DE102010047427A1 - Selective protein quantification by multivariate evaluation of UV absorption spectra - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Quantifizierung einzelner Proteine in einem Proteingemisch. Dieses Verfahren basiert auf der Bestimmung der Einzelkonzentrationen der Proteine in dem Proteingemisch aus einem UV-Absorptionsspektrum des Proteingemisches. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein auf diesem Verfahren basierendes System zur selektiven Quantifizierung einzelner Proteine in einem Proteingemisch.The present invention relates to a method for the selective quantification of individual proteins in a protein mixture. This method is based on the determination of the individual concentrations of the proteins in the protein mixture from a UV absorption spectrum of the protein mixture. The present invention further relates to a system based on this method for the selective quantification of individual proteins in a protein mixture.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Quantifizierung einzelner Proteine in einem Proteingemisch. Dieses Verfahren basiert auf der Bestimmung der Einzelkonzentrationen der Proteine in dem Proteingemisch aus einem UV-Absorptionsspektrum des Proteingemisches. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein auf diesem Verfahren basierendes System zur selektiven Quantifizierung einzelner Proteine in einem Proteingemisch.The present invention relates to a method for the selective quantification of individual proteins in a protein mixture. This method is based on the determination of the individual concentrations of the proteins in the protein mixture from a UV absorption spectrum of the protein mixture. Furthermore, the present invention relates to a method based on this method for the selective quantification of individual proteins in a protein mixture.
Die meisten Proteine absorbieren aufgrund der aromatischen Strukturen der darin enthaltenen Aminosäuren Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin elektromagnetische Strahlung im mittleren ultravioletten Bereich (etwa 210 bis 300 nm). Die Absorptionsspektren dieser Aminosäuren weisen zwei Absorptionsmaxima auf, ein intensives Maximum im Bereich von 220 bis 230 nm und ein weniger intensives Maximum im Bereich von 250 bis 290 nm (vgl.
Für die präparative Aufreinigung von Proteinen, z. B. in der pharmazeutischen Industrie, wird sehr häufig Säulenchromatographie mit einer flüssigen mobilen Phase eingesetzt. Hierbei wird standardmäßig die erzielte chromatographische Auftrennung der Proteine mit Hilfe von UV-Absorptionsmessungen bei einer einzelnen Wellenlänge im mittleren UV-Bereich am Säulenausgang visualisiert bzw. analysiert.For the preparative purification of proteins, eg. As in the pharmaceutical industry, very often column chromatography is used with a liquid mobile phase. By default, the achieved chromatographic separation of the proteins is visualized or analyzed by means of UV absorption measurements at a single wavelength in the middle UV range at the column exit.
So erstellte Chromatogramme zeigen typischerweise die über das Elutionsvolumen aufgetragene UV-Absorption des Eluats bei einer bestimmten Wellenlänge, wobei diese UV-Absorption mit der Gesamtkonzentration aller Proteine im Eluat korreliert. Weitere prozessanalytische Parameter, die bei einem solchen Verfahren erfaßt werden können, sind beispielsweise pH-Wert, Leitfähigkeit und Temperatur des Eluats am Säulenausgang.Chromatograms prepared in this way typically show the UV absorption of the eluate at a specific wavelength, which is plotted via the elution volume, this UV absorption correlating with the total concentration of all proteins in the eluate. Further process analytical parameters which can be detected in such a process are, for example, the pH, conductivity and temperature of the eluate at the column outlet.
In der Entwicklung von Prozessen zur Proteinaufreinigung oder von Screeningverfahren werden in jüngerer Zeit vermehrt miniaturisierte Experimente automatisiert in Hochdurchsatzverfahren durchgeführt. Für die Auswertung solcher Experimente ist ebenfalls eine selektive Proteinquantifizierung notwendig. Geeignete analytische Verfahren hierfür müßten einen vergleichbaren Durchsatz haben und einfach zu automatisieren sein. Entsprechende analytische Meßverfahren, die auf der Basis photospektrometrischer Daten Proteingemische qualitativ und/oder quantitativ analysieren könnten, sind dabei im Stand der Technik nicht bekannt.In the development of processes for protein purification or of screening methods, increasingly miniaturized experiments are being carried out in automated manner in high-throughput methods recently. For the evaluation of such experiments also a selective protein quantification is necessary. Suitable analytical procedures for this would have to have comparable throughput and be easy to automate. Corresponding analytical measuring methods which could qualitatively and / or quantitatively analyze protein mixtures on the basis of photospektrometric data are not known in the prior art.
Der Begriff „selektive Proteinanalytik” deckt Verfahren ab, die in der Lage sind, die verschiedenen Proteine, die in einer Probe vorhanden sind, gleichzeitig nachzuweisen und gegebenenfalls zu quantifizieren. Für die selektive Analytik komplexer Mehrkomponentengemische, die keine Proteine enthalten, sind im Stand der Technik Verfahren bekannt, die multivariate Kalibrierungsmethoden verwenden, um anhand von Spektraldaten die Zusammensetzung dieser komplexen Gemische zu bestimmen. Solche Verfahren wurden allerdings bisher nicht für Proteingemische verwendet, da die Unterschiede zwischen den UV-Absorptionsspektren verschiedener Proteine als zu gering erachtet wurden, um multivariate Kalibrierungsmethoden erfolgreich auf komplexe Proteingemische anwenden zu können.The term "selective protein analysis" covers processes that are capable of simultaneously detecting and possibly quantifying the various proteins present in a sample. For the selective analysis of complex multicomponent mixtures that do not contain any proteins, methods are known in the art which use multivariate calibration methods to determine the composition of these complex mixtures on the basis of spectral data. However, such methods have not previously been used for protein mixtures because the differences between the UV absorption spectra of various proteins were considered too low to successfully apply multivariate calibration methods to complex protein mixtures.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, ein einfaches und schnelles Verfahren zur selektiven Quantifizierung einzelner Proteine in einem Proteingemisch bereitzustellen. Dieses Verfahren soll die Nachteile bestehender Verfahren überwinden können. Insbesondere soll das Verfahren ohne aufwendige Probenvorbereitung auskommen, leicht zu automatisieren sein und eine schnelle Analytik von Proteingemischen ermöglichen.The present invention is therefore based on the object to provide a simple and rapid method for the selective quantification of individual proteins in a protein mixture. This method is intended to overcome the disadvantages of existing methods. In particular, the method should be able to do without complicated sample preparation, be easy to automate and enable rapid analysis of protein mixtures.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.This object is achieved by the embodiments of the present invention characterized in the claims.
Dementsprechend betrifft ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur selektiven Quantifizierung einzelner Proteine in einem Proteingemisch, umfassend die Schritte:
- (a) Erstellen eines UV-Absorptionsspektrums des Proteingemisches, und
- (b) Bestimmen der Einzelkonzentration zumindest eines Proteins in dem Proteingemisch aus dem in Schritt (a) erstellten UV-Absorptionsspektrum.
- (a) establishing a UV absorption spectrum of the protein mixture, and
- (b) determining the single concentration of at least one protein in the protein mixture from the UV absorption spectrum prepared in step (a).
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden Nachteile von bestehenden Verfahren zur selektiven Proteinanalytik, wie Massenspektrometrie, Gelelektrophorese und Kapillarelektrophorese überwunden. Beispielsweise ist zur Durchführung der genannten herkömmlichen Verfahren meist eine mehr oder weniger aufwendige Probenvorbereitung von Nöten. Die dadurch bedingte Dauer der Analysen und die mangelhafte Automatisierung macht jedoch eine Anwendung auf dem Gebiet der Hochdurchsatz-basierten Prozessentwicklung bzw. -analytik schwierig, wenn nicht unmöglich. Diese Schwierigkeit wird durch das erfindungsgemäße Verfahren überwunden.In accordance with the present invention, disadvantages of existing methods for selective protein analysis such as mass spectrometry, gel electrophoresis and capillary electrophoresis have been overcome. For example, a more or less complex sample preparation is usually necessary for carrying out the aforementioned conventional methods. However, the resulting duration of analysis and poor automation make it difficult, if not impossible, to apply high-throughput process development analytics. This difficulty is overcome by the method according to the invention.
Ein weiteres herkömmliches Verfahren zur selektiven Proteinanalytik, die analytische Chromatographie, läßt sich zwar in vielen Fällen ohne Probenvorbereitung durchführen, ist jedoch gerätebedingt ein sequentiell durchgeführtes Verfahren, wodurch sich sehr lange Analysenzeiten ergeben können, welche den zeitlichen Gewinn bei Hochdurchsatz-Experimenten wieder zunichte machen.Although another conventional method for selective protein analysis, analytical chromatography, can be performed in many cases without sample preparation, it is a sequentially performed procedure due to the device, which can result in very long analysis times, which nullify the time gain in high-throughput experiments.
Schließlich existieren Verfahren auf dem Gebiet der selektiven Proteinanalytik, deren Anwendung auf Proteine beschränkt ist, die eine spezifische Absorption bei bestimmten Wellenlängen aufweisen (z. B. Cytochrom C oder Green Fluorescent Protein (GFP)). Dabei wird herkömmlicher Wiese die Absorption bei diesen bestimmten Wellenlängen für die selektive Quantifizierung verwendet. Eine generelle Anwendbarkeit, wie dies durch die vorliegende Erfindung ermöglicht wird, ist bei solchen herkömmlichen Verfahren allerdings nicht gegeben.Finally, there are methods in the field of selective protein analysis limited to proteins having specific absorption at specific wavelengths (eg, cytochrome C or green fluorescent protein (GFP)). Conventionally, absorption at these particular wavelengths is used for selective quantification. A general applicability, as is made possible by the present invention, however, is not given in such conventional methods.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist diese Nachteile nicht mehr auf. Insbesondere bedarf das erfindungsgemäße Verfahren keiner Probenvorbereitung, was eine schnelle und leicht zu automatisierende selektive Proteinanalytik ermöglicht.The inventive method no longer has these disadvantages. In particular, the method according to the invention requires no sample preparation, which allows a fast and easy to automate selective protein analysis.
Der Begriff „selektive Quantifizierung” bezeichnet die Bestimmung der Einzelkonzentrationen eines, mehrerer oder aller Proteine in dem Proteingemisch nach ihrer jeweiligen Art. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt (b) die Einzelkonzentrationen eines, mehrerer oder aller Proteine in dem Proteingemisch bestimmt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist damit in der Lage, nicht lediglich die Gesamtkonzentration aller Proteine in der Gesamtheit, sondern die Einzelkonzentrationen der jeweiligen Proteine zu bestimmen.The term "selective quantification" denotes the determination of the individual concentrations of one, several or all proteins in the protein mixture according to their respective species. In a preferred embodiment of the method according to the invention, in step (b) the individual concentrations of one, several or all proteins in the protein mixture are determined , The method according to the invention is thus able to determine not only the total concentration of all proteins in the whole, but the individual concentrations of the respective proteins.
Verfahren zum Erstellen von UV-Absorptionsspektren sind dem Fachmann bekannt und umfassen die Verwendung eines UV-Detektors, beispielsweise eines Dioden-basierten UV-Detektors.Methods for generating UV absorption spectra are known to those skilled in the art and include the use of a UV detector, for example a diode-based UV detector.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden kontinuierliche UV-Absorptionsspektren erstellt. Der Begriff „kontinuierliches UV-Spektrum” bezeichnet UV-Spektren, welche die UV-Absorption über einen bestimmten Wellenlängenbereich in angemessener Auflösung, beispielsweise in 10 nm-, bevorzugt in 5 nm-, mehr bevorzugt in 1 nm-Schritten, erfassen, wobei sich die Auflösung über den gemessenen Wellenlängenbereich ändern kann. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform besteht in der Nutzung von diskontinuierlichen Absorptionsspektren, wobei die Auflösung nicht über den gesamten Wellenlängenbereich vorliegen muss. Beispielsweise können nur zehn UV-Spektren, bevorzugt nur fünf UV-Spektren, mehr bevorzugt nur drei UV-Spektren gemessen werden.In a preferred embodiment of the method according to the invention continuous UV absorption spectra are created. The term "continuous UV spectrum" refers to UV spectra which detect UV absorption over a certain wavelength range in appropriate resolution, for example in 10 nm, preferably 5 nm, more preferably 1 nm, steps can change the resolution over the measured wavelength range. A further preferred embodiment consists in the use of discontinuous absorption spectra, wherein the resolution does not have to be present over the entire wavelength range. For example, only ten UV spectra, preferably only five UV spectra, more preferably only three UV spectra can be measured.
Erfindungsgemäß wurde erkannt, daß sich die UV-Absorptionsspektren verschiedener Proteine unterscheiden, insbesondere wurde erkannt, daß sich die Formen der Absorptionsspektren der individuellen Proteine unterscheiden (vgl.
In anderen Worten wurde erfindungsgemäß erkannt, die Unterschiede in den Absorptionsspektren verschiedener Proteingemische ausreichen, daß die Einzelkonzentration zumindest eines Proteins des Proteingemisches, insbesondere aller Proteine des Proteingemisches bestimmt, insbesondere berechnet werden können. In other words, it has been recognized according to the invention that the differences in the absorption spectra of different protein mixtures are sufficient to enable the individual concentration of at least one protein of the protein mixture, in particular of all proteins of the protein mixture, to be determined in particular.
Dementsprechend wird in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens Schritt (b), also das Bestimmen der Einzelkonzentration der Proteine in dem Proteingemisch aus dem in Schritt (a) erstellten UV-Absorptionsspektrum, mit Hilfe eines multivariaten Kalibrierungsmodells durchgeführt.Accordingly, in a preferred embodiment of the method according to the invention, step (b), ie the determination of the individual concentration of the proteins in the protein mixture from the UV absorption spectrum prepared in step (a), is carried out with the aid of a multivariate calibration model.
Bevorzugt wird das multivariate Kalibrierungsmodell gemäß der vorliegenden Erfindung auf Grundlage von UV-Absorptionsspektren von Proben erstellt, die bekannte Proteine in bekannten Konzentration enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten die Kalibrierungsproben jeweils nur ein Protein in bekannter Konzentration. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden aus den UV-Absorptionsspektren der jeweils nur ein Protein in bekannter Konzentration enthaltenden Kalibrierungsproben durch Linearkombinationen Mischspektren erzeugt, die für die Erstellung des multivariaten Kalibrierungsmodells verwendet werden. Verfahren für das Erzeugen von Mischspektren aus den UV-Absorptionsspektren von jeweils nur ein Protein in bekannter Konzentration enthaltenden Kalibrierungsproben durch Linearkombinationen sind dem Fachmann bekannt. Vorteile einer solchen Vorgehensweise sind eine verbesserte Genauigkeit des Verfahrens, da Ungenauigkeiten beim Generieren der Proteinproben, z. B. durch fehlerhaftes Pipettieren, minimiert werden können. Außerdem wird nur eine kleine Menge der oft seht teuren und schwer zugänglichen Proteine benötigt.Preferably, the multivariate calibration model according to the present invention is prepared based on UV absorption spectra of samples containing known proteins in known concentration. In a preferred embodiment of the method according to the invention, the calibration samples each contain only one protein in known concentration. In a further preferred embodiment, mixed spectra are generated from the UV absorption spectra of the calibration samples, each containing only one protein in a known concentration, by linear combinations, which are used for the preparation of the multivariate calibration model. Methods for generating mixed spectra from the UV absorption spectra of calibration samples containing only one protein in known concentration by linear combinations are known to those skilled in the art. Advantages of such a procedure are an improved accuracy of the method, since inaccuracies in generating the protein samples, eg. B. by incorrect pipetting can be minimized. In addition, only a small amount of often very expensive and difficult to access proteins is needed.
Der Begriff ”multivariates Kalibrierungsmodell” bezeichnet im Allgemeinen Modelle mit deren Hilfe mehrere miteinander in Zusammenhang stehende statistische Variablen gleichzeitig untersucht werden können. Dabei können Zusammenhänge und Abhängigkeitsstrukturen zwischen den Variablen erkannt werden. Ein multivariates Kalibrierungsmodell verknüpft dabei die Beziehung zwischen mehreren Eingangsvariablen mit einer oder mehreren Zieleigenschaft(en). In manchen Fällen ist der Vorteil einer multivariaten Kalibrierung ein robusteres Modell. In anderen Fällen kann die Zieleigenschaft überhaupt nur untersucht werden, wenn mehrere Variablen gemessen werden. Im Fall der vorliegenden Erfindung sind die Eingangsvariablen die spektralen Daten der aufgenommenen UV-Absorptionsspektren, und die Zieleigenschaften sind die Konzentrationen der in dem Proteingemisch enthaltenen jeweiligen Proteine. Im Weiteren werden die Eingangsdaten als X-Daten und die Zieleigenschaften als Y-Daten bezeichnet.The term "multivariate calibration model" generally refers to models by which several interrelated statistical variables can be examined simultaneously. In the process, relationships and dependency structures between the variables can be identified. A multivariate calibration model combines the relationship between multiple input variables with one or more target properties. In some cases, the benefit of multivariate calibration is a more robust model. In other cases, the objective property can only be examined if several variables are measured. In the case of the present invention, the input variables are the spectral data of the recorded UV absorption spectra, and the target properties are the concentrations of the respective proteins contained in the protein mixture. In the following, the input data are referred to as X data and the target properties as Y data.
Multilineare Regression (MLR) ist ein klassisches statistisches Verfahren für die multivariate Kalibrierung. Ein auf MLR basierendes Kalibrierungsmodell besteht aus einer linearen Gleichung, in der jede Variable der X-Daten mit einer Gewichtung multipliziert wird. Allerdings ist MLR bekannt dafür, empfindlich gegenüber Kollinearität zu sein. Kollinearität zwischen den gemessenen Variablen kann immer auftreten, wenn die Anzahl der gemessenen Variablen die Anzahl der in der Kalibrierung enthaltenen Proben übersteigt. Weiter ist Kollinearität inhärent in spektralen Daten enthalten, da diese nicht aus unabhängigen Variablen bestehen. Die Hauptkomponentenanalyse (principal component analysis, PCA) ist ein Verfahren, das verwendet wird, um die signifikante Varianz innerhalb von X-Daten zu finden, die aus nicht-unabhängigen Variablen bestehen. Durch sie werden die X-Daten in ein neues (Haupt-)Achsensystem transformiert. Dies geschieht auf solche Weise, daß die Transformation auf diese Achsen die größtmögliche Varianz in dem Datensatz widerspiegelt. Diese neuen Variablen werden als latente Variablen bezeichnet. Auf diese Weise können unabhängige latente Variablen aus den ursprünglichen X-Daten (also den Absorptionsspektren) erzeugt werden, und verwendet werden, um ein Kalibrierungsmodell mittels MLR zu erzeugen, mit dessen Hilfe die Y-Daten (also die spezifischen Proteinkonzentrationen) vorhergesagt werden können. Allerdings ist, wenn das PCA-Verfahren verwendet wird, um latente Variablen zu finden, das einzige Kriterium die Menge der beschreibbaren Varianz. Da es keine Garantie dafür geben kann, daß diese Variablen mit den Zieleigenschaften korrelieren, kann das Verwenden von PCA für die multivariate Kalibrierung zu suboptimalen Kalibrierungen führen. Dieses Problem wird durch Verwenden der PLS-Regression gelöst, da diese die latenten Variablen der X-Daten basierend auf zwei Kriterien extrahiert, nämlich beschriebene Varianz und Korrelation mit den Y-Daten. Im Zusammenhang mit PLS werden die latenten Variablen als Komponenten bezeichnet.Multilinear regression (MLR) is a classical statistical technique for multivariate calibration. An MLR-based calibration model consists of a linear equation in which each variable of the X data is multiplied by a weight. However, MLR is known to be sensitive to collinearity. Collinearity between the measured variables can always occur if the number of measured variables exceeds the number of samples included in the calibration. Furthermore, collinearity is inherent in spectral data, as it does not consist of independent variables. Principal component analysis (PCA) is a technique used to find the significant variance within X data consisting of non-independent variables. They transform the X data into a new (main) axis system. This is done in such a way that the transformation to these axes reflects the largest possible variance in the data set. These new variables are called latent variables. In this way, independent latent variables can be generated from the original X data (ie, the absorption spectra) and used to generate a calibration model using MLR, which can be used to predict the Y data (ie, specific protein concentrations). However, if the PCA method is used to find latent variables, the only criterion is the set of writable variance. Since there can be no guarantee that these variables will correlate with the target properties, using PCA for multivariate calibration may result in suboptimal calibrations. This problem is solved by using the PLS regression because it extracts the latent variables of the X data based on two criteria, namely described variance and correlation with the Y data. In the context of PLS, the latent variables are called components.
Der Begriff „PLS-Regression” bezeichnet das beschriebene statistische Regressionsverfahren, das oftmals als partial least square Regression, richtiger aber als projection to latent structure Regression bezeichnet wird. Das Akronym „PLS” kann somit beide Bedeutungen haben, wobei das bezeichnete statistische Regressionsverfahren in jedem Fall dasselbe ist. Die PLS-Regression bietet im Vergleich zu anderen multivariaten Kalibrierungsansätzen, wie z. B. der multilinearen Regression, eine höhere Robustheit gegenüber Meßfehlern.The term "PLS regression" refers to the described statistical regression method, often referred to as partial least square regression, but more correctly as projection to latent structure regression. The acronym "PLS" can thus have both meanings, with the designated statistical regression method being the same in each case. The PLS regression provides compared to other multivariate calibration approaches, such as. As the multilinear regression, a higher robustness to measurement errors.
Multivariate Kalibrierungsmodelle, die in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind dem Fachmann bekannt. Erfindungsgemäß wurde erkannt, daß zur Bestimmung der Einzelkonzentration zumindest eines Proteins in einem Proteingemisch beispielsweise Kalibrierungsmodelle eingesetzt werden können, die mit Hilfe eines MCR (Multivariate Curve Resolution) genannten Verfahrens, multilinearer Regression oder PLS-Regression erstellt werden. Multivariate calibration models which can be used in conjunction with the method according to the invention are known to the person skilled in the art. According to the invention, it has been recognized that for the determination of the individual concentration of at least one protein in a protein mixture, for example, calibration models can be used which are created with the aid of an MCR (Multivariate Curve Resolution) method, multilinear regression or PLS regression.
Dementsprechend wird in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens das multivariate Kalibrierungsmodell mit Hilfe eines statistischen Verfahrens, ausgewählt aus der Gruppe der Methoden zur multivariaten Kalibrierung, insbesondere bestehend aus Multivariate Curve Resolution (MCR), partial least square (PLS)-Regression und Multilinearer Regression (MLR), erstellt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das statistische Verfahren die PLS-Regression.Accordingly, in a preferred embodiment of the inventive method, the multivariate calibration model using a statistical method selected from the group of methods for multivariate calibration, in particular consisting of Multivariate Curve Resolution (MCR), partial least square (PLS) regression and multilinear regression ( MLR). In a particularly preferred embodiment, the statistical method is PLS regression.
Die Berechnung multivariater Kalibrierungsmodelle und ihre Anwendung sind oft sehr aufwendig und werden daher meist computergestützt durchgeführt. Geeignete Software-Pakete, die auch in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise das auf MATLAB basierende Paket „PLS Toolbox” (EigenVector, USA).The calculation of multivariate calibration models and their application are often very expensive and are therefore usually computer-aided. Suitable software packages which can also be used in conjunction with the method according to the invention are known to the person skilled in the art and include, for example, the MATLAB-based package "PLS Toolbox" (EigenVector, USA).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird, basierend auf Spektren von Proben bekannter Zusammensetzung bezüglich Protein und Konzentration, ein Kalibrierungsmodell mit Hilfe der PLS-Regression erstellt. Mit diesem Modell können in Proteingemischen unbekannter Zusammensetzung die Einzelkonzentrationen der vorhandenen Proteine anhand des UV-Absorptionsspektrums des jeweiligen Proteingemisches bestimmt werden.According to a preferred embodiment of the inventive method, based on spectra of samples of known composition in terms of protein and concentration, a calibration model using the PLS regression is created. With this model, protein concentrations of unknown composition can be used to determine the individual concentrations of the proteins present based on the UV absorption spectrum of the respective protein mixture.
Dabei stammt in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens das Proteingemisch aus einer Säulenchromatographie. Das Erstellen des UV-Spektrums erfolgt dabei bevorzugt am Säulenausgang, wobei bevorzugt mindestens ein UV-Spektrum alle zehn Sekunden, mehr bevorzugt mindestens ein UV-Spektrum pro Sekunde, mehr bevorzugt mindestens vier UV-Spektren pro Sekunde erstellt werden. Es ist auch möglich, daß zwischen 1 und 20 UV-Spektren pro Sekunde, beispielsweise zwischen 2 und 10 UV-Spektren pro Sekunde, insbesondere zwischen 4 und 7 UV-Spektren pro Sekunde am Säulenausgang erstellt werden.In a preferred embodiment of the process according to the invention, the protein mixture originates from a column chromatography. The creation of the UV spectrum is preferably carried out at the column outlet, wherein preferably at least one UV spectrum every ten seconds, more preferably at least one UV spectrum per second, more preferably at least four UV spectra per second are created. It is also possible that between 1 and 20 UV spectra per second, for example, between 2 and 10 UV spectra per second, in particular between 4 and 7 UV spectra per second are created at the column output.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Säulenchromatographie eine präparative Säulenchromatographie. Säulenchromatographische Verfahren, die in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt.In a preferred embodiment, column chromatography is preparative column chromatography. Column chromatographic methods that can be used in conjunction with the method of the invention are known to those skilled in the art.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens stammt das Proteingemisch aus einem Hochdurchsatzverfahren, wobei bevorzugt mindestens ein UV-Spektrum alle zehn Sekunden, mehr bevorzugt mindestens ein UV-Spektrum pro Sekunde, mehr bevorzugt mindestens vier UV-Spektren pro Sekunde erstellt werden. Es ist auch möglich, daß zwischen 1 und 20 UV-Spektren pro Sekunde, beispielsweise zwischen 2 und 10 UV-Spektren pro Sekunde, insbesondere zwischen 4 und 7 UV-Spektren pro Sekunde erstellt werden. Hochdurchsatzverfahren, die in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt.In a further preferred embodiment of the process according to the invention, the protein mixture originates from a high-throughput process, wherein preferably at least one UV spectrum is produced every ten seconds, more preferably at least one UV spectrum per second, more preferably at least four UV spectra per second. It is also possible that between 1 and 20 UV spectra per second, for example, between 2 and 10 UV spectra per second, in particular between 4 and 7 UV spectra per second are created. High throughput processes which can be used in conjunction with the process of the invention are known to those skilled in the art.
Ein Nachteil herkömmlicher Verfahren zur Analyse chromatographischer Auftrennungen von Proteinen ist die fehlende Möglichkeit, die Proteine im Eluat selektiv, d. h. ihrer jeweiligen Art nach, zu bestimmen. Daher kann die genaue Zusammensetzung des Eluats, sowie die Einzelkonzentrationen bzw. die Mengen der einzelnen darin enthaltenen Proteine nicht zeitnah bestimmt werden. Vielmehr müssen erst die gesammelten Fraktionen des Eluats analysiert werden, wodurch nachstehende Prozesschritte verzögert werden. Ebenso ist eine optimale Fraktionierung des Zielproteins, unabhängig davon ob Reinheit oder Ausbeute des Proteins die relevante Zielgröße ist, nicht möglich.A disadvantage of conventional methods for analyzing chromatographic separations of proteins is the inability to selectively label the proteins in the eluate; H. their respective nature. Therefore, the exact composition of the eluate, as well as the individual concentrations or the amounts of the individual proteins contained therein can not be determined promptly. Rather, the collected fractions of the eluate first have to be analyzed, which delays the following process steps. Likewise, optimal fractionation of the target protein, irrespective of whether the purity or yield of the protein is the relevant target, is not possible.
Dagegen ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zum selektiven Nachweis von Proteinen in einem Proteingemisch möglich, zeitgleich zur Elution die Reinheit des Zielproteins im Eluat zu bestimmen. Somit ist eine deutlich verbesserte Grundlage für die Fraktionierung des Eluats im Hinblick auf eine kontrollierbare Reinheit oder Ausbeute geschaffen.In contrast, with the method according to the invention for the selective detection of proteins in a protein mixture, it is possible to determine the purity of the target protein in the eluate at the same time as the elution. Thus, a significantly improved basis for the fractionation of eluate in terms of controllable purity or yield is provided.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt das zu untersuchende Proteingemisch N verschiedene Proteine, wobei N eine natürliche Zahl und bevorzugt N ≥ 2 oder N ≥ 3 oder N ≥ 5 oder N ≥ 7 oder N ≥ 10 und/oder N ≤ 100 und/oder N ≤ 50 und/oder N ≤ 30 und/oder N ≤ 20 ist. Beispielsweise kann für N gelten: N ∊ [2, 10] oder N ∊ [3, 10] oder N 〉 [4, 7]. Insbesondere kann für N gelten: N = 2 oder N = 3 oder N = 4 oder N = 5 oder N = 6 oder N = 7 oder N = 8 oder N = 9 oder N = 10, etc.In a further preferred embodiment of the method according to the invention, the protein mixture to be examined comprises N different proteins, where N is a natural number and preferably N ≥ 2 or N ≥ 3 or N ≥ 5 or N ≥ 7 or N ≥ 10 and / or N ≤ 100 and / or N ≤ 50 and / or N ≤ 30 and / or N ≤ 20. For example, for N, N ε [2, 10] or N ε [3, 10] or N> [4, 7]. In particular, for N, N = 2 or N = 3 or N = 4 or N = 5 or N = 6 or N = 7 or N = 8 or N = 9 or N = 10, etc.
Dabei enthält in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens das zu untersuchende Proteingemisch kein dem multivariaten Kalibrierungsmodell unbekanntes Protein, bzw. kein Protein, das bei der Erstellung des multivariaten Kalibrierungsmodells nicht berücksichtigt wurde. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält das zu untersuchende Proteingemisch dem multivariaten Kalibrierungsmodell unbekannte Proteine zu einem Anteil von höchstens 30% (w/v), mehr bevorzugt höchstens 10% (w/v), und am meisten bevorzugt höchstens 1% (w/v). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedarf das erfindungsgemäße Verfahren keinerlei Probenvorbereitung.In this case, in a preferred embodiment of the method according to the invention, the protein mixture to be investigated contains no protein unknown to the multivariate calibration model, or no protein that was not taken into account in the preparation of the multivariate calibration model. In a further preferred embodiment of the method according to the invention, the protein mixture to be investigated contains unknown proteins to the multivariate calibration model in a proportion of at most 30% (w / v), more preferably at most 10% (w / v), and most preferably at most 1% ( w / v). In a further preferred embodiment, the method according to the invention does not require any sample preparation.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das UV-Spektrum in einem mittleren ultravioletten Bereich, mehr bevorzugt in einem Bereich von etwa 210 nm bis etwa 300 nm Wellenlänge, am meisten bevorzugt in einem Bereich von etwa 240 nm bis etwa 300 nm Wellenlänge erstellt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das UV-Spektrum in einem Wellenlängenbereich erstellt, welcher den Bereich zwischen 240 nm und 300 nm beinhaltet oder Teile davon umfasst, beispielsweise im Bereich zwischen 220 nm und 300 nm, 230 nm und 300 nm, 250 nm und 300 nm, 260 nm und 300 nm, 220 nm und 280 nm, 240 nm und 280 nm oder 250 nm und 290 nm. Dabei ist das Spektrum bevorzugt ein kontinuierliches oder diskontinuierliches UV-Absorptionsspektrum. Das UV-Absorptionsspektrum wird in einer bevorzugten Ausführungsform mit Hilfe eines Dioden-basierten Detektors erstellt. Solche Geräte sind in der Lage, mehrere Spektren pro Sekunde aufzunehmen. Geeignete Detektoren sind dem Fachmann bekannt.In a further preferred embodiment of the method according to the invention, the UV spectrum is produced in a middle ultraviolet range, more preferably in a range of about 210 nm to about 300 nm wavelength, most preferably in a range of about 240 nm to about 300 nm wavelength , In a further preferred embodiment, the UV spectrum is produced in a wavelength range which includes or comprises parts between 240 nm and 300 nm, for example in the range between 220 nm and 300 nm, 230 nm and 300 nm, 250 nm and 300 nm, 260 nm and 300 nm, 220 nm and 280 nm, 240 nm and 280 nm or 250 nm and 290 nm. The spectrum is preferably a continuous or discontinuous UV absorption spectrum. The UV absorption spectrum is created in a preferred embodiment with the aid of a diode-based detector. Such devices are capable of recording multiple spectra per second. Suitable detectors are known to the person skilled in the art.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Verfahren automatisiert durchgeführt.In a preferred embodiment of the method according to the invention, the method is carried out automatically.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein System zur selektiven Quantifizierung einzelner Proteine in einem Proteingemisch, umfassend:
- (a) Mittel für eine säulenchromatographische Trennung eines Proteingemisches,
- (b) einen Detektor, insbesondere einen Dioden-basierten UV-Detektor, der am Säulenausgang angeordnet ist, und
- (c) Mittel für die automatische Verarbeitung der von dem UV-Detektor erstellten UV-Absorptionsspektren und die Bestimmung der Konzentration der einzelnen Proteine in dem Proteingemisch aus diesen UV-Absorptionsspektren mit Hilfe eines multivariaten Kalibrierungsmodells und eines geeigneten statistischen Verfahrens.
- (a) means for a column chromatographic separation of a protein mixture,
- (B) a detector, in particular a diode-based UV detector, which is arranged at the column exit, and
- (c) means for automatically processing the UV absorption spectra produced by the UV detector and determining the concentration of the individual proteins in the protein mixture from these UV absorption spectra using a multivariate calibration model and a suitable statistical method.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein System zur selektiven Quantifizierung einzelner Proteine in Proteingemischen, umfassend:
- (a) Mittel für die automatisierte Handhabung von Multi-Well-Platten, welche die Proteingemische enthalten,
- (b) einen Detektor, insbesondere einen Dioden-basierten UV-Detektor, der oberhalb oder unterhalb der Multi-Well-Platten angeordnet ist, und
- (c) Mittel für die automatische Verarbeitung der von dem Detektor erstellten UV-Absorptionsspektren und die Bestimmung der Konzentration der einzelnen Proteine in den Proteingemischen aus diesen UV-Absorptionsspektren mit Hilfe eines multivariaten Kalibrierungsmodells und eines geeigneten statistischen Verfahrens.
- (a) means for the automated handling of multi-well plates containing the protein mixtures,
- (B) a detector, in particular a diode-based UV detector, which is arranged above or below the multi-well plates, and
- (c) means for automatically processing the UV absorption spectra produced by the detector and determining the concentration of the individual proteins in the protein mixtures from these UV absorption spectra using a multivariate calibration model and a suitable statistical method.
Mittel für eine säulenchromatographische Trennung eines Proteingemisches sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise geeignete Säulen, Säulenmaterialien, Pumpen, Sammler, mobile Phasen, Fluidik, Steuer- und Kontrolleinrichtungen. Mittel für die automatisierte Handhabung von Multi-Well-Platten sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und umfassen beispielsweise übliche Plattenlesegeräte. Die Systeme können insbesondere auch ein oder mehrere Quellen elektromagnetischer Strahlung, insbesondere eine UV-Quelle beinhalten oder damit funktional verbunden sein. Geeignete Dioden-basierte UV-Detektoren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Zusätzlich oder alternativ ist es auch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren bei anderen Wellenlängen als der Wellenlänge des UV zu verwenden. Entsprechend kann das System andere bzw. zusätzliche Quellen elektromagnetischer Strahlung und entsprechende Detektor(en) aufweisen.Compositions for a column chromatographic separation of a protein mixture are known to those skilled in the art and include, for example, suitable columns, column materials, pumps, collectors, mobile phases, fluidics, control and monitoring equipment. Means for the automated handling of multi-well plates are also known in the art and include, for example, conventional plate readers. In particular, the systems may also contain or be functionally connected to one or more sources of electromagnetic radiation, in particular a UV source. Suitable diode-based UV detectors are also known to the person skilled in the art. Additionally or alternatively, it is also possible to use the method according to the invention at wavelengths other than the wavelength of the UV. Accordingly, the system may include other or additional sources of electromagnetic radiation and corresponding detector (s).
Mittel für die automatische Verarbeitung der von dem UV-Detektor erstellten UV-Absorptionsspektren und die Bestimmung der Konzentration der einzelnen Proteine in dem Proteingemisch aus diesen UV-Absorptionsspektren mit Hilfe eines multivariaten Kalibrierungsmodells sind dem Fachmann ebenfalls bekannt, und umfassen beispielsweise geeignete Computer in Verbindung mit geeigneter Software. Geeignete Software-Pakete, die in diesem Zusammenhang eingesetzt werden können, sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise das auf MATLAB basierende Paket „PLS Toolbox” (EigenVector, USA).Means for automatically processing the ultraviolet absorption spectra produced by the UV detector and determining the concentration of the individual proteins in the protein mixture from these ultraviolet absorption spectra using a multivariate calibration model are also known to those skilled in the art and include, for example, suitable computers in conjunction with suitable software. Suitable software Packages which can be used in this context are known to the person skilled in the art and include, for example, the MATLAB-based package "PLS Toolbox" (EigenVector, USA).
Anhand der vorliegenden Erfindung konnte überraschend gezeigt werden, daß die Unterschiede zwischen den UV-Absorptionsspektren verschiedener Proteine groß genug sind, um mit Hilfe multivariater Kalibrierungsmethoden aus UV-Absorptionsspektren komplexer Proteingemische die Einzelkonzentrationen der enthaltenen Proteine zu bestimmen. Bislang wurde in der Fachwelt angenommen, daß dies nicht möglich ist.The present invention surprisingly showed that the differences between the UV absorption spectra of different proteins are large enough to determine the individual concentrations of the proteins contained by means of multivariate calibration methods from UV absorption spectra of complex protein mixtures. So far, it has been assumed in the art that this is not possible.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht insbesondere eine schnelle Analytik von Proteingemischen, z. B. des Eluats einer säulenchromatographischen Proteinaufreinigung, wodurch eine oft zeit- und kostenaufwendige nachgeschaltete Proteinanalytik überflüssig wird. Insbesondere kann hierbei durch die mit der Elution gleichzeitig stattfindende Bestimmung der Einzelkonzentrationen der im Eluat enthaltenen Proteine eine optimale Fraktionierung des Eluats unmittelbar erfolgen, da eine nachgeschaltete Proteinanalytik überflüssig wird. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet weiter die Möglichkeit, Proteine in wäßriger Lösung schnell und automatisiert durch das Erstellen eines UV-Absorptionsspektrums und die Verknüpfung der so gewonnenen spektralen Informationen mit selektiven Proteinkonzentrationen über eine multivariate Kalibrierung zu quantifizieren, ohne daß eine Vorbereitung der Proben nötig wäre.The inventive method allows in particular a rapid analysis of protein mixtures, z. As the eluate of a column chromatographic protein purification, whereby an often time-consuming and costly downstream protein analysis is unnecessary. In particular, optimal determination of the eluate can be effected directly by the determination of the individual concentrations of the proteins contained in the eluate, which takes place simultaneously with the elution, since downstream protein analysis becomes superfluous. The method of the invention further provides the ability to rapidly and automatically quantify proteins in aqueous solution by creating a UV absorption spectrum and linking the spectral information thus obtained to selective protein concentrations via a multivariate calibration without the need for sample preparation.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in vielfältiger Weise auf den Gebieten der Protein- und Prozessanalytik einsetzbar. Insbesondere erlaubt es eine selektive Proteinanalytik bei allen Fragestellungen der Proteinquantifizierung in einem Proteingemisch und/oder der relativen oder absoluten Änderung der Proteinzusammensetzung eines Proteingemisches. Mögliche Einsatzgebiete sind das Hochdurchsatz-Screening in der Biologie, Biochemie, Biotechnologie, Pharmazie oder Medizin, die Mikrofluidik, die Sensorik, die Biochromatographie, die Bioprozessentwicklung oder die Bioprozessanalytik, wobei das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise sowohl im Batchbetrieb in Küvetten oder Multi-Well-Platten, als auch im Durchflussbetrieb in mikrofluidischen Applikationen, Leitungen oder Meßzellen durchgeführt werden kann. Dies ist bei den im Stand der Technik bekannten Verfahren zur selektiven Proteinanalytik nicht möglich.The process according to the invention can be used in a variety of ways in the fields of protein and process analysis. In particular, selective protein analysis in all questions permits protein quantification in a protein mixture and / or the relative or absolute change in the protein composition of a protein mixture. Possible areas of application are high-throughput screening in biology, biochemistry, biotechnology, pharmacy or medicine, microfluidics, sensor technology, biochromatography, bioprocess development or bioprocess analysis, the method according to the invention being used, for example, in batch operation in cuvettes or multiwell plates , as well as in the flow operation in microfluidic applications, lines or measuring cells can be performed. This is not possible with the methods for selective protein analysis known in the prior art.
Weiter ist die Einfachheit und Schnelligkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens auch von großem Nutzen in der Hochdurchsatz-Analytik. Insbesondere ist, entgegen den im Stand der Technik bekannten Verfahren zur selektiven Proteinanalytik, eine Automatisierung ohne großen Aufwand möglich und die Analysezeit und/oder die Vorbereitungszeit wesentlich geringer. Die benötigte Ausstattung ist darüber hinaus preiswert, wenig störanfällig und leicht zu bedienen.Furthermore, the simplicity and rapidity of the method according to the invention is also of great use in high-throughput analysis. In particular, contrary to the methods for selective protein analysis known in the prior art, automation is possible without much effort and the analysis time and / or the preparation time is considerably lower. The required equipment is also inexpensive, less susceptible to interference and easy to use.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von UV-Absorptionsspektren zur Bestimmung der Konzentration einzelner Proteine in dem Proteingemisch mit Hilfe eines multivariaten Kalibrierungsmodells und eines geeigneten statistischen Verfahrens.Another object of the present invention relates to the use of UV absorption spectra for determining the concentration of individual proteins in the protein mixture using a multivariate calibration model and a suitable statistical method.
Die Figuren zeigen:The figures show:
- (a) Rohspektren der reinen Modellproteine bei 0,5 mg/ml.
- (b) Rohspektren von fünf Proben, die reines Protein und drei verschiedene Mischungsverhältnisse von cytC und ribA umfassen.
- (c) Die fünf Spektren, die basierend auf der Absorption der reinen cytC-
Probe bei 280 nm in ihren Offsets verschoben wurden. - (d) Differenzspektren, die aus den fünf Offset-verschobenen Spektren erstellt wurden.
- (a) Raw spectra of pure model proteins at 0.5 mg / ml.
- (b) Raw spectra of five samples comprising pure protein and three different mixing ratios of cytC and ribA.
- (c) The five spectra shifted in their offsets based on the absorbance of the pure cytC sample at 280 nm.
- (d) Difference spectra created from the five offset-shifted spectra.
- (a) 19 Mischungsverhältnisse der drei Modellproteine, die sich aus dem vierschaligen Design, auf dem das Kalibrierungsset basierte, ergaben.
- (b) Die Konzentrationen der
Proteine reichten von 0bis 0,7 mg/ml. Die Konzentrationen von ribA und lys sind gezeigt. Weitere drei Proben mit einerKonzentration von 0,05 mg/ml nur jeweils eines Proteins wurden hinzugefügt (Proben 28 bis 30).
- (a) 19 mixing ratios of the three model proteins resulting from the four-shell design on which the calibration set was based.
- (b) The concentrations of the proteins ranged from 0 to 0.7 mg / ml. The concentrations of ribA and lys are shown. Another three samples with a concentration of 0.05 mg / ml of only one protein each were added (samples 28 to 30).
- (a) Ribonuclease A,
- (b) Cytochrom C,
- (c) Lysozym. Eine die ideale Korrelation symbolisierende Gerade ist gezeigt. Ebenso sind die entsprechenden relativen und absoluten Fehler gezeigt (untere Reihe).
- (a) Ribonuclease A,
- (b) cytochrome C,
- (c) lysozyme. A straight line symbolizing the ideal correlation is shown. Likewise, the corresponding relative and absolute errors are shown (bottom row).
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden nicht-einschränkenden Beispiele näher erläutert.The present invention will be further illustrated by the following non-limiting examples.
Material und Methoden material and methods
Verbrauchsmaterialienconsumables
Probenvorbereitung: 96-well Platten mit flachem Boden, volumetrische Kapazität 2 ml, Polypropylen (VWR, Deutschland). Messung von UV-Spektren im mittleren Bereich: 96-well UV-Mikrotiterplatten mit flachem Boden, volumetrische Kapazität 360 μl, Polystyrol (Greiner, Deutschland). Chromatographie: Mit 200 μl Harz für die Kationenaustauschchromatographie befüllte RoboColumns®. Die folgenden Harze wurden verwendet: CM Ceramic HyperD® F, Toyopearl® SP 650 M, SP Sepharose® FF und Fractogel® EMDSO3 (Atoll, Deutschland).Sample preparation: 96-well plates with flat bottom,
Modellproteinemodel proteins
Modellproteine waren Lysozym (lys) aus Hühnereiweiß, Cytochrom C (cytC) aus Pferdeherzen, Ribonuclease A (ribA) aus bovinem Pankreas, bovines Serumalbumin (BSA) und humanes Serumalbumin (HSA) (alle Sigma-Aldrich, Deutschland).Model proteins were lysozyme (lys) from chicken egg white, cytochrome C (cytC) from horse hearts, ribonuclease A (ribA) from bovine pancreas, bovine serum albumin (BSA), and human serum albumin (HSA) (all from Sigma-Aldrich, Germany).
Pipettierstationpipetting
Die Herstellung der Kalibrierungs- und Testproben für das Kalibrierungsmodell, sowie die chromatographischen Experimente wurden automatisiert auf einer Tecan Freedom Evo® 200 Pipettierstation (Tecan, Crailsheim, Deutschland) durchgeführt. Um das Durchführen von Säulenchromatographie auf der Pipettierstation zu ermöglichen, wurde ein Te-Chrom® Säulenträger (Tecan, Crailsheim, Deutschland) installiert. Weiter wurde die Pipettierstation mit einem Infinite 200 Plattenleser (Tecan, Crailsheim, Deutschland) ausgerüstet, um UV-Spektren im mittleren UV-Bereich der hergestellten Kalibrierungs- und Testproben, sowie der chromatographischen Fraktionen zu messen.The preparation of the calibration and test samples for the calibration model as well as the chromatographic experiments were performed on an automated
Softwaresoftware
Für das Design der Probenzusammensetzung für das Kalibrierungsmodell und für die Testproben, die zur Evaluierung des Kalibrierungsmodells verwendet wurden, wurde die Software MODDE® (Umetrics, Umea, Schweden) verwendet. Die Pipettierstation wurde mit EVOware 2.0 (Tecan, Crailsheim, Deutschland) betrieben. Die zu importierenden Werte für die zu pipettierenden Volumina und die zu exportierenden Spektraldaten wurden mit Microsoft Excel verwaltet (Microsoft, Redmond, USA). Um die Kalibrierungsmodelle der verschiedenen Proteingemische zu erstellen, und um die unbekannten Proteinkonzentrationen in den Chromatographieproben vorherzusagen, wurde das auf MATLAB basierende Paket PLS Toolbox (EigenVector, USA) verwendet.For the design of the sample composition for the calibration model and the test samples were used to evaluate the calibration model that MODDE ® Software (Umetrics, Umea, Sweden) was used. The pipetting station was operated with EVOware 2.0 (Tecan, Crailsheim, Germany). The values to be imported for the volumes to be pipetted and the spectral data to be exported were managed with Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, USA). To prepare the calibration models of the different protein mixtures and to predict the unknown protein concentrations in the chromatography samples, the MATLAB based package PLS Toolbox (EigenVector, USA) was used.
Probenvorbereitung und Aufnehmen der SpektrenSample preparation and recording of the spectra
Die Kalibrierungs- und Testproben wurden aus Stammlösungen, die 2,1 mg/ml Protein in einem Natriumphosphatpuffer bei pH 7 enthielten, hergestellt. Die Proben wurden in 96-well Platten in einem Volumen von 2 ml hergestellt. Für die Messung der UV-Absorptionsspektren wurden 150 μl der Proben in UV-transparente 96-well UV-Mikrotiterplatten mit flachem Boden überführt. Die Absorptionsspektren wurden mit einer Auflösung von 1 nm im Bereich von 240 nm bis 295 nm mit Hilfe eines Lambda 35 UV-Detektors (Perkin Elmer, Deutschland) oder dem Infinite 200 Plattenleser (Tecan, Crailsheim, Deutschland) gemessen.The calibration and test samples were prepared from stock solutions containing 2.1 mg / ml protein in a sodium phosphate buffer at pH 7. The samples were prepared in 96-well plates in a volume of 2 ml. For the measurement of the UV absorption spectra, 150 μl of the samples were transferred to UV-transparent 96-well flat-bottomed UV microtiter plates. The absorption spectra were measured at a resolution of 1 nm in the range of 240 nm to 295 nm using a Lambda 35 UV detector (Perkin Elmer, Germany) or the
Erstellen des multivariaten KalibrierungsmodellsCreate the multivariate calibration model
Für das ternäre Proteingemisch lys/cytC/ribA basierten die Kalibrierungsproben auf einem D-optimalen Zwiebel-Design mit vier Ebenen. Dies führte zu 19 Mischungsverhältnissen (vgl.
Chromatographiechromatography
Ein 5 mg/ml jedes Modellproteins enthaltendes Proteingemisch wurde in einem 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7) hergestellt. Alle Säulen wurden mit 5 Säulenvolumina (column volume, CV) (1 CV = 200 μl) des Ladepuffers äquilibriert, bevor sie mit 50 μl der Proteinlösung, entsprechend 0,25 mg jedes Proteins, beladen wurden. Die Proteine wurden von der Säule mit einem Natriumchlorid-Gradienten von 0 bis 500 mM über 24 CV eluiert. Gerätebedingt wurde dabei ein schrittweiser Gradient mit einem Anstieg der Salzkonzentration von 20,83 mM pro CV verwendet. Jeder Schritt des Gradienten hatte ein Volumen von 200 μl und wurde als eine Fraktion gesammelt und analysiert. Nach der vollständigen Elution wurden 150 μl jeder eluierten Fraktion in frische 96-well Platten überführt und die UV-Absorptionsspektren gemessen.A protein mixture containing 5 mg / ml of each model protein was prepared in a 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7). All columns were equilibrated with 5 column volume (CV) volumes of the loading buffer before being loaded with 50 μl of the protein solution corresponding to 0.25 mg of each protein. The proteins were eluted from the column with a sodium chloride gradient from 0 to 500 mM over 24 CV. Due to the device, a gradual gradient with an increase in the salt concentration of 20.83 mM per CV was used. Each step of the gradient had a volume of 200 μl and was collected as a fraction and analyzed. After complete elution, 150 μl of each eluted fraction was transferred to fresh 96-well plates and the UV absorption spectra were measured.
Deamidierung von AspartDeamidation of aspart
Das humane Insulin-Analogon Aspart (Novo Nordisk, Dänemark) wurde in Form von Aspart API bereitgestellt. Für die Deamidierung wurde Aspart für 16 Tage bei 45°C in einem Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) inkubiert. Die Lösung wurde alle 24 Stunden durch einen Spritzenfilter (0,2 μm) filtriert, um bakterieller Kontamination vorzubeugen.The human insulin analog Aspart (Novo Nordisk, Denmark) was provided in the form of Aspart API. For deamidation Aspart was incubated for 16 days at 45 ° C in a sodium phosphate buffer (pH 7.4). The solution was filtered through a syringe filter (0.2 μm) every 24 hours to prevent bacterial contamination.
Beispiel 1:Example 1:
UV-Absorptionsspektren der drei Modellproteine lys, cytC und ribAUV absorption spectra of the three model proteins lys, cytC and ribA
Aufgrund der verschiedenen Verhältnisse der aromatischen Aminosäurereste, die in einem bestimmten Protein vorhanden sind, unterscheiden sich die Intensität und die Form der entsprechenden UV-Absorptionsspektren verschiedener Proteine leicht voneinander.
Das UV-Absorptionsspektrum von lys unterscheidet sich klar von denen der anderen beiden Proteine. Dagegen erscheinen die UV-Absorptionsspektren von cytC und ribA sehr ähnlich in ihrer Form und scheinen sich nur in ihrer Intensität zu unterscheiden. Um zu zeigen, daß sich die Spektren der beiden Proteine tatsächlich auch in ihrer Form unterscheiden, wurden fünf Proben mit unterschiedlichen Mischungsverhältnissen der beiden Proteine hergestellt und die entsprechenden UV-Absorptionsspektren verglichen.
Beispiel 2:Example 2:
Multivariates Kalibrierungsmodell für das lys, cytC, ribA SystemMultivariate calibration model for the lys, cytC, ribA system
Die Unterschiede in den UV-Absorptionsspektren der drei Modellproteine wurden verwendet, um multivariate Kalibrierungsmodelle mit der Fähigkeit, spezifische Proteinkonzentrationen vorherzusagen, zu erstellen. Um PLS-Regression im Vergleich zu MLR zu testen, wurden Kalibrierungsmodelle mit beiden Ansätzen erstellt. Weiter wurde der Einfluß der Datenaufbereitung, hier Zentrierung auf den Mittelwert, untersucht. In allen vier Modellen wurden die Konzentrationen der drei Proteine ko-kalibriert. Ein unabhängiger Probensatz wurde verwendet, um die tatsächliche Vorhersagefähigkeit der Modelle zu testen. Die PLS-Modelle basierten auf drei Komponenten. Tabelle 1 zeigt die Bestimmungskoeffizienten (R2-Werte) für jedes, jeweils mit den vier verschiedenen Ansätzen kalibrierte Protein. Die Ergebnisse der Kreuzvalidierung (cross validation, cv), wie auch die Vorhersagen der Testsets (test) sind gezeigt. Tabelle 1: Bestimmungskoeffizienten aller Kreuzvalidierungen und der vorhergesagten Testdaten
Die besten Ergebnisse wurden mit PLS-Regression, basierend auf mittelwertzentrierten Daten, erhalten. Dieses Modell lieferte R2-Werte über 0,99 für alle Proteine. Eine Zentrierung auf den Mittelwert war dabei entscheidend für das PLS-Modell, nachdem die Vorhersagefähigkeit von Kalibrierungsmodellen, die auf rohen Spektraldaten basierten, wesentlich niedriger war. Charakteristisch für die MLR-Modelle sind R2-Werte von 1,0 bei der Kreuzvalidierung. Aufgrund der hohen Anzahl an Variablen im Vergleich zur PLS-Regression, auf denen diese Modelle basieren (MLR: 60 Variablen; PLS: 3 Variablen), können die MLR-Modelle angepaßt werden, um die exakten Konzentrationen in den Kalibrierungsdatensätzen unabhängig von der Datenaufbereitung vorherzusagen. Diese Fähigkeit zur fehlerfreien Vorhersage trifft allerdings nur auf die Kalibrierungsdatensätze zu.The best results were obtained with PLS regression based on mean-centered data. This model provided R 2 values above 0.99 for all proteins. Centering on the mean was key to the PLS model after the predictive ability of calibration models based on raw spectral data was significantly lower. Characteristic for the MLR models are R 2 values of 1.0 in the cross validation. Due to the large number of variables compared to the PLS regression on which these models are based (MLR: 60 variables, PLS: 3 variables), the MLR models can be adapted to predict the exact concentrations in the calibration data sets independent of the data preparation , However, this error-free prediction capability only applies to the calibration records.
Für alle Testproben wurden absolute (mg/ml) und relative (%) Abweichungen von den Vorhersagen, die das PLS-Modell basierend auf mittelwertszentrierten Daten lieferte, berechnet.
Beispiel 3:Example 3:
Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der SäulenchromatographieApplication of the method according to the invention in column chromatography
Die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde anhand säulenchromatographischer Trennungen der drei Modellproteine untersucht. Die Trennungen wurden automatisiert auf einer Pipettierstation durchgeführt. Dabei wurden vier verschiedene Kationentauscher-Materialien verwendet, und die Elution mit dem gleichen Salzgradienten für jede Säule durchgeführt. Die resultierenden Chromatogramme sind in
Beispiel 4:Example 4:
Kalibrierungsmodell für BSA/lysCalibration Model for BSA / lys
UV-Absorptionsspektren für das binäre Proteinsystem BSA (bovines Serumalbumin)/lys wurden aufgenommen. Die Proben wurden jeweils entsprechend den in
Zunächst wurden Kalibrierungsmodelle ohne vorherige Datenaufbereitung erstellt.
Weitere Kalibrierungsmodelle wurden mit den selben Daten des BSA/lys-Systems erstellt, allerdings wurden die Daten vorab durch Zentrierung auf den Mittelwert aufbereitet. Basierend auf den in
Beispiel 5:Example 5:
Kalibrierungsmodell für BSA/HSACalibration model for BSA / HSA
UV-Absorptionsspektren für das binäre Proteinsystem BSA/HSA (humanes Serumalbumin) wurden aufgenommen, um die Kalibrierung von strukturell ähnlicheren Proteinen zu testen. Die Proben wurden jeweils entsprechend den in
Für das Erstellen der Kalibrierungsmodelle wurden die Daten vorab mittelwertszentriert. Basierend auf den in
Beispiel 6:Example 6:
Kalibrierungsmodell für deamidiertes/nicht-deamidiertes AspartCalibration Model for Deamidated / Non-Deamidated Aspart
Um die Grenzen des Auflösungsvermögens des erfindungsgemäßen Verfahrens auszuloten, wurde die Kalibrierung von zwei extrem ähnlichen Proteinen, nämlich dem humanen Insulin-Analogon Aspart in deamidierter und nicht-deamidierter Form getestet. Mögliche Unterschiede in den UV-Absorptionsspektren dieser Proteine sollten, wenn überhaupt detektierbar, äußerst klein sein.To explore the limits of resolving power of the method of the invention, the calibration of two extremely similar proteins, the human insulin analogue Aspart in deamidated and non-deamidated form, was tested. Possible differences in the UV absorption spectra of these proteins should be extremely small if detectable at all.
Das auf PLS basierende Kalibrierungsmodell wurde mit zwei latenten Variablen erstellt. Die PLS-Regression wurde mit Kreuzvalidierungen durchgeführt, wobei jede Probe einmal weggelassen und von dem Kalibrierungsmodell, basierend auf den restlichen Proben, vorhergesagt wurde.
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