DE102010012421B4 - Process for the specific detection of microorganisms - Google Patents
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Abstract
Verfahren zum Nachweis eines Mikroorganismus in einer Probe umfassend die folgenden Schrittea) Bereitstellen der Probeb) Zugabe einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde zu der Probe, wobei die Sonde spezifisch für den nachzuweisenden Mikroorganismus ist;c) Zugabe einer mit einem Quencher markierten ersten Sonde, wobei die mit einem Quencher markierte erste Sonde im wesentlichen komplementär, bevorzugterweise revers komplementär zu der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde ist und der Quencher in der Lage ist, die Fluoreszenz der fluoreszenzmarkierten Sonde zu löschen;d) Anregen des Fluroreszenzfarbstoffes; unde) Bestimmen des Auftretens oder Löschens von durch den Fluoreszenzfarbstoff bedingter Fluroreszenz.A method for detecting a microorganism in a sample, comprising the following stepsa) providing the sampleb) adding a first probe labeled with a fluorescent dye to the sample, the probe being specific for the microorganism to be detected;c) adding a first probe labeled with a quencher, wherein the quencher-labeled first probe is substantially complementary, preferably reverse-complementary, to the fluorescent dye-labeled first probe and the quencher is capable of quenching the fluorescence of the fluorescent-labeled probe;d) exciting the fluorescent dye; ande) determining the occurrence or quenching of fluorescence due to the fluorescent dye.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Mikroorganismus oder einer Gruppe von Mirkoorganismen, sowie einen Kit hierzu.The present invention relates to a method for detecting a microorganism or a group of microorganisms and a kit therefor.
Die mikrobielle Routineanalytik in der Lebensmittelindustrie ist in vielen Bereichen mit einem hohen Probenaufkommen (> 100 Proben pro Tag) konfrontiert, welches schnell und möglichst parallel abgearbeitet werden muss. Um die Verarbeitung eines derartig großen Probendurchsatzes (High-throughput) mit einem spezifischen, molekularbiologischen Schnellnachweissystem zu realisieren, bietet sich als Reaktionsformat die Mikrotiterplatte an. In der Standardausführung können hiermit bis zu 96 Analysen parallel durchgeführt werden. Die Voraussetzung zum Einsatz dieses Reaktionsformats ist, dass die Analysen in Suspension durchführbar sind.In many areas, routine microbial analysis in the food industry is confronted with a high volume of samples (> 100 samples per day), which must be processed quickly and, if possible, in parallel. In order to process such a large sample throughput (high-throughput) with a specific, molecular-biological rapid detection system, the microtiter plate is a suitable reaction format. In the standard version, up to 96 analyzes can be carried out in parallel. The prerequisite for using this reaction format is that the analyzes can be carried out in suspension.
Protokolle zur Fluoreszenz in situ Hybridisierung in flüssiger Phase wurden bereits für eine Detektion mittels Durchflusszytometer etabliert (Wallner et al., 1995 und Thelen, 2002). Diese basieren auf dem Reaktionsmechanismus der Standard-FISH-Technik. Alle Schritte der Hybridisierungsreaktion wurden dabei nahezu unverändert vom Format Objektträger auf das Format Reaktionsgefäß übertragen und die verschiedenen Lösungen via Zentrifugation entfernt. Konzeptionell sind diese Protokolle für die Bearbeitung von einzelnen Analysen ausgerichtet.Protocols for fluorescence in situ hybridization in the liquid phase have already been established for detection using a flow cytometer (Wallner et al., 1995 and Thelen, 2002). These are based on the reaction mechanism of the standard FISH technique. All steps of the hybridization reaction were transferred almost unchanged from the slide format to the reaction vessel format and the various solutions were removed via centrifugation. Conceptually, these logs are designed for processing individual analyses.
Obgleich die Standard-FISH-Technik auch für die mikrobielle Routineanalytik mit klaren Vorteilen verbunden ist, stellt deren Adaptation an Fragestellungen, die mit einem großen Probendurchsatz verbunden sind, eine Herausforderung dar. Insbesondere ist der bei Ganzzellhybridisierung erforderliche Wachschritt zur Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses in der Routineanalytik sehr arbeitsintensiv. Weiterhin stellt der Waschschritt einen weiteren Prozessparameter dar, der bei der Würdigung des beobachteten Ergebnisses und der erforderlichen Standardisierung des Verfahrens zu beachten ist.Although the standard FISH technique also has clear advantages for routine microbial analysis, its adaptation to questions associated with a large sample throughput poses a challenge. relationship in routine analysis very labour-intensive. Furthermore, the washing step represents another process parameter that must be considered when evaluating the observed result and the required standardization of the process.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen allgemein und eines Mikroorganismus, im Folgenden auch als MO bezeichnet, im speziellen bereitzustellen, welches die vorstehenden Nachteile des Standes der Technik überwindet.The present invention was therefore based on the object of providing a method for detecting microorganisms in general and a microorganism, also referred to below as MO, in particular, which overcomes the above disadvantages of the prior art.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch den Gegenstand der beigefügten unabhängigen Ansprüche. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.According to the invention, the object is solved by the subject matter of the appended independent claims. Preferred embodiments emerge from the dependent claims.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt den schnellen und spezifischen Nachweis von Mikroorganismen, ohne dass es dabei eines Wachschrittes wie bei der Standard-FISH-Technik bedarf.The method according to the invention allows the rapid and specific detection of microorganisms without the need for a washing step as in the standard FISH technique.
Weiterhin wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die bei der Standard-FISH-Technik und insbesondere der klassischen FISH Technik auftretende und bei der Auswertung nicht unproblematische Autofluoreszenz vermieden. Schließlich kann das vorliegende Verfahren zumindest und auch hinsichtlich der Auswertung automatisiert werden.Furthermore, the method according to the invention avoids the autofluorescence which occurs in the standard FISH technique and in particular the classic FISH technique and which is not unproblematic in the evaluation. Finally, the present method can be automated at least and also with regard to the evaluation.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für eine Analytik mit hohem Probendurchsatzes (High-throughput). Weiterhin ist das erfindungsgemäße Verfahren geeignet, in einem Format durchgeführt zu werden, das einen hohen Probendurchsatz erlaubt. Ein derartiges Format stellt das Mikrotiterplattenformat dar. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine einfache Durchführung, die auch ohne komplexe Geräteausstattung wie z. B. Mikrotiterplatten-Zentrifuge mit objektiver automatischer Auswertung, z. B. mittels eines Mikrotiterplatten-Fluorometers, möglich ist.The method according to the invention is particularly suitable for analysis with a high sample throughput. Furthermore, the method according to the invention is suitable for being carried out in a format that allows a high sample throughput. The microtiter plate format represents such a format. B. Microtiter plate centrifuge with objective automatic evaluation, e.g. B. by means of a microtiter plate fluorometer, is possible.
Ohne im Folgenden darauf festgelegt zu sein wollen, gehen die vorliegenden Erfinder derzeit von einem der erfindungsgemäßen Verfahren zugrundeliegenden Mechanismus aus, wie er im Folgenden beschrieben ist.Without wishing to be bound to this in the following, the present inventors are currently assuming a mechanism on which the methods according to the invention are based, as is described below.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt der spezifische Nachweis eines Mikroorganismus mittels einer ersten fluoreszenzmarkierten Nukleinsäure, genauer mittels einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten erste Sonde, bevorzugterweise in flüssiger Phase, wobei der Mikroorganismus als ganze Zelle im Rahmen einer Ganzzellhybridisierung spezifisch und direkt nachgewiesen und gegebenenfalls quantifiziert wird. Der Nachweis des Mikroorganismus wird dabei durch ein Fluoreszenzquenching ermöglicht bzw. beruht auf diesem. Dabei tragen nur diejenigen mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonden, die am Zielorganismus gebunden sind, zum Fluoreszenzsignal bei. Das Signal der nicht am Zielorganismus hybridisierten und damit freien Sonden wird hingegen durch Hybridisierung mit einer Quenchersonde, d.h. einer mit einem Quencher markierten oder versehenen ersten Sonde weitestgehend ausgelöscht. Durch diesen Reaktionsmechanismus wird ein einstufiges Testsystem möglich. Bei diesem einstufigen Testsystem wird bevorzugterweise nach einer erfolgenden Überführung der mikrobiellen Zellen einer Probe in ein entsprechendes Reaktionsgefäß bevorzugterweise eine oder maximal zwei verschiedene Lösungen angewandt werden und nach einer anschließenden Inkubation direkt der Nachweis (oder Detektion) der Mikroorganismen erfolgen.In the method according to the invention, a microorganism is specifically detected by means of a first fluorescence-labeled nucleic acid, more precisely by means of a first probe labeled with a fluorescent dye, preferably in the liquid phase, with the microorganism being specifically and directly detected as a whole cell as part of a whole-cell hybridization and, if necessary, quantified. The detection of the microorganism is made possible by fluorescence quenching or is based on this. Only those probes labeled with a fluorescent dye that are bound to the target organism contribute to the fluorescence signal. The signal of the non-hybridized to the target organism and thus free probes, on the other hand, is largely extinguished by hybridization with a quencher probe, ie a first probe labeled or provided with a quencher. This reaction mechanism makes a one-step test system possible. In this one-stage test system, one or at most two different solutions are preferably used after the microbial cells of a sample have been transferred to a corresponding reaction vessel and the microorganisms are directly detected (or detected) after subsequent incubation.
Hinsichtlich des Reaktionsmechanismus der in dem Verfahren verwendeten mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und einer mit einem Quencher markierten ersten Sonde sind im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens grundsätzlich zwei Ausführungsformen zu unterscheiden. Bei einer ersten Ausführungsform diffundiert die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde nach deren Zugabe zu der zu untersuchenden Probe innerhalb des Mikroorganismus zu ihrer Zielsequenz und bindet daran. Ungebundene und überschüssige mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde wird im Gegensatz zum Stand der Technik und insbesondere der Standard-FISH-Technik, bei dem diese mit einem stringenten Waschschritt entfernt wird, durch Zugabe einer mit einem Quencher markierten ersten Sonde hybridisiert und bildet so ein nicht mehr fluoreszierendes Nukleinsäurehybrid aus. Hatte die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde zuvor an eine geeignete Zielsequenz gebunden, so geht diese Sonde kein Hybrid mit einer mit einem Quencher markierten ersten Sonde ein. Infolgedessen wird nach Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes auf der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde eine Fluoreszenz beobachtet werden, die im Falle der Nichthybridisierung der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde mit der Zielsequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus infolge Hybridisierung der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde mit der mit einem Quencher markierten ersten Sonde nicht auftritt. Infolgedessen ist die beobachtete Fluoreszenz ein direktes qualitatives und auch quantifizierbares Signal für den Mikroorganismus bzw. dessen Menge, für den die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde spezifisch ist.With regard to the reaction mechanism of the first probe used in the method, which is labeled with a fluorescent dye, and a first probe which is labeled with a quencher, there are basically two different embodiments within the scope of the method according to the invention. In a first embodiment, the first probe, which is labeled with a fluorescent dye, diffuses to and binds to its target sequence within the microorganism after it has been added to the sample to be examined. In contrast to the prior art and in particular the standard FISH technique, in which it is removed with a stringent washing step, unbound and excess first probe labeled with a fluorescent dye is hybridized by adding a first probe labeled with a quencher and thus does not form a more fluorescent nucleic acid hybrid. If the first probe labeled with a fluorescent dye had previously bound to a suitable target sequence, then this probe does not hybridize with a first probe labeled with a quencher. As a result, after excitation of the fluorescent dye on the first probe labeled with the fluorescent dye, fluorescence will be observed, which in the case of non-hybridization of the first probe labeled with a fluorescent dye with the target sequence in the microorganism to be detected as a result of hybridization of the first probe labeled with a fluorescent dye with the a quencher labeled first probe does not occur. As a result, the observed fluorescence is a direct, qualitative and also quantifiable signal for the microorganism or its quantity, for which the first probe labeled with a fluorescent dye is specific.
Bei einer zweiten Ausführungsform werden die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde und die mit einem Quencher markierte erste Sonde gleichzeitig zu der zu analysierenden Probe hinzugegeben. Dabei kommt es selbst bei Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes auf der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde zu keiner Fluoreszenz, da die Fluoreszenz durch die Anwesenheit des Quenchers auf der mit dem Quencher markierten ersten Sonde gelöscht wird. Ohne darauf festgelegt zu sein wollen, gehen die vorliegenden Erfinder davon aus, dass dies dadurch erfolgt, dass die den Fluoreszenzfarbstoff tragende oder versehene, d.h. mit diesem markierte erste Sonde mit der den Quencher tragenden oder versehenen, d.h. mit diesem markierten ersten Sonde in einem Komplex, insbesondere einem Nukleinsäurehybrid vorliegen. Für den Fall, dass der nachzuweisende Mikroorganismus in der Probe vorhanden ist, dissoziiert das Nukleinsäurehybrid in die den Fluoreszenzfarbstoff tragende erste Sonde, die bevorzugterweise einzelsträngig ausgebildet ist, und die den Quencher tragende erste Sonde, die bevorzugterweise auch einzelsträngig ausgebildet ist. Die den Fluoreszenzfarbstoff tragende erste Sonde bindet an die Zielsequenzen innerhalb des nachzuweisenden Mirkoorganismen, für den die den Fluoreszenzfarbstoff tragende erste Sonde spezifisch ist, während die den Quencher tragende erste Sonde aufgrund des Fehlens einer komplementären Zielsequenz ungebunden in Lösung bleibt. Infolgedessen kommt es bei Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes der den Fluoreszenzfarbstoff tragenden ersten Sonde zu einer Fluoreszenz. Ist der nachzuweisende Mikroorganismus mit einer geeigneten Sondenbindungsstelle, d.h. einer Bindungsstelle für die den Fluoreszenzfarbstoff tragende erste Sonde nicht in der Lösung vorhanden, dann verbleibt das Nukleinsäurehybrid im nicht fluoreszierenden, bevorzugterweise doppelsträngigen Zustand in der Lösung. Wie auch bei der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform wird das Fluoreszenzsignal mittels eines Fluoreszenzdetektors wie z.B. mit einem Mikrotiterplatten-Fluorometer nachgewiesen.In a second embodiment, the first probe labeled with a fluorescent dye and the first probe labeled with a quencher are added simultaneously to the sample to be analyzed. There is no fluorescence even when the fluorescent dye is excited on the first probe marked with the fluorescent dye, since the fluorescence is quenched by the presence of the quencher on the first probe marked with the quencher. Without wanting to be bound to it, the present inventors assume that this occurs in that the fluorescent dye-carrying or provided, i.e. labeled with this first probe with the quencher-carrying or provided, i.e. labeled with this first probe in a complex , In particular a nucleic acid hybrid. If the microorganism to be detected is present in the sample, the nucleic acid hybrid dissociates into the first probe carrying the fluorescent dye, which is preferably single-stranded, and the first probe carrying the quencher, which is preferably also single-stranded. The first probe carrying the fluorescent dye binds to the target sequences within the microorganism to be detected for which the first probe carrying the fluorescent dye is specific, while the first probe carrying the quencher remains unbound in solution due to the lack of a complementary target sequence. As a result, when the fluorescent dye of the first probe carrying the fluorescent dye is excited, fluorescence occurs. If the microorganism to be detected with a suitable probe binding site, i.e. a binding site for the first probe carrying the fluorescent dye, is not present in the solution, then the nucleic acid hybrid remains in the non-fluorescent, preferably double-stranded state in the solution. As in the first embodiment described above, the fluorescence signal is detected using a fluorescence detector such as a microtiter plate fluorometer.
Der dem erfindungsgemäßen Verfahren zugrunde liegende Reaktionsmechanismus lässt sich somit, ohne darauf beschränkt zu sein, durch zwei verschiedene, konkurrierenden Hybridisierungsreaktionen beschreiben. Zum einen bilden die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde und die mit einem Quencher markierte erste Sonde über eine DNS:DNS-Hybridisierung ein nicht fluoreszentes Nukleinsäurehybrid in Lösung aus. Dieses Hybrid steht im thermodynamischen Gleichgewicht zu den dissoziierten Bestandteilen des Hybrides, also dissoziierter, mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierter ersten Sonde und dissoziierter, mit einem Quencher markierter erster Sonde. Zum anderen hybridisiert die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde nach Dissoziation dieses Hybrides über ein DNS:RNS-Hybridisierung an ihre Zielstelle auf der Zielsequenz innerhalb des nachzuweisenden Mikroorganismus. Zwischen diesen beiden Gleichgewichten fungiert das Zellhüllsystem, bevorzugt die Zellmembran/Zellwand des Mikroorganismus als semipermeable Barriere. Ein steigendes Fluoreszenzsignal indiziert eine Zuwachsrate an DNS:RNS Hybrid an den/der Zielstelle(n), d.h. Zielsequenz(en) des nachzuweisenden MO. In diesem Zusammenhang ist beachtlich, dass die vorbeschriebenen Reaktionen bzgl. des Transportes über das Zellhüllsystem auch bei einem nicht nachzuweisenden Mikroorganismus auftreten, dort es infolge des Fehlens der Zielsequenz(en) jedoch zu einer Reassoziation und demzufolge zu keiner Auflösung des DNS-DNS-Hybrides aus der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierter ersten Sonde und der mit einem Quencher markierten ersten Sonde kommt, so dass dort auch keine Fluoreszenzsignal nach Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde beobachtet werden kann. Vorstehend wurde das erfindungsgemäße Verfahren anhand von Sonden beschrieben, die aus Desoxyribonukleotiden bestehen und daher auch als DNS-Sonden hierin bezeichnet werden. Es wird jedoch von den Fachleuten anerkannt werden, dass grundsätzlich auch andere Sonden verwendet werden können, sofern diese Sonden das vorstehend beschriebene Verhalten bzgl. der Ausbildung verschiedener Hybride und insbesondere eine Dissoziation zugunsten der Ausbildung eines Komplexes aus der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde und einer Zielsequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus zeigen.The reaction mechanism on which the method according to the invention is based can thus be described by two different, competing hybridization reactions, without being restricted thereto. On the one hand, the first probe marked with a fluorescent dye and the first probe marked with a quencher form a non-fluorescent nucleic acid hybrid in solution via DNA:DNA hybridization. This hybrid is in thermodynamic equilibrium with the dissociated components of the hybrid, ie dissociated first probe labeled with the fluorescent dye and dissociated first probe labeled with a quencher. On the other hand, after dissociation of this hybrid, the first probe, which is labeled with a fluorescent dye, hybridizes via a DNA:RNA hybridization to its target site on the target sequence within the microorganism to be detected. Between these two equilibria, the cell envelope system acts as a semipermeable barrier, preferably the cell membrane/cell wall of the microorganism. An increasing fluorescence signal indicates an increase rate of DNA:RNA hybrid at the target site(s), ie target sequence(s) of the MO to be detected. In this It is noteworthy that the reactions described above regarding transport via the cell envelope system also occur in a microorganism that cannot be detected, but there due to the lack of the target sequence(s) there is a reassociation and consequently no resolution of the DNA-DNA hybrid from the first probe marked with a fluorescent dye and the first probe marked with a quencher, so that no fluorescence signal can be observed there either after excitation of the fluorescent dye of the first probe marked with the fluorescent dye. The method according to the invention was described above using probes which consist of deoxyribonucleotides and are therefore also referred to herein as DNA probes. However, it will be recognized by those skilled in the art that, in principle, other probes can also be used, provided that these probes show the behavior described above with regard to the formation of various hybrids and in particular dissociation in favor of the formation of a complex of the probe labeled with a fluorescent dye and a target sequence in the microorganism to be detected.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist eine Sonde wie hierin verwendet allgemein ein Molekül, welches mit einer Zielnukleinsäure spezifisch in Wechselwirkung treten kann. Bevorzugterweise handelt es sich bei den Sonden um Nukleinsäuresonden. Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff, dass ein Molekül spezifisch mit einer Zielnukleinsäure in Wechselwirkung treten kann, dass damit eine Zielnukleinsäure von einer Nicht-Zielnukleinsäure unterschieden werden kann. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei den Sonden um einzelsträngige Nukleinsäuresonden oder um zumindest teilweise einzelsträngige Nukleinsäuresonden. In der Ausführungsform, wo die Sonden zumindest teilweise einzelsträngige Sonden sind, ist vorgesehen das entweder die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert erste Sonde, die mit einem Quencher markierte erste Sonde oder beiden Sonden zumindest teilweise doppelsträngig sind. Es wird von den Fachleuten anerkannt werden, dass bevorzugterweise die mit dem Quencher versehene erste Sonde teilweise doppelsträngig ausgebildet ist. In der Ausführungsform, wo zumindest eine der beiden Sonden doppelsträngig ausgebildet ist, ist vorgesehen, dass die teilweise doppelsträngige Sonde erlaubt, dass der Nukleinsäurehybrid ausgebildet werden kann.In one embodiment of the invention, a probe as used herein is generally a molecule that can specifically interact with a target nucleic acid. The probes are preferably nucleic acid probes. As used herein, the term that a molecule is capable of specifically interacting with a target nucleic acid means that it can be used to distinguish a target nucleic acid from a non-target nucleic acid. In a further embodiment, the probes are single-stranded nucleic acid probes or at least partially single-stranded nucleic acid probes. In the embodiment where the probes are at least partially single-stranded probes, it is provided that either the first probe labeled with a fluorescent dye, the first probe labeled with a quencher, or both probes are at least partially double-stranded. It will be appreciated by those skilled in the art that preferably the quenched first probe is partially double-stranded. In the embodiment where at least one of the two probes is double-stranded, it is provided that the partially double-stranded probe allows the nucleic acid hybrid to be formed.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass ein Mikroorganismus nachgewiesen wird. Wie hierin verwendet bezeichnet dabei der Begriff „ein Mikroorganismus“ bevorzugterweise lediglich eine oder mehrere taxonomische Einheiten und/oder eine Gruppe von Mikroorganismen, die aufgrund bestimmter Kriterien künstlich zusammengestellt ist/sind. Es versteht sich dabei, dass beim Nachweis eines derartigen Mikroorganismus mehr als nur eine einzelne Zelle nachgewiesen wird. In der Regel erfolgt der Nachweis einer oder mehrerer Zellen, wobei der Nachweis auf dem Nachweis der von einer Einzelzellen ausgehenden Fluoreszenz beruht.It is within the scope of the present invention that a microorganism is detected. As used herein, the term "a microorganism" preferably designates only one or more taxonomic units and/or a group of microorganisms that is/are artificially assembled based on certain criteria. It goes without saying that when such a microorganism is detected, more than just a single cell is detected. As a rule, one or more cells are detected, the detection being based on the detection of the fluorescence emanating from a single cell.
Eine taxonomische Einheit, zu deren Nachweis das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann ist dabei eine solche, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die Domänen/Königreiche, Divisionen/Phyla, Klassen, Subklassen, Ordnungen, Subordnungen, Familien, Subfamilien, Gattungen, Untergattungen, Arten, Unterarten, Stämme und Unterstämme umfasst. Beispielhafte Domänen sind z.B. Eubacteria, Archae und Eukarya.A taxonomic unit for the detection of which the method according to the invention can be used is one selected from the group consisting of domains/kingdoms, divisions/phyla, classes, subclasses, orders, suborders, families, subfamilies, genera, subgenera, Includes species, subspecies, phyla and subphyla. Exemplary domains include Eubacteria, Archae, and Eukarya.
Eine künstlich zusammengestellte Gruppe sind beispielsweise solche Mikroorganismen, die in einer Probe kursorisch erfasst werden sollen, ohne dass es der Differenzierung der einzelnen taxonomischen Einheit bedarf. Derartig künstlich zusammengestellte Gruppen können bspw. solche der Gattung Lactobacillus und Art Megasphaera cerevisiae oder andere Kombinationen sein wie bspw. Coliforme Bakterien oder sog. „Schadorganismen“ für bestimmte Lebensmittel wie z.B. Schadorganismen für Bier, Käse etc.An artificially compiled group is, for example, those microorganisms that are to be recorded cursorily in a sample without the need to differentiate between the individual taxonomic units. Such artificially assembled groups can be, for example, those of the genus Lactobacillus and species Megasphaera cerevisiae or other combinations such as coliform bacteria or so-called "harmful organisms" for certain foods such as harmful organisms for beer, cheese, etc.
Die Probe, wie sie im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird, ist bevorzugterweise eine flüssige Probe, in der die nachzuweisenden Mikroorganismen in der flüssigen Phase vorliegen. Dabei ist ausreichend, wenn zumindest ein Teil der einzelnen Zellen des nachzuweisenden Mikroorganismus in der flüssigen Phase vorliegt. Insoweit ist die Probe bevorzugterweise eine flüssige Probe, wobei insbesondere unter der vorstehenden Voraussetzung auch eine nur teilweise flüssige Probe oder eine Suspension oder eine Dispersion verwendet werden kann.The sample used in the method according to the invention is preferably a liquid sample in which the microorganisms to be detected are present in the liquid phase. It is sufficient if at least some of the individual cells of the microorganism to be detected are present in the liquid phase. In this respect, the sample is preferably a liquid sample, in which case an only partially liquid sample or a suspension or a dispersion can also be used, in particular under the above prerequisite.
Die im Rahmen der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu analysierende Probe kann dabei eine jegliche Primärprobe sein, von der eine Sekundärprobe erzeugt wird, die dann als flüssige Probe in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird. Eine Primärprobe kann eine feste, pastöse, flüssige oder gasförmige Probe sein. Typischerweise wird von der Primärprobe eine repräsentative Mischung von Mikroorganismen erhalten, die dann in die flüssige Probe, wie sie im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird, überführt wird.The sample to be analyzed when carrying out the method according to the invention can be any primary sample from which a secondary sample is generated, which is then used as a liquid sample in the method according to the invention. A primary sample can be a solid, pasty, liquid or gaseous sample. Typically, a representative mixture of microorganisms is obtained from the primary sample, which is then converted into the liquid sample used in the method of the invention.
Es wird von den Fachleuten anerkannt werden, dass das Löschen in Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht notwendigerweise vollständig ist. Für die Zwecke des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es ausreichend, wenn ein signifikanter und unter Verwendung des jeweiligen Nachweissystems, d.h. Detektors, ausreichender Signalunterschied zwischen dem Vorliegen einer nicht mit einer/der mit einem Quencher markierten ersten Sonde hybridisierten mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und einem Komplex, d.h. Nukleinsäurehybrid aus einer/der mit einem Quencher markierten ersten Sonde und einer/der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde vorliegt. Dabei kann das Ausmaß des Löschens von etwa 10 bis 90%, bevorzugterweise etwa 50% und mehr betragen.It will be appreciated by those skilled in the art that the quenching in step d) of the method of the invention is not necessarily complete. For the purposes of the method according to the invention, it is sufficient if there is a significant and, using the respective detection system, ie detector, sufficient signal difference between the presence of a first probe not hybridized with a quencher-labeled first probe labeled with a fluorescent dye and a complex ie a nucleic acid hybrid of a/the first probe labeled with a quencher and a/the first probe labeled with a fluorescent dye is present. In this case, the extent of the erasure can be from about 10 to 90%, preferably about 50% and more.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung und insbesondere des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass die Mikroorganismen einer Probe und damit auch der in der Probe enthaltene nachzuweisende Mikroorganismus „fixiert“ wird oder in der Probe bereits fixiert vorliegt. Dabei wird unter dem Begriff des Fixierens hierin bevorzugterweise ein Fixieren verstanden, wie es auch im Rahmen von Standard-FISH-Techniken zur Anwendung gelangt und beispielsweise beschrieben ist in Amann R., und Fuchs B. (2008): Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6: 339-350.It is within the scope of the present invention and in particular of the method according to the invention that the microorganisms of a sample and thus also the microorganism to be detected contained in the sample are “fixed” or are already fixed in the sample. The term “fixing” here is preferably understood to mean fixing, as is also used in the context of standard FISH techniques and is described, for example, in Amann R. and Fuchs B. (2008): Single-cell identification in microbial Communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6:339-350.
Ziel des Fixierens ist es, das Zellhüllsystem, d.h. Zellwand und/oder Zellmembran so zu modifizieren, dass das Zellhüllsystem einen Transportwiderstand für die Passage eines doppelsträngigen Komplexes, insbesondere eines Nukleinsäurehybrides, das aus einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und einer mit einem Quencher markierten ersten Sonde besteht, aufbaut, so dass ein derartige Komplex aus der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und der mit einem Quencher markierten ersten Sonde nicht oder zumindest deutlich schlechter oder langsamer über das Zellhüllsystem gelangt als die nicht als Komplex, d.h. Nukleinsäurehybrid, oder in einem derartigen Komplex, insbesondere einem derartigen doppelsträngigen Komplex vorliegende mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde oder mit einem Quencher markierten erste Sonde.The aim of fixing is to modify the cell envelope system, i.e. cell wall and/or cell membrane, in such a way that the cell envelope system has a transport resistance for the passage of a double-stranded complex, in particular a nucleic acid hybrid, consisting of a first probe marked with a fluorescent dye and a first probe marked with a quencher first probe consists, so that such a complex of the first probe labeled with a fluorescent dye and the first probe labeled with a quencher does not, or at least significantly worse or more slowly, passes through the cell envelope system than the non-complex, i.e. nucleic acid hybrid, or in one such a complex, in particular such a double-stranded complex present with a fluorescent dye labeled first probe or labeled with a quencher first probe.
Entsprechend erfolgt die Fixierung unter Verwendung von einem Alkohol, insbesondere eines kurzkettigen Alkohols wie bspw. Ethanol, Methanol oder Isopropylalkohol. Anstelle eines Alkohols kann auch Formaldehyd oder para-Formaldehyd verwendet werden. Die genauen Reaktionsbedingungen eines derartigen Fixierverfahrens können durch einfache Standardversuche und Routineexperimente bestimmt werden und sind im Rahmen des durchschnittlichen Könnens eines Fachmannes auf dem Gebiet der mikrobiellen Diagnostik.Correspondingly, the fixation takes place using an alcohol, in particular a short-chain alcohol such as ethanol, methanol or isopropyl alcohol. Instead of an alcohol, formaldehyde or para-formaldehyde can also be used. The exact reaction conditions of such a fixation method can be determined by simple standard trials and routine experimentation and are within the ordinary skill of a person skilled in the art of microbial diagnostics.
Neben der Behandlung mittels Alkohol oder Formaldehyd und deren entsprechenden Derivaten zum Zwecke des Fixierens, ist es auch im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass die Zelle bzw. das Zellhüllsystem wie bspw. die Zellwand, insbesondere bei Gram-positiven einer enzymatischen Behandlung unterzogen wird. Im Rahmen der enzymatischen Behandlung wird das Passage-Verhalten des doppelsträngigen Komplexes aus mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und einer mit einem Quencher markierten ersten Sonde, und/oder der nicht im Komplex vorliegenden mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und/oder der nicht im Komplex vorliegenden mit dem Quencher markierten ersten Sonde geändert. Vorteilhafterweise wird die Durchgängigkeit der nicht in dem doppelsträngigen Komplex vorliegenden mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und der nicht in dem doppelsträngigen Komplex vorliegenden mit einem Quencher versehenen ersten Sonde erhöht.In addition to the treatment with alcohol or formaldehyde and their corresponding derivatives for the purpose of fixing, it is also within the scope of the method according to the invention that the cell or the cell envelope system such as the cell wall, especially in the case of Gram-positive cells, is subjected to an enzymatic treatment. As part of the enzymatic treatment, the passage behavior of the double-stranded complex of a fluorescent dye-labeled first probe and a quencher-labeled first probe, and / or not in the complex with the fluorescent dye-labeled first probe and / or not in the complex present first probe marked with the quencher changed. Advantageously, the permeability of the fluorescently labeled first probe not in the double-stranded complex and the quenched first probe not in the double-stranded complex is increased.
Bevorzugterweise erfolgt die Fixierung des Mikroorganismus vor der Hybridisierung der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde mit der Zielsequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus. Dabei gilt es, bevorzugterweise, zum einen die Integrität und, in einem gewissen Umfang, auch die Form der nachzuweisenden Zellen beizubehalten sowie einen Verlust an Zellen des nachzuweisenden Mikroorganismus insbesondere durch Lyse zu vermeiden. Andererseits gilt es so viele Zellen wie möglich des nachzuweisenden Mikroorganismus durch das Fixieren zu permeabilisieren, so dass die mit einem Fluoreszenzfarbstoff und/oder mit einem Quencher markierten Sonden, insbesondere einzeln bzw. als Einzelstrang in die Zellen eindringen können, um dort an die Zielsequenz(en), sofern dort vorhanden, zu hybridisieren.The microorganism is preferably fixed before the hybridization of the first probe, labeled with a fluorescent dye, with the target sequence in the microorganism to be detected. It is important here, preferably, on the one hand to maintain the integrity and, to a certain extent, also the shape of the cells to be detected and to avoid a loss of cells of the microorganism to be detected, in particular through lysis. On the other hand, it is important to permeabilize as many cells as possible of the microorganism to be detected by the fixation, so that the probes marked with a fluorescent dye and/or with a quencher can penetrate into the cells, in particular individually or as a single strand, in order to attach to the target sequence ( en), if present there, to hybridize.
Infolge der Diversität der Zellhüllsysteme und insbesondere auch der Zellwände der verschiedenen nachzuweisenden Mikroorganismus erfolgt bevorzugterweise eine Adaptierung der Reaktionsbedingungen für die Fixierung des im Einzelfalle nachzuweisenden Mikroorganismus. Es wird jedoch anerkannt werden, dass mit der hierin vermittelten technischen Lehre der Fachmann in der Lage sein wird, eine derartige Adaptierung durch Routineversuche vorzunehmen. Bevorzugterweise wird eine Fixierung durch niedere Alkohole, insbesondere Ethanol, oder Formaldehyd oder para-Formaldehyd erfolgen. Die Fixierung kann dabei auch eine enzymatische Behandlung umfassen. Eine enzymatische Behandlung kann in Abhängigkeit von der Art der Zellwand oder deren Modifizierung bspw. mittels Lysozym erfolgen, für den Fall, dass ein dickes Peptidoglycan vorliegt, oder mittels Proteasen, für den Fall, dass eine Proteinzellwand vorliegt. Weitere Behandlungen können bspw. die kurzzeitige Behandlung der Zellen mittels Lösungsmitteln oder Salzsäure zur Entfernung von insbesondere Wachsschichten umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Schritt des Fixierens in dem erfindungsgemäßen Verfahren dazu führt, dass die fixierten Zellen nicht mehr lebensfähig sind und bevorzugtererweise dennoch intakt, bevorzugt morphologisch intakt vorliegen.Due to the diversity of the cell envelope systems and in particular also the cell walls of the various microorganisms to be detected, the reaction conditions for fixing the microorganism to be detected in the individual case are preferably adapted. However, it will be appreciated that, given the teachings herein, those skilled in the art will be able to make such adaptation through routine experimentation. Fixing is preferably carried out using lower alcohols, in particular ethanol, or formaldehyde or paraformaldehyde. The fixation can also include an enzymatic treatment. An enzymatic treatment can be carried out depending on the type of cell wall or its modification, for example, using lysozyme in the case where a thick peptidoglycan is present, or using proteases in the case where a protein cell wall is present. Further treatments can include, for example, the short-term treatment of the cells with solvents or hydrochloric acid to remove layers of wax in particular. In a preferred embodiment it is provided that the fixing step in the method according to the invention has the result that the fixed cells are no longer viable and are preferably still intact, preferably morphologically intact.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde und/oder die mit einem Quencher markierte erste Sonde eine einzelsträngige Nukleinsäure ist. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die besagten Sonden einzeln und unabhängig voneinander auch doppelsträngig ausgebildet sein können, wobei eine derartige doppelsträngige Struktur bspw. durch Rückfaltung oder Ausbildung eines sog. hair-pins ausgebildet werden kann. Alternative kann eine derartige doppelsträngige Struktur auch aus zwei einzelnen, d.h. separaten Strängen ausgebildet werden. It is within the scope of the present invention that the first probe labeled with a fluorescent dye and/or the first probe labeled with a quencher is a single-stranded nucleic acid. It is within the scope of the present invention that said probes can also be formed individually and independently of one another as double-stranded, with such a double-stranded structure being able to be formed, for example, by folding back or forming a so-called hairpin. Alternatively, such a double-stranded structure can also be formed from two individual, i.e. separate, strands.
Bevorzugterweise ist in dem Fall, dass die Sonde doppelsträngig ausgebildet ist, lediglich ein Teil der Sequenz, die, im Falle der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde, spezifisch für den nachzuweisenden Mikroorganismus ist, bzw. im Falle der mit einem Quencher markierten ersten Sonde im wesentlichen komplementär zu der fluoreszenzmarkierten Sonde, d.h. der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde, ist, doppelsträngig ausgebildet. Das Ausmaß der Ausbildung eines Doppelstranges in den jeweiligen Sonden ist von den Erfordernissen der Hybridisierung mit der Zielsequenz und insbesondere der Hybridisierung mit der jeweils komplementären Sonde abhängig.Preferably, in the case that the probe is double-stranded, only part of the sequence, which, in the case of the first probe labeled with a fluorescent dye, is specific for the microorganism to be detected, or in the case of the first probe labeled with a quencher substantially complementary to the fluorescently labeled probe, i.e. the first probe labeled with a fluorescent dye, is double-stranded. The extent to which a double strand is formed in the respective probes depends on the requirements of the hybridization with the target sequence and in particular the hybridization with the respective complementary probe.
Eine jede der im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Sonde kann dabei als DNS, RNS, PNS oder LNS, oder Kombinationen von zwei oder mehreren davon ausgebildet sein.Each of the probes to be used within the scope of the present invention can be in the form of DNA, RNA, PNS or LNS, or combinations of two or more thereof.
Sonden, die vollständig oder zumindest teilweise aus PNS oder PNA („peptide nucleic acid“), oder LNS oder LNA („locked nucleic acid“) bestehen, weisen eine höhere Affinität für komplementäre Nukleinsäuren auf. Fluoreszenzmarkierte PNS wurden bereits für den Einzellnachweis von marinen Cyanobakterien verwendet. Nukleinsäuresonden mit 2 bis 4 LNS wurden als 16S rRNA-Sonden verwendet, wobei deren Bindungsstärke um den Faktor 16 erhöht war. PNS- und/oder LNS-haltige Sonden sind besonders für solche Zielsequenzen geeignet, die eine starke Sekundärstruktur aufweisen.Probes that consist entirely or at least partially of PNS or PNA (“peptide nucleic acid”), or LNS or LNA (“locked nucleic acid”) have a higher affinity for complementary nucleic acids. Fluorescence-labeled PNS have already been used for single-cell detection of marine cyanobacteria. Nucleic acid probes with 2 to 4 LNS were used as 16S rRNA probes with their binding strength increased 16-fold. PNS- and/or LNS-containing probes are particularly suitable for those target sequences that have strong secondary structure.
Die Ausgestaltung bzw. Auswahl der die jeweiligen Sonden ausbildenden Nukleotide ist im Rahmen des Könnens des Durchschnittsfachmannes auf dem Gebiet der Erfindung und kann durch Routineverfahren und -überlegungen im Lichte der hierin gegebenen Offenbarung und insbesondere des der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden mutmaßlichen Mechanismus erfolgen.The design or selection of the nucleotides forming the particular probes is within the skill of one of ordinary skill in the art and can be made by routine methods and considerations in light of the disclosure herein and particularly the putative mechanism underlying the present invention.
Die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde ist spezifisch für den nachzuweisenden Mikroorganismus. Die Erzeugung entsprechender spezifischer Sonden ist den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Die Spezifität wird bevorzugterweise über den Homologiegrad zwischen der Sonde und der Zielsequenz der Sonde bestimmt. Bevorzugterweise ist der Homologiegrad mindestens 70%, bevorzugterweise mindestens 80%, bevorzugtererweise mindestens 95% und am bevorzugtesten mindestens 96%, 97%, 98%, 99% oder 100%. In einer Ausführungsform ist die Sonde damit innerhalb der vorgegebenen Homologiewerte im Wesentlichen identisch mit der Zielsequenz. Alternativ kann die Nukleotidsequenz der Sonde im wesentlichen revers komplementär zu der Zielsequenz sein. Auch dann gelten die vorstehend genannten Homologiewerte als Ausmaß der Identität bzw. Komplementarität der Nukleotidsequenz der Sonde mit bzw. zu der Zielsequenz. Alternative kann, insbesondere im Falle einer revers komplementären Sequenz, das Ausmaß der Homologie durch die Bedingungen, unter denen noch eine Hybridisierung der Sonde und der Zielsequenz erfolgt, definiert werden. Die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde ist bevorzugterweise revers komplementär zu der Zielsequenz, bevorzugterweise wenn sie mit der Zielsequenz unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert. Entsprechende Bedingungen sind in der europäischen Patenanmeldung EP 00 931 109.3 beschriebenThe first probe, which is labeled with a fluorescent dye, is specific for the microorganism to be detected. The generation of corresponding specific probes is known to those skilled in the art. The specificity is preferably determined via the degree of homology between the probe and the target sequence of the probe. Preferably the degree of homology is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 95% and most preferably at least 96%, 97%, 98%, 99% or 100%. In one embodiment, the probe is thus substantially identical to the target sequence within the specified homology values. Alternatively, the nucleotide sequence of the probe can be substantially reverse complementary to the target sequence. Even then, the homology values mentioned above apply as the extent of the identity or complementarity of the nucleotide sequence of the probe with or to the target sequence. Alternatively, particularly in the case of a reverse-complementary sequence, the extent of the homology can be defined by the conditions under which the probe and the target sequence are still hybridized. The first probe labeled with a fluorescent dye is preferably reverse complementary to the target sequence, preferably when hybridizing to the target sequence under moderate or stringent conditions. Corresponding conditions are described in the European patent application EP 00 931 109.3
Das hierin zu der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde Gesagte gilt auch für die mit einem Quencher markierte erste Sonde, wobei es für den Fachmann offenkundig ist, dass die mit einem Quencher markierte erste Sonde im wesentlichen revers komplementär zu der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde ist und das Ausmaß der Komplementarität zwischen dieser, mit einem Quencher markierten ersten Sonde und der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde im gleichen Maße definiert werden kann, wie im Falle der Komplementarität zwischen der Zielsequenz in dem nachzuweisenden Mirkoorganismus und der der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde, was hierin durch Bezugnahme zur Vermeidung von Wiederholungen aufgenommen wird.What is said herein about the first probe labeled with a fluorescent dye also applies to the first probe labeled with a quencher, it being obvious to the person skilled in the art that the first probe labeled with a quencher is essentially reverse complementary to the first probe labeled with a fluorescent dye and the degree of complementarity between this quencher-labeled first probe and the fluorescent dye-labeled first probe in the same degree, such as in the case of complementarity between the target sequence in the microorganism to be detected and that of the first probe labeled with a fluorescent dye, which is incorporated herein by reference to avoid repetition.
Zielsequenzen, die den spezifischen Nachweis eines Mikroorganismus erlauben, sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Bevorzugte Zielsequenzen sind insbesondere 16S rRNS, 23S rRNS, 18S rRNS, tRNS, EF-Tu, mRNS 16S-23S rRNA-Spacer und 23S-5S rRNA-Spacer. Siehe hierzu insbesondere beispielhaft „Archaeal diversity in naturally occurring and impacted environments from a tropical region.“ Clementino MM, Fernandes CC, Vieira RP, Cardoso AM, Polycarpo CR, Martins OB. J Appl Microbiol. 2007 Jul;103(1):141-51; „Interand intraspecific genomic variability of the 16S-23S intergenic spacer regions (ISR) in representatives of Acidithiobacillus thiooxidans and Acidithiobacillus ferrooxidans.“ Ni YQ, Yang Y, Bao JT, He KY, Li HY. FEMS Microbiol Lett. 2007 May;270(1):58-66. Epub 2007 Feb 16.; „Identification of medically important Candida and non-Candida yeast species by an oligonucleotide array.“ Leaw SN, Chang HC, Barton R, Bouchara JP, Chang TC. J Clin Microbiol. 2007 Jul;45(7):2220-9. Epub 2007 May 16; oder „PCR-based identification and strain typing of Pichia anomala using the ribosomal intergenic spacer region IGS1.“ Bhardwaj S, Sutar R, Bachhawat AK, Singhi S, Chakrabarti A. J Med Microbiol. 2007 Feb;56(Pt 2): 185-9.Target sequences that allow specific detection of a microorganism are known to those skilled in the art. In particular, preferred target sequences are 16S rRNA, 23S rRNA, 18S rRNA, tRNA, EF-Tu, mRNA 16S-23S rRNA spacer and 23S-5S rRNA spacer. See in particular "Archaeal diversity in naturally occurring and impacted environments from a tropical region." Clementino MM, Fernandes CC, Vieira RP, Cardoso AM, Polycarpo CR, Martins OB. J Appl Microbiol. 2007 Jul;103(1):141-51; "Interand intraspecific genomic variability of the 16S-23S intergenic spacer regions (ISR) in representatives of Acidithiobacillus thiooxidans and Acidithiobacillus ferrooxidans." Ni YQ, Yang Y, Bao JT, He KY, Li HY. FEMS Microbiol Lett. 2007 May;270(1):58-66. Epub 2007 Feb 16th; "Identification of medically important Candida and non-Candida yeast species by an oligonucleotide array." Leaw SN, Chang HC, Barton R, Bouchara JP, Chang TC. J Clin Microbiol. 2007 Jul;45(7):2220-9. Epub 2007 May 16; or "PCR-based identification and strain typing of Pichia anomala using the ribosomal intergenic spacer region IGS1." Bhardwaj S, Sutar R, Bachhawat AK, Singhi S, Chakrabarti A. J Med Microbiol. 2007 Feb;56(Pt 2):185-9.
Die Länge der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und der mit einem Quencher markierten ersten Sonde beträgt unabhängig von einander etwa 15 bis 31 Nukleotide, bevorzugterweise etwa 17 bis 25 Nukleotide, bevorzugtererweise etwa 17 bis 23 Nukleotide und am bevorzugtesten 17 oder 18 Nukleotide. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die beiden Sonden im Wesentlichen gleich lang. Beide Sonden können weitere Nukleotide umfassen, als es zur Ausbildung der vorstehend genannten Längen erforderlich ist, wobei diese weiteren Nukleotide jedoch bevorzugterweise dann nicht zur Ausbildung einer doppelsträngigen Struktur beitragen oder an dieser beteiligt sind, wenn sich die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde mit der mit einem Quencher markierten ersten Sonde basenpaart, wobei die Basenpaarung bevorzugterweise eine Watson-Crick-Basenpaarung ist, und einen hybridisierten Komplex ausbildet. In einer Ausführungsform ist die Länge der Sonden und der zueinander komplementäre Bereich der Sonden gleich lang und bevorzugterweise identisch.The length of the first probe labeled with a fluorescent dye and the first probe labeled with a quencher are independently about 15 to 31 nucleotides, preferably about 17 to 25 nucleotides, more preferably about 17 to 23 nucleotides and most preferably 17 or 18 nucleotides. In a preferred embodiment, the two probes are essentially the same length. Both probes can include more nucleotides than is required to form the above-mentioned lengths, but these other nucleotides preferably do not contribute to the formation of a double-stranded structure or are involved in this when the first probe, which is labeled with a fluorescent dye, interacts with the a quencher-labeled first probe, the base pairing preferably being a Watson-Crick base pairing, and forming a hybridized complex. In one embodiment, the length of the probes and the mutually complementary region of the probes are of the same length and preferably identical.
Für die Auswahl der Länge der Sonden kann der hierin offenbarte Reaktionsmechanismus herangezogen werden, gemäß dessen die Dissoziation der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und der mit einem Quencher markierten ersten Sonde, die, im Falle der Ausgestaltung der beiden Sonden als DNS-Sonden, im Gleichgewicht als DNS:DNS-Hybrid in Lösung vorliegen. Je länger die beiden Sonden sind, desto stärker liegt das Gleichgewicht der Dissoziation wegen der höheren thermischen Stabilität auf der Seite des DNS:DNS-Hybrides. Eine Verschiebung des Gleichgewichts hin zum DNS:RNS-Hybrid an die Zielnukleinsäure des Mikroorganismus ist dann nur mehr durch überhöhte Hybridisierungstemperaturen oder durch DNS destabilisierende Agenzien erreichbar. Gleiches gilt für die Ausgestaltung der Sonden, die andere als Desoxyribonukleotide verwenden.The reaction mechanism disclosed herein can be used to select the length of the probes, according to which the dissociation of the first probe marked with a fluorescent dye and the first probe marked with a quencher, which, in the case of the design of the two probes as DNA probes, in equilibrium as a DNA:DNA hybrid in solution. The longer the two probes are, the more the dissociation equilibrium favors the DNA:DNA hybrid because of the higher thermal stability. A shift in the equilibrium towards the DNA:RNA hybrid to the target nucleic acid of the microorganism can then only be achieved by excessive hybridization temperatures or by DNA-destabilizing agents. The same applies to the design of the probes that use other than deoxyribonucleotides.
Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe sind insbesondere solche, wie sie auch im Rahmen der Standard-FISH-Technik verwendet werden können. Der Fluoreszenzfarbstoff kann beispielsweise aus der Gruppe ausgewählt sein, die FAM, TAMRA, CY3, Alexa 350, Pacific Blue, Coumarin, Cy2, Alexa 488, TET, Alexa 532, HEX, Alexa 546, TMR, Cy3.5, Alexa 568, Texas red, Alexa 594, Alexa 633, Cy5, Cy5.5 Alexa 660, Alexa 680, Rox und Vic umfasst. Es wird von den Fachleuten auf dem Gebiet anerkannt werden, dass es grundsätzlich keine Beschränkung hinsichtlich der Eignung von Fluoreszenzfarbstoffen gibt, jedoch solche Fluoreszenzfarbstoffe bevorzugt sind, für die es einen im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbaren Quencher gibt.The fluorescent dyes used in the method according to the invention are in particular those which can also be used in the standard FISH technique. For example, the fluorescent dye can be selected from the group consisting of FAM, TAMRA, CY3, Alexa 350, Pacific Blue, Coumarin, Cy2, Alexa 488, TET, Alexa 532, HEX, Alexa 546, TMR, Cy3.5, Alexa 568, Texas red, Alexa 594, Alexa 633, Cy5, Cy5.5 Alexa 660, Alexa 680, Rox and Vic. It will be appreciated by those skilled in the art that there is in principle no restriction as to the suitability of fluorescent dyes, however, those fluorescent dyes for which there is a quencher which can be used in the context of the method according to the invention are preferred.
Hinsichtlich der Ausgestaltung bzw. der Auswahl des Quenchers bestehen ebenfalls grundsätzlich keine Beschränkungen. Es wird jedoch anerkannt werden, dass die Auswahl des Fluoreszenzfarbstoffes und des Quenchers so erfolgen muss, dass eine ausreichende Löschung des Fluoreszenzsignals des Fluoreszenzfarbstoffes nach dessen Anregung entweder direkt oder indirekt erfolgt. Eine ausreichende Löschung ist wie hierin bereits festgestellt eine solche, welche einen Unterschied bzw. Unterscheidung zwischen dem gelöschten und dem ungelöschten Zustand erlaubt.With regard to the design or the selection of the quencher, there are also basically no restrictions. However, it will be appreciated that the choice of fluorescer and quencher must be such that there is sufficient quenching of the fluorescence signal of the fluorescer upon its excitation, either directly or indirectly. A sufficient erasure, as stated herein, is one that allows for a distinction between the erased and unerased states.
Es ist dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung und Gegenstand einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass der Quencher wiederum selbst ein Fluoreszenzfarbstoff ist.It is within the scope of the present invention and the subject matter of one embodiment of the method according to the invention that the quencher itself is a fluorescent dye.
Einige exemplarische Kombinationen von Fluoreszenzfarbstoff und Quencher sind in der folgenden Tabelle angegeben.
Weitere Kombinationen finden sich im Stand der Technik, so z.B. bei Marras et al. (Marras S. A. E., Kramer F. R., and Tyagi S. (2002): Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nuc. Acids Res. 30: e122). sowie bei Marras et al, 2006 (aaO).Other combinations can be found in the prior art, e.g., in Marras et al. (Marras SA, Kramer F.R., and Tyagi S. (2002): Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nuc. Acids Res. 30:e122). as well as in Marras et al, 2006 (loc. cit.).
Bei der Auswahl eines geeigneten Paares aus Fluoreszenzfarbstoff und Quencher kann dabei unterschieden werden, ob es sich bei dem beobachteten bzw. zugrundeliegenden Löschen entweder um ein statisches Löschen oder ein dynamisches Löschen handelt. Die Positionierung des Fluoreszenzfarbstoffes und des Quenchers kann in Abhängigkeit davon erfolgen, ob es sich um ein statisches oder ein dynamisches Löschen handelt.When selecting a suitable pair of fluorescent dye and quencher, a distinction can be made as to whether the observed or underlying quenching is either static quenching or dynamic quenching. The fluorescent dye and the quencher can be positioned depending on whether the quenching is static or dynamic.
Generell wird als Fluoreszenzquenching die Abschwächung oder die Auslöschung eines Fluoreszenzsignals bezeichnet. Für eine optimale Quenchingeffizienz ist dabei eine genaue Abstimmung von Fluoreszenzfarbstoff und korrespondierendem Quencher entscheidend (Marras, 2006; Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes. In: Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes: Design and Protocols. Methods in Molecular Biology. 335: 3-16).Fluorescence quenching generally refers to the weakening or extinguishing of a fluorescence signal. Precise matching of the fluorescent dye and the corresponding quencher is crucial for optimal quenching efficiency (Marras, 2006; Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes. In: Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes: Design and Protocols. Methods in Molecular Biology 335:3-16).
Ein Fluoreszenzfarbstoff, hierin auch als Fluorophor bezeichnet, ist ein Molekül, das Licht bei einer charakteristischen Wellenlänge, idealerweise an seinem Absorbtionsmaximum, absorbiert bzw. davon energetisch angeregt wird. Dieses Licht (Photon) wird nach einer bestimmten Zeit z. B. wieder in Form von Fluoreszenz oder als Schwingungsenergie (Wärme) emittiert. Das Fluorophor kehrt dabei in den energetisch günstigeren nicht angeregten Ausgangszustand zurück. Ein Quencher (Akzeptor) ist ein Molekül, das Energie von einem angeregten Fluorophor (Donator oder Donor) absorbiert und damit dessen Fluoreszenzemission auslöscht. Beim sogenannten statischen Quenching bzw. Kontaktquenching bildet sich im angeregten Zustand ein nicht-fluoreszenter Komplex zwischen Fluorophor und Quencher. Donator und Akzeptor befinden sich beim statischen Quenching räumlich sehr nahe (< oder gleich 20 Å). Die Moleküle interagieren dabei direkt durch einen Protonen-gekoppelten Elektronentransfer mittels der Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen (Förster, 1948, Intermolecular energy transference and fluorescence. Ann. Phys. 2: 55-75; Lakowicz, 1999, Principles of Fluorescence Spectroscopy. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY.; Marras, 2006, aaO).A fluorescent dye, also referred to herein as a fluorophore, is a molecule that absorbs or is energetically excited by light at a characteristic wavelength, ideally at its absorption maximum. This light (photon) is after a certain time z. B. emitted again in the form of fluorescence or as vibrational energy (heat). The fluorophore then returns to the energetically more favorable non-excited initial state. A quencher (acceptor) is a molecule that absorbs energy from an excited fluorophore (donor or donor), thereby quenching its fluorescence emission. In so-called static quenching or contact quenching, a non-fluorescent complex is formed between the fluorophore and the quencher in the excited state. In static quenching, the donor and acceptor are spatially very close (< or equal to 20 Å). The molecules interact directly through a proton-coupled electron transfer through the formation of hydrogen bonds (Förster, 1948, Intermolecular energy transference and fluorescence. Ann. Phys. 2: 55-75; Lakowicz, 1999, Principles of Fluorescence Spectroscopy. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY.; Marras, 2006, supra).
Infolgedessen wird beim Vorliegen eines statischen Löschens oder Quenches der Fluoreszenzfarbstoff in einer räumlichen Nähe von typischweise < oder gleich 20 Angström vorliegen.As a result, in the presence of a static quench, the fluorescent dye will be in close proximity, typically < or equal to 20 angstroms.
Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Methode des dynamischen Quenchings, dem sogenannten FRET-Quenching (Fluorescence Resonance Energy Transfer) zur Anwendung gelangt. Bei dem das angeregte Fluorophor seine Energie auf den Quencher überträgt und danach strahlungslos in den Grundzustand zurückkehrt. Donator und Akzeptor befinden sich in einem räumlichen Abstand von 40-100 Å (was ca. 3 bis 30 Nukleotiden innerhalb einer doppelsträngigen DNS entspricht). Eine Voraussetzung für FRET-Quenching ist zudem, dass das Fluoreszenzemissionsspektrum des Donators mit dem Absorbtionsspektrum des Akzeptors überlappt.However, it is also within the scope of the present invention that the method of dynamic quenching, the so-called FRET quenching (fluorescence resonance energy transfer), is used. In which the excited fluorophore transfers its energy to the quencher and then returns to the ground state without radiation. Donor and acceptor are in a spatial distance of 40-100 Å (corresponding to about 3 to 30 nucleotides within a double-stranded DNA). A prerequisite for FRET quenching is that the fluorescence emission spectrum of the donor overlaps with the absorption spectrum of the acceptor.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Sonde, die spezifisch ist für den nachzuweisenden Organismus, sowohl den Fluoreszenzfarbstoff trägt als auch den Quencher. Derartige Konstrukte sind in der Technik bekannt und unter anderem beschrieben in der internationalen Patentanmeldung
In einer derartigen Ausführungsform erfolgt somit die Zugabe von lediglich einer entsprechend markierten und für den Nachweis des nachzuweisenden Mikroorganismus spezifischen Sonde.In such an embodiment, only one appropriately labeled probe specific for the detection of the microorganism to be detected is added.
Das Verhältnis der beiden in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten ersten Sonden, d.h. der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und der mit einem Quencher markierten ersten Sonde hängt von den Bedingungen der konkreten einzelnen Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung ab und kann im Rahmen von Routineuntersuchungen leicht von den Fachleuten auf dem Gebiet bestimmt werden. Dabei ist beachtlich, dass sich aufgrund des angenommenen Mechanismus über zwei konkurrierende Gleichgewichte von DNS:DNS und DNS:RNS die Anpassungen der Parameter Temperatur und Salzgehalt in sehr engen Grenzen bewegt, so dass sich als in Frage kommender Temperaturbereich unter Beibehaltung der hierin angegebenen Sondenlängen dieser in den Grenzen 30-45°C bei 0-100mM NaCl oder eines anderen monovalenten Kations (z.B. K+ , Li+ etc) bewegen. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zu verwendenden Kompetitorsonden werden in ähnlicher Weise wie bei der Standard-FISH-Technologie weitestgehend vom Zielorganismus und dessen nächsten Verwandten abhängig ausgestaltet, was im Rahmen der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmannes ist.The ratio of the two first probes used in the method according to the invention, ie the first probe labeled with a fluorescent dye and the first probe labeled with a quencher Probe depends on the conditions of the particular particular embodiment of the method according to the invention and can be easily determined by those skilled in the art within the framework of routine investigations. It is noteworthy that due to the assumed mechanism of two competing equilibria of DNA:DNA and DNS:RNA, the adjustments of the parameters temperature and salinity are within very narrow limits, so that the temperature range in question while maintaining the probe lengths given here is this move within the limits 30-45°C at 0-100mM NaCl or another monovalent cation (e.g. K + , Li + etc). The competitor probes to be used within the scope of the method according to the invention are designed to be largely dependent on the target organism and its closest relatives, in a manner similar to standard FISH technology, which is within the capabilities of the person skilled in the art.
Es ist im Rahmen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, dass der nachzuweisende Mikroorganismus und/oder die in der Probe enthaltenen Mikroorganismen an eine Oberfläche immobilisiert werden oder sind. Die Oberfläche kann dabei eine von dem Reaktionsgefäß, in dem das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, bereitgestellte Oberfläche sein. Dabei sind grundsätzlich für das erfindungsgemäße Verfahren alle Formate denkbar, die eine Hybridisierung in Suspension und/oder Lösung, aber auch an einer Oberfläche ermöglichen, so dass neben Mikrotiterplatten z. B. auch Küvetten, Reaktionsgefäße jeglicher Art und Größe usw. in Frage kommen und verwendet werden können.It is within the scope of one embodiment of the present invention that the microorganism to be detected and/or the microorganisms contained in the sample are or are immobilized on a surface. The surface can be a surface provided by the reaction vessel in which the method according to the invention is carried out. In principle, all formats are conceivable for the method according to the invention that allow hybridization in suspension and/or solution, but also on a surface, so that in addition to microtiter plates, e.g. B. also cuvettes, reaction vessels of any type and size, etc. come into question and can be used.
In analoger Weise zu der Standard-FISH-Technik kann eine Quantifizierung des Fluoreszenzsignals zur Quantifizierung der Anzahl der Zellen, insbesondere der Ganzzellen, des nachzuweisenden Mikroorganismus verwendet werden. Die entsprechenden Verfahren sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.In a manner analogous to the standard FISH technique, a quantification of the fluorescence signal can be used to quantify the number of cells, in particular whole cells, of the microorganism to be detected. The appropriate procedures are known to those skilled in the art.
Zur Erhöhung der Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens können neben den beiden in Schritt a) und b) zugegebenen Sonden unabhängig davon, ob die beiden Sonden separat oder gemeinsam zu der Probe hinzugegeben werden, in der ein Mikroorganismus nachgewiesen werden soll bzw. die auf die Anwesenheit eines Mikroorganismus hin untersucht werden soll, noch so genannte Kompetitorsonden der Reaktion zugegeben werden.To increase the specificity of the method according to the invention, in addition to the two probes added in step a) and b), regardless of whether the two probes are added separately or together to the sample in which a microorganism is to be detected or which indicates the presence of a Microorganism is to be examined, so-called competitor probes are added to the reaction.
Unter dem Begriff „Kompetitorsonden“ werden insbesondere Oligonukleotide verstanden, die eventuell auftretende ungewollte Bindungen, d.h. insbesondere Bindungsstellen, der Nukleinsäuresonden, insbesondere der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde abdecken und dabei eine höhere Sequenzähnlichkeit zu einem nicht nachzuweisenden Mikroorganismus aufweisen als zu dem/den nachzuweisenden Mikroorganismus/Mikroorganismen. Durch den Einsatz von Kompetitorsonden kann verhindert werden, dass die besagte mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde an die Nukleinsäuresequenz des/der nicht nachzuweisenden Mikroorganismus/Mikroorganismen bindet und somit zu falschen Signalen führt. Die Kompetitorsonde ist typischerweise unmarkiert und wird bevorzugterweise vor der entsprechenden mit einem Fluoreszenzfarbstoff bzw. Quencher markierten ersten Sonde bzw. einem daraus bestehenden Hybrid eingesetzt. Die Kompetitorsonde sollte im Wesentlichen komplementär sein zu einer Zielsequenz von einer oder mehreren nicht nachzuweisenden Mikroorganismen.The term “competitor probes” is understood to mean, in particular, oligonucleotides that cover any unwanted bindings that may occur, i.e. in particular binding sites, of the nucleic acid probes, in particular of the first probe labeled with a fluorescent dye, and in doing so have a higher sequence similarity to a microorganism that cannot be detected than to the microorganism(s) to be detected microorganism/microorganisms. The use of competitor probes can prevent said first probe labeled with a fluorescent dye from binding to the nucleic acid sequence of the microorganism(s) not to be detected and thus leading to false signals. The competitor probe is typically unlabeled and is preferably used before the corresponding first probe labeled with a fluorescent dye or quencher, or a hybrid consisting thereof. The competitor probe should be substantially complementary to a target sequence of one or more undetectable microorganisms.
Bei der Kompetitorsonde, wie sie im Rahmen der Erfindung verwendet werden kann, kann es sich um eine DNA- oder RNA-Sequenz handeln, die in der Regel zwischen 12 und 100 Nukleotide umfassen wird, bevorzugt zwischen 15 und 50, besonders bevorzugt zwischen 17 und 25 Nukleotide. Durch die Auswahl einer definierten Sequenz kann die Hybridisierung der mit einem Fluoreszenzfarbstoff bzw. Quencher markierten ersten Sonden an die Nukleinsäuresequenz einer taxonomischen Einheit oder künstlich zusammengestellten Gruppe abgeblockt werden. Komplementarität zu der abzublockenden Nukleinsäuresequenz, d.h. Zielsequenz sollte bei einer Kompetitorsonde von 15 Nukleotiden über 100 % der Sequenz gegeben sein. Bei Kompetitorsonden mit mehr als 15 Nukleotiden sind je nach Länge ein bis mehrere Fehlpaarungsstellen erlaubt. Derartige Kompetitorsonden sind bspw. in der europäischen Patentanmeldung
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass neben dem Paar aus einer einen Fluoreszenzfarbstoff tragenden ersten Sonde und einer mit einem - darauf abgestimmten - Quencher markierten ersten Sonde noch ein zweites Paar aus einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten zweiten Sonde und einer mit einem auf den zweiten Fluoreszenzfarbstoff abgestimmten Quencher markierten zweiten Sonde verwendet wird. Die Ausgestaltung der zweiten Sonden erfolgt entsprechend dem ersten Paar, wie es detailliert hierin beschrieben ist. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Spezifität der zweiten Sonde(n) auf eine andere Zielsequenz des durch das erste Sondenpaar adressierten und damit nachzuweisenden Mikroorganismus gerichtet ist. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Spezifität der zweiten Sonde(n) auf einen anderen nachzuweisenden Mikroorganismus gerichtet ist. Damit würde es ermöglicht, dass in einer Reaktion zwei verschiedene nachzuweisende Mikroorganismen nachgewiesen werden können.It is within the scope of the present invention that, in addition to the pair of a fluorescent dye-carrying first probe and a quencher-labeled first probe, a second pair of a fluorescent dye-labeled second probe and one with a second Fluorescent dye-matched quencher-labeled second probe is used. The design of the second probes is similar to the first pair as detailed herein. It is within the scope of the present invention that the specificity of the second probe(s) is directed towards a different target sequence of the microorganism addressed by the first pair of probes and thus to be detected. However, it is also within the scope of the present invention that the specificity of the second probe(s) is directed to another microorganism to be detected. This would make it possible for two different microorganisms to be detected to be detected in one reaction.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit. Der erfindungsgemäße Kit umfasst mindestens eine mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde, wobei die Sonde spezifisch für den nachzuweisenden Mikroorganismus ist und/oder eine mit einem Quencher markierte erste Sonde, wobei die mit dem Quencher markierte erste Sonde im wesentlichen komplementär, bevorzugterweise revers komplementär zu der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde ist, die für den nachzuweisenden Mikroorganismus spezifisch. Insoweit entsprechen bevorzugterweise die in dem erfindungsgemäßen Kit enthaltenen Sonden den in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Sonden, und umgekehrt. In einer Ausführungsform des Kits ist vorgesehen, dass die Sonde(n) in aliquotierter Form vorliegen. In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Kit eine oder mehrere Positiv- und/oder Negativkontrollen enthält.Another aspect of the present invention relates to a kit. The kit according to the invention comprises at least one first probe marked with a fluorescent dye, the probe being specific for the microorganism to be detected and/or a first probe marked with a quencher, the first probe marked with the quencher being essentially complementary, preferably reversely complementary, to the with a fluorescent dye labeled first probe that is specific to the microorganism to be detected. In this respect, the probes contained in the kit according to the invention preferably correspond to the probes used in the method according to the invention, and vice versa. In one embodiment of the kit, the probe(s) are provided in aliquoted form. A further embodiment provides that the kit contains one or more positive and/or negative controls.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele und Figuren weiter veranschaulicht, aus denen sich weitere Merkmale, Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung ergeben. Dabei zeigt:
-
1 schematisch das dem erfindungsgemäßen Verfahren zugrundeliegende Reaktionsgeschehen. -
2 schematisch eine Ausführungsform der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Hybridisierung in Lösung kombiniert mit Fluoreszenzquenching, das hierin auch als Strategie A bezeichnet wird. -
3 schematisch eine Ausführungsform der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Hybridisierung in Lösung kombiniert mit Fluoreszenzquenching, das hierin auch als Strategie B bezeichnet wird. -
4 die Wirkung einer Verdünnungsreihe der Sonden EUB338 und Esak997-3 auf das Fluoreszenzverhalten, dargestellt als Balkendiagramm, das die Fluoreszenzintensität als Funktion der Sondenkonzentration bei verschiedenen Reaktionsbedingungen ohne Quencher darstellt. -
5 das Ergebnis zur Bestimmung des optimales Sonden/Quenchersonden Verhältnisses, dargestellt als Balkendiagramm, das die Fluoreszenzintensität als Funktion der Konzentration der mit einem Quencher versehenen Sonde bei verschiedenen Reaktionsbedingungen darstellt. -
6 die Reaktionskinetik von Strategie A in modifiziertem PCR-Puffer, dargestellt als Funktion der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Hybridisierungsdauer. -
7 die Reaktionskinetik von Strategie A inStandardhybridisierungspuffer mit 0 % Formamid, dargestellt als Funktion der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Hybridisierungsdauer. -
8 die Reaktionskinetik von Strategie B in modifiziertem PCR-Puffer, dargestellt als Funktion der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Hybridisierungsdauer. -
9 die Reaktionskinetik von Strategie B inStandardhybridisierungspuffer mit 0 % Formamid, dargestellt als Funktion der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Hybridisierungsdauer. -
10 das Ergebnis einer Untersuchung von künstlich mit C. sakazakii kontaminierten Milchpulverproben, dargestellt als Funktion der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Hybridisierungsdauer.
-
1 schematically shows the reaction process on which the process according to the invention is based. -
2 schematically an embodiment of the implementation of the method according to the invention with hybridization in solution combined with fluorescence quenching, which is also referred to as strategy A herein. -
3 schematically an embodiment of the implementation of the method according to the invention with hybridization in solution combined with fluorescence quenching, which is also referred to as strategy B herein. -
4 the effect of serial dilutions of probes EUB338 and Esak997-3 on fluorescence behavior, presented as a bar graph plotting fluorescence intensity as a function of probe concentration at various reaction conditions without quencher. -
5 the result for determining the optimal probe/quencher probe ratio, presented as a bar graph depicting the fluorescence intensity as a function of the concentration of the quenched probe under various reaction conditions. -
6 the reaction kinetics of strategy A in modified PCR buffer, shown as a function of the fluorescence intensity as a function of the hybridization time. -
7 the reaction kinetics of strategy A in standard hybridization buffer with 0 % formamide, shown as a function of the fluorescence intensity as a function of the hybridization time. -
8th the reaction kinetics of strategy B in modified PCR buffer, shown as a function of the fluorescence intensity as a function of the hybridization time. -
9 the reaction kinetics of strategy B in standard hybridization buffer with 0% formamide, shown as a function of the fluorescence intensity as a function of the hybridization time. -
10 the result of an examination of milk powder samples artificially contaminated with C. sakazakii, shown as a function of the fluorescence intensity as a function of the hybridization time.
Basierend auf experimentellen Daten sind in
Zu Beginn der Reaktion oder in Abwesenheit von rRNS-Bindungsstellen liegen die den Quencher tragende bzw. mit diesem markierte Nukleinsäuresonde (Quenchersonde) und die den Fluoreszenzfarbstoff tragende bzw. mit diesem markierte Nukleinsäuresonde (Fluoreszenzsonde) als DNS:DNS-Hybrid vor. Da Quenchersonden und Fluoreszenzsonden nicht in gleichen Teilen sondern im Verhältnis 3:1 in die Reaktion eingesetzt wurden, wird das Sondensignal in der Lösung nahezu vollständig ausgelöscht (98% bis 99%) und das Reaktionsgleichgewicht verschiebt sich anfänglich zu Gunsten der DNS:DNS-Hybridisierung. In dem Fall, dass potentielle Zielstellen auf der rRNS für die Fluoreszenzsonden verfügbar sind, verschieben sich die Gleichgewichte der Reaktionen in Abhängigkeit von der Hybridisierungsdauer vom DNS:DNS-Hybrid in Richtung DNS:RNS-Hybrid. Die Fluoreszenzsonden werden dabei durch die Bindung an die rRNS stetig aus der Gleichgewichtsreaktion entzogen und forcieren auf diese Weise eine weitere Dissoziation der Quenchersonden/Fluoreszenzsonden-Hybride.At the beginning of the reaction or in the absence of rRNA binding sites, the nucleic acid probe carrying or marked with the quencher (quencher probe) and the nucleic acid probe carrying the fluorescent dye or marked with it (fluorescence probe) are present as a DNA:DNA hybrid. There If quencher probes and fluorescent probes are not used in equal parts but in the ratio 3:1 in the reaction, the probe signal is almost completely extinguished in the solution (98% to 99%) and the reaction equilibrium initially shifts in favor of DNA:DNA hybridization. In the event that potential target sites on the rRNA are available for the fluorescent probes, the equilibria of the reactions shift from DNA:DNA hybrid towards DNA:RNA hybrid depending on the hybridization time. The fluorescence probes are constantly withdrawn from the equilibrium reaction by binding to the rRNA and in this way force further dissociation of the quencher probes/fluorescence probe hybrids.
Dieser Verlauf setzt sich so lange fort bis keine freien Fluoreszenzsonden-Moleküle für die Hybridisierung an die rRNS aus der Dissoziation der Quenchersonden/Fluoreszenzsonden-Hybride zur Verfügung stehen oder alle potentiellen Zielstellen durch eine Fluoreszenzsonden-Bindung abgedeckt wurden. Zu diesem Zeitpunkt wird die maximale Fluoreszenzintensität in der Lösung erhalten und die Reaktion erreicht einen stabilen gesättigten Zustand.This process continues until no free fluorescent probe molecules are available for hybridization to the rRNA from the dissociation of the quencher probe/fluorescent probe hybrids or until all potential target sites have been covered by fluorescent probe binding. At this point, the maximum fluorescence intensity is obtained in the solution and the reaction reaches a stable saturated state.
BEISPIELEEXAMPLES
Beispiel 1: In silico und in situ Überprüfung der Spezifität der Sonde Esak997Example 1: In silico and in situ verification of the specificity of the Esak997 probe
Die Sonde Esak997 wurde 2004 von der vermicon AG zum spezifischen Nachweis von Enterobacter sakazakii entwickelt. Um deren Spezifität nach der Re-Klassifizierung von Enterobacter sakazakii als Cronobacter spp. zu evaluieren, wurde ein in silico und ein in situ Abgleich auf allen zur Verfügung stehenden Cronobacter Arten mit dieser Sonde durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass die Sonde Esak997 in silico und in situ alle bis dato beschriebenen Cronobacter Arten als Gattungs-spezifische Sonde nachweist.The Esak997 probe was developed by vermicon AG in 2004 for the specific detection of Enterobacter sakazakii. In order to assess their specificity after the reclassification of Enterobacter sakazakii as Cronobacter spp. To evaluate, an in silico and an in situ comparison was carried out on all available Cronobacter species with this probe. It was found that the Esak997 probe detects all Cronobacter species described to date as a genus-specific probe in silico and in situ.
Beispiel 2: Theoretische Konzeptionierung der HybridisierungsstrategienExample 2: Theoretical conceptual design of hybridization strategies
Zur Kombination der Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit einem statischen Fluoreszenzquenching-Verfahren, wurden theoretisch zwei mögliche Strategien für eine Hybridisierung in Lösung definiert, und experimentell überprüft. Strategie A ist in
Strategie A (
Demgegenüber verfolgt die in
Beispiel 3: Evaluierung des Sonden/ Quenchersonden VerhältnissesExample 3: Evaluation of the probe/quencher probe ratio
Die folgende Tabelle C.9 zeigt eine Übersicht der verwendeten Fluoreszenzsonden („Sonden“) und der korrespondierenden Quenchersonden Tabelle C.9: Übersicht verwendete Sonden und korrespondierende Quenchersonden
Legende: 1)Sonde, 2)Quenchersonde, 3)Markierungsposition des Farbstoffes oder Quenchers Table C.9 below shows an overview of the fluorescence probes used (“probes”) and the corresponding quencher probes Table C.9: Overview of the probes used and the corresponding quencher probes
Legend: 1) probe, 2) quencher probe, 3) labeling position of dye or quencher
Verwendete Puffersysteme:
HP0%
HP0%
Modifizierter PCR-Puffer:
- 5
M NaCl 50 mM - 1 M Tris/HCl (
pH 8,0) 10mM TritonX100
- 5M NaCl 50mM
- 1M Tris/HCl (pH 8.0) 10mM
- TritonX100 0.1%
Die Sonden wurden in den entsprechenden Puffern in die Endkonzentrationen 5 ng/ µl, 500 pg/µl, 50 pg/µl, 5 pg/µ1, 500 fg/µl sowie 50 fg/µl verdünnt und im Anschluss daran vermessen.The probes were diluted in the appropriate buffers to final concentrations of 5 ng/µl, 500 pg/µl, 50 pg/µl, 5 pg/µl, 500 fg/µl and 50 fg/µl and then measured.
Die niedrigste, mittels Mikrotiterplatten Fluorometer (Gain 80), messbare Sondenkonzentration, sollte für die Sonden EUB338-TAMRA und Esak977-3-TAMRA gelöst in Standardhybridisierungspuffer mit 0 % Formamid (HP 0 %) und modifiziertem PCR-Puffer bestimmt werden.The lowest probe concentration that can be measured using a microtiter plate fluorometer (Gain 80) should be determined for the probes EUB338-TAMRA and Esak977-3-TAMRA dissolved in standard hybridization buffer with 0% formamide (
Wie in
Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die Sondenkonzentration, insbesondere die niedrigste Konzentration der Fluoreszenzsonde, für alle weiteren Hybridisierungen auf 5 ng/µl fixiert.Based on these results, the probe concentration, especially the lowest concentration of fluorescent probe, was fixed at 5 ng/µl for all further hybridizations.
In einem weiteren Versuch wurde für diese Konzentration der Fluoreszenzsonde das optimale Verhältnis der korrespondierenden Quenchersonde ermittelt, bei dem > 95 % des Fluoreszenzsignals der Fluoreszenzsonde ausgelöscht werden. Dazu wurden die korrespondierenden Quenchersonden in den Endkonzentrationen 5 ng/µl, 7,5 ng/µl, 10 ng/ µl, 12,5 ng/µl sowie 15 ng/ µl in Kombination mit der entsprechenden Sonde (5 ng/ µl) eingesetzt.In a further experiment, the optimal ratio of the corresponding quencher probe was determined for this concentration of the fluorescence probe, at which >95% of the fluorescence signal of the fluorescence probe is extinguished. The corresponding quencher probes were used in the final concentrations of 5 ng/µl, 7.5 ng/µl, 10 ng/µl, 12.5 ng/µl and 15 ng/µl in combination with the corresponding probe (5 ng/µl).
Das optimale Verhältnis von Fluoreszenzsonde zu Quenchersonde wurde exemplarisch für die Fluoreszenzsonden/Quenchersonden Kombinationen EUB338-TAMRA/ Quen-EUB338-BHQ2 und Esak977-3-TAMRA/ Quen2-Esak997-3-BHQ2 in HP0 % und modifiziertem PCR-Puffer bestimmt und ist im Ergebnis in
Tabelle C.12 weist die prozentuale Effizienz des Fluoreszenzquenchings pro entsprechender Konzentration der Quenchersonde aus. Tabelle C.12: Prozentuale Quenchingeffizienz
Legende: Die prozentuale Quenchingeffizienz bezieht sich auf die Auslöschung des Sondensignals pro Quenchersondenkonzentration. Spalten 5-10 ng/µl markiert eine Quenchingeffizienz > 95%Table C.12 reports the percent efficiency of fluorescence quenching per corresponding concentration of quencher probe. Table C.12: Percent quenching efficiency
Legend: Percent quenching efficiency refers to the elimination of probe signal per quencher probe concentration. Columns 5-10 ng/µl mark a quenching efficiency > 95%
Bei einer Sondenkonzentration von 5 ng/µl wurden ab einer Quenchersondenkonzentration von 5 ng/µl für alle untersuchten Kombinationen aus Fluoreszenzsonden und Quenchersonden eine Quenchingeffizienz von > 95% erzielt (siehe hierzu Tabelle C.12, Spalten mit 5 ng/µl, 7,5 ng/µl, 10 ng/µl, 12,5 ng/µl und 15 ng/µl)Unter Verwendung von 10 ng/µl Quenchersonde wurde die Quenchingeffizienz auf > 98% gesteigert. Quenchersondenkonzentrationen von > 10 ng/µl führten zu keiner weiteren signifikanten Steigerung in der Signalauslöschung.With a probe concentration of 5 ng/µl, a quenching efficiency of > 95% was achieved from a quencher probe concentration of 5 ng/µl for all investigated combinations of fluorescent probes and quencher probes (see Table C.12, columns with 5 ng/µl, 7.5 ng/µl, 10 ng/µl, 12.5 ng/µl and 15 ng/µl) Using 10 ng/µl quencher probe, the quenching efficiency was increased to > 98%. Quench probe concentrations of > 10 ng/µl did not result in any further significant increase in signal quenching.
Basierend auf diesen Ergebnissen wurde für alle weiteren Hybridisierungen 10 ng/µl als Standardkonzentration für Quenchersonden definiert.Based on these results, 10 ng/µl was defined as the standard concentration for quencher probes for all further hybridizations.
Beispiel 4: Experimentelle Verifizierung der HybridisierungsstrategienExample 4: Experimental verification of hybridization strategies
Auf Basis der vorstehend beschriebenen Experimente wurde im Folgenden ein Versuchsaufbau spezifiziert, über den die generelle Eignung von Strategie A und B zur Hybridisierung in Lösung experimentell überprüft werden konnte.On the basis of the experiments described above, an experimental setup was specified below, with which the general suitability of strategies A and B for hybridization in solution could be experimentally checked.
Als Hybridisierungstemperatur wurde, angelehnt an die zur Fluoreszenz in situ Hybridisierung auf Objektträgern und Membranfiltern verwendete Temperatur von 46°C, 45°C ±2°C ausgewählt.Based on the temperature of 46°C used for fluorescence in situ hybridization on slides and membrane filters, 45°C ±2°C was selected as the hybridization temperature.
Es wurden zwei Puffer mit unterschiedlicher NaCl-Konzentration für die Hybridisierung ausgewählt. Zum einen wurde modifizierter PCR-Puffer (siehe Beispiel 3, NaCl-Konzentration: 50 mM) und zum anderen Standardhybridisierungspuffer mit 0% Formamid (siehe Beispiel 3, NaCl-Konzentration: 800 mM) als Puffersystem definiert. Diese Puffer wurden im Verhältnis 9:1 mit der Fluoreszenzsonde (Endkonzentration: 5 ng/µl)und der Quenchersonde (Endkonzentration: 10 ng/ µl) kombiniert.Two buffers with different NaCl concentrations were selected for the hybridization. A modified PCR buffer (see Example 3, NaCl concentration: 50 mM) and a standard hybridization buffer with 0% formamide (see Example 3, NaCl concentration: 800 mM) were defined as the buffer system. These buffers were combined with the fluorescence probe (final concentration: 5 ng/µl) and the quencher probe (final concentration: 10 ng/µl) in a ratio of 9:1.
Für die Reaktion wurde ein Gesamtvolumen (Reaktionspuffer/Fluoreszenzsonde/Quenchersonde) von 100 µl pro well in die Mikrotiterplatte eingesetzt.A total volume (reaction buffer/fluorescence probe/quencher probe) of 100 μl per well was used in the microtiter plate for the reaction.
Als Zielorganismus wurde eine EtOH-Fixierung von Cronobacter sakazakii LMG 2760 verwendet. Als Nichtzielorganismen wurden EtOH-Fixierungen von Citrobacter freundii DSM 30039 (4 Basenunterschiede (MM) zur Sondenbindungsstelle), Enterobacter cloacae DSM 30054 (4 MM zur Sonden-bindungsstelle), Erwinia chrysanthemii DSM 4610 (1 MM zur Sondenbindungsstelle) und Edwardsiella tarda DSM 30052 (2 MM zur Sondenbindungsstelle) in diesem Versuch mitgeführt.EtOH fixation of
Im ersten Schritt wurden die fixierten Zellen in der Mikrotiterplatte dehydratisiert (60°C, 30 min). Für Strategie A wurden 90 µl Reaktionspuffer inkl. Fluoreszenzsondenlösung (Endkonzentration Fluoreszenzsonde: 5 ng/µl) auf die dehydratisierten Zellen gegeben und die Mikrotiterplatte bei 45°C für 1,5 h im Hybridisierungsofen (Memmert) inkubiert.In the first step, the fixed cells in the microtiter plate were dehydrated (60°C, 30 min). For strategy A, 90 μl of reaction buffer including fluorescence probe solution (final concentration of fluorescence probe: 5 ng/μl) were applied to the dehydrated cells and the microtiter plate was incubated at 45° C. for 1.5 h in a hybridization oven (Memmert).
Nach Ablauf dieser Inkubationszeit wurden 10 µl Reaktionspuffer inkl. Quenchersondenlösung (Endkonzentration Quenchersonde: 10 ng/µl) in die Suspension pipettiert und die Inkubation im Hybridisierungsofen fortgesetzt (45°C für 2,5 h).After this incubation time, 10 μl of reaction buffer including quencher probe solution (final concentration of quencher probe: 10 ng/μl) were pipetted into the suspension and the incubation continued in the hybridization oven (45° C. for 2.5 h).
Die Fluoreszenzmessung im Mikrotiterplatten-Fluorometer erfolgte direkt nach Zugabe der Fluoreszenzsondenlösung (Messpunkt 0 h) sowie nach 0,5 h und 1 h Inkubation. Eine weitere Messung wurden direkt nach Zugabe der Quenchersonde (Messpunkt: 1,5 h) durchgeführt.The fluorescence was measured in the microtiter plate fluorometer immediately after addition of the fluorescence probe solution (measuring point 0 h) and after 0.5 h and 1 h of incubation. Another measurement was carried out directly after adding the quencher probe (measurement point: 1.5 h).
Die Kinetik des Fluoreszenzquenchings wurde zusätzlich auch nach 2 h, 2,5 h, 3 h und 4 h Inkubation über weitere Messungen bestimmt.The kinetics of the fluorescence quenching was also determined by further measurements after 2 h, 2.5 h, 3 h and 4 h of incubation.
Der gesamte Reaktionsverlauf der Strategie A ist für den modifizierten PCR-Puffer in
Für Strategie B wurden 100 µl Reaktionspuffer inkl. Fluoreszenzsonden- und Quenchersondenlösung (Endkonzentration Fluoreszenzsonde: 5 ng/µl/ Quenchersonde: 10 ng/ µl) auf die dehydratisierten Zellen pipettiert und die Mikrotiterplatte bei 46°C für 4 h im Hybridisierungsofen inkubiert. Die Fluoreszenzmessung im Mikrotiterplatten-Fluorometer erfolgte nach Zugabe der Fluoreszenzsonden-/Quencherlösung (Messpunkt 0 h) sowie nach 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h und 4 h Inkubation.For strategy B, 100 µl of reaction buffer including fluorescence probe and quencher probe solution (final concentration of fluorescence probe: 5 ng/µl/quencher probe: 10 ng/µl) were pipetted onto the dehydrated cells and the microtiter plate was incubated at 46°C for 4 h in the hybridization oven. The fluorescence was measured in the microtiter plate fluorometer after addition of the fluorescence probe/quencher solution (measuring point 0 h) and after 0.5 h, 1 h, 1.5 h, 2 h, 2.5 h, 3 h and 4 h incubation.
Die Reaktionskinetik der Hybridisierung in Lösung ist für Strategie B für modifizierten PCR-Puffer in
Dem Verlauf der Kurven in den
Nach Zugabe der Quenchersonden in den modifizierten PCR-Puffer wurden im Reaktionsverlauf von Strategie A (
- C. sakazakii erreichte nach Strategie B (
8 , schwarze Kurve) im gleichen Puffersystem Fluoreszenzintensitäten von > 45000 RFU. Die Signale der Nichtzielorganismen verblieben im Bezug dazu < 25000 RFU.
- C. sakazakii achieved strategy B (
8th , black curve) in the same buffer system fluorescence intensities of > 45000 RFU. In relation to this, the signals from the non-target organisms remained < 25000 RFU.
Im Gegensatz dazu schlug eine Hybridisierung in Standardhybridisierungspuffer mit 0 % Formamid für beide Strategien fehl (
Nach Zugabe der Quenchersonden wurden die Signale von Zielorganismus und Nichtzielorganismen in Strategie A gleichermaßen ausgelöscht (
Die gemessenen Fluoreszenzintensitäten aller Fixierungen fielen von ihrem Ausgangswert von > 40000 RFU auf ein Niveau von < 1000 RFU.The measured fluorescence intensities of all fixations fell from an initial value of > 40000 RFU to a level of < 1000 RFU.
Für Strategie B verblieben die Fluoreszenzsignale in HP0 % über die gesamte Hybridisierungsdauer für Zielorganismus und Nichtzielorganismen < 1000 RFU.For strategy B, the fluorescence signals remained in HP0% over the entire hybridization period for target and non-target organisms < 1000 RFU.
Als Schlussfolgerung bleibt festzuhalten, dass diese experimentellen Untersuchungen generell die Erwartungen, die aufgrund der vorangegangenen theoretischen Überlegungen an das erfindungsgemäße Verfahren gestellt wurden, erfüllten.As a conclusion, it can be stated that these experimental investigations generally fulfilled the expectations that were placed on the method according to the invention on the basis of the preceding theoretical considerations.
Eine erste Unterscheidung von Zielorganismus und Nichtzielorganismen konnte in modifiziertem PCR-Puffer gezeigt werden und ein erster funktioneller „proof of concept“ wurde für beide Strategien erbracht.A first distinction between target and non-target organisms could be shown in modified PCR buffer and a first functional "proof of concept" was provided for both strategies.
Basierend auf dem Reaktionsmechanismus wird das der Erfindung zugrundeliegende Prinzip auch als „quenching induzierte Kontakt Verdrängungs“-Fluoreszenz in situ Hybridisierung (quenching induced contact competition) oder abgekürzt als Quick-FISH bezeichnet.Based on the reaction mechanism, the principle on which the invention is based is also referred to as “quenching induced contact displacement” fluorescence in situ hybridization (quenching induced contact competition) or abbreviated as Quick-FISH.
Beispiel 5: Nachweis von C. sakazakii in MilchpulverprobenExample 5: Detection of C. sakazakii in milk powder samples
Angelehnt an die ISO-Vornorm
Dazu wurde analog zu den Kultivierungsbedingungen gemäß ISO-Vornorm eine zweistufige Anreicherungsstrategie bestehend aus einer Voranreicherung und einer Selektivanreicherung implementiert.For this purpose, a two-stage enrichment strategy consisting of a pre-enrichment and a selective enrichment was implemented analogously to the cultivation conditions according to the ISO pre-standard.
Die Milchpulverproben wurden künstlich mit C. sakazakii Zellen kontaminiert (10 Zellen/ 100 g) und bis zur Verarbeitung vier Wochen bei 4°C gelagert. Die eingesetzte Zellzahl wurde mittels Plattierung auf Trypton-Soja-Agar bestätigt.The milk powder samples were artificially contaminated with C. sakazakii cells (10 cells/100 g) and stored at 4°C for four weeks until processing. The cell number used was confirmed by plating on tryptone soy agar.
100 g künstlich kontaminiertes Milchpulver wurde für die Voranreicherung in gepuffertem Peptonwasser (BPW) und destilliertem Wasser (H2Odest.) resuspendiert und für 24 h unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Zur Selektivanreicherung wurden jeweils 0,1 ml Voranreicherung in Mossel-Anreicherungsmedium (EE-Broth) und in modifizierte LaurylSulfat-Tryptose Bouillon (mLSTB) überführt und für weitere 24 h unter Schütteln bei 37°C inkubiert.100 g of artificially contaminated milk powder were resuspended in buffered peptone water (BPW) and distilled water (H 2 O dest .) for pre-enrichment and incubated for 24 h at 37° C. with shaking. For selective enrichment, 0.1 ml each of pre-enrichment was transferred to Mossel enrichment medium (EE broth) and to modified lauryl sulfate tryptose broth (mLSTB) and incubated for a further 24 h at 37° C. with shaking.
Ein Aliquot (2 ml) wurde aus jeder Selektivanreicherung entnommen, abzentrifugiert (5 min, 5000 rpm) und das Zellpellet in 100 µl EtOHabs. aufgenommen und fixiert.An aliquot (2 ml) was taken from each selective enrichment, centrifuged down (5 min, 5000 rpm) and the cell pellet in 100 μl EtOH abs. recorded and fixed.
Diese Fixierungen wurden für die Hybridisierung in Lösung verwendet und über eine maximale Inkubationsdauer von 4 h bei den Inkubationstemperaturen 30°C und 45°C sowie einer NaCl-Konzentration von 50 mM in modifiziertem PCR-Puffer hybridisiert (Esak997-3-TAMRA/ Quen1-Esak997-3-BHQ2).These fixations were used for hybridization in solution and hybridized over a maximum incubation period of 4 h at incubation temperatures of 30°C and 45°C and an NaCl concentration of 50 mM in modified PCR buffer (Esak997-3-TAMRA/ Quen1- Esak997-3-BHQ2).
Den Kurvenverläufen ist zu entnehmen, dass sowohl mittels Vorkultivierungsstrategie 1 (
Bei einer Hybridisierungstemperatur von 45°C wurde die maximale Fluoreszenzintensität nach 1 h und bei 30°C nach ca. 3 h Hybridisierung erreicht.At a hybridization temperature of 45°C, the maximum fluorescence intensity was reached after 1 hour and at 30°C after about 3 hours of hybridization.
Literaturstellenreferences
Die folgenden Literaturstellen werden ebenso wie die in der vorstehenden Beschreibung angeführten Literaturstellen hierein durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
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Die in der vorangehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.The features of the invention disclosed in the preceding description, the claims and the drawings can be essential both individually and in any combination for realizing the invention in its various embodiments.
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