DE102008059446A1 - New proteases and compositions comprising these proteases - Google Patents

New proteases and compositions comprising these proteases

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DE102008059446A1
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Karl-Heinz Dr. Maurer
Petra Dr. Siegert
Astrid Spitz
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Henkel AG and Co KGaA
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Henkel AG and Co KGaA
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus

Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft neue Proteasen, hinreichend verwandte Proteasen und deren Derivate sowie deren Herstellung und deren Verwendung. The present application relates to novel proteases sufficiently related proteases and their derivatives as well as their production and their use. Sie betrifft außerdem Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese Proteasen, hinreichend verwandte Proteasen und deren Derivate, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie Verwendungen der Proteasen, insbesondere zu Wasch- und Reinigungszwecken. It also relates to agents, in particular detergents and cleaning products containing these proteases sufficiently related proteases and their derivatives, corresponding washing and cleaning methods and uses of the proteases, in particular to washing and cleaning purposes.

Description

  • Die vorliegende Anmeldung betrifft neue Proteasen, hinreichend verwandte Proteasen und deren Derivate sowie deren Herstellung und deren Verwendung. The present application relates to novel proteases sufficiently related proteases and their derivatives as well as their production and their use. Sie betrifft außerdem Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese Proteasen, hinreichend verwandte Proteasen und deren Derivate, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie Verwendungen der Proteasen, insbesondere zu Wasch- und Reinigungszwecken. It also relates to agents, in particular detergents and cleaning products containing these proteases sufficiently related proteases and their derivatives, corresponding washing and cleaning methods and uses of the proteases, in particular to washing and cleaning purposes.
  • Proteasen gehören zu den technisch bedeutendsten Enzymen überhaupt. Proteases are among the technically most important enzymes in general. Für Wasch- und Reinigungsmittel sind sie die am längsten etablierten und in praktisch allen modernen, leistungsfähigen Wasch- und Reinigungsmitteln enthaltenen Enzyme. For washing and cleaning agents, they are the longest established and in virtually all modern, powerful detergents and cleaners enzymes. Sie bewirken den Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. They cause the breakdown of proteinaceous soils from washing. Hierunter sind wiederum Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilasen, Subtilopeptidasen, EC 3.4.21.62) besonders wichtig, welche aufgrund der katalytisch wirksamen Aminosäuren den Serin-Proteasen zugerechnet werden. Among these in turn are proteases of the subtilisin type (subtilases subtilopeptidases, EC 3.4.21.62) is particularly important, which are supplied to the serine proteases due to the catalytically active amino acids. Sie wirken als unspezifische Endopeptidasen, das heißt, sie hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen, die im Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen. They act as unspecific endopeptidases, ie they hydrolyze any acid amide bonds located inside peptides or proteins. Ihr pH-Optimum liegt meist im deutlich alkalischen Bereich. Its pH optimum is usually within the distinctly alkaline range. Einen Überblick über diese Familie bietet beispielsweise der Artikel An overview of this family is provided, for example, the article . , Subtilasen werden natürlicherweise von Mikroorganismen gebildet; Subtilases are naturally produced by microorganisms; hierunter sind insbesondere die von Bacillus-Spezies gebildeten und sekretierten Subtilisine als bedeutendste Gruppe innerhalb der Subtilasen zu erwähnen. See below the formed by Bacillus species and secreted subtilisins are particularly useful as important group to mention within the subtilases.
  • Beispiele für die in Wasch- und Reinigungsmitteln bevorzugt eingesetzten Proteasen vom Subtilisin-Typ sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease P692, die Subtilisine 147 und 309, die Protease aus Bacillus lentus, insbesonder aus Bacillus lentus DSM 5483, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Examples of the preferably used in detergents and cleaning agents proteases of the subtilisin type are the subtilisins BPN 'and Carlsberg, Protease P692, subtilisins 147 and 309, the protease from Bacillus lentus, insbesonder from Bacillus lentus DSM 5483 subtilisin DY and the the subtilases, but not more subtilisins in the strict sense as enzymes thermitase, proteinase K and proteases TW3 and TW7. Weitere verwendbare Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym ® , Relase ® , Everlase ® , Nafizym, Natalase ® , Kannase ® und Ovozyme ® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect ® , Purafect ® OXP, Purafect ® Prime und Properase ® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol ® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi ® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather ® und Protease P ® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme. Other usable proteases are, for example, under the trade names Durazym ®, relase ®, Everlase® ®, Nafizym, Natalase ®, Kannase® ® and Ovozyme ® from Novozymes, the ® under the trade names Purafect ®, Purafect ® OXP, Purafect Prime and Properase.RTM ® from Genencor, that under the trade name Protosol® ® from Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India, under the trade name Wuxi ® from Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, the P under the trade names Proleather® ® and protease ® from Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, and the enzymes available under the name proteinase K-16 from Kao Corp., Tokyo, Japan.
  • Hinsichtlich der Anwendung von Proteasen in Wasch- und Reinigungsmitteln ist bekannt, dass Proteasen zur Verbesserung der Wasch- beziehungsweise Reinigungsleistung zusammen mit weiteren Enzymen, beispielsweise Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Mannanasen, β-Glucosidasen, Oxidasen, Oxidoreduktasen oder Lipasen eingesetzt werden können. With regard to the use of proteases in detergents and cleaning agents is well known that proteases for improving the washing or cleaning performance can be used together with other enzymes, for example amylases, cellulases, hemicellulases, mannanases, β-glucosidases, oxidases, oxidoreductases or lipases. Ebenso ist der Einsatz von Proteasen in Waschmitteln in Kombination mit anderen Wirkstoffen wie etwa Bleichmitteln oder Soil-Release-Wirkstoffen dem Fachmann bekannt. Likewise, the use of proteases in detergent compositions in combination with other active ingredients such as bleaching agents or soil release agents is known in the art.
  • Es ist ferner bekannt, dass einige für den Einsatz in Waschmitteln etablierte Proteasen auch für kosmetische Zwecke oder für die organisch-chemische Synthese geeignet sind. It is also known that some for use in detergents established proteases are also suitable for cosmetic purposes or for organic-chemical synthesis.
  • Die hier beispielhaft erwähnten, unterschiedlichen technischen Einsatzgebiete erfordern Proteasen mit unterschiedlichen Eigenschaften, was beispielsweise die Reaktionsbedingungen, die Stabilität oder die Substratspezifität angeht. The here mentioned as an example, different technical areas of application require proteases with different properties in terms of, for example, the reaction conditions, stability or substrate specificity. Umgekehrt hängen die technischen Einsatzmöglichkeiten der Proteasen, beispielsweise im Kontext einer Wasch- oder Reinigungsmittelrezeptur, von weiteren Faktoren wie der Stabilität des Enzyms gegenüber hohen Temperaturen, gegenüber oxidierenden Agentien oder gegenüber dessen Denaturierung durch Tenside, von Faltungseffekten oder von erwünschten Synergien mit anderen Inhaltsstoffen ab. Conversely, the technical applications of proteases, for example in the context of a washing or cleaning agent formulation, other factors such as the stability of the enzyme to high temperatures, to oxidizing agents or with respect to its denaturation by surfactants, on folding effects or desired synergies with other ingredients from.
  • Somit besteht nach wie vor ein hoher Bedarf an technisch einsetzbaren Proteasen, die aufgrund der Vielzahl ihrer Einsatzgebiete in ihrer Gesamtheit ein breites Spektrum an Eigenschaften bis hin zu sehr subtilen Leistungsunterschieden abdecken. Thus, there is still a great need for technically usable proteases that cover due to the variety of their applications in their entirety a wide range of properties to very subtle differences in performance.
  • Die Basis hierfür sind neue Proteasen, welche ihrerseits hinsichtlich spezieller Einsatzgebiete gezielt weiterentwickelt werden können. The basis for this are novel proteases which can be further developed targeted specific areas of application themselves. Das klassische Vorgehen zur Gewinnung neuer Enzyme besteht darin, Mikroorganismen-haltige Proben aus natürlichen Habitaten zu entnehmen und unter den als geeignet angesehenen Bedingungen – zum Beispiel in alkalischem Milieu – zu kultivieren. The classic approach to attract new enzymes is to remove microorganisms-containing samples from natural habitats and among the distinguished suitable conditions - for example, in an alkaline medium - to cultivate. Auf diese Weise werden Anreicherungskulturen von Mikroorganismen erhalten, die mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit auch Enzyme, darunter Proteasen enthalten, welche unter den jeweiligen Bedingungen aktiv sind. In this way, enrichment cultures of microorganisms are obtained that with a certain probability, enzymes, including contain proteases that are active under the respective conditions. Hieraus werden dann beispielsweise über Ausplattieren auf proteinhaltigen Agarplatten und Ausmessen der gebildeten Lysehöfe die Mikroorganismen mit den leistungsfähigsten Enzymen ausgewählt und aufgereinigt beziehungsweise die jeweiligen Gene kloniert. From this, then for example the plating on protein-containing agar plates and measuring the lysis zones formed microorganisms selected with the most efficient enzymes and purified or cloned the respective genes. Solch ein Vorgehen wird beispielsweise in dem Lehrbuch Such a procedure is for example in the textbook beschrieben. described.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere, bislang noch nicht bekannte Proteasen bereitzustellen, die eine proteolytische Aktivität aufweisen. The object of the present invention is to provide additional, not yet known proteases that have proteolytic activity. Vorteilhafterweise sollte sich die Protease dadurch auszeichnen, dass ihr Beitrag zur Leistung eines Mittels, welches die Protease enthält, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, dem Beitrag von einem für diesen Zweck etablierten proteolytischen Enzym zur Leistung des Mittels zumindest nahe kommt und idealerweise übertrifft. Advantageously, the protease should be characterized in that their contribution to the performance of a product, which contains the protease, in particular a washing or cleaning agent, the contribution of an established for this purpose proteolytic enzyme for performance of the agent is at least close to, and ideally exceed. Als Beitrag zur Leistung ist diesbezüglich insbesondere der Beitrag zur Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels von Bedeutung. As a contribution to performance in this regard is particularly the contribution to the cleaning performance of a washing or cleaning agent is important.
  • Eine weitere Aufgaben der Erfindung ist es, Proteasen, insbesondere vom Subtilisin-Typ, bereitzustellen, die gegenüber dem Stand der Technik eine verbesserte Stabilität gegenüber Temperatureinflüssen, pH-Wert-Schwankungen, denaturierenden oder oxidierenden Agentien, proteolytischem Abbau, hohen Temperaturen, sauren oder alkalischen Bedingungen oder gegenüber einer Veränderung der Redox-Verhältnisse aufweisen. Another objects of the invention is, especially of the subtilisin type, provide proteases over the prior art, an improved stability to temperature influences, pH fluctuations denaturing, or oxidizing agents, proteolytic degradation, high temperature, acidic or alkaline conditions or exhibit to a change in the redox conditions. Weitere Aufgaben können in einer verringerten Immunogenität bzw. verringerten allergenen Wirkung gesehen werden. Other tasks can be seen in reduced immunogenicity and reduced allergenicity.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Proteasen bereitzustellen, die bei niedrigeren Temperaturen, insbesondere zwischen 10°C und 50°C und bevorzugt zwischen 10°C und 40°C oder zwischen 20°C und 40°C eine gute Reinigungsleistung, vorzugsweise eine verbesserte Reinigungsleistung im Vergleich zu den im Stand der Technik offenbarten Proteasen, insbesondere denjenigen vom Subtilisin-Typ, aufweisen. Another object of the present invention is to provide proteases that at lower temperatures, in particular between 10 ° C and 50 ° C and preferably between 10 ° C and 40 ° C or between 20 ° C and 40 ° C, a good cleaning performance, preferably improved cleaning performance in comparison to those disclosed in the prior art proteases, in particular those of the subtilisin type have.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Proteasen bereitzustellen, die in Bezug auf die im Stand der Technik bekannten Proteasen eine verbesserte Reinigungsleistung in Bezug auf zumindest eine Anschmutzung, vorzugsweise in Bezug auf mehrere Anschmutzungen, aufweisen. Another object of the present invention is to provide proteases of the known in the art proteases improved cleaning performance with respect to at least one stain, preferably with respect to several stains have in relation.
  • Weitere Teilaufgaben bestanden darin, Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, die für derartige Proteasen codieren, und Vektoren, Wirtszellen und Herstellverfahren zur Verfügung zu stellen, die zur Gewinnung derartiger Proteasen genutzt werden können. Other tasks were to provide nucleic acids encoding such proteases, and to provide vectors, host cells and manufacturing processes available that can be used to obtain such proteases. Ferner sollten entsprechende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie entsprechende Verwendungsmöglichkeiten für derartige Proteasen zur Verfügung gestellt werden. Further suitable agents, especially laundry detergents and cleaning products, corresponding washing and cleaning methods as well as corresponding uses for such proteases should be made available.
  • Ein Gegenstand der Erfindung ist eine Protease umfassend eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus An object of the invention is a protease comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of
    • a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. a) amino acid sequence to that of SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 98,3% identisch ist 3 amino acid sequence shown at least 98.3% identical
    • b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. b) amino acid sequence to that of SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 98,5% identisch ist, 2 amino acid sequence shown at least 98.5% identical,
    insbesondere eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus in particular an amino acid sequence selected from the group consisting of
    • a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. a) amino acid sequence to that of SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist 3 amino acid sequence given increasingly preferably to at least 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and very particularly preferably 100% identical
    • b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. b) amino acid sequence to that of SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist. 2 amino acid sequence shown at least 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99, 5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and very particularly preferably 100% identical.
  • Hiermit sind als weitere Erfindungsgegenstände die zugehörigen, für erfindungsgemäße Proteasen codierende Nukleinsäuren, erfindungsgemäße Proteasen oder Nukleinsäuren enthaltende nicht menschliche Wirtszellen, geeignete Verfahren zu ihrer Herstellung, insbesondere auf den Nukleinsäuren bzw. Wirtszellen aufbauende molekularbiologische Verfahren und Verfahrenselemente sowie Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, Wasch- und Reinigungsverfahren und über die betreffenden Proteasen gekennzeichnete Verwendungsmöglichkeiten verbunden. This is for further subjects of the invention associated, coding for proteases of the invention nucleic acids, proteases according to the invention or nucleic acids not containing human host cells, appropriate methods constituent for their preparation, in particular to the nucleic acids or host cells molecular biology methods and procedures elements as well as agents, in particular detergents and cleaning agents, uses detergents and cleaning method and marked on the relevant proteases connected.
  • Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende, natürlicherweise gebildete Protease ist, wie anhand der Beispiele nachvollzogen werden kann, aus dem Kulturüberstand eines Bacillus Stammes erhältlich, der von der DSMZ (DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Deutschland) als ein Bacillus pumilus Stamm identifiziert ist. The protease of the present invention is based, naturally formed, as can be ascertained from the examples, obtainable from the culture supernatant of a Bacillus strain (from the DSMZ DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Germany) is identified as a Bacillus pumilus strain. Zum Zwecke der Nacharbeitbarkeit wurde gemäß Budapester Vertrag ein Plasmid, das die Nukleinsäuresequenz der erfindungsgemäßen Protease enthält, bei der DSMZ mit der Hinterlegungsnummer DSM 21891 hinterlegt. For the purpose of Reproducibility under the Budapest Treaty, has been deposited at the DSMZ with the accession number DSM 21891, a plasmid containing the nucleic acid sequence of the protease according to the invention.
  • Eine erfindungsgemäße Protease weist eine proteolytische Aktivität auf, das heißt, sie ist zur Hydrolyse von Peptidbindungen eines Polypeptids bzw. Proteins befähigt, insbesondere in einem Wasch- oder Reinigungsmittel. A protease of the invention has a proteolytic activity, that is, it is capable of, particularly in a washing or cleaning agent for the hydrolysis of peptide bonds of a polypeptide or protein. Eine erfindungsgemäße Protease ist daher ein Enzym, welches die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert und dadurch in der Lage ist, Peptide oder Proteine zu spalten. A protease of the invention is, therefore, an enzyme which catalyzes the hydrolysis of peptide bonds and thus is capable of cleaving peptides or proteins. Eine erfindungsgemäße Protease ist insbesondere ein Subtilisin. A protease of the invention is in particular a subtilisin. Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Enzyme, Proteine, Fragmente und Derivate, sofern sie nicht explizit als solche angesprochen zu werden brauchen, unter dem Oberbegriff Proteine bzw. Polypeptide zusammengefasst, da ein Protein ein Polypeptid ist. For the purposes of the present invention are enzymes, proteins, fragments and derivatives, unless they need to be explicitly referred to as such, summarized under the generic term proteins or polypeptides as a protein is a polypeptide.
  • Eine erfindungsgemäße Protease ist auf Grund ihrer proteolytischen Aktivität und ihrer weiteren Eigenschaften, insbesondere betreffend ihre Stabilität gegenüber Tensiden und/oder Bleichmitteln und/oder ihr Temperaturprofil und/oder ihr pH-Profil, für die Anwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet. A protease of the invention is due to its proteolytic activity, and its further properties, in particular concerning suitable their stability to surfactants and / or bleaching agents and / or its temperature profile and / or its pH profile, for use in washing and cleaning agents. Überraschenderweise leistet sie bereits in ihrer Wildtyp-Form einen so guten Beitrag zur Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels, welches die Protease enthält, der dem Beitrag von einem für diesen Zweck etablierten proteolytischen Enzym zur Reinigungleistung des Mittels nahe kommt und ihn an unterschiedlichen Anschmutzungen sogar übertrifft. Surprisingly, it is already making in their wild-type form such a good contribution to the cleaning performance of a washing or cleaning agent containing the protease, which comes to the post from an established for this purpose proteolytic enzyme close to the cleaning performance of the agent and even surpasses him in different soils , Sie ermöglicht daher eine verbesserte Entfernung von mindestens einer, bevorzugt von mehreren protease-sensitiven Anschmutzungen auf Textilien und/oder harten Oberflächen, beispielsweise Geschirr. Therefore, it enables improved removal of at least one, preferably multiple protease-sensitive stains on textiles and / or hard surfaces, such as dishes. Weiter überraschend wurde festgestellt, dass eine solche Protease einem Wasch- oder Reinigungsmitteln eine vorteilhafte Reinigungsleistung verleiht, vor allem auch bei niedrigen Temperaturen, beispielsweise zwischen 10°C und 50°C, insbesondere zwischen 10°C und 40°C oder zwischen 20°C und 40°C. Further surprisingly been found that such a protease a washing or cleaning agents imparts a favorable cleaning performance, especially also at low temperatures, for example between 10 ° C and 50 ° C, in particular between 10 ° C and 40 ° C or between 20 ° C and 40 ° C.
  • Unter Reinigungsleistung wird erfindungsgemäß die Aufhellungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels an Anschmutzungen, insbesondere an protease-sensitiven Anschmutzungen und hierunter insbesondere an protease-sensitiven Wäscheanschmutzungen, verstanden. Under cleaning performance is achieved according to the whitening performance of a washing or cleaning agent to stains, particularly to protease-sensitive stains, and among these in particular to protease-sensitive Wäscheanschmutzungen understood. Die Reinigungsleistung wird bevorzugt ermittelt wie weiter unten angegeben. The cleaning performance is preferably determined as indicated below.
  • Aufgrund der zur Verfügung gestellten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ist eine zusätzliche Optimierung dieser Protease, beispielsweise durch Aminosäuresubstitutionen oder weitere Mutationen, möglich. Due to the provided invention nucleic acids is an additional optimization of these protease, for example, by amino acid substitutions or more mutations possible. Ferner können erfindungsgemäße Nukleinsäuren in verschiedenste Rekombinationsansätze eingebracht und damit zur Erzeugung völlig neuartiger Proteasen oder anderer Polypeptide genutzt werden. Furthermore, nucleic acids according to the invention can be incorporated into various Rekombinationsansätze and thus be used for the generation of completely novel proteases or other polypeptides.
  • Zahlreiche Proteasen und insbesondere Subtilisine werden als sogenannte Präproteine, also zusammen mit einem Propeptid und einem Signalpeptid gebildet, wobei die Funktion des Signalpeptids üblicherweise darin besteht, die Ausschleusung der Protease aus der sie produzierenden Zelle in das Periplasma oder das die Zelle umgebende Medium zu gewährleisten, und das Propeptid üblicherweise für die korrekte Faltung der Protease nötig ist. Numerous proteases and particularly subtilisins, are formed as so-called preproteins, ie, together with a pro-peptide and a signal peptide, wherein the function of the signal peptide usually is out of it to ensure the discharge of the protease-producing cell into the periplasm or the medium surrounding the cell, and the pro-peptide is usually necessary for the proper folding of the protease. Das Signalpeptid und das Propeptid sind in der Regel der N-terminale Teil des Präproteins. The signal peptide and propeptide are usually the N-terminal part of the pre-protein. Das Signalpeptid wird unter natürlichen Bedigungen durch eine Signalpeptidase von der übrigen Protease abgespalten. The signal peptide is cleaved under natural conditions by a signal from the rest of protease. Anschließend erfolgt die durch das Propeptid unterstützte korrekte endgültige Faltung der Protease. Then supported by the pro-peptide correct final folding of the protease takes place. Die Protease ist dann in ihrer aktiven Form und spaltet das Propeptid selbst ab. The protease is then in its active form and cleaves the pro-peptide itself. Nach der Abspaltung des Propeptids übt die dann reife (mature) Protease, insbesondere Subtilisin, ihre katalytische Aktivität ohne die ursprünglich vorhandenen N-terminalen Aminosäuren aus. After cleavage of the propeptide exerts which then mature (mature) protease, especially subtilisin, from their catalytic activity without the N-terminal amino acids originally present.
  • Für technische Anwendungen sind aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität die reifen (maturen) Proteasen, dh die nach ihrer Herstellung prozessierten Enzyme, gegenüber den Präproteinen bevorzugt. For technical applications, the mature (mature) owing to their enzymatic activity are proteases, ie the processed after their production enzymes, over the preproteins preferred. Die Proteasen können von den sie produzierenden Zellen nach der Herstellung der Polypeptidkette modifiziert werden, beispielsweise durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche Modifikationen werden als posttranslationale Modifikationen bezeichnet. The proteases can be modified by the cells that produce them after the production of the polypeptide, for example, by attachment of sugar molecules, formylation, amination, etc. Such modifications are referred to as post-translational modifications. Diese posttranslationalen Modifizierungen können, müssen jedoch nicht einen Einfluss auf die Funktion der Protease ausüben. These post-translational modifications may or may not have an impact on the function of the protease.
  • Eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz ist unter SEQ ID NO. A nucleic acid sequence according to the invention is SEQ ID NO. 1 angegeben. 1 is specified. Diese Nukleinsäure codiert für eine Protease, welche eine für Subtilisine typische Einteilung in Signalpeptid, Propeptid und reife (mature) Protease aufweist. This nucleic acid encodes for a protease which has a typical subtilisins division into signal peptide, propeptide and mature (mature) protease. Das Gesamtlängenprotein ist unter SEQ ID NO. The total length protein is shown under SEQ ID NO. 2 und die reife (mature) Protease unter SEQ ID NO. 2 and the mature (mature) protease with SEQ ID NO. 3 angegeben. 3 indicated. Hiermit ist das tatsächlich aktive reife Protein gemeint, weil dieses die technisch relevante Funktion ausübt. This actually active mature protein is meant because it exercises the technically relevant function. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind daher die reifen, aktiven Proteasen. the mature, active proteases, therefore, are particularly preferred according to the invention. Diese weisen ein Molekulargewicht zwischen 25 und 30 kD (Kilodalton) auf, insbesondere 27 kD, ermittelt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese. These have a molecular weight of 25-30 kD (kilodaltons), in particular 27 kD, determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Für die Protease gemäß SEQ ID NO. For the protease of SEQ ID NO. 3 bzw. SEQ ID NO. 3 or SEQ ID NO. 2 wurde eine Sequenzanalyse sowie ein Sequenzvergleich mit bekannten Proteinsequenzen aus den allgemein zugänglichen Datenbanken UniProtKB und/oder Swiss-Prot (vgl. UniProtKB, EMBL Outstation – European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, United Kingdom; http://www.uniprot.org) und/oder GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), durchgeführt, um die Proteine mit der größten Ähnlichkeit zu ermitteln. 2, a sequence analysis and a sequence comparison with known protein sequences from the generally accessible databases UniProtKB and / or Swiss-Prot (see UniProtKB, EMBL Outstation - European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, United Kingdom; http.: //www.uniprot.org) and / or GenBank (National Center for Biotechnology information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), performed to identify proteins with the greatest similarity. Dieser Sequenzvergleich erfolgte mit Hilfe des im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. beispielsweise This sequence comparison was made (see using the established in the prior art and usually used BLAST algorithm. For example, , und , and ). ). Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Another available in the prior art algorithm is the FASTA algorithm.
  • Auf der Ebene der Aminosäuren für die gesamte Protease gemäß SEQ ID NO. On the amino acid level for the entire protease of SEQ ID NO. 2 wurde als nächstähnliches Protein identifiziert: Sequenz Q5XPN0 aus Bacillus pumilus (UniProtKB/TrEMBL Q5XPN0 (Q5XPN0_BACPU); „Organic solvent tolerant Protease”) mit 98,4% Identität bzw. Abweichungen in 6 Aminosäurepositionen. 2 was identified as the most similar protein: Q5XPN0 sequence of Bacillus pumilus (UniProtKB / TrEMBL Q5XPN0 (Q5XPN0_BACPU); "Organic solvent tolerant protease") with 98.4% identity or deviations in 6 amino acid positions.
  • Auf der Ebene der Aminosäuren für die reife (mature) Protease gemäß SEQ ID NO. At the level of amino acids for the mature (mature) protease of SEQ ID NO. 3 wurde als nächstähnliches Protein identifiziert: Sequenz Q5XPN0 aus Bacillus pumilus UniProtKB/TrEMBL Q5XPN0 (Q5XPN0_BACPU); 3 was identified as the most similar protein: Q5XPN0 sequence from Bacillus pumilus UniProtKB / TrEMBL Q5XPN0 (Q5XPN0_BACPU); „Organic solvent tolerant Protease”) mit 98,2% Identität bzw. Abweichungen in 5 Aminosäurepositionen. "Organic solvent tolerant protease") with 98.2% identity or deviations in 5 amino acid positions.
  • Damit unterscheidet sich die erfindungsgemäße Protease von dieser Protease in 6 Aminosäuren bezogen auf das Gesamtlängenprotein gemäß SEQ ID NO. Thus, the protease of the protease of the invention differs in 6 amino acids based on the total length protein according to SEQ ID NO. 2 und in 5 Aminosäuren bezogen auf die reife (mature) Protease gemäß SEQ ID NO. 2 and 5 amino acids in relation to the mature (mature) protease of SEQ ID NO. 3. Somit handelt es sich bei der gefundenen Protease um ein neues Enzym. 3. Thus, it is found in the protease is a novel enzyme. In den Schutzbereich eingeschlossen werden können somit alle Proteasen, die mindestens zu 98,5% identisch zu SEQ ID NO. can be included within the scope thus all proteases which is at least 98.5% identical to SEQ ID NO. 2 sind und/oder die sich von der Sequenz Q5XPN0 (angegeben als SEQ ID NO. 5) in mindestens einer, bevorzugt 2, 3, 4, 5 oder 6 Aminosäuren unterscheiden bzw. die mindestens zu 98,3% identisch zu SEQ ID NO. 2 and / or from the sequence Q5XPN0 (given as SEQ ID NO. 5) in at least one, preferably 2, 3, 4, 5 or 6 different amino acids or at least 98.3% identical to SEQ ID NO , 3 sind und/oder die sich von der Sequenz der reifen Protease gemäß Q5XPN0 (angegeben als SEQ ID NO. 6) in mindestens einer, bevorzugt 2, 3, 4 oder 5 Aminosäuren unterscheiden. 3, and / or which (given as SEQ ID NO. 6) from the sequence of the mature protease of Q5XPN0 in at least one, preferably 2, 3, 4 or 5 different amino acids. Zu der im Stand der Technik etablierten Protease aus Bacillus lentus (SEQ ID NO. 4, vgl. auch (To the well-established in the prior art protease from Bacillus lentus SEQ ID NO. 4, see. Also WO 97/21760 A1 WO 97/21760 A1 ) ergibt sich eine Identität von 58,2% bezogen auf das reife Enzym. ) Is given an identity of 58.2% with respect to the mature enzyme.
  • Aufgrund der zu erkennenden Übereinstimmungen und der Verwandtschaft zu den anderen angegebenen Subtilisinen ist eine erfindungsgemäße Protease als ein Subtilisin anzusehen. Because of the recognizable agreements and the relationship to the other specified subtilisins a protease of the invention is to be regarded as a subtilisin.
  • Die Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. The determination of the identity of nucleic acid or amino acid sequences is performed by a sequence comparison. Durch einen solchen Vergleich mit bekannten Enzymen, die beispielsweise in allgemein zugänglichen Datenbanken hinterlegt sind, Isst sich aus der Aminosäure- oder Nukleotid-Sequenz auch die enzymatische Aktivität eines betrachteten Enzyms folgern. Through such a comparison with known enzymes, which are stored for example in generally accessible data banks, Eating from the amino acid or nucleotide sequence, the enzymatic activity of an enzyme conclude. Diese kann durch andere Bereiche des Proteins, die nicht an der eigentlichen Reaktion beteiligt sind, qualitativ oder quantitativ modifiziert werden. This can be qualitatively or quantitatively modified by other regions of the protein that are not involved in the actual reaction. Dies könnte beispielsweise die Enzymstabilität, die Aktivität, die Reaktionsbedingungen oder die Substratspezifität betreffen. This could, for example, enzyme stability, activity, reaction conditions or substrate specificity concern.
  • Solch ein Vergleich geschieht dadurch, dass ähnliche Abfolgen in den Nukleotidsequenzen (oder auch Aminosäuresequenzen) einander zugeordnet werden. Such a comparison is done by assigning similar sequences in the nucleotide sequences (or amino acid sequences) are associated with each other. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. A tabular assignment of the respective positions is referred to as alignment. Bei der Analyse von Nukleotidsequenzen sind wiederum beide komplementären Stränge und jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen; In the analysis of nucleotide sequences, both complementary strands and all three possible reading frames have to be considered; ebenso die Degeneriertheit des genetischen Codes und die organismenspezifische Verwendung der Codons (Codon-Usage). likewise the degeneracy of the genetic code and the organism-specific codon usage (codon usage). Üblicherweise werden Sequenzvergleiche und Alignments über Computerprogramme erstellt. Usually, sequence comparisons and alignments are produced by computer programs. Häufig genutzt werden beispielsweise Clustal (vgl. beispielsweise are often used, for example, Clustal (see. for example, ) oder T-Coffee (vgl. beispielsweise ) Or T-Coffee (see. For example, ) sowie BLAST oder FASIA für die Datenbanksuche, beziehungsweise Programme, die auf diesen Programmen bzw. Algorithmen basieren. ) And BLAST or FASTA for database search, or programs based on these programs or algorithms. In der vorliegenden Patentanmeldung wurden Sequenzvergleiche und Alignments mit dem Computer-Programm Vector NTI ® Suite 7.0 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Default-Parametern erstellt. In the present application sequence comparisons and alignments were performed with the computer program Vector NTI ® Suite 7.0 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, United States) created with the preset default parameters.
  • Eine Zusammenstellung aller in den verglichenen Sequenzen übereinstimmenden Positionen wird als Konsensus-Sequenz bezeichnet. A compilation of all matching in the compared sequences is referred to as consensus sequence.
  • Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Such a comparison also allows a statement about the similarity of the compared sequences. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben bzw. in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. It is generally expressed corresponding positions in percent identity, i.e. the proportion of identical nucleotides or amino acid residues in the same or in an alignment. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. The broader concept of homology refers in amino acid sequences conserved amino acid substitutions in the analysis one, ie amino acids with similar chemical activity, since they usually similar within the protein chemical activities. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Therefore, the similarity of the compared sequences can also be specified percent homology or percent similarity. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Identity and / or homology data can be taken over entire polypeptides or genes or only about individual regions.
  • Homologe oder identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Homologous or identical regions of different nucleic acid or amino acid sequences are defined by similarities in the sequences. Solche Bereiche können auch durch identische Funktionen gekennzeichnet sein. Such regions can also be characterized by identical functions. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide bzw. Aminosäuren umfassen. You can be small and include only a few nucleotides or amino acids. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Proteins essentielle Funktionen aus. Often such small areas of the overall activity of the protein exert essential functions. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls kleine Bereiche zu beziehen. It may therefore be useful to refer sequence matches only to individual, possibly small areas. Beispiele für solche Funktionen können bei Nukleinsäuren die Wechselwirkung mit speziellen Molekülen sein, beispielsweise bei Promotorsequenzen die Wechselwirkung mit bestimmten Transkriptionsfaktoren. Examples of such functions for nucleic acids, the interaction with specific molecules be, for example promoter sequences interaction with specific transcription factors. Bei Aminosäuresequenzen können solche Funktionen auch kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Polypeptid ausgeübten Funktion sein wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasserstoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder eines Übergangskomplexes. For amino acid sequences, such functions may be even the smallest part of the functions performed by the entire polypeptide function, such as the formation of individual hydrogen bridge bonds for complexing a substrate or transition complex.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Protease dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus In a preferred embodiment of the invention, the protease is characterized in that it comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of
    • a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. a) amino acid sequence to that of SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist 3 amino acid sequence given increasingly preferably to at least 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and very particularly preferably 100% identical
    • b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. b) amino acid sequence to that of SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist. 2 amino acid sequence shown at least 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99, 5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and very particularly preferably 100% identical.
  • Alle vorstehenden Sachverhalte und Ausführungen gelten für diese bevorzugten Ausführungsformen entsprechend. All the above facts and apply accordingly for these preferred embodiments.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Protease dadurch gekennzeichnet, dass ihre Reinigungsleistung mindestens derjenigen einer Protease entspricht, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO. In a further preferred embodiment of the invention, the protease is characterized in that its cleaning performance at least equivalent to those of a protease comprising an amino acid sequence in SEQ ID NO. 4 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, und/oder mindestens derjenigen einer Protease entspricht, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO. 4 corresponds to amino acid sequence specified, and / or at least equal to that of a protease comprising an amino acid sequence in SEQ ID NO. 6 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, und/oder mindestens derjenigen der Protease aus Bacillus pumilus gemäß 6 corresponds to amino acid sequence specified, and / or at least those of the protease derived from Bacillus pumilus according WO2007/131656 WO2007 / 131656 entspricht, wobei die Reinigungsleistung in einem Waschsystem bestimmt wird, das ein Waschmittel in einer Dosierung zwischen 4,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte sowie die Protease enthält, wobei die zu vergleichenden Proteasen aktivitätsgleich eingesetzt sind und die Reinigungsleistung gegenüber einer oder mehrerer der Anschmutzungen Blut-Milch/Tusche auf Baumwolle, Voll-Ei/Pigment (Ganzei/Ruß) auf Baumwolle, Schokoladenmilch/Ruß auf Baumwolle, Erdnuss Öl-Pigment/Tusche auf Polyester/Baumwolle, Gras auf Baumwolle und Kakao auf Baumwolle, insbesondere gegenüber einer oder mehrerer der Anschmutzungen corresponds to, wherein the cleaning performance is determined in a washing system comprising a washing agent in a dosage from 4.5 to 7.0 grams per liter of wash liquor, and the protease, wherein the inserted activity equal to the comparative proteases and the cleaning performance against one or more of stains blood-milk / ink on cotton, whole egg / pigment (whole egg / carbon black) on cotton, chocolate milk / carbon black on cotton, peanut oil pigment / ink on polyester / cotton, grass on cotton and cocoa on cotton, in particular with respect to a or more of the stains
    • – Blut-Milch/Tusche auf Baumwolle: Produkt Nr. C-05 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) BV Vlaardingen, Niederlande - Blood-milk / ink on cotton: product no C-05 available from CFT (Center For test material) BV Vlaardingen, Netherlands.
    • – Voll-Ei/Pigment (Ganzei/Ruß) auf Baumwolle: Produkt Nr. 10 N erhältlich von der Firma wfk Testgewebe GmbH; - whole egg / pigment (whole egg / soot) on cotton: product no 10N available from wfk test fabrics GmbH;. Brüggen-Bracht, Deutschland, oder Produkt CS-37 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) BV Vlaardingen, Niederlande Brüggen-Bracht, Germany, or product CS-37 available from CFT (Center For test material) BV Vlaardingen, Netherlands
    • – Schokoladenmilch/Ruß auf Baumwolle: Produkt Nr. C-03 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) BV Vlaardingen, Niederlande - Chocolate milk / soot on cotton: product no C-03 available from CFT (Center For test material) BV Vlaardingen, Netherlands.
    • – Erdnuss Öl-Pigment/Tusche auf Polyester/Baumwolle: Produkt Nr. PC-10 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) BV Vlaardingen, Niederlande - peanut oil pigment / ink on polyester / cotton: product no PC-10 available from CFT (Center For test material) BV Vlaardingen, Netherlands.
    • – Gras auf Baumwolle: Produkt Nr. 164 erhältlich von der Firma Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Schweiz - grass on cotton: product no 164 available from Federal materials and testing institute (EMPA) Test materials AG, St. Gallen, Switzerland.
    • – Kakao auf Baumwolle: Produkt Nr. 112 erhältlich von der Firma Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Schweiz, - Cocoa on cotton: product no 112 available from Federal materials and testing institute (EMPA) Test materials AG, St. Gallen, Switzerland.
    bestimmt wird durch Messung des Weißheitsgrades der gewaschenen Textilien, der Waschvorgang für mindestens 30 Minuten, optional 60 Minuten, bei einer Temperatur von 40°C erfolgt und das Wasser eine Wasserhärte zwischen 15,5 und 16,5° (deutsche Härte) aufweist. is determined by measuring the whiteness of the washed fabrics, the washing operation for at least 30 minutes, optionally for 60 minutes at a temperature of 40 ° C and the water having a water hardness of 15.5 to 16.5 ° (German hardness).
  • Erfindungsgemäß sind die Begriffe Ganzei/Ruß bzw. Vollei/Pigment hinsichtlich der Anschmutzungen als gleichwertig und einander entsprechend zu betrachten. According to the invention, the terms whole egg / carbon black or whole egg / pigment with respect to the stains, as equivalent to and at each other accordingly.
  • Ein bevorzugtes flüssiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3–0,5% Xanthan Gum, 0,2–0,4% Anti-Schaummittel, 6–7% Glycerin, 0,3–0,5% Ethanol, 4–7% FASOS (Fettalkoholethersulfat), 24-28% nichtionische Tenside, 1% Borsäure, 1–2% Natriumcitrat (Dihydrat), 2-4% Soda, 14-16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP (1-Hydroxyethan-(1,1-di-phosphonsäure)), 0–0,4% PVP (Polyvinylpyrrolidon), 0–0,05% optischer Aufheller, 0–0,001% Farbstoff, Rest demineralisiertes Wasser. A preferred liquid detergent for such a washing system is composed as follows (all figures in percentage weight): 0.3-0.5% Xanthan Gum, 0.2-0.4% anti-foaming agent, 6-7% glycerol, 0.3-0.5% of ethanol, 4-7% Faso (fatty alcohol ether sulfate), 24-28% nonionic surfactants, 1% boric acid, 1-2% sodium citrate (dihydrate), 2-4% soda, 14-16% coconut fatty acids, 0.5% HEDP (1-hydroxyethane (1,1-diphosphonic acid)), 0-0.4% PVP (polyvinylpyrrolidone), 0-0.05% optical brighteners, 0 to 0.001% dye, remainder demineralized water. Bevorzugt beträgt die Dosierung des flüssigen Waschmittels zwischen 4,5 und 6,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 4,7, 4,9 oder 5,9 Gramm pro Liter Waschflotte. Preferably, the dosage of the liquid washing agent from 4.5 to 6.0 grams per liter of wash liquor is, for example 4.7, 4.9 or 5.9 grams per liter of wash liquor. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 8 und pH 10,5, bevorzugt zwischen pH 8 und pH 9. washed in a pH range between pH 8 and pH 10.5 preferably between pH 8 and pH 9 is preferable.
  • Ein bevorzugtes pulverförmiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 10% lineares Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz), 1,5% C12-C18-Fettalkoholsulfat (Natrium-Salz), 2,0% C12-C18-Fettalkohol mit 7 EO, 20% Natriumcarbonat, 6,5% Natriumhydrogencarbonat, 4,0% amorphes Natriumdisilikat, 17% Natriumcarbonat-peroxohydrat, 4,0% TAED, 3,0% Polyacrylat, 1,0% Carboxymethylcellulose, 1,0% Phosphonat, 25% Natriumsulfat, Rest: optional Schauminhibitoren, optischer Aufheller, Duftstoffe und ggfs. Wasser ad 100%. A preferred powdered detergent for such a washing system is composed as follows (all figures in percentage weight): 10% linear alkyl benzene sulphonate (sodium salt), 1.5% C12-C18-fatty alcohol sulfate (sodium salt), 2.0% C12-C18 fatty alcohol with 7 EO, 20% sodium carbonate, 6.5% sodium bicarbonate, 4.0% amorphous sodium disilicate, 17% sodium carbonate peroxohydrate, 4.0% TAED, 3.0% polyacrylate, 1.0% carboxymethylcellulose, 1.0% phosphonate, 25% sodium sulfate, rest:. optionally foam inhibitors, optical brighteners, perfumes and optionally water ad 100%. Bevorzugt beträgt die Dosierung des pulverförmigen Waschmittels zwischen 5,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 5,6, 5,9 oder 6,7 Gramm pro Liter Waschflotte. Preferably, the dosage of the powdered detergent from 5.5 to 7.0 grams per liter of wash liquor is, for example 5.6, 5.9 or 6.7 grams per liter of wash liquor. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 9 und pH 11. washed in a pH range between pH 9 and pH 11 is preferred.
  • Der Weißheitsgrad, dh die Aufhellung der Anschmutzungen, als Maß für die Reinigungsleistung wird bevorzugt mit optischen Messverfahren bestimmt, bevorzugt photometrisch. The degree of whiteness, that is, the brightening of the stains, as a measure for the cleaning performance is preferably determined with optical measuring method is preferred photometrically. Ein hierfür geeignetes Gerät ist beispielsweise das Spektrometer Minolta CM508d. A suitable device for example, the Minolta CM508d spectrometer. Üblicherweise werden die für die Messung eingesetzten Geräte zuvor mit einem Weißstandard, bevorzugt einem mitgelieferten Weißstandard, kalibriert. Typically, the devices used for the measurement are previously calibrated with a white standard, preferably a white standard.
  • Durch den aktivitätsgleichen Einsatz der jeweiligen Protease wird sichergestellt, dass auch bei einem etwaigen Auseinanderklaffen des Verhältnisses von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften, also beispielsweise die Reinigungsleistung an bestimmten Anschmutzungen, verglichen werden. By the activity equal usage of the respective protease is ensured that even with a possible divergence of the ratio of active substance to total protein (the values ​​of the specific activity), the respective enzymatic properties, thus for example, the cleaning performance on certain stains are compared. Generell gilt, dass eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann. In general, a low specific activity can be compensated by adding a larger amount of protein. Verfahren zur Bestimmung der Proteaseaktivitäten sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie geläufig und werden von ihm routinemäßig angewendet. A method for determining the protease activity are familiar to the person skilled in the field of enzyme technology and are routinely used by him. Beispielsweise sind solche Verfahren offenbart in For example, such methods are disclosed in . , Die Proteaseaktivität wird vorzugsweise in PE (Protease-Einheiten) angegeben. The protease activity is preferably expressed in PU (protease units). Beispielsweise geeignete Proteaseaktivitäten betragen 2,25, 5 oder 10 PE (Protease-Einheiten) pro ml Waschflotte. For example, suitable protease activities amount to 2.25, 5 or 10 PU (protease units) per ml wash liquor. Die Proteaseaktivität ist jedoch nicht gleich Null. However, the protease activity is not zero.
  • Proteine können auch über die Reaktion mit einem Antiserum oder einem bestimmten Antikörper zu Gruppen immunologisch verwandter Proteine zusammengefaßt werden. Proteins can also be combined via the reaction with an antiserum or an antibody specific to groups of immunologically related proteins. Die Angehörigen einer Gruppe zeichnen sich dadurch aus, dass sie dieselbe, von einem Antikörper erkannte antigene Determinante aufweisen. The members of a group are characterized in that they have the same, recognized by an antibody antigenic determinant. Sie sind daher einander strukturell so ähnlich, dass sie von einem Antiserum oder betimmten Antikörpern erkannt werden. They are therefore another structurally so similar that they are recognized by an antiserum or dog world antibodies. Einen weiteren Erfindungsgegenstand bilden daher ferner Proteasen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei oder vier übereinstimmende antigene Determinanten mit einer erfindungsgemäßen Protease aufweisen. Furthermore, another subject of the invention therefore form proteases, which are characterized in that they have at least one, and increasingly preferably two, three or four identical antigenic determinants with a protease of the invention. Solche Proteasen sind auf Grund ihrer immunologischen Übereinstimmungen den erfindungsgemäßen Proteasen strukturell so ähnlich, dass auch von einer gleichartigen Funktion auszugehen ist. Such proteases are structurally similar on the basis of their immunological matches the proteases of the invention that is also presumed a similar function.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist eine erfindungsgemäße Protease natürlicherweise in einem Organismus vorhanden, der aus einem natürlichen Habitat isolierbar ist. In a further embodiment of the invention, a protease of the invention is naturally present in an organism which is isolable from a natural habitat.
  • Diese Ausführungsform ist deshalb besonders vorteilhaft, weil dann der zugehörige Organismus selbst in Kultur genommen werden kann. This embodiment is particularly advantageous because the associated organism itself can then be placed in culture. Vorteilhafterweise lassen sich dann aus dessen Zellextrakten oder Kulturüberständen erfindungsgemäße Proteasen isolieren und herstellen. Advantageously, then can be isolated proteases according to the invention and prepared from the cell extracts or culture supernatants.
  • Bevorzugt ist die Protease in einem Mikroorganismus vorhanden, weiter bevorzugt in einem Pilz, in einem gramnegativen oder in einem grampositiven Bakterium, und hierunter besonders bevorzugt in einem Bakterium der Gattung Bacillus. Preferably, the protease is present in a microorganism, more preferably in a fungus in a gram negative or a gram-positive bacterium, and among these particularly preferably in a bacterium of the genus Bacillus. Denn besonders für diese Organismen sind im Stand der Technik Kultivierungsmethoden bekannt und etabliert. Because most of these organisms cultivation methods are known in the art and established. Das gilt insbesondere für Bacilli, die in der technischen Enzymherstellung eine herausragende Rolle einnehmen. This is especially true for Bacilli that play a prominent role in the technical enzyme production. Ganz besonders bevorzugt ist die Protease vorhanden in Bacillus pumilus und insbesondere in Bacillus pumilus DSM ID 08-100. Most preferably, the protease is present in Bacillus pumilus, and in particular in Bacillus pumilus DSM ID 08-100.
  • Ferner wurde eine für eine bevorzugte erfindungsgemäße Protease codierende Nukleinsäure im Rahmen der vorliegenden Erfindung rekombinant in eine Wirtszelle eingebracht und wie vorstehend beschrieben unter der Nummer DSM 21891 bei der DSMZ hinterlegt. Further, a coding for a preferred protease of the invention nucleic acid in the present invention has been recombinantly introduced into a host cell, and as described above under the number DSM deposited at the DSMZ 21,891th In einer weiteren bevorzugten Ausführungform der Erfindung ist die Protease somit dadurch gekennzeichnet, dass sie von einer Nukleinsäure codiert wird, die in einer Wirtszelle mit der Hinterlegungsnummer DSM 21891 vorhanden ist. In a further preferred embodiment of the invention, the protease is thus characterized in that it is encoded by a nucleic acid which is 21891 present in a host cell having the deposit number DSM.
  • Proteasen bzw. Enzyme im allgemeinen können durch verschiedene Verfahren, z. Proteases or enzymes generally can be prepared by various methods, such. B. gezielte genetische Veränderung durch Mutageneseverfahren, weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich spezieller Eigenschaften, beispielsweise katalytische Aktivität, Stabilität, usw., optimiert werden. B. targeted genetic modification through mutagenesis, further developed and optimized for a particular purpose, or in terms of specific properties such as catalytic activity, stability, etc. Änderungen der Nukleotid- oder Aminosäuresequenz, wie sie beispielsweise durch an sich bekannte molekularbiologische Methoden herbeigeführt werden können, werden demnach als Mutationen bezeichnet. Changes in nucleotide or amino acid sequence as they can be produced, for example, by per se known molecular biological methods are, therefore, called mutations. Je nach Art der Änderung kennt man beispielsweise Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutationen oder solche, bei denen verschiedene Gene oder Teile von Genen miteinander fusioniert werden. Depending on the type of change is known, for example, deletion, insertion or substitution mutations or those in which various genes or parts of genes are fused together. Die zugehörigen Organismen werden als Mutanten bezeichnet. The associated organisms are referred to as mutants. Von mutierten Nukleinsäuren codierte Proteine werden als Varianten bezeichnet. From mutated nucleic acids encoded proteins are referred to as variants. So führen beispielsweise Deletions-, Insertions-, Substitutionsmutationen oder Fusionen zu deletions-, insertions-, substitutionsmutierten Genen bzw. Fusionsgenen und auf Proteinebene zu entsprechenden Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten beziehungsweise Fusionsproteinen. For example, deletion, insertion, substitution mutations or fusions result in deletion, insertion, substitution-genes or fusion genes and, at the protein level, to corresponding deletion, insertion or substitution variants or fusion proteins. Das Ziel ist es, in die bekannten Moleküle gezielte Mutationen, beispielsweise Substitutionen, Insertionen oder Deletionen, einzuführen, um beispielsweise die Reinigungsleistung von erfindungsgemäßen Enzymen zu verbessern. The aim is to introduce into the known molecules targeted mutations, such as substitutions, insertions or deletions to improve, for example, the cleaning performance of the inventive enzymes. Hierzu können insbesondere die Oberflächenladungen und/oder der isoelektrische Punkt der Moleküle und dadurch beispielsweise ihre Wechselwirkungen mit dem Substrat verändert werden. For this purpose, particularly the surface charges and / or the isoelectric point of molecules and thereby, for example, their interactions with the substrate can be changed. So kann beispielsweise über Mutationen die Nettoladung der Enzyme verändert werden, um darüber die Substratbindung insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zu beeinflussen. Thus, the net charge of the enzymes may be modified, for example through mutations to about affecting the substrate binding in particular for use in detergents and cleaners. Eine weitere, insbesondere ergänzende Strategie besteht darin, durch entsprechende Mutationen die Stabilität der betreffenden Proteasen zu erhöhen und dadurch ihre Reinigungsleistung zu erhöhen. Another, in particular complementary strategy is to increase the stability by appropriate mutations of the relevant proteases and thereby increase its cleaning performance.
  • Eine moderne Richtung der Enzymentwicklung besteht darin, Elemente aus bekannten, miteinander verwandten Proteinen über statistische Verfahren zu neuen Enzymen mit bislang nicht erreichten Eigenschaften zu kombinieren. A modern direction in enzyme development is to combine elements from known related proteins using statistical methods to new enzymes with previously unattainable properties. Solche Verfahren werden auch unter dem Oberbegriff Directed Evolution zusamengefaßt. Such methods are taken together evolution under the generic term directed. Dazu gehören beispielsweise die sogenannte „StEP”-Methode, „Random priming recombination”, „DNA-Shuffling”, „RACHITT” oder „Recombining ligation reaction” (RLR). These include the so-called "StEP" method "random priming recombination", "DNA shuffling", "RACHITT" or "recombining ligation reaction" (RLR).
  • Für die Beschreibung von Substitutionen, die genau eine Aminosäureposition betreffen (Aminosäureaustausche), wird folgende Konvention angewendet: zunächst wird die natürlicherweise vorhandene Aminosäure in Form des international gebräuchlichen Einbuchstaben-Codes bezeichnet, dann folgt die zugehörige Sequenzposition und schließlich die eingefügte Aminosäure. For the description of substitutions that affect exactly one amino acid position (amino acid substitutions) is applied following convention: first, the naturally present amino acid in the form of the internationally accepted single-letter codes is referred to, followed by the corresponding sequence position and, finally, the inserted amino acid. Mehrere Austausche innerhalb derselben Polypeptidkette werden durch Schrägstriche voneinander getrennt. Multiple substitutions within the same polypeptide chain are separated by slashes. Bei Insertionen sind nach der Sequenzposition zusätzliche Aminosäuren benannt. When insertions additional amino acids are named according to the sequence position. Bei Deletionen ist die fehlende Aminosäure durch ein Symbol, beispielsweise einen Stern oder einen Strich, ersetzt. In the absence of deletions amino acid is replaced by a symbol such as a star or a stroke. Beispielsweise beschreibt A95G die Substitution von Alanin an Position 95 durch Glycin, A95AG die Insertion von Glycin nach der Aminosäure Alanin an Position 95 und A95* die Deletion von Alanin an Position 95. Diese Nomenklatur ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie bekannt. For example, A95G describes the substitution of alanine at position 95 by glycine, A95AG the insertion of glycine after the amino acid alanine at position 95 and A95 * the deletion of alanine at position 95. This nomenclature is known to those skilled in the field of enzyme technology.
  • Es ist aus dem Stand der Technik weiterhin allgemein bekannt, dass sich vorteilhafte Eigenschaften einzelner Mutationen, z. It is from the prior art also generally known that advantageous properties of individual mutations, eg. B. einzelner Substitutionen, ergänzen können. B. single substitutions can supplement. Eine hinsichtlich bestimmter Eigenschaften bereits optimierte Protease, zum Beispiel hinsichtlich ihrer Stabilität gegenüber Tensiden und/oder Bleichmitteln und/oder anderen Komponenten, kann erfindungsgemäß zusätzlich weiterentwickelt werden. An already optimized with respect to certain properties protease, for example with regard to their stability to surfactants and / or bleaching agents and / or other components, can be according to the invention also developed.
  • Unter Fragmenten werden alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als natürliche Proteine und beispielsweise auch synthetisch erhalten werden können. Fragments all proteins or peptides are understood which are smaller than natural proteins and, for example, can also be obtained synthetically. Aufgrund ihrer Aminosäuresequenzen können sie den jeweiligen vollständigen Proteinen zugeordnet werden. Because of their amino acid sequences, they can be assigned to the respective full-length proteins. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen annehmen oder enzymatische Aktivitäten oder Teilaktivitäten ausüben, wie beispielsweise die Komplexierung eines bestimmten Substrats. For example you can adopt identical structures or exert enzymatic activities or partial activities such as complexing of a particular substrate. Fragmente und Deletionsvarianten von Ausgangsproteinen sind prinzipiell gleichartig dadurch, dass eine oder mehrere Aminosäuren im Vergleich zu einer Ausgangssequenz fehlen; Fragments and deletion variants of starting proteins are basically the same manner in that one or more amino acids as compared to a starting sequence is missing; während Fragmente üblicherweise kleine Stücke einer Ausgangssequenz umfassen, fehlen Deletionsmutanten üblicherweise nur kurze Bereiche und damit ggfs. nur einzelne Teilaktivitäten. while fragments typically include small pieces of a starting sequence, deletion mutants usually lack only short regions and thus possibly. only individual partial activities.
  • Insertionen sind wie Deletionen nicht auf einzelne Aminosäuren beschränkt. Insertions are as deletions are not limited to single amino acids. Vielmehr können auch mehrere Aminosäuren oder ganze Fragmente oder selbst ganze Proteine in eine Ausgangssequenz eingefügt sein oder mit einer Ausgangssequenz fusioniert sein. Rather, several amino acids or whole fragments or even entire proteins can be inserted into an output sequence or be fused with an output sequence. Im letzteren Fall handelt es sich dann um ein chimäres Protein. then in the latter case is a chimeric protein. Hierzu gehören auch Neukombinationen von größeren Enzymabschnitten, also Fragmenten, mit anderen Enzymen oder Proteinen anderer Funktion. This includes new combinations of larger enzyme sections, ie fragments with other enzymes or proteins of other function. So ist es beispielsweise möglich, ein erfindungsgemäßes Enzym oder Teile davon über peptidische Linker oder direkt als Fusionsprotein mit Bindungsdomänen aus anderen Proteinen, etwa der Cellulose-Bindungsdomäne, zu versehen und dadurch die Hydrolyse des Substrats effektiver zu gestalten. Thus, it is possible, for example, an enzyme of the invention or parts thereof via peptide linkers or directly provided as a fusion protein with binding domains from other proteins, for example the cellulose binding domain and thus to make hydrolysis of the substrate more effective. Ebenso können erfindungsgemäße Enzyme beispielsweise auch mit Amylasen oder Cellulasen oder Fragmenten davon verknüpft werden, um eine Doppelfunktion auszuüben. Also, enzymes of the invention can also be linked with amylases or cellulases or fragments thereof, for example, to exert a double function.
  • Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt somit eine Protease dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einer erfindungsgemäßen Protease als Ausgangsmolekül erhaltbar ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 50 und zunehmend bevorzugt mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266, 267 oder 268 zusammenhängenden Aminosäurepositionen mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt. A further subject of the invention thus provides a protease that is characterized in that it is comprised by fragmentation, deletion, insertion or substitution, and an amino acid sequence of a protease of the invention obtainable as starting molecule, the increasingly over a length of at least 50 and preferably at least 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266, 267 or coincides 268 contiguous amino acid positions with the parent molecule.
  • So ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den Loops des Enzyms einzelne Aminosäuren zu deletieren, ohne daß dadurch die proteolytische Aktivität verlorengeht. So it is for instance possible to delete individual amino acids at the termini, or in the loops of the enzyme without thereby lost the proteolytic activity. Durch derartige Deletionen kann beispielsweise oftmals auch die Allergenizität betreffender Enzyme gesenkt und somit insgesamt ihre Einsetzbarkeit verbessert werden. Such deletions also the allergenicity, for example, often reduced of respective enzymes and thus their overall usability can be improved. Hinsichtlich des beabsichtigten Einsatzes dieser Enzyme ist es besonders bevorzugt, wenn sie auch nach der Fragmentierung oder Deletionsmutagenese eine proteolytische Aktivität besitzen. With respect to the intended use of these enzymes, it is particularly preferred if they possess a proteolytic activity even after fragmentation or deletion.
  • Auch Substitionenen können vorteilhafte Wirkungen begründen. Also Substitionenen can establish advantageous effects. Prinzipiell gehören hierzu auch Einzelaustausche von Aminosäuren, es können aber auch mehrere zusammenhängende Aminosäuren gegen andere ausgetauscht werden. In principle, this includes single amino acid changes, but it can be replaced by others more contiguous amino acids.
  • Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt eine Protease dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einer erfindungsgemäßen Protease als Ausgangsmolekül erhaltbar ist und einen oder mehrere Aminosäureaustausche in Positionen aufweist, die den Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268 der Protease aus Bacillus lentus gemäß SEQ ID NO. A further subject of the invention provides a protease that is characterized in that it is obtainable from a protease of the invention as a starting molecule and having one or more amino acid substitutions in positions corresponding to the positions 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237 , 242, 243, 255 and 268 of the protease from Bacillus lentus as shown in SEQ ID NO. 4 in einem Alignment zugeordnet sind. 4 are assigned in an alignment. Die Aminosäurepositionen werden hierbei durch ein Alignment der Aminosäuresequenz einer erfindungsgemäßen Protease mit der Aminosäuresequenz der Protease aus Bacillus lentus, wie sie in SEQ ID NO. The amino acid positions are in this case by an alignment of the amino acid sequence of a protease of the invention having the amino acid sequence of the protease from Bacillus lentus as shown in SEQ ID NO. 4 angegeben ist, definiert. is indicated 4, is defined. Ein solches Alignment ist in Such alignment is 1 1 angegeben. specified. Da die Protease aus Bacillus lentus im Stand der Technik ein wichtiges Referenzmolekül zur Beschreibung neuer Proteasen und von Aminosäureveränderungen darstellt und die hier beschriebenen neuen Proteasen und somit auch ihre Sequenz bislang unbekannt sind, ist es vorteilhaft, in der Zuordnung der Aminosäurepositionen auf die Zählung der Protease aus Bacillus lentus (SEQ ID NO. 4) Bezug zu nehmen. Since the protease from Bacillus lentus in the prior art an important reference molecule to the description of new proteases and of amino acid alterations is and the novel proteases and thus also its sequence have hitherto unknown described herein, it is advantageous in the assignment of amino acid positions on the count of the protease from Bacillus lentus (SEQ ID NO. 4) to refer. Weiterhin richtet sich die Zählung nach dem reifen (maturen) Protein. Furthermore, the count is directed by the mature protein (mature). Diese Zuordnung ist insbesondere auch anzuwenden, wenn die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Protease eine höhere Zahl von Aminosäurenresten umfasst als die Protease aus Bacillus lentus gemäß SEQ ID NO. This mapping is also particularly applicable when the amino acid sequence of the protease according to the invention a higher number of amino acid residues comprises, as the protease from Bacillus lentus as shown in SEQ ID NO. 4. Ausgehend von den genannten Positionen in der Aminosäuresequenz der Protease aus Bacillus lentus sind die Veränderungspositionen in einer erfindungsgemäßen Protease diejenigen, die eben diesen Positionen in einem Alignment gemäß 4. Starting from the mentioned positions in the amino acid sequence of the protease from Bacillus lentus the change positions in a protease of the invention the ones that these same positions in an alignment in accordance with 1 1 zugeordnet sind. assigned.
  • Vorteilhafte Positionen für Sequenzveränderungen, insbesondere Substitutionen, der Protease aus Bacillus lentus, die übertragen auf homologe Positionen der erfindungsgemäßen Proteasen bevorzugt von Bedeutung sind und der Protease vorteilhafte funktionelle Eigenschaften verleihen, sind demnach die Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268, zuzuordnen in einem Alignment mit SEQ ID NO. Advantageous positions for sequence alterations, in particular substitutions, the protease from Bacillus lentus, transferred to homologous positions of the proteases of the invention are preferably of the meaning and the protease advantageous impart functional properties, therefore, the positions 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 and 268 to assign in an alignment with SEQ ID NO. 4 und damit in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 4 and thus to the numbering according to SEQ ID NO. 4. In den genannten Positionen liegen in dem Wildtypmolekül der Protease aus Bacillus lentus folgende Aminosäurereste: S3, V4, S36, N42, A47, T56, G61, T69, E87, A96, R99, A101, I102, S104, N114, H118, A120, S130, S139, T141, S142, S154, S157, A188, V193, V199, G205, L211, A224, K229, S236, N237, N242, H243, N255 beziehungsweise T268. 4. the protease from Bacillus are in said positions in the wild type molecule lentus following amino acid residues: S3, V4, S36, N42, A47, T56, G61, T69, E87, A96, R99, A101, I102, S104, N114, H118, A120, S130, S139, T141, S142, S154, S157, A188, V193, V199, G205, L211, A224, K229, S236, N237, N242, H243, N255 or T268.
  • Vorteilhaft sind insbesondere beispielsweise Substitutionen 3T, 4I, 61A, 99G, 99A, 99S, 154D, 154E, 211D, 211G und 211E, sofern die entsprechend homologen Positionen in einer erfindungsgemäßen Protease nicht schon natürlicherweise von einer dieser bevorzugten Aminosäuren eingenommen werden. are particularly advantageous, for example, substitutions 3T, 4I, 61A, 99G, 99A, 99S, 154D, 154E, 211D, 211G and 211E, provided that the correspondingly homologous positions in a protease of the invention are not already naturally occupied by one of these preferred amino acids. Die Austausche 3T und 41 führen vermutlich über einen Stabilisierungseffekt auf das Molekül zu einer Verbesserung der Reinigungsleistung der Protease und damit zu einer verbesserten Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels, das die Protease enthält. The substitutions 3T and 41 lead presumably via a stabilizing effect on the molecule to an improvement in the cleaning performance of the protease and thus to improved cleaning performance of a washing or cleaning agent that contains the protease.
  • Eine endgültige Bestätigung in der Zuordnung homologer Positionen, dh insbesondere deren funktionelle Entsprechung, können letztlich nur Vergleichsversuche liefern, wonach die beiden auf der Basis eines Alignments einander zugeordneten Positionen in beiden miteinander verglichenen Proteasen auf die gleiche Weise verändert werden und beobachtet wird, ob bei beiden die enzymatische Aktivität auf gleiche Weise verändert wird. A final confirmation in the assignment of homologous positions, ie in particular its functional equivalent, can ultimately provide only comparative tests, after which the two on the basis of an alignment mutually associated positions in the two compared with each other proteases in the same way be varied and it is observed whether at the two the enzymatic activity is changed in the same manner. Geht beispielsweise ein Aminosäureaustausch in einer bestimmten Position der Protease aus Bacillus lentus (BLAP) mit einer Erhöhung von K M oder einem anderen enzymatischen Parameter einher, und wird die gleiche bzw. eine ähnliche Verschiebung des K M -Werts in einer erfindungsgemäßen Protease-Variante beobachtet, deren Aminosäureaustausch durch dieselbe eingeführte Aminosäure erreicht wurde, so ist hierin die Bestätigung dieses Erfindungsaspekts zu sehen. Is, for example, an amino acid substitution in a particular position of the protease from Bacillus lentus (BLAP) with an increase of K M, or other enzymatic parameters associated, and the same or a similar shift of the K M -value in an inventive protease variant is observed whose amino acid change was achieved by the same amino acid introduced, so it in any way the confirmation of this invention aspect.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher eine zuvor beschriebene Protease, die zusätzlich stabilisiert ist, insbesondere durch eine oder mehrere Mutationen, beispielsweise Substitutionen, oder durch Kopplung an ein Polymer. Another object of the invention is therefore a protease as described above, which is additionally stabilized, in particular by one or more mutations, such as substitutions, or by coupling to a polymer.
  • Denn eine Erhöhung der Stabilität bei der Lagerung und/oder während des Einsatzes, beispielsweise beim Waschprozess, führt dazu, dass die enzymatische Aktivität länger anhält und damit die Reinigungsleistung verbessert wird. For increasing the stability during storage and / or during use, for example during the washing process leads to the enzymatic activity lasts longer and therefore the cleaning performance is improved. Neben den vorstehend genannten Stabilisierungsmöglichkeiten kommen alle im Stand der Technik beschriebenen und/oder zweckmäßigen Stabilisierungsmöglichkeiten in Betracht. Besides the aforementioned stabilization options are all stabilization methods described in the prior art and / or appropriate consideration.
  • Bevorzugt sind solche Stabilisierungen, die über Muationen des Enzyms selbst möglich sind. Such stabilization that are possible through Muationen of the enzyme itself are preferred. Denn diese Stabilisierungen erfordern im Anschluss an die Gewinnung des Enzyms keine weiteren Arbeitsschritte. For these stabilizations require following the recovery of the enzyme no further work. Einige hierfür geeignete Sequenzveränderungen sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt. Some suitable for this sequence alterations are known from the prior art. So können Proteasen beispielsweise auch dadurch stabilisiert werden, dass man bestimmte Tyrosin-Reste gegen andere austauscht. Thus proteases may for example also be stabilized by exchanging certain tyrosine residues with other residues.
  • Weitere Möglichkeiten sind beispielsweise: Other options include:
    • – Veränderung der Bindung von Metallionen, insbesondere der Calcium-Bindungsstellen, beispielsweise durch Austauschen von einer oder mehreren der an der Calcium-Bindung beteiligten Aminosäure gegen eine oder mehrere negativ geladene Aminosäuren und/oder durch Einführen von Sequenzveränderungen in mindestens einer der Folgen der beiden Aminosäuren Arginin/Glycin; - altering the binding of metal ions, especially the calcium binding sites, for example by exchanging one or more of the amino acid involved in calcium binding to one or more negatively charged amino acids and / or by introduction of sequence changes in at least one of the sequences of the two amino acids arginine / glycine;
    • – Schutz gegen den Einfluss von denaturierenden Agentien wie Tensiden durch Mutationen, die eine Veränderung der Aminosäuresequenz auf bzw. an der Oberfläche des Proteins bewirken; - protection against the influence of denaturing agents such as surfactants by mutations that cause a change in amino acid sequence or at the surface of the protein;
    • – Austausch von Aminosäuren, die nahe dem N-Terminus liegen, gegen solche, die vermutlich über nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären Struktur leisten. - exchange of amino acids that are close to the N-terminus, against those who presumably occur via non-covalent interactions with the rest of the molecule in contact and thus contribute to maintaining the globular structure.
  • Bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen das Enzym auf mehrere Arten stabilisiert wird. Preferred embodiments are those in which the enzyme is stabilized in several ways. Denn es kann davon ausgegangen werden, dass mehrere stabilisierende Mutationen additiv oder synergistisch wirken. Because it can be assumed that multiple stabilizing mutations act additively or synergistically.
  • Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt eine Protease wie vorstehend beschrieben dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens eine chemische Modifikation aufweist. A further subject of the invention provides a protease as described above is, which is characterized in that it comprises at least one chemical modification. Eine Protease mit einer solchen Veränderung wird auch als Derivat bezeichnet, dh die Protease ist derivatisiert. A protease having such a change is also referred to as a derivative, ie, the protease is derivatized.
  • Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Derivatives such proteins are understood, the pure amino acid chain has been chemically modified for the purposes of the present application. Solche Derivatisierungen können beispielsweise biologisch im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch die Wirtszelle erfolgen. Such derivatizations can be performed, for example, biologically in connection with protein biosynthesis by the host cell. Diesbezüglich sind Kopplungen niedrigmolekularer Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben. In this regard, coupling of low molecular weight compounds such as lipids or oligosaccharides are particularly noteworthy. Hierfür können molekularbiologische Methoden eingesetzt werden. Molecular-biological methods may be used. Derivatisierungen können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. However, derivatizations can also be carried out chemically, for example by the chemical conversion of a side chain of an amino acid or by covalent binding of another compound to the protein. Beispielsweise ist die Kopplung von Aminen an Carboxylgruppen eines Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts möglich. For example, the coupling of amines to the carboxyl group of an enzyme to alter the isoelectric point is possible. Bei solch einer Verbindung kann es sich aber auch um andere Proteine handeln, die beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. But with such a compound may also be other proteins which are bound, for example via bifunctional chemical compounds to proteins of the invention. Derartige Modifizierungen können beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Such modifications may affect to the substrate or may cause a temporary blocking of the enzymatic activity when it is in the coupled substance is an inhibitor, for example, the substrate specificity or the binding strength. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein. This can be useful, for example, for the period of storage. Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen, genauso wie auch ein nichtkovalenter Einschluss in geeignete makromolekulare Käfigstrukturen. Similarly, the covalent bonding to a macromolecular carrier is meant by derivatization, as well as a non-covalent inclusion in suitable macromolecular cage structures. Derartige Modifikationen können ferner die Stabilität, Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat oder die enzymatische Aktivität beeinflussen. Such modifications may also affect the stability, substrate specificity or the strength of binding to the substrate or enzymatic activity. Sie können auch dazu dienen, um die Allergenizität und/oder Immunogenizität des Enzyms herabzusetzen und damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen. You can also serve to reduce the allergenicity and / or immunogenicity of the enzyme and thus for example to increase its skin compatibility. Beispielsweise können Kopplungen mit makromolekularen Verbindungen, beispielsweise Polyethylenglykol, das Protein hinsichtlich der Stabilität und/oder Hautverträglichkeit verbessern. For example, couplings with macromolecular compounds such as polyethylene glycol, the protein in terms of stability and / or skin compatibility may be improved.
  • Unter Derivaten eines erfindungsgemäßen Proteins können im weitesten Sinne auch Präparationen dieser Proteine verstanden werden. Derivatives of a protein of the invention in its broadest sense and preparations of these proteins can be understood. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. Depending on the production, working up or preparation, a protein can be associated with various other substances, for example, from the culture of the producing microorganisms. Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit bestimmten anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. A protein may also have been targeted displaced for example to increase its storage stability, with certain other substances. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen eines erfindungsgemäßen Proteins. According to the invention, therefore, all preparations of a protein according to the invention. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. This is regardless of whether it actually produces said enzymic activity in a particular preparation or not. Denn es kann gewünscht sein, dass es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine enzymatische Funktion entfaltet. Because it may be desirable that there is no or only has low activity in storage, and develops its enzymatic function only at the time of use. Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe gesteuert werden. This can for example be controlled by suitable accompanying substances. Insbesondere die gemeinsame Präparation von Proteasen mit Protease-Inhibitoren ist vorteilhaft. In particular, the joint preparation of proteases with protease inhibitors is advantageous.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für eine erfindungsgemäße Protease codiert, sowie ein Vektor enthaltend eine solche Nukleinsäure. Another object of the invention is a nucleic acid encoding a protease of the invention, as well as a vector comprising such a nucleic acid.
  • Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung die natürlicherweise aus Nukleotiden aufgebauten als Informationsträger dienenden Moleküle zu verstehen, die für die lineare Aminosäureabfolge in Proteinen oder Enzymen codieren. Nucleic acids are understood to be naturally composed of nucleotides as an information carrier serving molecules in the context of the present application, which code for the linear amino acid sequence in proteins or enzymes. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. They can be present as a single strand, as a single strand complementary to that single strand or a double strand. Als der natürlicherweise dauerhaftere Informationsträger ist die Nukleinsäure DNA für molekularbiologische Arbeiten bevorzugt. As the naturally more durable information carrier, the nucleic acid DNA is preferred for molecular biological work. Demgegenüber wird für die Realisierung der Erfindung in natürlicher Umgebung, wie beispielsweise in einer exprimierenden Zelle, eine RNA gebildet, weshalb erfindungswesentliche RNA-Moleküle ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen. In contrast, an RNA is used for the realization of the invention in the natural environment, for example in an expressing cell, formed, so essential to the invention, RNA molecules also represent embodiments of the present invention.
  • Bei DNA sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. With DNA, the sequences of both complementary strands in all three possible reading frames have to be considered.
  • Ferner ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codons, also Basentriplets, für die gleichen Aminosäuren codieren können, so dass eine bestimmte Aminosäuresequenz von mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuren codiert werden kann, was als Degeneriertheit des genetischen Codes bezeichnet wird. It should also be borne in mind that different codons, so base triplets can code for the same amino acids so that a particular amino acid sequence of several different nucleic acids can be encoded, which is called the degeneracy of the genetic code. Außerdem weisen verschiedene Organismen Unterschiede im Gebrauch dieser Codons auf. In addition, different organisms show differences in the use of these codons. Aus diesen Gründen müssen sowohl Aminosäuresequenzen als auch Nukleotidsequenzen in die Betrachtung des Schutzbereichs einbezogen werden. For these reasons, both amino acid sequences and nucleotide sequences must be included in the scope of protection. Daher sind sämtliche Nukleotidsequenzen und damit Nukleinsäuren in diesen Erfindungsgegenstand mit eingeschlossen, die eine der vorstehend beschriebenen Proteasen codieren können. Therefore, all nucleotide sequences and thus these nucleic acids in the subject invention are included, which can encode one of the proteases as described above. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleotidsequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind. The expert is able to determine these nucleotide sequences doubt because in spite of the degeneracy of the genetic code defined individual codons amino acids are attributable. Daher kann der Fachmann ausgehend von einer Aminosäuresequenz für diese Aminosäuresequenz codierende Nukleinsäuren problemlos ermitteln. Therefore, the skilled person can easily determine on the basis of an amino acid sequence of this amino acid sequence coding nucleic acids.
  • Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekular-biologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. One skilled in the art, it is about nowadays generally known methods such as chemical synthesis or the polymerase chain reaction (PCR) in combination with molecular-biological and / or protein-chemical standard methods, on the basis of known DNA and / or amino acid sequences of the corresponding nucleic acids up to produce complete genes. Derartige Methoden sind beispielsweise aus Such methods are, for example, bekannt. known.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nukleinsäure, die für eine erfindungsgemäße Protease kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus In a preferred embodiment of the invention, the nucleic acid encoding a protease according to the invention, characterized in that it comprises a nucleic acid sequence selected from the group consisting of
    • a) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. a) nucleic acid sequence to that of SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in einem Teilstück von mindestens 300 zusammenhängenden Nukleotiden mindestens zu 97,1% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist 1 nucleic acid sequence given in a portion of at least 300 contiguous nucleotides is at least 97.1% and increasingly preferably at least 97.2%, 97.4%, 97.6%, 97.8%, 98%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99, 3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and very particularly preferably 100% identical
    • b) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. b) a nucleic acid sequence complementary to the SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in den Positionen 325 bis 1149 mindestens zu 97,1% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist 1 nucleic acid sequence shown in positions 325-1149 of at least 97.1% and increasingly preferably at least 97.2%, 97.4%, 97.6%, 97.8%, 98%, 98.2%, 98, 3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3% is identical 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and very particularly preferably to 100%
    • c) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. c) nucleic acid sequence to that of SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 97,1% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist. Nucleic acid sequence specified at least 1 to 97.1% and increasingly preferably at least 97.2%, 97.4%, 97.6%, 97.8%, 98%, 98.2%, 98.3%, 98.4 %, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and very particularly preferably 100% identical.
  • In einer weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. In a further embodiment of the invention the nucleic acid is characterized in that it comprises a nucleic acid sequence to that of SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in einem Teilstück von zunehmend bevorzugt 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 zusammenhängenden Nukleotiden jeweils mindestens zu 97,1% und zunehmend bevorzugt jeweils zu mindestens 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist. 1 nucleic acid sequence given in a portion of increasing preference, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 contiguous nucleotides at least 97.1%, and increasingly preferably in each case at least 97.2%, 97.4%, 97 , 6%, 97.8%, 98%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9 %, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and very particularly preferably 100% identical.
  • Die vorstehend unter b) angegebene Nukleinsäuresequenz betrifft den Bereich, der für die reife (mature) Protease codiert. The above-defined under b) nucleic acid sequence refers to the region encoding protease for the mature (mature). Das Stop-Codon ist in diese Betrachtung einbezogen, denn dessen Existenz sorgt dafür, dass nicht ein größeres, evtl. nicht mehr funktionsfähiges, ungewolltes Protein gebildet wird. The stop codon is included in this consideration, because its existence ensures that not a larger, may no longer be viable, unwanted protein is formed. Somit ist bei einer Klonierung darauf zu achten, dass an dieser Stelle ebenfalls ein Stop-Codon liegt, wenn nicht gezielt über den C-Terminus eine Proteinfusion herbeigeführt werden soll. when cloning is therefore necessary to ensure that is at this point also a stop codon, unless a fusion protein is to be brought specifically on the C-terminus. Sollte sich später herausstellen, dass das reife (mature) Protein nur von einem Teil dieser Sequenz gebildet wird, so gilt der Schutzbereich entsprechend für diesen Teil. If it turns out later that the mature (mature) protein is formed only a part of this sequence, so the scope shall apply throughout this section. Bevorzugt sind solche Nukleinsäuren, die für reife (mature) Proteine codieren, und zunehmend bevorzugt sind besonders solche, die für zunehmend aktivere Varianten der erfindungsgemäßen Proteine codieren. those nucleic acids that encode proteins for mature (mature) are preferred, and increasingly preferred are particularly those encoding increasingly active variants of the proteins of the invention.
  • Weiterhin können bei erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ein oder mehrere Codons durch synonyme Codons ersetzt worden sein. Furthermore, may have been replaced by synonymous codons in the nucleic acids according to the invention, one or more codons. Dieser Aspekt bezieht sich auf die heterologe Expression der erfindungsgemäßen Enzyme. This aspect relates to the heterologous expression of the enzymes of the invention. So besitzt jeder Organismus, insbesondere jeder Produktionsstamm, eine gewisse Codon-Usage. So has every organism, in particular each production strain, a certain codon usage. Unter Codon-Usage wird die Übersetzung des genetischen Codes in Aminosäuren verstanden, dh welche Nukleotidfolge (Triplett oder Basentriplett) für welche Aminosäure bzw. für welche Funktion, beispielsweise Beginn und Ende des zu translatierenden Bereichs, Bindungsstellen für verschiedene Proteine, usw., codiert. Under codon usage, the translation of the genetic code, it is understood in amino acids that is, which nucleotide sequence (triplet or base triplet) for which amino acid or to which function, for example, the beginning and end of the to be translated region, binding sites for various proteins, etc. encoded. So besitzt jeder Organismus, insbesondere jede Wirtszelle, eine bestimmte Codon-Usage. So has any organism, especially any host cell, a specific codon usage. Es kann zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der transgenen Nukleinsäure liegenden Codons in der Wirtszelle einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNAs gegenüberstehen. It can lead to bottlenecks in protein biosynthesis, if the codons lying on the transgenic nucleic acid facing in the host cell a comparatively small number of charged tRNAs. Synonyme Codons codieren dagegen für dieselben Aminosäuren und können in der jeweiligen Wirtszelle besser translatiert werden. Synonymous codons encode the other hand, for the same amino acids and can be better translated in the host cell. Dieses gegebenenfalls notwendige Umschreiben hängt somit von der Wahl des Expressionssystems ab. This any necessary rewriting thus depends on the choice of expression system. Insbesondere bei Proben aus unbekannten, eventuell nicht kultivierbaren Organismen kann eine entsprechende Anpassung notwendig sein. Especially with samples from unknown, possibly not culturable organisms, a corresponding adjustment may be necessary.
  • Mit allen genannten Erfindungsgegenständen und Ausführungsformen sind als weitere Erfindungsgegenstände entsprechende Vektoren, Wirtszellen, Herstellungsverfahren, in denen entsprechende Vektoren oder Wirtszellen eingesetzt werden sowie Verwendungen entsprechender Nukleinsäuren, Vektoren und Wirtszellen verbunden. With all the aforementioned objects and embodiments of the invention as further objects of the invention are suitable vectors, host cells, production process, in which respective vectors or host cells are employed, as well as uses of corresponding nucleic acids, vectors and host cells are connected. Daher betreffen die vorstehenden Ausführungen diese Erfindungsgegenstände entsprechend. Therefore, the foregoing objects relating to this invention accordingly.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit ein Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor. Another object of the invention is a vector comprising an inventive nucleic acid, in particular a cloning vector or an expression vector.
  • Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten. Vectors of the present invention will be understood from existing elements within the meaning nucleic acids which contain, as characteristic nucleic acid region of a nucleic acid according to the invention. Sie vermögen diese in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. They are able to establish this as a stable genetic element in a species or a cell line over several generations or cell divisions. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkulare genetische Elemente. Vectors are special plasmids, in particular for use in bacteria, ie circular genetic elements. Es wird unterschieden zwischen solchen Vektoren, die der Lagerung und somit gewissermaßen auch der gentechnischen Arbeit dienen, sogenannten Klonierungsvektoren, und solchen, die die Funktion erfüllen, die Nukleinsäure bzw. das auf dieser vorhandene Gen (oftmals Transgen) in der Wirtszelle zu realisieren, das heißt, die Expression des betreffenden Polypeptids zu ermöglichen. A distinction is made between such vectors which serve for storage and thus to a certain extent also for genetic engineering work, so-called cloning vectors, and those which fulfill the function of this gene present to realize the nucleic acid or the (often transgene) in the host cell, the means to enable the expression of the relevant polypeptide. Diese Vektoren werden als Expressionsvektoren bezeichnet. These vectors are referred to as expression vectors.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure geeigneterweise in einen Vektor kloniert. In the present invention, a nucleic acid according to the invention is suitably cloned in a vector. Dazu können beispielsweise solche gehören, deren Ursprung bakterielle Plasmide, Viren oder Bacteriophagen sind, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. For this example, they can include those whose origins are bacterial plasmids, viruses or bacteriophages, or predominantly synthetic vectors or plasmids with elements verschiedenster origin. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. With the further each existing genetic elements vectors to establish itself in the respective host cells over several generations as stable units. Es ist dabei im Sinne der Erfindung unerheblich, ob sie extrachomosomal als eigene Einheiten vorliegen oder in ein Chromosom bzw. chromosomale DNA integrieren. It is irrelevant for the purposes of the invention, whether they are present extrachromosomally as independent units or integrated into a chromosome or chromosomal DNA. Welches der zahlreichen aus dem Stand der Technik bekannten Systeme gewählt wird, hängt vom Einzelfall ab. Which of the numerous known from the prior art is selected depends on the individual case. Ausschlaggebend können beispielsweise die erreichbare Kopienzahl, die zur Verfügung stehenden Selektionssysteme, darunter vor allem Antibiotikaresistenzen, oder die Kultivierbarkeit der zur Aufnahme der Vektoren befähigten Wirtszellen sein. Decisive for example, the achievable copy number, the selection systems available, including in particular antibiotic resistance, or the Culturability capable of accommodating the vectors, host cells can be.
  • Expressionsvektoren umfassen Teilsequenzen, die sie dazu befähigen, in den sie enthaltenden Wirtszellen, vorzugsweise Mikroorganismen, besonders bevorzugt Bakterien, zu replizieren und dort eine enthaltene Nukleinsäure zur Expression zu bringen. Expression vectors include partial sequences, which enable them, in the host cells containing them, preferably microorganisms, more preferably bacteria to replicate, and to bring a nucleic acid to expression there. Die Expression wird insbesondere von dem oder den Promotoren beeinflusst, welche die Transkription regulieren. Expression is influenced in particular by the one or more promoters that regulate transcription. Prinzipiell kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor der zu exprimierenden Nukleinsäure lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle oder auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle. In principle, the expression may take place by the natural, original localized before to be expressed, the nucleic acid promoter, but also by a provided on the expression vector promoter of the host cell or by a modified, or an entirely different promoter of another organism, or other host cell. Im vorliegenden Fall wird zumindest ein Promotor für die Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Verfügung gestellt und für deren Expression genutzt. In this case, a promoter is at least provided for the expression of a nucleic acid according to the invention are available and used for their expression.
  • Expressionsvektoren können regulierbar sein, beispielsweise durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte der sie enthaltenen Wirtszellen oder durch Zugabe von bestimmten Substanzen, insbesondere Aktivatoren der Genexpression. Expression vectors may be adjustable, for example by changing the cultivation conditions or on reaching a certain cell density, the host cells they contained, or by addition of certain substances, in particular activators of gene expression. Ein Beispiel für eine solche Substanz ist das Galactose-Derivat Isopropyl-β-Dthiogalactopyranosid (IPTG), welches als Aktivator des bakteriellen Lactose-Operons (lac-Operons) verwendet wird. An example of such a substance is the galactose derivative isopropyl-β-Dthiogalactopyranosid (IPTG), which is as an activator of the bacterial lactose operon (lac operon) is used.
  • Expressionsvektoren ermöglichen, dass ein erfindungsgemäßes Protein heterolog, also in einer anderen Zelle bzw. Wirtszelle als derjenigen, aus der es natürlicherweise gewonnen werden kann, produziert wird. Expression vectors allow a heterologous protein of the invention, thus in another cell or host cell as that from which it can be naturally derived, is produced. Die Zellen können dabei zu verschiedenen Organismen zugehörig sein oder von verschiedenen Organismen stammen. The cells may be associated with different organisms or from different organisms. Auch eine homologe Gewinnung eines erfindungsgemäßen Proteins aus einer Wirtszelle, die dieses Protein natürlicherweise (also bereits in ihrer Wildtyp-Form) exprimiert, ist mit einem erfindungsgemäßen Vektor möglich. Also homologous obtaining a protein according to the invention from a host cell (that is already in its wild-type form) expressed this protein naturally, is possible with an inventive vector. Dies kann den Vorteil aufweisen, dass natürliche, mit der Translation in einem Zusammenhang stehende Modifikationen an dem entstehenden Protein genauso durchgeführt werden, wie sie auch natürlicherweise ablaufen würden. This may have the advantage that natural, standing in connection with a translational modifications of the resulting protein are carried out exactly as they would take place naturally.
  • Zu einem einsetzbaren Expressionssystem können ferner zusätzliche Nukleinsäuren (Gene) bzw. von ihnen codierte Proteine zählen, beispielsweise solche, die auf anderen Vektoren zur Verfügung gestellt werden, und die die Produktion erfindungsgemäßer Proteine beeinflussen. To an expression system which can be used additional nucleic acids (genes) or encoded by them proteins may also include, for example, those which are made available on other vectors, influence the production and proteins of the invention. Hierbei kann es sich um modifizierende Proteine handeln oder um solche, die mit dem erfindungsgemäßen Protein gemeinsam aufgereinigt werden sollen, etwa um dessen enzymatische Funktion zu beeinflussen. This may involve modifying proteins or those which are to be purified together with the protein of the invention to influence, for example to its enzymatic function. Dabei kann es sich beispielsweise um andere Proteine oder Enzyme, um Inhibitoren oder um solche Elemente handeln, die die Wechselwirkung mit verschiedenen Substraten beeinflussen. It may, for example, inhibitors or those elements which influence the interaction with various substrates, other proteins or enzymes. In der Regel müssen aus der Fülle an verschiedenen im Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systemen die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermittelt werden. In general, the optimal expression systems for the individual case must be determined experimentally from the abundance of different available in the prior art systems.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine nicht menschliche Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor beinhaltet, oder die eine erfindungsgemäße Protease beinhaltet, insbesondere eine, die die Protease in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert. Another object of the invention is a non-human host cell which contains a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention, or which contains a protease of the invention, particularly one in which the host cell secretes the protease surrounding medium. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. ein erfindungsgemäßer Vektor wird bevorzugt in die Wirtszelle eingebracht durch deren Transformation. A nucleic acid of the invention or a vector of the invention is preferably in the host cell is introduced by the transformation. Bevorzugt wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. ein erfindungsgemäßer Vektor in einen Mikroorganismus transformiert, der dann eine erfindungsgemäße Wirtszelle darstellt. a nucleic acid of the invention or a vector of the invention is preferably transformed into a microorganism, which then represents a host cell of the invention. Alternativ können auch einzelne Komponenten, dh Nukleinsäure-Teile bzw. -Fragmente einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure derart in eine Wirtszelle eingebracht werden, dass die dann resultierende Wirtszelle eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Alternatively, individual components, ie, nucleic acid parts or fragments of a nucleic acid according to the invention can be so introduced into a host cell, then the resulting host cell containing a nucleic acid of the invention or a vector of the invention. Dieses Vorgehen eignet sich besonders dann, wenn die Wirtszelle bereits einen oder mehrere Bestandteile einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. eines erfindungsgemäßen Vektors enthält und die weiteren Bestandteile dann entsprechend ergänzt werden. This procedure is particularly suitable when the host cell already contains one or more components of a nucleic acid of the invention or a vector of the invention and the other components are then supplemented accordingly. Verfahren zur Transformation von Zellen sind im Stand der Technik etabliert und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Methods of transforming cells are well established in the art and known to the skilled worker. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Zellen, das heißt prokaryotische oder eukaryotische Zellen. Suitable host cells are in principle all cells are suitable, that is prokaryotic or eukaryotic cells. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit der Nukleinsäure oder dem Vektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Such host cells can be genetically handled advantageous as regards for example, transformation with the nucleic acid or the vector and its stable establishment, such as unicellular fungi or bacteria. Ferner zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Moreover, preferred host cells are distinguished by good microbiological and biotechnological manageability. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. This applies, for example, ease of cultivation, high growth rates, low demands on fermentation media and good production and secretion rates for foreign proteins. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sezernieren das (transgen) exprimierte Protein in das die Wirtszellen umgebende Medium. Preferred host cells of the invention secrete the (transgenic) expressed protein in the host cells surrounding medium.
  • Weitere bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Vektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Other preferred embodiments are those host cells that are regulated owing to genetic regulatory elements which are made for example on the vector available, but also can be present from the outset in these cells in their activity. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. For example, by controlled addition of chemical compounds serving as activators, by changing the cultivation conditions or on reaching a certain cell density, they can be stimulated to expression. Dies ermöglicht eine wirtschaftliche Produktion der erfindungsgemäßen Proteine. This allows efficient production of proteins of the invention. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist IPTG wie vorstehend beschrieben. An example of such a compound IPTG as described above.
  • Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryontische oder bakterielle Zellen. Preferred host cells are prokaryotic or bacterial cells. Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Bacteria are characterized by short generation times and small demands on the cultivation conditions. Dadurch können kostengünstige Kultivierungsverfahren bzw. Herstellungsverfahren etabliert werden. This cost-effective method of cultivation or production processes can be established. Zudem verfügt der Fachmann bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. In addition, the expert with bacteria in fermentation technology a wealth of experience. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf usw., gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein. For a large, gram negative or gram positive bacteria may be suitable, etc. from different, to be determined experimentally in the individual case, such as nutrient sources, product formation rate, time required.
  • Bei gramnegativen Bakterien wie beispielsweise Escherichia coli wird eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sezerniert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. In gram-negative bacteria such as Escherichia coli, a variety of proteins in the periplasmic space is secreted, ie into the compartment between the two membranes, the cells inclusive. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. This can be advantageous for particular applications. Ferner können auch gramnegative Bakterien so ausgestaltet werden, dass sie die exprimierten Proteine nicht nur in den periplasmatischen Raum, sondern in das das Bakterium umgebende Medium ausschleusen. Furthermore, Gram-negative bacteria can be designed so that they not only the expressed proteins in the periplasmic space, but in which the bacterium surrounding medium. Grampositive Bakterien wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so dass sezernierte Proteine sogleich in das die Bakterien umgebende Medium, in der Regel das Nährmedium, abgegeben werden, aus welchem sich die exprimierten Proteine aufreinigen lassen. In contrast, Gram-positive bacteria such as bacilli or actinomycetes or other representatives of Actinomycetales have no outer membrane so that secreted proteins immediately into the medium surrounding the bacteria, usually the nutrient medium can be discharged from which the expressed proteins can be purified. Sie können aus dem Medium direkt isoliert oder weiter prozessiert werden. They can be directly isolated from the medium or further processed. Zudem sind grampositive Bakterien mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Enzyme, so dass sie über eine ähnliche Codon-Usage verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist. In addition, gram-positive bacteria with most source organisms for industrially important enzymes are related or identical and mostly themselves comparable enzymes so that they have a similar codon usage and their protein synthesis apparatus is aligned naturally accordingly.
  • Erfindungsgemäße Wirtszellen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder noch andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Host cells according to the invention can be changed to the culture conditions with respect to their requirements, have other or additional selection markers or even express different or additional proteins. Es kann sich insbesondere auch um solche Wirtszellen handeln, die mehrere Proteine oder Enzyme transgen exprimieren. There may also be particular those host cells expressing transgenic more proteins or enzymes.
  • Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf alle Mikroorganismen, insbesondere auf alle fermentierbaren Mikroorganismen, besonders bevorzugt auf solche der Gattung Bacillus, anwendbar und führt dazu, dass sich durch den Einsatz solcher Mikroorganismen erfindungsgemäße Proteine herstellen lassen. The present invention is in principle all microorganisms, and in particular all fermentable microorganisms, particularly preferably those of the genus Bacillus, applicable and leads to proteins of the invention can be prepared by the use of such microorganisms. Solche Mikroorganismen stellen dann Wirtszellen im Sinne der Erfindung dar. Such microorganisms then provide host cells within the meaning of the invention.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia. In a further embodiment of the invention the host cell is characterized in that it is a bacterium, preferably one that is selected from the group of genera Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas and Pseudomonas, more preferably one that is selected from the group of Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum , Arthrobacter oxydans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor and Stenotrophomonas maltophilia.
  • Die Wirtszelle kann aber auch eine eukaryontische Zelle sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. However, the host cell may be a eukaryotic cell, which is characterized in that it possesses a nucleus. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt daher eine Wirtszelle dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Therefore in another aspect of the invention provides a host cell, which is characterized in that it possesses a nucleus.
  • Im Gegensatz zu prokaryontischen Zellen sind eukaryontische Zellen in der Lage, das gebildete Protein posttranslational zu modifizieren. In contrast to prokaryotic cells, eukaryotic cells are able to modify posttranslationally the protein produced. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Examples include fungi such as actinomycetes or yeasts such as Saccharomyces or Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. This can for example be particularly advantageous if the proteins in connection with their synthesis to learn specific modifications which enable such systems. Zu den Modifikationen, die eukaryontische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. The modifications that perform eukaryotic systems particularly in the context of protein synthesis, include, for example, the binding of small molecules such as membrane anchors or oligosaccharides. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität eines exprimierten Proteins wünschenswert sein. Oligosaccharide modifications may be for example desirable to reduce the allergenicity of an expressed protein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen, kann vorteilhaft sein. Coexpression with the formed naturally by cells such enzymes such as cellulases may also be advantageous. Ferner können sich beispielsweise thermophile pilzliche Expressionssysteme besonders zur Expression temperaturbeständiger Proteine oder Varianten eignen. Furthermore, for example, thermophilic fungal expression systems are particularly suitable for the expression of temperature-resistant proteins or variants.
  • Die erfindungsgemäßen Wirtszellen werden in an sich bekannter Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. The host cells according to the invention are cultured in a conventional manner and fermented, for example in batch or continuous systems. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Wirtszellen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. In the first case a suitable nutrient medium with the host cell is inoculated and harvested the product after a period of time to be determined experimentally from the medium. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig aus dem Medium das gebildete Protein entnommen werden kann. Continuous fermentations are characterized by attainment of a steady state in which, over a comparatively long period of time cells partially die but also grow and the protein produced can be removed simultaneously from the medium.
  • Erfindungsgemäße Wirtszellen werden bevorzugt verwendet, um erfindungsgemäße Proteasen herzustellen. Host cells according to the invention are preferably used to produce proteases of the invention. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer Protease umfassend Another object of the invention, a method for producing a protease is therefore comprising
    • a) Kultivieren einer erfindungsgemäßen Wirtszelle a) culturing a host cell of the invention
    • b) Isolieren der Protease aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle. b) isolating the protease from the culture medium or from the host cell.
  • Dieser Erfindungsgegenstand umfasst bevorzugt Fermentationsverfahren. This subject invention preferably comprises fermentation processes. Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes, beispielsweise der erfindungsgemäßen Protease. Fermentation processes are known from the prior art and represent the actual industrial production step, usually followed by a suitable purification method of the manufactured product, such as the protease of the invention. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem entsprechenden Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Protease beruhen, stellen Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar. All fermentation process, based on a corresponding method for producing a protease of the invention, illustrate embodiments of this invention the article.
  • Hierbei müssen die jeweils optimalen Bedingungen für die Herstellungsverfahren, insbesondere die optimalen Kulturbedingungen für die benutzten Wirtszellen, nach dem Wissen des Fachmanns experimentell ermittelt werden, beispielsweise hinsichtlich Fermentationsvolumen und/oder Medienzusammensetzung und/oder Sauerstoffversorgung und/oder Rührergeschwindigkeit. Here comply with the appropriate optimum conditions for the manufacturing process, in particular the optimal culture conditions for the used host cells are determined experimentally according to the skill of the art, for example with regard fermentation volume and / or media composition and / or oxygen and / or stirrer.
  • Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen ebenfalls in Betracht. Fermentation processes, which are characterized in that the fermentation is carried out with a supply strategy, are also contemplated. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert. Here, the media components that are consumed by the continuous cultivation are fed. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte als auch in der Zellmasse bzw. Trockenmasse und/oder vor allem der Aktivität der interessierenden Protease erreicht werden. This makes it possible to achieve considerable increases in both the cell density and in the cell mass or dry matter and / or especially the activity of the protease of interest.
  • Ferner kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden. Further, the fermentation can also be designed so that unwanted metabolic products filtered out or be neutralized by the addition of buffer or matching counter ions.
  • Die hergestellte Protease kann aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. The protease produced can be harvested from the fermentation medium. Ein solches Fermentationsverfahren ist gegenüber einer Isolation der Protease aus der Wirtszelle, dh einer Produktaufbereitung aus der Zellmasse (Trockenmasse) bevorzugt, erfordert jedoch die Zurverfügungstellung von geeigneten Wirtszellen oder von einem oder mehreren geeigneten Sekretionsmarkern bzw. -mechanismen und/oder Transportsystemen, damit die Wirtszellen die Protease in das Fermentationsmedium sezernieren. Such a fermentation process is compared to an insulation of the protease from the host cell, ie, a product purification from the cell mass (dry mass) is preferred, however, requires the provision of suitable host cells or from one or more suitable Sekretionsmarkern or mechanisms and / or transport systems so that the host cells the protease secrete into the fermentation medium. Ohne Sekretion kann alternativ die Isolation der Protease aus der Wirtszelle, dh eine Aufreinigung derselben aus der Zellmasse, erfolgen. Without secretion alternatively, the isolation of the protease from the host cell can, that is, a purification of the same take place from the cell mass. Auch hierfür sind verschiedene Verfahren bekannt, wie Fällung z. And various processes are known as precipitation z. B. durch Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder die chromatographische Reinigung. As by ammonium sulfate or ethanol, or chromatographic purification.
  • Alle vorstehend ausgeführten Sachverhalte können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteasen herzustellen. All matters set forth above may be combined with methods to produce proteases of the invention. Es sind diesbezüglich eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten von Verfahrensschritten denkbar. There are in this respect a variety of combinations of process steps possible. Das optimale Verfahren muss für jeden konkreten Einzelfall ermittelt werden. The optimum method must be determined for each specific case.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine erfindungsgemäße Protease wie vorstehend beschrieben enthält. Another object of the invention is a composition, which is characterized in that it contains a protease of the invention as described above. Bevorzugt ist das Mittel ein Wasch- oder Reinigungsmittel. Preferably, the agent is a detergent or cleaning agent.
  • Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Mittel ferner dadurch gekennzeichnet, dass es eine erfindungsgemäße Protease in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels enthält. Preferably, an agent of the invention is further characterized in that a protease of the invention in an amount of from 2 ug to 20 mg, preferably from 5 ug to 17.5 mg, particularly preferably from 20 .mu.g to 15 mg and very particularly preferably from 50 .mu.g to contains 10 mg per g of the composition.
  • Zu diesem Erfindungsgegenstand zählen alle denkbaren Wasch- bzw. Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Handwäsche beziehungsweise -reinigung. To this subject of the invention includes all conceivable washing or cleaning agent types, both concentrates and without dilution, for use on a commercial scale, in washing machines or in hand washing or cleaning. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. These include, for example, detergents for textiles, carpets, or for which the term detergent is used natural fibers. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder, für die die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet wird. These include also dishwashing detergents for dishwashers or manual dishwashing detergents or cleaners for hard surfaces such as metal, glass, porcelain, ceramic, tiles, stone, painted surfaces, plastics, wood or leather, for which the term detergent is used.
  • Ein erfindungsgemäßes Mittel kann sowohl ein Mittel für Großverbraucher oder technische Anwender als auch ein Produkt für den Privatverbraucher sein, wobei alle im Stand der Technik etablierten Wasch- und Reinigungsmittelarten ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen. An inventive agent can be a means for large consumers or industrial users and also a product for the private consumer, all well-established in the prior art washing and cleaning agent species also represent embodiments of the present invention.
  • Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel, die als insbesondere pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können außer den erfindungsgemäß eingesetzten Proteasen im Prinzip alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei bevorzugt mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist. The inventive washing or cleaning agent, which may be in particular powdery solids, in post-compacted particles, as homogeneous solutions or suspensions may, except for the presently employed proteases include all known and customary in such compositions, in principle, wherein preferably at least one further ingredient in is the agent available. Die erfindungsgemäßen Mittel können insbesondere Buildersubstanzen, oberflächenaktive Tenside, Bleichmittel auf Basis organischer und/oder anorganischer Persauerstoffverbindungen, Bleichaktivatoren, wassermischbare organische Lösungsmittel, Enzyme, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, pH-Regulatoren und weitere Hilfsstoffe wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Schaumregulatoren sowie Farb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthalten. The inventive compositions may contain builders, surfactants, bleaching agent based on organic and / or inorganic peroxygen compounds, bleach activators, water-miscible organic solvents, enzymes, sequestering agents, electrolytes, pH regulators and other adjuvants such as optical brighteners, graying inhibitors, foam regulators and dyes and fragrances and combinations thereof contained.
  • Insbesondere eine weitere Kombination der erfindungsgemäßen Wirkstoffe mit einem oder mehreren weiteren Inhaltsstoff(en) der Mittel erweist sich als vorteilhaft, da ein solches Mittel eine verbesserte Reinigungsleistung durch sich ergebende Synergismen aufweisen kann. In particular, a further combination of the active ingredients according to the invention with one or more further ingredient (s) of the center proves to be advantageous, since such an agent can have an improved cleaning performance resulting synergism. Insbesondere durch die Kombination einer erfindungsgemäßen Protease mit einem der nachfolgend beschriebenen Tenside und/oder einer der nachfolgend beschriebenen Buildersubstanzen und/oder einem der nachfolgend beschriebenen Bleichmittel wird ein solcher Synergismus erreicht. In particular by the combination of a protease of the invention with one of the surfactants described below, and / or one of the builders described below and / or any of the bleaching agents described below, such a synergy is reached.
  • Die erfindungsgemäßen Mittel können ein Tensid oder mehrere Tenside enthalten, wobei insbesondere anionische Tenside, nichtionische Tenside und deren Gemische, aber auch kationische, zwitterionische und amphotere Tenside in Frage kommen. The inventive compositions may contain a surfactant or more surfactants, particularly anionic surfactants, nonionic surfactants and mixtures thereof, but also cationic, zwitterionic and amphoteric surfactants in question.
  • Geeignete nichtionische Tenside sind insbesondere Alkylglykoside und Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte von Alkylglykosiden oder linearen oder verzweigten Alkoholen mit jeweils 12 bis 18 C-Atomen im Alkylteil und 3 bis 20, vorzugsweise 4 bis 10 Alkylethergruppen. Suitable nonionic surfactants are in particular alkyl glycosides and ethoxylation and / or propoxylation products of alkyl glycosides or linear or branched alcohols containing 12 to 18 carbon atoms in the alkyl moiety and 3 to 20, preferably 4 to 10 alkyl ether. Weiterhin sind entsprechende Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte von N-Alkyl-aminen, vicinalen Diolen, Fettsäureestern und Fettsäureamiden, die hinsichtlich des Alkylteils den genannten langkettigen Alkoholderivaten entsprechen, sowie von Alkylphenolen mit 5 bis 12 C-Atomen im Alkylrest brauchbar. In addition, corresponding ethoxylation and / or propoxylation products of N-alkylamines, vicinal diols, fatty acid amides and Fettsäureestern corresponding to the long-chain alcohol derivatives with regard to the alkyl moiety, and of alkylphenols of 5 to 12 carbon atoms in the alkyl radical.
  • Als nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise 8 bis 18 C-Atomen und durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid (EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der Alkoholrest linear oder bevorzugt in 2-Stellung methylverzweigt sein kann beziehungsweise lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so wie sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. can be used as nonionic surfactants alcohol are preferably alkoxylated, advantageously ethoxylated, more especially primary alcohols preferably containing 8 to 18 carbon atoms and on average 1 to 12 moles of ethylene oxide (EO) per mole of used, in which the alcohol methyl-branched linear or preferably in the 2-position linear and methyl-branched radicals may contain the mixtures typically present in oxoalcohol radicals. Insbesondere sind jedoch Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C-Atomen, z. However, alcohol ethoxylates containing linear radicals of alcohols are of natural origin having 12 to 18 carbon atoms, z. B. aus Kokos-, Palm-, Talgfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8 EO pro Mol Alkohol bevorzugt. Example from coconut, palm, tallow or oleyl alcohol, and on average 2 to 8 EO per mole of alcohol. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen gehören beispielsweise C 12 -C 14 -Alkohole mit 3 EO oder 4 EO, C 9 -C 11 -Alkohole mit 7 EO, C 13 -C 15 -Alkohole mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, C 12 -C 18 -Alkohole mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus C 12 -C 14 -Alkohol mit 3 EO und C 12 -C 18 -Alkohol mit 7 EO. Preferred ethoxylated alcohols include, for example, C 12 -C 14 alcohols with 3 EO or 4 EO, C 9 -C 11 alcohols with 7 EO, C 13 -C 15 alcohols with 3 EO, 5 EO, 7 EO or 8 EO, C12 -C18 -alcohols containing 3 EO, 5 EO or 7 EO and mixtures thereof, such as mixtures of C 12 -C 14 alcohol with 3 EO and C 12 -C 18 alcohol with 7 EO. Die angegebenen Ethoxylierungsgrade stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können. The degrees of ethoxylation mentioned are statistical averages which may be an integer or a fractional number for a specific product. Bevorzugte Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung auf (narrow range ethoxylates, NRE). Preferred alcohol ethoxylates have a narrow homolog distribution (narrow range ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen nichtionischen Tensiden können auch Fettalkohole mit mehr als 12 EO eingesetzt werden. In addition to these nonionic surfactants, fatty alcohols containing more than 12 EO may also be used. Beispiele hierfür sind (Talg-) Fettalkohole mit 14 EO, 16 EO, 20 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO. Examples thereof are (tallow) fatty alcohols containing 14 EO, 16 EO, 20 EO, 25 EO, 30 EO or 40 EO. Insbesondere in Mitteln für den Einsatz in maschinellen Verfahren werden üblicherweise extrem schaumarme Verbindungen eingesetzt. In particular, in compositions for use in automatic process Extremely low-foaming compounds are normally used. Hierzu zählen vorzugsweise C 12 -C 18 -Alkylpolyethylenglykolpolypropylenglykolether mit jeweils bei zu 8 Mol Ethylenoxid- und Propylenoxideinheiten im Molekül. These preferably include C 12 -C 18 -Alkylpolyethylenglykolpolypropylenglykolether containing up to 8 moles of ethylene oxide and propylene oxide units in the molecule. Man kann aber auch andere bekannt schaumarme nichtionische Tenside verwenden, wie zum Beispiel C 12 -C 1 8 -Alkylpolyethylenglykol-polybutylenglykolether mit jeweils bis zu 8 Mol Ethylenoxid- und Butylenoxideinheiten im Molekül sowie endgruppenverschlossene Alkylpolyalkylenglykolmischether. One can also use other known low-foaming nonionic surfactants such as C 12 -C 1 8 alkyl polyethylene glycol polybutylene each having up to 8 moles of ethylene oxide and butylene oxide units in the molecule and end-capped Alkylpolyalkylenglykolmischether. Besonders bevorzugt sind auch die hydroxylgruppenhaltigen alkoxylierten Alkohole, wie sie in der europäischen Patentanmeldung Particularly preferred are the alkoxylated alcohols containing hydroxyl as described in the European patent application EP 0 300 305 EP 0300305 beschrieben sind, sogenannte Hydroxymischether. described, so-called hydroxy. Zu den nichtionischen Tensiden zählen auch Alkylglykoside der allgemeinen Formel RO(G) x eingesetzt werden, in der R einen primären geradkettigen oder methylverzweigten, insbesondere in 2-Stellung methylverzweigten aliphatischen Rest mit 8 bis 22, vorzugsweise 12 bis 18 C-Atomen bedeutet und G für eine Glykoseeinheit mit 5 oder 6 C-Atomen, vorzugsweise für Glucose, steht. The nonionic surfactants include alkyl glycosides of the formula RO (G) x employed in which R is a primary linear or methyl-branched, more particularly 2-methyl-branched aliphatic radical containing 8 to 22, preferably 12 to 18 carbon atoms and G a glycose unit having 5 or 6 C atoms, preferably for glucose. Der Oligomerisierungsgrad x, der die Verteilung von Monoglykosiden und Oligoglykosiden angibt, ist eine beliebige Zahl – die als analytisch zu bestimmende Größe auch gebrochene Werte annehmen kann – zwischen 1 und 10; The degree of oligomerization x, which indicates the distribution of monoglycosides and oligoglycosides, is any number - which may take as an analytically determined quantity, also fractional values ​​- Between 1 and 10; vorzugsweise liegt x bei 1,2 bis 1,4. x is preferably 1.2 to 1.4. Ebenfalls geeignet sind Polyhydroxyfettsäureamide der Formel (III), in der R 1 CO für einen aliphatischen Acylrest mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, R 2 für Wasserstoff, einen Alkyl- oder Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und [Z] für einen linearen oder verzweigten Polyhydroxyalkylrest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen und 3 bis 10 Hydroxylgruppen steht: Also suitable are polyhydroxy fatty acid amides of the formula (III) in which R 1 CO is an aliphatic acyl radical having 6 to 22 carbon atoms, R 2 represents hydrogen, an alkyl or hydroxyalkyl having 1 to 4 carbon atoms and [Z] is a linear or branched polyhydroxyalkyl having 3 to 10 carbon atoms and 3 to 10 hydroxyl groups:
    Figure 00270001
  • Vorzugsweise leiten sich die Polyhydroxyfettsäureamide von reduzierenden Zuckern mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere von der Glucose ab. Preferably, the polyhydroxy fatty acid amides of reducing sugars having 5 or 6 carbon atoms, more particularly from glucose. Zur Gruppe der Polyhydroxyfettsäureamide gehören auch Verbindungen der Formel (IV), The group of polyhydroxyfatty acid amides also includes compounds of formula (IV),
    Figure 00280001
    in der R 3 für einen linearen oder verzweigten Alkyl- oder Alkenylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, R 4 für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylenrest oder einen Arylenrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen und R 5 für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest oder einen Oxy-Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht, wobei C 1 -C 4 -Alkyl- oder Phenylreste bevorzugt sind, und [Z] für einen linearen Polyhydroxyalkylrest, dessen Alkylkette mit mindestens zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, oder alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder propoxylierte Derivate dieses Restes steht. in which R 3 is a linear or branched alkyl or alkenyl group having 7 to 12 carbon atoms, R 4 is a linear, branched or cyclic alkylene residue or an arylene radical having 2 to 8 carbon atoms and R 5 is a linear, branched or cyclic alkyl group or a aryl group or an oxyalkyl group having 1 to 8 carbon atoms, wherein C 1 -C 4 alkyl or phenyl groups being preferred, and [Z] is a linear polyhydroxyalkyl ethoxylated whose alkyl chain is substituted with at least two hydroxyl groups, or alkoxylated, preferably or propoxylated derivatives of this residue. [Z] wird auch hier vorzugsweise durch reduktive Aminierung eines Zuckers wie Glucose, Fructose, Maltose, Lactose, Galactose, Mannose oder Xylose erhalten. [Z] is preferably obtained here by reductive amination of a sugar such as glucose, fructose, maltose, lactose, galactose, mannose or xylose. Die N-Alkoxy- oder N-Aryloxy-substituierten Verbindungen können dann beispielsweise durch Umsetzung mit Fettsäuremethylestern in Gegenwart eines Alkoxids als Katalysator in die gewünschten Polyhydroxyfettsäureamide überführt werden. The N-alkoxy- or N-aryloxy-substituted compounds may be converted as a catalyst in the desired polyhydroxy then, for example by reaction with fatty acid methyl ester in the presence of an alkoxide. Eine weitere Klasse bevorzugt eingesetzter nichtionischer Tenside, die entweder als alleiniges nichtionisches Tensid oder in Kombination mit anderen nichtionischen Tensiden, insbesondere zusammen mit alkoxylierten Fettalkoholen und/oder Alkylglykosiden, eingesetzt werden, sind alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder ethoxylierte und propoxylierte Fettsäurealkylester, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, insbesondere Fettsäuremethylester. Another class of preferred nonionic surfactants which are used either as sole nonionic surfactant or in combination with other nonionic surfactants, in particular together with alkoxylated fatty alcohols and / or alkyl glycosides, are alkoxylated, preferably ethoxylated or ethoxylated and propoxylated fatty acid alkyl ester, preferably having 1 to 4 carbon atoms in the alkyl chain, especially fatty acid methyl ester. Auch nichtionische Tenside vom Typ der Aminoxide, beispielsweise N-Kokosalkyl-N,N-dimethylaminoxid und N-Talgalkyl-N,N-dihydroxyethylaminoxid, und der Fettsäurealkanolamide können geeignet sein. Nonionic surfactants of the amine oxide type, for example N-cocoalkyl-N, N-dimethylamine oxide and N-tallowalkyl-N, N-dihydroxyethylamine oxide, and the fatty acid alkanolamide may be suitable. Die Menge dieser nichtionischen Tenside beträgt vorzugsweise nicht mehr als die der ethoxylierten Fettalkohole, insbesondere nicht mehr als die Hälfte davon. The amount of these nonionic surfactants is preferably not more than that of the ethoxylated fat alcohols, especially not more than half of them. Als weitere Tenside kommen sogenannte Gemini-Tenside in Betracht. Other suitable surfactants are so-called Gemini surfactants can be considered. Hierunter werden im Allgemeinen solche Verbindungen verstanden, die zwei hydrophile Gruppen pro Molekül besitzen. Among such compounds are generally understood that possess two hydrophilic groups per molecule. Diese Gruppen sind in der Regel durch einen sogenannten ”Spacer” voneinander getrennt. These groups are separated from each other generally by a so-called "spacer". Dieser Spacer ist in der Regel eine Kohlenstoffkette, die lang genug sein sollte, dass die hydrophilen Gruppen einen ausreichenden Abstand haben, damit sie unabhängig voneinander agieren können. This spacer is usually a carbon chain which should be long enough that the hydrophilic groups are a sufficient distance so that they can act independently. Derartige Tenside zeichnen sich im Allgemeinen durch eine ungewöhnlich geringe kritische Micellkonzentration und die Fähigkeit, die Oberflächenspannung des Wassers stark zu reduzieren, aus. Such surfactants are generally characterized by an unusually low critical micelle concentration and the ability to greatly reduce the surface tension of the water from. In Ausnahmefällen werden unter dem Ausdruck Gemini-Tenside nicht nur derartig ”dimere”, sondern auch entsprechend ”trimere” Tenside verstanden. In exceptional cases, the expression gemini surfactants not only such "dimeric" but also "trimeric" surfactants. Geeignete Gemini-Tenside sind beispielsweise sulfatierte Hydroxymischether oder Dimeralkohol-bis- und Trimeralkohol-tris-sulfate und -ethersulfate. Suitable gemini surfactants are sulfated hydroxy mixed ethers, for example, or dimer alcohol bis- and trimer alcohol tris-sulfates and ether sulfates. Endgruppenverschlossene dimere und trimere Mischether zeichnen sich insbesondere durch ihre Bi- und Multifunktionalität aus. End-capped dimeric and trimeric mixed distinguished in particular by their bi- and multifunctionality. So besitzen die genannten endgruppenverschlossenen Tenside gute Netzeigenschaften und sind dabei schaumarm, so dass sie sich insbesondere für den Einsatz in maschinellen Wasch- oder Reinigungsverfahren eignen. So the end-capped surfactants have good wetting properties and are low-foaming, so they are particularly suitable for use in machine washing or cleaning processes. Eingesetzt werden können aber auch Gemini-Polyhydroxyfettsäureamide oder Poly-Polyhydroxyfettsäureamide. but can also be used Gemini acid amides or poly-polyhydroxy. Geeignet sind auch die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid ethoxylierten geradkettigen oder verzweigten C 7 -C 21 -Alkohole, wie 2-Methylverzweigte C 9 -C 11 -Alkohole mit im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder C 12 -C 18 -Fettalkohole mit 1 bis 4 EO. Also suitable are the Schwefelsäuremonoester the ethoxylated with 1 to 6 moles of ethylene oxide, linear or branched C 7 -C 21 alcohols, such as 2-methyl-branched C 9 -C 11 alcohols containing on average 3.5 mol ethylene oxide (EO) or C 12 - C 18 fatty alcohols with 1 to 4 EO. Zu den bevorzugten Aniontensiden gehören auch die Salze der Alkylsulfobernsteinsäure, die auch als Sulfosuccinate oder als Sulfobernsteinsäureester bezeichnet werden, und die Monoester und/oder Diester der Sulfobernsteinsäure mit Alkoholen, vorzugsweise Fettalkoholen und insbesondere ethoxylierten Fettalkoholen darstellen. The preferred anionic surfactants include the salts of alkylsulfosuccinic acid, which are also known as sulfosuccinates or as sulfosuccinic acid esters and the Monoester and / or diesters of sulfosuccinic acid with alcohols, preferably fatty alcohols and especially ethoxylated fatty alcohols include, represent. Bevorzugte Sulfosuccinate enthalten C 8 - bis C 18 -Fettalkoholreste oder Mischungen aus diesen. Preferred sulfosuccinates contain C 8 - C 18 fatty alcohol radicals or mixtures thereof. Insbesondere bevorzugte Sulfosuccinate enthalten einen Fettalkoholrest, der sich von ethoxylierten Fettalkoholen ableitet, die für sich betrachtet nichtionische Tenside darstellen. Particularly preferred sulfosuccinates contain a fatty alcohol radical derived from ethoxylated fatty alcohols which, considered in isolation, represent nonionic surfactants. Dabei sind wiederum Sulfosuccinate, deren Fettalkohol-Reste sich von ethoxylierten Fettalkoholen mit eingeengter Homologenverteilung ableiten, besonders bevorzugt. Of these sulfosuccinates whose fatty alcohol radicals are derived from ethoxylated fatty alcohols with a narrow homolog distribution are particularly preferred. Ebenso ist es auch möglich, Alk(en)ylbernsteinsäure mit vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatomen in der Alk(en)ylkette oder deren Salze einzusetzen. Likewise, it is also possible to use alk (en) yl succinic acid preferably containing 8 to 18 carbon atoms in the alk (en) yl chain or salts thereof. Als weitere anionische Tenside kommen Fettsäure-Derivate von Aminosäuren, beispielsweise von N-Methyltaurin (Tauride) und/oder von N-Methylglycin (Sarkoside) in Betracht. Other suitable anionic surfactants are fatty acid derivatives of amino acids, such as N-methyl taurine (taurides) and / or N-methylglycine (sarcosides) into consideration. Insbesondere bevorzugt sind dabei die Sarkoside beziehungsweise die Sarkosinate und hier vor allem Sarkosinate von höheren und gegebenenfalls einfach oder mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie Oleylsarkosinat. Particularly preferred are the Sarcosides or sarcosinates, above all sarcosinates of higher and optionally mono- or polyunsaturated fatty acids, such as oleyl are. Als weitere anionische Tenside kommen insbesondere Seifen in Betracht. Other anionic surfactants in particular, soaps. Geeignet sind insbesondere gesättigte Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, hydrierten Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere aus natürlichen Fettsäuren, zum Beispiel Kokos-, Palmkern- oder Talgfettsäuren, abgeleitete Seifengemische. Particularly suitable are saturated fatty acid soaps, such as the salts of lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, hydrogenated erucic acid and behenic acid, and in particular from natural fatty acids, for example coconut, palm kernel or tallow soap mixtures derived. Zusammen mit diesen Seifen oder als Ersatzmittel für Seifen können auch die bekannten Alkenylbernsteinsäuresalze eingesetzt werden. Along with these soaps or as a substitute for soaps also known alkenylsuccinic acid salts can be used.
  • Die anionischen Tenside, einschließlich der Seifen, können in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze sowie als lösliche Salze organischer Basen, wie Mono-, Di- oder Triethanolamin, vorliegen. The anionic surfactants, including the soaps, may be present in the form of their sodium, potassium or ammonium salts and as soluble salts of organic bases such as mono-, di- or triethanolamine. Vorzugsweise liegen die anionischen Tenside in Form ihrer Natrium- oder Kaliumsalze, insbesondere in Form der Natriumsalze vor. Preferably, the anionic surfactants are in the form of their sodium or potassium salts, in particular in the form of the sodium salts.
  • Tenside sind in erfindungsgemäßen Mitteln in Mengenanteilen von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von 8 Gew.-% bis 30 Gew.-%, enthalten. Surfactants are agents of the invention in proportions of preferably 5 wt .-% to 50 wt .-%, particularly 8 wt .-% to 30 wt .-%, of.
  • Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält vorzugsweise mindestens einen wasserlöslichen und/oder wasserunlöslichen, organischen und/oder anorganischen Builder. An agent of the invention preferably contains at least one water-soluble and / or water-insoluble, organic and / or inorganic builders. Zu den wasserlöslichen organischen Buildersubstanzen gehören Polycarbonsäuren, insbesondere Citronensäure und Zuckersäuren, monomere und polymere Aminopolycarbonsäuren, insbesondere Methylglycindiessigsäure, Nitrilotriessigsäure und Ethylendiamintetraessigsäure sowie Polyasparaginsäure, Polyphosphonsäuren, insbesondere Aminotris(methylenphosphonsäure), Ethylendiamintetrakis(methylenphosphonsäure) und 1-Hydroxyethan-1,1-diphosphonsäure, polymere Hydroxyverbindungen wie Dextrin sowie polymere (Poly-)carbonsäuren, insbesondere die durch Oxidation von Polysacchariden beziehungsweise Dextrinen zugänglichen Polycarboxylate, polymere Acrylsäuren, Methacrylsäuren, Maleinsäuren und Mischpolymere aus diesen, die auch geringe Anteile polymerisierbarer Substanzen ohne Carbonsäurefunktionalität einpolymerisiert enthalten können. The water-soluble organic builders include polycarboxylic acids, particularly citric acid and sugar acids, monomeric and polymeric aminopolycarboxylic acids, in particular methylglycinediacetic acid, nitrilotriacetic acid and ethylenediaminetetraacetic acid and polyaspartic acid, polyphosphonic acids, especially amino-tris (methylenephosphonic acid), ethylenediaminetetrakis (methylenephosphonic acid) and 1-hydroxyethane-1,1-diphosphonic acid, polymeric hydroxy compounds such as dextrin as well as polymeric (poly) carboxylic acids, in particular obtainable by oxidation of polysaccharides or dextrins polycarboxylates, polymeric acrylic acids, methacrylic acids, maleic acids and copolymers thereof which may also contain, polymerized small amounts of polymerizable substances with no carboxylic acid functionality. Die relative Molekülmasse der Homopolymeren ungesättiger Carbonsäuren liegt im allgemeinen zwischen 3 000 und 200 000, die der Copolymeren zwischen 2 000 und 200 000, vorzugsweise 30 000 bis 120 000, jeweils bezogen auf freie Säure. The molecular weight of the homopolymers of unsaturated carboxylic acids is generally from 3000 to 200,000, that of the copolymers 2000-200000, preferably from 30,000 to 120,000, based on free acid. Ein besonders bevorzugtes Acrylsäure-Maleinsäure-Copolymer weist eine relative Molekülmasse von 30 000 bis 100 000 auf. A particularly preferred acrylic acid-maleic acid copolymer has a relative molecular weight from 30,000 to 100,000. Handelsübliche Produkte sind zum Beispiel Sokalan ® CP 5, CP 10 und PA 30 der Firma BASF. Commercial products are, for example Sokalan ® CP 5, CP 10 and PA 30 from BASF. Geeignete, wenn auch weniger bevorzugte Verbindungen dieser Klasse sind Copolymere der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Vinylethern, wie Vinylmethylethern, Vinylester, Ethylen, Propylen und Styrol, in denen der Anteil der Säure mindestens 50 Gew.-% beträgt. Suitable, but less preferred compounds of this class are copolymers of acrylic acid or methacrylic acid with vinyl ethers, such as vinyl, Vinylester, ethylene, propylene and styrene, in which the proportion of the acid is at least 50 wt .-%. Als wasserlösliche organische Buildersubstanzen können auch Terpolymere eingesetzt werden, die als Monomere zwei ungesättigte Säuren und/oder deren Salze sowie als drittes Monomer Vinylalkohol und/oder einem veresterten Vinylalkohol oder ein Kohlenhydrat enthalten. As the water-soluble organic builders are terpolymers may be used as monomers containing two unsaturated acids and / or their salts and as third monomer, vinyl alcohol and / or an esterified vinyl alcohol or a carbohydrate. Das erste saure Monomer beziehungsweise dessen Salz leitet sich von einer monoethylenisch ungesättigten C 3 -C 8 -Carbonsäure und vorzugsweise von einer C 3 -C 4 -Monocarbonsäure, insbesondere von (Meth)-acrylsäure ab. The first acidic monomer or its salt is derived from a monoethylenically unsaturated C 3 -C 8 carboxylic acid and preferably from a C 3 -C 4 monocarboxylic acid, in particular (meth) acrylic acid. Das zweite saure Monomer beziehungsweise dessen Salz kann ein Derivat einer C 4 -C 8 -Dicarbonsäure, wobei Maleinsäure besonders bevorzugt ist, und/oder ein Derivat einer Allylsulfonsäure, die in 2-Stellung mit einem Alkyl- oder Arylrest substituiert ist, sein. The second acidic monomer or its salt may be a derivative of a C 4 -C 8 -dicarboxylic acid, maleic acid being particularly preferred, and / or a derivative of an allyl sulfonic acid substituted in the 2-position with an alkyl or aryl radical. Derartige Polymere weisen im Allgemeinen eine relative Molekülmasse zwischen 1 000 und 200 000 auf. Such polymers generally have a molecular weight from 1000 to 200,000. Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die als Monomere vorzugsweise Acrolein und Acrylsäure/Acrylsäuresalze beziehungsweise Vinylacetat aufweisen. Other preferred copolymers are those which contain as monomers, acrolein and acrylic acid / acrylic acid salts or vinyl acetate. Die organischen Buildersubstanzen können, insbesondere zur Herstellung flüssiger Mittel, in Form wäßriger Lösungen, vorzugsweise in Form 30- bis 50-gewichtsprozentiger wäßriger Lösungen eingesetzt werden. in the form of aqueous solutions, preferably in the form of the organic builder substances can be used 30 to 50 percent strength by weight aqueous solutions, particularly for the production of liquid detergents. Alle genannten Säuren werden in der Regel in Form ihrer wasserlöslichen Salze, insbesondere ihre Alkalisalze, eingesetzt. All said acids are generally used in the form of their water-soluble salts, particularly their alkali metal salts.
  • Derartige organische Buildersubstanzen können gewünschtenfalls in Mengen bis zu 40 Gew.-%, insbesondere bis zu 25 Gew.-% und vorzugsweise von 1 Gew.-% bis 8 Gew.-% enthalten sein. Such organic builder substances may, if desired, in amounts up to 40 wt .-%, in particular up to 25 wt .-%, and contain preferably from 1 wt .-% to 8 wt .-%. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in pastenförmigen oder flüssigen, insbesondere wasserhaltigen, erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt. Quantities near the upper limit mentioned are preferably used in paste-form or liquid, more particularly water-containing agents of the invention.
  • Als wasserlösliche anorganische Buildermaterialien kommen insbesondere Alkalisilikate, Alkalicarbonate und Alkaliphosphate, die in Form ihrer alkalischen, neutralen oder sauren Natrium- oder Kaliumsalze vorliegen können, in Betracht. As the water-soluble inorganic builder materials are in particular alkali metal silicates, alkali metal carbonates and alkali metal phosphates which may be present in the form of their alkaline, neutral or acidic sodium or potassium salts, are also suitable. Beispiele hierfür sind Trinatriumphosphat, Tetranatriumdiphosphat, Dinatriumdihydrogendiphosphat, Pentanatriumtriphosphat, sogenanntes Natriumhexametaphosphat, oligomeres Trinatriumphosphat mit Oligomerisierungsgraden von 5 bis 1000, insbesondere 5 bis 50, sowie die entsprechenden Kaliumsalze beziehungsweise Gemische aus Natrium- und Kaliumsalzen. Examples include trisodium phosphate, tetrasodium diphosphate, disodium dihydrogen diphosphate, pentasodium triphosphate, so-called sodium hexametaphosphate, trisodium phosphate oligomer with degrees of oligomerization of 5 to 1000, particularly 5 to 50, and the corresponding potassium salts or mixtures of sodium and potassium salts. Als wasserunlösliche, wasserdispergierbare anorganische Buildermaterialien werden insbesondere kristalline oder amorphe Alkalialumosilikate, in Mengen von bis zu 50 Gew.-%, vorzugsweise nicht über 40 Gew.-% und in flüssigen Mitteln insbesondere von 1 Gew.-% bis 5 Gew.-%, eingesetzt. Suitable water-insoluble, water-dispersible inorganic builders are alkali metal aluminosilicates, in particular crystalline or amorphous, in amounts of up to 50 wt .-%, preferably not more than 40 wt .-%, and in liquid compositions and in particular of 1 wt .-% to 5 wt .-%, used. Unter diesen sind die kristallinen Natriumalumosilikate in Waschmittelqualität, insbesondere Zeolith A, P und gegebenenfalls X, allein oder in Mischungen, beispielsweise in Form eines Co-Kristallisats aus den Zeolithen A und X (Vegobond ® AX, ein Handelsprodukt der Condea Augusts S. p. A.), bevorzugt. Among these, the crystalline sodium aluminosilicates in detergent quality, more particularly zeolite A, P and optionally X, alone or in mixtures, for example in the form of a co-crystals of zeolites A and X (VEGOBOND ® AX, a commercial product of Condea August S. p. A.) is preferred. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in festen, teilchenförmigen Mitteln eingesetzt. Quantities near the upper limit mentioned are preferably used in solid particulate compositions. Geeignete Alumosilikate weisen insbesondere keine Teilchen mit einer Korngröße über 30 μm auf und bestehen vorzugsweise zu wenigstens 80 Gew.-% aus Teilchen mit einer Größe unter 10 μm. Suitable alumosilicates contain no particles having a particle size of about 30 microns and preferably consist of at least 80 wt .-% of particles having a size below 10 microns. Ihr Calciumbindevermögen, das nach den Angaben der deutschen Patentschrift Their calcium binding capacity, which according to the data of the German Patent DE 24 12 837 DE 24 12 837 bestimmt werden kann, liegt in der Regel im Bereich von 100 bis 200 mg CaO pro Gramm. can be determined, is generally in the range of 100 to 200 mg CaO per gram.
  • Geeignete Substitute beziehungsweise Teilsubstitute für das genannte Alumosilikat sind kristalline Alkalisilikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können. Suitable substitutes or partial substitutes for the alumosilicate mentioned are crystalline alkali metal silicates which may be present alone or in admixture with amorphous silicates. Die in den erfindungsgemäßen Mitteln als Gerüststoffe brauchbaren Alkalisilikate weisen vorzugsweise ein molares Verhältnis von Alkalioxid zu SiO 2 unter 0,95, insbesondere von 1:1,1 bis 1:12 auf und können amorph oder kristallin vorliegen. The use as builders in the inventive alkali metal silicates preferably have a molar ratio of alkali metal oxide to SiO 2 of less than 0.95, in particular from 1: 1.1 to 1:12 and may be present in amorphous or crystalline. Bevorzugte Alkalisilikate sind die Natriumsilikate, insbesondere die amorphen Natriumsilikate, mit einem molaren Verhältnis Na 2 O:SiO 2 von 1:2 bis 1:2,8. Preferred alkali metal silicates are the sodium silicates, more particularly amorphous sodium silicates, with a molar ratio Na 2 O: SiO 2 of 1: 2 to 1: 2.8. Als kristalline Silikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können, werden vorzugsweise kristalline Schichtsilikate der allgemeinen Formel Na 2 Si x O 2x+1 ·yH 2 O eingesetzt, in der x, das sogenannte Modul, eine Zahl von 1,9 bis 22, insbesondere 1,9 bis 4 und y eine Zahl von 0 bis 33 ist und bevorzugte Werte für x 2, 3 oder 4 sind. The crystalline silicates which may be present alone or in admixture with amorphous silicates, are crystalline layer silicates with the general formula Na 2 Si x O 2x + 1 · are used yH 2 O, in which x, the so-called module, a number from 1.9 is up to 22, in particular 1.9 to 4 and y is a number from 0 to 33, preferred values ​​for x being 2, 3 or. 4 Bevorzugte kristalline Schichtsilikate sind solche, bei denen x in der genannten allgemeinen Formel die Werte 2 oder 3 annimmt. Preferred crystalline layer silicates are those in which x assumes in said general formula the values ​​2 or the third Insbesondere sind sowohl β- als auch δ-Natriumdisilikate (Na 2 Si 2 O 5 ·yH 2 O) bevorzugt. In particular, both β- and δ-sodium (Na 2 Si 2 O 5 · yH 2 O) are preferred. Auch aus amorphen Alkalisilikaten hergestellte, praktisch wasserfreie kristalline Alkalisilikate der obengenannten allgemeinen Formel, in der x eine Zahl von 1,9 bis 2,1 bedeutet, können in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt werden. prepared from amorphous alkali silicates, practically water-free crystalline alkali metal silicates of the abovementioned general formula in which x is a number from 1.9 to 2.1 can be used in the inventive compositions. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel wird ein kristallines Natriumschichtsilikat mit einem Modul von 2 bis 3 eingesetzt, wie es aus Sand und Soda hergestellt werden kann. In a further preferred embodiment according to the invention, a crystalline sodium layered silicate with a modulus of 2 to 3, as it can be made of sand and soda. Kristalline Natriumsilikate mit einem Modul im Bereich von 1,9 bis 3,5 werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel eingesetzt. Crystalline sodium silicates with a modulus in the range from 1.9 to 3.5 are used in another preferred embodiment of inventive compositions. Kristalline schichtförmige Silikate der oben angegebenen Formel (I) werden von der Fa. Clariant GmbH unter dem Handelsnamen Na-SKS vertrieben, z. Crystalline layered silicates corresponding to the above formula (I) are sold by the company. Clariant GmbH under the trade name Na-SKS, for example. B. Na-SKS-1 (Na 2 Si 22 O 45 ·xH 2 O, Kenyait), Na-SKS-2 (Na 2 Si 14 O 29 ·xH 2 O, Magadiit), Na-SKS-3 (Na 2 Si 8 O 17 ·xH 2 O) oder Na-SKS-4 (Na 2 Si 4 O 9 ·xH 2 O, Makatit). (B. Na-SKS-1 (Na 2 Si 22 O 45 · xH 2 O, kenyaite), Na-SKS-2 (Na 2 Si 14 O 29 · xH 2 O, magadiite), Na-SKS-3 Na 2 Si 8 O 17 .xH 2 O) or Na-SKS-4 (Na 2 Si 4 O 9 · xH 2 O, makatite). Von diesen eignen sich vor allem Na-SKS-5 (α-Na 2 Si 2 O 5 ), Na-SKS-7 (β-Na 2 Si 2 O 5 , Natrosilit), Na-SKS-9 (NaHSi 2 O 5 ·3H 2 O), Na-SKS-10 (NaHSi 2 O 5 ·3H 2 O, Kanemit), Na-SKS-11 (t-Na 2 Si 2 O 5 ) und Na-SKS-13 (NaHSi 2 O 5 ), insbesondere aber Na-SKS-6 (δ-Na 2 Si 2 O 5 ). Among these are in particular Na-SKS-5 (α-Na 2 Si 2 O 5), Na-SKS-7 (β-Na 2 Si 2 O 5, natrosilite), Na-SKS-9 (NaHSi 2 O 5 · 3H 2 O), Na-SKS-10 (NaHSi 2 O 5 · 3H 2 O, kanemite), Na-SKS-11 (t-Na 2 Si 2 O 5) and Na-SKS-13 (NaHSi 2 O 5 ), but in particular Na-SKS-6 (δ-Na 2 Si 2 O 5). In einer bevorzugten Ausgestaltung erfindungsgemäßer Mittel setzt man ein granulares Compound aus kristallinem Schichtsilikat und Citrat, aus kristallinem Schichtsilikat und oben genannter (co-)polymerer Polycarbonsäure, oder aus Alkalisilikat und Alkalicarbonat ein, wie es beispielsweise unter dem Namen Nabion ® 15 im Handel erhältlich ist. In a preferred embodiment of inventive compositions is a granular compound of crystalline phyllosilicate and citrate, of crystalline layered silicate and aforementioned (co) polymeric polycarboxylic acid or of alkali silicate and alkali metal as it is available, for example under the name Nabion ® 15 commercially ,
  • Buildersubstanzen sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise in Mengen bis zu 75 Gew.-%, insbesondere 5 Gew.-% bis 50 enthalten. Builders are preferably included in the inventive compositions in amounts up to 75 wt .-%, particularly 5 wt .-% to 50th
  • Als für den Einsatz in erfindungsgemäßen Mitteln geeignete Persauerstoffverbindungen kommen insbesondere organische Persäuren beziehungsweise persaure Salze organischer Säuren, wie Phthalimidopercapronsäure, Perbenzoesäure oder Salze der Diperdodecandisäure, Wasserstoffperoxid und unter den Waschbedingungen Wasserstoffperoxid abgebende anorganische Salze, zu denen Perborat, Percarbonat, Persilikat und/oder Persulfat wie Caroat gehören, in Betracht. As for the use in inventive compositions suitable peroxygen compounds especially organic peracids or peracid salts of organic acids such as phthalimidopercaproic, perbenzoic acid or salts of diperdodecanedioic acid, hydrogen peroxide and under the washing conditions release hydrogen peroxide inorganic salts, including perborate, percarbonate, persilicate and / or persulfate such as Caroat® belong, into consideration. Sofern feste Persauerstoffverbindungen eingesetzt werden sollen, können diese in Form von Pulvern oder Granulaten verwendet werden, die auch in im Prinzip bekannter Weise umhüllt sein können. If solid peroxygen compounds are to be used, they can be used in the form of powders or granules, the manner known in principle can also be encapsulated. Falls ein erfindungsgemäßes Mittel Persauerstoffverbindungen enthält, sind diese in Mengen von vorzugsweise bis zu 50 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 30 Gew.-%, vorhanden. If an agent of the invention contains peroxygen compounds, they are present in amounts of preferably up to 50 wt .-%, particularly 5 wt .-% to 30 wt .-%, yet. Der Zusatz geringer Mengen bekannter Bleichmittelstabilisatoren wie beispielsweise von Phosphonaten, Borsten beziehungsweise Metaboraten und Metasilikaten sowie Magnesiumsalzen wie Magnesiumsulfat kann zweckdienlich sein. The addition of small amounts of known bleach stabilizers, for example phosphonates, bristles or metabolites and metasilicates and magnesium salts such as magnesium sulfate, may be appropriate.
  • Als Bleichaktivatoren können Verbindungen, die unter Perhydrolysebedingungen aliphatische Peroxocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder gegebenenfalls substituierte Perbenzoesäure ergeben, eingesetzt werden. Suitable bleach activators are compounds which, under perhydrolysis conditions produce aliphatic peroxocarboxylic acids preferably containing 1 to 10 carbon atoms, especially 2 to 4 carbon atoms, and / or optionally substituted perbenzoic acid, can be used. Geeignet sind Substanzen, die O- und/oder N-Acylgruppen der genannten C-Atomzahl und/oder gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppen tragen. Suitable substances which carry O- and / or N-acyl groups of said number of carbon atoms and / or optionally substituted benzoyl groups. Bevorzugt sind mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere Tetraacetylethylendiamin (TAED), acylierte Triazinderivate, insbesondere 1,5-Diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazin (DADHT), acylierte Glykolurile, insbesondere Tetraacetylglykoluril (TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoylsuccinimid (NOSI), acylierte Phenolsulfonate, insbesondere n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- bzw. iso-NOBS), Carbonsäureanhydride, insbesondere Phthalsäureanhydrid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere Triacetin, Ethylenglykoldiacetat, 2,5-Diacetoxy-2,5-dihydrofuran und Enolester sowie acetyliertes Sorbitol und Mannitol beziehungsweise deren beschriebene Mischungen (SORMAN), acylierte Zuckerderivate, insbesondere Pentaacetylglukose (PAG), Pentaacetylfruktose, Tetraacetylxylose und Octaacetyllactose sowie acetyliertes, gegebenenfalls N-alkyliertes Glucamin und Gluconolacton, und/oder N-acylierte Lactame, beispielsweise N-Benzoylcaprolactam. Preference is given to polyacylated alkylenediamines, especially tetraacetylethylenediamine (TAED), acylated triazine derivatives, especially 1,5-diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazine (DADHT), acylated glycolurils, in particular tetraacetylglycoluril (TAGU), N- acylimides, in particular N-nonanoylsuccinimide (NOSI), acylated phenol sulfonates, more particularly n-nonanoyl or isononanoyloxybenzenesulfonate (n- or iso-NOBS), carboxylic anhydrides, in particular phthalic anhydride, acylated polyhydric alcohols, especially triacetin, ethylene glycol diacetate, 2,5-diacetoxy 2,5-dihydrofuran and the enol esters and acetylated sorbitol and mannitol and the described mixtures (SORMAN), acylated sugar derivatives, especially pentaacetylglucose (PAG), pentaacetyl fructose, tetraacetyl xylose and octaacetyl lactose and acetylated, optionally N-alkylated glucamine and gluconolactone, and / or N acylated lactams, for example N-benzoyl caprolactam. Die hydrophil substituierten Acylacetale und die Acyllactame werden ebenfalls bevorzugt eingesetzt. The hydrophilically substituted acyl acetals and the acyl lactams are also preferably used. Auch Kombinationen konventioneller Bleichaktivatoren können eingesetzt werden. Combinations of conventional bleach activators may be used. Derartige Bleichaktivatoren können, insbesondere bei Anwesenheit obengenannter Wasserstoffperoxid-liefernder Bleichmittel, im üblichen Mengenbereich, vorzugsweise in Mengen von 0,5 Gew.-% bis 10 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis 8 Gew.-%, bezogen auf gesamtes Mittel, enthalten sein, fehlen bei Einsatz von Percarbonsäure als alleinigem Bleichmittel jedoch vorzugsweise ganz. Such bleach activators, especially in the presence of the above-mentioned hydrogen peroxide-releasing bleaching agents in the usual quantities, preferably in quantities of 0.5 wt .-% to 10 wt .-%, particularly 1 wt .-% to 8 wt .-%, based overall composition be present but absent when percarboxylic acid as the sole bleaching agent preferably entirely.
  • Zusätzlich zu den konventionellen Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können auch Sulfonimine und/oder bleichverstärkende Übergangsmetallsalze beziehungsweise Übergangsmetallkomplexe als sogenannte Bleichkatalysatoren enthalten sein. In addition to the conventional bleach activators or instead of them, sulfone and / or bleach-boosting transition metal salts or transition metal complexes may be present as so-called bleach catalysts.
  • Zu den in den erfindungsgemäßen Mitteln, insbesondere wenn sie in flüssiger oder pastöser Form vorliegen, neben Wasser verwendbaren organischen Lösungsmitteln gehören Alkohole mit 1 bis 4 C-Atomen, insbesondere Methanol, Ethanol, Isopropanol und tert.-Butanol, Diole mit 2 bis 4 C-Atomen, insbesondere Ethylenglykol und Propylenglykol, sowie deren Gemische und die aus den genannten Verbindungsklassen ableitbaren Ether. To the invention in the compositions, especially when they are present in liquid or paste form, be used in addition to water organic solvents include alcohols having 1 to 4 carbon atoms, especially methanol, ethanol, isopropanol and tert-butanol, diols having from 2 to 4 C -atoms, especially ethylene glycol and propylene glycol, and mixtures thereof and the derivable from the aforesaid compound classes ether. Derartige wassermischbare Lösungsmittel sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise in Mengen nicht über 30 Gew.-%, insbesondere von 6 Gew.-% bis 20 Gew.-%, vorhanden. Such water-miscible solvents are present in the agents in amounts of preferably not more than 30 wt .-%, particularly 6 wt .-% to 20 wt .-%, yet.
  • Zur Einstellung eines gewünschten, sich durch die Mischung der übrigen Komponenten nicht von selbst ergebenden pH-Werts können die erfindungsgemäßen Mittel system- und umweltverträgliche Säuren, insbesondere Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Apfelsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure und/oder Adipinsäure, aber auch Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure, oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide, enthalten. To establish a desired, is not self-resultant pH of the inventive compositions may system- and environmentally safe acids, particularly citric acid, acetic acid, tartaric acid, malic acid, lactic acid, glycolic acid, succinic acid, glutaric acid and / or adipic acid, by mixing the other components but also mineral acids, particularly sulfuric acid, or bases, particularly ammonium or alkali metal hydroxides. Derartige pH-Regulatoren sind in den erfindungsgemäßen Mitteln in Mengen von vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%, enthalten. Such pH adjusters are present in the agents in amounts of preferably not more than 20 wt .-%, particularly from 1.2 wt .-% to 17 wt .-%, of.
  • Vergrauungsinhibitoren haben die Aufgabe, den von der Textilfaser abgelösten Schmutz in der Flotte suspendiert zu halten. Graying inhibitors have the task of keeping suspended detached from the textile fiber dirt in the fleet. Hierzu sind wasserlösliche Kolloide meist organischer Natur geeignet, beispielsweise Stärke, Leim, Gelatine, Salze von Ethercarbonsäuren oder Ethersulfonsäuren der Stärke oder der Cellulose oder Salze von sauren Schwefelsäureestern der Cellulose oder der Stärke. Water-soluble colloids usually of an organic nature are suitable, for example starch, glue, gelatin, salts of ether carboxylic acids or ether sulfonic acids of starch or cellulose or salts of acidic Schwefelsäureestern of cellulose or starch. Auch wasserlösliche, saure Gruppen enthaltende Polyamide sind für diesen Zweck geeignet. Water-soluble polyamides containing acid groups are suitable for this purpose. Weiterhin lassen sich andere als die obengenannten Stärkederivate verwenden, zum Beispiel Aldehydstärken. Furthermore, other than the abovementioned starch derivatives can be used, for example aldehyde. Bevorzugt werden Celluloseether, wie Carboxymethylcellulose (Na-Salz), Methylcellulose, Hydroxyalkylcellulose und Mischether, wie Methylhydroxyethylcellulose, Methylhydroxypropylcellulose, Methylcarboxymethylcellulose und deren Gemische, beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Mittel, eingesetzt. Preferred are cellulose ethers such as carboxymethyl cellulose (Na salt), methyl cellulose, hydroxyalkyl cellulose, and mixed ethers, such as methylhydroxyethylcellulose, methylhydroxypropylcellulose, methyl carboxymethyl cellulose and mixtures thereof, for example, in amounts of from 0.1 to 5 wt .-%, based on the agent.
  • Erfindungsgemäße Textilwaschmittel können als optische Aufheller beispielsweise Derivate der Diaminostilbendisulfonsäure beziehungsweise deren Alkalimetallsalze enthalten, obgleich sie für den Einsatz als Colorwaschmittel vorzugsweise frei von optischen Aufhellern sind. Laundry detergents according to the invention may contain, for example, derivatives of diaminostilbene disulfonic acid or alkali metal salts, although they are preferably free of optical brighteners for use as color detergents as an optical brightener. Geeignet sind zum Beispiel Salze der 4,4'-Bis(2-anilino-4-morpholino-1,3,5-triazinyl-6-amino)stilben-2,2'-disulfonsäure oder gleichartig aufgebaute Verbindungen, die anstelle der Morpholino-Gruppe eine Diethanolaminogruppe, eine Methylaminogruppe, eine Anilinogruppe oder eine 2-Methoxyethylaminogruppe tragen. Suitable are, for example, salts of 4,4'-bis (2-anilino-4-morpholino-1,3,5-triazinyl-6-amino) stilbene-2,2'-disulfonic acid or compounds of similar structure, instead of the morpholino group a diethanolamino, a methylamino group, an anilino group or a 2-methoxyethylamino carry. Weiterhin können Aufheller vom Typ der substituierten Diphenylstyryle anwesend sein, zum Beispiel die Alkalisalze des 4,4'-Bis(2-sulfostyryl)-diphenyls, 4,4'-Bis(4-chlor-3-sulfostyryl)-diphenyls, oder 4-(4-Chlorstyryl)-4'-(2-sulfostyryl)-diphenyls. Brighteners of the substituted diphenyl styryl type, for example alkali metal salts of 4,4'-bis (2-sulfostyryl), 4,4'-bis (4-chloro-3-sulfostyryl) or 4 - (4-chlorostyryl) -4 '- (2-sulfostyryl). Auch Gemische der vorgenannten optischen Aufheller können verwendet werden. Mixtures of the above-mentioned optical brighteners may be used.
  • Insbesondere beim Einsatz in maschinellen Verfahren kann es von Vorteil sein, den Mitteln übliche Schauminhibitoren zuzusetzen. In particular, when used in automatic processes, it may be of advantage to add typical foam inhibitors. Als Schauminhibitoren eignen sich beispielsweise Seifen natürlicher oder synthetischer Herkunft, die einen hohen Anteil an C 18 -C 24 -Fettsäuren aufweisen. Suitable foam inhibitors are, for example, soaps of natural or synthetic origin which have a high proportion of C 18 -C 24 fatty acids. Geeignete nichttensidartige Schauminhibitoren sind beispielsweise Organopolysiloxane und deren Gemische mit mikrofeiner, gegebenenfalls silanierter Kieselsäure sowie Paraffine, Wachse, Mikrokristallinwachse und deren Gemische mit silanierter Kieselsäure oder Bisfettsäurealkylendiamiden. Suitable non-active foam inhibitors are, for example, organopolysiloxanes and mixtures thereof with microfine, optionally silanized silica and also paraffins, waxes, microcrystalline waxes and mixtures thereof with silanized silica or Bisfettsäurealkylendiamiden. Mit Vorteilen werden auch Gemische aus verschiedenen Schauminhibitoren verwendet, zum Beispiel solche aus Silikonen, Paraffinen oder Wachsen. With advantages also mixtures of different foam inhibitors, for example mixtures of silicones, paraffins or waxes. Vorzugsweise sind die Schauminhibitoren, insbesondere Silikon- und/oder Paraffin-haltige Schauminhibitoren, an eine granulare, in Wasser lösliche beziehungsweise dispergierbare Trägersubstanz gebunden. Preferably, the foam inhibitors, more particularly silicone- and / or paraffin-containing foam inhibitors, to a granular-soluble or dispersible carrier material in water. Insbesondere sind dabei Mischungen aus Paraffinen und Bistearylethylendiamid bevorzugt. Mixtures of paraffins and bis-stearyl ethylenediamide are preferred.
  • Die zu wählenden Inhaltsstoffe wie auch die Bedingungen, unter denen das Mittel eingesetzt wird, wie beispielsweise Temperatur, pH-Wert, Ionenstärke, Redox-Verhältnisse oder mechanische Einflüsse, sollten für das jeweilige Reinigungsproblem optimiert sein. The ingredients to be chosen as well as the conditions under which the agent is employed, such as temperature, pH, ionic strength, redox conditions or mechanical influences should be optimized for the particular cleaning problem. So liegen übliche Temperaturen für Wasch- und Reinigungsmittel in Bereichen von 10°C über 40°C und 60°C bis hin zu 95° bei maschinellen Mitteln oder bei technischen Anwendungen. Thus, usual temperatures for washing and cleaning compositions are in the ranges of 10 ° C above 40 ° C and 60 ° C up to 95 ° with mechanical means or for industrial applications. Da bei modernen Wasch- und Spülmaschinen die Temperatur meist stufenlos einstellbar ist, sind auch alle Zwischenstufen der Temperatur eingeschlossen. Because in modern washing machines and dishwashers, the temperature is usually adjustable, all intermediate temperatures are also included. Vorzugsweise werden die Inhaltsstoffe der betreffenden Mittel aufeinander abgestimmt. Preferably, the ingredients of the relevant funds are matched. Bevorzugt sind Synergien hinsichtlich der Reinigungsleistung. Synergies in terms of cleaning performance are preferred. Besonders bevorzugt sind Synergien, die in einem Temperaturbereich zwischen 10°C und 60°C vorhanden sind, insbesondere in einem Temperaturbereich von 10°C bis 60°C, von 10°C bis 50°C, von 10°C bis 40°C, von 10°C bis 30°C, von 15°C bis 30°C von 10°C bis 25°C und von 15°C bis 25°C. Particularly preferred synergies that are present in a temperature range between 10 ° C and 60 ° C, in particular in a temperature range from 10 ° C to 60 ° C, from 10 ° C to 50 ° C, from 10 ° C to 40 ° C is from 10 ° C to 30 ° C, from 15 ° C to 30 ° C from 10 ° C to 25 ° C and 15 ° C to 25 ° C.
  • Die Herstellung erfindungsgemäßer fester Mittel bietet keine Schwierigkeiten und kann auf bekannte Weise, zum Beispiel durch Sprühtrocknen oder Granulation, erfolgen, wobei Enzyme und eventuelle weitere thermisch empfindliche Inhaltsstoffe wie zum Beispiel Bleichmittel gegebenenfalls später separat zugesetzt werden. The preparation of solid compositions according to the invention presents no difficulty and can, for example, by spray drying or granulation, in a known manner, said enzymes and any other heat-sensitive ingredients such as bleaching agents are optionally added separately later. Zur Herstellung erfindungsgemäßer Mittel mit erhöhtem Schüttgewicht, insbesondere im Bereich von 650 g/l bis 950 g/l, ist ein einen Extrusionschritt aufweisendes Verfahren bevorzugt. For the preparation of inventive compositions with increased bulk density, in particular in the range from 650 g / l to 950 g / l, a an extrusion step method is preferred.
  • Zur Herstellung von erfindungsgemäßen Mitteln in Tablettenform, die einphasig oder mehrphasig, einfarbig oder mehrfarbig und insbesondere aus einer Schicht oder aus mehreren, insbesondere aus zwei Schichten bestehen können, geht man vorzugsweise derart vor, dass man alle Bestandteile – gegebenenfalls je einer Schicht – in einem Mischer miteinander vermischt und das Gemisch mittels herkömmlicher Tablettenpressen, beispielsweise Exzenterpressen oder Rundläuferpressen, mit Preßkräften im Bereich von etwa 50 bis 100 kN, vorzugsweise bei 60 bis 70 kN verpreßt. To prepare the inventive compositions in tablet form, which may be single-phase or multi-phase, single-colored or multi-colored, and in particular of a layer or multiple, in particular two layers, the procedure is preferably such that all components can - optionally for each layer - in a mixed mixer and the mixture is compressed using conventional tablet presses, for example eccentric presses or rotary presses, under pressures in the range of about 50 to 100 kN, preferably 60 to 70 kN. Insbesondere bei mehrschichtigen Tabletten kann es von Vorteil sein, wenn mindestens eine Schicht vorverpreßt wird. Particularly in the case of multilayer tablets, it may be advantageous if at least one layer is compressed. Dies wird vorzugsweise bei Preßkräften zwischen 5 und 20 kN, insbesondere bei 10 bis 15 kN durchgeführt. This is preferably carried out at pressing forces of 5 to 20 kN, in particular at 10 to 15 kN. Man erhält so problemlos bruchfeste und dennoch unter Anwendungsbedingungen ausreichend schnell lösliche Tabletten mit Bruch- und Biegefestigkeiten von normalerweise 100 bis 200 N, bevorzugt jedoch über 150 N. Vorzugsweise weist eine derart hergestellte Tablette ein Gewicht von 10 g bis 50 g, insbesondere von 15 g bis 40 g auf. Is obtained so easily break-proof, yet under conditions of use sufficiently fast soluble tablets with breaking and flexural strengths of normally 100 to 200 N, but preferably about 150 N. Preferably, a tablet produced a weight of 10 g to 50 g, especially from 15 g to 40 g. Die Raumform der Tabletten ist beliebig und kann rund, oval oder eckig sein, wobei auch Zwischenformen möglich sind. The three-dimensional shape of the tablets is arbitrary and may be round, oval or angular, with intermediate forms also are possible. Ecken und Kanten sind vorteilhafterweise abgerundet. Edges and corners are advantageously rounded. Runde Tabletten weisen vorzugsweise einen Durchmesser von 30 mm bis 40 mm auf. Round tablets preferably have a diameter of 30 mm to 40 mm. Insbesondere die Große von eckig oder quaderförmig gestalteten Tabletten, welche überwiegend über die Dosiervorrichtung beispielsweise der Geschirrspülmaschine eingebracht werden, ist abhängig von der Geometrie und dem Volumen dieser Dosiervorrichtung. In particular, the size of square or cuboid-shaped tablets, which are mainly introduced from the metering device, for example, the dishwashing machine is dependent on the geometry and the size of the dispensing. Beispielhaft bevorzugte Ausführungsformen weisen eine Grundfläche von (20 bis 30 mm) × (34 bis 40 mm), insbesondere von 26 × 36 mm oder von 24 × 38 mm auf. For example, preferred embodiments have an area of ​​(20 to 30 mm) x (34 to 40 mm), in particular from 26 × 36 mm or 24 × 38 mm.
  • Flüssige beziehungsweise pastöse erfindungsgemäße Mittel in Form von übliche Lösungsmittel enthaltenden Lösungen werden in der Regel durch einfaches Mischen der Inhaltsstoffe, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer gegeben werden können, hergestellt. Liquid or pasty composition of the invention in the form of solutions containing conventional solvents are generally prepared by simple mixing of the ingredients can be added neat or as a solution in an automatic mixer. Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Wasch- oder Reinigungsmittel stellen demnach einen eigenen Erfindungsgegenstand dar. Alle Verfahren, mit denen ein Wasch- oder reinigungsmittel, wie es in der vorliegenden Anmeldung beschrieben ist, erhalten werden kann, werden in den Schutzbereich dieses Erfindungsgegenstandes eingeschlossen. Accordingly, methods for preparing inventive detergents or cleaning agents they constitute one subject invention. All of the methods with which a washing or cleaning agent, as described in the present application can be obtained, can be included within the scope of this inventive object.
  • Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen somit alle festen, pulverförmigen, flüssigen, gelförmigen oder pastösen Darreichungsformen der Mittel, die gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen bestehen können sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Embodiments of the present invention thus include all solid, powdered, liquid, gel or paste-like forms of administration of agents which can also consist of several phases, where appropriate, and may be in compressed or uncompressed form. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellen daher Mittel dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie als Einkomponentensystem vorliegen. A further embodiment of the invention provide means, which are characterized in that they are present as a single component. Solche Mittel bestehen bevorzugt aus einer Phase. Such means preferably consist of one phase. Dagegen sind Mittel, die aus mehreren Phasen bestehen, dadurch gekennzeichnet sind, dass es in mehrere Komponenten aufgeteilt ist. In contrast, agents which consist of several phases, are characterized in that it is split into several components. Zu den erfindungsgemäßen festen Darreichungsformen zählen ferner Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches, die sowohl in Großgebinden als auch portionsweise abgepackt vorliegen können. To give the novel solid dosage forms also include extrudates, granules, tablets or pouches, which may also be packed in portions both in bulk as well.
  • Ein erfindungsgemäßes Mittel kann als rieselfähiges Pulver vorliegen, insbesondere mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l oder 600 g/l bis 850 g/l. An inventive agent may be present as a free flowing powder, in particular with a bulk density of 300 g / l to 1200 g / l, in particular 500 g / l to 900 g / l or 600 g / l to 850 g / l. Alternativ können erfindungsgemäße Mittel auch flüssig, gelförmig oder pastös sein. Alternatively, agents of the invention may also be liquid, gel or paste form. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist daher dadurch gekennzeichnet, dass das Wasch- oder Reinigungsmittel in flüssiger, gelförmiger oder pastöser Form vorliegt, insbesondere in Form eines nicht-wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wässrigen Paste oder in Form eines wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste. Another embodiment of the invention is therefore characterized in that the washing or cleaning agent is in liquid, gel or paste form, in particular in the form of a non-aqueous liquid detergent or a non-aqueous paste or in the form of an aqueous liquid detergent or a water-containing paste.
  • Das erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel kann in einem Behältnis, vorzugsweise einem luftdurchlässigen Behältnis, verpackt sein, aus dem es kurz vor Gebrauch oder während des Waschvorgangs freigesetzt wird. The inventive washing or cleaning agent can be in a container, preferably packed an air-permeable container, from which it is released shortly before use or during the washing process. Insbesondere kann die in dem Mittel enthaltene Protease und/oder weitere Inhaltsstoffe des Mittels mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für das Enzym undurchlässigen Substanz umhüllt sein, welche unter Anwendungsbedingungen des Mittels durchlässig für das Enzym wird. In particular, the protease contained in the agent and / or other ingredients of the composition may be coated with a room temperature or in the absence of water for the enzyme impermeable substance which is permeable to the enzyme under application conditions of the agent. Eine solche Ausführungsform der Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet, dass die Protease mit einer bei Raumtemperatur und/oder bei Abwesenheit von Wasser für die Protease undurchlässigen Substanz umhüllt ist. Such an embodiment of the invention is thus characterized in that the protease is coated with an impermeable at room temperature and / or in the absence of water for the protease substance.
  • Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel können ausschließlich eine Protease enthalten. Washing or cleaning agents according to the invention may contain a protease exclusively. Alternativ können sie auch weitere hydrolytische Enzyme oder andere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration enthalten. Alternatively, they may also contain other hydrolytic enzymes or other enzymes in an expedient for the effectiveness of the agent concentration. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen, wobei prinzipiell alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar sind. A further subject of the invention thus constitute means which further comprise one or more other enzymes, in principle any established in the art for this purpose enzymes can be used. Als weitere Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere eine insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, β-Glucosidase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase, sowie vorzugsweise deren Gemische. preferably be used as further enzymes are all enzymes that can exhibit a catalytic activity in the present invention means, in particular an in particular a protease, amylase, cellulase, hemicellulase, mannanase, tannase, xylanase, xanthanase, β-glucosidase, Carrageenase, perhydrolase, oxidase, oxidoreductase or a lipase, and preferably mixtures thereof. Diese Enzyme sind im Prinzip natürlichen Ursprungs; These enzymes are in principle of natural origin; ausgehend von den natürlichen Molekülen stehen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Varianten zur Verfügung, die entsprechend bevorzugt eingesetzt werden. starting from the natural molecules are available for use in detergents and cleaning agents, improved variants are available that can be preferably used accordingly.
  • Erfindungsgemäße Mittel enthalten Enzyme vorzugsweise in Gesamtmengen von 1 × 10–8 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein. Agents of the invention preferably comprise enzymes in total amounts of 1 × 10-8 to 5 percent by weight based on active protein. Bevorzugt sind die Enzyme von 0,001 bis 5 Gew.-%, weiter bevorzugt von 0,01 bis 5 Gew.-%, noch weiter bevorzugt von 0,05 bis 4 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,075 bis 3,5 Gew.-% in erfindungsgemäßen Mitteln enthalten, wobei jedes enthaltene Enzym in den genannten Mengenverhältnissen vorliegen kann. the enzymes from 0.001 to 5 wt .-%, more preferably from 0.01 to 5 wt .-%, even more preferably from 0.05 to 4 wt .-% and particularly preferably 0.075 to 3.5 by weight are preferred. -% contained in the inventive compositions, each contained enzyme may be in the stated proportions. Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren ( The protein concentration can be determined using known methods, for example the BCA method (bicinchonic acid; 2,2'-biquinolyl 4,4'-dicarboxylic acid) (or the biuret method ) bestimmt werden. be determined).
  • Die Proteaseaktivität in derartigen Mitteln kann nach der in The protease activity in such agents may after in beschriebenen Methode ermittelt werden. Method are determined described. Sie wird in PE (Protease-Einheiten) angegeben. It is given in PU (protease units).
  • Bei dem Vergleich der Leistungen zweier Waschmittelenzyme muss zwischen proteingleichem und aktivitätsgleichem Einsatz unterschieden werden. When comparing the performance of two detergent enzymes have to distinguish between protein and the same activity the same effort. Insbesondere bei gentechnisch erhaltenen, weitgehend nebenaktivitätsfreien Präparationen ist der proteingleiche Einsatz angebracht. Particularly in the case of genetically obtained, substantially free of secondary activity of the protein preparations same insert is mounted. Denn damit ist eine Aussage darüber möglich, ob dieselben Proteinmengen – als Maß für den Ertrag der fermentativen Produktion – zu vergleichbaren Ergebnissen führen. Because that a statement is possible whether the same amounts of protein - lead to comparable results - as a measure of the yield of the fermentative production. Klaffen die jeweiligen Verhältnisse von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) auseinander, so ist ein aktivitätsgleicher Vergleich zu empfehlen, weil hierüber die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften verglichen werden. The respective ratios of active substance to total protein (the values ​​of specific activity) apart, is recommended, because here on the respective enzymatic properties are compared an activity equal comparison. Generell gilt, daß eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann. In general, a low specific activity can be compensated by adding a larger amount of protein.
  • Besonders bevorzugt unterstützen die weiteren Enzyme die Wirkung des Mittels, beispielsweise die Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels, hinsichtlich bestimmter Anschmutzungen oder Flecken. Particularly preferably, the additional enzymes support the effect of the agent, for example, the cleaning performance of a washing or cleaning agent, in respect of certain stains or spots. Besonders bevorzugt zeigen die Enzyme synergistische Effekte hinsichtlich ihrer Wirkung gegenüber bestimmter Anschmutzungen oder Flecken, dh die in der Mittelzusammensetzung enthaltenen Enzyme unterstützen sich in ihrer Reinigungsleistung gegenseitig. Particularly preferably, the enzymes exhibit synergistic effects in terms of their effect against certain stains or spots, ie the enzymes contained in the composition assist in their cleaning performance each other. Synergistische Effekte können nicht nur zwischen verschiedenen Enzymen, sondern auch zwischen einem oder mehreren Enzymen und weiteren Inhaltsstoffen des erfindungsgemäßen Mittels auftreten. Synergistic effects can occur not only between different enzymes, but also between one or more enzymes and other ingredients of the inventive composition.
  • Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittels zur Entfernung von Anschmutzungen, insbesondere von protease-sensitiven Anschmutzungen, auf Textilien oder harten Oberflächen, dh zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, dar. A separate subject invention provides the use of an inventive detergent or cleaning agent to remove soils, particularly protease-sensitive stains on textiles or hard surfaces, ie for cleaning textiles or hard surfaces, represents.
  • Denn erfindungsgemäße Mittel können, insbesondere auf Grund der vorstehend beschriebenen Eigenschaften der enthaltenen Protease, vorteilhaft dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen entsprechende Verunreinigungen zu beseitigen. Because, agents according to the invention, in particular due to the above-described properties of the protease contained, be advantageously used to remove from fabrics or hard surfaces corresponding impurities. Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen beispielsweise die Handwäsche, die manuelle Entfernung von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen oder die Verwendung im Zusammenhang mit einem maschinellen Verfahren dar. Embodiments of this invention the subject example, the hand wash, the manual removal of stains from textiles or hard surfaces, or use in connection with a mechanical methods represent.
  • Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. All facts, subjects and embodiments described for inventive washing or cleaning agents, are also applicable to this subject invention. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehende erfindungsgemäße Verwendung gilt. Therefore, reference is expressly made at this point to the disclosure at the appropriate point by pointing out that this disclosure also applies to the above inventive use. In bevorzugten Ausführungsformen dieser Verwendung werden die betreffenden Wasch- oder Reinigungsmittel daher nach einer der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen bereitgestellt. In preferred embodiments of this use, the washing or cleaning agent in question are therefore provided according to one of the embodiments described above.
  • Einen weiteren Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar, bei denen wenigstens in einem der Verfahrensschritte ein erfindungsgemäßes Mittel verwendet wird. A further subject of the invention is method for cleaning textiles or hard surfaces in which an agent of the invention is used in at least one of the method steps. Das Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen ist demnach dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein erfindungsgemäßes Mittel angewendet ist. The process for cleaning textiles or hard surfaces is therefore characterized in that in at least one process step, a composition of the invention is applied.
  • Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren aufgrund ihrer präziseren Steuerbarkeit, was beispielsweise die eingesetzten Mengen und Einwirkzeiten angeht, bevorzugt sind. These include both manual and automatic methods, wherein automatic methods due to their precise controllability with regard, for example, the amounts and reaction times used, preferred.
  • Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung bzw. Verdünnung dieses Mittels behandelt wird. A method for cleaning textiles are generally distinguished by the fact that in several process steps, various cleaning-active substances are applied to the cleaned and washed after the contact time, or that the items to be cleaned is treated in another manner with a detergent or a solution or diluent of this agent , Entsprechendes gilt für Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, insbesondere von harten Oberflächen. The same applies to methods for cleaning all materials other than textiles, especially from hard surfaces. Alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um die Anwendung eines erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittels bereichert werden und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. All conceivable washing or cleaning methods can be enriched by the application of an inventive washing or cleaning agent in at least one of the process steps and then represent embodiments of the present invention. All facts, objects and embodiments are described for the inventive detergents or cleaning agents, are applicable to this subject invention. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren gilt. Therefore, reference is expressly made at this point to the disclosure at the appropriate point by pointing out that this disclosure also applies to the above process according to the invention.
  • Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Protease katalytisch aktiv ist, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist. A further subject of the invention, illustrate methods for cleaning textiles or hard surfaces, which are characterized in that a protease of the invention is catalytically active in at least one method step, in particular in such a way that the protease in an amount of 40 micrograms to 4 g, preferably is inserted from 50 micrograms to 3 g, particularly preferably from 100 micrograms to 2 g and very particularly preferably from 200 .mu.g to 1 g per application. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Proteasen beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. All facts, subjects and embodiments described for inventive proteases are also applicable to this subject invention. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren gilt. Therefore, reference is expressly made at this point to the disclosure at the appropriate point by pointing out that this disclosure also applies to the above process according to the invention.
  • Da erfindungsgemäße Proteasen natürlicherweise bereits eine hydrolytische Aktivität besitzen und diese auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner und/oder der einziger Schritt eines solchen Verfahrens darin bestehen, dass gewünschtenfalls als einzige reinigungsaktive Komponente eine solche Protease mit der Anschmutzung in Kontakt gebracht wird, bevorzugt in einer Pufferlösung oder in Wasser. Since proteases according to the invention already have a hydrolytic activity naturally and this also develop in media which otherwise have no cleaning power, such as in the naked buffer, an individual and / or the single step of such a procedure are that, if desired, as the sole detergent-active component such protease is brought into contact with the stain, preferably in a buffer solution or in water. Dies stellt eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstandes dar. This represents a further embodiment of this inventive object.
  • Alternative Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen auch Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, bei denen in wenigstens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Protease aktiv wird. Alternative embodiments of this invention, the object also constitute methods for the treatment of textile raw materials or for textile care, where a protease of the invention is active in at least one process step. Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen bevorzugt, und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide. Here, methods for textile raw materials, fibers or textiles containing natural constituents are preferred and very particularly for those containing wool or silk.
  • Es kann sich dabei beispielsweise um Verfahren handeln, in denen Materialien zur Verarbeitung in Textilien vorbereitet werden, etwa zur Antifilzausrüstung, oder beispielsweise um Verfahren, welche die Reinigung getragener Textilien um eine pflegende Komponente bereichern. It may, for example, be methods in which materials are prepared for processing into textiles, for example for anti-felt, or, for example, methods that supplement the cleaning worn textiles with a care component. Wegen der oben beschriebenen Wirkung von Proteasen auf natürliche, proteinhaltige Rohstoffe handelt es sich in bevorzugten Ausführungsformen um Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen, insbesondere mit Wolle oder Seide. Because of the above-described action of proteases on natural protein-containing raw materials, in preferred embodiments, to methods for the treatment of textile raw materials, fibers or textiles containing natural components, in particular wool or silk.
  • Erfindungsgemäße Enzyme sind entsprechend der vorstehenden Ausführungen vorteilhaft in erfindungsgemäßen Mitteln, insbesondere Wasch- und Reinigungsmitteln, und Verfahren, insbesondere Wasch- und Reinigungsverfahren, einsetzbar. Enzymes of the invention are in accordance with the foregoing, advantageous in the inventive compositions, in particular detergents and cleaning agents and methods, in particular washing and cleaning processes, can be used. Sie können also dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen proteinhaltige Verunreinigungen zu beseitigen. You can therefore be used to eliminate textiles or hard surfaces proteinaceous contaminants.
  • Einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildet daher die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease, wie sie vorstehend beschreiben wurde zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen. Therefore in another aspect the invention provides the use of a protease according to the invention, as was described above for cleaning textiles or hard surfaces. Bevorzugt wird die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt. the protease in an amount of 40 micrograms to 4 g is preferred, preferably used from 50 .mu.g to 3 g, particularly preferably from 100 micrograms to 2 g and very particularly preferably from 200 .mu.g to 1 g per application. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Proteasen beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. All facts, subjects and embodiments described for inventive proteases are also applicable to this subject invention. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehende erfindungsgemäße Verwendung gilt. Therefore, reference is expressly made at this point to the disclosure at the appropriate point by pointing out that this disclosure also applies to the above inventive use. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung werden die betreffenden erfindungsgemäßen Enzyme im Rahmen eines erfindungsgemäßen Mittels, vorzugsweise eines erfindungsgemäßen Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittels, bereitgestellt. In a preferred embodiment of this use the enzymes in the context of an agent of the invention in question according to the invention, preferably a washing or cleaning agent according to the invention is provided.
  • Eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Wasch- oder Reinigungsmitteln dar. Another embodiment of this inventive subject matter is the use of a protease according to the invention for activating or deactivating ingredients of detergents or cleaning agents.
  • Denn Protein-Bestandteile von Wasch- oder Reinigungsmitteln können durch das Einwirken einer Protease inaktiviert werden. For protein constituents of detergents or cleaning agents may be inactivated by the action of a protease. Diesen ansonsten eher unerwünschten Effekt gezielt einzusetzen, ist ebenfalls ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. using this otherwise rather undesired effect specifically, is also an aspect of the present invention. Ebenso ist es wie oben beschrieben möglich, dass durch Proteolyse eine andere Komponente erst aktiviert wird, etwa, wenn sie ein Hybridprotein aus dem eigentlichen Enzym und dem dazu passenden Inhibitor darstellt. It is also possible as described above, that another component is only activated by proteolysis, for example, if it constitutes a hybrid protein of the actual enzyme and the corresponding inhibitor. Ein anderes Beispiel für eine solche Regulation ist die, bei der eine aktive Komponente zum Schutz oder zur Kontrolle ihrer Aktivität in einem Material verkapselt vorliegt, das durch Proteolyse angegriffen wird. Another example of such regulation is that in which an active component for the protection or control of their activity encapsulated in a material is present, which is attacked by proteolysis. Erfindungsgemäße Proteasen können somit zu Inaktivierungs-, Aktivierungs- oder Freisetzungsreaktionen verwendet werden, insbesondere in mehrphasigen Mitteln. Proteases of the invention can be used for inactivation, activation, or release reactions thus, in particular in multiphase compositions.
  • Ferner stellen auch folgende Verwendungen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar: Furthermore, the following uses, embodiments of the present invention:
    • – Die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung, insbesondere zum Entfernen von Schutzschichten auf Geweben; - The use of a protease of the invention for obtaining or treating raw materials or intermediates in the manufacture of textiles, in particular for removing protective layers on fabrics;
    • – die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege und hierunter bevorzugt - the use of a protease of the invention for the treatment of textile raw materials or for textile care and among these preferably
    • – die entsprechende Verwendung für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide. - the corresponding use for textile raw materials, fibers or textiles containing natural components and very particularly for those containing wool or silk.
  • Die vorliegende Erfindung wird auch in Form von solchen eine erfindungsgemäße Protease enthaltenden Mitteln verwirklicht, bei denen es sich um Kosmetika handelt. The present invention is also realized in the form of such a protease of the invention containing means in which it is cosmetics. Hierunter werden alle Arten von reinigenden und pflegenden Mitteln für menschliche Haut oder Haar verstanden, insbesondere reinigende Mittel. This includes all types are understood by cleaning and care products for human skin or hair, in particular cleaning agents.
  • Denn Proteasen spielen auch im Zellerneuerungsprozess der menschlichen Haut (Desquamation) eine entscheidende Rolle. Proteases also play a crucial role in the cell renewal process of the human skin (desquamation). Dementsprechend werden Proteasen auch als bioaktive Komponenten in Hautpflegemitteln verwendet, um den Abbau der in trockener Haut vermehrten Desmosomenstrukturen zu unterstützen. Accordingly, proteases are used as bioactive components in skincare products to support the dismantling of increasingly present in dry skin desmosome. Wie vorstehend ausführlich erläutert können erfindungsgemäße Proteasen weiterentwickelt werden, beispielsweise über Aminosäuresubstitutionen und/oder weitere Mutationen. as explained in detail above, proteases of the invention can be further developed, for example, by amino acid substitutions and / or other mutations. Somit eignen sich auch erfindungsgemäße Proteasen, insbesondere solche, die etwa nach Mutagenese oder durch Zugabe entsprechender, mit ihnen wechselwirkender Stoffe in ihrer Aktivität kontrolliert sind, als aktive Komponenten in Haut- oder Haar-Reinigungs- oder Pflegemitteln. Thus, proteases according to the invention, particularly those that are controlled include mutagenesis, or by addition of appropriate substances interacting with them in their activity, as active components in skin or hair cleaning or care products. Are Besonders bevorzugt sind solche Präparationen dieser Enzyme, die wie oben beschrieben, beispielsweise durch Kopplung an makromolekulare Träger stabilisiert und/oder durch Substitutionen an hochallergenen Positionen verändert oder derivatisiert sind, so dass sie für den Menschen eine höhere Hautverträglichkeit aufweisen. Particularly preferred are those preparations of these enzymes as described above, stabilized for example by coupling to macromolecular carriers and / or modified by substitutions at highly allergenic positions or are derivatized to have higher skin compatibility for humans.
  • Dementsprechend werden auch entsprechende kosmetische Reinigungs- und Pflegeverfahren und die Verwendung derartiger proteolytischer Enzyme zu kosmetischen Zwecken in diesen Erfindungsgegenstand einbezogen, insbesondere in entsprechenden Mitteln, wie beispielsweise Shampoos, Seifen oder Waschlotionen, oder in Pflegemitteln, die beispielsweise in Form von Cremes angeboten werden. Accordingly, corresponding cosmetic cleaning and care methods and the use of proteolytic enzymes for cosmetic purposes in this inventive subject matter are included, in particular in appropriate agents, such as shampoos, soaps or washing lotions or in care products which are available for example in the form of creams. Auch die Verwendung in einem schälenden Arzneimittel, beziehungsweise zu dessen Herstellung ist eingeschlossen. Also, the use in a peeling medicament, or for the production thereof are included.
  • Neben dem Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln und Kosmetika sind im Stand der Technik zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten von Proteasaen, insbesondere Subtilasen etabliert. Besides its use in detergents and cleaners and cosmetics numerous applications of Proteasaen, in particular subtilases have been established in the art. Einen Überblick hierüber bietet beispielsweise das Handbuch An overview here on, for example, provides the manual . , All diese Techniken können durch erfindungsgemäße Proteasen bereichert werden. All of these techniques can be enhanced by inventive proteases. Hierzu gehören insbesondere folgende Einsatzgebiete: These include in particular the following applications:
    • – die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur biochemischen Analyse oder zur Synthese von niedermolekularen Verbindungen oder von Proteinen; - the use of a protease of the invention for biochemically analyzing or for synthesizing low molecular weight compounds or proteins;
    • – darunter bevorzugt die Verwendung zur Endgruppenbestimmung im Rahmen einer Peptid-Sequenzanalyse; - including preferably the use for the terminal groups in a peptide sequence analysis;
    • – die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen; - the use of a protease of the invention for preparing, purifying or synthesizing natural substances or biological valuable substances;
    • – die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Synthese von Proteinen oder anderen niedermolekularen chemischen Verbindungen; - the use of a protease of the invention for the synthesis of proteins or other low molecular weight chemical compounds;
    • – die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen, insbesondere zur Oberflächenbehandlung, ganz besonders zur Behandlung von Leder; - the use of a protease of the invention for the treatment of natural raw materials, in particular for surface treatment, especially for the treatment of leather;
    • – die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Behandlung von photographischen Filmen, insbesondere zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten; - the use of a protease of the invention for the treatment of photographic films, in particular for removing gelatin-containing or similar protective layers; und and
    • – die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln. - the use of a protease of the invention for the production of food or animal feed.
  • Grundsätzlich wird der Einsatz erfindungsgemäßer Proteasen in allen weiteren Technikgebieten in den Schutzbereich der vorliegenden Anmeldung eingeschlossen, für die es sich als geeignet herausstellt. In principle, the use of inventive proteases in all other areas of technology will be included in the scope of the present application for which it turns out to be suitable.
  • Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter, ohne sie jedoch darauf einzuschränken. The following examples illustrate the invention, but without limiting it.
  • Beispiele Examples
  • Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von All molecular biological steps follow standard methods such as those described in the manual by , oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. are given, or comparable relevant works. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt. Enzymes and kits (kits) were used according to instructions of the manufacturer.
  • Beispiel 1 example 1
  • Isolierung und Identifizierung des proteolytisch aktiven Bakterienstamms Isolation and identification of proteolytically active bacterial strain
  • 0,1 g einer Bodenprobe wurden in 1 ml sterilen 0,9%iger NaCl-Lösung suspendiert und auf milchpulverhaltigen Agarplatten (1,5% Agar, 0,1% K 2 HPO 4 , 0,5% Hefeextrakt, 1% Pepton, 1% Milchpulver, 0,02% MgSO 4 ·7H 2 O, 0,4% Na 2 CO 3 , pH 10) ausplattiert und bei 30°C inkubiert. 0.1 g of a soil sample were sterile in 1 ml suspended 0.9% NaCl solution, and (on agar plates containing milk powder 1.5% agar, 0.1% K 2 HPO 4, 0.5% yeast extract, 1% peptone, 1% milk powder, 0.02% MgSO 4 · 7H 2 O, 0.4% Na 2 CO 3, pH 10) and incubated at 30 ° C. Anhand eines Klärungshofes wurde ein proteolytisch aktives Bakterium isoliert, welches von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) als Bacillus pumilus identifiziert wurde (ID 08-100). Based on a clearance Court a proteolytically active bacterium was isolated which (DSMZ) was identified as a Bacillus pumilus of the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (ID 08-100).
  • Beispiel 2 example 2
  • Isolierung und Klonierug der neuen Serinprotease aus dem Boden Isolation and Klonierug the new serine protease from the ground
  • Das proteolytisch aktive Bakterium wurde in TBY-Medium (0,5% NaCl, 0,5% Hefeextrakt, 1% Trypton, pH 7,4) für 16 h bei 30°C kultiviert. The proteolytically active bacterium was cultured in TBY medium (0.5% NaCl, 0.5% yeast extract, 1% tryptone, pH 7.4) for 16 h at 30 ° C. Die Gesamt-DNA dieses Bakteriums wurde nach Standardmethoden präpariert, mit dem Restriktionsenzym Sau 3A behandelt und in einen Bacillusvektor (Derivat des pBC16; The total DNA of these bacteria was prepared according to standard methods, treated with the restriction enzyme Sau 3A, and (in a Bacillus vector derivative of pBC16; ) kloniert. ) Cloned. Dieser Vektor wurde in den Protease-negativen Wirtsstamm Bacillus subtilis DB 104 ( This vector was (in the protease negative host strain Bacillus subtilis DB 104 ) transformiert. ) Transformed.
  • Die Transformanden wurden zunächst auf DM3-Medium regeneriert und dann auf milchpulverhaltige Agarplatten (TBY-Skimmilk-Platten; siehe Beispiel 1) überimpft. The transformants were first regenerated on DM3 medium and then milk powder-containing agar plates (TBY Skimmilk plates; see Example 1) was inoculated. Proteolytisch aktive Klone wurden anhand ihrer Lysehöfe identifiziert. Proteolytically active clones were identified by their lysis zones. Aus den erhaltenen proteolytisch aktiven Klonen wurde einer ausgewählt, dessen Plasmid (Vektor) isoliert und das in diesem Vektor enthaltene Genfragment (Insert) nach Standardmethoden sequenziert. From the obtained clones with proteolytic activity is selected, its plasmid (vector) and the gene fragment contained in this vector (Insert) sequenced by standard methods.
  • Das Insert enthält einen offenen Leserahmen von ca. 1,2 kb, dessen DNA-Sequenz für eine Protease vom Subtilisin-Typ codiert. The insert contains an open reading frame of about 1.2 kb, which DNA sequence encodes for a protease of the subtilisin type. Die Sequenz wurde mittels PCR amplifiziert, in der E. coli Vektor pUC19 kloniert und gemäß dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Nummer DSM 21891 hinterlegt. The sequence was amplified by PCR, cloned into the E. coli vector pUC19 and deposited under the Budapest Treaty at the DSMZ under the number DSM 21,891th
  • Beispiel 3 example 3
  • Ermittlung der Reinigungsleistung bei Einsatz in einem handelsüblichen pulverförmigen Waschmittel Determination of the cleaning performance when used in a commercial powder detergent
  • Für dieses Beispiel wurden standardisiert verschmutze Textilien eingesetzt, die von der EMPA Testmaterialien AG (St. Gallen, Schweiz), der wfk Testgewebe GmbH (Brüggen-Bracht, Deutschland) oder dem Center For Testmaterials (CFT, Vlaardingen, Niederlande) bezogen worden waren. For this example soiled fabrics were used standardized, which had been obtained from EMPA Test materials AG (St. Gallen, Switzerland), the wfk test fabrics GmbH (Brueggen-Bracht, Germany) or the Center For test material (CFT, Vlaardingen, The Netherlands). Dabei wurden folgende Anschmutzungen und Textilien verwendet: The following soilings and textiles were used:
    • A: Gras auf Baumwolle: Produkt Nr. 164 von der Firma Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Schweiz; A: Grass on cotton: product no 164 by the company Federal materials and testing institute (EMPA) Test materials AG, St. Gallen, Switzerland;.
    • B: Erdnuss Öl-Pigment/Tusche auf Polyester/Baumwolle: Produkt Nr. PC-10 von CFT (Center For Testmaterials) BV Vlaardingen, Niederlande; . B: peanut oil pigment / ink on polyester / cotton: product no PC-10 from CFT (Center For test material) BV Vlaardingen, The Netherlands;
    • C: Schokoladenmilch/Ruß auf Baumwolle: Produkt Nr. C-03 von CFT (Center For Testmaterials) BV Vlaardingen, Niederlande. C: chocolate milk / soot on cotton. Product Nr C-03 from CFT (Center For test material) BV Vlaardingen, Netherlands.
  • Mit diesem Testmaterial wurden verschiedene Waschmittelrezepturen auf ihre Reinigungsleistung hin untersucht. This test material, various detergent formulations were tested for their cleaning performance down. Dafür wurden die Ansätze für 60 Minuten bei einer Temperatur von 40°C gewaschen. For this, the approaches for 60 minutes at a temperature of 40 ° C were washed. Die Dosierung lag bei 5,9 g des Waschmittels pro Liter Waschflotte. The dosage was 5.9 g of detergent per liter wash liquor. Es wurde mit Stadtwasser mit einer Wasserhärte von etwa 16° deutscher Härte gewaschen. It was washed with tap water having a water hardness of about 16 ° German hardness.
  • Als Kontroll-Waschmittel diente eine Waschmittel-Basis-Rezeptur folgender Zusammensetzung (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 10% lineares Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz), 1,5% C12-C18-Fettalkoholsulfat (Natrium-Salz), 2,0% C12-C18-Fettalkohol mit 7 EO, 20% Natriumcarbonat, 6,5% Natriumhydrogencarbonat, 4,0% amorphes Natriumdisilikat, 17% Natriumcarbonatperoxohydrat, 4,0% TAED, 3,0% Polyacrylat, 1,0% Carboxymethylcellulose, 1,0% Phosphonat, 25% Natriumsulfat, Rest: Schauminhibitoren, optischer Aufheller, Duftstoffe. 2.0 10% linear alkyl benzene sulphonate (sodium salt), 1.5% C12-C18-fatty alcohol sulfate (sodium salt): The control detergent was a basic detergent formulation of the following composition was used (all amounts in weight percent) % C12-C18 fatty alcohol with 7 EO, 20% sodium carbonate, 6.5% sodium bicarbonate, 4.0% amorphous sodium disilicate, 17% sodium carbonate peroxyhydrate, 4.0% TAED, 3.0% polyacrylate, 1.0% carboxymethylcellulose, 1 , phosphonate 0%, 25% sodium sulfate, rest: foam inhibitors, optical brighteners, perfumes. Die Waschmittel-Basis-Rezeptur wurde für die verschiedenen Versuchsreihen aktivitätsgleich (5 PE/ml Endkonzentration) mit folgenden Proteasen versetzt: erfindungsgemäße Protease umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. The detergent base formulation was identical activities for the different test series are added (5 PE / ml final concentration) with the following proteases: protease of the invention comprising an amino acid sequence according to SEQ ID NO. 3 (Ansatz 1), Protease aus Bacillus pumilus gemäß 3 (Approach 1), protease from Bacillus pumilus according WO2007/131656 WO2007 / 131656 (Ansatz 2) und leistungsverbesserte Variante F49 der Protease aus Bacillus lentus gemäß (Batch 2) and performance-enhanced variant F49 of the protease from Bacillus lentus according WO 95/23221 WO 95/23221 (Ansatz 3). (Run 3).
  • Nach dem Waschen wurde der Weißheitsgrad der gewaschenen Textilien gemessen. After washing, the whiteness of the washed fabrics was measured. Die Messung erfolgte an einem Spektrometer Minolta CM508d (Lichtart D65, 10°). The measurement was performed on a spectrometer Minolta CM508d (illuminant D65, 10 °). Das Gerät wurde zuvor mit einem mitgelieferten Weißstandard kalibriert. The instrument has been calibrated with a white standard. Die erhaltenen Ergebnisse sind die Differenzremissionen zwischen einem Waschvorgang mit einem Waschmittel enthaltend eine Protease und einem parallel durchgeführten Kontrollwaschgang mit einem Waschmittel ohne Protease. The obtained results are the difference between the reflectances to a washing operation using a detergent containing a protease and a carried out in parallel control wash with detergent without protease. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt und erlauben einen unmittelbaren Rückschluss auf den Beitrag des jeweils enthaltenen Enzyms zur Reinigungsleistung des verwendeten Mittels. The results are summarized in Table 1 below and allow an immediate conclusion about the contribution of the enzyme in each case contained the cleaning performance of the agent used. Tabelle 1: Waschergebnisse mit einem pulverförmigen Waschmittel bei 40°C Table 1: washing results with a powdered detergent at 40 ° C
    Anschmutzung soiling Ansatz 1 approach 1 Ansatz 2 approach 2 Ansatz 3 approach 3
    A A 2,4 2.4 0,8 0.8 2,4 2.4
    B B 8,0 8.0 7,4 7.4 7,3 7.3
    C C 6,3 6.3 3,0 3.0 4,3 4.3
  • Es wird deutlich, dass eine erfindungsgemäße Protease bereits in ihrer Wildtyp-Form eine bessere Reinigungsleistung zeigt im Vergleich zu einer bekannten Protease aus Bacillus pumilus, die eine ähnliche Aminosäuresequenz aufweist, sowie selbst im Vergleich mit der leistungsverbesserten Proteasevariante gemäß Ansatz 3, die kein Wildtyp-Molekül ist. It is clear that a protease of the invention already in their wild-type form exhibits better cleaning performance in comparison to a known protease from Bacillus pumilus that has a similar amino acid sequence, and even in comparison with the performance-enhanced protease variant according to lug 3 which no wild-type molecule.
  • Beschreibung der Figuren DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • 1 1 : Alignment der erfindungsgemäßen reifen Protease (SEQ ID NO. 3) mit Proteasen aus dem Stand der Technik, erstellt mit dem Programm Vector NTI ® Suite 7.0 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) unter Standardparametern. Alignment of the mature protease of the invention (. SEQ ID NO: 3) with proteases from the prior art, created with the program Vector NTI ® Suite 7.0 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, USA) using standard parameters.
  • Darin bedeuten: Where:
    • 1: Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 ( (Protease from Bacillus lentus DSM 5483: 1 WO 92/21760 A1 WO 92/21760 A1 ) )
    • 2: Erfindungsgemäße Protease gemäß SEQ ID NO. Protease of SEQ ID NO invention: second 3 (reifes Enzym) 3 (mature enzyme)
    • 3: reife (mature) Protease gemäß Datenbankeintrag Q5XPN0 aus Bacillus pumilus (Q5XPN0_BACPU; „Organic solvent tolerant protease”; Bacillus pumilus (Bacillus mesentericus); vgl. SEQ ID NO. 6) 3: mature (mature) protease of database entry Q5XPN0 from Bacillus pumilus (Q5XPN0_BACPU; "Organic solvent tolerant protease"; Bacillus pumilus (Bacillus mesentericus); see SEQ ID NO. 6).
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden. It follows a sequence listing by WIPO St. 25 This can be downloaded from the official publication of the DPMA platform.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDED IN THE DESCRIPTION
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. This list of references cited by the applicant is generated automatically and is included solely to inform the reader. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. The list is not part of the German patent or utility model application. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen. The DPMA is not liable for any errors or omissions.
  • Zitierte Patentliteratur Cited patent literature
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    • - WO 2007/131656 [0036, 0167] - WO 2007/131656 [0036, 0167]
    • - EP 0300305 [0110] - EP 0300305 [0110]
    • - DE 2412837 [0116] - DE 2412837 [0116]
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    • - WO 92/21760 A1 [0171] - WO 92/21760 A1 [0171]
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Claims (17)

  1. Protease umfassend eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. Protease comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of a) amino acid sequence to that of SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 98,3% identisch ist b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 amino acid sequence shown at least 98.3% identical b) amino acid sequence to that of SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 98,5% identisch ist, insbesondere eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 amino acid sequence shown at least 98.5% identical, in particular an amino acid sequence selected from the group consisting of a) amino acid sequence to that of SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 amino acid sequence given increasingly preferably to at least 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and very particularly preferably 100% identical b) amino acid sequence which is at the in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist. 2 amino acid sequence shown at least 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99, 5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and very particularly preferably 100% identical.
  2. Protease nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie natürlicherweise in einem Organismus vorhanden ist, der aus einem natürlichen Habitat isolierbar ist, insbesondere in einem Mikroorganismus, vorzugsweise in einem Pilz, in einem gramnegativen oder in einem grampositiven Bakterium, hierunter besonders bevorzugt in einem Bakterium der Gattung Bacillus, insbesondere in Bacillus pumilus und insbesondere in Bacillus pumilus DSM ID 08-100, oder dass sie von einer Nukleinsäure codiert wird, die in einer Wirtszelle mit der Hinterlegungsnummer DSM 21891 vorhanden ist. Protease according to claim 1, characterized in that it is present in an organism naturally, which is isolable from a natural habitat, in particular in a microorganism, preferably a fungus, in a gram negative or a gram-positive bacterium, among these particularly preferably in a bacterium of the genus Bacillus, in particular Bacillus pumilus, and in particular in Bacillus pumilus DSM ID 08-100, or that it is encoded by a nucleic acid which is 21891 present in a host cell having the deposit number DSM.
  3. Protease, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease nach einem der Ansprüche 1 oder 2 als Ausgangsmolekül erhaltbar ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 50 und zunehmend bevorzugt mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266, 267 oder 268 zusammenhängenden Aminosäurepositionen mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt, und/oder dass sie aus einer Protease nach einem der Ansprüche 1 oder 2 als Ausgangsmolekül erhaltbar ist durch einen oder mehrere Aminosäureaustausche in Positionen, die den Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268 der Protease aus Bacillus lentus gemäß SEQ ID NO. Protease, characterized in that it is obtainable as a starting molecule of a protease according to any one of claims 1 or 2 comprising by fragmentation, deletion, insertion or substitution, and an amino acid sequence that is preferred over a length of at least 50 and, increasingly, at least 60, 70 , 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266, 267 or 268 contiguous amino acid positions with the starting molecule matches, and / or that it consists of a protease according to any of claims 1 or 2 obtainable as starting molecule by one or more amino acid substitutions in positions corresponding to the positions 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87 , 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243 , 255 and 268 of the protease from Bacillus lentus as shown in SEQ ID NO. 4 in einem Alignment zugeordnet sind. 4 are assigned in an alignment.
  4. Nukleinsäure codierend für eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3, insbesondere eine, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. Nucleic acid encoding a protease according to any one of claims 1 to 3, in particular one that comprises a nucleic acid sequence which is selected from the group consisting of a) nucleic acid sequence to that of SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in einem Teilstück von mindestens 300 zusammenhängenden Nukleotiden mindestens zu 97,1% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist b) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 nucleic acid sequence given in a portion of at least 300 contiguous nucleotides is at least 97.1% and increasingly preferably at least 97.2%, 97.4%, 97.6%, 97.8%, 98%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99, 3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and very particularly preferably 100% identical b) a nucleic acid sequence complementary to the SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in den Positionen 325 bis 1149 mindestens zu 97,1% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist c) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 nucleic acid sequence shown in positions 325-1149 of at least 97.1% and increasingly preferably at least 97.2%, 97.4%, 97.6%, 97.8%, 98%, 98.2%, 98, 3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3% is identical 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and very particularly preferably 100%, c) nucleic acid sequence to that of SEQ ID NO , 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 97,1% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist. Nucleic acid sequence specified at least 1 to 97.1% and increasingly preferably at least 97.2%, 97.4%, 97.6%, 97.8%, 98%, 98.2%, 98.3%, 98.4 %, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and very particularly preferably 100% identical.
  5. Vektor enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 4, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor. A vector comprising a nucleic acid according to claim 4, in particular a cloning vector or an expression vector.
  6. Nicht menschliche Wirtszelle, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 4 oder einen Vektor nach Anspruch 5 beinhaltet, oder die eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3 beinhaltet, insbesondere eine, die die Protease in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert. includes non-human host cell which contains a nucleic acid according to claim 4 or a vector according to claim 5, or a protease according to any of claims 1 to 3, especially one, in which the host cell secretes the protease surrounding medium.
  7. Wirtszelle nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Zellkern besitzt, oder dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia. A host cell according to claim 6, characterized in that it comprises a nucleus, or that it is a bacterium, preferably one that is selected from the group of genera Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas and Pseudomonas , more preferably one that is selected from the group of Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans , Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor and Stenotrophomonas maltophilia.
  8. Verfahren zur Herstellung einer Protease umfassend a) Kultivieren einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7 b) Isolieren der Protease aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle. A method for producing a protease comprising: a) culturing a host cell according to any one of claims 6 or 7 b) isolating the protease from the culture medium or from the host cell.
  9. Mittel, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält, insbesondere in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels, Means, in particular a washing or cleaning agent, characterized in that it contains at least one protease of any one of claims 1 to 3, in particular in an amount of from 2 ug to 20 mg, preferably from 5 ug to about 17.5 mg, more preferably from 20 ug to 15 mg and very particularly preferably from 50 .mu.g to 10 mg per g of the composition,
  10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es als Einkomponentensystem vorliegt oder dass es in mehrere Komponenten aufgeteilt ist. Composition according to claim 9, characterized in that it is present as a single component or that it is divided into several components.
  11. Mittel nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es in fester Form vorliegt, insbesondere als rieselfähiges Pulver mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l, oder dass es in flüssiger, gelförmiger oder pastöser pastöser Form vorliegt. Agent according to one of claims 9 or 10, characterized in that it is in solid form, especially as free-flowing powder having a bulk density of 300 g / l to 1200 g / l, in particular 500 g / l to 900 g / l, or in that it is present in liquid, gel or paste-like paste form.
  12. Mittel nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease mit einer bei Raumtemperatur und/oder bei Abwesenheit von Wasser für die Protease undurchlässigen Substanz umhüllt ist. Agent according to one of claims 9 to 11, characterized in that the protease is coated with an impermeable at room temperature and / or in the absence of water for the protease substance.
  13. Mittel nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es eines oder mehrere weitere Enzyme umfasst, insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Taunase, Xylanase, Xanthanase, β-Glucosidase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase, sowie vorzugsweise deren Gemische. Agent according to one of claims 9 to 12, characterized in that it comprises one or more further enzymes, in particular a protease, amylase, cellulase, hemicellulase, mannanase, Taunase, xylanase, xanthanase, β-glucosidase, Carrageenase, perhydrolase, oxidase, oxidoreductase or a lipase, and preferably mixtures thereof.
  14. Verwendung eines Mittels nach einem der Ansprüche 9 bis 13 zur Entfernung von protease-sensitiven Anschmutzungen auf Textilien oder harten Oberflächen. Use of an agent according to one of claims 9 to 13 for the removal of protease sensitive stains on textiles or hard surfaces.
  15. Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein Mittel nach einem der Ansprüche 9 bis 13 angewendet ist. A process for cleaning textiles or hard surfaces, characterized in that in at least one process step, a composition according to any one of claims 9 to 13 is applied.
  16. Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3 katalytisch aktiv ist, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist. A process for cleaning textiles or hard surfaces, characterized in that a protease according to any of claims 1 to 3 is catalytically active in at least one method step, in particular in such a way that the protease in an amount of 40 micrograms to 4 g, preferably from 50 ug is inserted to 3 g, particularly preferably from 100 micrograms to 2 g and very particularly preferably from 200 .mu.g to 1 g per application.
  17. Verwendung einer Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist. Use of a protease according to any of claims 1 to 3 for cleaning textiles or hard surfaces, in particular such that the protease in an amount of 40 micrograms to 4 g, preferably from 50 micrograms to 3 g, particularly preferably from 100 micrograms to 2 g and very particularly preferably used from 200 .mu.g to 1 g per application.
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