DE102010024643B4

DE102010024643B4 - Contrast agents and methods for molecular ultrasound imaging

Info

Publication number: DE102010024643B4
Application number: DE102010024643.3A
Authority: DE
Inventors: Prof. Ergün Süleyman; Jens Fehre; Dr. Nanke Ralf; Dr. Singer Bernhard
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens Healthcare GmbH
Priority date: 2010-06-22
Filing date: 2010-06-22
Publication date: 2016-02-11
Anticipated expiration: 2030-06-23
Also published as: DE102010024643A1

Abstract

Kontrastmittel für die molekulare Ultraschallbildgebung, welches eine an Mikrobläschen gebundene Koppelsubstanz enthält, die selektiv an eine A- und/oder B-Domäne und damit nicht in merklichem Ausmaß an eine N-Domäne eines CEACAM1-Moleküls bindet.A contrast agent for molecular ultrasound imaging, which contains a coupling substance bound to microbubbles, which binds selectively to an A and / or B domain and thus not to a considerable extent to an N domain of a CEACAM1 molecule.

Description

Die Erfindung betrifft ein Kontrastmittel für die molekulare Ultraschallbildgebung. Bei der molekularen Ultraschallbildgebung kommen in die Blutbahn des menschlichen oder tierischen Körpers injizierte Kontrastmittel zum Einsatz, die spezifisch an bestimmte, etwa durch ein spezifisches Krankheitsbild geprägte Gewebe bindende Koppelsubstanzen enthalten. Bindungspartner sind dabei Oberflächenstrukturen des Gewebes oder darin vorkommende Moleküle. Bei der Erkennung von Tumorgewebe ist für den Heilungserfolg eine möglichst frühzeitige Erkennung entscheidend. Ein Tumor kann nur dann überleben, wenn er ein eigenes Gefäßsystem generiert. Dazu müssen die Epithelzellen des Tumors Endothelzellen von Gefäßen extratumoralen Gewebes stimulieren, neue Blutgefäße zu bilden. Die stimulierten Endothelzellen tragen auf ihrer Oberfläche Moleküle, die sie sonst nicht tragen. Dazu gehört auch CEACAM1 (carzinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule). Diese Moleküle werden nun dazu genutzt, Tumore in einem sehr frühen Entwicklungsstadium zu erkennen, indem das sich gerade erst bildende, das sog. neoangiogenetisch-aktivierte endotheliale Blutgefäßsystems sichtbar gemacht wird. Die Moleküle der Koppelsubstanz sind an sog. Microbubbles gebunden, also an mit Luft gefüllte Mikrobläschen mit Durchmessern beispielsweise im Bereich von 0,1 μm bis 5 μm. Die Mikrobläschen reflektieren die Ultraschallwellen das in Rede stehende Gefäßsystem von benachbarten Gewebe optisch abhebt, an dem keine oder jedenfalls deutlich weniger Mikrobläschen lokalisiert sind. Als Koppelsubstanzen kommen dabei Aptamere, Spiegelmere, Anticaline und vor allem monoklonale Antikörper in Frage. Monoklonale Antikörper sind gegen eine bestimmte antigene Determinante (Epitop/Antigen) gerichtet. Bei einer Ultraschalluntersuchung bzw. einem auf Ultraschall basierenden bildgebenden Verfahren der in Rede stehenden Art besteht die Gefahr einer Beeinträchtigung des interessierenden Zielgewebes etwa dadurch, dass aufgrund der Bindung einer Koppelsubstanz an das Zielgewebe unerwünschte Reaktionen des Gewebes in Gang gesetzt werden.The invention relates to a contrast agent for molecular ultrasound imaging. In molecular ultrasound imaging, contrast agents injected into the bloodstream of the human or animal body are used, which specifically contain binding substances binding tissue, for example through a specific disease pattern. Binding partners are surface structures of the tissue or molecules occurring therein. In the detection of tumor tissue as early detection is crucial for the success of the cure. A tumor can only survive if it generates its own vascular system. To do this, the epithelial cells of the tumor must stimulate endothelial cells of extravascular tissues to form new blood vessels. The stimulated endothelial cells carry on their surface molecules that they otherwise do not carry. This includes CEACAM1 (carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule). These molecules are now used to detect tumors at a very early stage of development by visualizing the newly formed, so-called neoangiogenetically-activated endothelial blood vessel system. The molecules of the coupling substance are bound to so-called microbubbles, ie to air-filled microbubbles with diameters, for example in the range from 0.1 μm to 5 μm. The microbubbles reflect the ultrasonic waves optically lifting the subject vasculature from adjacent tissues where no or at least significantly fewer microbubbles are located. Suitable coupling substances are aptamers, spiegelmers, anticalins and especially monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies are directed against a particular antigenic determinant (epitope / antigen). In the case of an ultrasound examination or an ultrasound-based imaging method of the type in question, there is the risk of impairment of the target tissue of interest, for example because unwanted reactions of the tissue are initiated due to the binding of a coupling substance to the target tissue.

Aus DE 10 2007 041 831 A1 und D. Tilki et. al., „Molekulare Bildgebung der Tumorgefäße”. In: Urologe, ISSN 0340-2592, 2007, 46, 1266–1271 sind Ultraschallkontrastmittel bekannt, welche Koppelsubstanzen enthalten, die an Mikrobläschen gebunden sind und an CEACAM1-Moleküle binden.Out DE 10 2007 041 831 A1 and D. Tilki et. al., "Molecular Imaging of the Tumor Vessels." In: Urologist, ISSN 0340-2592, 2007, 46, 1266-1271 ultrasound contrast agents are known which contain coupling substances bound to microbubbles and binding to CEACAM1 molecules.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Kontrastmittel der eingangs beschriebenen Art vorzuschlagen, das in dieser Hinsicht verbessert ist.The object of the invention is to propose a contrast agent of the type described above, which is improved in this regard.

Diese Aufgabe wird nach Anspruch 1 durch ein Kontrastmittel für die molekulare Ultraschallbildgebung, welches ein an Mikrobläschen gebundene Koppelmoleküle enthält, die selektiv an eine A- und/oder B-Domäne eines CEACAM1-Moleküls binden, gelöst. Der Erfindung liegt dabei die Überlegung zugrunde, dass CEACAM1 einen Molekülbestandteil, die sog. N-Domäne aufweist, welche im außerzellulären Bereich vorhandene Stoffe binden, wodurch intrazelluläre Signalkaskaden in Gang gesetzt und unerwünschte Gewebeveränderungen ausgelöst werden können. Erfindungsgemäß wird dies vermieden, da die Koppelsubstanz die Eigenschaft hat, selektiv an die A- und/oder B-Domäne, also nicht, jedenfalls nicht in merklichem Ausmaß, an die N-Domäne bindet. Dabei haben sich Antikörper, insbesondere des Typs mabB3 als Koppelsubstanz als besonders selektiv bindend erwiesen.This object is achieved according to claim 1 by a contrast agent for molecular ultrasound imaging, which contains a coupling molecule bound to microbubbles, which bind selectively to an A and / or B domain of a CEACAM1 molecule. The invention is based on the consideration that CEACAM1 has a molecular constituent, the so-called N-domain, which bind substances present in the extracellular region, whereby intracellular signal cascades can be set in motion and undesired tissue changes can be triggered. According to the invention, this is avoided since the coupling substance has the property of selectively binding to the A and / or B domain, that is not, at least not to a considerable extent, to the N-domain. Antibodies, in particular of the type mabB3 as a coupling substance, have proved to be particularly selective in binding.

Für die weitere Beschreibung der Erfindung wird auf die beigefügten Abbildungen Bezug genommen. Es zeigen jeweils in schematischer Darstellung:For further description of the invention, reference is made to the accompanying drawings. Shown schematically in each case:

1 ein Endothel mit einem CEACAM1-Molekül, 1 an endothelium with a CEACAM1 molecule,

2 die Struktur eines Mikrobläschens, 2 the structure of a microbubble,

3 die Bindung eines Antikörpers an ein Mikrobläschen. 3 the binding of an antibody to a microbubble.

Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern 1 gegen ein bestimmtes Epitop, im vorliegenden Fall also gegen eine A- und/oder B-Domäne des CEACAM1, werden einer Maus als Antigene CEACAM1-Moleküle injiziert, denen die N-Domäne fehlt. Eine andere Möglichkeit ist die Injektion von Antigenen, welche die N-Domäne des CEACAM1 nachbildende Molekülteile sind. In beiden Fällen erfolgt die Herstellung nach Verfahren, die dem einschlägigen Fachmann geläufig sind und daher nicht näher erläutert werden müssen. Nach der Injektion der in Rede stehenden Antigene bilden die B-Lymphozyten der Maus als Immunantwort Antikörper gegen die A- und/oder B-Domänen des CEACAM1 aus. Die B-Lymphozyten werden isoliert und mit Plasmazellen aus einem Myelom verschmolzen. Die B-Lymphozyten der durch die Verschmelzung entstandenen Hybridom-Zelllinie bilden Antikörper gegen die o. g. Domänen des CEACAM1. Aus verschiedenen Hybridom-Zelllinien wird diejenige ausgewählt, deren Antikörper am besten an den A- bzw. B-Domänen binden. Mit solchen Antikörpern verbundene Mikrobläschen lassen sich ohne Auslösung unerwünschter Signalkaskaden an den eine erhöhte CEACAM1-Expression aufweisenden Endothelzellen 2 des oben beschriebenen Gefäßsystems anreichern wodurch dieses mit einem Ultraschall verwendenden Bildgebungsverfahren erkennbar wird.For the production of monoclonal antibodies 1 against a particular epitope, in this case against an A and / or B domain of CEACAM1, a mouse is injected as antigens with CEACAM1 molecules lacking the N domain. Another possibility is the injection of antigens which are the N-domain of CEACAM1 replicating moieties. In both cases, the preparation by methods that are familiar to the skilled person and therefore need not be explained in more detail. After injection of the antigens in question, the B lymphocytes of the mouse as an immune response form antibodies against the A and / or B domains of CEACAM1. The B lymphocytes are isolated and fused with plasma cells from a myeloma. The B-lymphocytes of the hybridoma cell line produced by the fusion form antibodies against the above-mentioned domains of the CEACAM1. From different hybridoma cell lines, the one whose antibodies bind best to the A or B domains is selected. Microbubbles associated with such antibodies can be attached to the endothelial cells having an increased CEACAM1 expression without triggering undesired signal cascades 2 accumulate the above-described vascular system whereby this using an ultrasound imaging method is recognizable.

Neben Antikörpern können auch andere Koppelsubstanzen, wie etwa die oben erwähnten Aptamere, Spiegelmere und Anticaline für ein Kontrastmittel verwendet werden. Aptamere sind Bruchstücke von RNA-Molekülen, welche im Zuge der Proteinsynthese Informationen von der DNA aus dem Zellkern transportieren. Im Gegensatz zu Antikörpern können Aptamere auf einfache Weise, nämlich in einem Reagenzglas auf ein besseres Bindungsverhalten gegenüber CEACAM1 optimiert werden, beispielsweise mit den sog. Selex-Verfahren, einem in der Molekularbiologie bekannten kombinatorischen Verfahren zur evolutionären Entwicklung von an bestimmte Targets bzw. Epitope angepassten Oligonukleotid-Strängen. Spiegelmere sind spiegelverkehrte RNA-Abschnitte bzw. Aptamere, die resistent gegen enzymatischen Abbau sind. Spiegelmere verwendende Kontrastmittel besitzen damit neben einer hohen Selektivität und Affinität eine längere Lebensdauer im Körper, so dass auch länger dauernde Ultraschall-Untersuchungen möglich sind. Anticaline sind künstliche Proteine, die zur Bindung an Antigene bzw. Epitope befähigt sind. Sie setzen sich aus etwa 180 Aminosäuren zusammen. Durch Variation der Aminosäure-Sequenz, z. B. durch das oben erwähnte Selex-Verfahren lassen sich Anticaline herstellen, die mit hoher Selektivität ausschließlich an die A- und/oder B-Domäne des CEACAM1 binden. Zur Entwicklung von spezifisch an eine A- oder B-Domäne eines CEACAM1-Moleküls bindenden Aptameren, Spiegelmeren und Anticalinen werden ebenfalls CEACAM1-Moleküle ohne N-Domäne oder die N-Domäne nachbildende Teilmoleküle verwendet.Besides antibodies, other coupling substances such as the aptamers, spiegelmers and anticalins mentioned above can also be used for a contrast agent. Aptamers are fragments of RNA molecules that carry information from the DNA from the nucleus during protein synthesis. In contrast to antibodies, aptamers can be optimized in a simple manner, namely in a test tube, for a better binding behavior with respect to CEACAM1, for example with the so-called Selex method, a combinatorial method known in molecular biology for the evolutionary development of specific targets or epitopes oligonucleotide strands. Spiegelmers are mirror-inverted RNA sections or aptamers that are resistant to enzymatic degradation. Spiegelmers using contrast agents thus have a high selectivity and affinity longer life in the body, so that even longer-lasting ultrasound examinations are possible. Anticalins are artificial proteins that are capable of binding to antigens or epitopes. They are composed of about 180 amino acids. By variation of the amino acid sequence, e.g. B. by the above-mentioned Selex method can be prepared anticalins that bind with high selectivity exclusively to the A and / or B domain of CEACAM1. To develop aptamers, spiegelmers and anticalins that specifically bind to an A or B domain of a CEACAM1 molecule, CEACAM1 molecules without an N domain or the N domain replicating submolecules are also used.

Die oben erwähnten Koppelsubstanzen sind an Mikrobläschen 3 gebunden. Es handelt sich dabei um mit einem gasförmigen Medium, beispielsweise Sauerstoff, Luft oder Schwefelhexafluorid, gefüllte kugelförmige Gebilde mit einem Durchmesser beispielsweise im Mikrometerbereich. Sie weisen eine Hülle beispielsweise aus einer Doppelschicht von Phospholipiden 4 wie Distearoylphosphatidylcholin auf und sind z. B. mit Schwefelhexafluorid gefüllt. Die Phospholipide bestehen aus einem hydrophilen Teil 4a und einem lipophilen Teil 4b, wobei die hydrophilen Teile 4a nach außen bzw. nach innen gerichtet sind und quasi die innere und äußere Oberfläche der Mikrobläschen 4 bilden. Neben Mikrobläschen mit einer Lipid-Doppelschicht als Hülle kommen auch solche mit anderen, beispielsweise aus PLGA (Poly-DL-Lactid-co-Glycolid) bestehenden Hülle in Frage.The above-mentioned coupling substances are on microbubbles 3 bound. These are with a gaseous medium, for example oxygen, air or sulfur hexafluoride, filled spherical structures with a diameter, for example in the micrometer range. They have a shell, for example, of a bilayer of phospholipids 4 as distearoylphosphatidylcholine and are e.g. B. filled with sulfur hexafluoride. The phospholipids consist of a hydrophilic part 4a and a lipophilic part 4b , wherein the hydrophilic parts 4a directed outwards or inwards, and quasi the inner and outer surfaces of the microbubbles 4 form. In addition to microbubbles with a lipid bilayer as a shell, those with other, for example from PLGA (poly-DL-lactide-co-glycolide) existing shell come into question.

An die Außenseite Mikrobläschen 4 sind Moleküle der spezifisch an CEACAM1 bindenden Koppelsubstanz, etwa in 3 gezeigte Antikörper 1 gebunden. Die Bindung erfolgt über sog. Crosslinker, das sind bifunktionale Moleküle mit beispielsweise endständigen funktionalen Gruppen, die eine kovalente Bindung mit den die Hülle der Mikrobläschen bildenden Molekülen einerseits und der Koppelsubstanz andererseits eingehen. Derartige Crosslinker sind bekannt und beispielsweise von der Thermo Fischer Scientific Inc., Rockford, USA, erhältlich. Denkbar ist auch eine Bindung über Protein A oder Protein B, das sind ursprünglich aus der Zellwand von bestimmten Bakterien stammende Proteine, die die Fähigkeit haben, Antikörper zu binden. Eine weitere bekannte Möglichkeit ist eine Bindung über das Biotin-Streptavidin-System, wobei am hydrophilen Teil 4a eines Phospholipids 4 ein Biotinmolekül 5 an den Antikörper 1 bzw. einem anderen Molekül als Koppelsubstanz, etwa einem Aptamer, einem Spiegelmer oder einem Anticalin, ein Streptavidin-Molekül 6 gebunden ist, das wiederum mit dem Biotin-Molekül 5 des Mikrobläschens 3 verbunden ist.To the outside microbubbles 4 are molecules of the binding substance binding specifically to CEACAM1, for example in 3 shown antibodies 1 bound. The binding takes place via so-called. Crosslinker, which are bifunctional molecules with, for example, terminal functional groups that form a covalent bond with the shell of the microbubble forming molecules on the one hand and the coupling substance on the other hand. Such crosslinkers are known and are available, for example, from Thermo Fischer Scientific Inc., Rockford, USA. Also conceivable is binding via protein A or protein B, which are proteins originally derived from the cell wall of certain bacteria and have the ability to bind antibodies. Another known possibility is binding via the biotin-streptavidin system, wherein the hydrophilic part 4a a phospholipid 4 a biotin molecule 5 to the antibody 1 or another molecule as a coupling substance, such as an aptamer, a spiegelmer or an anticalin, a streptavidin molecule 6 bound, in turn, with the biotin molecule 5 of the microbubble 3 connected is.

Eine auf die oben genannte Art und Weise an ein Mikrobläschen 3 gebundene Koppelsubstanz reichert sich wegen der spezifischen Bindung mit einer A- und/oder B-Domäne dem oben beschriebenen Gefäßsystem an. Aufgrund des charakteristischen Echosignals der Mikrobläschen hebt sich dieses deutlich von umgebenden Gewebe ab. Wegen der fehlenden Bindung an die N-Domäne des CEACAM1 bleibt das Zielgewebe unbeeinflusst von Reaktionen, die durch die N-Domäne des CEACAM1 ausgelöst werden.One in the above manner to a microbubble 3 bound coupling substance accumulates because of the specific binding with an A and / or B-domain to the vascular system described above. Due to the characteristic echo signal of the microbubbles, this clearly stands out from the surrounding tissue. Because of the lack of binding to the N-domain of CEACAM1, the target tissue remains unaffected by responses elicited by the N-domain of CEACAM1.

Claims

A contrast agent for molecular ultrasound imaging, which contains a coupling substance bound to microbubbles, which binds selectively to an A and / or B domain and thus not to a considerable extent to an N domain of a CEACAM1 molecule.

A contrast agent according to claim 1, wherein the coupling substance is formed by monoclonal antibodies.

Contrast agent according to claim 2, having an antibody of the type mab B3.

Contrast agent according to claim 1, having a coupling substance from the group aptamers, spiegelmers, anticalins.