columnar elements (22):

k = \frac{F}{Δ x} \leq 10 m N / m, preferably \leq 1 m N / m,

wherein Δx is the deflection of the upper end of the columnar elements (22) in the horizontal direction and F is a horizontal force which acts on the upper end (22b) of the columnar elements (22).

Force sensor (24) according to one of the preceding claims, in which the solid material is crystalline, polycrystalline or amorphous, and in particular is formed by a metal or a semiconductor material.

Force sensor (24) according to one of the preceding claims, in which the solid material is GaAs, Si, SiN or SiO ₂ .

Force sensor (24) according to one of the preceding claims, in which the solid body material has piezoelectric properties.

Force sensor (24) according to one of the preceding claims, in which the solid material is biocompatible or the surface of the force sensor (24) to be exposed to the cells is at least partially treated or coated in order to produce biocompatibility.

Force sensor (24) according to one of the preceding claims, in which the length of the columnar elements (22) is between 3 µm and 15 µm, preferably between 4 µm and 12 µm and particularly preferably between 4 µm and 10 µm.

Force sensor (24) according to one of the preceding claims, in which the columnar elements (22) are arranged in a rectangular or hexagonal lattice structure on the substrate (26), the difference between the lattice constant of the lattice and the cross section of the columnar elements (22) am lower end (22a) is preferably between 1 µm and 10 µm.

Force sensor (24) according to one of the preceding claims, wherein the number of columnar elements (22) is at least 25, preferably at least 100 and particularly preferably at least 1000.

Force sensor (24) according to one of the preceding claims, in which cells (10) are located on the upper ends (22c) of the columnar elements (22) or in the spaces between columnar elements (22), wherein the ratio of column height and mean cell diameter is 0.75 to 2.0, preferably 0.8 to 1.5, and / or - The difference between the lattice constant of the lattice and the cross section of the columnar elements (22) at the lower end (22a) is 0.4 to 2.0 times, preferably 0.5 to 1.5 times the mean cell diameter .

Method for producing a force sensor (24) according to one of the Claims 1 to 12th of a solid material substrate (26), in which the spaces between the columnar elements (22) to be formed are etched into the substrate (26), in particular in a plasma etching process.

Procedure according to Claim 13 , in which - a photo mask (64) is applied to the substrate (26), - the photo mask (64) is exposed by electron beam lithography in accordance with the structure of the upper ends (22c) of the columnar elements (22) to be produced and then developed, to structure the photomask (64), - the areas (68) of the substrate which correspond to the upper ends (22c) of the columnar elements (22) to be formed are covered with a mask, in particular a metal mask, and - the plasma etching process is carried out so that downwardly tapering columnar elements (22) are formed.

Use of a force sensor (24) according to one of the Claims 1 to 12th for measuring cell forces, the distance between the columnar elements (22) being sufficiently large that the cells can be at least partially in the spaces between the columnar elements (22).

Using a force sensor (24) Claim 15 , in which the deflection of the columnar elements (22) from their rest positions and the movement of the cells (10) are observed with the aid of an optical microscope.

Using a force sensor (24) Claim 16 , in which at least two focussing planes of the microscope are used, of which an upper plane corresponds to the plane in which the upper ends (22c) of the columnar elements (22) lie, and a lower focussing plane lies between the upper plane and the substrate (26 ) to allow imaging of cells located between the columnar elements (22).

Using a force sensor (24) Claim 16 or 17th , in which the current deflection of the columnar elements (22) is determined by light which is reflected from the upper ends (22c) of the columnar elements (22), and the position and / or configuration of the cells (10) is determined by fluorescent light .

Using a force sensor (24) Claim 18 in which light is irradiated, part of which is reflected by the upper ends (22c) of the columnar members (22) and another part is used to excite fluorescence.

Use of a force sensor (24) according to one of the Claims 16 to 19th , in which the location at which a cell (10) exerts a force on a columnar element (22) is determined by varying the focal plane in the longitudinal direction of the columnar element (22) and internal processes of the cell, in particular actin polymerization, to be watched.

Use of a force sensor (24) according to one of the Claims 16 to 20th using a spinning disc confocal microscope.