DE102011006080A1 - Nozzle of flow cytometer for fractionation of spermatozoa of e.g. bull, has inner flow channel with outlet cross-section that is reduced more in its first dimension compared with first dimension of inlet cross-section of channel - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fraktionierung von Säugerspermatozoen und die Verwendung einer Vorrichtung für dieses Verfahren, wobei sich die Vorrichtung durch die Verwendung einer Düse auszeichnet, die eine Ausrichtung von Säugerspermatozoen in einem Flüssigkeitsstrom erlaubt. Im Sinne der Erfindung sind Säugerspermatozoen ausschließlich nicht-menschliche Säugerspermatozoen. Das Verfahren zur Fraktionierung unter Verwendung der Düse umfasst die Erzeugung eines die Säugerspermatozoen enthaltenden Kernstroms innerhalb eines Hüllstroms, wodurch im Verfahren die Säugerspermatozoen innerhalb des Kernstroms einheitlich ausgerichtet werden, während der einheitlichen Ausrichtung mit optischer Strahlung bestrahlt werden, wobei abgegebene Strahlung detektiert wird. Entsprechend betrifft die Erfindung die Verwendung der Düse in einem Verfahren zur Ausrichtung von Säugerspermatozoen und Sortierung der Säugerspermatozoen in der Abhängigkeit von einer Eigenschaft, die im Anschluss an den Durchtritt der Partikel durch die Düse detektiert wird. Dabei ist die Sortierung vorzugsweise das Ablenken von Abschnitten des Flüssigkeitsstroms, insbesondere von Tropfen, die aus dem Flüssigkeitsstrom gebildet sind, in zumindest zwei Fraktionen. In dieser Ausführungsform betrifft die Erfindung die Herstellung einer Fraktion von Säugerspermatozoen durch Ausrichtung der Säugerspermatozoen in einem Flüssigkeitsstrom unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung.The present invention relates to a method for fractionating mammalian spermatozoa and to the use of a device for this method, the device being characterized by the use of a nozzle which allows alignment of mammalian spermatozoa in a fluid flow. For the purposes of the invention mammalian spermatozoa are exclusively non-human mammalian spermatozoa. The method of fractionating using the nozzle involves generating a mammalian spermatozoa-containing core stream within a sheath stream whereby, in the method, the mammalian spermatozoa are uniformly aligned within the core stream while irradiating optical radiation with the uniform orientation, whereby emitted radiation is detected. Accordingly, the invention relates to the use of the nozzle in a method for aligning mammalian spermatozoa and sorting the mammalian spermatozoa in dependence on a property detected following the passage of the particles through the nozzle. The sorting is preferably the deflection of portions of the liquid stream, in particular of drops, which are formed from the liquid stream, in at least two fractions. In this embodiment, the invention relates to the production of a fraction of mammalian spermatozoa by aligning mammalian spermatozoa in a fluid stream using the device of the invention.
Die Säugerspermatozoen, die mit dem Verfahren ausgerichtet und optional in Fraktionen sortiert werden, sind von insgesamt flacher Gestalt, und sind beispielsweise zu einer Schnittebene symmetrisch, sodass die Säugerspermatozoen senkrecht zu ihrer Längsachse einen Querschnitt mit einer ersten und einer zweiten Dimension aufweisen, wobei der Querschnitt in der ersten Dimension kleiner ist als in der zweiten Dimension. Bevorzugte nicht-menschliche Säugerspermatozoen bzw. Säugetierspermien sind solche, die von einem männlichen Rind, Schwein, Schaf, Elefanten, Kamel, Ziege, Hund, Katze, Katzenarten, Büffel oder Pferd gewonnen sind.The mammalian spermatozoa, which are aligned with the process and optionally sorted into fractions, are of generally flat shape and are symmetrical, for example, to a sectional plane such that the mammalian spermatozoa have a cross section with a first and a second dimension perpendicular to their longitudinal axis, the cross section smaller in the first dimension than in the second dimension. Preferred non-human mammalian spermatozoa are those derived from a male, pork, sheep, elephant, camel, goat, dog, cat, cat, buffalo or horse.
Stand der TechnikState of the art
Die
Die
Die
Aufgabe der ErfindungObject of the invention
Gegenüber dem Stand der Technik liegt die Aufgabe der Erfindung darin, eine alternative eine Vorrichtung mit einer Düse zur Ausrichtung von Säugerspermatozoen in einem Flüssigkeitsstrom und ein Verfahren zu deren Ausrichtung im Flüssigkeitsstrom bereitzustellen.Compared to the prior art, the object of the invention is to provide an alternative device with a nozzle for aligning mammalian spermatozoa in a liquid flow and a method for their alignment in the liquid flow.
Allgemeine Beschreibung der ErfindungGeneral description of the invention
Die Erfindung löst die Aufgabe mit den Merkmalen der Ansprüche, und insbesondere durch ein Verfahren unter Verwendung einer Düse, in deren Innenvolumen eine Zuleitung kreisförmigen Innenquerschnitts für eine Hüllstromflüssigkeit in einer ersten Einlauföffnung mündet, und eine Zuleitung für eine Säugerspermatozoen enthaltende Kernstromflüssigkeit in einer zweiten Einlauföffnung mündet, wobei die Düse angrenzend an ihre Auslassöffnung einen sich verjüngenden Abschnitt aufweist, und die Düse zwischen der zweiten Einlauföffnung für die Kernstromflüssigkeit und dem sich verjüngenden Abschnitt einen inneren Strömungskanal aufweist. Der innere Strömungskanal ist z. B. von zumindest einem Träger in einem Abstand zur Innenwandung der Düse gehalten oder ist mit der zweiten Einlauföffnung verbunden oder an dieser zweiten Einlauföffnung befestigt, die von der Zuleitung kreisförmigen Innenquerschnitts aufgespannt ist.The invention achieves the object with the features of the claims, and in particular by a method using a nozzle, in whose inner volume a feed line of circular inner cross section for a sheath flow liquid opens in a first inlet opening, and a feed line for mammalian spermatozoa containing core flow liquid opens in a second inlet opening wherein the nozzle has a tapered portion adjacent to its outlet port, and the nozzle has an inner flow passage between the second core flow fluid inlet port and the tapered portion. The inner flow channel is z. B. is held by at least one carrier at a distance from the inner wall of the nozzle or is connected to the second inlet opening or attached to this second inlet opening, which is spanned by the inlet circular inner cross-section.
Der innere Strömungskanal weist einen Eintrittsabschnitt auf, der der zweiten Einlauföffnung für Kernstromflüssigkeit zugewandt ist, und einen gegenüberliegenden Austrittsabschnitt, der dem an die Auslassöffnung der Düse angrenzenden sich verjüngenden Abschnitt zugewandt ist. Die Auslassöffnung der Düse ist vorzugsweise kreisförmig. Der Eintrittsabschnitt spannt einen Eintrittsquerschnitt auf, der sich über die Länge des Strömungskanals zu dem vom Austrittsabschnitt aufgespannten Austrittsquerschnitt in einer Dimension senkrecht zur Längsachse des Strömungskanals stärker verjüngt als in der senkrecht zur Längsachse stehenden zweiten Dimension. Dadurch, dass der Austrittsabschnitt des Strömungskanals einen Austrittsquerschnitt aufspannt, der in einer ersten Dimension senkrecht zur Längsachse des Strömungskanals gegenüber dem Eintrittsquerschnitt stärker verjüngt ist, als er in seiner zweiten Dimension gegenüber der zweiten Dimension des Eintrittsquerschnitts verjüngt ist, bildet der Strömungskanal aus dem Eintrittsquerschnitt einen schmaleren Austrittsquerschnitt. Dabei kann der Austrittsquerschnitt betragsmäßig eine größere Fläche, eine gleich große Fläche oder eine kleinere Fläche aufspannen, als der Eintrittsquerschnitt. Bevorzugt ist der Betrag der Fläche des Austrittsquerschnitts gleich dem Betrag der Fläche des Eintrittsquerschnitts, sodass in den Eintrittsabschnitt eintretende Flüssigkeit mit derselben Geschwindigkeit am Austrittsquerschnitt aus dem Strömungskanal austritt, während eine Zunahme des Betrags der Fläche des Austrittsquerschnitts gegenüber dem Eintrittsquerschnitt zu einer Reduzierung der Strömungsgeschwindigkeit durch den Strömungskanal führt und eine Verringerung des Betrags der Fläche des Austrittsquerschnitts gegenüber dem Eintrittsquerschnitt zu einer Beschleunigung der Flüssigkeit durch den Strömungskanal.The inner flow channel has an inlet portion facing the second core liquid flow inlet port and an opposite outlet portion facing the Outlet opening of the nozzle is adjacent to facing tapered portion. The outlet opening of the nozzle is preferably circular. The inlet section biases an inlet cross-section, which tapers more strongly over the length of the flow channel to the outlet cross-section defined by the outlet section in a dimension perpendicular to the longitudinal axis of the flow channel than in the second dimension perpendicular to the longitudinal axis. Characterized in that the outlet portion of the flow channel spans an outlet cross section, which is tapered in a first dimension perpendicular to the longitudinal axis of the flow channel relative to the inlet cross section, as it is tapered in its second dimension relative to the second dimension of the inlet cross section, the flow channel from the inlet cross section forms a narrower outlet cross-section. In terms of amount, the outlet cross section can span a larger area, an equal area or a smaller area than the inlet cross section. Preferably, the amount of the area of the outlet cross section is equal to the amount of the area of the inlet cross section, so that liquid entering the inlet section exits the flow channel at the same speed at the outlet cross section, while an increase in the amount of the area of the outlet cross section relative to the inlet cross section leads to a reduction in the flow velocity through leading the flow channel and a reduction in the amount of the area of the outlet cross section with respect to the inlet cross-section to an acceleration of the liquid through the flow channel.
In Ausführungsformen mit Beabstandung der zweiten Einlauföffnung für Kernstromflüssigkeit vom Eintrittsabschnitt des Strömungskanals kann Hüllstromflüssigkeit in einem an den Kernstrom angrenzenden Bereich durch den Eintrittsabschnitt des Strömungskanals eintreten, insbesondere in der bevorzugten Ausführungsform, in der die zweite Einlauföffnung für Kernstromflüssigkeit koaxial zum Strömungskanal angeordnet ist. Besonders bevorzugt weist die zweite Einlauföffnung einen Querschnitt auf, der gleich ist mit dem Eintrittsquerschnitt oder kleiner ist als der Eintrittsquerschnitt des Strömungskanals.In embodiments with spacing of the second core flow inlet port from the inlet section of the flow channel, sheath flow fluid may enter the flow passage in an area adjacent the core flow, particularly in the preferred embodiment where the second core flow inlet port is coaxial with the flow channel. Particularly preferably, the second inlet opening has a cross section which is equal to the inlet cross section or smaller than the inlet cross section of the flow channel.
In Ausführungsformen, bei denen der Eintrittsabschnitt des Strömungskanals unmittelbar an die zweite Einlauföffnung runden Querschnitts angrenzt, die von der Zuleitung für eine Hüllstromflüssigkeit aufgespannt ist, kann Kernstromflüssigkeit vor Eintritt in die Hüllstromflüssigkeit zu einem Flüssigkeitsstrom mit einem Querschnitt geformt werden, der gleich dem Austrittsquerschnitt des inneren Strömungskanals ist.In embodiments where the inlet portion of the flow channel immediately adjacent to the second inlet opening of round cross-section, which is spanned by the conduit for a sheath flow liquid, core flow liquid can be formed before entering the sheath flow liquid into a liquid flow having a cross section which is equal to the outlet cross section of the inner Flow channel is.
Der Strömungskanal kann optional zwischen seinem Eintrittsquerschnitt und seinem Austrittsquerschnitt einen Zwischenquerschnitt aufweisen, der eine gleich große Fläche wie der Eintrittsquerschnitt aufspannt, oder der eine kleinere Fläche aufspannt, als der Eintrittsquerschnitt und/oder als der Austrittsquerschnitt. Der Zwischenquerschnitt ist z. B. bei 1/5 bis 1/2 des Abstands zwischen Eintrittsquerschnitt und Austrittsquerschnitt, gemessen vom Eintrittsquerschnitt angeordnet. Der Zwischenquerschnitt bildet vorzugsweise den Übergang zwischen dem Eintrittsquerschnitt und dem Austrittsquerschnitt, wobei z. B. im Zwischenquerschnitt ein an den Eintrittsabschnitt angrenzender Bereich mit Eintrittsquerschnitt und ein an den Austrittsabschnitt angrenzender Bereich mit dem Austrittsquerschnitt in einem gemeinsamen Zwischenquerschnitt aufeinander treffen und insbesondere einen stufenfreien Übergang bilden.The flow channel can optionally have an intermediate cross section between its inlet cross section and its outlet cross section, which spans an area of the same size as the inlet cross section, or which spans a smaller area than the inlet cross section and / or as the outlet cross section. The intermediate cross section is z. B. at 1/5 to 1/2 of the distance between inlet cross section and outlet cross section, measured from the inlet cross section. The intermediate cross section preferably forms the transition between the inlet cross section and the outlet cross section, wherein z. B. in the intermediate cross-section adjacent to the inlet portion with inlet cross section and an area adjacent to the outlet portion with the outlet cross-section meet in a common intermediate cross-section and in particular form a stepless transition.
In einer Ausführungsform ist der Eintrittsquerschnitt kreisförmig und der Austrittsquerschnitt gestreckt, beispielsweise in Form einer Ellipse oder in Form zweier paralleler beabstandeter Flächenabschnitte, die durch zwei schmalseitige Flächenabschnitte begrenzt werden. Alternativ kann der Eintrittsquerschnitt in einer Dimension senkrecht zur Längsachse des Strömungskanals gestreckt sein, beispielsweise entlang der ersten oder zweiten Dimension ellipsenförmig oder rechteckig sein, wobei der Austrittsquerschnitt in seiner ersten Dimension verringert ist.In one embodiment, the inlet cross-section is circular and the outlet cross-section is stretched, for example in the form of an ellipse or in the form of two parallel spaced-apart surface sections bounded by two narrow-sided surface sections. Alternatively, the inlet cross-section may be elongated in a dimension perpendicular to the longitudinal axis of the flow channel, for example ellipsoidal or rectangular along the first or second dimension, the outlet cross-section being reduced in its first dimension.
Vorzugsweise ist der Strömungskanal von rotationssymmetrisch zur Längsachse angeordneten Trägern in der Düse gehalten, beispielsweise durch zwei, drei oder vier rotationssymmetrisch angeordnete Träger, die sich zwischen dem Strömungskanal und der Innenwandung der Düse erstrecken. Träger haben vorzugsweise einen zur Längsachse des Strömungskanals und/oder zur Längsachse der Düse symmetrischen Querschnitt. Träger können z. B. radial zur Längsachse des Strömungskanals und/oder radial zur Längsachse der Düse angeordnete plattenförmige Elemente oder Stege mit tropfenförmigem Querschnitt sein, dessen stumpfes Ende im Eintrittsabschnitt angeordnet ist, und dessen spitzes Ende dem Austrittsquerschnitt zugewandt ist.Preferably, the flow channel is held in the nozzle by carriers arranged rotationally symmetrically with respect to the longitudinal axis, for example by two, three or four rotationally symmetrically arranged carriers which extend between the flow channel and the inner wall of the nozzle. Carriers preferably have a symmetrical to the longitudinal axis of the flow channel and / or to the longitudinal axis of the nozzle cross-section. Carriers can, for. B. radially to the longitudinal axis of the flow channel and / or radially to the longitudinal axis of the nozzle arranged plate-shaped elements or webs with teardrop-shaped cross-section, the blunt end is arranged in the inlet portion, and whose pointed end faces the outlet cross-section.
Die Außenfläche des Strömungskanals hat vorzugsweise das gleiche Profil wie der Strömungskanal und ist besonders bevorzugt durch eine über den Umfang und/oder über die Längsachse des Strömungskanals konstante Wandstärke von der Innenfläche des Strömungskanals beabstandet.The outer surface of the flow channel preferably has the same profile as the flow channel and is particularly preferably spaced from the inner surface of the flow channel by a wall thickness which is constant over the circumference and / or over the longitudinal axis of the flow channel.
In einer Ausführungsform ist das Verhältnis der Größe der Querschnittsfläche zwischen Innenwandung der Düse und der Außenwandung des Strömungskanals im axialen Abschnitt des Eintrittsquerschnitts zur Größe der Querschnittsfläche zwischen Innenwandung der Düse und der Außenwandung des Strömungskanals im axialen Abschnitt des Austrittsquerschnitts gleich dem Verhältnis der Größen von Eintrittsquerschnitt zu Austrittsquerschnitt, sodass die durchströmten Querschnitte am Eintrittsabschnitt und Austrittsabschnitt innerhalb des Strömungskanals und zwischen Strömungskanal und innerer Düsenwandung sich im gleichen Verhältnis ändern. In dieser Ausführungsform wird beim Verfahren die Strömung von Flüssigkeit längs der Längsachse der Düse um den Strömungskanal in gleichem Maße beschleunigt bzw. bleibt konstant, wie die Strömung von Flüssigkeit durch den Strömungskanal beschleunigt wird bzw. konstant bleibt.In one embodiment, the ratio of the size of the cross-sectional area between the inner wall of the nozzle and the outer wall of the flow channel in the axial section of the inlet cross-section to the size of the cross-sectional area between the inner wall of the nozzle and the outer wall of the flow channel in the axial portion of the Outlet cross-section equal to the ratio of the sizes of inlet cross-section to outlet cross-section, so that the flow-through cross sections at the inlet section and outlet section within the flow channel and between the flow channel and inner nozzle wall change in the same ratio. In this embodiment, in the method, the flow of liquid along the longitudinal axis of the nozzle about the flow channel is accelerated to the same extent or remains constant, as the flow of liquid through the flow channel is accelerated or remains constant.
In einer weiteren Ausführungsform läuft die Düse in dem axialen Abschnitt, über den sich der Strömungskanal erstreckt, kegelstumpfförmig auf die Auslassöffnung zu, während der Betrag des Eintrittsquerschnitts und der Betrag des Austrittsquerschnitts des Strömungskanals etwa gleich groß sind. Dadurch wird die Flüssigkeitsströmung außerhalb des Strömungskanals, insbesondere aus Hüllstromflüssigkeit, gegenüber dem durch den Strömungskanal tretenden Flüssigkeitsstrom beschleunigt, der insbesondere aus der Kernstromflüssigkeit mit einem Anteil Hüllstromflüssigkeit besteht. Die Beschleunigung der um den Strömungskanal tretenden Hüllstromflüssigkeit gegenüber dem Kernstrom verstärkt die Vereinzelung von Partikeln entlang der Längsachse der Düse.In a further embodiment, the nozzle in the axial section, over which the flow channel extends, frusto-conically toward the outlet opening, while the amount of the inlet cross section and the amount of the outlet cross section of the flow channel are approximately equal. As a result, the liquid flow outside the flow channel, in particular from the sheath flow liquid, is accelerated in relation to the liquid flow passing through the flow channel, which consists in particular of the core flow liquid with a proportion of sheath flow liquid. The acceleration of the sheath flow liquid passing around the flow channel with respect to the core flow enhances the separation of particles along the longitudinal axis of the nozzle.
Bevorzugt weist die Düse einen Schwingungserzeuger, z. B. ein Piezoelement auf, der senkrecht zur Längsachse der Düse verlaufende Druckwellen erzeugt, um bei Anordnung der Auslaßöffnung der Düse in einem gasgefüllten Raum einen Tropfenstrom zu erzeugen.Preferably, the nozzle has a vibrator, z. As a piezoelectric element which generates perpendicular to the longitudinal axis of the nozzle extending pressure waves to produce a drop stream when the outlet opening of the nozzle in a gas-filled space.
Die erfindungsgemäß verwendete Düse kann in einem Durchflusszytometer verwendet werden, das zumindest eine erste Strahlungsquelle aufweist, die auf einen ersten Abschnitt des aus der Düse austretenden Flüssigkeitsstroms gerichtet ist, z. B. einen Laser, und einen gegenüber der Strahlungsquelle auf den ersten Abschnitt des Flüssigkeitsstroms gerichteten ersten Detektor, wobei optional der Detektor ein Signal erzeugt, das eine Auslenkungseinrichtung ansteuert, um Abschnitte des Flüssigkeitsstroms in Abhängigkeit von der Detektion mittels des Signals abzulenken, z. B. zu fraktionieren. Optional weist die im Verfahren verwendete Vorrichtung eine zweite Strahlungsquelle auf, die z. B. auf einen zweiten Abschnitt des Flüssigkeitsstroms zwischen der ersten Strahlungsquelle und der Düse gerichtet ist, und einen zweiten Detektor, der auf diesen zweiten Abschnitt gerichtet ist. Bevorzugt erzeugt der zweite Detektor ein zweites Signal, das die Auslenkungseinrichtung steuert, so dass Abschnitte des Flüssigkeitsstroms zusätzlich in Abhängigkeit von dem zweiten Signal ausgelenkt werden.The nozzle used in the invention can be used in a flow cytometer having at least one first radiation source directed to a first portion of the liquid flow exiting the nozzle, e.g. A laser, and a first detector directed toward the first portion of the liquid stream with respect to the radiation source, optionally with the detector generating a signal which drives deflection means to deflect portions of the liquid flow in response to detection by the signal, e.g. B. to fractionate. Optionally, the apparatus used in the method has a second radiation source, which, for. B. is directed to a second portion of the liquid flow between the first radiation source and the nozzle, and a second detector which is directed to this second portion. Preferably, the second detector generates a second signal that controls the deflection device so that portions of the fluid flow are additionally deflected in response to the second signal.
Die Auslenkungseinrichtung kann ein Paar elektrisch entgegengesetzt geladener Platten sein, die beidseitig des Flüssigkeitsstroms angeordnet sind, und ein elektrostatisches Feld ausbilden. Dazu ist die Halterung der Düse mit einem elektrischen Kontakt versehen, über den der Flüssigkeitsstrom mit einem elektrischen Impuls beaufschlagt werden kann. Die Ladung, positiv oder negativ, des Impulses ist von einem ersten und/oder zweiten Signal abhängig, das für einen Abschnitt des Flüssigkeitsstroms bzw. für ein Säugerspermatozoon detektiert wird. Nachdem der letzte Abschnitt bzw. Tropfen des Flüssigkeitsstroms, der bevozugt diskontinuierlich ist, geladen wird, reißt er ab und passiert die Auslenkungseinrichtung. Alternativ kann die Auslenkungseinrichtung ein auf den Flüssigkeitsstrom gerichteter Laser sein, der auf den Flüssigkeitsstrom gerichtet ist und eingerichtet ist, den Flüssigkeitsstrom nur oberflächlich bis zur oberflächlichen Verdampfung des Flüssigkeitsstroms zu verdampfen, wie dies z. B. in der
Das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung der Düse bzw. unter Verwendung eines Durchflusszytometers mit der Düse, weist die folgenden Schritte auf:
- – Bereitstellen einer Säugerspermatozoen enthaltenden Kernstromflüssigkeit,
- – Bereitstellen einer Hüllstromflüssigkeit,
- – Pumpen der Hüllstromflüssigkeit durch eine erste Einlauföffnung einer Düse,
- – Pumpen der Säugerspermatozoen enthaltenden Kernstromflüssigkeit durch eine zweite Einlauföffnung der Düse, wobei die zweite Einlauföffnung einen kreisförmigen Querschnitt aufweist und unmittelbar an den Eintrittsquerschnitt des Strömungskanals angrenzt und/oder die zweite Einlauföffnung einen kreisförmigen Querschnitt aufweist und in einem Abstand zu einem Eintrittsquerschnitt eines in der Düse gehaltenen Strömungskanals angeordnet ist,
- – Durchströmen der Düse von Hüllstromflüssigkeit und Kernstromflüssigkeit, wobei die Kernstromflüssigkeit beim Durchtritt durch den Strömungskanal von einem Eintrittsquerschnitt mit einer sich senkrecht zur Längsachse des Strömungskanals erstreckenden ersten Dimension und einer zweiten Dimension und einen Austrittsquerschnitt mit einer sich senkrecht zur Längsachse des Strömungskanals erstreckenden ersten Dimension und einer zweiten Dimension, wobei der Austrittsquerschnitt in seiner ersten Dimension starker gegenüber der ersten Dimension des Eintrittsquerschnitts verkleinert ist als in seiner zweiten Dimension gegenüber der zweiten Dimension des Eintrittsquerschnitts, wodurch die Kernstromflüssigkeit einen gestreckten Querschnitt erhält,
- – Durchströmen eines sich verjüngenden Düsenabschnitts zwischen dem Strömungskanal und der Auslassöffnung, wodurch der Querschnitt von Hüllstromflüssigkeit und Kernstromflüssigkeit verringert wird, und
- – Austreten der von einer Hüllstromflüssigkeit umgebenen Kernstromflüssigkeit durch die Auslassöffnung der Düse.
- – Optional enthält das Verfahren den Schritt des Detektierens einer Eigenschaft der Säugerspermatozoen und,
- – weiter optional, den Schritt des Behandelns (z. B. durch Laserbestrahlung) und/oder des Ablenkens der Säugerspermatozoen in getrennte Fraktionen bzw. Behälter in Abhängigkeit von einer detektierten Eigenschaft.
- Providing a mammalian spermatozoa-containing core-flow fluid,
- Providing a sheath flow fluid,
- Pumping the sheath flow fluid through a first inlet opening of a nozzle,
- Pumping the mammalian spermatozoa-containing core flow fluid through a second inlet opening of the nozzle, wherein the second inlet opening has a circular cross-section and immediately adjacent to the inlet cross-section of the flow channel and / or the second inlet opening has a circular cross-section and at a distance from an inlet cross-section of one in the nozzle arranged flow channel is arranged
- Flow through the nozzle of sheath flow fluid and core flow fluid, the core flow fluid passing through the flow passage of an inlet cross section with a first dimension extending perpendicular to the longitudinal axis of the flow channel and a second dimension and an outlet cross section with a first dimension extending perpendicular to the longitudinal axis of the flow channel and a second dimension, wherein the Outlet cross-section is reduced in its first dimension more strongly compared to the first dimension of the inlet cross-section than in its second dimension relative to the second dimension of the inlet cross section, whereby the core flow liquid receives a stretched cross-section,
- Flowing through a tapered nozzle section between the flow channel and the outlet opening, whereby the cross section of sheath flow liquid and core flow liquid is reduced, and
- - Exiting the core flow liquid surrounded by an envelope flow liquid through the outlet opening of the nozzle.
- Optionally, the method includes the step of detecting a property of mammalian spermatozoa and,
- Optionally further, the step of treating (eg by laser irradiation) and / or deflecting the mammalian spermatozoa into separate fractions or containers in response to a detected property.
Insbesondere bevorzugt ist ein Verfahren zur Herstellung geschlechtschromosomenspezifisch sortierter bzw. Fraktionen nicht-menschlicher Säugerspermatozoen unter Verwendung der Düse.Especially preferred is a method of producing sex chromosome-specific sorted or fractions of non-human mammalian spermatozoa using the nozzle.
Die erfindungsgemäß verwendete Düse erzeugt durch den in ihrem Innenvolumen angeordneten Strömungskanal einen Kernstrom mit gestrecktem Querschnitt, in welchem die Säugerspermatozoen effizient ausgerichtet sind, bzw. in welchem die Säugerspermatozoen effizient ausgerichtet werden, insbesondere mit ihrer Längsachse parallel zur Längsachse des Flüssigkeitsstroms bzw. parallel zur Längsachse der Düse und parallel zur Längsachse des Strömungskanals, und mit ihren Schmalseiten parallel zu den Schmalseiten der Kernstromflüssigkeit. Für Säugerspermatozoen, deren Querschnitt in einer zur Längsachse senkrechten ersten Dimension kleiner ist als in der zweiten Dimension ergibt sich dadurch, dass der Austrittsquerschnitt in seiner ersten Dimension stärker gegenüber dem Eintrittsquerschnitt verringert ist, als in seiner zweiten Dimension eine Ausrichtung der Säugerspermatozoen, in der ihre erste Dimension mit der ersten Dimension des Austrittsquerschnitts gleichgerichtet ist.The nozzle used in accordance with the invention generates a stream of ducts with a stretched cross section through which the mammalian spermatozoa are efficiently aligned or in which the mammalian spermatozoa are efficiently aligned, in particular with their longitudinal axis parallel to the longitudinal axis of the liquid flow or parallel to the longitudinal axis the nozzle and parallel to the longitudinal axis of the flow channel, and with their narrow sides parallel to the narrow sides of the core flow liquid. For mammalian spermatozoa, whose cross section is smaller in a first dimension perpendicular to the longitudinal axis than in the second dimension, the result is that the outlet cross section is reduced in its first dimension more strongly in relation to the inlet cross section than in its second dimension an orientation of the mammalian spermatozoa in which its first dimension is rectified with the first dimension of the outlet cross-section.
Ein besonderer Vorteil ergibt sich daraus, dass der Querschnitt der Kernstromflüssigkeit nach Austritt aus dem Austrittsquerschnitt des Strömungskanals im Wesentlichen unabhängig vom äußeren Querschnitt bzw. vom Umfang der Hüllstromflüssigkeit ist. So erzeugt die Verwendung der Düse bei kreisförmiger Auslassöffnung einen Hüllstrom mit zylindrischem Umfang und einen im Hüllstrom angeordneten Kernstrom mit gestrecktem Querschnitt, in welchem die Säugerspermatozoen durch die Streckung des Querschnitts des Kernstroms mittels des Strömungskanals im Wesentlichen gleichförmig ausgerichtet sind, z. B. mit ihren Längsseiten parallel zu den Längsseiten des Querschnitts der Kernstromflüssigkeit und mit ihren Schmalseiten parallel zu den Schmalseiten der Kernstromflüssigkeit.A particular advantage results from the fact that the cross section of the core flow fluid after exiting the outlet cross section of the flow channel is substantially independent of the outer cross section or of the circumference of the sheath flow liquid. Thus, the use of the nozzle with circular outlet produces a sheath flow having a cylindrical circumference and a sheath flow arranged in the core stream with a stretched cross section in which the mammalian spermatozoa are substantially uniformly aligned by the extension of the cross section of the core flow by means of the flow channel, e.g. B. with their longitudinal sides parallel to the longitudinal sides of the cross section of the core flow liquid and with their narrow sides parallel to the narrow sides of the core flow liquid.
Die erfindungsgemäß verwendete Düse kann den Strömungskanal in Abmessungen von 0,5 mm bis 5 mm längs ihrer Längsachse und 0,5 mm bis 10 mm senkrecht zu ihrer Längsachse enthalten. Daher ist, insbesondere für Ausführungsformen, die Düsen mit einem einstückigen Strömungskanal verwenden oder Strömungskanäle solcher Gestaltung bzw. Abmessungen verwenden, optional mit angeformten Trägern, die in einen Düseninnenraum einsetzbar sind, die Herstellung mittels dreidimensionaler Stereolithographie bevorzugt. Bei diesem Herstellungsverfahren für die verwendete Düse mit einstückig ausgebildetem Strömungskanal bzw. für einen Strömungskanal, der optional stoffschlüssig angeformte Träger aufweist und der kraft- und/oder formschlüssig in den Innenraum einer Düse einsetzbar ist, wird mittels eines nach einem 3D-Modell gesteuerten Laserstrahls in Lösung die Polymerisation ausgelöst, so dass an den bestrahlten Stellen Polymer gebildet wird. Als Monomeren wurde z. B. Diphenylsilandiol in Mischung mit Methacryloxypropyltrimethoxysilan eingesetzt, die bei Bestrahlung zu einem formstabilen Polymer reagieren. Alternativ erfolgte die Herstellung mittels Rapid-Prototyping-Verfahren.The nozzle used in the invention may contain the flow channel in dimensions of 0.5 mm to 5 mm along its longitudinal axis and 0.5 mm to 10 mm perpendicular to its longitudinal axis. Therefore, particularly for embodiments using nozzles with a one-piece flow channel or using flow channels of such design, optionally with molded-on supports usable in a nozzle interior, fabrication by three-dimensional stereolithography is preferred. In this production method for the nozzle used with integrally formed flow channel or for a flow channel, which optionally has materially integrally molded carrier and which is non-positively and / or positively inserted into the interior of a nozzle, is controlled by means of a 3D model controlled laser beam in Solution triggered the polymerization, so that polymer is formed at the irradiated sites. As monomers z. B. diphenylsilanediol in mixture with methacryloxypropyltrimethoxysilane, which react when irradiated to a dimensionally stable polymer. Alternatively, the production was carried out by means of rapid prototyping method.
Bei Ausführungsformen mit einem unmittelbar an die zweite Einlauföffnung angrenzenden Strömungskanal, der bevorzugt an der Öffnung der Zuleitung runden Innen- und Außenquerschnitts angebracht ist, kann der Strömungskanal aus Kunststoff spritzgegossen sein oder aus Keramik oder Metall angefertigt sein.In embodiments with a directly adjacent to the second inlet opening flow channel, which is preferably attached to the opening of the inlet round inner and outer cross-section, the flow channel may be injection molded from plastic or be made of ceramic or metal.
Genaue Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention
Die Erfindung wird nun genauer mit Bezug auf die Figuren und anhand von Beispielen beschrieben, die schematisch inThe invention will now be described in more detail with reference to the figures and by means of examples, which are schematically illustrated in FIG
In den Figuren bezeichnen gleiche Bezugsziffern funktionsgleiche Elemente.In the figures, like reference numerals designate functionally identical elements.
Der Strömungskanal
Am gegenüberliegenden Ende weist der Strömungskanal
In einem Abstand von etwa 1/4 des Strömungskanals
In
Die Hüllstromflüssigkeit H umströmt die Träger
Eine Analyse des aus der runden Auslassöffnung
Beispiel 1: Detektion Y-Chromosomen-haltiger Spermien in Frischsamen und geschlechtsspezifische SortierungExample 1: Detection of Y-chromosome-containing sperm in fresh semen and gender-specific sorting
Frisch gewonnener Bullensamen wurde in üblicher Weise in Verdünner verdünnt und mit DNA-spezifischem Farbstoff, z. B. Bisbenzimid H 33342 (Hoechst), für 30 bis 60 min bei einer Temperatur von 20°C bis 40°C inkubiert und anschließend in einem Durchflusszytometer gemäß
Die Ausrichtung der Spermien wurde mit einem Detektor bestimmt, der unmittelbar stromabwärts der Düse auf den austretenden Flüssigkeitsstrom aus vereinzelten Tropfen gerichtet war. Der Gesamt-DNA-Gehalt wurde mit einem weiteren Detektor bestimmt, der weiter stromabwärts auf den Flüssigkeitsstrom gerichtet war. Die Ablenkungseinrichtung wies zwei entgegengesetzt elektrostatisch geladene Platten auf, die beidseitig des Flüssigkeitsstroms angeordnet waren und zwischen sich ein elektrisches Feld erzeugten, durch das der Flüssigkeitsstrom trat. Zur elektrischen Aufladung der Flüssigkeit wies die Düse einen elektrischen Kontakt auf, der, wie generell bevorzugt, abhängig vom detektierten Fluoreszenzsignal, das von den Spermien emittiert wurde, die Düse bzw. den darin enthaltenen Flüssigkeitsstrom nicht oder mit einem positiven oder negativen elektrischen Impuls beaufschlagte. Dieser elektrische Impuls zur Aufladung des Tröpfchenstroms wurde wie bekannt in Abhängigkeit von dem Signal des Detektors aufgegeben, das von der Ausrichtung der Spermien abhängt, und die Polarität des elektrischen Impulses zur Aufladung wurde in Abhängigkeit von dem Signal des Detektors zur Bestimmung des Gesamt-DNA-Gehalts gesteuert. Auf diese Weise wurden die Spermatozoen abhängig von dem detektierten Signal im elektrischen Feld in geschlechtschromosomenspezifische Fraktionen abgelenkt. The orientation of the spermatozoa was determined with a detector which was directed immediately downstream of the nozzle on the exiting liquid stream of isolated drops. The total DNA content was determined with another detector directed further downstream to the liquid flow. The deflector had two oppositely electrostatically charged plates placed on either side of the liquid flow creating an electric field between them through which the liquid flow passed. For electrical charging of the liquid, the nozzle has an electrical contact which, as is generally preferred, does not act on the nozzle or liquid stream contained therein, depending on the detected fluorescence signal emitted by the spermatozoa, or with a positive or negative electrical pulse. This electrical impulse for charging the droplet stream was given up, as known, depending on the signal from the detector, which depends on the orientation of the sperm, and the polarity of the electrical impulse for charging was determined as a function of the signal from the detector for determining the total DNA Salary controlled. In this way, the spermatozoa were deflected into sex-chromosome-specific fractions depending on the detected signal in the electric field.
Optional wurde ein Fluorid zur Immobilisierung der Spermien zugesetzt, z. B. in die während des Sortierverfahrens verwendete Hüll- oder Transportflüssigkeit, und/oder vor oder während des Zusatzes des Farbstoffs, um die Penetration des Farbstoffs in die Spermatozoen zu erhöhen. Fluoridionen wurden im Bereich von 0,1 bis 100 mM, vorzugsweise von 10 nM bis 10 mM zugesetzt. Es wurde gefunden, dass die optimale Konzentration des Fluorids, z. B. NaF oder KF, zwischen verschiedenen Spezies und für Individuen abwich. Die optimale Konzentrationen für die Spezies ist spezifisch und konnte allgemein als die Konzentration bestimmt werden, die bei mikroskopischer Betrachtung eine Immobilisierung von wenigstens 90% der Spermatozoen ergab, vorzugsweise von im wesentlichen allen Spermatozoen.Optionally, a fluoride was added to immobilize the sperm, e.g. In the coating or transport liquid used during the sorting process, and / or before or during the addition of the dye to increase the penetration of the dye into the spermatozoa. Fluoride ions were added in the range of 0.1 to 100 mM, preferably 10 nM to 10 mM. It has been found that the optimal concentration of fluoride, e.g. As NaF or KF, between different species and for individuals differed. The optimal concentration for the species is specific and could generally be determined as the concentration which, upon microscopic observation, resulted in immobilization of at least 90% of the spermatozoa, preferably of substantially all spermatozoa.
Entsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf Zusammensetzungen der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Spermafraktionen, und auf Verfahren zur Herstellung von geschlechtsspezifischen Spermafraktionen und anschließenden Konservierung der Spermafraktionen von nicht-menschlichen Säugetieren, jeweils vorzugsweise in Anwesenheit von Fluorid und/oder Antioxidationsmitteln.Accordingly, the present invention also relates to compositions of the sperm fractions produced by the method of the invention, and to methods for producing sex-specific sperm fractions and subsequent preservation of the sperm fractions of non-human mammals, each preferably in the presence of fluoride and / or antioxidants.
BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS
- KK
- KernstromflüssigkeitCore stream of liquid
- HH
- Hüllstromflüssigkeitsheath flow
- 11
- axialer Abschnittaxial section
- 22
- Strömungskanalflow channel
- 33
- Auslassöffnungoutlet
- 44
- Trägercarrier
- 55
- Eintrittsabschnittentry section
- 66
- Austrittsabschnittexit section
- 77
- EintrittsquerschnittInlet cross-section
- 88th
- AustrittsquerschnittOutlet cross section
- 99
- ZwischenquerschnittBetween cross-section
- 1010
- zweite Einlauföffnungsecond inlet opening
- 1111
- erste Einlauföffnungfirst inlet opening
- 1212
- Zuleitungsupply
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION
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Zitierte PatentliteraturCited patent literature
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- DE 102005044530 [0042] DE 102005044530 [0042]
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