DE102011001380B3

DE102011001380B3 - TCRalpha/beta-depletierte Zellseparationen

Info

Publication number: DE102011001380B3
Application number: DE102011001380A
Authority: DE
Inventors: Rupert Handgretinger; Volker Huppert
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Priority date: 2011-03-17
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2012-08-09
Anticipated expiration: 2031-03-18

Abstract

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, aufweisend eine aus Knochenmark oder aus Blut erhaltbare Zellpopulation, wobei die Zellpopulation von Zellen, die TCR alpha/beta exprimieren, depletiert ist. Eine derartige pharmazeutische Zusammensetzung ermöglicht die Rekonstitution der Immunabwehr eines Menschen im Rahmen einer Knochenmarkstransplantation. Durch die Erfindung wird einerseits die Zeit bis zur Immunrekonstitution erheblich verkürzt als auch die Immunreaktionen nach Behandlung erheblich verringert, insbesondere das Auftreten der GvHD. Die Überlebensrate der Patientinnen und Patienten wird erheblich erhöht.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendung von TCRalpha/beta(TCRα/β)-depletierten Zellpräparationen zur Wiederherstellung des Knochenmarks und/oder des Immunsystems, insbesondere im Rahmen einer Stammzelltransplantation sowie bei der Behandlung von Krebserkrankungen, wie beispielsweise Leukämien.
Einleitung
In Europa werden jährlich mehr als 31.000 Stammzelltransplantationen durchgeführt, von denen ca. 13.000 allogen und 18.000 autolog sind (Baldomero H, Gratwohl M. Gratwohl A, Tichelli A, Niederwieser D, Madrigal A, Frauendorfer K. The EBMT activity survey 2009: trends over the past 5 years. Bone Marrow Transplant. 2011 Feb 28). Sie gewinnt immer mehr an Bedeutung in der Behandlung von hämatologischen, onkologischen, immunologischen und genetischen Erkrankungen (Zintl et al., Correction of fatal genetic diseases using bone marrow transplantation.. Kinderarztl Prax. 1991 Jan-Feb; 59(1–2): 6–9. Review., Zintl, Bone marrow transplantation in childhood. I. Kinderarzt) Prax. 1988 Jun; 56(6): 259–64. Review., Down J D, Mauch P M. The effect of combining cyclophosphamide with total-body irradiation an donor bone marrow engraftment. Transplantation. 1991 Jun; 51(6): 1309–11) und stellt für viele dieser Erkrankungen die einzige langfristige Heilungsmöglichkeit dar (Eyrich et al., A prospective comparison of immune reconstitution in pediatric recipients of positively selected CD34+ peripheral blood stem cells from unrelated donors vs recipients of unmanipulated bone marrow from related donors. Bone Marrow Transplant. 2003 Aug; 32(4): 379–90).
Die Hauptkomplikationen der Stammzelltransplantation ergeben sich vor allem aus der Reaktion des Transplantats gegen den Empfänger (Graff-versus-host-disease, GvHD oder GvHR), einem fehlerhaften Engraftment der transplantierten Stammzellen, der Toxizität der Konditionierung und den Infektionen, unter Therapie aufgrund einer verzögerten oder inkompletten Immunrekonstitution.
Mit reduziertem Konditionierungsregime konnten bei allogener Transplantation die Inzidenz von therapieassoziierter Mortalität gesenkt werden. Neben der Reduktion potenzieller chemotherapieassoziierter Nebenwirkungen für den Empfänger wird durch reduzierte Post-Transplant Immunsuppression tendenziell der immunologische Effekt des Transplantats gegen das maligne Gewebe begünstigt. Dieser Transplantat gegen Tumor Effekt wird insbesondere durch T- und NK-Zellen des Spenders vermittelt. Trotz der reduzierten Konditionierung steigt die Tumorprogression nicht an (Valcárcel et al., Conventional versus reduced-intensity conditioning regimen for allogeneic stem cell transplantation in patients with hematological malignancies. Eur J Haematol. 2005 Feb; 74(2): 144–51.; Strahm et al.. Reduced intensity conditioning in unrelated donor transplantation for refractory cytopenia in childhood. Bone Marrow Transplant. 2007 Aug; 40(4): 329–33.). Um erhöhte Mortalität zu vermeiden, gilt es also nach allogener Transplantation das Immunsystem so schnell wie möglich wieder herzustellen um eine Kontrolle des Tumors und von Infektionen zu ermöglichen. Dies ist mit dem Auftreten von GvHD zu balancieren, welche bei frühem Abesetzen der Immunsuppression, der Verwendung von zu vielen alloreaktiven T-Zellen oder bei zu großer Antigendifferenz begünstigt wird und Mortalität und Morbidität erzeugt
1) Passive TCD (CD34 Anreicherung)
Bisher wurden Patientinnen und Patienten, die eine Stammzelltransplantation benötigten, mit einer Zellpräparation aus CD34 positiven Zellen (Stammzellen) als zweckmäßiger Vergleichstherapie behandelt. Auf diese Weise werden T-Zellen depletiert, die bei der GvHD eine maßgebliche Rolle spielen, allerdings gehen mit den T-Zellen, aber auch NK-Zellen auch unabdingbare Faktoren (Effektorzellpopulationen) verloren, die bei der Heilung eine Rolle spielen.
Unter der Graft-versus-Host-Reaktion (GvHR; deutsch: Transplantat-Wirt-Reaktion; englisch: Graft-versus-Host-Disease (GvHD)) versteht man eine immunologische Reaktion, welche in der Folge einer allogenen Knochenmark- oder Stammzelltransplantation auftreten kann (Jacobsohn D A, Vogelsang G B: Acute graft versus host disease. Orphanet J Rare Dis. 2007 Sep 4; 2: 35).
Bei der GvHR reagieren vor allem die im Transplantat enthaltenen T-Lymphozyten eines Spenders gegen den Empfängerorganismus. Sie ist damit immunologisch gesehen eine Reaktion der Spender-Lymphozyten auf die fremden Antigene des Patienten.
Man unterscheidet eine akute GvHD (aGvHD) und eine chronische GvHD (cGvHD) voneinander, wobei die chronische Form 100 Tage nach Transplantation aus der akuten oder als de-novo GvHD entstehen kann.
Nach dem Seattle Schema werden die akute und chronische Form in Grade unterteilt. An Haut, Darm und Leber manifestiert sich die GvHD mittels Exanthemen und Blasen auf der Körperoberfläche, Diarrhoen, Ileus und angestiegenem Bilirubin. Für die aGvHD ergibt sich aus der Summe der Manifestationsorte und der Schwere der Manifestation eine Unterteilung von Grad 0 bis Grad IV. Um eine aGvHD zu vermeiden, können prophylaktische Maßnahmen eingeleitet werden. Zu diesen zählen die Gabe von Immunsuppressiva wie Methotrexat (MTX), Cyclosporin A (CsA), Kortikosteroiden oder die Kombination aus diesen Medikamenten. (Martino R, Romero P et al.: „Comparison of the classic Glucksberg criteria and the IBMTR Severity Index for grading acute graft-versus-host disease following HLA-identical sibling stem cell transplantation. International Bone Marrow Transplant Registry.” Bone Marrow Transplant 1999; 24(3): S. 283–287 und Wikipedia, Graftversus-Host-Reaktion).
Das Risiko, eine GvHD zu entwickeln hängt eng mit der Kompatibilität ab, welche durch das humane Leukozyten-Antigen (HLA) bestimmt wird. Ein besonders hohes Risiko, eine aGvHD zu erleiden, besteht bei unverwandter Fremdspende und HLA-inkompatibler Spende. Bei allogener Transplantation von HLA-identischen Geschwisterspendern entwickeln jedoch trotz optimaler Vorsorge ca. 35–60% der Patienten eine akute GvHD leichter bis mittlerer Ausprägung trotz der Verabreichung von immunsupprimierenden Medikamenten; ca. 10% erleiden eine schwer kontrollierbare GvHD (Kanda Y, Chiba S: „Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation from family members other than HLA-identical siblings over the last decade (1991–2000).” Blood 2003; 102(4): S. 1541–1547).
Ein erheblicher Anteil (ca. 30–65%) der Patienten entwickelt eine chronische GvHD, die langfristig eine der häufigsten Nebenwirkungen und Todesursachen nach Stammzelltransplantation darstellt (Ringdén et al., The graft-versus-leukemia effect using matched unrelated donors is not superior to HLA-identical siblings for hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2009 Mar 26; 113(13): 3110-8; Ratanatharathorn et al., Phase III study comparing methotrexate and tacrolimus (prograf, FK506) with methotrexate and cyclosporine for graft-versus-host disease prophylaxis after HLA-identical sibling bone marrow transplantation. Blood. 1998 Oct 1; 9 2(7): 2303–14.), die Lebensqualität nachhaltig beeinträchtigt, sowie die Rückkehr an den Arbeitsplatz verzögert (Wong et al., Long-term recovery after hematopoietic cell transplantation: predictors of quality-of-life concems. Blood. 2010 Mar 25; 115(12): 2508–19.; Sutherland et al., Quality of life following bone marrow transplantation: a comparison of patient reports with population norms. Bone Marrow Transplant. 1997 Jun; 19(11): 1129–36).
Zusätzlich erfordert nicht nur die Prophylaxe, sondern auch die Behandlung der GvHD die Verabreichung von Immunsuppressiva, die erhebliche Nebenwirkungen verursachen können, z. B. Kortikosteroid-Nebenwirkungen wie Diabetes, avaskuläre Nekrose, Cushing's Syndrom oder CsA/Tacrolimus Nebenwirkungen wie Nierenschädigungen, Bluthochdruck, Paresthesias und allgemein Infektionen jeder Art (Wong et al., Long-term recovery after hematopoietic cell transplantation: predictors of quality-of-life concems. Blood. 2010 Mar 25; 115(12): 2508-19.; Sutherland et al., Quality of life following bone marrow transplantation: a comparison of patient reports with population norms. Bone Marrow Transplant. 1997 Jun; 19(11): 1129–36; Ferrara J L, Levine J E, Reddy P, Holler E. Graft-versus-host disease. Lancet. 2009 May 2; 373(9674): 1550–61. Review).
Immunrekonstitution
Ein weiterer Nachteil der bisherigen Behandlungsmethode ist die verzögerte Immunrekonstitution, d. h. die verzögerte Wiederherstellung eines funktionierenden Immunsystems bzw. hämatopoietischen Systems im transplantierten Patienten. Das Immunsystem bedarf zur Rekonstitution ca. 1 bis 2 Jahre.
In dieser Zeit besteht das stark erhöhte Risiko, an lebensbedrohlichen Infektionen vor allem viralen, bakteriellen oder Pilzinfektionen zu erkranken bzw. zu versterben (Handgretinger R, Klingebiel T, Lang P et al. Megadose transplantation of purified peripheral blood CD34(+) progenitor cells from HLA-mismatched parental donors in children. Bone Marrow Transplant 2001; 27: 777–83 und Platzbecker U, Ehninger G, Bornhauser M. Allogeneic transplantation of CD34+ selected hematopoietic cells: clinical problems and current challenges. Leuk Lymphoma 2004; 45: 447–53).
Die Ursache hierfür liegt in der Tatsache, dass mit der Anreicherung von CD34 positiven Stammzellen sämtliche T-Zellen, NK-Zellen und weitere akzessorische Zellpopulationen verloren gehen, die bei der Immunrekonstitution bzw. der Rekonstitution des hämatopoietischen Systems helfen könnten.
Die Regeneration der T-Zellen nach Transplantation und damit der Immunrekonstitution verläuft auf zwei Wegen. Der sogenannte zentrale Weg ist thymusabhängig und setzt einen intakten Thymus voraus. T-Zellen, die den Thymus erst kürzlich verlassen haben, weisen auf die Erholung des Immunsystems hin. Die Bestimmungen des T-Zell-Rezeptor Exzisions Zyklus (TREC) und unreifer T-Zellen mit dem Oberflächenantigen CD45RA eignen sich zur Darstellung. Der periphere Weg der T-Zell-Rekonstitution ist thymusunabhängig und sehr wichtig, da viele Konditionierungsregime den Thymus schädigen. Die Expansion maturer T-Lymphozyten, welche mit dem Transplantat übertragen werden, gewährleistet die Rekonstitution des Immunsystems.
CD34+selektionierte Transplantationen, bei denen die T-Zellen nicht auf den Patienten übertragen werden, weisen somit ein verspätetes Einsetzen der Rekonstitution des Immunsystems auf (Sutherland et al., Rekonstitution of naïve T cells and type 1 function alter autologous peripheral stem cell transplantation: impact an the relapse of original cancer. Transplantation. 2002 Apr 27; 73(8): 1336–9.; Rutella et al., Immune reconstitution alter autologous peripheral blood progenitor cell transplantation: effect of interleukin-15 an T-cell survival and effector functions. Exp Hematol. 2001 Dec; 29(12): 1503–16.; Heining et al., Lymphocyte reconstitution following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective study including 148 patients. Bone Marrow Transplant. 2007 May; 39(10): 613–22.). Die geringe GvHD Rate bei diesen Transplantationen wird durch eine stark verzögerte Immunrekonstitution sozusagen erkauft. Daraus ergibt sich als aktuelle Schwachstelle die verzögerte Immunrekonstitution d. h. die verzögerte Wiederherstellung eines funktionierenden Immunsystems, die mit einem erhöhten Risiko potentiell letaler Infektionen assoziiert ist.
Relapse
Ein weiterer Nachteil der T-Zell-Depletion ist das erhöhte Risiko, daß die zugrundeliegende Erkrankung, die Grund für die Stammzelltransplantation war (meist eine Leukämie), nach CD34-Stammzelltransplantationen häufiger wieder auftritt (Horowitz M M, Gale R P, Sondel P M et al. Graft-versus leukemia reactions after bone marrow transplantation. Blood 1990; 75: 555–62), auch durch die Entfernung der NK-Zellen (natural killer cells), die einen anti-leukämischen Effekt haben (Ruggeri L, Mancusi A, Capanni M et al. Exploitation of alloreactive NK cells in adoptive immunotherapy of cancer, Curr Opin Immunol 2005; 17: 211–7).
2) Aktive TCD (CD3 Depletion)
CD3-depletierte Zellpräparationen wurden kürzlich verwendet, in denen die T-Zellen depletiert sind; NK-Zellen, Monozyten, Granulozyten und CD34 negative Stammzellvorläuferzellen im Transplantat aber noch enthalten sind. Zwar war das Risiko von GvHD und therapieassoziiertem Frühversterben (early treatment related mortality, TRM) etwas verkleinert, allerdings führten auch diese Zellpräparationen nicht zu einer messbaren Erhöhung der Überlebensrate (Lee C K, DeMagalhaes-Silverman M et al.: „Donor T-lymphocyte infusion for unrelated allogeneic bone marrow transplantation with CD3+ T-cell-depleted graft.” Bone Marrow Transplant 2003; 31(2): S. 121–128 und Wikipedia, Graft-versus-Host-Reaktion) oder einer verbesserten Immunrekonstitution.
Beschreibung
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine aus Knochenmark oder aus Blut erhaltbare Zellpopulation aufweist. Erfindungsgemäß ist die Zellpopulation von TCR (T-Zell Rezeptor) alpha/beta-positiven Zellen und von CD19-positiven Zellen depletiert. Es finden sich somit T-Zellen in der pharmazeutischen Zusammensetzung, die TCR gamma/delta positiv sind, aber nur noch wenige oder fast keine oder, im besten Fall, keine Zellen mehr, die TCR alpha/beta positiv sind.
Unter Depletion wird hier die signifikante Abreicherung von Zellen aus einer Zellpopulation verstanden. So kann Depletion eine Abreicherung einer Zellart (die durch das Vorhandensein z. B. eines Zelloberflächenmarkers definiert sein kann) um mindestens 2 logarithmische Stufen, bevorzugt um mindestens 3 logarithmische Stufen, besonders bevorzugt um mindestens 4 logarithmische Stufen (z. B. 4,6 logarithmische Stufen), am meisten bevorzugt um mindestens 4 bis 5 logarithmische Stufen.
Die Entfernung nach logarithmischen Stufen ist wie folgt: 1 log = 90% Entfernung der störenden Zellen, 2 log = 99%, 3 log = 99,9% und 4 log = 99,99%. Arten zur Berechnung von Separationsperformance sind dem Fachmann bekannt und z. B. in Bosio et al., Isolation and Enrichment of Stern Cells, Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology, Springer Verlag Berlin Heidelberg, 2009, beschrieben.
Eine derartige Depletion erfolgt über den Oberflächenmarker TCR alpha/beta und über CD19. Die Depletion kann mit jeder im Stand der Technik bekannten Methode erfolgen, z. B. Panning, Elutriation oder magnetischer Zellseparation. Bevorzugt ist eine Depletion mittels magnetischer Zellseparation (z. B. CliniMACS, Miltenyi Biotec GmbH) aufgrund der hohen Depletionseffizienz.
Die aus Blut erhaltbare Zellpopulation ist insbesondere ein Zellpräparat, das mittels einer Leukozytenapherese oder Knochenmarkpunktion erhalten wird. Bevorzugt wird das Zellpräparat von einem gesunden Spender gewonnen, der zuvor mit stammzellmobilisierenden Medikamenten behandelt wurde.
Die Zellpopulation dieser pharmazeutischen Zusammensetzung ist auch hinsichtlich CD19-positiven Zellen depletiert. Dies führt dazu, dass die Zellpopulation keine B-Zellen enthält. Damit entfällt eine mögliche Übertragung des Epstein-Barr-Virus (EBV) an den die pharmazeutische Zusammensetzung empfangenden Patienten und es müssen weniger oder keine Immunsuppressiva verabreicht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der pharmazeutischen Zusammensetzung weist die Zusammensetzung weiterhin mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Zusatzstoff auf.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann gegen Krebserkrankungen verabreicht werden, wie beispielsweise Leukämien und andere Erkrankungen, z. B. akute myeloider Leukämie, akute lymphatische Leukämie, Agranulocytose, B-Thalassenämie, Inborn Error (HHS) als auch gegen solide Tumoren (z. B. Neuroblastom, Sarkome etc.), bei denen eine allogene Transplantation indiziert ist oder ein therapeutischer Effekt von TCR alpha/beta depletierten Zellzubereitungen zu erwarten ist.
Weiterhin müssen bei einer allogenen Transplantation genügend CD34+ Zellen übertragen werden, (mindestens 2 bis 4 Millionen pro kg Körpergewicht des Empfängers), um eine gute Rekonstitution der Blutbildung zu erreichen und es sollten weniger als 25,000 TCR alpha beta positive T Zellen pro kg Körpergewicht des Empfängers gegeben werden, wenn auf eine Immunsuppression verzichtet werden soll. B Zellen, welche durch eine CD19 Depletion aus dem Transplantat entfernt werden, sollten so wenig wie möglich enthalten sein oder nachträglich im Empfänger durch z. B. die Gabe eines anti-CD19 Antikörpers in vivo entfernt werden, wenn das Risiko einer EBV Infektion und der damit auftretenden Komplikationen vermindert werden soll.
Die einem menschlichen Patienten zu verabreichende Menge der depletierten Zellpopulation liegt typischer Weise bei 2 × 10E10 bis 1 × 10E11 Lymphocyten.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung einer aus Knochenmark oder aus Blut erhaltbaren Zellpopulation, wobei die Zellpopulation von TCR alpha/beta-positiven Zellen und CD19-positiven Zellen depletiert ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Rekonstitution des hämatopoietischen Systems eines Menschen nach einer Stammzell- oder Knochenmarkstransplantation. Diese Rekonstitution ist gegenüber der bisher bekannten Rekonstitution (z. B. mit unverändertem Knochenmark oder CD34 positiven Stammzellen aus Knochenmark oder Blut bzw. mobilisiertem, prozessiertem Blut nach Leukapherese) deutlich schneller und führt damit zu einem geringeren Bedarf an Transfusionen von Blutbestandteilen, der Möglichkeit eines kompletten Verzichts auf, oder einer Reduktion immunsuppremierender Medikamente und führt somit zu geringeren Nebenwirkungen, weniger Infektionen, und einer verringerten Sterblichkeit des Transplantatermpfängers.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein (in vitro) Verfahren zur Herstellung einer Population von Zellen. Das Verfahren weist die folgenden Schritte auf:

– Bereitstellen von Knochenmark oder Blut eines Spenders (also einer Population, die u. a. TCR alpha/beta positive und TCR gamma/delta positive Zellen aufweist) und
– Depletion von TCR alpha/beta-positiven Zellen und von CD19 positiven Zellen aus der Zellpopulation.

Bevorzugter Weise erfolgt in dem Verfahren die Depletion von TCR alpha/beta positiven Zellen mittels eines Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragments gegen TCR alpha/beta. Dabei kann die Depletion mittels eines Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragments gegen TCR alpha/beta erfolgen.
Das Verfahren weist zusätzlich den folgenden Schritt auf:

– Depletion von CD19-positiven Zellen aus der Zellpopulation. Dieser Schritt kann zeitlich, vor, nach, oder gleichzeitig mit der Depletion von TCR alpha/beta-positiven Zellen aus der Zellpopulation durchgeführt werden.

In dem Verfahren kann die Depletion von CD19-positiven Zellen mittels eines Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragments gegen CD19 erfolgen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung eines beschriebenen Verfahrens zur Rekonstitution der Immunabwehr bzw. des hämatopoietischen Systems eines Menschen im Rahmen einer Stammzell- oder Knochenmarkstransplantation.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer aus Knochenmark oder aus Blut erhaltenen Zellpopulation, wobei die Zellpopulation von Zellen, die TCR alpha/beta exprimieren und von Zellen, die CD19 exprimieren, depletiert ist, nämlich zur Rekonstitution der Immunabwehr eines Menschen im Rahmen einer Knochenmarkstransplantation.
Vorteile der Erfindung
Trotz der Verbesserungen in den letzten Jahren ist die Stammzelltransplantation immer noch mit einer akut erhöhten Morbidität und einer initialen transplantationsbedingten Mortalität verbunden. Die Hauptkomplikationen der Stammzelltransplantation, ergeben sich vor allem aus den Abstoßungsreaktionen (Graft-versus-Host Erkrankung) und deren Therapie, der langsamen Immunrekonstitution bzw. Rekonstitution des hämatopoietischen Systems und den daraus resultierenden Infektionen nach Transplantation sowie der Toxizität der Konditionierung.
Durch die Verwendung von TCR alpha/beta und CD19 depletierten Zellen (depletierte Zellpopulation) ist es möglich, das hämatologische Stammzelltransplantat so zu manipulieren, dass die Hauptkomplikationen nach Stammzelltransplantation, d. h. die Graft-versus-host Krankheit, sowie die langsame Immunrekonstitution nach Stammzelltransplantation und die damit verbundene lang andauernde Infektanfälligkeit gegenüber bakteriellen, viralen und Pilzinfektionen mit potentiell letelem Ausgang, erheblich zu reduzieren.
Gleichzeitig bleibt die Graft-versus-Tumor Reaktivität des Zellgemisches erhalten d. h. es ist kein erhöhtes Rückfallrisiko für den Patienten zu erwarten. Ein weiterer Vorteil ist ein stabiles Anwachsen des Transplantats das sogenannte Engraftment.
Durch die erhebliche Reduktion der genannten Hauptkomplikationen ist es möglich, die Medikamente, die üblicherweise zur Behandlung dieser Komplikationen eingesetzt werden und zum Teil erhebliche Nebenwirkungen hervorrufen (und hohe Kosten verursachen), stark zu reduzieren oder vollständig darauf zu verzichten. Durch den Verzicht der medikamentösen Immunsuppressiva zur GvHD-Prophylaxe können Nebenwirkungen, wie z. B. Infektionen (Sepsis, Candidose, Herpes simplex, etc.), die aus der medikamentösen Unterdrückung des Immunsystems resultieren, vermieden werden.
Als Konsequenz kann zum einen die Lebensqualität des Patienten, sowie der Therapieerfolg erheblich verbessert und gleichzeitig die Kosten für die Behandlung reduziert werden. Zu den oben genannten Medikamenten gehören Medikamente zur GvHD Prophylaxe wie z. B. Mofetilmycophenolat, das als GvHD Prophylaxe eingesetzt wird.
Neben der Reduktion von Infektionen und der GvHD ermöglicht die depletierte Zellpopulation die Verwendung eines reduzierten Konditionierungsregimes (RIC). Reduzierte Konditionierungsregime können bei allogener Transplantation die Inzidenz von therapieassoziierter Mortalität senken und dann eingesetzt werden, wenn der immunologische Effekt des Transplantats gegen das maligne Gewebe ausgenutzt werden kann. Dieser Transplantat gegen Tumor Effekt wird insbesondere durch T- und NK-Zellen des Spenders vermittelt und ist daher bei CD34 angereicherten Stammzellpräparaten nicht einsetzbar.
Insofern liegt ein erheblicher Zusatznutzen gegenüber der zweckmäßigen Vergleichstherapie(n) vor, da eine nachhaltige und gegenüber der zweckmäßigen Vergleichstherapie bisher nicht erreichte große Verbesserung des therapierelevanten Nutzens erreicht wird, insbesondere eine Heilung der Erkrankung, eine erhebliche Verlängerung der Überlebensdauer, eine langfristige Freiheit von schwerwiegenden Symptomen und die weitgehende Vermeidung schwerwiegender Nebenwirkungen.
Die Nutzung der TCR alpha/beta Depletionsstrategie resultiert in eine frühere Immunrekonstitution, mit Werten von mehr als 100 CD4 Zellen/μl innerhalb von 6 Wochen nach der Transplantation verglichen zu 10 Monaten, wie von Aversa et al. berichtet (Treatment of high-risk acute leukemia with T-cell-depleted stem cells from related donors with one fully mismatched HLA haplotype. N Engl J Med. 1998 Oct 22; 339(17): 1186–93.).
Der Nutzen eines Arzneimittels ist der patientenrelevante therapeutische Effekt insbesondere hinsichtlich der Verbesserung des Gesundheitszustands, der Verkürzung der Krankheitsdauer, der Verlängerung des Überlebens, der Verringerung von Nebenwirkungen oder einer Verbesserung der Lebensqualität.
Der Zusatznutzen eines Arzneimittels ist ein Nutzen, der quantitativ oder qualitativ höher ist als der Nutzen, den die zweckmäßige Vergleichstherapie aufweist.
Ein erheblicher Zusatznutzen liegt vor, wenn eine nachhaltige und gegenüber der zweckmäßigen Vergleichstherapie bisher nicht erreichte große Verbesserung des therapierelevanten Nutzens erreicht wird, insbesondere eine Heilung der Erkrankung, eine erhebliche Verlängerung der Überlebensdauer, eine langfristige Freiheit von schwerwiegenden Symptomen oder die weitgehende Vermeidung schwerwiegender Nebenwirkungen;
Ein beträchtlicher Zusatznutzen liegt vor, wenn eine gegenüber der zweckmäßigen Vergleichstherapie bisher nicht erreichte deutliche Verbesserung des therapierelevanten Nutzens erreicht wird, insbesondere eine Abschwächung schwerwiegender Symptome, eine moderate Verlängerung der Lebensdauer, eine für die Patientinnen und Patienten spürbare Linderung der Erkrankung, eine relevante Vermeidung schwerwiegender Nebenwirkungen, oder eine bedeutsame Vermeidung anderer Nebenwirkungen.
Ein geringer Zusatznutzen liegt vor, wenn eine gegenüber der zweckmäßigen Vergleichstherapie bisher nicht erreichte moderate und nicht nur geringfügige Verbesserung des therapierelevanten Nutzens erreicht wird, insbesondere eine Verringerung von nicht schwerwiegenden Symptomen der Erkrankung oder eine relevante Vermeidung von Nebenwirkungen.
Technische Ergebnisse
Extern und intern durchgeführte Abreicherungsläufe (Depletion runs bzw. Depletion) mit CliniMACS TCRαβ-Biotin (Miltenyi Biotec GmbH) belegen, dass die Effizienz der Abreicherung mit einer durchschnittlichen Log Abreicherung von 4,6 sehr robust ist (1).
CD19 ist ein Oberflächenmolekül auf T-Zellen. CD19 positive Zellen bedeutet, dass ein CD19-bindendes Molekül, z. B. ein Antikörper an das CD19-Molekül auf der Oberfläche der T-Zellen binden kann.
TCR alpha-beta ist ein Oberflächenmolekül auf T-Zellen. TCR alpha/beta positive Zellen bedeutet, dass ein TCR alpha/beta-bindendes Molekül, z. B. ein Antikörper, an das TCR alpha/beta-Molekül auf der Oberfläche der T-Zellen binden kann.
„Antikörper” bedeutet ein monoklonaler, polyklonaler Antikörper (Harlow and Lane, „Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor, USA), der an ein Molekül bindet oder ein Derivat dieses Antikörpers, der die Bindungskapazität behält oder im Wesentlichen behält. Bevorzugte Derivate dieser Antikörper sind chimäre Antikörper umfassend beispielsweise chimäre Antikörper eine variable Region der Maus oder der Ratte und eine humanen konstanten Region. Der Begriff „Antikörper” umfasst ebenfals einen bifunktionalen oder bispezifischen Antikörper und Antikörper-Konstrukte wie Fvs (scFv) aus Einzelketten oder Antikörper-Fusionsproteine. Der Begriff „scFv” (single chain Fv Fragment) ist der Fachperson bekannt und bevorzugt, da das Fragment rekombinant hergestellt werden kann.
Der Antikörper kann human oder humanisiert sein. Der Begriff „humanisierter Antikörper” bedeutet, dass mindestens eine Antikörperbindungsstelle (complementary determining region (CDR) wie z. B. CDR3 und vorzugsweise alle 6 CDRs ausgetauscht wurden durch CDRs von einem humanen Antikörper mit der gewünschten Spezifität. Optional wurden die nicht-humane(n) konstante(n) Region(en) des Antikörpers ersetzt durch a) konstante Region(en) eines humanen Antikörpers. Methoden zur Herstellung von humanisierten Antikörpern sind beschrieben z. B. in EP 0239400 A1 und WO 90/07861 A1 .
Der Begriff Antigen-bindendes Fragment bezeichnet ein Fragment des oben definierten Begriffs „Antikörper” wie z. B. getrennte leichte und schwere Ketten, Fab, Fab/c, Fv, Fab', F(ab')2. Ein antigen-bindendes Fragment kann eine variable Region der leichten Kette und eine variable Region der schweren Kette umfassen, nicht notwendigerweise beide zugleich.
Klinische Ergebnisse
Im Rahmen von Heilversuchen wurden 11 Patienten behandelt. 8 Patienten mit einem TCRαβ depletierten Transplantat von einem haploidenten Spender und 3 Patienten mit einem Transplantat von einem passenden unverwandten Spender (matched unrelated donor).
Aufgrund der sehr robusten Depletion und damit geringen Zellzahl von TCRαβ⁺ T-Zellen im Transplantat musste keine GvHD Prophylaxe in Form von immunsupprimierenden Medikamenten nach der Transplantation wie z. B. MMF oder CsA verabreicht werden.
Die Graft-versus-Host Erkrankung war in den behandelten Patienten reduziert (2). In allen Fällen war nur die Haut von GvHD Symptomen betroffen und die Symptome traten nur temporär auf. 36% der Patienten zeigten GvHD Grad I, 18% zeigten GvHD Grad II. GvHD Grad III wurde nicht beobachtet. Das ist besonders bemerkenswert, da keine GvHD Prophylaxe in Form von immunsupprimierenden Medikamenten nach der Transplantation verabreicht wurden. Bei 10 von 11 Patienten wuchs das Transplantat zwischen Tag 7 und Tag 9 an.
In allen Patienten wurde eine stark beschleunigte Immunrekonstitution beobachtet. Wie in 1 zu sehen ist, war die Immunrekonstitution mit TCRαβ/CD19 depletierten Zellpopulationen (Transplantaten) deutlich schneller als mit CD3/CD19 depletierten Zellen (Transplantaten).
Dargestellt ist die Immunrekonstitution bis zum Erreichen von > 200 Zellen/μl nach Transplantation von TCRαβ/CD19 depletierten peripheren Blutstemmzellen (N = 11) im Vergleich zu CD34 angereicherten peripheren Blutstammzellen (historische Kontrolle, N = 13). Die Daten zur Immunrekonstitution nach Stammzelltransplantation mit CD34 angereicherten Zellen wurden der folgenden Publikation entnommen: Br J Haematol. 2001 Aug; 114(2): 422–32.
In allen diesen Patienten ist eine sehr schnelle Immunrekonstitution zu beobachten, die völlig überraschend ist und bisher nicht erklärbar, da die Rekonstitution auch deutlich schneller erfolgt als bei der Gabe von unmanipuliertem Knochenmark, welches sämtliche immunrekonstituierenden Zellen des Spenders enthält und daher bei unmanipuliertem Knochenmark eigentlich eine schnellere Immunrekonstitution zu erwarten gewesen wäre als bei der Verabreichung von TCR alpha/beta und CD 19 depletiertem Zellpräparat, welches deutlich weniger immunrekonstituierende Zellen enthält.
5 zeigt die Immunrekonstitution eines bei Patienten bei 3 aufeinanderfolgenden Stammzelltransplantationen. Die erste Stammzelltransplantation erhielt der Patient von einem MUD-Spender mit unmanipuliertem Knochenmark, die zweite von einem haploidenten Spender mit CD3/CD19 depletierten peripheren Blutstammzellen (PBSC). In beiden Fällen erfolgte keine Rekonstitution des Immunsystems. Erst als der Patient eine dritte Stammzelltransplantation mit TCR alpha/beta und CD19 depletierten PBSCs des Vaters erhielt, erfolgte eine sehr schnelle Immunrekonstitution.
Die GvHD war in den Fällen der TCR alpha/beta und CD19 Transplantation entgegen den Erwartungen nicht erhöht (2). Dabei ist zu berücksichtigen, dass nur die Haut von der GvHD betroffen war und die GvHD-Symptome nur temporär auftraten, obwohl keine Immunsuppression zur Behandlung gegeben wurde.
Grund für die schnelle Immunrekonstitution könnten die TCR gamma/delta Zellen sein, die bei einem TCR alpha/beta depletierten Zellpräparat im Transplantat enthalten sind, bei einem CD34 positiven Stammzelltransplantat nicht.
Stammzell- und Knochenmarktransplantation
Bei der Knochenmarktransplantation wird dem Spender unter Vollnarkose ungefähr ein Liter Knochenmark-Blut-Gemisch aus dem Beckenknochen entnommen.
Bei der Stammzellentnahme aus dem Blut wird dem Spender über mehrere Tage ein körpereigener hormonähnlicher Stoff verabreicht, der die Produktion der Stammzellen und ihren Übertritt aus dem Knochenmark in den Blutkreislauf anregt. Die Methoden zur Vorbehandlung des Spenders und zur Entnahme von Knochenmarks- oder Blutstammzellen sind Stand der Technik und dem Fachmann bekannt.
Ablauf
Das Ziel der Blutstammzelltransplantation besteht darin, den Empfänger mit einer gesunden Stammzellpopulation auszustatten, die sich zu Blutzellen ausdifferenzieren. Dadurch werden die defizienten oder pathologischen Zellen des Empfängers ersetzt (Beers und Berkow 2000). Bei der allogenen Transplantation stammt das Gewebe von einem gesunden Spender. Dies kann ein eineiiger Zwilling (identical sibling twin), ein HLA-identisches Geschwisterkind (identical sibling), ein nicht HLA-identisches Familienmitglied (mismatched related donor) ein (haploidentischer Spender) oder ein unverwandter HLA-kompatibeler Spender sein. Das Hauptziel der allogenen Transplantation ist es, das erkrankte oder defekte hämatopoietische System, wie z. B. das Knochenmark des Empfängers, vollständig durch ein gesundes, funktionierendes hämatopoetisches System (u. a. Immunsystem) zu ersetzen. Die Stammzelltransplantation kann aber auch mit autologen, d. h. patienteneigenen Zellen erfolgen.
Spender (IdSib, MUD, Haploidente Spender)
Als Spender der ersten Wahl gilt ein hinsichtlich der relevanten Histokompatibilitäts-Antigene HLA-A, B, C, DRB1 und DQB1 identisches Geschwister (Identical Sibling = IdSib). Dieses kann allerdings in nur ca. 30% gefunden werden, so dass stattdessen oft ein HLA-identischer unverwandter Spender (matched unrelated donor, MUD) gesucht werden muss (Ottinger et al., 2001). Da bei weitem nicht alle Histokompatibilitäts-Antigene bekannt sind und auch nur eine begrenzte Zahl von Allelen getestet werden können, muss beim identischen Fremdspender von einer schlechteren Übereinstimmung als beim Geschwisterspender ausgegangen werden. Es bleibt immer noch ein beträchtlicher Teil ohne Spender. Für diese Patienten können verwandte Spender genutzt werden, die mit dem Empfänger nur in einem Haplotyp ihrer HLA-Allele übereinstimmen, also haploidentisch sind.
Transplantate von unverwandten Spendern (MUD) werden für hämatopoetische Stammzelltransplantationen am häufigsten verwendet (Blood. 2003 Feb 15; 101(4): 1630–6.)
MUD: Unmanipuliertes Transplantat
Bei unmanipulierten Transplantaten im MUD Setting ist die GvHD die Hauptkomplikation. Schwere Formen der GvHD sind als lebensbedrohlich einzustufen und erfordern eine massive Therapie mit immunsppressiven Substanzen, für die Ansprechraten von ca. 40% beschrieben werden (Vogelsang et al. 2003); die akute GvHD Grad II–IV: V: 33%; C: 51% und Grad III–IV: V: 11.7%; C: 24,5% (Finke et al. Lancet 2009).
Alternativ wurde CD34 angereichertes Transplantat im MUD Setting verwendet, um die GvHD zu reduzieren und die mit der notwendigen GvHD-Prophylaxe verwendeten Nebenwirkungen zu vermeiden. Nachteil ist die verzögerte Immunrekonstitution mit allen Folgen wie bereits erwähnt.
Eigentliche Transplantation
Die eigentliche Transplantation gliedert sich in zwei Phasen. Mit der Konditionierung durch Chemo- und/oder Strahlentherapie wird das Immunsystem des Empfängers zerstört, damit es das übertragene bzw. transplantierte Knochenmark bzw. die Stammzellen nicht abstößt, d. h. der Empfänger wird auf das Angehen des Transplantats vorbereitet. Je besser dies gelingt, desto geringer ist das Risiko eines Nichtanwachsens oder einer Abstoßung des Transplantates. Je nach Stärke der Konditionierung wird das Ziel verfolgt, im Patienten noch verbliebene leukämische oder bösartige Zellen zu vernichten. Die Transplantation erfolgt am Tag 0 intravenös. Bis zum Anwachsen (engraftment) des Transplantats und Abklingen der unmittelbaren Toxizitäten verbleibt der Patient in der Regel auf einer speziell eingerichteten Station. Nach Anwachsen des Transplantats und Abklingen der unmittelbaren Toxizitäten ist während der ersten 3 Monate eine enge Überwachung notwendig. Die Intensität der Überwachung hängt stark vom Spendertyp und den Komplikationen ab und geht kontinuierlich in die regelmäßige lebenslange Nachsorge über.
Indikationen
Alle Indikationen, die eine allogene Stammzelltransplantation erforderlich machen, können mit der erfindungsgemäßen Zellpopulation bzw. pharmazeutischen Zusammensetzung behandelt werden. Alle schweren angeborenen und erworbenen malignen und nichtmalignen Erkrankungen des hämatopoetischen Systems sind grundsätzlich Indikationen für eine allogene Stammzelltransplantation. Hinzu kommen maligne Erkrankungen, die auf eine Dosisintensivierung der Chemotherapie oder Strahlentherapie ansprechen.
Immunsuppressiva wie Ciclosporin, Kortikosteroide, Antimetabolite und monoklonale Antilymphozyten-Antikörper werden heute routinemäßig eingesetzt, um die GvHD besser kontrollieren zu können.
Depletion von TCRα/β⁺ Zellen
Die Depletion von TCRα/β+ ist z. B. in Chaleff et al., Cytotherapy, 2007, 9, 746–754 oder wie im Protokoll von Miltenyi Biotec beschrieben.
Kombinierte Depletion von TCRα/β⁺/CD19⁺ Zellen
Das Leukapherese-Produkt wird mit CliniMACS^® PBS/EDTA Buffer verdünnt (mit HSA bis zu einer Endkonzentration von 0.5% (w/v)) vor magnetischer Markierung. Das Leukaphereseprodukt wird bis zum 3-fachen Volumen des Leukaphereseprodukts verdünnt ohne ein Maximalvolumen von 600 ml zu überschreiten.
Die Zellen werden bei 200 × g für 15 min bei Raumtemperatur zentrifugiert (+19°C bis +25°C). Der Überstand wird verworfen. Das optimale Gewicht für das Labelling ist 88 g (±5 g). Das Pellet wird resuspendiert und das Gewicht bestimmt. Die Zellen werden mit CliniMACS^® TCRα/β-Biotin und mit CliniMACS^® CD19 Reagenz, ein Gefäß (7,5 ml) CliniMACS^® TCRα/β-Biotin und ein Gefäß (7,5 ml) CliniMACS^® CD19 gelabelt. Die Gefäße werden bei +2°C bis +8°C gelagert und kalt verwendet. Zellen und Reagenzien werden gemischt, die Inkubationszeit beträgt 30 min bei 25 rpm und Raumtemperatur (+19°C bis +25°C).
Leukapherese Produkt und Puffer werden gemischt und leicht bewegt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 300 × g für 15 min ohne Bremse bei Raumtemperatur (+19°C bis +25°C). Der Überstand wird verworfen. Das Pellet wird resuspendiert und gewaschen. Puffer wird hinzugefügt bis ca. 190 g Gewicht erreicht werden für das magnetische Labelling mit den TCRα/β-Biotin gelabelten Zellen mit dem CliniMACS® Anti-Biotin Reagenz. Die bei +2°C bis +8°C gekühlten (7,5 ml) CliniMACS^® Anti-Biotin Reagenzien werden den Zellen hinzugefügt, 30 min inkubiert bei leichtem Bewegen der Zellen bei 25 rpm und Raumtemperatur (+19°C bis +25°C).
Leukapherese Produkt und 500 ml Puffer werden leicht bewegt und gemischt, dann bei 300 × g für 15 min ohne Bremse bei Raumtemperatur (+19°C bis +25°C) zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, das Pellet resuspendiert bis 150 g erreicht sind. Es wird empfohlen, eine maximale Konzentration von 0,4 × 10⁹ Zellen pro ml einzuhalten.
Das Programm DEPLETION 3.1 auf dem CliniMACS^® plus Instrument wird gestartet und den Anweisungen gefolgt wie vom Hersteller Miltenyi Biotec GmbH angegeben. Nachdem die automatische Separation beendet ist, wird die Zellkonzentration bestimmt. Die Zellen sind nach der automatischen Separation TCR alpha/beta und CD19 mit ca. 3–5 Logstufen depletiert. Das so erhaltene TCR alpha/beta und CD19 depletierte Zellpräparat kann zur Transplantation verwendet werden, nachdem es in einer für die Tansplanation geeigneten Lösung aufgenommen wurde, die dem Fachmann bekannt ist.
Figuren
Fig. 1: Immunrekonstitution nach Stammzelltransplantation bis zum Erreichen von > 200 Zellen/μl.
Dargestellt ist die Immunrekonstitution bis zum Erreichen von > 200 cells/μl nach Transplantation von TCRαβ/CD19 depletierten peripheren Blutstammzellen (N = 11) im Vergleich zu CD34 angereicherten peripheren Blutstammzellen (historische Kontrolle, N = 13). Die Daten zur Immunrekonstitution nach Stammzelltransplantation mit CD34 angereicherten Zellen wurden der folgenden Publikation entnommen: Br J Haematol. 2001 Aug; 114(2): 422–32.
Fig. 2: GvHD nach Stammzelltransplantation
Inzidenz der akuten GvHD bei Patienten mit TCRαβ/CD19 depletierten haploidentischen Transplantaten. Vergleichsgruppen (historische Kontrollen): Patienten mit CD34 angereicherten haploidentischen Transplantaten und Patienten mit unmanipuliertem Knochenmark von identischen Fremdspendern und Methotrexat/CsA zur GvHD Prophylaxe. Die Daten der Vergleichsgruppen wurden aus Lang et al. 2007, Zeitschrift für Regenerative Medizin, Nr. 1: 32–39 entnommen. „Grade” = Stadium
Fig. 3: Analyse der T-Zell-Rezeptor β Repertoire Diversität zur Bestätigung der Thymus abhängigen T-Zell Rekonstitution
Exemplarisch dargestellt ist das Ergebnis der Analyse des TCRβ Repertoire Diversität durch CDR3 Spectratyping zur Messung der Thymus-abhängigen T-Zell Rekonstitution bei einem Patienten an Tag 12 und Tag 33. Die T-Zell-Rezeptor CDR3 Region ist die einzige nicht Keimbahn kodierte hypervariabele Region. Diese TCRαβ Region wird im Thymus u. a. durch Rekombination erzeugt. Die Methode ist in Bone Marrow Transplant. 2008 Oct; 42 Suppl 2: S54–9 beschrieben.
Fig. 4: T-Zell-Rezeptor Excision Circles (TRECs) im peripheren Blut zur Quantifizierung der aus dem Thymus stammenden T-Zellen
Exemplarisch dargestellt ist das Ergebnis der Bestimmung des T-Zell Rezeptor Excision Circles (TRECS) im peripheren Blut zur Bestätigung, dass T-Zellen nach Transplantation im Thymus produziert wurden. Diese Methode wurde in vielen Studien nach der Transplantation eingesetzt, um die Aktivität der Thymus abzuschätzen. Die Methode ist in Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2007 Aug 28; 87(32): 2265–7 beschrieben. „threshold cycle C(t)” = Grenzwertzyklus C(t), „not depleted” = nicht depletiert, „pre TX” = prä TX (Transplantation)
Fig. 5: Klinische Ergebnisse bei Kindern. Vergleichende Analyse der T-Zell-Regeneration eines Patienten.

1. Transplantat: Unmanipuliertes Knochenmark von MUD Spender (2008)
2. Transplantat: CD3/CD19 depletiertes PBSC der Mutter (2009)
3. Transplantat: TCRα/β/CD19 depletiertes PBSC des Vaters (9 Monate nach 2. Transplantation)

Die Graphen zeigen die Konzentration von (von links nach rechts) CD3 positiven Zellen, CD4 positiven Zellen und CD8 positiven Zellen zu verschienen Zeitpunkten nach Transplantation von Knochenmark (Zellen/Mikroliter).
Beispiel: Transplantation
Es wurden 11 Patienten transplantiert, 5 mit der Diagnose akute lymphatische Leukämie (ALL), 3 Patienten mit der Diagnose akute myeloide Leukämie (AML), 1 Patient mit der Diagnose Agranulocytose, 1 Patient mit der Diagnose beta-Thalassenämie, 1 Patient mit der Diagnose Inborn Error (HHS). 5 der Patienten hatten bereits eine Stammzelltransplantation zuvor erhalten, 3 weitere hatten bereits 2 bzw. 3 Stammzelltransplantationen erhalten.
Bei keinem Patienten erfolgte eine Immunsuppression nach Transplantation.
Beispiel: MUD Spender
Ein Patient mit beta-Thalassenämie, ein Patient mit ALL und ein Patient mit Inborn Error erhielt Spendermaterial von einem MUD-Spender mit einem TCR alpha/beta-depletierten und CD19-depletierten Zellpräparat.
Beispiel: chronische GvHD
Ein Patient, der Material von einem haploidenten Spender erhielt entwickelte eine chronische GvHD mit mildem Verlauf.
Kein Patient, der Material von einem MUD-Spender erhielt entwickelte eine chronische GvHD.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, aufweisend eine aus Knochenmark oder aus Blut erhaltbare Zellpopulation, wobei die Zellpopulation von TCR alpha/beta-positiven Zellen und von CD19-positiven Zellen depletiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, aufweisend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verfahren zur Herstellung einer Zellpopulation, aufweisend die folgenden Schritte: – Bereitstellen von Knochenmark oder Blut und – Depletion von TCR alpha/beta-positiven Zellen und von CD19-positiven Zellen aus der Zellpopulation.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Depletion von TCR alpha/beta positiven Zellen mittels eines Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragments gegen TCR alpha/beta erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Depletion von CD19-positiven Zellen mittels eines Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragments gegen CD19 erfolgt.