DE102009052404A1 - System for high throughput screening of candidate compounds, comprises a first and second type of lipid membrane vesicle, and a device for the determination of desired effect of the candidate compounds to be tested - Google Patents

System for high throughput screening of candidate compounds, comprises a first and second type of lipid membrane vesicle, and a device for the determination of desired effect of the candidate compounds to be tested Download PDF

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Abstract

The system for high throughput screening of candidate compounds, comprises a first type of lipid membrane vesicle A containing a determined quantity of functional channel protein complex in the lipid membrane and containing a reaction partner I in a medium in internal volume of the lipid membrane vesicle A, and a second type of lipid membrane vesicle B containing functional channel protein complex in the lipid membrane and containing a reaction partner II in internal volume of the lipid membrane vesicle B containing means for the determination of desired effect of the candidate compounds. The system for high throughput screening of candidate compounds, comprises a first type of lipid membrane vesicle A containing a determined quantity of functional channel protein complex in the lipid membrane and containing a reaction partner I in a medium in internal volume of the lipid membrane vesicle A, a second type of lipid membrane vesicle B containing functional channel protein complex in the lipid membrane and containing a reaction partner II in internal volume of the lipid membrane vesicle B containing means for the determination of desired effect of the candidate compounds to be tested, a device for the determination of desired effect of the candidate compounds to be tested, a device for the determination of the reaction between the reaction partner I from the lipid membrane vesicle A and the reaction partner II from the lipid membrane vesicle B, where the lipid membrane vesicle A and lipid membrane vesicle B are formed through the channel protein complex to be tested in the lipid membrane vesicle B, or the lipid membrane vesicle A and the lipid membrane vesicle B are formed through a protein complex of a channel through which the reaction partner arrives in the interior volume of the respective another lipid membrane vesicle, and means for supplying the candidate compounds to be tested in order to modulate the formation of the channel through the channel protein complex present in the lipid membrane. The reaction partner I guides with the reaction partner II to a demonstrable reaction. The lipid membrane vesicle A and the lipid membrane vesicle B. The second type of lipid membrane vesicle B is a humane cell. The functional channel protein complex is formed from connexins. The channel protein complexes are identical in lipid membrane vesicle A and B. The lipid membrane vesicle A and/or B exists in the form of nanovesicle in a size of 40-80 nM. The means for the determination of desired effect or the reaction partner exists in the interior volume of the lipid membrane vesicle except the buffer or the medium only the candidate compounds to be tested. Independent claims are included for: (1) a method for high throughput screening of candidate compounds; and (2) a lipid membrane vesicle having lipids for forming lipid membrane or channel protein complex such as connexons, innexons or pannexons.

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft in einem ersten Aspekt ein System zum Screenen von Kandidatenverbindungen. Genauer richtet sich die vorliegende Anmeldung auf ein System zum Screenen von Kandidatenverbindungen mit Hilfe von Lipidmembranvesikeln in die die zu testenden Kandidatenverbindungen im Innenvolumen integriert sind und einer zweiten Art von Lipidmembranvesikeln, die in ihrem Innenvolumen Reaktionspartner zu diesen zu testenden Kandidatenverbindungen aufweisen sowie eine Einrichtung zur Bestimmung einer möglichen Reaktion der Kandidatenverbindung. In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen, sowie auf Lipidmembranvesikel und ihre Anwendung auf dem medizinisch-pharmazeutischen Gebiet.The present application in a first aspect relates to a system for screening candidate compounds. More particularly, the present application is directed to a system for screening candidate compounds by means of lipid membrane vesicles in which the candidate compounds to be tested are integrated in the internal volume and a second type of lipid membrane vesicles having in their internal volume reactants to these candidate compounds to be tested and a device for determination a possible reaction of the candidate compound. In another aspect, the present invention is directed to methods for screening candidate compounds, as well as lipid membrane vesicles and their application in the medical-pharmaceutical field.

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Das Screenen und die Identifizierung von Verbindungen, sogenannten Kandidatenverbindungen, die als mögliche Wirkstoffe pharmakologisch eingesetzt werden können bzw. Leitstrukturen für solche Wirkstoffe darstellen, aber auch die Identifizierung von Targetsubstanzen, die an der Aufnahme von Wirkstoffen beteiligt sind, ist für medizinische und pharmakologische Anwendungen und medizinische Therapieansätze von hochrangigem Interesse. Dabei werden mit Hilfe von Datenbänken von chemischen oder biologischen Entitäten meist durch „high throughput Verfahren” diese Entitäten mit bekannter Struktur auf eine mögliche Wirkung im Testsystem untersucht. Insbesondere das Einbringen von Wirkstoffen in Zellen als auch die Identifizierung von Zielstrukturen, die an der Aufnahme von Wirkstoffen in die Zellen beteiligt sind, spielen eine wesentliche Rolle bei der Wirksamkeit von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen. Zum Einschleusen der Wirkstoffe in Zellen stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Meist werden gängige Transportmechanismen der Zellen genutzt, um die Wirkstoffe in diese einzubringen, alternativ gelangen die Wirkstoffe auch selbständig über die zellulären Barrieren in die Zelle. Zu unterscheiden ist hierbei zwischen einem gerichteten und ungerichteten Einbringen der Wirkstoffe in die Zellen. Während bei ungerichteten Verfahren solche Transportmechanismen genutzt werden, die den Wirkstoff im wesentlichen in jede Zelle einbringen, finden bei der zielgerichteten Anwendung spezifische Andockmoleküle oder spezifische Targetsubstanzen Anwendung, die den Wirkstoff zielgerichtet in eine ausgewählte Gruppe von Zellen einbringen. Beispielhaft seien hier solche Hilfsmittel wie Liposomen etc. genannt. Diese werden üblicherweise für ein ungerichtetes Einbringen verwendet. Gleiches gilt für bekannte Targetmoleküle, zum Beispiel die Tat-Sequenz des HIV, Lysinsequenzen etc. Auch virale Transportmechanismen zum Einbringen von Wirkstoffen in Zellen wurden vorgeschlagen. Bei dem gerichteten Einbringen von Wirkstoffen in eine vorbestimmte Zellart wird die Tatsache ausgenutzt, dass diese spezifische Moleküle auf ihrer Oberfläche exprimieren. Diese Moleküle werden dann zum Beispiel als Andockstationen der Transportmechanismen an die Zielzellen genutzt, um den Wirkstoff in die Zellen gezielt einzubringen.The screening and identification of compounds, so-called candidate compounds, which can be used pharmacologically as possible active substances or lead structures for such active substances, but also the identification of target substances, which are involved in the uptake of active substances, for medical and pharmacological applications and Medical therapeutic approaches of high interest. With the aid of data banks of chemical or biological entities, these entities with a known structure are usually examined for a possible effect in the test system by "high throughput methods". In particular, the introduction of drugs into cells as well as the identification of target structures involved in the uptake of drugs into the cells play an essential role in the efficacy of pharmacologically active drugs. Various methods are available for introducing the active substances into cells. Usually, common transport mechanisms of the cells are used to introduce the active ingredients into them, alternatively, the active ingredients also enter the cell independently via the cellular barriers. It should be distinguished between a directed and undirected introduction of the active ingredients into the cells. While in undirected methods, such transport mechanisms are used, which bring the drug substantially in each cell, find in the targeted application specific docking molecules or specific target substances application that bring the drug targeted in a selected group of cells. By way of example, such aids as liposomes etc. may be mentioned here. These are commonly used for non-directional insertion. The same applies to known target molecules, for example the Tat sequence of HIV, lysine sequences etc. Viral transport mechanisms for introducing active substances into cells have also been proposed. The directed introduction of drugs into a predetermined cell type exploits the fact that they express specific molecules on their surface. These molecules are then used, for example, as docking stations of the transport mechanisms to the target cells in order to introduce the active substance into the cells in a targeted manner.

Unterschiedliche Hüllformen oder Behälter werden derzeit verwendet, um den Inhalt in die Zelle oder in bzw. an den Zielort zu dirigieren. In den letzten Jahren wurde zum Beispiel Einschlussverfahren in Lipidmembranvesikel (Liposomen) genutzt. Diese Lipidvesikel werden zum Beispiel in Form einer Emulsion angewendet. In der Literatur sind für die oben beschriebenen Transportmechanismen zahlreiche Beispiele beschrieben, um Wirkstoffe in Zellen einzubringen. Dieses schließt auch das Gebiet der Gentherapie ein. Wie bereits oben angemerkt, sind in den meisten Fällen die Zielobjekte unbestimmt, das heißt aufgrund des ungerichteten Targetings kann der Wirkstoff in jede beliebige Zelle gelangen. Aufgrund der ungerichteten Applikation ist häufig eine sehr hohe Konzentration des Wirkstoffes notwendig beziehungsweise der Wirkstoff muss sehr lange im Körper verweilen, damit die gewünschte Wirkung erreicht wird. In den letzten Jahren werden auch Vesikelandocksysteme entwickelt, die ein gezieltes Targeting mit den Transportmechanismen ermöglichen sollen. Bisher gibt es aber ein entsprechendes zielspezifisches Perzeptionssystem nicht.Different wrappers or containers are currently used to direct the content into or into the cell. In recent years, for example, inclusion methods have been used in lipid membrane vesicles (liposomes). These lipid vesicles are used, for example, in the form of an emulsion. Numerous examples of the transport mechanisms described above are described in the literature in order to introduce active substances into cells. This also includes the field of gene therapy. As noted above, in most cases the target objects are indeterminate, that is, because of the undirected targeting, the drug may enter any cell. Due to the undirected application is often a very high concentration of the active ingredient necessary or the active ingredient must remain in the body for a long time, so that the desired effect is achieved. In recent years, vesicle docking systems have also been developed that are intended to enable targeted targeting with the transport mechanisms. So far, however, there is no corresponding target-specific perception system.

Lipidmembranvesikel sind seit langem aus der Literatur bekannt. In der EP 2 054 729 werden zum Beispiel Lipidmembranvesikel beschrieben, die in ihrem Innenvolumen eine Ionenart enthalten, deren Freisetzung in dem dort beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Diese Lipidmembranvesikel weisen in ihrer Lipidmembran Ionenkanalmembranproteine auf. Solche Vesikel werden auch von Steffens M. et al., Biochemica et Biophysica Acta 1778 (2008), 1206–1212 beschrieben. Diese Veröffentlichung beschreibt Lipidmembranvesikel mit Connexin 26 Kanalmembrankomplexen. Solche Lipidmembranvesikel können zum Beispiel temperaturabhängig Markermoleküle freisetzen, die sich ansonsten im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel befinden.Lipid membrane vesicles have long been known from the literature. In the EP 2 054 729 For example, lipid membrane vesicles are described which contain in their internal volume an ionic species whose release is determined in the method described therein. These lipid membrane vesicles have ion channel membrane proteins in their lipid membrane. Such vesicles are also used by Steffens M. et al., Biochemica et Biophysica Acta 1778 (2008), 1206-1212 described. This publication describes lipid membrane vesicles with connexin 26 channel membrane complexes. Such lipid membrane vesicles, for example, can release marker molecules, which are otherwise located in the inner volume of the lipid membrane vesicles, depending on the temperature.

Vor kurzem wurde von Kaneda M., et al., Biomaterials 30 (2009), 3971–3977 eine direkte Bildung von Proteoliposomen durch in vitro Synthese beschrieben. Weiterhin wird in dieser Veröffentlichung die zelluläre zytosolische Zufuhr mit Connexin exprimierenden Liposomen hergestellt durch in vitro Synthese ausgeführt. Dort beschriebene Liposomen enthalten eine unbestimmte Zahl von Membranproteinen, wie zum Beispiel Connexine. Diese verwendeten Liposomen werden dadurch gewonnen, dass eine in vitro Translation durchgeführt und dabei die Connexine bei Ausbildung der Liposomen in situ in diese eingebaut werden. Die Zusammensetzung des Innenvolumens der Liposomen ist dabei nicht definiert und weist unter anderem die zur in vitro Translation notwendigen Bestandteile auf. Insbesondere im pharmakologischen Bereich sind die dort beschriebenen Liposomen nicht einsetzbar, da die Reinheit und die Zusammensetzung dieser so hergestellten Liposomen nicht im wünschenswerten Umfang gegeben ist. Insbesondere können die Liposomen nicht wünschenswerte DNA und RNA Komponenten aber auch andere Komponenten der in vitro Translation enthalten.Recently was from Kaneda M., et al., Biomaterials 30 (2009), 3971-3977 a direct formation of proteoliposomes by in vitro synthesis described. Furthermore, in this publication, the cellular cytosolic delivery with connexin-expressing liposomes prepared by in vitro synthesis is carried out. Liposomes described therein contain an indeterminate number of membrane proteins, such as connexins. These liposomes are obtained by: carried out an in vitro translation while the connexins are incorporated in the formation of liposomes in situ in these. The composition of the internal volume of the liposomes is not defined and includes, among other things, the components necessary for in vitro translation. In particular, in the pharmacological field, the liposomes described therein can not be used, since the purity and the composition of these liposomes thus produced is not given to the desired extent. In particular, the liposomes may contain undesirable DNA and RNA components as well as other components of in vitro translation.

Solche Liposomen sind auch nicht für Verfahren zum Screenen und Identifizieren von Leitstrukturen, zum Beispiel im „high throughput Screening” von Bibliotheken chemischer und biologischer Entitäten, geeignet, da ihre Zusammensetzung nicht eindeutig und definiert ist. Solche Screening-Verfahren und Systeme hierfür erfordern aber die Verwendung von entsprechenden Mitteln bekannter Zusammensetzung, um die spezifische Wirkung der einzelnen Kandidatenverbindungen bestimmen zu können.Also, such liposomes are not suitable for methods for screening and identifying lead structures, for example in high throughput screening of chemical and biological entity libraries, since their composition is not unique and defined. However, such screening methods and systems require the use of appropriate agents of known composition in order to determine the specific activity of the individual candidate compounds.

Es besteht daher nach wie vor ein Bedarf, Systeme und Verfahren bereit zu stellen, die als in vitro Testsysteme beziehungsweise Verfahren geeignet sind, Kandidatenverbindungen, insbesondere in „high throughput Verfahren” zu testen. Des Weiteren besteht ein Bedarf an hochreinen Transportmechanismen zur medizinischen und pharmazeutischen Anwendung.There is therefore still a need to provide systems and methods that are suitable as in vitro test systems or methods to test candidate compounds, in particular in "high throughput method". Furthermore, there is a need for high purity transport mechanisms for medical and pharmaceutical use.

Kurze Beschreibung der ErfindungBrief description of the invention

Die Erfinder waren erfolgreich in der Bereitstellung von Verfahren und Systemen, die ein Screenen von Kandidatenverbindungen auf ihre gewünschten Wirkungen ermöglichen. Diese Kandidatenverbindungen können einerseits solche sein, die Wirkungen auf bestimmte Targetstrukturen (Zielstrukturen) aufzeigen. Andererseits können diese Kandidatenverbindungen solche sein, die zum Beispiel ein Andocken von Transportmechanismen an Zielstrukturen verhindern. Mit Hilfe der Verfahren und des Systems können zum Beispiel Leitstrukturen für pharmazeutisch wirksame Verbindungen identifiziert werden.The inventors have been successful in providing methods and systems that enable screening of candidate compounds for their desired effects. On the one hand, these candidate compounds can be those which show effects on specific target structures (target structures). On the other hand, these candidate compounds may be those which prevent, for example, docking of transport mechanisms on target structures. For example, lead structures for pharmaceutically active compounds can be identified using the methods and system.

In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung daher ein System zum Screenen von Kandidatenverbindungen bereit, umfassend

  • i) eine erste Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und im Innenvolumen der Lipidmembranvesikeln A enthaltend die zu testende Kandidatenverbindung in einem Medium;
  • ii) eine zweite Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel B enthaltend Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung;
  • iii) eine Einrichtung zur Bestimmung der gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung,
wobei die Lipidmembranvesikel A und die Lipidmembranvesikel B bei in Kontakt bringen durch die Kanalproteinkomplexe einen verbindenden Kanal ausbilden können, durch den die zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel B oder umgekehrt gelangen können.In a first aspect, therefore, the present invention provides a system for screening candidate compounds, comprising
  • i) a first type of lipid membrane vesicles A containing an optionally predetermined amount of functional channel protein complexes in the lipid membrane and in the internal volume of the lipid membrane vesicles A containing the candidate compound to be tested in a medium;
  • ii) a second type of lipid membrane vesicles B containing functional channel protein complexes in the lipid membrane and in the internal volume of the lipid membrane vesicle B containing means for determining a desired effect of the candidate compound to be tested;
  • iii) means for determining the desired effect of the candidate compound to be tested,
wherein the lipid membrane vesicle A and the lipid membrane vesicle B, when brought into contact by the channel protein complexes, can form a connecting channel through which the candidate compounds to be tested can enter the lipid membrane vesicle B or vice versa.

In einer alternativen Ausführungsform wird ein System zum Screenen von Kandidatenverbindungen bereitgestellt umfassend

  • i) eine erste Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge eines funktionalen Kanalproteinkomplexes in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel A einen Reaktionspartner I in einem Medium;
  • ii) eine zweite Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Bindungspartner in den Lipidmembranen und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvisikel B einen Reaktionspartner II, der mit dem Reaktionspartner I, vorhanden im Innenvolumen der Lipidmembranvisikel A, zu einer nachweisbaren Reaktion führt;
  • iii) eine Einrichtung zur Bestimmung der Reaktion zwischen dem Reaktionspartner I und dem Reaktionspartner II, wobei die Lipidmembranvesikel A und Lipidmembranvesikel B bei in Kontakt bringen durch die Proteinkomplexe einen Kanal ausbilden können, durch die die Reaktionspartner in das Innenvolumen des jeweiligen anderen Lipidmembranvesikels gelangen können;
  • iv) Mittel zum Einbringen der zu testenden Kandidatenverbindungen, um die Ausbildung des Kanals durch die in den Lipidmembranen vorhandenen Kanalproteinkomplexe zu modulieren.
In an alternative embodiment, a system for screening candidate compounds is provided comprising
  • i) a first type of lipid membrane vesicles A containing an optionally predetermined amount of a functional channel protein complex in the lipid membrane and further comprising in the internal volume of the lipid membrane vesicles A a reactant I in a medium;
  • ii) a second type of lipid membrane vesicles B containing functional binding partners in the lipid membranes and further containing in the internal volume of the lipid membrane visceral B a reactant II which results in a detectable reaction with the reactant I present in the internal volume of the lipid membrane viscus A;
  • iii) means for determining the reaction between Reagent I and Reagent II, wherein the lipid membrane vesicles A and Lipid Membrane Vesicles B, when brought into contact by the protein complexes, can form a channel through which the reactants can enter the interior volume of the respective other lipid membrane vesicle;
  • iv) means for introducing the candidate compounds to be tested to modulate the formation of the channel by the channel protein complexes present in the lipid membranes.

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Screenen von Kandidantenverbindungen bereitgestellt umfassend die folgenden Schritte:

  • a) Bereitstellen einer ersten Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenraum die zu testenden Kandidatenverbindungen in einem Medium;
  • b) Bereitstellen einer zweiten Art von Lipidmembranvesikel B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel B Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindungen;
  • c) In Kontakt bringen der Lipidmembranvesikel A und der Lipidmembranvesikel B derart, dass die in den Lipidmembranvesikeln vorhandenen Kanalproteinkomplexe einen Kanal ausbilden, durch die die zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel B oder die Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel A gelangen können;
  • d) Bestimmen der gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung.
In another aspect of the present invention, methods for screening candidate compounds are provided comprising the following steps:
  • a) providing a first type of lipid membrane vesicles A containing an optionally predetermined amount of functional channel protein complexes in the lipid membrane and further containing in the interior the candidate compounds to be tested in a medium;
  • b) providing a second type of lipid membrane vesicle B containing functional channel protein complexes in the lipid membrane and further containing in the internal volume of the Lipid membrane vesicles B means for determining a desired effect of the candidate compounds to be tested;
  • c) contacting the lipid membrane vesicles A and the lipid membrane vesicles B such that the channel protein complexes present in the lipid membrane vesicles form a channel through which the candidate compounds to be tested enter the lipid membrane vesicles B or the means for determining a desired effect of the candidate compounds to be tested in the lipid membrane vesicles A can get;
  • d) determining the desired effect of the candidate compound to be tested.

In einer alternativen Ausführungsform dieses Verfahrens zum Screenen von Kandidatenverbindungen erlaubt dieses Kandidatenverbindungen zu identifizieren, die die Fähigkeit besitzen, ein Binden von Lipidmembranvesikeln an Zielstrukturen und gegebenenfalls ein Ausbilden von Kanalkomplexen, zum Beispiel gab junctions, zu modulieren. Dieses Verfahren umfasst die Schritte:

  • a) Bereitstellen einer ersten Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und enthaltend weiterhin im Innenvolumen einen Reaktionspartner I in einem Medium;
  • b) Bereitstellen einer zweiten Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Proteinkomplexe in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen einen Reaktionspartner II, der mit dem Reaktionspartner I eine Reaktion eingehen kann;
  • c) In Kontakt bringen der Lipidmembranvesikel A mit den Lipidmembranvesikeln B in Anwesenheit und Abwesenheit der zu testenden Kandidatenverbindungen; und
  • d) Bestimmen der Reaktion zwischen dem Reaktionspartner I und dem Reaktionspartner II, zur Bestimmung der Fähigkeit der zu testenden Kandidatenverbindungen, die Ausbildung einer Bindung und gegebenenfalls von Kanälen durch die vorhandenen im Lipidmembranvesikeln A und dem Lipidmembranvesikeln B Kanalproteinkomplexe, zu modulieren.
In an alternative embodiment of this method for screening candidate compounds, this candidate allows compounds to be identified which have the ability to modulate binding of lipid membrane vesicles to target structures and optionally forming channel complexes, for example, junctions. This method comprises the steps:
  • a) providing a first type of lipid membrane vesicles A containing an optionally predetermined amount of functional channel protein complexes in the lipid membrane and further comprising in the internal volume a reactant I in a medium;
  • b) providing a second type of lipid membrane vesicles B containing functional protein complexes in the lipid membrane and further comprising in the internal volume a reaction partner II which is capable of reacting with the reaction partner I;
  • c) contacting the lipid membrane vesicles A with the lipid membrane vesicles B in the presence and absence of the candidate compounds to be tested; and
  • d) determining the reaction between Reagent I and Reagent II to determine the ability of the candidate compounds to be tested to modulate the formation of a bond and optionally channels by the presence in the lipid membrane vesicles A and the lipid membrane vesicles B channel protein complexes.

Weiterhin werden Liposomen enthaltend pharmazeutisch oder kosmetisch wirksame Inhaltsstoffe bereitgestellt.Furthermore, liposomes containing pharmaceutically or cosmetically active ingredients are provided.

Kurze Beschreibung der AbbildungShort description of the picture

1 zeigt den funktionalen Nachweis der Ausbildung von gap junctions. Um die Docking Reaktion zu verfolgen, enthielten die Lipidmembranvesikel mit Connexin hCx26 100 mM ATP, ein Lipidmembranvesikel mit hCx26 einer zweiten Art enthielt Luciferin und Firefly-Luciferase. Bei Ausbildung von hCx26 gap junctions kommen ATP mit dem Luciferin und Luciferase in Kontakt, als Ergebnis dieser Reaktion zwischen ATP und dem Luciferin und Luciferase ist ein Biolumineszenzsignal messbar. Dargestellt in der 1 sind die verschiedenen Ansätze und das bestimmte Biolumineszenzsignal bei Ausbildung der gap junctions beziehungsweise der Kontrollansätze, in denen keine gap junctions ausgebildet wurden. Als Kontrolle wurden Liposomen ohne eingebautes hCx26 verwendet. 1 shows the functional proof of the formation of gap junctions. To follow the docking reaction, the lipid membrane vesicles containing connexin hCx26 contained 100 mM ATP, a second type lipid membrane vesicle with hCx26 contained luciferin and firefly luciferase. When hCx26 gap junctions are formed, ATP contacts the luciferin and luciferase, and as a result of this reaction between ATP and the luciferin and luciferase, a bioluminescence signal is measurable. Shown in the 1 are the different approaches and the specific bioluminescence signal in the formation of the gap junctions or the control approaches in which no gap junctions were formed. As a control, liposomes without incorporated hCx26 were used.

Ausführliche Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention

In einem ersten Aspekt wird ein System zum Screenen von Kandidatenverbindungen bereitgestellt. Dieses System erlaubt ein Screenen von Kandidatenverbindungen, zum Beispiel aus entsprechenden, chemische und/oder biologische Entitäten umfassende Bibliotheken auf eine gewünschte Wirkung. Diese gewünschte Wirkung kann zum Beispiel ein Modulieren einer Enzymaktivität sein, eine Bindung und/oder Aktivierung oder Hemmung einer Zielstruktur usw. Weiterhin sind solche Kandidatenverbindungen interessant, die durch die Kanäle (gap junctions) transportierbar sind und die gap junctions nicht beeinflussen. Solche Verbindungen, die in den Zielstrukturen eine gewünschte pharmazeutische Wirkung aufzeigen und den Transport nicht beeinflussen, sind insbesondere von Interesse, da sie für therapeutische Anwendungen mit Hilfe der erfindugnsgemäßen Lipidmembranvesikel transportiert werden können, ohne diese Transportvehikel selbst zu beeinflussen. Es können z. B. therapeutische Connexin-enthaltende Lipidmembranvesikel (therapeutische Connexosomen) bereitgestellt werden. Das erfindungsgemäße System umfasst i) eine erste Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und weiterhin im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel A enthaltend die zu testende Kandidatenverbindung in einem Medium. Weiterhin umfasst das System eine zweite Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und weiterhin im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel B enthaltend Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung. Das System umfasst schließlich eine Einrichtung zur Bestimmung der gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung. Die Lipidmembranvesikel A und die Lipidmembranvesikel B zeichnen sich dadurch aus, dass sie bei in Kontakt bringen miteinander durch die Kanalproteinkomplexe einen verbindenden Kanal ausbilden können, durch den die zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel B gelangen können beziehungsweise umgekehrt die Mittel zur Bestimmung der gewünschten Wirkung in das Innenvolumen der Lipidmembranvesikel A gelangen.In a first aspect, a system for screening candidate compounds is provided. This system allows candidate compounds to be screened, for example, from libraries comprising chemical and / or biological entities for a desired effect. This desired effect may be, for example, modulating an enzyme activity, binding and / or activating or inhibiting a target structure, etc. Further, candidate compounds which are transportable through the gap junctions and which do not affect gap junctions are interesting. Such compounds, which exhibit a desired pharmaceutical effect in the target structures and do not affect the transport, are of particular interest since they can be transported for therapeutic applications by means of the lipid membrane vesicles according to the invention without influencing these transport vehicles themselves. It can z. For example, therapeutic connexin-containing lipid membrane vesicles (therapeutic connexosomes) may be provided. The system of the invention comprises i) a first type of lipid membrane vesicles A containing an optionally predetermined amount of functional channel protein complexes in the lipid membrane and further in the internal volume of the lipid membrane vesicles A containing the candidate compound to be tested in a medium. Furthermore, the system comprises a second type of lipid membrane vesicles B containing functional channel protein complexes in the lipid membrane and further in the internal volume of the lipid membrane vesicles B containing means for determining a desired effect of the candidate compound to be tested. Finally, the system includes means for determining the desired effect of the candidate compound to be tested. The lipid membrane vesicles A and the lipid membrane vesicles B are characterized by being able to form, in contact with each other through the channel protein complexes, a connecting channel through which the candidate compounds to be tested can enter the lipid membrane vesicles B or vice versa the means for determining the desired effect enter the inner volume of the lipid membrane vesicles A.

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Medium” auf geeignete flüssige Medien und Puffer, zum Beispiel wässrige Medien oder Puffer, geeignet zur Aufnahme der Kandidatenverbindungen beziehungsweise der Wirkstoffe. As used herein, the term "medium" refers to suitable liquid media and buffers, for example aqueous media or buffers, suitable for receiving the candidate compounds or agents, respectively.

Eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Systems zum Screenen von Kandidatenverbindungen umfasst eine erste Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge eines funktionalen Kanalproteinkomplexes in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel einen Reaktionspartner I in einem Medium. Weiterhin umfasst das System als zweite Art von Lipidmembranvesikel B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in den Lipidmembranen und weiterhin enthaltend im Volumen der Lipidmembranvesikel B einen Reaktionspartner II, der mit dem Reaktionspartner I vorhanden im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel A zu einer nachweisbaren Reaktion führt. Das erfindungsgemäße System weist weiterhin eine Einrichtung zur Bestimmung der Reaktion zwischen dem Reaktionspartner I mit dem Reaktionspartner II aus dem Lipidmembranvesikeln auf. Diese Reaktion kann erfolgen, wenn die Lipidmembranvesikel A und die Lipidmembranvesikel B bei in Kontakt kommen durch die Membranproteinkomplexe einen Kanal ausbilden können, durch die die Reaktionspartner in das Innenvolumen des jeweiligen anderen Lipidmembranvesikels gelangen können. Das System umfasst weiterhin Mittel zum Einbringen der zu testenden Kandidatenverbindungen, um die Ausbildung des Kanals durch die in den Lipidmembranen vorhandenen Kanalproteinkomplexe zu modulieren. Diese Kandidatenverbindungen können die Ausbildung des Kanalproteinkomplexes modulieren, indem sie ein Anbinden der Lipidmembranvesikel A an die Lipidmembranvesikel B durch die Kanalmembrankomplexe verhindern, also einen Inhibitor der Bindung darstellen, oder, andererseits, die Bindung und gegebenenfalls Ausbildung des Kanals durch die in den Lipidmembran vorhandenen Kanalproteinkomplexe fördern, also ein Verstärker der Bindung beziehungsweise Ausbildung der Kanäle. Solche Modulatoren der Bindung, wie Inhibitoren, sind z. B. Antikörper, Peptide oder chemische Entitäten.An alternative embodiment of the candidate compound screening system of the invention comprises a first type of lipid membrane vesicle A containing an optionally predetermined amount of a functional channel protein complex in the lipid membrane and further containing in the interior volume of the lipid membrane vesicle a reactant I in a medium. Furthermore, the system comprises as a second type of lipid membrane vesicles B containing functional channel protein complexes in the lipid membranes and further containing in the volume of the lipid membrane vesicles B a reactant II, which with the reactant I present in the inner volume of the lipid membrane vesicles A leads to a detectable reaction. The system according to the invention also has a device for determining the reaction between the reaction partner I with the reaction partner II from the lipid membrane vesicles. This reaction can occur when the lipid membrane vesicles A and the lipid membrane vesicles B coming into contact through the membrane protein complexes can form a channel through which the reactants can enter the interior volume of the other lipid membrane vesicle. The system further comprises means for introducing the candidate compounds to be tested to modulate the formation of the channel by the channel protein complexes present in the lipid membranes. These candidate compounds can modulate the formation of the channel protein complex by preventing binding of the lipid membrane vesicles A to the lipid membrane vesicles B through the channel membrane complexes, thus inhibiting binding, or, on the other hand, binding and optionally channeling through the channel protein complexes present in the lipid membrane promote, so an amplifier of the binding or training of the channels. Such modulators of binding, such as inhibitors, are e.g. As antibodies, peptides or chemical entities.

Mit dem Ausdruck „Kandidatenverbindungen” sind alle Arten von chemischen oder biologischen Entitäten gemeint. Das heißt es kann sich sowohl um sogenannte „small molecules” handeln, also chemische Verbindungen die synthetisch hergestellt wurden, als auch um biologische Entitäten, zum Beispiel um DNA, RNA, Peptid oder Proteinmoleküle, aber auch um natürlich vorkommende Moleküle wie Steroide etc.By the term "candidate compounds" is meant all types of chemical or biological entities. This means they can be both so-called "small molecules", ie chemical compounds that have been synthesized, as well as biological entities, for example DNA, RNA, peptide or protein molecules, but also naturally occurring molecules such as steroids, etc.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Systems können insbesondere Verbindungen auf ihre Fähigkeit gescreent werden, eine Bindung über das in der Lipidmembran der Lipidmembranvesikel vorhandenen Kanalproteinkomplexe an einen Bindungspartner zu hemmen oder zu fördern.In particular, compounds can be screened for their ability to inhibit or promote binding to the binding partner via the channel protein complexes present in the lipid membrane of the lipid membrane vesicles.

Das erfindungsgemäße System erlaubt ein entsprechendes Identifizieren von geeigneten Kandidatenverbindungen, zum Beispiel von Leitstrukturen. Diese Kandidatenverbindungen können dann entsprechend weiterentwickelt werden, um gegebenenfalls pharmazeutische Wirkstoffe herzustellen.The system according to the invention allows a corresponding identification of suitable candidate compounds, for example of lead structures. These candidate compounds can then be developed further in order to prepare pharmaceutical active ingredients if appropriate.

In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst die Schritte:

  • a) Bereitstellen einer ersten Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenraum die zu testenden Kandidatenverbindungen in einem Medium;
  • b) Bereitstellen einer zweiten Art von Lipidmembranvesikel B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel B Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindungen;
  • c) In Kontakt bringen der Lipidmembranvesikel A und der Lipidmembranvesikel B derart, dass die in den Lipidmembranvesikeln vorhandenen Kanalproteinkomplexe einen Kanal ausbilden, durch die die zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel B oder die Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel A gelangen können;
  • d) Bestimmen der gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung.
In another aspect, the invention provides a method for screening candidate compounds. This method comprises the steps:
  • a) providing a first type of lipid membrane vesicles A containing an optionally predetermined amount of functional channel protein complexes in the lipid membrane and further containing in the interior the candidate compounds to be tested in a medium;
  • b) providing a second type of lipid membrane vesicle B containing functional channel protein complexes in the lipid membrane and further comprising, in the interior volume of the lipid membrane vesicle B, means for determining a desired effect of the candidate compounds to be tested;
  • c) contacting the lipid membrane vesicles A and the lipid membrane vesicles B such that the channel protein complexes present in the lipid membrane vesicles form a channel through which the candidate compounds to be tested enter the lipid membrane vesicles B or the means for determining a desired effect of the candidate compounds to be tested in the lipid membrane vesicles A can get;
  • d) determining the desired effect of the candidate compound to be tested.

In einer alternativen Ausführungsform zum erfindungsgemäßen Verfahren eignet sich dieses Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen zur Bestimmung der Fähigkeit dieser Kandidatenverbindungen ein Binden und gegebenenfalls ein Ausbilden von Kanälen, insbesondere von gap junctions, zu modulieren, das heißt zu hemmen oder fördern. Dieses Verfahren umfasst die Schritte:

  • a) Bereitstellen einer ersten Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und enthaltend weiterhin im Innenvolumen einen Reaktionspartner I in einem Medium;
  • b) Bereitstellen einer zweiten Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen einen Reaktionspartner II, der mit dem Reaktionspartner I eine Reaktion eingehen kann;
  • c) In Kontakt bringen der Lipidmembranvesikel A mit den Lipidmembranvesikeln B in Anwesenheit und Abwesenheit der zu testenden Kandidatenverbindungen; und
  • d) Bestimmen der Reaktion zwischen dem Reaktionspartner I und dem Reaktionspartner II, zur Bestimmung der Fähigkeit der zu testenden Kandidatenverbindungen, die Ausbildung einer Bindung und gegebenenfalls von Kanälen durch die vorhandenen im Lipidmembranvesikeln A und dem Lipidmembranvesikeln B Kanalproteinkomplexe, zu modulieren.
In an alternative embodiment of the method according to the invention, this method is suitable for screening candidate compounds for determining the ability of these candidate compounds to modulate, ie inhibit or promote, binding and optionally channel formation, in particular gap junctions. This method comprises the steps:
  • a) providing a first type of lipid membrane vesicles A containing an optionally predetermined amount of functional channel protein complexes in the lipid membrane and further comprising in the internal volume a reactant I in a medium;
  • b) providing a second type of lipid membrane vesicles B containing functional channel protein complexes in the lipid membrane and further containing in the interior volume Reaction partner II, which can react with the reactant I a reaction;
  • c) contacting the lipid membrane vesicles A with the lipid membrane vesicles B in the presence and absence of the candidate compounds to be tested; and
  • d) determining the reaction between Reagent I and Reagent II to determine the ability of the candidate compounds to be tested to modulate the formation of a bond and optionally channels by the presence in the lipid membrane vesicles A and the lipid membrane vesicles B channel protein complexes.

Bei den Kanalproteinkomplexen, wie sie in den Lipidmembranvesikel A beziehungsweise B der Lipidmembran vorliegen, handelt es sich bevorzugt um solche gebildet aus Connexinen, Pannexinen und/oder Innexinen. Insbesondere bevorzugt sind solche gebildet aus Connexinen.The channel protein complexes, as present in the lipid membrane vesicles A and B, respectively, of the lipid membrane are preferably those formed from connexins, pannexins and / or innexins. Particularly preferred are those formed from connexins.

Connexine verbinden Zellen miteinander durch Ausbildung von gap junctions, die aus zwei Halbzellkanälen, den hexameren Connexonen gebildet werden, und erlauben so eine Kopplung der Zellen. Es ist unter anderem bekannt, dass Connexine nicht nur Ionen, Nukleotide und Farbstoffe, sondern auch Peptide durchleiten können. Das heißt, die Kandidatenverbindungen, chemische oder biologische Entitäten, können vielfältiger Natur sein. Bevorzugt handelt es sich bei den Verbindungen um solche mit einer Größe bis zu 1800 Dalton, wie bis zu 1000 Dalton.Connexins connect cells to each other by forming gap junctions, which are formed from two half-cell channels, the hexameric connexones, and thus allow a coupling of the cells. It is known, among other things, that connexins can not only pass ions, nucleotides and dyes, but also peptides. That is, the candidate compounds, chemical or biological entities, can be of a variety of nature. Preferably, the compounds are those having a size up to 1800 daltons, such as up to 1000 daltons.

Das heißt, die vorliegende Erfindung beruht darauf, gereinigte Connexonen, Pannexonen oder Innexonen in Lipidmembranen von Lipidmembranvesikeln bereitzustellen, im Folgenden auch als Connexosomen, Pannexosomen und Innexosomen bezeichnet. Die Lipidmembranvesikel A zeichnen sich insoweit aus, dass sie eine vorbestimmte Anzahl von Kanalmembranproteinen, insbesondere hexameren Connexonen, aufweisen um dann mit einem entsprechenden Partner die gap junctions auszubilden. Bei den erfindungsgemäß eingesetzten Lipidmembranvesikeln handelt es sich um synthetisch hergestellte Lipidmembranvesikel.That is, the present invention is based on providing purified connexones, pannexones or innexones in lipid membranes of lipid membrane vesicles, also referred to below as connexosomes, breakdown exosomes and nomenosomes. The lipid membrane vesicles A are distinguished insofar as they have a predetermined number of channel membrane proteins, in particular hexameric connexones, in order then to form the gap junctions with a corresponding partner. The lipid membrane vesicles used according to the invention are synthetically produced lipid membrane vesicles.

Bevorzugt weisen diese Lipidmembranvesikel neben dem notwendigen Puffer beziehungsweise Medium nur die Reaktionspartner, zu testenden Kandidatenverbindungen beziehungsweise die Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel auf. Das heißt es liegen keine weiteren gegebenenfalls störenden Komponenten im Innenvolumen aber auch in der Lipidmembran selbst vor. Die Vesikel werden aus definierten membranbildenden Lipiden gebildet. Anschließend werden die Kanalproteine, die in einem Schritt vorher isoliert und aufgereinigt wurden, in die Lipidmembran der Vesikel eingeführt. Vor Einfügen der Kanalproteinkomplexe liegen die zu testenden Kandidatenverbindungen, die Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung beziehungsweise die Reaktionspartner im Innenvolumen der synthetisch gebildeten Lipidmembranvesikel vor. Somit können nicht definierte Komponente aus dem erfindungsgemäßen System beziehungsweise bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgeschlossen werden.In addition to the necessary buffer or medium, these lipid membrane vesicles preferably have only the reactants, candidate compounds to be tested or the means for determining a desired effect in the internal volume of the lipid membrane vesicles. That is, there are no further possibly interfering components in the internal volume but also in the lipid membrane itself. The vesicles are formed from defined membrane-forming lipids. Subsequently, the channel proteins previously isolated and purified in one step are introduced into the lipid membrane of the vesicles. Before insertion of the channel protein complexes, the candidate compounds to be tested, the means for determining a desired effect or the reactants in the inner volume of the synthetically formed lipid membrane vesicles are present. Thus undefined components can be excluded from the system according to the invention or in the method according to the invention.

Vorteile der erfindungsgemäßen Lipidmembranvesikel sind u. a. die definierte Zusammensetzung und die vorbestimmte Größe. Dieses erlaubt den Einsatz im medizinischen und pharmazeutischen Bereich. Die Lipidmembranvesikel sind damit sowohl für die erfindungsgemäßen Verfahren als auch für die erfindungsgemäßen Systeme geeignet, insbesondere bei Anwendung in „high throughput Screening”. Die Connexosomen können aber auch direkt zur medizinischen Applikation von Wirkstoffen in Individuen eingesetzt werden. Dazu enthalten diese Connexosomen gegebenenfalls weitere Bestandteile, zum Beispiel Rezeptoren oder Liganden dieser Rezeptoren, die die Spezifität der Connexosomen weiter erhöht. Dadurch können Substanzen, mit denen vorher die Lipidmembranvesikel beladen wurden und Wirkstoffeigenschaften aufweisen, gezielt in andere Lipidmembranvesikel, insbesondere in Zellen, eingebracht werden.Advantages of the lipid membrane vesicles according to the invention are u. a. the defined composition and the predetermined size. This allows the use in the medical and pharmaceutical field. The lipid membrane vesicles are thus suitable both for the methods according to the invention and for the systems according to the invention, in particular when used in "high throughput screening". The connexosomes can also be used directly for the medical application of active ingredients in individuals. These connexosomes optionally contain further components, for example receptors or ligands of these receptors, which further increases the specificity of the connexosomes. As a result, substances with which the lipid membrane vesicles were previously loaded and have active substance properties can be introduced in a targeted manner into other lipid membrane vesicles, in particular into cells.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei den Lipidmembranvesikel B bevorzugt um Zellen, insbesondere Säugetierzellen, wie menschliche Zellen. Bei Bindung und Ausbildung des Kanals können die in dem Lipidmembranvesikel A vorhandenen Moleküle in das Innenvolumen des zweiten Lipidmembranvesikels eingebracht werden. Handelt es sich bei diesem zweiten Membranvesikel um Zellen, so erlauben die Lipidmembranvesikel A erfindungsgemäß das Einbringen von Molekülen in das Zytoplasma der Zelle.According to the invention, the lipid membrane vesicles B are preferably cells, in particular mammalian cells, such as human cells. Upon binding and formation of the channel, the molecules present in the lipid membrane vesicle A can be introduced into the interior volume of the second lipid membrane vesicle. If this second membrane vesicle is a cell, the lipid membrane vesicles A according to the invention allow the introduction of molecules into the cytoplasm of the cell.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Kanalproteinkomplexe in den Lipidmembranvesikeln A und B identisch. Es können aber auch unterschiedliche Kanalproteinkomplexe vorliegen, die eine Ausbildung von heteromeren Kanälen erlaubt.In a preferred embodiment, the channel protein complexes in the lipid membrane vesicles A and B are identical. However, different channel protein complexes may also be present which permit the formation of heteromeric channels.

Insbesondere bevorzugt handelt es sich bei den eingesetzten Kanalproteinkomplexen um Hexamere der Connexine, wie Connexin 26, Connexin 32 oder Connexin 43. Derzeit umfasst die Genfamilie der Connexine 21 Gene.The channel protein complexes used are particularly preferably connexin hexamers, such as connexin 26, connexin 32 or connexin 43. Currently, the connexin gene family comprises 21 genes.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Lipidmembranvesikeln A und/oder B um solche in Form von Nanovesikeln, bevorzugt in einer Größe von 40 bis 80 nm. In diesen Nanovesikeln liegen die Connexone in vorbestimmter Mengen zum Beispiel in einer Menge von 2 bis 4 Connexonen vor. Dadurch ist es möglich definierte Lipidmembranvesikel bereitzustellen.In a further preferred embodiment, the lipid membrane vesicles A and / or B are those in the form of nanovesicles, preferably in a size of 40 to 80 nm. In these Nanovesikel the connexones are present in predetermined amounts, for example in an amount of 2 to 4 connexones. This makes it possible to provide defined lipid membrane vesicles.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen erlaubt eine Bestimmung der gewünschten Wirkung dieser auf die Zielstrukturen. Diese Zielstrukturen können zellinterne Targets aller Art, wie Enzyme, Rezeptoren, Nukleinsäuren, Zucker, Lipide, Peptide, Toxine etc. sein.The method according to the invention for screening candidate compounds allows a determination of the desired effect of these on the target structures. These target structures may be cell-internal targets of all kinds, such as enzymes, receptors, nucleic acids, sugars, lipids, peptides, toxins, etc.

Des Weiteren können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren aus den Kandidatenverbindungen solche Verbindungen identifiziert werden, die die Ausbildung der Kanäle verhindern oder ein Binden der Vesikel (Andocken) verhindern. Bevorzugt dient das Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen, die ein Ausbilden von gap junctions verhindern oder fördern. Es können des Weiteren Verbindungen identifiziert werden, die besonders für das vorliegende therapeutische System der Connexosomen geeignet sind, da sie gut durch die gap junctions transportierbar sind und die Ausbildung der gap junctions nicht blocken.Furthermore, with the method according to the invention, it is possible to identify from the candidate compounds those compounds which prevent the formation of the channels or prevent a binding of the vesicles (docking). Preferably, the method is for screening candidate compounds that prevent or promote gap junctions. Furthermore, compounds which are particularly suitable for the present therapeutic system of the Connexosome can be identified, since they are well transportable through the gap junctions and do not block the formation of the gap junctions.

Bei den Mitteln zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindungen, die im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel B vorliegen kann es sich um verschiedene Mittel handeln. Geeignete Mittel sind zum Beispiel Enzyme und deren Substrate aber auch Bindungspartner etc., wie bereits ausgeführt. Wenn es sich bei dem Lipidmembranvesikel B um Zellen handelt, können diese Mittel Zellkomponenten sein. Erfindungsgemäß können diese Kandidatenverbindungen in diesen Zellen die gewünschte Wirkung hervorrufen, zum Beispiel Zellproliferation, Zelltot, Zelldifferenzierung etc.The means for determining a desired effect of the candidate compounds to be tested present in the internal volume of the lipid membrane vesicles B may be various agents. Suitable agents are, for example, enzymes and their substrates but also binding partners, etc., as already stated. When the lipid membrane vesicle B is cells, these agents may be cell components. According to the invention, these candidate compounds in these cells can produce the desired effect, for example cell proliferation, cell death, cell differentiation etc.

Alternativ können die Lipidmembranvesikel A und/oder B Reaktionspartner enthalten. Diese Reaktionspartner führen bei in Kontakt bringen miteinander eine Reaktion durch. Das sich daraus bildende Reaktionsprodukt beziehungsweise zum Beispiel die Abnahme von Reaktionspartnern kann dann mit entsprechenden Einrichtungen bestimmt werden und erlauben somit einen Nachweis für die Ausbildung von entsprechenden Bindungen beziehungsweise Ausbildung von Kanälen.Alternatively, the lipid membrane vesicles A and / or B may contain reactants. These reactants, when brought into contact with each other, undergo a reaction. The resulting reaction product or, for example, the removal of reactants can then be determined with appropriate facilities and thus allow evidence for the formation of appropriate bonds or training of channels.

In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei den Kanalproteinkomplexen um Innexine. Innexine werden von Invertebraten exprimiert. Die Kandidatenverbindungen sind solche, die Leitstrukturen für zum Beispiel Insektizide darstellen. Das heißt erfindungsgemäß wird ein System ein Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen als Leitstrukturen für Insektizide bereitgestellt.In another embodiment, the channel protein complexes are innexins. Innexins are expressed by invertebrates. The candidate compounds are those which are lead structures for, for example, insecticides. That is, in accordance with the present invention, a system is provided a method of screening candidate compounds as lead structures for insecticides.

Die erfindungsgemäßen Lipidmembranvesikel bestehen aus Lipidmembranausbildenden Lipiden, mit in die Lipidmembran integrierten Kanalproteinkomplexen, bei denen es sich bevorzugt um Connexonen, Innexonen oder Pannexonen handelt, wobei die Lipidmembranvesikel im Innenvolumen mindestens einen pharmazeutisch aktiven Inhaltsstoff gegebenenfalls in Form seines Salzes oder Solvates, enthalten. Diese Lipidmembranvesikel sind besonders gut in pharmazeutischen und medizinischen Anwendungen verwendbar. Aufgrund der definierten Zusammensetzung der erfindungsgemäßen Lipidmembranvesikel können diese an Individuen verabreicht werden. Solche Lipidmembranvesikel eignen sich unter anderem auch in der Gentherapie und stellen eine hervorragende Alternative zu derzeit verwendeten Liposomen oder Transportsystemen auf viraler Basis dar. Ein Vorteil dieser erfindungsgemäßen Lipidmembranvesikel ist die definierte Zusammensetzung und insbesondere die aufgrund der definierten Zusammensetzung vorliegende geringe Immunsystem-aktivierende Wirkung. Das heißt die Abwehrreaktionen des Individuums bei einer Gentherapie können stark verringert werden. Die Lipidmembranvesikel können auch gezielt Substanzen in neoplastische Zellen einschleusen indem ungekoppelte Halbzellkanäle in den neoplastischen Zellen für das Andocken genutzt werden und dann die im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel vorliegenden Wirkstoffe gezielt in die Zielzellen eingebracht werden können. Entsprechend können hochaktive Wirkstoffe auch in andere Zielzellen eingebracht werden, um zum Beispiel Zellproliferation, Zelltot, Zelldifferenzierung, etc auszulösen. Eine Wirkung als Kontrazeptiva ist ebenfalls möglich. Vorteil der vorliegenden Lipidmembranvesikel ist, dass nicht nur einfache chemische Entitäten im Innenvolumen vorliegen können, sondern auch Peptid- oder Nukleotidmoleküle, wie siRNA, miRNA etc.The lipid membrane vesicles according to the invention consist of lipid membrane-forming lipids, with channel protein complexes integrated in the lipid membrane, which are preferably connexones, innexones or pannexones, wherein the lipid membrane vesicles contain at least one pharmaceutically active ingredient, optionally in the form of its salt or solvate, in the internal volume. These lipid membrane vesicles are particularly useful in pharmaceutical and medical applications. Due to the defined composition of the lipid membrane vesicles according to the invention, these can be administered to individuals. Such lipid membrane vesicles are also suitable, inter alia, in gene therapy and represent an excellent alternative to currently used liposomes or transport systems on a viral basis. An advantage of these lipid membrane vesicles according to the invention is the defined composition and in particular the low immune system activating effect due to the defined composition. That is, the individual's defense responses to gene therapy can be greatly reduced. The lipid membrane vesicles can also specifically introduce substances into neoplastic cells by using uncoupled half-cell channels in the neoplastic cells for docking and then selectively introducing the active substances present in the inner volume of the lipid membrane vesicles into the target cells. Accordingly, highly active drugs can also be introduced into other target cells, for example, to trigger cell proliferation, cell death, cell differentiation, etc. An effect as a contraceptive is also possible. The advantage of the present lipid membrane vesicles is that not only can simple chemical entities be present in the internal volume, but also peptide or nucleotide molecules, such as siRNA, miRNA, etc.

Die Lipidmembranvesikel eignen sich insbesondere bei dem Zuführen von neurologisch wirksamen Inhaltstoffen. Da die Lipidmembranvesikel, insbesondere wenn Sie eine Größe von < 100 nM aufweisen, die entsprechenden Barrieren passieren können, können diese Lipidmembranvesikel gezielt pharmazeutisch aktive Wirkstoff in Bereiche einbringen, wie cerebrale Bereiche, die ansonsten nur schwer zugänglich sind.The lipid membrane vesicles are particularly useful in delivering neurologically active ingredients. Since the lipid membrane vesicles, especially if they have a size of <100 nM, can pass through the corresponding barriers, these lipid membrane vesicles can selectively introduce pharmaceutically active ingredient into areas such as cerebral areas, which are otherwise difficult to access.

BeispieleExamples

Herstellung von ConnexonenProduction of Connexons

Als allgemeines Beispiel dient hier das humane Connexin 26, es kann aber auch jedes andere Connexin gewählt werden. Rekombinantes Connexin hCx26 wird in E. coli Zellen gemäß bekannten Verfahren als Kanalmonomer erzeugt, Steffens et al, supra . Nach Affinitätsreinigung der Proteinuntereinheiten des Connexins werden die vorhandenen Tags mittels einer Protease entfernt, so dass das entsprechende Connexinprotein als korrekt kodiertes Proteinmonomer vorliegt, Steffens et al., supra. In Gegenwart von dem Lipid POPC wird das Kanalmonomer in Kanalhexamere gefaltet. Hierbei wird ein Protein-Lipidverhältnis von 1:1 (w/w) gewählt. Als Beispiel dient 1 mg gereinigtes Kanalprotein, das von dem Tag befreit wurde und in 30 mM Octylglucosid, 150 mM NaCl und 10 mM Tris pH 8 vorliegt. Das Protein wird mit 1 mg POPC auf Eis inkubiert und anschließend gegen ein 10-faches Volumen gegen 1xPBs über Nacht bei 4°C dialysiert. Anschließend wird dieser Ansatz 5-fach verdünnt mit einem Puffer, der 30 mM OG und 1x PBS enthält, verdünnt und mittels 100 K Konzentratoren auf 1–2 mg ml–1 Kanalprotein konzentriert. Geformte Kanalhexamere lassen sich über SDS-PAGE nachweisen. Connexinhexamere werden dann über einen Zentrifugationsfilter (Amicon Y100) abgetrennt.A general example is the human connexin 26, but any other connexin can be chosen. Recombinant connexin hCx26 is produced in E. coli cells according to known methods as channel monomer, Steffens et al, supra , After affinity purification the Protein subunits of the connexin are the tags removed by means of a protease, so that the corresponding connexin protein is present as a correctly coded protein monomer, Steffens et al., Supra. In the presence of the lipid POPC, the channel monomer is folded into channel hexamer. Here, a protein-lipid ratio of 1: 1 (w / w) is selected. As an example, 1 mg of purified channel protein that has been cleared from the day and is present in 30 mM octylglucoside, 150 mM NaCl, and 10 mM Tris pH8. The protein is incubated with 1 mg POPC on ice and then dialysed against a 10-fold volume of 1xPBs overnight at 4 ° C. Subsequently, this mixture is diluted 5-fold with a buffer containing 30 mM OG and 1x PBS, diluted and concentrated by means of 100 K concentrators to 1-2 mg ml -1 channel protein. Shaped channel hexamers can be detected by SDS-PAGE. Connexin hexamers are then separated via a centrifugation filter (Amicon Y100).

Herstellung von ConnexosomenProduction of Connexosomes

Hierzu werden 10 mg ml–1 Lipid (hier POPC) in 0.2 ml Chloroform gelöst und der Lipidfilm unter N2 Gasstrom in einem Glaskolben unter Schwenken getrocknet, eventuell verbleibende Chloroformreste werden durch Anlegen eines Vakuums bei 50°C über Nach entfernt. Der getrocknete Lipidfilm wird in 1 ml Puffer, der Farbstoffe, Wirkstoffe, Nukleinsäuren oder Peptide, sowie Puffer und Salze enthält, gelöst.For this purpose, 10 mg ml -1 lipid (here POPC) dissolved in 0.2 ml of chloroform and the lipid film under N2 gas stream in a glass flask under stirring, any remaining chloroform residues are removed by applying a vacuum at 50 ° C over. The dried lipid film is dissolved in 1 ml of buffer containing dyes, drugs, nucleic acids or peptides, as well as buffers and salts.

Als Testsystem wird hier eine 1%ige Lucifer Yellow mit 150 mM NaCl und 10 mM Tris pH 8 verwendet. Die Lipidsuspension wird 20 Minuten in einem Ultraschallbad beschallt oder mit einer Ultraschallsonde bis die Suspension nicht mehr milchig erscheint. Anschließend wird der Ansatz über eine Sepharose 4B getrennt oder mittels einem 0.1 μm Filter filtriert. Hierbei entstehen vorwiegend kleine unilamellare Vesikel (SUV's) mit 35–80 nm Durchmesser. Die Vesikelsuspensionen (10 mg ml–1) wird anschließend mit gereinigten Connexonen inkubiert, hier 0,1 mg Connexone (~0,65 μmol), die in 30 mM Octylglucosid sowie einer entsprechenden Salz und Pufferlösungen vorliegen. Die Ansätze werden über Nacht auf Eis geschüttelt und nach Überführung in einen Dialyseschlauch 48 h gegen 2 l Puffervolumen (10 mM Tris pH 8, 150 NaCl, 5 mM CaCl2) unter dreimaligem Wechsel dialysiert. Alle Arbeiten sind gekühlt bei 4°C durchzuführen. Anschließend werden die Vesikel auf Eis gekühlt bei 4°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.The test system used here is a 1% Lucifer Yellow with 150 mM NaCl and 10 mM Tris pH 8. The lipid suspension is sonicated for 20 minutes in an ultrasonic bath or with an ultrasound probe until the suspension no longer appears milky. The mixture is then separated on a Sepharose 4B or filtered by means of a 0.1 micron filter. This mainly produces small unilamellar vesicles (SUVs) with 35-80 nm diameter. The vesicle suspensions (10 mg ml -1 ) are then incubated with purified connexones, here 0.1 mg Connexone (~ 0.65 .mu.mol), which are present in 30 mM octylglucoside and a corresponding salt and buffer solutions. The mixtures are shaken overnight on ice and dialyzed after conversion into a dialysis tube for 48 h against 2 l buffer volume (10 mM Tris pH 8, 150 NaCl, 5 mM CaCl 2 ) with three changes. All work must be carried out cooled at 4 ° C. Subsequently, the vesicles are cooled on ice at 4 ° C until further use.

Für Aktivitätsmessungen wurden Liposomen mit rekonstituierten Connexonen genutzt, die mit 1% Lucifer Yellow Farbstoff gefüllt sind. Die externe Messlösung enthält keinen Farbstoff. Als Messpuffer dient der entsprechende Dialysepuffer mit dem die Vesikel hergestellt wurden einschließlich 5 mM CaCl2. In die Messlösung (95 μl) werden 5 μl Vesikellösung appliziert und sofort vermischt. Die Messung wird bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt. Obwohl bei höheren Temperaturen die Kanäle aktiv sind, verhindert die Anwesenheit von Ca2+, dass Connexine mit physiologischer Orientierung Farbstoff freisetzen können. Erst unter Erniedrigung der freien Ca2+-Konzentration durch Zugabe von EDTA und Einstellung der Ca2+ Konzentration unter 100 μM, werden die Connexone aktiviert und die Kanalöffnung wird provoziert und ermöglichen einen Ionentransport (hier Farbstoff) gefolgt von einer Änderung des optischen Signals. Die Messungen werden in einem Fluorimeter entsprechend den Farbstoffeigenschaften mit Temperaturregelung in einer Mikrotiterplatte durchgeführt.For activity measurements, liposomes were used with reconstituted connexones filled with 1% Lucifer Yellow dye. The external measurement solution contains no dye. The measurement buffer is the appropriate dialysis buffer used to prepare the vesicles, including 5 mM CaCl 2 . 5 μL vesicle solution is applied to the test solution (95 μL) and mixed immediately. The measurement is carried out at different temperatures. Although the channels are active at higher temperatures, the presence of Ca 2+ prevents the connexins from releasing dye with physiological orientation. Only by lowering the free Ca 2+ concentration by addition of EDTA and setting the Ca 2+ concentration below 100 μM, the connexones are activated and the channel opening is provoked and allow an ion transport (here dye) followed by a change in the optical signal. The measurements are carried out in a fluorimeter according to the dye properties with temperature control in a microtiter plate.

Kopplungsnachweiscoupling evidence

Connexone sind in der Lage, Nukleotide wie ATP zu transportieren. Dies wird in dem Luciferase-Testsystem ausgenutzt, den ATP-Transport von dem einen Vesikel in das über Gap-Junction gekoppelte Nachbarvesikel nachzuweisen. Um die Kopplungsfähigkeit nachzuweisen werden zwei getrennte Liposomenpopulation hergestellt. Die eine Liposomenpopulation enthält 0,1 mM ATP, die andere Luciferin und Luciferase in entsprechenden Puffer des Herstellers, (hier Biafin). Entsprechend wird die Vesikelsuspension über eine Sepharose 4B Säule getrennt und die Vesikelsuspension mittels eines 0,1 μm Filters filtriert. Nachfolgend werden die Vesikelpopulation für 20 min bei unterschiedlichen Bedingungen bei RT inkubiert. Luciferin und Luciferase enthaltende Lösungen werden auch während der Verarbeitung vor Belichtung geschützt. Die Ausbildung von Gap Junctions kann anhand des ATP-Transportes und der entstehenden Bioluminiszens in einem geeigneten Gerät (Berthold) nachgewiesen werden.Connexone are able to transport nucleotides such as ATP. This is exploited in the luciferase assay system to detect ATP transport from the one vesicle into the gap junction-coupled neighbor vesicle. To demonstrate the coupling ability, two separate liposome populations are prepared. One liposome population contains 0.1 mM ATP, the other luciferin and luciferase in corresponding buffer of the manufacturer, (here Biafin). Accordingly, the vesicle suspension is separated on a Sepharose 4B column and the vesicle suspension is filtered by means of a 0.1 micron filter. Subsequently, the vesicle population are incubated for 20 min at different conditions at RT. Solutions containing luciferin and luciferase are also protected from exposure during processing. The formation of gap junctions can be demonstrated by the ATP transport and the resulting bioluminescence in a suitable device (Berthold).

ErgebnisseResults

Connexin 26 wurde rekombinant in E. coli hergestellt und nach Reinigung zu einem Connexon (ein Hexamer) in Gegenwart von Lipid rekonstituiert. Um nachzuweisen, dass diese Kanalhexamere funktionell sind wurde durch die Freisetzung von Lucifer Yellow (LY) aus Connexon-haltigen Lipidvesikeln überprüft. Da Kalzium Connexone blockiert, kann die Herabsetzung der freien Kalziumkonzentration über EDTA die Connexonaktivität steuern. Dies wird ausgenutzt, um die temperaturabhängige Freisetzung von LY aus den Vesikeln über Connexone zu steuern. Befindet sich LY in den Vesikeln eingeschlossen, erhält man ein niedrigeres Floureszenssignal gegenüber freigesetzten LY. Wird eine konzentrierte EDTA-Lösung zur Vesikellösung gegeben, kann eine Freisetzung von LY und ein damit verbundener Anstieg des Fluoreszenzsignals dann detektiert werden, wenn dies auch gleichzeitig mit einer Temperaturerhöhung verbunden ist. Die Temperaturerhöhung ist der eigentliche Trigger für die Freisetzung, die Sensitivität gegenüber Ca2+ bleibt aber davon unbetroffen, so dass Inhibitoren auf diese Weise analysiert werden können. Dies zeigt, dass die gereinigten Connexone als Halbzellkanäle aktiv sind.Connexin 26 was recombinantly produced in E. coli and reconstituted after purification to a connexon (a hexamer) in the presence of lipid. To demonstrate that these channel hexamers are functional was checked by the release of Lucifer Yellow (LY) from connexone-containing lipid vesicles. Since calcium blocks connexone, lowering the free calcium concentration via EDTA can control connexone activity. This is exploited to control the temperature-dependent release of LY from the vesicles via Connexone. If LY is trapped in the vesicles, a lower fluorescence signal than released LY is obtained. If a concentrated EDTA solution is added to the vesicle solution, a release of LY and an associated increase in the fluorescence signal can then be detected, although this is also associated with an increase in temperature. The temperature increase is However, the actual trigger for the release, the sensitivity to Ca 2+ remains unaffected, so that inhibitors can be analyzed in this way. This shows that the purified connexones are active as half cell channels.

Um in einem Funktionstest die Kopplung zwischen zwei verschiedenen Lipidmembranvesikeln unterschiedlicher Art nachzuweisen, wurde der ATP-Transport durch ausgebildete Gap Junctions untersucht, was dann mittels Luciferin/Luciferasesystem als entstehende Bioluminiszenz beobachtet werden kann. Hierzu wurden zwei Vesikelpopulationen, die ATP und Luciferin/Luciferase enthielten in einem Kopplungspuffer gemischt. Ausgebildete Gap-Junctions ermöglichen den Transport von ATP in das benachbarte Vesikel, das zu einem Bioluminiszenzsignal führt, wenn ATP von dem Luciferin/Luciferasesystem detektiert wird.In order to demonstrate in a functional test the coupling between two different lipid membrane vesicles of different types, the ATP transport was investigated by formed gap junctions, which can then be observed by means of luciferin / luciferase system as resulting bioluminescence. To this end, two vesicle populations containing ATP and luciferin / luciferase were mixed in a coupling buffer. Trained gap junctions enable the transport of ATP into the adjacent vesicle, resulting in a bioluminescent signal when ATP is detected by the luciferin / luciferase system.

In ist das ermittelte Biolumineszenzsignal als Funktion unterschiedlicher Inkubationsbedingungen dargestellt. Es ist zu erkennen, dass ein Absenken des pHs auf 5.5 zu einem erhöhten Biolumineszenzsignal führt, was mit der Ausbildung von Gap-Junctions einhergeht. Dagegen wurden keine Gap-Junctions ausgebildet, wenn der pH erhöht wurde oder DTT oder Mercaptoethanol zugesetzt wurde. Eine Absenkung des pH-Werts erlaubt die Ausbildung der Gap-Junctions.In the detected bioluminescence signal is shown as a function of different incubation conditions. It can be seen that lowering the pH to 5.5 leads to an increased bioluminescence signal, which is accompanied by the formation of gap junctions. In contrast, no gap junctions were formed when the pH was increased or DTT or mercaptoethanol was added. Lowering the pH allows the formation of gap junctions.

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

  • EP 2054729 [0004] EP 2054729 [0004]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

  • Steffens M. et al., Biochemica et Biophysica Acta 1778 (2008), 1206–1212 [0004] Steffens M. et al., Biochemica et Biophysica Acta 1778 (2008), 1206-1212 [0004]
  • Kaneda M., et al., Biomaterials 30 (2009), 3971–3977 [0005] Kaneda M., et al., Biomaterials 30 (2009), 3971-3977 [0005]
  • Steffens et al, supra [0039] Steffens et al, supra [0039]

Claims (17)

System zum Screenen von Kandidatenverbindungen umfassend i) eine erste Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel A enthaltend die zu testende Kandidatenverbindung in einem Medium; ii) eine zweite Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel B enthaltend Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung; iii) eine Einrichtung zur Bestimmung der gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung, wobei die Lipidmembranvesikel A und die Lipidmembranvesikel B bei in Kontakt bringen durch die Kanalproteinkomplexe einen verbindenden Kanal ausbilden können, durch den die zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel B gelangen können oder umgekehrt.A system for screening candidate compounds i) a first type of lipid membrane vesicles A containing an optionally predetermined amount of functional channel protein complexes in the lipid membrane and in the internal volume of the lipid membrane vesicles A containing the candidate compound to be tested in a medium; ii) a second type of lipid membrane vesicles B containing functional channel protein complexes in the lipid membrane and in the internal volume of the lipid membrane vesicle B containing means for determining a desired effect of the candidate compound to be tested; iii) means for determining the desired effect of the candidate compound to be tested, wherein the lipid membrane vesicles A and the lipid membrane vesicles B, when brought into contact by the channel protein complexes, can form a connecting channel through which the candidate compounds to be tested can enter the lipid membrane vesicles B or vice versa. System zum Screenen von Kandidatenverbindungen umfassend: i) eine erste Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge eines funktionalen Kanalproteinkomplexes in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel A einen Reaktionspartner 1 in einem Medium; ii) eine zweite Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Kanalprotienkomplexe in den Lipidmembranen und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvisikel B einen Reaktionspartner II, der mit dem Reaktionspartner I zu einer nachweisbaren Reaktion führt; iii) eine Einrichtung zur Bestimmung der Reaktion zwischen dem Reaktionspartner I aus dem Lipidmembranvesikel A und dem Reaktionspartner II aus dem Lipidmembranvesikel B, wobei die Lipidmembranvesikel A und Lipidmembranvesikel B bei in Kontakt bringen durch die Proteinkomplexe einen Kanal ausbilden können, durch die die Reaktionspartner in das Innenvolumen des jeweiligen anderen Lipidmembranvesikels gelangen können; iv) Mittel zum Einbringen der zu testenden Kandidatenverbindungen, um die Ausbildung des Kanals durch die in den Lipidmembranen vorhandenen Kanalproteinkomplexe zu modulieren.System for screening candidate compounds comprising: i) a first type of lipid membrane vesicles A containing an optionally predetermined amount of a functional channel protein complex in the lipid membrane and further comprising in the internal volume of the lipid membrane vesicles A a reactant 1 in a medium; ii) a second type of lipid membrane vesicles B containing functional channel protien complexes in the lipid membranes and further containing in the internal volume of the lipid membrane visceral B a reactant II which leads to a detectable reaction with the reactant I; iii) means for determining the reaction between the reactant I from the lipid membrane vesicle A and the reaction partner II from the lipid membrane vesicle B, wherein the lipid membrane vesicles A and lipid membrane vesicles B, when brought into contact by the protein complexes, can form a channel through which the reactants enter the Inner volume of the respective other Lipidmembranvesikels reach; iv) means for introducing the candidate compounds to be tested to modulate the formation of the channel by the channel protein complexes present in the lipid membranes. System nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die zweite Art von Lipidmembranvesikel B eine Zelle ist, bevorzugt eine Säugetierzelle, insbesondere eine humane Zelle.System according to one of the preceding claims, wherein the second type of lipid membrane vesicle B is a cell, preferably a mammalian cell, in particular a human cell. System nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der funktionale Kanalproteinkomplex einer ist gebildet aus Connexinen, Pannexinen und/oder Innexinen, bevorzugt Connexine.System according to one of the preceding claims, wherein the functional channel protein complex is one formed from connexins, Pannexinen and / or Innexinen, prefers Connexine. System nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Kanalproteinkomplexe in den Lipidmembranvesikeln A und B identisch sind.A system according to any one of the preceding claims, wherein the channel protein complexes in the lipid membrane vesicles A and B are identical. System nach einem der vorherigen Ansprüche geeignet zum „high throughput Screening” von Kandidatenverbindungen.System according to one of the preceding claims suitable for "high throughput screening" of candidate compounds. System nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Lipidmembranvesikel A und/oder B in Form von Nanosvesikeln, bevorzugt in einer Größe von 40 bis 80 nM, vorliegen.System according to one of the preceding claims, wherein the lipid membrane vesicles A and / or B in the form of nanosvesicles, preferably in a size of 40 to 80 nM, are present. System nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel außer dem Puffer oder dem Medium nur die zu testenden Kandidatenverbindungen, die Mittel zur Bestimmung der gewünschten Wirkung beziehungsweise die Reaktionspartner vorliegen.System according to one of the preceding claims, wherein in the inner volume of the lipid membrane vesicles except the buffer or the medium only the candidate compounds to be tested, the means for determining the desired effect or the reactants are present. Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen umfassend a) Bereitstellen einer ersten Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenraum die zu testenden Kandidatenverbindungen in einem Medium; b) Bereitstellen einer zweiten Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel B Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindungen; c) In Kontakt bringen der Lipidmembranvesikel A und der Lipidmembranvesikel B derart, dass die in den Lipidmembranvesikeln vorhandenen Kanalproteinkomplexe einen Kanal ausbilden, durch die die zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel B oder die Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel A gelangen können; d) Bestimmen der gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung.A method for screening candidate compounds comprising a) providing a first type of lipid membrane vesicle A containing an optionally predetermined amount of functional channel protein complexes in the lipid membrane and further containing in the interior the candidate compounds to be tested in a medium; b) providing a second type of lipid membrane vesicles B containing functional channel protein complexes in the lipid membrane and further comprising, in the interior volume of the lipid membrane vesicles B, means for determining a desired effect of the candidate compounds to be tested; c) contacting the lipid membrane vesicles A and the lipid membrane vesicles B such that the channel protein complexes present in the lipid membrane vesicles form a channel through which the candidate compounds to be tested enter the lipid membrane vesicles B or the means for determining a desired effect of the candidate compounds to be tested in the lipid membrane vesicles A can get; d) determining the desired effect of the candidate compound to be tested. Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen zur Bestimmung der Fähigkeit dieser Kandidatenverbindungen ein Binden und gegebenenfalls Ausbilden von Kanälen (gap junctions) zu modulieren umfassend a) Bereitstellen einer ersten Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und enthaltend weiterhin im Innenvolumen einen Reaktionspartner I in einem Medium; b) Bereitstellen einer zweiten Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen einen Reaktionspartner II, der mit dem Reaktionspartner I eine Reaktion eingehen kann; c) In Kontakt bringen der Lipidmembranvesikel A mit den Lipidmembranvesikeln B in Anwesenheit und Abwesenheit der zu testenden Kandidatenverbindungen; und d) Bestimmen der Reaktion zwischen dem Reaktionspartner I und dem Reaktionspartner II, zur Bestimmung der Fähigkeit der zu testenden Kandidatenverbindungen, die Ausbildung einer Bindung und gegebenenfalls von Kanälen durch die vorhandenen im Lipidmembranvesikeln A und dem Lipidmembranvesikeln B Kanalproteinkomplexe, zu modulieren.A method for screening candidate compounds to determine the ability of these candidate compounds to modulate binding and optionally forming gap junctions a) providing a first type of lipid membrane vesicles A containing an optionally predetermined amount of functional channel protein complexes in the lipid membrane and further comprising in the internal volume a reactant I in a medium; b) providing a second type of lipid membrane vesicles B containing functional channel protein complexes in the lipid membrane and further comprising in the internal volume a reaction partner II which is capable of reacting with the reaction partner I; c) contacting the lipid membrane vesicles A with the lipid membrane vesicles B in the presence and absence of the candidate compounds to be tested; and d) determining the reaction between Reagent I and Reagent II to determine the ability of the candidate compounds to be tested to modulate the formation of a bond and optionally channels by the presence in the lipid membrane vesicles A and the lipid membrane vesicles B channel protein complexes. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, wobei dieses mit einem System nach einem der Ansprüche 1 bis 8 durchgeführt wird.Method according to one of claims 9 or 10, wherein this is carried out with a system according to one of claims 1 to 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Kandidatenverbindungen eine Größe von maximal 1800 Dalton aufweisen.Method according to one of claims 9 to 11, characterized in that the candidate compounds have a size of a maximum of 1800 daltons. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Kanalproteinkomplexe Innexine sind und die Kandidatenverbindungen Kandidatenverbindungen für Insektizide darstellen.A method according to any one of claims 9 to 12, wherein the channel protein complexes are innexines and the candidate compounds are candidate compounds for insecticides. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Ausbildung der Kanäle zwischen den Vesikeln aufgrund der Änderung des pH-Werts und/oder der Temperatur erfolgt.A method according to any one of claims 9 to 13, wherein the formation of channels between the vesicles is due to the change in pH and / or temperature. Lipidmembranvesikel bestehend aus Lipiden zur Ausbildung der Lipidmembran, Kanalproteinkomplexen, bevorzugt Connexonen, Innexonen oder Pannexonen, die in der Lipidmembran vorliegen und im Innenvolumen der Vesikel mindestens einen pharmazeutisch aktiven Inhaltsstoff, gegebenenfalls in Form seines Salzes, in einem geeigneten Medium.Lipid membrane vesicles consisting of lipids for forming the lipid membrane, channel protein complexes, preferably connexones, innexones or Pannexonen present in the lipid membrane and in the inner volume of the vesicles at least one pharmaceutically active ingredient, optionally in the form of its salt, in a suitable medium. Lipidmembranvesikel nach Anspruch 15 in Form von Nanovesikeln, bevorzugt in einer Größe von kleiner 100 nm.Lipid membrane vesicles according to claim 15 in the form of nanovesicles, preferably in a size of less than 100 nm. Verwendung der Lipidmembranvesikel nach Anspruch 15 oder 16 in pharmazeutischen Zusammensetzungen, insbesondere solchen für neurologische Anwendungen.Use of the lipid membrane vesicles according to claim 15 or 16 in pharmaceutical compositions, especially those for neurological applications.
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