DE102009046267B4

DE102009046267B4 - Verfahren zur Messung magnetischer Informationen, insbesondere der magnetischen AC-Suszeptibilität, von magnetischen Nanopartikeln (Markern)

Info

Publication number: DE102009046267B4
Application number: DE102009046267A
Authority: DE
Inventors: Stephan Block; Prof. Dr. Helm Christiane A.
Original assignee: Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald
Current assignee: Universitaet Greifswald
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2009-10-30
Publication date: 2013-12-24
Anticipated expiration: 2029-10-31
Also published as: WO2011051449A1; DE102009046267A1

Abstract

Verfahren mit einem Rasterkraftmikroskop zur räumlich aufgelösten Bestimmung von Nanopartikeln, welche in beziehungsweise auf eine Probe gebracht werden, und Messung der magnetischen Informationen der Nanopartikel, insbesondere der magnetischen AC-Suszeptibilität, wobei der Durchmesser der Nanopartikel im Bereich von 5 nm bis 50 nm liegt und diese magnetische Dipolmomente aufweisen, die eine externe magnetische Flussdichte verstärken oder abschwächen, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel und die Probe mit einem magnetischen Wechselfeld angeregt werden, so dass die gesamte Flussdichte in der Nähe der Nanopartikel verändert wird, die zu untersuchende Probe dreidimensional gerastert wird, mit der magnetischen Spitze des Rasterkraftmikroskops die Änderung der gesamten magnetischen Flussdichte unter Einfluss des magnetischen Wechselfeldes auf die Probe bestimmt wird, indem die Auslenkung der magnetischen Spitze gemessen wird, das anregende magnetische Wechselfeld eine Frequenz von 10 kHz bis 100 MHz aufweist und das Verfahren im Bereich der Raumtemperatur angewandt wird, was den Einsatz unter biologischen Bedingungen ermöglicht.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem mittels Rasterkraftmikroskopie magnetische Informationen von einzelnen isolierten magnetischen Markern im nm-Bereich gemessen werden können, sowie die Verwendung des Verfahrens zur räumlichen Trennung von markierten und unmarkierten Bereichen, zur Messung der magnetischen Suszeptibilität der Marker und zur Bestimmung der Geometrie der Marker.
Um magnetische Wechselwirkungen mit dem Atomkraftmikroskop, englisch atomic force microscope (AFM) zu messen, existieren bisher zwei typische Ansätze: Magnetkraft-Mikroskopie, in Englisch magnetic force microscopy (MFM) wie in EP 0924 529 B1 beschrieben und Rasterkraftmagnet-Mikroskopie, in Englisch magnetic resonance force microscopy (MRFM) gemäß US Patent 5 166 615 A .
Verfahren, bei denen die MRFM angewandt wird, werden beispielsweise in den folgenden Schriften behandelt:

1. O. Klein et al.: ”Ferromagnetic resonance force spectroscopy of individual submicron-Size samples”. Phys. Rev. B 78, pp. 144410 (2008);
2. US 5,266,896 A ;
3. K. Wago et al.: ”Paramagnetic and ferromagnetic resonance imaging with a tip-on-cantilever magnetic resonance force microscope”. Appl. Phys. Lett. 72, pp. 2757–2759 (1998) und
4. DE 695 23 559 T2 .
Die MFM bzw. AFM wird beispielsweise in den folgenden Schriften genutzt:
5. US 2003/0067308 A1 ,
6. US 7,560,921 B2 und
7. N. I. Polushkin et al.: ”Local magnetostrictive response of small magnetic entities in artificial Fe-Cr composites”. J. Appl. Phys. 92. pp. 2779–2782 (2002).

Bei der MFM werden statische magnetische Informationen vermessen, d. h. man misst die Wechselwirkung von unterschiedlichen, stabil aufmagnetisierten Domänen mit der magnetischen AFM-Spitze. Diese Wechselwirkung erzeugt eine Kraft, welche die Schwingungseigenschaften der AFM-Spitze verändert.
Die Messung erfolgt dadurch, dass man die AFM-Spitze zu Schwingungen anregt und in Abhängigkeit von der Position der AFM-Spitze über der Probe Veränderungen in der erzwungenen Spitzen-Schwingung misst. Dadurch können magnetische Dipolmomente mit lateralen Auflösungen um 40 nm gemessen werden. Hierzu muss das Dipolmoment jedoch stabil sein, da sich sonst die Wechselwirkungen während der Messung herausmitteln würden.
Diese oben beschriebenen Verfahren zur Messung magnetischer Wechselwirkungen mit dem AFM haben einige Nachteile: Die MFM nutzt ausschließlich statische, zumindest während der Messung stabile Dipolmomente.
Aus Patentschrift DE 698 23 578 T2 ist eine Sonde für ein Magnetkraftmikroskop bekannt, bei der ein magnetisches Wechselfeld an der Sondenspitze konzentriert werden kann, ohne dass Streufelder der Spule die magnetische Probe beeinflussen können. Die Sonde ist am freien Ende eines Auslegerarmes angebracht und hat ein Paar Magnetpole, die Bestandteil eines magnetischen Jochs und einer um das Joch gewundenen elektrisch leitenden Spule sind. Durch die Anordnung der Spule in der Nähe der Sondenspitze kann man das Magnetfeld an der Sondenspitze konzentrieren und die Entstehung von magnetischen Streufeldern verhindern, die mit den Magnetfeldern der Probe Wechselwirken könnten.
Bei der MRFM wird die AFM-Spitze zu Schwingungen durch die Wechselwirkung mit dem zu messenden Magnetfeld angeregt. Dieses Verfahren stellt eine ”Verkleinerung” der NMR-Technik auf die nm-Skala dar. Wie bei der NMR wird die Probe in eine magnetische Flussdichte von typischerweise 2T eingebracht, was eine Aufspaltung von Energieniveaus aufgrund der Wechselwirkung des Magnetfeldes mit den Spins verursacht. Diese Aufspaltung kann detektiert werden, indem die Probe durch ein elektromagnetisches Feld angeregt wird und senkrecht zur Anregungsebene die elektromagnetische Antwort der Probe gemessen wird. Bei der NMR erfolgt dies durch eine Spule, bei der MRFM-Technologie durch eine magnetische AFM-Spitze, die durch die elektromagnetische Antwort zu Schwingungen angeregt wird.
Die Resonanzfrequenz, mit der die Probe angeregt wird, hängt somit von der externen magnetischen Flussdichte ab und liegt typischerweise im GHz-Bereich. Da die Resonanzfrequenz der AFM-Spitze jedoch im kHz-Bereich liegt, wird bei der MRFM das anregende elektromagnetische Feld mit der Resonanzfrequenz der AFM-Spitze ”ein- und ausgeschaltet”, um eine Ankopplung der AFM-Spitze an die elektromagnetische Antwort der Probe zu ermöglichen. Da die zu messenden Wechselwirkungen sehr klein sind, wird bei der MRFM der Sensorkraftarm nur gering durch die magnetische Anregung ausgelenkt. Um dennoch ein Messsignal gegenüber dem Hintergrundrauschen erhalten zu können, müssen MRFM-Messungen im Vakuum und bei sehr tiefen Temperaturen durchgeführt werden.
Derartige, oben beschriebene Verfahren, sowie Verfahrensvarianten sind dem Fachmann geläufig und in der Literatur beschrieben. Sie werden als übliche Nachweisverfahren zusammengefasst.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, welches die oben genannten Nachteile überwindet, beispielsweise keine tiefen Temperaturen erfordert.
Diese Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren mit den Merkmalen gemäß Anspruch 1. Weitere bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
In anderen Worten wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Messung der magnetischen Informationen, insbesondere der magnetischen AC-Suszeptibilität, wobei das gemessene Signal mittels eines Verstärkers weiterverarbeitet wird, von magnetischen Nanopartikeln (Marker), die in/auf eine Probe gebracht werden, die eine externe magnetische Flussdichte verstärken oder abschwächen, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die Marker durch ein magnetisches Wechselfeld H angeregt werden und dadurch eine magnetische Flussdichte B_cl erzeugen, die von der AC-Suszeptibilität der Marker und dem Wechselfeld H abhängt und welche die gesamte Flussdichte B in der Nähe der Marker verändert, die zu untersuchende Probe zwei- bzw. dreidimensional gescannt, und die Änderung der magnetischen Flussdichte mittels der durch die magnetische Wechselwirkung angeregten Schwingung der AFM-Spitze mit einem Rasterkraftmikroskop gemessen wird (Signal).
Es sollen Nanopartikel hinsichtlich ihrer magnetischen Eigenschaften untersucht werden. Zwei Hauptanwendungen sind hierbei die Lokalisation und Differenzierung von magnetischen Markern biologischer Zellen mit Auflösungen im nm-Bereich, sowie materialwissenschaftliche Untersuchungen, speziell das Messen der Grenzfrequenz von einzelnen magnetischen Markern für die Grundlagenforschung, wie z. B. für die Optimierung von magnetischen Markern, das Messen von dynamischen magnetischen Informationen für die Datenspeicherung und die Datenspeicherung mittels magnetischer Einzeldomänen: Gemäß dem Stand der Technik wird für die Datenspeicherung normalerweise auf Dünnschichttechnologien zurückgegriffen, d. h. die Daten werden auf magnetischen Schichten gespeichert. Mittlerweile hat sich die Nanotechnologie aber stark weiterentwickelt und erlaubt durch den Einsatz von magnetischen Einzeldomänen deutlich feinere laterale Strukturierungen.
Zur Überwindung der oben genannten Nachteile nutzt die vorliegende Erfindung gerade aus, dass veränderliche Dipolmomente Veränderungen im Magnetfeld induzieren können, die ihrerseits Anregungen der magnetisierten AFM-Spitze hervorrufen. Des Weiteren wird bei der MFM die AFM-Spitze stets durch das AFM selbst zu Schwingungen angeregt. Auch ohne Wechselwirkung schwingt die AFM-Spitze, so dass die induzierten Veränderungen der Schwingung bei schwachen Wechselwirkungen in der Anregung ”untergehen” können. Erfindungsgemäß ist die Schwingung der AFM-Spitze bereits die Messinformation. Folglich können im Vergleich zur MFM deutlich kleinere Wechselwirkungen gemessen werden.
Im Gegensatz zur MRFM detektiert die vorliegende Erfindung keine Energieaufspaltungen sondern misst die AC-Suszeptibilität von magnetischen Einzeldomänen, die oft ein kontinuierliches Frequenzspektrum aufweisen. Da ohne externe magnetische Flussdichte keine Energieaufspaltung vorhanden ist, welche die Detektion einer Resonanz ermöglicht, kann die MRFM im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung nicht ohne statisches externes Magnetfeld arbeiten. Ein weiterer Vorteil liegt in der Tatsache, dass das erfindungsgemäße Messverfahren unter Normalbedingungen, in Luft oder Flüssigkeit und bei Raumtemperatur angewandt wird, was den Einsatz unter biologischen Bedingungen ermöglicht.
Während bei der MRFM der Kontrast durch die unterschiedliche Dichte der Spins in der Probe hervorgerufen wird, wird bei der vorliegenden Erfindung der Kontrast durch unterschiedliche magnetische Eigenschaften verursacht. Selbst wenn die Stärke der magnetischen Antwort der Marker gleich ist, so kann man die Marker aufgrund ihrer unterschiedlichen frequenzabhängigen magnetischen Suszeptibilität unterscheiden. Aufgrund der technologisch bedingten Tatsache, dass bei der MRFM die Wechselwirkung nicht direkt unter der Spitze gemessen wird, setzen sich die mit MRFM gewonnenen Bilder stets aus einer Überlagerung zweier lateral gegeneinander verschobener Bilder zusammen. Die Rekonstruktion des ”ursprünglichen Bildes” bedarf spezieller Rechenverfahren, während bei der vorliegenden Erfindung das Bild direkt gemessen wird und keiner weiteren signaltechnischen Bearbeitung bedarf.
Bei der Erfindung handelt es sich um ein Messverfahren für Rasterkraftmikroskope, mit der magnetische Informationen, wie z. B. die AC-Suszeptibilität, von einzelnen, isolierten magnetischen Markern gemessen werden, wobei die laterale Auflösung im Bereich von einigen Nanometern liegt. Magnetische Marker sind hier alle Nanopartikel mit Durchmessern im Bereich von 5 bis 50 nm, vorzugsweise 5–25 nm, die eine externe magnetische Flussdichte verstärken bzw. abschwächen können. Werden die Marker in irgendeiner Form an einer biologischen Struktur, Zellen oder Teile von Zellen, fixiert, so bezeichnet man dies als magnetisches Labeln. Unter den Begriffen magnetische Information bzw. Geometrie eines Markers sind hier alle magnetischen Eigenschaften der magnetischen Marker, wie Frequenzabhängigkeit der Suszeptibilität, Diamagnetismus vs. Paramagnetismus, und die räumlichen Abmaße des Markers zu verstehen.
Das Material der Marker wird ausgewählt aus diamagnetischen, paramagnetischen und ferro-/ferri-magnetischen Stoffen. Die diamagnetischen Stoffe, welche die Flussdichte abschwächen, sind vorzugsweise Gold, Silber und Kupfer-Cluster, welche vorzugsweise Durchmesser > 5 nm aufweisen. Paramagnetische Stoffe, welche die Flussdichte schwach verstärken, sind vorzugsweise Titan, Wolfram oder Platin. Als ferro-/ferrimagnetische Stoffe, welche die Flussdichte verstärken, werden Materialien aus der Gruppe von Eisen, Eisenoxid-Clustern (Maghemit = gamma-Fe₂O₃; Magnetit = Fe₃O₄) Kobalt und Nickel ausgewählt.
Die magnetische AC-Suszeptibilität gibt an, ob der Marker extern angelegte magnetische Felder verstärkt oder abschwächt. Wenn die ferro-/ferrimagnetischen Marker eine gewisse Größe unterschreiten (bei Maghemit-Clustern beispielsweise für Durchmesser kleiner als 25 nm), so zeigen sie häufig Superparamagnetismus, d. h. die Verstärkung der magnetischen Flussdichte wird dann frequenzabhängig: unterhalb einer gewissen Grenzfrequenz zeigen diese Marker eine magnetische AC-Suszeptibilität, die deutlich über der von Paramagneten liegt, während oberhalb der Grenzfrequenz keine bzw. kaum eine Verstärkung der Flussdichte stattfindet. Diese Grenzfrequenz hängt stark vom Material, vom Volumen und der Geometrie der Marker ab, so dass sich die magnetischen AC-Suszeptibilitäten unterschiedlicher Marker stark in der Frequenzabhängigkeit unterscheiden können.
Erfindungsgemäß werden die Marker durch ein magnetisches Wechselfeld der Feldstärke H und Frequenz f angeregt und ein Rasterkraftmikroskop wird eingesetzt, um die magnetische Antwort des Markers lokal mittels einer AFM-Spitze zu messen. Vorzugsweise weist das anregende magnetische Wechselfeld eine Feldstärke H von 0,08 kA/m bis 40 kA/m (entspricht einer magnetischen Vakuumflussdichte von 0,1 mT bis 50 mT) auf. Erfindungsgemäß weist das anregende magnetische Wechselfeld eine Frequenz f von 10 kHz bis 100 MHz, vorzugsweise 50 kHz bis 20 MHz auf. Ein Vergleich von Anregung und magnetischer Antwort des Markers liefert die Suszeptibilität, die durch die Erfindung bei unterschiedlichen Anregungsfrequenzen gemessen wird. Somit werden einzelne Marker lateral aufgelöst, es wird deren Suszeptibilität gemessen und somit zwischen unterschiedlichen Markern unterschieden.
Die Vorteile der Erfindung basieren darauf, dass die vom Marker erzeugte magnetische Flussdichte B_cl lokal durch eine magnetische AFM-Spitze gemessen wird. Diese Flussdichte addiert sich vektoriell zur bereits bestehenden den Marker anregenden Flussdichte gemäß B = μ₀ H + B_cl hinzu. Die AFM-Spitze ist derart an einer Feder (AFM-Cantilever) befestigt, dass die Auslenkung der AFM-Spitze über die Auslenkung des AFM-Cantilevers gemessen wird. Durch Einbringen der magnetischen AFM-Spitze in B wirkt eine Kraft auf dieselbe, die eine Auslenkung proportional zur Stärke von B bewirkt. Durch die magnetische Wechselwirkung zwischen Spule und AFM-Spitze wird letztere zu Schwingungen mit der Frequenz f und einer zu B proportionalen Amplitude angeregt. Dieses Signal wird in einen Trägerfrequenzverstärker (Lock-In-Verstärker) geleitet, der die induzierte Spitzenschwingung mit der Anregung vergleicht. Hierbei werden die Flussdichte an der AFM-Spitze und die Phasenverschiebung der Schwingung der AFM-Spitze bezüglich des anregenden Wechselfeldes H gemessen. Dabei ist die Phasenverschiebung ein Maß für die zeitliche Verzögerung zwischen magnetischer Anregung und induzierter AFM-Spitzen-Schwingung und erlaubt es, die Grenzfrequenz des einzelnen Markers zu bestimmen.
Die anregende Spule ist nicht direkt parallel zur AFM-Spitze ausgerichtet, da sonst eine direkte Anregung der Spitze durch die Spule erfolgen würde, und die zusätzlich durch die Marker erzeugte Flussdichte B_cl verglichen zum anregenden Magnetfeld unmessbar klein wäre. Eine seitliche, nahezu parallel zur Oberfläche der Probe ausgerichtete Anregung der Marker verringert diese unerwünschte direkte Anregung. Vorzugsweise erfolgt die magnetische Anregung des Markers durch eine in direkter Nähe zur Probe unter einem Winkel von 0,1 bis 15 Grad bezüglich der Probenoberfläche ausgerichtete Spule.
Das Verfahren nutzt ferner aus, dass obwohl die Marker von der Seite angeregt werden, die magnetische Antwort B_cl der Marker eine Flussdichte erzeugt, die auch senkrecht zur Proben-Oberfläche wirkt und somit durch die AFM-Spitze detektiert wird. Die Flussdichte B in Richtung der AFM-Spitze ist somit zu einem großen Teil durch B_cl gegeben und messbar. Vorzugsweise wird senkrecht zur Oberfläche der Probe die magnetische Flussdichte B mit Hilfe der Schwingung, zu der die AFM-Spitze durch die magnetische Wechselwirkung angeregt wird, gemessen. Die AFM-Spitze wird proportional zur Stärke des den Marker anregenden B-Feldes, in welches sie gebracht wird, ausgelenkt.
Die magnetische AC-Suszeptibilität wird durch das Ermitteln des Betrages und der Phase der Flussdichte sowohl in direkter Nähe als auch in größerer Entfernung zu den Markern bestimmt. Die Veränderung der beiden Größen in Markernähe im Vergleich zu Bereichen auf der Proben-Oberfläche, die nicht markiert sind, erlaubt es den Einfluss der Marker auf die magnetische Flussdichte zu ermitteln. Vorzugsweise wird das gemessene Signal in einen Trägerfrequenzverstärker geleitet, der das induzierte Signal mit der Anregung vergleicht, wobei die Frequenz f des anregenden magnetischen Wechselfeldes H, die im Bereich von 10 kHz bis 100 MHz, vorzugsweise 50 kHz bis 20 MHz, liegt, mit einer Resonanzfrequenz der AFM-Spitze bzw. des AFM-Cantilevers übereinstimmt. Die zu untersuchende Probe befindet sich in einem Medium aus der Gruppe von Vakuum, Schutzgas, Raumluft oder Flüssigkeit. Unter „Schutzgas” sind Gase wie CO₂, aber auch die Inertgase zu verstehen, d. h. Stickstoff sowie die Edelgase (He, Ne, Ar, Kr, Xe, Rn).
Flüssigkeiten sind hier wässrige Lösungen (mit einem pH-Wert von 3 bis 10, vorzugsweise einem pH-Wert von 6 bis 9) oder organische Lösungsmittel. Diese weisen erfindungsgemäß eine dynamische Viskosität zwischen 0,1 und 100 mPa·s, vorzugsweise zwischen 0,2 und 10 mPa·s auf.
Die Flüssigkeiten können allein oder in Mischung eingesetzt werden, wobei Mischungen von verschiedenen wässrigen Lösungen, von wässrigen Lösungen mit organischen Lösungsmitteln, sowie Mischungen verschiedener organischer Lösungsmittel umfasst sind.
Entscheidend ist, dass die Flüssigkeit sich magnetisch neutral verhält, d. h. die magnetische Flussdichte nicht beeinflusst.
Die Viskosität ist von Relevanz, da eine ausreichende Schwingung der AFM-Spitze gewährleistet sein muss, d. h. die Reibung an der AFM-Spitze darf nicht zu groß sein. Ein pH-Wert kleiner als 3 oder größer als 10 ist ungünstig, da zu saure bzw. zu basische pH-Werte zu einer Zersetzung der Grenzfläche führen, d. h. die AFM-Spitze angegriffen wird.
Wenn die zu untersuchende Probe eine biologischen Struktur, Zellen oder Teile von Zellen ist/sind, in oder auf welcher die Marker fixiert werden, so werden ausschließlich wässrige Lösungen eingesetzt. Mischungen verschiedener wässriger Lösungen sind davon umfasst. Die Grenzen der einsetzbaren Lösungen richten sich dabei lediglich -neben den oben genannten Angaben- nach den Anforderungen der Probe. Für biologische Materialien wird alles verwendet, was nicht toxisch für die Zellen ist. Bevorzugte Ausführungsformen betreffen dabei wässrige Lösungen von Salzen wie NaCl und KCl, von Puffern wie Na₂HPO₄-Puffersysteme, sowie Nährmedien wie wässrige Glucoselösungen. Bevorzugt handelt es sich bei den wässrigen Salzlösungen um solche mit einer Salzkonzentration (I) zwischen 0,1 mM und 4 M, vorzugsweise zwischen 0,1 und 0,3 M. Kochsalz (NaCl) wird dabei bevorzugt, wobei insbesondere eine isotone Kochsalzlösung eingesetzt wird.
Das folgende Beispiel soll den Erfindungsgedanken näher erläutern; es stellt keine Einschränkung des Erfindungsumfanges dar.
Gemäß 1 wird ein magnetisches Wechselfeld H (4) möglichst parallel zur Probenoberfläche eingestrahlt und durch die magnetischen Marker (5) (im Allgemeinen frequenzabhängig) verstärkt oder abgeschwächt. Die resultierende magnetische Flussdichte B setzt sich somit aus zwei Anteilen zusammen: den Anteil μ₀ H, der durch das magnetische Wechselfeld H erzeugt wird, sowie der Flussdichte B_cl, welche durch die Marker erzeugt wird.
Die resultierende magnetische Flussdichte B kann mit dem magnetischen Dipolmoment (2) der AFM-Spitze (1) Wechselwirken und daher eine Kraft erzeugen, welche die AFM-Spitze (1) auslenkt. Entspricht die Frequenz der magnetischen Felder H und B einer Resonanzfrequenz des AFM-Cantilevers, auf dem die AFM-Spitze (1) befestigt ist, so führt die magnetische Wechselwirkung zu einer periodischen Schwingung der AFM-Spitze (1), welche auf den AFM-Cantilever übertragen und durch Resonanz verstärkt wird. Dabei ist die Amplitude der Schwingung ein Maß für den Betrag der Komponente von B, welche senkrecht zur Probenoberfläche steht.
Das AFM kann nun verwendet werden, um räumlich aufgelöst die Schwingungsamplitude der Spitze und somit die magnetische Antwort der Marker auf die externe Anregung zu messen. Dies wird in 2 und 3 demonstriert. In beiden Abbildungen wurde auf der linken Seite das Höhenprofil dargestellt, wobei helle Farben stets höhere Objekte bedeuten. Die Marker sind als relativ kreisförmige, helle Objekte deutlich vom Hintergrund unterscheidbar. Auf der rechten Seite ist die Veränderung der Amplitude der AFM-Spitze (1) (Rohdaten) dargestellt, und es wird sofort erkennbar, dass sich die beiden Marker signifikant voneinander unterscheiden: während oberhalb der Eisenoxid-Cluster die Schwingungsamplitude zunimmt (dunkle Bereiche), wird sie über den Gold-Clustern verringert (helle Bereiche). Unter „Eisenoxid-Cluster” sind hier Maghemit-Cluster, d. h. gamma-Fe₂O₃, zu verstehen. Dies entspricht dem erwarteten Verhalten: Gold verhält sich diamagnetisch, d. h. es schwächt magnetische Felder ab. Von Eisenoxid-Clustern mit Durchmesser < 20 nm ist jedoch bekannt, dass sie super-paramagnetisches Verhalten aufweisen können, d. h. dass sie ein magnetisches Dipolmoment besitzen, welches sich unter Umständen parallel zu einem externen Magnetfeld ausrichten kann und somit das externe Magnetfeld verstärkt. Die unterschiedlichen Wechselwirkungsmechanismen mit dem Magnetfeld führen somit für beide Marker zu einem unterschiedlichen Kontrast. Eine Abschwächung des Magnetfeldes wird wie folgt gemessen: Die anregende Spule wird nie gänzlich parallel zur Probenoberfläche ausgerichtet sein. Dadurch wird es immer eine Komponente des Magnetfeldes geben, welches senkrecht zur Oberfläche wirkt und somit die AFM-Spitze (1) zum Schwingen anregt. Die Erfindung misst somit lokal eine Abweichung von dieser „Hintergrund”-Schwingung, welche durch die Marker verstärkt oder abgeschwächt wird.
Da sich beide Marker in ihrer Wirkung auf die AFM-Spitze (1) unterscheiden und somit einen unterschiedlichen Kontrast in der Amplitude verursachen, können die Marker in einer einzigen Probe anhand dieses Verhaltens voneinander unterschieden werden (siehe 4).
Bei dem in 4 dargestellten Experiment wird eine Probe mit einer Mischung aus Gold- und Eisenoxid-Clustern verwendet. Um beide Marker eindeutig unterscheiden zu können, werden Eisenoxid-Cluster aus einer Charge adsorbiert, deren Cluster deutlich kleiner als die Gold-Cluster sind. Somit können die Marker auch anhand ihrer Geometrie voneinander unterschieden werden. In 4 sind einige Gold-Cluster hervorgehoben und zeigen die erwartete Abschwächung des Magnetfeldes. Analog ist ein Eisenoxid-Cluster markiert, der zu einer Erhöhung des Magnetfeldes geführt hat. Die Erfindung ist somit nachweislich in der Lage, verschiedene Marker anhand ihrer magnetischen Eigenschaften voneinander zu unterscheiden. Der Einsatz der Erfindung ist dabei nicht auf die fundamentale Resonanzfrequenz der AFM-Spitze limitiert. Wie aus 5 und 6 zu entnehmen, ist es durchaus möglich, die magnetischen Eigenschaften auch bei höheren Frequenzen zu untersuchen. Gemäß 6 nimmt der Kontrast mit der Größe der Marker ab, da sich bei Verkleinerung des Marker-Volumens auch dessen magnetisches Dipolmoment verringert.
Des Weiteren können durch Einsatz des Lock-In-Verfahrens neben der Schwingungsamplitude auch die Phasenverschiebung zwischen dem magnetischen Wechselfeld H und der magnetischen Flussdichte B bestimmt werden (vgl. 7 und 8).
Die Erfindung ist somit nicht nur in der Lage, verschiedene Marker voneinander zu unterscheiden, sondern kann vielmehr die gesamte AC-Suszeptibilität (Betrag und Phasenverschiebung) von einzelnen, nanoskopischen Markern messen. Die gemessenen Effekte sind nicht auf Crosstalk der geometrischen Eigenschaften zurückzuführen. Dazu wurden Silizium-Stufen mit einer Höhe von ca. 25 nm mit dem entwickelten Verfahren abgebildet und Amplitude und Phase gemessen (vgl. 9 und 10).
Trotz vergleichbarer geometrischer Dimension ist das Übersprechen der Geometrie auf die magnetische Information vernachlässigbar im Vergleich zu den gemessenen Werten bei den Markern (vgl. 3 und 6 bis 8). Somit kann der Kontrast in Amplitude und Phase bei Verwendung der Marker nicht durch deren Geometrie verursacht worden sein. Er muss somit einen magnetischen Ursprung haben. Dies wird auch durch die Messungen untermauert, bei denen die Anregung kurzzeitig abgeschaltet wurde, wodurch keine Schwingung der AFM-Spitze und somit auch kein Kontrast mehr messbar war (vgl. 3 und 5).
Bezugszeichenliste

1: magnetische AFM Spitze
2: magnetisches Dipolmoment
3: Anregungsspule
4: Anregendes elektromagnetisches Wechselfeld
5: Magnetischer Marker

Beschreibung der Figuren
Es zeigen
1 den Aufbau des Messverfahrens, speziell den rasterkraftmikroskopischen Teil
2 Marker = Eisenoxid-Cluster mit einem Durchmesser von ca. 12.5 nm; angeregt bei f = 82,6 kHz; Bildgröße: 1 × 1 μm²; links: Höhenprofil; rechts: Änderung der Schwingungsamplitude der AFM-Spitze.
3 Marker = Gold-Cluster (Au) mit einem Durchmesser von ca. 15 nm; angeregt bei f = 81,9 kHz; Bildgröße: 1 × 1 μm²; links: Höhenprofil; rechts: Änderung der Schwingungsamplitude der AFM-Spitze.
4 Marker = Au-Cluster und Eisenoxid-Cluster; angeregt bei f = 81,9 kHz; Bildgröße: 1 × 0.4 μm²; oben: Höhenprofil; Mitte: Änderung der Schwingungsamplitude der AFM-Spitze; unten: Änderung der Schwingungsamplitude der AFM-Spitze nach digitaler Tiefpass-Filterung.
5 Marker = Eisenoxid-Cluster mit einem Durchmesser von ca. 12.5 nm; angeregt bei f = 518 kHz; Bildgröße: 1 × 1 μm²; links: Höhenprofil; rechts: Änderung der Schwingungsamplitude der AFM-Spitze.
6 Marker = Eisenoxid-Cluster mit einem Durchmesser zwischen 8 und 10 nm; angeregt bei f = 518 kHz; Bildgröße: 1 × 0,5 μm²; oben: Höhenprofil; unten: Änderung der Schwingungsamplitude der AFM-Spitze nach digitaler Tiefpass-Filterung.
7 Marker = Eisenoxid-Cluster mit einem Durchmesser von ca. 12.5 nm; angeregt bei f = 562 kHz; Bildgröße: 1 × 0,5 μm²; oben: Höhenprofil; unten: Phasenverschiebung in bel. Einheiten (a. u. englisch arbitrary units).
8 Marker = Eisenoxid-Cluster mit einem Durchmesser von ca. 12.5 nm; angeregt bei f = 1566 kHz; Bildgröße: 1 × 0,5 μm²; oben: Höhenprofil; unten: Phasenverschiebung in bel. Einheiten nach digitaler Tiefpass-Filterung.
9 25 nm Silizium-Stufen; angeregt bei f = 81,9 kHz; Bildgröße: 4 × 4 μm²; links: Höhenprofil; rechts: Änderung der Schwingungsamplitude der AFM-Spitze. Hier wurde die gleiche AFM-Spitze wie in 3 und 6 verwendet.
10 25 nm Silizium-Stufen; angeregt bei f = 562 kHz; Bildgröße: 2 × 1 μm²; oben: Höhenprofil; unten: Phasenverschiebung in bel. Einheiten. Hier wurde die gleiche AFM-Spitze wie in 7 und 8 verwendet.
11 eine auf molekularer Ebene schematisierte Darstellung einer Messung bei festem Abstand Sonde-Probe
12 eine Detailansicht einer magnetischen Spitze mit typischen technischen Parametern.

Claims

Verfahren mit einem Rasterkraftmikroskop zur räumlich aufgelösten Bestimmung von Nanopartikeln, welche in beziehungsweise auf eine Probe gebracht werden, und Messung der magnetischen Informationen der Nanopartikel, insbesondere der magnetischen AC-Suszeptibilität, wobei der Durchmesser der Nanopartikel im Bereich von 5 nm bis 50 nm liegt und diese magnetische Dipolmomente aufweisen, die eine externe magnetische Flussdichte verstärken oder abschwächen, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel und die Probe mit einem magnetischen Wechselfeld angeregt werden, so dass die gesamte Flussdichte in der Nähe der Nanopartikel verändert wird, die zu untersuchende Probe dreidimensional gerastert wird, mit der magnetischen Spitze des Rasterkraftmikroskops die Änderung der gesamten magnetischen Flussdichte unter Einfluss des magnetischen Wechselfeldes auf die Probe bestimmt wird, indem die Auslenkung der magnetischen Spitze gemessen wird, das anregende magnetische Wechselfeld eine Frequenz von 10 kHz bis 100 MHz aufweist und das Verfahren im Bereich der Raumtemperatur angewandt wird, was den Einsatz unter biologischen Bedingungen ermöglicht.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das anregende magnetische Wechselfeld eine Feldstärke von 0,08 bis 40 kA/m hat.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Frequenz des anregenden magnetischen Wechselfeldes mit einer Resonanzfrequenz der Spitze des Rasterkraftmikroskops übereinstimmt.
Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das magnetische Wechselfeld mit mindestens einer Spule erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetische Anregung der Nanopartikel durch eine in direkter Nähe zur Probe, unter einem Winkel zwischen 0,1 und 15 Grad bezüglich der Probenoberfläche, und somit nicht direkt parallel zur Spitze des Rasterkraftmikroskops, ausgerichtete Spule erfolgt.
Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das gemessene Signal in einem Trägerfrequenzverstärker mit dem Anregungssignal des magnetischen Wechselfeldes verglichen wird und die Amplitude und die Phase des gemessenen Signals bestimmt werden.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Spitze des Rasterkraftmikroskops an einem Cantilever befestigt ist, so dass die Auslenkung der Spitze des Rasterkraftmikroskops über die Auslenkung des Cantilevers gemessen wird.
Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sich die zu untersuchende Probe in einem Medium aus der Gruppe von Vakuum, Schutzgas, Raumluft und Flüssigkeit befindet.