DE102008059446A1 - New proteases and agents containing these proteases - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Anmeldung betrifft neue Proteasen, hinreichend verwandte Proteasen und deren Derivate sowie deren Herstellung und deren Verwendung. Sie betrifft außerdem Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese Proteasen, hinreichend verwandte Proteasen und deren Derivate, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie Verwendungen der Proteasen, insbesondere zu Wasch- und Reinigungszwecken.The present application relates to novel proteases, sufficiently related proteases and their derivatives and their preparation and their use. It also relates to agents, in particular detergents and cleaners containing these proteases, sufficiently related proteases and their derivatives, corresponding washing and cleaning processes and uses of the proteases, in particular for washing and cleaning purposes.
Description
Die vorliegende Anmeldung betrifft neue Proteasen, hinreichend verwandte Proteasen und deren Derivate sowie deren Herstellung und deren Verwendung. Sie betrifft außerdem Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese Proteasen, hinreichend verwandte Proteasen und deren Derivate, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie Verwendungen der Proteasen, insbesondere zu Wasch- und Reinigungszwecken.The present application relates to novel proteases, sufficiently related Proteases and their derivatives as well as their preparation and their use. It also relates to agents, especially detergents and cleaners containing these proteases, sufficiently related proteases and their derivatives, appropriate washing and cleaning processes and Uses of the proteases, especially for washing and cleaning purposes.
Proteasen
gehören zu den technisch bedeutendsten Enzymen überhaupt.
Für Wasch- und Reinigungsmittel sind sie die am längsten
etablierten und in praktisch allen modernen, leistungsfähigen
Wasch- und Reinigungsmitteln enthaltenen Enzyme. Sie bewirken den
Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. Hierunter
sind wiederum Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilasen, Subtilopeptidasen,
EC 3.4.21.62) besonders wichtig, welche aufgrund der katalytisch
wirksamen Aminosäuren den Serin-Proteasen zugerechnet werden.
Sie wirken als unspezifische Endopeptidasen, das heißt,
sie hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen, die im
Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen. Ihr pH-Optimum liegt
meist im deutlich alkalischen Bereich. Einen Überblick über
diese Familie bietet beispielsweise der Artikel
Beispiele für die in Wasch- und Reinigungsmitteln bevorzugt eingesetzten Proteasen vom Subtilisin-Typ sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease P692, die Subtilisine 147 und 309, die Protease aus Bacillus lentus, insbesonder aus Bacillus lentus DSM 5483, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Weitere verwendbare Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® und Ovozyme® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect® OXP, Purafect® Prime und Properase® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme.Examples of the subtilisin-type proteases preferably used in detergents and cleaners are the subtilisins BPN 'and Carlsberg, the protease P692, the subtilisins 147 and 309, the protease from Bacillus lentus, in particular from Bacillus lentus DSM 5483, subtilisin DY and the the subtilases, but not the subtilisins in the narrower sense attributable enzyme thermitase, proteinase K and the proteases TW3 and TW7. Other usable proteases are, for example, under the trade names Durazym ®, relase ®, Everlase® ®, Nafizym, Natalase ®, Kannase® ® and Ovozyme ® from Novozymes, the ® under the trade names Purafect ®, Purafect ® OXP, Purafect Prime and Properase.RTM ® from Genencor, that under the trade name Protosol® ® from Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India, under the trade name Wuxi ® from Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, the P under the trade names Proleather® ® and protease ® from Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, and the enzymes available under the name proteinase K-16 from Kao Corp., Tokyo, Japan.
Hinsichtlich der Anwendung von Proteasen in Wasch- und Reinigungsmitteln ist bekannt, dass Proteasen zur Verbesserung der Wasch- beziehungsweise Reinigungsleistung zusammen mit weiteren Enzymen, beispielsweise Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Mannanasen, β-Glucosidasen, Oxidasen, Oxidoreduktasen oder Lipasen eingesetzt werden können. Ebenso ist der Einsatz von Proteasen in Waschmitteln in Kombination mit anderen Wirkstoffen wie etwa Bleichmitteln oder Soil-Release-Wirkstoffen dem Fachmann bekannt.Regarding the use of proteases in detergents and cleaners known that proteases improve the washing or Cleaning performance together with other enzymes, for example Amylases, cellulases, hemicellulases, mannanases, β-glucosidases, Oxidases, oxidoreductases or lipases can be used. Likewise, the use of proteases in detergents in combination with other active ingredients such as bleaches or soil release agents known to the skilled person.
Es ist ferner bekannt, dass einige für den Einsatz in Waschmitteln etablierte Proteasen auch für kosmetische Zwecke oder für die organisch-chemische Synthese geeignet sind.It It is also known that some for use in detergents established proteases also for cosmetic purposes or for the organic-chemical synthesis are suitable.
Die hier beispielhaft erwähnten, unterschiedlichen technischen Einsatzgebiete erfordern Proteasen mit unterschiedlichen Eigenschaften, was beispielsweise die Reaktionsbedingungen, die Stabilität oder die Substratspezifität angeht. Umgekehrt hängen die technischen Einsatzmöglichkeiten der Proteasen, beispielsweise im Kontext einer Wasch- oder Reinigungsmittelrezeptur, von weiteren Faktoren wie der Stabilität des Enzyms gegenüber hohen Temperaturen, gegenüber oxidierenden Agentien oder gegenüber dessen Denaturierung durch Tenside, von Faltungseffekten oder von erwünschten Synergien mit anderen Inhaltsstoffen ab.The exemplified here, different technical Applications require proteases with different properties, such as the reaction conditions, the stability or the substrate specificity. Conversely, hang the technical applications of proteases, for example in the context of a detergent or cleaning agent formulation, of others Factors like the stability of the enzyme high temperatures, over oxidizing agents or towards its denaturation by surfactants, from folding effects or of desired synergies with other ingredients from.
Somit besteht nach wie vor ein hoher Bedarf an technisch einsetzbaren Proteasen, die aufgrund der Vielzahl ihrer Einsatzgebiete in ihrer Gesamtheit ein breites Spektrum an Eigenschaften bis hin zu sehr subtilen Leistungsunterschieden abdecken.Consequently There is still a high demand for technically usable Proteases, due to the variety of their uses in their Entire a wide range of properties to very much cover subtle differences in performance.
Die
Basis hierfür sind neue Proteasen, welche ihrerseits hinsichtlich
spezieller Einsatzgebiete gezielt weiterentwickelt werden können.
Das klassische Vorgehen zur Gewinnung neuer Enzyme besteht darin,
Mikroorganismen-haltige Proben aus natürlichen Habitaten
zu entnehmen und unter den als geeignet angesehenen Bedingungen – zum
Beispiel in alkalischem Milieu – zu kultivieren. Auf diese
Weise werden Anreicherungskulturen von Mikroorganismen erhalten,
die mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit auch Enzyme, darunter
Proteasen enthalten, welche unter den jeweiligen Bedingungen aktiv
sind. Hieraus werden dann beispielsweise über Ausplattieren
auf proteinhaltigen Agarplatten und Ausmessen der gebildeten Lysehöfe
die Mikroorganismen mit den leistungsfähigsten Enzymen
ausgewählt und aufgereinigt beziehungsweise die jeweiligen Gene
kloniert. Solch ein Vorgehen wird beispielsweise in dem Lehrbuch
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere, bislang noch nicht bekannte Proteasen bereitzustellen, die eine proteolytische Aktivität aufweisen. Vorteilhafterweise sollte sich die Protease dadurch auszeichnen, dass ihr Beitrag zur Leistung eines Mittels, welches die Protease enthält, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, dem Beitrag von einem für diesen Zweck etablierten proteolytischen Enzym zur Leistung des Mittels zumindest nahe kommt und idealerweise übertrifft. Als Beitrag zur Leistung ist diesbezüglich insbesondere der Beitrag zur Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels von Bedeutung.task The present invention is further, hitherto unknown Provide proteases that have a proteolytic activity exhibit. Advantageously, the protease should be characterized that their contribution to the performance of an agent containing the protease in particular a washing or cleaning agent, the contribution of one proteolytic enzyme established for this purpose Performance of the agent comes at least close and ideally exceeds. As a contribution to the performance in this regard is particular the contribution to the cleaning performance of a washing or cleaning agent significant.
Eine weitere Aufgaben der Erfindung ist es, Proteasen, insbesondere vom Subtilisin-Typ, bereitzustellen, die gegenüber dem Stand der Technik eine verbesserte Stabilität gegenüber Temperatureinflüssen, pH-Wert-Schwankungen, denaturierenden oder oxidierenden Agentien, proteolytischem Abbau, hohen Temperaturen, sauren oder alkalischen Bedingungen oder gegenüber einer Veränderung der Redox-Verhältnisse aufweisen. Weitere Aufgaben können in einer verringerten Immunogenität bzw. verringerten allergenen Wirkung gesehen werden.A Further objects of the invention are proteases, in particular of Subtilisin type, provide that opposite the state The technique provides improved stability Temperature effects, pH fluctuations, denaturing or oxidizing agents, proteolytic degradation, high temperatures, acid or alkaline conditions or against one Have change in the redox ratios. Other tasks may result in decreased immunogenicity or reduced allergenic effects.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Proteasen bereitzustellen, die bei niedrigeren Temperaturen, insbesondere zwischen 10°C und 50°C und bevorzugt zwischen 10°C und 40°C oder zwischen 20°C und 40°C eine gute Reinigungsleistung, vorzugsweise eine verbesserte Reinigungsleistung im Vergleich zu den im Stand der Technik offenbarten Proteasen, insbesondere denjenigen vom Subtilisin-Typ, aufweisen.A Another object of the present invention is to provide proteases, at lower temperatures, especially between 10 ° C and 50 ° C, and preferably between 10 ° C and 40 ° C or between 20 ° C and 40 ° C a good cleaning performance, preferably an improved cleaning performance compared to the proteases disclosed in the prior art, in particular those of the subtilisin type.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Proteasen bereitzustellen, die in Bezug auf die im Stand der Technik bekannten Proteasen eine verbesserte Reinigungsleistung in Bezug auf zumindest eine Anschmutzung, vorzugsweise in Bezug auf mehrere Anschmutzungen, aufweisen.A Another object of the present invention is to provide proteases, the proteases known in the art improved cleaning performance with respect to at least one soiling, preferably with respect to multiple soils.
Weitere Teilaufgaben bestanden darin, Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, die für derartige Proteasen codieren, und Vektoren, Wirtszellen und Herstellverfahren zur Verfügung zu stellen, die zur Gewinnung derartiger Proteasen genutzt werden können. Ferner sollten entsprechende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie entsprechende Verwendungsmöglichkeiten für derartige Proteasen zur Verfügung gestellt werden.Further Partial tasks consisted of nucleic acids which code for such proteases and vectors, To provide host cells and manufacturing processes, which can be used to obtain such proteases. Furthermore, appropriate means, in particular washing and cleaning agents, appropriate washing and cleaning procedures and corresponding Uses for such proteases to provide.
Ein Gegenstand der Erfindung ist eine Protease umfassend eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
- a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 98,3% identisch ist
- b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 98,5% identisch ist,
- a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist
- b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
- a) Amino acid sequence corresponding to that shown in SEQ ID NO. 3 amino acid sequence is at least 98.3% identical
- b) Amino acid sequence corresponding to that shown in SEQ ID NO. 2 amino acid sequence is at least 98.5% identical,
- a) Amino acid sequence corresponding to that shown in SEQ ID NO. 3, more preferably at least 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and most preferably 100% identical
- b) Amino acid sequence corresponding to that shown in SEQ ID NO. 2, at least 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99, 5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and most preferably 100% identical.
Hiermit sind als weitere Erfindungsgegenstände die zugehörigen, für erfindungsgemäße Proteasen codierende Nukleinsäuren, erfindungsgemäße Proteasen oder Nukleinsäuren enthaltende nicht menschliche Wirtszellen, geeignete Verfahren zu ihrer Herstellung, insbesondere auf den Nukleinsäuren bzw. Wirtszellen aufbauende molekularbiologische Verfahren und Verfahrenselemente sowie Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, Wasch- und Reinigungsverfahren und über die betreffenden Proteasen gekennzeichnete Verwendungsmöglichkeiten verbunden.Herewith are as further subjects of the invention the associated, coding for proteases of the invention Nucleic acids, proteases according to the invention or non-human host cells containing nucleic acids, suitable methods for their preparation, in particular on the nucleic acids or host cell-based molecular biological processes and process elements and agents, in particular detergents and cleaners, detergents and cleaners Purification process and the proteases concerned marked uses connected.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende, natürlicherweise gebildete Protease ist, wie anhand der Beispiele nachvollzogen werden kann, aus dem Kulturüberstand eines Bacillus Stammes erhältlich, der von der DSMZ (DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Deutschland) als ein Bacillus pumilus Stamm identifiziert ist. Zum Zwecke der Nacharbeitbarkeit wurde gemäß Budapester Vertrag ein Plasmid, das die Nukleinsäuresequenz der erfindungsgemäßen Protease enthält, bei der DSMZ mit der Hinterlegungsnummer DSM 21891 hinterlegt.The naturally formed protease on which the present invention is based can be obtained from the culture supernatant of a Bacillus strain which can be obtained from the examples. DSMZ (DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Inhoffenstr e 7 B, 38124 Braunschweig, Germany) is identified as a Bacillus pumilus strain. For the purpose of reworkability, according to the Budapest Treaty, a plasmid containing the nucleic acid sequence of the protease according to the invention was deposited with DSMZ under the accession number DSM 21891.
Eine erfindungsgemäße Protease weist eine proteolytische Aktivität auf, das heißt, sie ist zur Hydrolyse von Peptidbindungen eines Polypeptids bzw. Proteins befähigt, insbesondere in einem Wasch- oder Reinigungsmittel. Eine erfindungsgemäße Protease ist daher ein Enzym, welches die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert und dadurch in der Lage ist, Peptide oder Proteine zu spalten. Eine erfindungsgemäße Protease ist insbesondere ein Subtilisin. Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Enzyme, Proteine, Fragmente und Derivate, sofern sie nicht explizit als solche angesprochen zu werden brauchen, unter dem Oberbegriff Proteine bzw. Polypeptide zusammengefasst, da ein Protein ein Polypeptid ist.A Protease according to the invention has a proteolytic Activity, that is, it is for hydrolysis capable of peptide binding of a polypeptide or protein, especially in a washing or cleaning agent. An inventive Protease is therefore an enzyme which inhibits the hydrolysis of peptide bonds catalyzed and thereby able to add peptides or proteins columns. A protease according to the invention is in particular a subtilisin. For the purposes of the present invention, enzymes, Proteins, fragments and derivatives, unless explicitly stated such need to be addressed, under the generic term proteins or polypeptides, since a protein is a polypeptide is.
Eine erfindungsgemäße Protease ist auf Grund ihrer proteolytischen Aktivität und ihrer weiteren Eigenschaften, insbesondere betreffend ihre Stabilität gegenüber Tensiden und/oder Bleichmitteln und/oder ihr Temperaturprofil und/oder ihr pH-Profil, für die Anwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet. Überraschenderweise leistet sie bereits in ihrer Wildtyp-Form einen so guten Beitrag zur Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels, welches die Protease enthält, der dem Beitrag von einem für diesen Zweck etablierten proteolytischen Enzym zur Reinigungleistung des Mittels nahe kommt und ihn an unterschiedlichen Anschmutzungen sogar übertrifft. Sie ermöglicht daher eine verbesserte Entfernung von mindestens einer, bevorzugt von mehreren protease-sensitiven Anschmutzungen auf Textilien und/oder harten Oberflächen, beispielsweise Geschirr. Weiter überraschend wurde festgestellt, dass eine solche Protease einem Wasch- oder Reinigungsmitteln eine vorteilhafte Reinigungsleistung verleiht, vor allem auch bei niedrigen Temperaturen, beispielsweise zwischen 10°C und 50°C, insbesondere zwischen 10°C und 40°C oder zwischen 20°C und 40°C.A Protease of the invention is due to their proteolytic activity and its further properties, especially regarding their stability Surfactants and / or bleaching agents and / or their temperature profile and / or their pH profile, for use in detergents and cleaners suitable. Surprisingly, she already performs in her Such a good contribution to the cleaning performance of a washing or detergent containing the protease, the the contribution of a proteolytic agent established for this purpose Enzyme comes close to the cleaning performance of the compound and it gets to different soiling even surpasses. It therefore allows an improved Removal of at least one, preferably several protease-sensitive Soiling on textiles and / or hard surfaces, for example, dishes. Next surprisingly it was found that such a protease a washing or cleaning agents a gives advantageous cleaning performance, especially at low Temperatures, for example between 10 ° C and 50 ° C, in particular between 10 ° C and 40 ° C or between 20 ° C and 40 ° C.
Unter Reinigungsleistung wird erfindungsgemäß die Aufhellungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels an Anschmutzungen, insbesondere an protease-sensitiven Anschmutzungen und hierunter insbesondere an protease-sensitiven Wäscheanschmutzungen, verstanden. Die Reinigungsleistung wird bevorzugt ermittelt wie weiter unten angegeben.Under Cleaning performance according to the invention, the whitening performance a washing or cleaning agent to stains, in particular on protease-sensitive stains and hereunder in particular on protease-sensitive Wäscheanschmutzungen understood. The cleaning performance is preferably determined as below specified.
Aufgrund der zur Verfügung gestellten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ist eine zusätzliche Optimierung dieser Protease, beispielsweise durch Aminosäuresubstitutionen oder weitere Mutationen, möglich. Ferner können erfindungsgemäße Nukleinsäuren in verschiedenste Rekombinationsansätze eingebracht und damit zur Erzeugung völlig neuartiger Proteasen oder anderer Polypeptide genutzt werden.by virtue of the provided invention Nucleic acids is an additional optimization this protease, for example by amino acid substitutions or other mutations, possible. Furthermore, can Nucleic acids according to the invention in a wide variety Recombination approaches introduced and thus for the production completely new proteases or other polypeptides used become.
Zahlreiche Proteasen und insbesondere Subtilisine werden als sogenannte Präproteine, also zusammen mit einem Propeptid und einem Signalpeptid gebildet, wobei die Funktion des Signalpeptids üblicherweise darin besteht, die Ausschleusung der Protease aus der sie produzierenden Zelle in das Periplasma oder das die Zelle umgebende Medium zu gewährleisten, und das Propeptid üblicherweise für die korrekte Faltung der Protease nötig ist. Das Signalpeptid und das Propeptid sind in der Regel der N-terminale Teil des Präproteins. Das Signalpeptid wird unter natürlichen Bedigungen durch eine Signalpeptidase von der übrigen Protease abgespalten. Anschließend erfolgt die durch das Propeptid unterstützte korrekte endgültige Faltung der Protease. Die Protease ist dann in ihrer aktiven Form und spaltet das Propeptid selbst ab. Nach der Abspaltung des Propeptids übt die dann reife (mature) Protease, insbesondere Subtilisin, ihre katalytische Aktivität ohne die ursprünglich vorhandenen N-terminalen Aminosäuren aus.numerous Proteases and especially subtilisins are called pre-proteins, so formed together with a propeptide and a signal peptide, the function of the signal peptide is usually therein the release of the protease from the one producing it Cell into the periplasm or to ensure the medium surrounding the cell and the propeptide usually for the correct one Conclusion of the protease is necessary. The signal peptide and the Propeptide are usually the N-terminal part of the preprotein. The Signal peptide is transformed by natural conditions Signal peptidase cleaved from the remaining protease. Subsequently the correct final supported by the propeptide takes place Folding of the protease. The protease is then in its active form and cleaves off the propeptide itself. After cleavage of the propeptide exercises the then mature protease, especially subtilisin, their catalytic activity without the original ones N-terminal amino acids.
Für technische Anwendungen sind aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität die reifen (maturen) Proteasen, d. h. die nach ihrer Herstellung prozessierten Enzyme, gegenüber den Präproteinen bevorzugt. Die Proteasen können von den sie produzierenden Zellen nach der Herstellung der Polypeptidkette modifiziert werden, beispielsweise durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche Modifikationen werden als posttranslationale Modifikationen bezeichnet. Diese posttranslationalen Modifizierungen können, müssen jedoch nicht einen Einfluss auf die Funktion der Protease ausüben.For technical applications are due to their enzymatic activity the mature proteases, d. H. the after their production processed enzymes, compared to the preproteins prefers. The proteases can be produced by those who produce them Cells are modified after preparation of the polypeptide chain, for example, by attachment of sugar molecules, Formylations, aminations, etc. Such modifications will become referred to as post-translational modifications. This post translational Modifications can, but do not have to be Exert influence on the function of the protease.
Eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz ist unter SEQ ID NO. 1 angegeben. Diese Nukleinsäure codiert für eine Protease, welche eine für Subtilisine typische Einteilung in Signalpeptid, Propeptid und reife (mature) Protease aufweist. Das Gesamtlängenprotein ist unter SEQ ID NO. 2 und die reife (mature) Protease unter SEQ ID NO. 3 angegeben. Hiermit ist das tatsächlich aktive reife Protein gemeint, weil dieses die technisch relevante Funktion ausübt. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind daher die reifen, aktiven Proteasen. Diese weisen ein Molekulargewicht zwischen 25 und 30 kD (Kilodalton) auf, insbesondere 27 kD, ermittelt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.A Nucleic acid sequence according to the invention is under SEQ ID NO. 1 indicated. This nucleic acid encodes for a protease, which is one for subtilisins typical classification into signal peptide, propeptide and mature Protease has. The full-length protein is under SEQ ID NO. 2 and the mature protease under SEQ ID NO. 3 indicated. By this is meant the actually active mature protein, because this exercises the technically relevant function. Particularly according to the invention therefore, the mature, active proteases are preferred. These wise a molecular weight between 25 and 30 kD (kilodaltons), in particular 27 kD, determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
Für
die Protease gemäß SEQ ID NO. 3 bzw. SEQ ID NO.
2 wurde eine Sequenzanalyse sowie ein Sequenzvergleich mit bekannten
Proteinsequenzen aus den allgemein zugänglichen Datenbanken
UniProtKB und/oder Swiss-Prot (vgl. UniProtKB, EMBL Outstation – European
Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton,
Cambridge CB10 1SD, United Kingdom; http://www.uniprot.org) und/oder
GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National
Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), durchgeführt,
um die Proteine mit der größten Ähnlichkeit
zu ermitteln. Dieser Sequenzvergleich erfolgte mit Hilfe des im
Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten
BLAST-Algorithmus (vgl. beispielsweise
Auf der Ebene der Aminosäuren für die gesamte Protease gemäß SEQ ID NO. 2 wurde als nächstähnliches Protein identifiziert: Sequenz Q5XPN0 aus Bacillus pumilus (UniProtKB/TrEMBL Q5XPN0 (Q5XPN0_BACPU); „Organic solvent tolerant Protease”) mit 98,4% Identität bzw. Abweichungen in 6 Aminosäurepositionen.On the level of amino acids for the entire protease according to SEQ ID NO. 2 was next Protein identified: Sequence Q5XPN0 from Bacillus pumilus (UniProtKB / TrEMBL Q5XPN0 (Q5XPN0_BACPU); "Organic Solvent Tolerant Protease") with 98.4% identity or differences in 6 amino acid positions.
Auf der Ebene der Aminosäuren für die reife (mature) Protease gemäß SEQ ID NO. 3 wurde als nächstähnliches Protein identifiziert: Sequenz Q5XPN0 aus Bacillus pumilus UniProtKB/TrEMBL Q5XPN0 (Q5XPN0_BACPU); „Organic solvent tolerant Protease”) mit 98,2% Identität bzw. Abweichungen in 5 Aminosäurepositionen.On the level of amino acids for the mature Protease according to SEQ ID NO. 3 was next Protein identified: Sequence Q5XPN0 from Bacillus pumilus UniProtKB / TrEMBL Q5XPN0 (Q5XPN0_BACPU); "Organic Solvent Tolerant Protease") with 98.2% identity or deviations in 5 amino acid positions.
Damit
unterscheidet sich die erfindungsgemäße Protease
von dieser Protease in 6 Aminosäuren bezogen auf das Gesamtlängenprotein
gemäß SEQ ID NO. 2 und in 5 Aminosäuren
bezogen auf die reife (mature) Protease gemäß SEQ
ID NO. 3. Somit handelt es sich bei der gefundenen Protease um ein
neues Enzym. In den Schutzbereich eingeschlossen werden können
somit alle Proteasen, die mindestens zu 98,5% identisch zu SEQ ID
NO. 2 sind und/oder die sich von der Sequenz Q5XPN0 (angegeben als
SEQ ID NO. 5) in mindestens einer, bevorzugt 2, 3, 4, 5 oder 6 Aminosäuren
unterscheiden bzw. die mindestens zu 98,3% identisch zu SEQ ID NO.
3 sind und/oder die sich von der Sequenz der reifen Protease gemäß Q5XPN0
(angegeben als SEQ ID NO. 6) in mindestens einer, bevorzugt 2, 3,
4 oder 5 Aminosäuren unterscheiden. Zu der im Stand der Technik
etablierten Protease aus Bacillus lentus (SEQ ID NO. 4, vgl. auch
Aufgrund der zu erkennenden Übereinstimmungen und der Verwandtschaft zu den anderen angegebenen Subtilisinen ist eine erfindungsgemäße Protease als ein Subtilisin anzusehen.by virtue of the correspondence to be recognized and the relationship to the other specified subtilisins is an inventive Protease as a subtilisin.
Die Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. Durch einen solchen Vergleich mit bekannten Enzymen, die beispielsweise in allgemein zugänglichen Datenbanken hinterlegt sind, Isst sich aus der Aminosäure- oder Nukleotid-Sequenz auch die enzymatische Aktivität eines betrachteten Enzyms folgern. Diese kann durch andere Bereiche des Proteins, die nicht an der eigentlichen Reaktion beteiligt sind, qualitativ oder quantitativ modifiziert werden. Dies könnte beispielsweise die Enzymstabilität, die Aktivität, die Reaktionsbedingungen oder die Substratspezifität betreffen.The Determination of the identity of nucleic acid or Amino acid sequences are made by a sequence comparison. By such a comparison with known enzymes, for example are stored in generally accessible databases, Eats from the amino acid or nucleotide sequence as well conclude the enzymatic activity of a considered enzyme. This may be due to other areas of the protein that are not attached to the actual reaction involved, qualitatively or quantitatively be modified. This could be, for example, the enzyme stability, the activity, the reaction conditions or the substrate specificity affect.
Solch
ein Vergleich geschieht dadurch, dass ähnliche Abfolgen
in den Nukleotidsequenzen (oder auch Aminosäuresequenzen)
einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden
Positionen wird als Alignment bezeichnet. Bei der Analyse von Nukleotidsequenzen
sind wiederum beide komplementären Stränge und
jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen;
ebenso die Degeneriertheit des genetischen Codes und die organismenspezifische
Verwendung der Codons (Codon-Usage). Üblicherweise werden
Sequenzvergleiche und Alignments über Computerprogramme
erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise Clustal
(vgl. beispielsweise
Eine Zusammenstellung aller in den verglichenen Sequenzen übereinstimmenden Positionen wird als Konsensus-Sequenz bezeichnet.A Compilation of all matching in the compared sequences Positions is called a consensus sequence.
Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben bzw. in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden.Such a comparison also allows a statement about the similarity the compared sequences to each other. It usually becomes in percent identity, that is the proportion of identical nucleotides or amino acid residues on the same or in an alignment corresponding positions indicated. The broader term of homology refers to amino acid sequences Conserved amino acid substitutions into consideration one, so amino acids with similar chemical Activity as these are mostly similar within the protein exercise chemical activities. Therefore, the similarity the sequences compared also percent homology or percent similarity be specified. Identity and / or homology information can be transmitted via whole polypeptides or genes or only over individual areas to be hit.
Homologe oder identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche Bereiche können auch durch identische Funktionen gekennzeichnet sein. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide bzw. Aminosäuren umfassen. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Proteins essentielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls kleine Bereiche zu beziehen. Beispiele für solche Funktionen können bei Nukleinsäuren die Wechselwirkung mit speziellen Molekülen sein, beispielsweise bei Promotorsequenzen die Wechselwirkung mit bestimmten Transkriptionsfaktoren. Bei Aminosäuresequenzen können solche Funktionen auch kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Polypeptid ausgeübten Funktion sein wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasserstoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder eines Übergangskomplexes.homologous or identical regions of different nucleic acid or amino acid sequences are by matches defined in the sequences. Such areas can also be characterized by identical functions. You can be small and comprise only a few nucleotides or amino acids. Often, such small areas practice for overall activity of the protein essential functions. It may therefore make sense be, sequence matches only to individual, if necessary to relate to small areas. Examples of such functions may interact with nucleic acids be special molecules, for example in promoter sequences the interaction with certain transcription factors. At amino acid sequences Such functions can also be the smallest subfunctions of the be performed by the entire polypeptide function such as the formation of individual hydrogen bonds to Complexation of a substrate or a transition complex.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Protease dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
- a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist
- b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
- a) Amino acid sequence corresponding to that shown in SEQ ID NO. 3, more preferably at least 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and most preferably 100% identical
- b) Amino acid sequence corresponding to that shown in SEQ ID NO. 2, at least 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99, 5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and most preferably 100% identical.
Alle vorstehenden Sachverhalte und Ausführungen gelten für diese bevorzugten Ausführungsformen entsprechend.All The above facts and explanations apply to these preferred embodiments accordingly.
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
ist die Protease dadurch gekennzeichnet, dass ihre Reinigungsleistung
mindestens derjenigen einer Protease entspricht, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, die der in SEQ ID NO. 4 angegebenen Aminosäuresequenz
entspricht, und/oder mindestens derjenigen einer Protease entspricht,
die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO.
6 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, und/oder mindestens
derjenigen der Protease aus Bacillus pumilus gemäß
- – Blut-Milch/Tusche auf Baumwolle: Produkt Nr. C-05 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) B. V. Vlaardingen, Niederlande
- – Voll-Ei/Pigment (Ganzei/Ruß) auf Baumwolle: Produkt Nr. 10 N erhältlich von der Firma wfk Testgewebe GmbH; Brüggen-Bracht, Deutschland, oder Produkt C-S-37 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) B. V. Vlaardingen, Niederlande
- – Schokoladenmilch/Ruß auf Baumwolle: Produkt Nr. C-03 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) B. V. Vlaardingen, Niederlande
- – Erdnuss Öl-Pigment/Tusche auf Polyester/Baumwolle: Produkt Nr. PC-10 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) B. V. Vlaardingen, Niederlande
- – Gras auf Baumwolle: Produkt Nr. 164 erhältlich von der Firma Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Schweiz
- – Kakao auf Baumwolle: Produkt Nr. 112 erhältlich von der Firma Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Schweiz,
- - Blood milk / cotton ink: Product No. C-05 available from CFT (Center For Test Materials) BV Vlaardingen, the Netherlands
- - Whole egg / pigment (whole egg / carbon black) on cotton: Product No. 10 N available from the company wfk Testgewebe GmbH; Brüggen-Bracht, Germany, or product CS-37 available from CFT (Center For Test Materials) BV Vlaardingen, The Netherlands
- - Chocolate milk / soot on cotton: Product No. C-03 available from CFT (Center For Test Materials) BV Vlaardingen, The Netherlands
- - Peanut oil pigment / ink on polyester / cotton: Product No. PC-10 available from CFT (Center For Test Materials) BV Vlaardingen, The Netherlands
- - Grass on cotton: Product No. 164 available from the company Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Switzerland
- - Cocoa on cotton: Product No. 112 available from the company Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Switzerland,
Erfindungsgemäß sind die Begriffe Ganzei/Ruß bzw. Vollei/Pigment hinsichtlich der Anschmutzungen als gleichwertig und einander entsprechend zu betrachten.According to the invention the terms whole egg / carbon black or whole egg / pigment with regard to of soiling as equivalent and mutually consider.
Ein bevorzugtes flüssiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3–0,5% Xanthan Gum, 0,2–0,4% Anti-Schaummittel, 6–7% Glycerin, 0,3–0,5% Ethanol, 4–7% FASOS (Fettalkoholethersulfat), 24-28% nichtionische Tenside, 1% Borsäure, 1–2% Natriumcitrat (Dihydrat), 2-4% Soda, 14-16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP (1-Hydroxyethan-(1,1-di-phosphonsäure)), 0–0,4% PVP (Polyvinylpyrrolidon), 0–0,05% optischer Aufheller, 0–0,001% Farbstoff, Rest demineralisiertes Wasser. Bevorzugt beträgt die Dosierung des flüssigen Waschmittels zwischen 4,5 und 6,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 4,7, 4,9 oder 5,9 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 8 und pH 10,5, bevorzugt zwischen pH 8 und pH 9.One preferred liquid detergent for such Washing system is composed as follows (all figures in weight percent): 0.3-0.5% xanthan gum, 0.2-0.4% anti-foaming agent, 6-7% glycerol, 0.3-0.5% ethanol, 4-7% FASOS (fatty alcohol ether sulfate), 24-28% nonionic surfactants, 1% Boric acid, 1-2% sodium citrate (dihydrate), 2-4% Soda, 14-16% coconut fatty acids, 0.5% HEDP (1-hydroxyethane- (1,1-di-phosphonic acid)), 0-0.4% PVP (polyvinylpyrrolidone), 0-0.05% optical Brightener, 0-0.001% dye, remainder demineralized water. Preferably, the dosage of the liquid Detergent between 4.5 and 6.0 grams per liter of wash liquor, for example 4.7, 4.9 or 5.9 grams per liter wash liquor. Preference is given to washing in a pH range between pH 8 and pH 10.5, preferably between pH 8 and pH 9.
Ein bevorzugtes pulverförmiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 10% lineares Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz), 1,5% C12-C18-Fettalkoholsulfat (Natrium-Salz), 2,0% C12-C18-Fettalkohol mit 7 EO, 20% Natriumcarbonat, 6,5% Natriumhydrogencarbonat, 4,0% amorphes Natriumdisilikat, 17% Natriumcarbonat-peroxohydrat, 4,0% TAED, 3,0% Polyacrylat, 1,0% Carboxymethylcellulose, 1,0% Phosphonat, 25% Natriumsulfat, Rest: optional Schauminhibitoren, optischer Aufheller, Duftstoffe und ggfs. Wasser ad 100%. Bevorzugt beträgt die Dosierung des pulverförmigen Waschmittels zwischen 5,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 5,6, 5,9 oder 6,7 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 9 und pH 11.One preferred powdered detergent for a such washing system is composed as follows (all information in weight percent): 10% linear alkyl benzene sulfonate (sodium salt), 1.5% C12-C18 fatty alcohol sulfate (sodium salt), 2.0% C12-C18 fatty alcohol with 7 EO, 20% sodium carbonate, 6.5% sodium bicarbonate, 4.0% amorphous sodium disilicate, 17% sodium carbonate peroxohydrate, 4.0% TAED, 3.0% polyacrylate, 1.0% carboxymethylcellulose, 1.0% phosphonate, 25% sodium sulfate, balance: optional foam inhibitors, optical brightener, Fragrances and, if necessary, water ad 100%. Preferred is the dosage of the powdered detergent between 5.5 and 7.0 grams per liter of wash liquor, for example 5.6, 5.9 or 6.7 grams per liter of wash liquor. Preference is given to washing in one pH range between pH 9 and pH 11.
Der Weißheitsgrad, d. h. die Aufhellung der Anschmutzungen, als Maß für die Reinigungsleistung wird bevorzugt mit optischen Messverfahren bestimmt, bevorzugt photometrisch. Ein hierfür geeignetes Gerät ist beispielsweise das Spektrometer Minolta CM508d. Üblicherweise werden die für die Messung eingesetzten Geräte zuvor mit einem Weißstandard, bevorzugt einem mitgelieferten Weißstandard, kalibriert.Of the Whiteness, d. H. the brightening of soiling, as a measure of the cleaning performance is preferred determined by optical measuring methods, preferably photometrically. One this suitable device is for example the Spectrometer Minolta CM508d. Usually, the for previously measuring with a white standard, preferably a supplied white standard, calibrated.
Durch
den aktivitätsgleichen Einsatz der jeweiligen Protease
wird sichergestellt, dass auch bei einem etwaigen Auseinanderklaffen
des Verhältnisses von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die
Werte der spezifischen Aktivität) die jeweiligen enzymatischen
Eigenschaften, also beispielsweise die Reinigungsleistung an bestimmten
Anschmutzungen, verglichen werden. Generell gilt, dass eine niedrige
spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren
Proteinmenge ausgeglichen werden kann. Verfahren zur Bestimmung
der Proteaseaktivitäten sind dem Fachmann auf dem Gebiet
der Enzymtechnologie geläufig und werden von ihm routinemäßig
angewendet. Beispielsweise sind solche Verfahren offenbart in
Proteine können auch über die Reaktion mit einem Antiserum oder einem bestimmten Antikörper zu Gruppen immunologisch verwandter Proteine zusammengefaßt werden. Die Angehörigen einer Gruppe zeichnen sich dadurch aus, dass sie dieselbe, von einem Antikörper erkannte antigene Determinante aufweisen. Sie sind daher einander strukturell so ähnlich, dass sie von einem Antiserum oder betimmten Antikörpern erkannt werden. Einen weiteren Erfindungsgegenstand bilden daher ferner Proteasen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei oder vier übereinstimmende antigene Determinanten mit einer erfindungsgemäßen Protease aufweisen. Solche Proteasen sind auf Grund ihrer immunologischen Übereinstimmungen den erfindungsgemäßen Proteasen strukturell so ähnlich, dass auch von einer gleichartigen Funktion auszugehen ist.proteins can also talk about the reaction with an antiserum or a particular antibody to groups immunologically related proteins are summarized. The members A group is characterized by being the same, by one Antibodies recognized to have antigenic determinant. she are therefore structurally so similar to each other that they are of an antiserum or specific antibodies. A further subject of the invention therefore further proteases, which are characterized by having at least one and increasingly preferably two, three or four consensus antigenic determinants having a protease according to the invention. Such proteases are due to their immunological similarities structurally similar to the proteases of the invention, that also a similar function is assumed.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist eine erfindungsgemäße Protease natürlicherweise in einem Organismus vorhanden, der aus einem natürlichen Habitat isolierbar ist.In Another embodiment of the invention is an inventive Protease naturally present in an organism, which can be isolated from a natural habitat.
Diese Ausführungsform ist deshalb besonders vorteilhaft, weil dann der zugehörige Organismus selbst in Kultur genommen werden kann. Vorteilhafterweise lassen sich dann aus dessen Zellextrakten oder Kulturüberständen erfindungsgemäße Proteasen isolieren und herstellen.These Embodiment is therefore particularly advantageous because then the associated organism itself taken into culture can be. Advantageously, can then be from its cell extracts or culture supernatants according to the invention Isolate and produce proteases.
Bevorzugt ist die Protease in einem Mikroorganismus vorhanden, weiter bevorzugt in einem Pilz, in einem gramnegativen oder in einem grampositiven Bakterium, und hierunter besonders bevorzugt in einem Bakterium der Gattung Bacillus. Denn besonders für diese Organismen sind im Stand der Technik Kultivierungsmethoden bekannt und etabliert. Das gilt insbesondere für Bacilli, die in der technischen Enzymherstellung eine herausragende Rolle einnehmen. Ganz besonders bevorzugt ist die Protease vorhanden in Bacillus pumilus und insbesondere in Bacillus pumilus DSM ID 08-100.Preferably, the protease is present in a microorganism, more preferably in a fungus, in a Gram-negative or in a Gram-positive bacterium, and of these particularly preferably in one Bacterium of the genus Bacillus. Because especially for these organisms cultivation methods are known and established in the prior art. This is especially true for Bacilli, which play a prominent role in the technical production of enzymes. Most preferably, the protease is present in Bacillus pumilus and especially in Bacillus pumilus DSM ID 08-100.
Ferner wurde eine für eine bevorzugte erfindungsgemäße Protease codierende Nukleinsäure im Rahmen der vorliegenden Erfindung rekombinant in eine Wirtszelle eingebracht und wie vorstehend beschrieben unter der Nummer DSM 21891 bei der DSMZ hinterlegt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungform der Erfindung ist die Protease somit dadurch gekennzeichnet, dass sie von einer Nukleinsäure codiert wird, die in einer Wirtszelle mit der Hinterlegungsnummer DSM 21891 vorhanden ist.Further became one for a preferred invention Protease-encoding nucleic acid within the scope of the present invention Invention recombinantly introduced into a host cell and as above described under the number DSM 21891 deposited with the DSMZ. In a further preferred embodiment of the invention the protease is thus characterized by being derived from a Nucleic acid is coded in a host cell with the deposit number DSM 21891 is present.
Proteasen bzw. Enzyme im allgemeinen können durch verschiedene Verfahren, z. B. gezielte genetische Veränderung durch Mutageneseverfahren, weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich spezieller Eigenschaften, beispielsweise katalytische Aktivität, Stabilität, usw., optimiert werden. Änderungen der Nukleotid- oder Aminosäuresequenz, wie sie beispielsweise durch an sich bekannte molekularbiologische Methoden herbeigeführt werden können, werden demnach als Mutationen bezeichnet. Je nach Art der Änderung kennt man beispielsweise Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutationen oder solche, bei denen verschiedene Gene oder Teile von Genen miteinander fusioniert werden. Die zugehörigen Organismen werden als Mutanten bezeichnet. Von mutierten Nukleinsäuren codierte Proteine werden als Varianten bezeichnet. So führen beispielsweise Deletions-, Insertions-, Substitutionsmutationen oder Fusionen zu deletions-, insertions-, substitutionsmutierten Genen bzw. Fusionsgenen und auf Proteinebene zu entsprechenden Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten beziehungsweise Fusionsproteinen. Das Ziel ist es, in die bekannten Moleküle gezielte Mutationen, beispielsweise Substitutionen, Insertionen oder Deletionen, einzuführen, um beispielsweise die Reinigungsleistung von erfindungsgemäßen Enzymen zu verbessern. Hierzu können insbesondere die Oberflächenladungen und/oder der isoelektrische Punkt der Moleküle und dadurch beispielsweise ihre Wechselwirkungen mit dem Substrat verändert werden. So kann beispielsweise über Mutationen die Nettoladung der Enzyme verändert werden, um darüber die Substratbindung insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zu beeinflussen. Eine weitere, insbesondere ergänzende Strategie besteht darin, durch entsprechende Mutationen die Stabilität der betreffenden Proteasen zu erhöhen und dadurch ihre Reinigungsleistung zu erhöhen.proteases or enzymes in general can be prepared by various methods, z. B. targeted genetic modification by mutagenesis, evolved and for specific purposes or in terms of specific properties, such as catalytic activity, Stability, etc., to be optimized. amendments the nucleotide or amino acid sequence, as for example brought about by molecular biology methods known per se are therefore called mutations. Depending on the nature of the change, for example, deletion, Insertion or substitution mutations or those in which different genes or parts of genes are fused together. The associated organisms are called mutants. Proteins encoded by mutant nucleic acids are known as Variants called. For example, deletion, Insertion, substitution mutations or fusions to deletion, insertions, substitution mutated genes or fusion genes and at the protein level to corresponding deletion, insertion or Substitution variants or fusion proteins. The goal it is, in the known molecules targeted mutations, for example substitutions, insertions or deletions, to introduce for example, the cleaning performance of inventive To improve enzymes. For this purpose, in particular the surface charges and / or the isoelectric point of the molecules and thereby, for example their interactions with the substrate are changed. Thus, for example, via mutations, the net charge the enzymes are altered to reveal the substrate binding especially for use in detergents and cleaners to influence. Another, especially supplementary Strategy is to provide stability through appropriate mutations of the proteases in question, thereby increasing their To increase cleaning performance.
Eine moderne Richtung der Enzymentwicklung besteht darin, Elemente aus bekannten, miteinander verwandten Proteinen über statistische Verfahren zu neuen Enzymen mit bislang nicht erreichten Eigenschaften zu kombinieren. Solche Verfahren werden auch unter dem Oberbegriff Directed Evolution zusamengefaßt. Dazu gehören beispielsweise die sogenannte „StEP”-Methode, „Random priming recombination”, „DNA-Shuffling”, „RACHITT” oder „Recombining ligation reaction” (RLR).A modern direction of enzyme development consists of elements known, related proteins via statistical Procedure for new enzymes with previously unattainable properties to combine. Such procedures are also under the generic term Summarized Directed Evolution. This includes For example, the so-called "StEP" method, "Random priming recombination, "DNA shuffling", "RACHITT" or "recombining ligation reaction "(RLR).
Für die Beschreibung von Substitutionen, die genau eine Aminosäureposition betreffen (Aminosäureaustausche), wird folgende Konvention angewendet: zunächst wird die natürlicherweise vorhandene Aminosäure in Form des international gebräuchlichen Einbuchstaben-Codes bezeichnet, dann folgt die zugehörige Sequenzposition und schließlich die eingefügte Aminosäure. Mehrere Austausche innerhalb derselben Polypeptidkette werden durch Schrägstriche voneinander getrennt. Bei Insertionen sind nach der Sequenzposition zusätzliche Aminosäuren benannt. Bei Deletionen ist die fehlende Aminosäure durch ein Symbol, beispielsweise einen Stern oder einen Strich, ersetzt. Beispielsweise beschreibt A95G die Substitution von Alanin an Position 95 durch Glycin, A95AG die Insertion von Glycin nach der Aminosäure Alanin an Position 95 und A95* die Deletion von Alanin an Position 95. Diese Nomenklatur ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie bekannt.For the description of substitutions that exactly one amino acid position affect (amino acid exchanges), the following convention applied: first, the natural existing amino acid in the form of the internationally used Denotes one-letter codes, then follows the associated sequence position and finally the inserted amino acid. Several exchanges within the same polypeptide chain are performed Slashes separated. For insertions are after the sequence position additional amino acids named. For deletions, the missing amino acid is through replaced a symbol, such as a star or a dash. For example, A95G describes the substitution of alanine at position 95 by glycine, A95AG the insertion of glycine after the amino acid Alanine at position 95 and A95 * the deletion of alanine at position 95. This nomenclature is familiar to those skilled in the enzyme technology field known.
Es ist aus dem Stand der Technik weiterhin allgemein bekannt, dass sich vorteilhafte Eigenschaften einzelner Mutationen, z. B. einzelner Substitutionen, ergänzen können. Eine hinsichtlich bestimmter Eigenschaften bereits optimierte Protease, zum Beispiel hinsichtlich ihrer Stabilität gegenüber Tensiden und/oder Bleichmitteln und/oder anderen Komponenten, kann erfindungsgemäß zusätzlich weiterentwickelt werden.It It is also well known in the art that advantageous properties of individual mutations, eg. B. individual Substitutions, can complement. One regarding certain properties already optimized protease, for example in terms of their stability to surfactants and / or bleaching agents and / or other components, according to the invention additionally be further developed.
Unter Fragmenten werden alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als natürliche Proteine und beispielsweise auch synthetisch erhalten werden können. Aufgrund ihrer Aminosäuresequenzen können sie den jeweiligen vollständigen Proteinen zugeordnet werden. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen annehmen oder enzymatische Aktivitäten oder Teilaktivitäten ausüben, wie beispielsweise die Komplexierung eines bestimmten Substrats. Fragmente und Deletionsvarianten von Ausgangsproteinen sind prinzipiell gleichartig dadurch, dass eine oder mehrere Aminosäuren im Vergleich zu einer Ausgangssequenz fehlen; während Fragmente üblicherweise kleine Stücke einer Ausgangssequenz umfassen, fehlen Deletionsmutanten üblicherweise nur kurze Bereiche und damit ggfs. nur einzelne Teilaktivitäten.Fragments are understood as meaning all proteins or peptides which are smaller than natural proteins and, for example, can be obtained synthetically. Due to their amino acid sequences, they can be assigned to the respective complete proteins. For example, they may adopt the same structures or perform enzymatic activities or partial activities, such as the complexation of a particular substrate. Fragments and deletion variants of parent proteins are in principle similar in that one or more amino acids are absent compared to an initial sequence; while fragments usually comprise small pieces of an initial sequence, deletion mice are lacking usually only short areas and thus possibly only individual sub-activities.
Insertionen sind wie Deletionen nicht auf einzelne Aminosäuren beschränkt. Vielmehr können auch mehrere Aminosäuren oder ganze Fragmente oder selbst ganze Proteine in eine Ausgangssequenz eingefügt sein oder mit einer Ausgangssequenz fusioniert sein. Im letzteren Fall handelt es sich dann um ein chimäres Protein. Hierzu gehören auch Neukombinationen von größeren Enzymabschnitten, also Fragmenten, mit anderen Enzymen oder Proteinen anderer Funktion. So ist es beispielsweise möglich, ein erfindungsgemäßes Enzym oder Teile davon über peptidische Linker oder direkt als Fusionsprotein mit Bindungsdomänen aus anderen Proteinen, etwa der Cellulose-Bindungsdomäne, zu versehen und dadurch die Hydrolyse des Substrats effektiver zu gestalten. Ebenso können erfindungsgemäße Enzyme beispielsweise auch mit Amylasen oder Cellulasen oder Fragmenten davon verknüpft werden, um eine Doppelfunktion auszuüben.insertions like deletions are not limited to single amino acids. Rather, several amino acids or whole fragments or even whole proteins in an initial sequence be inserted or fused with an initial sequence be. In the latter case, it is then a chimeric protein. This includes new combinations of larger ones Enzyme sections, ie fragments, with other enzymes or proteins other function. So it is possible, for example, a enzyme of the invention or parts thereof peptidic linkers or directly as a fusion protein with binding domains from other proteins, such as the cellulose-binding domain, to provide and thereby the hydrolysis of the substrate more effectively shape. Likewise, inventive Enzymes, for example, with amylases or cellulases or fragments linked to perform a dual function.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt somit eine Protease dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einer erfindungsgemäßen Protease als Ausgangsmolekül erhaltbar ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 50 und zunehmend bevorzugt mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266, 267 oder 268 zusammenhängenden Aminosäurepositionen mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.a Another object of the invention thus represents a protease, which is characterized in that it consists of a Protease is obtainable as a parent molecule by fragmentation, deletion, Insertion or substitution mutagenesis and an amino acid sequence which covers a length of at least 50 and increasingly preferably at least 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266, 267 or 268 contiguous amino acid positions matches the parent molecule.
So ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den Loops des Enzyms einzelne Aminosäuren zu deletieren, ohne daß dadurch die proteolytische Aktivität verlorengeht. Durch derartige Deletionen kann beispielsweise oftmals auch die Allergenizität betreffender Enzyme gesenkt und somit insgesamt ihre Einsetzbarkeit verbessert werden. Hinsichtlich des beabsichtigten Einsatzes dieser Enzyme ist es besonders bevorzugt, wenn sie auch nach der Fragmentierung oder Deletionsmutagenese eine proteolytische Aktivität besitzen.So For example, it is possible at the terms or in the Loops of the enzyme to delete single amino acids, without that thereby the proteolytic activity is lost. By such deletions, for example, often the Allergenicity of relevant enzymes lowered and thus total their usability can be improved. Regarding the intended Use of these enzymes, it is particularly preferred if they too after fragmentation or deletion mutagenesis a proteolytic Own activity.
Auch Substitionenen können vorteilhafte Wirkungen begründen. Prinzipiell gehören hierzu auch Einzelaustausche von Aminosäuren, es können aber auch mehrere zusammenhängende Aminosäuren gegen andere ausgetauscht werden.Also Substitutes can give rise to advantageous effects. In principle, this also includes individual substitutions of amino acids, but it can also be several contiguous amino acids be exchanged for others.
Einen
weiteren Gegenstand der Erfindung stellt eine Protease dar, die
dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einer erfindungsgemäßen
Protease als Ausgangsmolekül erhaltbar ist und einen oder
mehrere Aminosäureaustausche in Positionen aufweist, die
den Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102,
104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199,
205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268 der Protease
aus Bacillus lentus gemäß SEQ ID NO. 4 in einem
Alignment zugeordnet sind. Die Aminosäurepositionen werden
hierbei durch ein Alignment der Aminosäuresequenz einer
erfindungsgemäßen Protease mit der Aminosäuresequenz
der Protease aus Bacillus lentus, wie sie in SEQ ID NO. 4 angegeben ist,
definiert. Ein solches Alignment ist in
Vorteilhafte Positionen für Sequenzveränderungen, insbesondere Substitutionen, der Protease aus Bacillus lentus, die übertragen auf homologe Positionen der erfindungsgemäßen Proteasen bevorzugt von Bedeutung sind und der Protease vorteilhafte funktionelle Eigenschaften verleihen, sind demnach die Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268, zuzuordnen in einem Alignment mit SEQ ID NO. 4 und damit in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 4. In den genannten Positionen liegen in dem Wildtypmolekül der Protease aus Bacillus lentus folgende Aminosäurereste: S3, V4, S36, N42, A47, T56, G61, T69, E87, A96, R99, A101, I102, S104, N114, H118, A120, S130, S139, T141, S142, S154, S157, A188, V193, V199, G205, L211, A224, K229, S236, N237, N242, H243, N255 beziehungsweise T268.advantageous Positions for sequence changes, in particular Substitutions, the protease from Bacillus lentus, that transmit to homologous positions of the invention Proteases are of importance and the protease advantageous give them functional properties are therefore the positions 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 and 268, to be assigned in an alignment with SEQ ID NO. 4 and thus in the count according to SEQ ID NO. 4. In the above positions lie in the wild-type molecule of Protease from Bacillus lentus following amino acid residues: S3, V4, S36, N42, A47, T56, G61, T69, E87, A96, R99, A101, I102, S104, N114, H118, A120, S130, S139, T141, S142, S154, S157, A188, V193, V199, G205, L211, A224, K229, S236, N237, N242, H243, N255 or T268.
Vorteilhaft sind insbesondere beispielsweise Substitutionen 3T, 4I, 61A, 99G, 99A, 99S, 154D, 154E, 211D, 211G und 211E, sofern die entsprechend homologen Positionen in einer erfindungsgemäßen Protease nicht schon natürlicherweise von einer dieser bevorzugten Aminosäuren eingenommen werden. Die Austausche 3T und 41 führen vermutlich über einen Stabilisierungseffekt auf das Molekül zu einer Verbesserung der Reinigungsleistung der Protease und damit zu einer verbesserten Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels, das die Protease enthält.Particularly advantageous examples are substitutions 3T, 4I, 61A, 99G, 99A, 99S, 154D, 154E, 211D, 211G and 211E, provided that the correspondingly homologous positions in a protease according to the invention are not naturally taken up by one of these preferred amino acids. The Austau presumably have a stabilizing effect on the molecule to improve the cleaning performance of the protease and thus to an improved cleaning performance of a washing or cleaning agent containing the protease.
Eine endgültige Bestätigung in der Zuordnung homologer Positionen, d. h. insbesondere deren funktionelle Entsprechung, können letztlich nur Vergleichsversuche liefern, wonach die beiden auf der Basis eines Alignments einander zugeordneten Positionen in beiden miteinander verglichenen Proteasen auf die gleiche Weise verändert werden und beobachtet wird, ob bei beiden die enzymatische Aktivität auf gleiche Weise verändert wird. Geht beispielsweise ein Aminosäureaustausch in einer bestimmten Position der Protease aus Bacillus lentus (BLAP) mit einer Erhöhung von KM oder einem anderen enzymatischen Parameter einher, und wird die gleiche bzw. eine ähnliche Verschiebung des KM-Werts in einer erfindungsgemäßen Protease-Variante beobachtet, deren Aminosäureaustausch durch dieselbe eingeführte Aminosäure erreicht wurde, so ist hierin die Bestätigung dieses Erfindungsaspekts zu sehen.A final confirmation in the assignment of homologous positions, ie in particular their functional correspondence, can ultimately provide only comparative experiments, according to which the two positions assigned to each other on the basis of an alignment in both compared proteases are changed in the same way and observed whether in both the enzymatic activity is changed in the same way. If, for example, an amino acid exchange in a certain position of the protease from Bacillus lentus (BLAP) is accompanied by an increase in K M or another enzymatic parameter, the same or a similar shift of the K M value is observed in a protease variant according to the invention , whose amino acid exchange has been achieved by the same introduced amino acid, the confirmation of this aspect of the invention is to be seen herein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher eine zuvor beschriebene Protease, die zusätzlich stabilisiert ist, insbesondere durch eine oder mehrere Mutationen, beispielsweise Substitutionen, oder durch Kopplung an ein Polymer.One Another object of the invention is therefore a previously described Protease, which is additionally stabilized, in particular by one or more mutations, for example substitutions, or by coupling to a polymer.
Denn eine Erhöhung der Stabilität bei der Lagerung und/oder während des Einsatzes, beispielsweise beim Waschprozess, führt dazu, dass die enzymatische Aktivität länger anhält und damit die Reinigungsleistung verbessert wird. Neben den vorstehend genannten Stabilisierungsmöglichkeiten kommen alle im Stand der Technik beschriebenen und/oder zweckmäßigen Stabilisierungsmöglichkeiten in Betracht.Because an increase in stability during storage and / or during use, for example during the washing process, causes the enzymatic activity to last longer stops and thus the cleaning performance is improved. In addition to the above-mentioned stabilization options all described in the prior art and / or appropriate Stabilization options into consideration.
Bevorzugt sind solche Stabilisierungen, die über Muationen des Enzyms selbst möglich sind. Denn diese Stabilisierungen erfordern im Anschluss an die Gewinnung des Enzyms keine weiteren Arbeitsschritte. Einige hierfür geeignete Sequenzveränderungen sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt. So können Proteasen beispielsweise auch dadurch stabilisiert werden, dass man bestimmte Tyrosin-Reste gegen andere austauscht.Prefers These are stabilizations that are due to mutations of the enzyme even possible. Because these require stabilization following the recovery of the enzyme no further steps. Some For this purpose suitable sequence changes are on known from the prior art. So can proteases For example, it can also be stabilized by being certain Replaces tyrosine residues with others.
Weitere Möglichkeiten sind beispielsweise:
- – Veränderung der Bindung von Metallionen, insbesondere der Calcium-Bindungsstellen, beispielsweise durch Austauschen von einer oder mehreren der an der Calcium-Bindung beteiligten Aminosäure gegen eine oder mehrere negativ geladene Aminosäuren und/oder durch Einführen von Sequenzveränderungen in mindestens einer der Folgen der beiden Aminosäuren Arginin/Glycin;
- – Schutz gegen den Einfluss von denaturierenden Agentien wie Tensiden durch Mutationen, die eine Veränderung der Aminosäuresequenz auf bzw. an der Oberfläche des Proteins bewirken;
- – Austausch von Aminosäuren, die nahe dem N-Terminus liegen, gegen solche, die vermutlich über nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären Struktur leisten.
- Changing the binding of metal ions, in particular the calcium binding sites, for example by exchanging one or more of the amino acids participating in the calcium binding for one or more negatively charged amino acids and / or introducing sequence changes in at least one of the sequences of the two amino acids arginine / glycine;
- Protection against the effect of denaturing agents, such as surfactants, on mutations causing an alteration of the amino acid sequence on or on the surface of the protein;
- Replacement of amino acids located near the N-terminus against those likely to contact non-covalent interactions with the rest of the molecule, thus contributing to the maintenance of the globular structure.
Bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen das Enzym auf mehrere Arten stabilisiert wird. Denn es kann davon ausgegangen werden, dass mehrere stabilisierende Mutationen additiv oder synergistisch wirken.preferred Embodiments are those in which the enzyme is on several species is stabilized. Because it can be assumed be that multiple stabilizing mutations additive or synergistic Act.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt eine Protease wie vorstehend beschrieben dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens eine chemische Modifikation aufweist. Eine Protease mit einer solchen Veränderung wird auch als Derivat bezeichnet, d. h. die Protease ist derivatisiert.a Another object of the invention provides a protease as above described, which is characterized in that they at least has a chemical modification. A protease with such a Change is also called derivative, i. H. the Protease is derivatized.
Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen können beispielsweise biologisch im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch die Wirtszelle erfolgen. Diesbezüglich sind Kopplungen niedrigmolekularer Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben. Hierfür können molekularbiologische Methoden eingesetzt werden. Derivatisierungen können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Beispielsweise ist die Kopplung von Aminen an Carboxylgruppen eines Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts möglich. Bei solch einer Verbindung kann es sich aber auch um andere Proteine handeln, die beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. Derartige Modifizierungen können beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein. Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen, genauso wie auch ein nichtkovalenter Einschluss in geeignete makromolekulare Käfigstrukturen. Derartige Modifikationen können ferner die Stabilität, Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat oder die enzymatische Aktivität beeinflussen. Sie können auch dazu dienen, um die Allergenizität und/oder Immunogenizität des Enzyms herabzusetzen und damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen. Beispielsweise können Kopplungen mit makromolekularen Verbindungen, beispielsweise Polyethylenglykol, das Protein hinsichtlich der Stabilität und/oder Hautverträglichkeit verbessern.For the purposes of the present application, derivatives are understood as meaning those proteins whose pure amino acid chain has been chemically modified. Such derivatizations can be carried out, for example, biologically in connection with protein biosynthesis by the host cell. In this regard, couplings of low molecular weight compounds such as lipids or oligosaccharides are particularly noteworthy. For this molecular biological methods can be used. However, derivatizations can also be carried out chemically, for example by the chemical transformation of a side chain of an amino acid or by covalent binding of another compound to the protein. For example, the coupling of amines to carboxyl groups of an enzyme to alter the isoelectric point is possible. However, such a compound can also be other proteins which are bound, for example via bifunctional chemical compounds, to proteins according to the invention. Such modifications may, for example, affect the substrate specificity or binding strength to the substrate or cause a temporary blockage of the enzymatic activity when the coupled substance is an inhibitor. This can be useful, for example, for the period of storage. Also, derivatization is understood to mean covalent attachment to a macromolecular carrier, as well as noncovalent inclusion in suitable macromolecular cage structures. Such modifications may further affect stability, substrate specificity, or binding strength to the substrate or enzymatic activity. They can also serve to reduce the allergenicity and / or immunogenicity of the enzyme and thus increase its skin tolerance, for example. For example, couplings with macromolecular compounds, for example, polyethylene glycol, can improve the protein in terms of stability and / or skin tolerance.
Unter Derivaten eines erfindungsgemäßen Proteins können im weitesten Sinne auch Präparationen dieser Proteine verstanden werden. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit bestimmten anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen eines erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, dass es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine enzymatische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe gesteuert werden. Insbesondere die gemeinsame Präparation von Proteasen mit Protease-Inhibitoren ist vorteilhaft.Under Derivatives of a protein of the invention can understood in the broadest sense also preparations of these proteins become. Depending on extraction, processing or preparation can a protein be associated with various other substances be, for example, from the culture of producing microorganisms. A protein can also, for example, increase its Storage stability, targeted with certain other substances have been added. Therefore, according to the invention also all preparations of an inventive Protein. That is also independent of whether it is in one certain preparation actually this enzymatic Activity unfolded or not. Because it can be desired be that there is little or no activity during storage owns, and only at the time of use its enzymatic Function unfolds. This can, for example, via appropriate Accompanying substances are controlled. In particular, the joint preparation proteases with protease inhibitors is advantageous.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für eine erfindungsgemäße Protease codiert, sowie ein Vektor enthaltend eine solche Nukleinsäure.One Another subject of the invention is a nucleic acid, which codes for a protease according to the invention, and a vector containing such a nucleic acid.
Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung die natürlicherweise aus Nukleotiden aufgebauten als Informationsträger dienenden Moleküle zu verstehen, die für die lineare Aminosäureabfolge in Proteinen oder Enzymen codieren. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Als der natürlicherweise dauerhaftere Informationsträger ist die Nukleinsäure DNA für molekularbiologische Arbeiten bevorzugt. Demgegenüber wird für die Realisierung der Erfindung in natürlicher Umgebung, wie beispielsweise in einer exprimierenden Zelle, eine RNA gebildet, weshalb erfindungswesentliche RNA-Moleküle ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.Under Nucleic acids are within the meaning of the present application naturally constructed from nucleotides as information carriers serving for the linear molecules Code amino acid sequence in proteins or enzymes. she can be as a single strand, as one to this single strand complementary single strand or as a double strand. As the naturally more permanent information carrier the nucleic acid DNA for molecular biological Works preferred. In contrast, for the Realization of the invention in natural environment, such as for example, in an expressing cell, an RNA is formed, which is why essential RNA molecules also embodiments of the present invention.
Bei DNA sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen.at DNA is the sequence of both complementary strands to be considered in all three possible reading frames.
Ferner ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codons, also Basentriplets, für die gleichen Aminosäuren codieren können, so dass eine bestimmte Aminosäuresequenz von mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuren codiert werden kann, was als Degeneriertheit des genetischen Codes bezeichnet wird. Außerdem weisen verschiedene Organismen Unterschiede im Gebrauch dieser Codons auf. Aus diesen Gründen müssen sowohl Aminosäuresequenzen als auch Nukleotidsequenzen in die Betrachtung des Schutzbereichs einbezogen werden. Daher sind sämtliche Nukleotidsequenzen und damit Nukleinsäuren in diesen Erfindungsgegenstand mit eingeschlossen, die eine der vorstehend beschriebenen Proteasen codieren können. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleotidsequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind. Daher kann der Fachmann ausgehend von einer Aminosäuresequenz für diese Aminosäuresequenz codierende Nukleinsäuren problemlos ermitteln.Further is to take into account that different codons, ie Base triplets encoding the same amino acids can, allowing a specific amino acid sequence be encoded by several different nucleic acids can, what is called degeneracy of the genetic code. In addition, different organisms have differences in the Use of these codons. For these reasons need both amino acid sequences and nucleotide sequences be included in the consideration of the scope. Therefore are all nucleotide sequences and thus nucleic acids included in this subject of the invention, one of the encoding proteases described above. Of the One skilled in the art is capable of doing these nucleotide sequences beyond doubt because despite the degeneracy of the genetic code individual codons defined amino acids are assigned. Therefore, the person skilled in the art can start from an amino acid sequence for this amino acid sequence encoding nucleic acids determine easily.
Einem
Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden,
wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) in Verbindung mit molekular-biologischen und/oder proteinchemischen
Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder
Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren
bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige
Methoden sind beispielsweise aus
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nukleinsäure, die für eine erfindungsgemäße Protease kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
- a) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in einem Teilstück von mindestens 300 zusammenhängenden Nukleotiden mindestens zu 97,1% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist
- b) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in den Positionen 325 bis 1149 mindestens zu 97,1% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist
- c) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 97,1% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
- a) Nucleic acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1 nucleic acid sequence in a portion of at least 300 contiguous nucleotides at least 97.1% and increasingly preferably at least 97.2%, 97.4%, 97.6%, 97.8%, 98%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99, 8%, 99.9%, and most preferably 100% identical
- b) Nucleic acid sequence corresponding to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1 to at least 97.1%, and more preferably at least 97.2%, 97.4%, 97.6%, 97.8%, 98%, 98.2%, 98, of Nucleic Acid Sequence in positions 325 to 1149. 3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3% , 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and most preferably 100% identical
- c) Nucleic acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1 to at least 97.1%, and more preferably at least 97.2%, 97.4%, 97.6%, 97.8%, 98%, 98.2%, 98.3%, 98.4 %, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and most preferably 100% identical.
In einer weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in einem Teilstück von zunehmend bevorzugt 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 zusammenhängenden Nukleotiden jeweils mindestens zu 97,1% und zunehmend bevorzugt jeweils zu mindestens 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.In Another embodiment of the invention is the Nucleic acid characterized in that it has a nucleic acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1 indicated nucleic acid sequence in a portion of increasingly preferred 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 contiguous nucleotides in each case at least 97.1% and increasingly preferably in each case at least 97.2%, 97.4%, 97.6%, 97.8%, 98%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% and most preferably 100% identical is.
Die vorstehend unter b) angegebene Nukleinsäuresequenz betrifft den Bereich, der für die reife (mature) Protease codiert. Das Stop-Codon ist in diese Betrachtung einbezogen, denn dessen Existenz sorgt dafür, dass nicht ein größeres, evtl. nicht mehr funktionsfähiges, ungewolltes Protein gebildet wird. Somit ist bei einer Klonierung darauf zu achten, dass an dieser Stelle ebenfalls ein Stop-Codon liegt, wenn nicht gezielt über den C-Terminus eine Proteinfusion herbeigeführt werden soll. Sollte sich später herausstellen, dass das reife (mature) Protein nur von einem Teil dieser Sequenz gebildet wird, so gilt der Schutzbereich entsprechend für diesen Teil. Bevorzugt sind solche Nukleinsäuren, die für reife (mature) Proteine codieren, und zunehmend bevorzugt sind besonders solche, die für zunehmend aktivere Varianten der erfindungsgemäßen Proteine codieren.The p. above) nucleic acid sequence the region coding for the mature protease. The stop codon is included in this consideration because of its Existence ensures that not a bigger, possibly no longer functional, unwanted protein is formed. Thus, when cloning is to pay attention that at this point there is also a stop codon, if not specifically induced via the C-terminus, a protein fusion shall be. Should later turn out that the Mature protein is formed only from part of this sequence is, the scope of protection applies accordingly for this Part. Preference is given to those nucleic acids which are suitable for encode mature proteins, and are increasingly preferred those which are increasingly active variants of the invention Encode proteins.
Weiterhin können bei erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ein oder mehrere Codons durch synonyme Codons ersetzt worden sein. Dieser Aspekt bezieht sich auf die heterologe Expression der erfindungsgemäßen Enzyme. So besitzt jeder Organismus, insbesondere jeder Produktionsstamm, eine gewisse Codon-Usage. Unter Codon-Usage wird die Übersetzung des genetischen Codes in Aminosäuren verstanden, d. h. welche Nukleotidfolge (Triplett oder Basentriplett) für welche Aminosäure bzw. für welche Funktion, beispielsweise Beginn und Ende des zu translatierenden Bereichs, Bindungsstellen für verschiedene Proteine, usw., codiert. So besitzt jeder Organismus, insbesondere jede Wirtszelle, eine bestimmte Codon-Usage. Es kann zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der transgenen Nukleinsäure liegenden Codons in der Wirtszelle einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNAs gegenüberstehen. Synonyme Codons codieren dagegen für dieselben Aminosäuren und können in der jeweiligen Wirtszelle besser translatiert werden. Dieses gegebenenfalls notwendige Umschreiben hängt somit von der Wahl des Expressionssystems ab. Insbesondere bei Proben aus unbekannten, eventuell nicht kultivierbaren Organismen kann eine entsprechende Anpassung notwendig sein.Farther can in nucleic acids of the invention one or more codons have been replaced by synonymous codons. This aspect relates to the heterologous expression of the invention Enzymes. So every organism, especially every production strain, a certain codon usage. Under codon usage is the translation understood the genetic code in amino acids, d. H. which nucleotide sequence (triplet or base triplet) for which amino acid or for which function, for example onset and end of the region to be translated, binding sites for different proteins, etc., coded. So every organism, in particular, each host cell, a particular codon Usage. It can bottlenecks in protein biosynthesis occur when the on the transgenic nucleic acid codons in the Host cell of a comparatively small number of loaded tRNAs face. Synonymous codons encode for the same amino acids and may be in the respective Host cell be translated better. This possibly necessary Rewriting thus depends on the choice of the expression system. Especially for samples from unknown, possibly not cultivable Organisms may need to be adjusted accordingly.
Mit allen genannten Erfindungsgegenständen und Ausführungsformen sind als weitere Erfindungsgegenstände entsprechende Vektoren, Wirtszellen, Herstellungsverfahren, in denen entsprechende Vektoren oder Wirtszellen eingesetzt werden sowie Verwendungen entsprechender Nukleinsäuren, Vektoren und Wirtszellen verbunden. Daher betreffen die vorstehenden Ausführungen diese Erfindungsgegenstände entsprechend.With All of the above subjects of the invention and embodiments are as further subjects of the invention corresponding vectors, Host cells, production methods in which appropriate vectors or Host cells are used as well as uses accordingly Linked to nucleic acids, vectors and host cells. Therefore The above statements relate to these subjects of the invention corresponding.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit ein Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor.One Another object of the invention is thus a vector, the one contains nucleic acid according to the invention, in particular a cloning vector or an expression vector.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten. Sie vermögen diese in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkulare genetische Elemente. Es wird unterschieden zwischen solchen Vektoren, die der Lagerung und somit gewissermaßen auch der gentechnischen Arbeit dienen, sogenannten Klonierungsvektoren, und solchen, die die Funktion erfüllen, die Nukleinsäure bzw. das auf dieser vorhandene Gen (oftmals Transgen) in der Wirtszelle zu realisieren, das heißt, die Expression des betreffenden Polypeptids zu ermöglichen. Diese Vektoren werden als Expressionsvektoren bezeichnet.Under For the purposes of the present invention, vectors are made from nucleic acids existing elements understood as the characteristic nucleic acid region contain a nucleic acid according to the invention. she they can translocate in a species or cell line several generations or cell divisions away as a stable genetic Establish element. Vectors are especially in use in bacteria special plasmids, so circular genetic elements. It is distinguished between such vectors, the storage and thus to a certain extent also the genetic engineering work serve, so-called cloning vectors, and those that have the function meet, the nucleic acid or on this to realize existing gene (often transgene) in the host cell, that is, the expression of the subject polypeptide to enable. These vectors are called expression vectors designated.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure geeigneterweise in einen Vektor kloniert. Dazu können beispielsweise solche gehören, deren Ursprung bakterielle Plasmide, Viren oder Bacteriophagen sind, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Es ist dabei im Sinne der Erfindung unerheblich, ob sie extrachomosomal als eigene Einheiten vorliegen oder in ein Chromosom bzw. chromosomale DNA integrieren. Welches der zahlreichen aus dem Stand der Technik bekannten Systeme gewählt wird, hängt vom Einzelfall ab. Ausschlaggebend können beispielsweise die erreichbare Kopienzahl, die zur Verfügung stehenden Selektionssysteme, darunter vor allem Antibiotikaresistenzen, oder die Kultivierbarkeit der zur Aufnahme der Vektoren befähigten Wirtszellen sein.in the The scope of the present invention is an inventive Nucleic acid suitably cloned into a vector. These may include, for example, those whose Origin of bacterial plasmids, viruses or bacteriophages are, or predominantly synthetic vectors or plasmids with elements of various kinds Origin. With the other existing genetic elements Vectors can translocate in the respective host cells several generations as stable units. It is irrelevant in the context of the invention, whether they are extrachromosomal exist as separate units or in a chromosome or chromosomal Integrate DNA. Which of the numerous from the state of the art well-known systems depends on the individual case from. Decisive, for example, the achievable Copy number, the available selection systems, especially antibiotic resistance, or cultivability be the host cells capable of receiving the vectors.
Expressionsvektoren umfassen Teilsequenzen, die sie dazu befähigen, in den sie enthaltenden Wirtszellen, vorzugsweise Mikroorganismen, besonders bevorzugt Bakterien, zu replizieren und dort eine enthaltene Nukleinsäure zur Expression zu bringen. Die Expression wird insbesondere von dem oder den Promotoren beeinflusst, welche die Transkription regulieren. Prinzipiell kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor der zu exprimierenden Nukleinsäure lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle oder auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle. Im vorliegenden Fall wird zumindest ein Promotor für die Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Verfügung gestellt und für deren Expression genutzt.expression vectors include subsequences that enable them to enter the host cells containing them, preferably microorganisms, especially prefers bacteria to replicate and there a contained nucleic acid to bring to expression. The expression is particularly of the promoter (s) that regulate transcription. In principle, expression can be influenced by the natural, originally in front of the nucleic acid to be expressed localized promoter, but also by one on the expression vector provided promoter of the host cell or by a modified or a completely different promoter of another organism or another host cell. In the present case, at least a promoter for the expression of a Nucleic acid provided and for used their expression.
Expressionsvektoren können regulierbar sein, beispielsweise durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte der sie enthaltenen Wirtszellen oder durch Zugabe von bestimmten Substanzen, insbesondere Aktivatoren der Genexpression. Ein Beispiel für eine solche Substanz ist das Galactose-Derivat Isopropyl-β-Dthiogalactopyranosid (IPTG), welches als Aktivator des bakteriellen Lactose-Operons (lac-Operons) verwendet wird.expression vectors can be regulated, for example by changing the cultivation conditions or when a certain Cell density of the host cells they contain or by adding certain Substances, in particular activators of gene expression. An example for such a substance, the galactose derivative is isopropyl-β-dithiogalactopyranoside (IPTG), which activates the bacterial lactose operon (lac operon) is used.
Expressionsvektoren ermöglichen, dass ein erfindungsgemäßes Protein heterolog, also in einer anderen Zelle bzw. Wirtszelle als derjenigen, aus der es natürlicherweise gewonnen werden kann, produziert wird. Die Zellen können dabei zu verschiedenen Organismen zugehörig sein oder von verschiedenen Organismen stammen. Auch eine homologe Gewinnung eines erfindungsgemäßen Proteins aus einer Wirtszelle, die dieses Protein natürlicherweise (also bereits in ihrer Wildtyp-Form) exprimiert, ist mit einem erfindungsgemäßen Vektor möglich. Dies kann den Vorteil aufweisen, dass natürliche, mit der Translation in einem Zusammenhang stehende Modifikationen an dem entstehenden Protein genauso durchgeführt werden, wie sie auch natürlicherweise ablaufen würden.expression vectors allow an inventive Protein heterologous, so in another cell or host cell as the one from which it is naturally derived can, is produced. The cells can be different Belonging to organisms or derived from different organisms. Also, a homologous recovery of an inventive Protein from a host cell containing this protein naturally (ie already in its wild-type form) is expressed with an inventive Vector possible. This may have the advantage that natural, Translational related modifications be performed on the resulting protein as well as they would naturally occur.
Zu einem einsetzbaren Expressionssystem können ferner zusätzliche Nukleinsäuren (Gene) bzw. von ihnen codierte Proteine zählen, beispielsweise solche, die auf anderen Vektoren zur Verfügung gestellt werden, und die die Produktion erfindungsgemäßer Proteine beeinflussen. Hierbei kann es sich um modifizierende Proteine handeln oder um solche, die mit dem erfindungsgemäßen Protein gemeinsam aufgereinigt werden sollen, etwa um dessen enzymatische Funktion zu beeinflussen. Dabei kann es sich beispielsweise um andere Proteine oder Enzyme, um Inhibitoren oder um solche Elemente handeln, die die Wechselwirkung mit verschiedenen Substraten beeinflussen. In der Regel müssen aus der Fülle an verschiedenen im Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systemen die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermittelt werden.To An insertable expression system may further include additional Counting nucleic acids (genes) or proteins encoded by them, for example, those available on other vectors be placed, and the production according to the invention Influence proteins. These may be modifying proteins act or those with the invention Protein should be purified together, about its enzymatic To influence function. These may be, for example, other proteins or enzymes to inhibitors or to act on such elements affect the interaction with different substrates. In usually have to come from the abundance of different ones in the prior art available systems the optimal expression systems for the individual case experimentally be determined.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine nicht menschliche Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor beinhaltet, oder die eine erfindungsgemäße Protease beinhaltet, insbesondere eine, die die Protease in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. ein erfindungsgemäßer Vektor wird bevorzugt in die Wirtszelle eingebracht durch deren Transformation. Bevorzugt wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. ein erfindungsgemäßer Vektor in einen Mikroorganismus transformiert, der dann eine erfindungsgemäße Wirtszelle darstellt. Alternativ können auch einzelne Komponenten, d. h. Nukleinsäure-Teile bzw. -Fragmente einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure derart in eine Wirtszelle eingebracht werden, dass die dann resultierende Wirtszelle eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Dieses Vorgehen eignet sich besonders dann, wenn die Wirtszelle bereits einen oder mehrere Bestandteile einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. eines erfindungsgemäßen Vektors enthält und die weiteren Bestandteile dann entsprechend ergänzt werden. Verfahren zur Transformation von Zellen sind im Stand der Technik etabliert und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Zellen, das heißt prokaryotische oder eukaryotische Zellen. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit der Nukleinsäure oder dem Vektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Ferner zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sezernieren das (transgen) exprimierte Protein in das die Wirtszellen umgebende Medium.A further subject of the invention is a non-human host cell which contains a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention or which contains a protease according to the invention, in particular one which secretes the protease into the medium surrounding the host cell. A nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention is preferably introduced into the host cell by its transformation. Preferably, a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention is transformed into a microorganism, which then represents a host cell according to the invention. Alternatively, it is also possible for individual components, ie nucleic acid fragments or fragments of a nucleic acid according to the invention, to be introduced into a host cell in such a way that the resulting host cell contains a nucleic acid or a vector according to the invention. This procedure is particularly suitable when the host cell already contains one or more constituents of a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention and the further constituents are then supplemented accordingly. Methods of transforming cells are well established in the art and well known to those skilled in the art. In principle, all cells, that is to say prokaryotic or eukaryotic cells, are suitable as host cells. Preference is given to those host cells which can be handled genetically advantageous, what in For example, the transformation with the nucleic acid or the vector and its stable establishment, for example, unicellular fungi or bacteria. Furthermore, preferred host cells are characterized by good microbiological and biotechnological handling. This concerns, for example, easy culturing, high growth rates, low demands on fermentation media and good production and secretion rates for foreign proteins. Preferred host cells according to the invention secrete the (transgenially) expressed protein into the medium surrounding the host cells.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Vektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine wirtschaftliche Produktion der erfindungsgemäßen Proteine. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist IPTG wie vorstehend beschrieben.Further preferred embodiments provide such host cells due to genetic regulatory elements, for example be provided on the vector, as well can be present in these cells from the outset, are regulatable in their activity. For example, by controlled addition of chemical compounds acting as activators serve by changing the cultivation conditions or when they reach a certain cell density, they can be excited for expression. This allows an economic Production of the proteins according to the invention. One An example of such a compound is IPTG as above described.
Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryontische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Kultivierungsverfahren bzw. Herstellungsverfahren etabliert werden. Zudem verfügt der Fachmann bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf usw., gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein.preferred Host cells are prokaryotic or bacterial cells. bacteria are characterized by short generation times and low demands to the cultivation conditions. This can be cost effective Cultivation method or manufacturing process can be established. In addition, the expert has bacteria in the fermentation over a wealth of experience. For a special production can be different, in individual cases experimentally reasons to be determined, such as nutrient sources, Product formation rate, time required, etc., Gram-negative or Gram-positive Bacteria be suitable.
Bei gramnegativen Bakterien wie beispielsweise Escherichia coli wird eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sezerniert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Ferner können auch gramnegative Bakterien so ausgestaltet werden, dass sie die exprimierten Proteine nicht nur in den periplasmatischen Raum, sondern in das das Bakterium umgebende Medium ausschleusen. Grampositive Bakterien wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so dass sezernierte Proteine sogleich in das die Bakterien umgebende Medium, in der Regel das Nährmedium, abgegeben werden, aus welchem sich die exprimierten Proteine aufreinigen lassen. Sie können aus dem Medium direkt isoliert oder weiter prozessiert werden. Zudem sind grampositive Bakterien mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Enzyme, so dass sie über eine ähnliche Codon-Usage verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist.at gram-negative bacteria such as Escherichia coli secretes a variety of proteins in the periplasmic space, that is, into the compartment between the two enclosing the cells Membranes. This can be advantageous for special applications be. Furthermore, Gram-negative bacteria can also be designed in this way be that they express the proteins not only in the periplasmic Space, but in the medium surrounding the bacterium eject. Gram-positive bacteria such as Bacilli or Actinomycetes or other representatives of Actinomycetales possess in contrast no outer membrane, leaving secreted proteins immediately into the medium surrounding the bacteria, usually the nutrient medium, are released, from which the expressed proteins purify to let. They can be isolated directly from the medium or be processed further. In addition, gram-positive bacteria with most of the organisms of origin for technically important ones Enzymes are related or identical and mostly self-comparable Enzymes, so they have a similar codon usage and their protein synthesizer of course accordingly is aligned.
Erfindungsgemäße Wirtszellen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder noch andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere auch um solche Wirtszellen handeln, die mehrere Proteine oder Enzyme transgen exprimieren.invention Host cells can meet their requirements the cultural conditions have changed, others or additional Have selection markers or other or additional Express proteins. In particular, it may also be such host cells which express several proteins or enzymes transgene.
Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf alle Mikroorganismen, insbesondere auf alle fermentierbaren Mikroorganismen, besonders bevorzugt auf solche der Gattung Bacillus, anwendbar und führt dazu, dass sich durch den Einsatz solcher Mikroorganismen erfindungsgemäße Proteine herstellen lassen. Solche Mikroorganismen stellen dann Wirtszellen im Sinne der Erfindung dar.The the present invention is in principle applicable to all microorganisms, in particular to all fermentable microorganisms, especially preferably applicable to those of the genus Bacillus, and leads to that by the use of such microorganisms according to the invention Make proteins. Such microorganisms then put Host cells in the context of the invention.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia.In Another embodiment of the invention is the host cell characterized in that it is a bacterium, preferably one, that is selected from the group of genera of Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas and Pseudomonas, more preferred one that is selected from the group of Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor and Stenotrophomonas maltophilia.
Die Wirtszelle kann aber auch eine eukaryontische Zelle sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt daher eine Wirtszelle dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt.The However, the host cell can also be a eukaryotic cell that is characterized characterized in that it has a nucleus. Another one The invention therefore provides a host cell which is characterized characterized in that it has a nucleus.
Im Gegensatz zu prokaryontischen Zellen sind eukaryontische Zellen in der Lage, das gebildete Protein posttranslational zu modifizieren. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Zu den Modifikationen, die eukaryontische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität eines exprimierten Proteins wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen, kann vorteilhaft sein. Ferner können sich beispielsweise thermophile pilzliche Expressionssysteme besonders zur Expression temperaturbeständiger Proteine oder Varianten eignen.In contrast to prokaryotic cells, eukaryotic cells are capable of post-translationally modifying the protein formed. Examples are fungi such as actinomycetes or yeasts such as sucrose myces or Kluyveromyces. This may be particularly advantageous, for example, if the proteins are to undergo specific modifications in the context of their synthesis that enable such systems. Modifications that eukaryotic systems perform, especially in connection with protein synthesis, include, for example, the binding of low molecular weight compounds such as membrane anchors or oligosaccharides. Such oligosaccharide modifications may be desirable, for example, to lower the allergenicity of an expressed protein. Also, coexpression with the enzymes naturally produced by such cells, such as cellulases, may be advantageous. Furthermore, for example, thermophilic fungal expression systems may be particularly suitable for the expression of temperature-resistant proteins or variants.
Die erfindungsgemäßen Wirtszellen werden in an sich bekannter Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Wirtszellen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig aus dem Medium das gebildete Protein entnommen werden kann.The Host cells according to the invention are in themselves cultivated and fermented in a known manner, for example in discontinuous or continuous systems. In the first case will be a suitable one Nutrient medium inoculated with the host cells and the product after an experimentally determined period of time from the medium harvested. Continuous fermentations are characterized by reaching a steady state in which over a relatively long-term cells partly die off but also regrow and at the same time from the medium the formed protein can be removed.
Erfindungsgemäße Wirtszellen werden bevorzugt verwendet, um erfindungsgemäße Proteasen herzustellen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer Protease umfassend
- a) Kultivieren einer erfindungsgemäßen Wirtszelle
- b) Isolieren der Protease aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.
- a) culturing a host cell according to the invention
- b) isolating the protease from the culture medium or from the host cell.
Dieser Erfindungsgegenstand umfasst bevorzugt Fermentationsverfahren. Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes, beispielsweise der erfindungsgemäßen Protease. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem entsprechenden Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Protease beruhen, stellen Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.This Subject of the invention preferably comprises fermentation process. Fermentation are known per se from the prior art and represent the actual large-scale production step, usually followed from a suitable purification method of the product produced, for example, the protease according to the invention. All fermentation processes based on a corresponding procedure for the preparation of a protease according to the invention are based, embodiments of this subject invention represents.
Hierbei müssen die jeweils optimalen Bedingungen für die Herstellungsverfahren, insbesondere die optimalen Kulturbedingungen für die benutzten Wirtszellen, nach dem Wissen des Fachmanns experimentell ermittelt werden, beispielsweise hinsichtlich Fermentationsvolumen und/oder Medienzusammensetzung und/oder Sauerstoffversorgung und/oder Rührergeschwindigkeit.in this connection need each of the optimal conditions for the Production process, in particular the optimal culture conditions for the host cells used, according to the knowledge of the expert be determined experimentally, for example in terms of fermentation volume and / or media composition and / or oxygenation and / or Stirrer.
Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen ebenfalls in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte als auch in der Zellmasse bzw. Trockenmasse und/oder vor allem der Aktivität der interessierenden Protease erreicht werden.Fermentation process, which are characterized in that the fermentation over An inflow strategy is also implemented into consideration. Here are the media components, by the continuous cultivation are consumed, fed. This can increase considerably both in the cell density as well as in the cell mass or dry mass and / or especially the activity of the protease of interest become.
Ferner kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden.Further The fermentation can also be designed to be unwanted Metabolites filtered out or by adding buffer or each appropriate counterions are neutralized.
Die hergestellte Protease kann aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Ein solches Fermentationsverfahren ist gegenüber einer Isolation der Protease aus der Wirtszelle, d. h. einer Produktaufbereitung aus der Zellmasse (Trockenmasse) bevorzugt, erfordert jedoch die Zurverfügungstellung von geeigneten Wirtszellen oder von einem oder mehreren geeigneten Sekretionsmarkern bzw. -mechanismen und/oder Transportsystemen, damit die Wirtszellen die Protease in das Fermentationsmedium sezernieren. Ohne Sekretion kann alternativ die Isolation der Protease aus der Wirtszelle, d. h. eine Aufreinigung derselben aus der Zellmasse, erfolgen. Auch hierfür sind verschiedene Verfahren bekannt, wie Fällung z. B. durch Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder die chromatographische Reinigung.The Protease prepared can be harvested from the fermentation medium become. Such a fermentation process is opposite isolation of the protease from the host cell, d. H. a product preparation the cell mass (dry matter) preferred, but requires the provision of suitable host cells or of one or more suitable ones Secretion markers or mechanisms and / or transport systems, so that the host cells secrete the protease into the fermentation medium. Without secretion, alternatively, the isolation of the protease from the Host cell, d. H. a purification of the same from the cell mass, respectively. Again, various methods are known as precipitation z. As by ammonium sulfate or ethanol, or the chromatographic purification.
Alle vorstehend ausgeführten Sachverhalte können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteasen herzustellen. Es sind diesbezüglich eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten von Verfahrensschritten denkbar. Das optimale Verfahren muss für jeden konkreten Einzelfall ermittelt werden.All The circumstances outlined above may apply Combined method to inventive Produce proteases. There are many in this regard possible combinations of process steps conceivable. The optimal procedure must be for each specific case be determined.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine erfindungsgemäße Protease wie vorstehend beschrieben enthält. Bevorzugt ist das Mittel ein Wasch- oder Reinigungsmittel.One Another object of the invention is an agent which is characterized is that it is a protease according to the invention contains described above. Preferred is the agent a washing or cleaning agent.
Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Mittel ferner dadurch gekennzeichnet, dass es eine erfindungsgemäße Protease in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels enthält.Prefers an agent according to the invention is further characterized characterized in that it is an inventive Protease in an amount of 2 μg to 20 mg, preferably from 5 μg to 17.5 mg, more preferably 20 μg to 15 mg and most preferably from 50 μg to 10 contains mg per g of the agent.
Zu diesem Erfindungsgegenstand zählen alle denkbaren Wasch- bzw. Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Handwäsche beziehungsweise -reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder, für die die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet wird.To This subject matter includes all conceivable washing or detergent types, both concentrates and undiluted means to be used, for commercial scale use, in the washing machine or in hand washing respectively -cleaning. These include, for example, detergents for Textiles, carpets, or natural fibers, for which the name Detergent is used. These include, for example also dishwashing detergents for dishwashers or manual dishwashing detergent or cleaner for hard surfaces such as metal, glass, porcelain, ceramics, Tiles, stone, painted surfaces, plastics, wood or leather for which the term detergent is used becomes.
Ein erfindungsgemäßes Mittel kann sowohl ein Mittel für Großverbraucher oder technische Anwender als auch ein Produkt für den Privatverbraucher sein, wobei alle im Stand der Technik etablierten Wasch- und Reinigungsmittelarten ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.One Means according to the invention can be both an agent for bulk consumers or technical users as also be a product for the private consumer, whereby all types of detergents and cleaning agents established in the prior art also embodiments of the present invention represent.
Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel, die als insbesondere pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können außer den erfindungsgemäß eingesetzten Proteasen im Prinzip alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei bevorzugt mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist. Die erfindungsgemäßen Mittel können insbesondere Buildersubstanzen, oberflächenaktive Tenside, Bleichmittel auf Basis organischer und/oder anorganischer Persauerstoffverbindungen, Bleichaktivatoren, wassermischbare organische Lösungsmittel, Enzyme, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, pH-Regulatoren und weitere Hilfsstoffe wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Schaumregulatoren sowie Farb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthalten.The detergents or cleaners according to the invention, as in particular powdered solids, in nachverdichteter Particle form, as homogeneous solutions or suspensions can, except the inventively used Proteases in principle all known and customary in such agents Contain ingredients, preferably at least one other Ingredient is present in the agent. The invention In particular, builders, surface-active agents can be used Surfactants, bleaching agents based on organic and / or inorganic Peroxygen compounds, bleach activators, water-miscible organic Solvents, enzymes, sequestrants, electrolytes, pH regulators and other auxiliaries such as optical brighteners, grayness inhibitors, Foam regulators, as well as dyes and fragrances, and combinations included hereof.
Insbesondere eine weitere Kombination der erfindungsgemäßen Wirkstoffe mit einem oder mehreren weiteren Inhaltsstoff(en) der Mittel erweist sich als vorteilhaft, da ein solches Mittel eine verbesserte Reinigungsleistung durch sich ergebende Synergismen aufweisen kann. Insbesondere durch die Kombination einer erfindungsgemäßen Protease mit einem der nachfolgend beschriebenen Tenside und/oder einer der nachfolgend beschriebenen Buildersubstanzen und/oder einem der nachfolgend beschriebenen Bleichmittel wird ein solcher Synergismus erreicht.Especially another combination of the invention Active substances with one or more further ingredients of the Means proves to be advantageous, since such a means a improved cleaning performance through resulting synergisms can have. In particular, by the combination of an inventive Protease with one of the surfactants described below and / or one of the builders described below and / or a The bleaching agent described below becomes such a synergism reached.
Die erfindungsgemäßen Mittel können ein Tensid oder mehrere Tenside enthalten, wobei insbesondere anionische Tenside, nichtionische Tenside und deren Gemische, aber auch kationische, zwitterionische und amphotere Tenside in Frage kommen.The Agents according to the invention can be a surfactant or more surfactants, especially anionic surfactants, nonionic surfactants and their mixtures, but also cationic, zwitterionic and amphoteric surfactants come into question.
Geeignete nichtionische Tenside sind insbesondere Alkylglykoside und Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte von Alkylglykosiden oder linearen oder verzweigten Alkoholen mit jeweils 12 bis 18 C-Atomen im Alkylteil und 3 bis 20, vorzugsweise 4 bis 10 Alkylethergruppen. Weiterhin sind entsprechende Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte von N-Alkyl-aminen, vicinalen Diolen, Fettsäureestern und Fettsäureamiden, die hinsichtlich des Alkylteils den genannten langkettigen Alkoholderivaten entsprechen, sowie von Alkylphenolen mit 5 bis 12 C-Atomen im Alkylrest brauchbar.suitable Nonionic surfactants are, in particular, alkyl glycosides and ethoxylation and / or propoxylation products of alkyl glycosides or linear or branched alcohols each having 12 to 18 carbon atoms in the alkyl moiety and 3 to 20, preferably 4 to 10 alkyl ether groups. Farther are corresponding ethoxylation and / or propoxylation products of N-alkylamines, vicinal diols, fatty acid esters and fatty acid amides, with respect to the alkyl part said long-chain alcohol derivatives correspond, and of alkylphenols having 5 to 12 carbon atoms in the alkyl radical useful.
Als
nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise
ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise
8 bis 18 C-Atomen und durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid
(EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der Alkoholrest linear
oder bevorzugt in 2-Stellung methylverzweigt sein kann beziehungsweise
lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so
wie sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. Insbesondere
sind jedoch Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen
nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C-Atomen, z. B. aus Kokos-, Palm-,
Talgfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8 EO pro
Mol Alkohol bevorzugt. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen
gehören beispielsweise C12-C14-Alkohole mit 3 EO oder 4 EO, C9-C11-Alkohole mit
7 EO, C13-C15-Alkohole
mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, C12-C18-Alkohole mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und
Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus C12-C14-Alkohol mit 3 EO und C12-C18-Alkohol mit 7 EO. Die angegebenen Ethoxylierungsgrade
stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles
Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können.
Bevorzugte Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung
auf (narrow range ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen
nichtionischen Tensiden können auch Fettalkohole mit mehr
als 12 EO eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind (Talg-)
Fettalkohole mit 14 EO, 16 EO, 20 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO. Insbesondere
in Mitteln für den Einsatz in maschinellen Verfahren werden üblicherweise
extrem schaumarme Verbindungen eingesetzt. Hierzu zählen
vorzugsweise C12-C18-Alkylpolyethylenglykolpolypropylenglykolether mit
jeweils bei zu 8 Mol Ethylenoxid- und Propylenoxideinheiten im Molekül.
Man kann aber auch andere bekannt schaumarme nichtionische Tenside
verwenden, wie zum Beispiel C12-C1 8-Alkylpolyethylenglykol-polybutylenglykolether
mit jeweils bis zu 8 Mol Ethylenoxid- und Butylenoxideinheiten im
Molekül sowie endgruppenverschlossene Alkylpolyalkylenglykolmischether.
Besonders bevorzugt sind auch die hydroxylgruppenhaltigen alkoxylierten
Alkohole, wie sie in der europäischen Patentanmeldung
Vorzugsweise leiten sich die Polyhydroxyfettsäureamide von reduzierenden Zuckern mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere von der Glucose ab. Zur Gruppe der Polyhydroxyfettsäureamide gehören auch Verbindungen der Formel (IV), in der R3 für einen linearen oder verzweigten Alkyl- oder Alkenylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, R4 für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylenrest oder einen Arylenrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen und R5 für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest oder einen Oxy-Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht, wobei C1-C4-Alkyl- oder Phenylreste bevorzugt sind, und [Z] für einen linearen Polyhydroxyalkylrest, dessen Alkylkette mit mindestens zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, oder alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder propoxylierte Derivate dieses Restes steht. [Z] wird auch hier vorzugsweise durch reduktive Aminierung eines Zuckers wie Glucose, Fructose, Maltose, Lactose, Galactose, Mannose oder Xylose erhalten. Die N-Alkoxy- oder N-Aryloxy-substituierten Verbindungen können dann beispielsweise durch Umsetzung mit Fettsäuremethylestern in Gegenwart eines Alkoxids als Katalysator in die gewünschten Polyhydroxyfettsäureamide überführt werden. Eine weitere Klasse bevorzugt eingesetzter nichtionischer Tenside, die entweder als alleiniges nichtionisches Tensid oder in Kombination mit anderen nichtionischen Tensiden, insbesondere zusammen mit alkoxylierten Fettalkoholen und/oder Alkylglykosiden, eingesetzt werden, sind alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder ethoxylierte und propoxylierte Fettsäurealkylester, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, insbesondere Fettsäuremethylester. Auch nichtionische Tenside vom Typ der Aminoxide, beispielsweise N-Kokosalkyl-N,N-dimethylaminoxid und N-Talgalkyl-N,N-dihydroxyethylaminoxid, und der Fettsäurealkanolamide können geeignet sein. Die Menge dieser nichtionischen Tenside beträgt vorzugsweise nicht mehr als die der ethoxylierten Fettalkohole, insbesondere nicht mehr als die Hälfte davon. Als weitere Tenside kommen sogenannte Gemini-Tenside in Betracht. Hierunter werden im Allgemeinen solche Verbindungen verstanden, die zwei hydrophile Gruppen pro Molekül besitzen. Diese Gruppen sind in der Regel durch einen sogenannten ”Spacer” voneinander getrennt. Dieser Spacer ist in der Regel eine Kohlenstoffkette, die lang genug sein sollte, dass die hydrophilen Gruppen einen ausreichenden Abstand haben, damit sie unabhängig voneinander agieren können. Derartige Tenside zeichnen sich im Allgemeinen durch eine ungewöhnlich geringe kritische Micellkonzentration und die Fähigkeit, die Oberflächenspannung des Wassers stark zu reduzieren, aus. In Ausnahmefällen werden unter dem Ausdruck Gemini-Tenside nicht nur derartig ”dimere”, sondern auch entsprechend ”trimere” Tenside verstanden. Geeignete Gemini-Tenside sind beispielsweise sulfatierte Hydroxymischether oder Dimeralkohol-bis- und Trimeralkohol-tris-sulfate und -ethersulfate. Endgruppenverschlossene dimere und trimere Mischether zeichnen sich insbesondere durch ihre Bi- und Multifunktionalität aus. So besitzen die genannten endgruppenverschlossenen Tenside gute Netzeigenschaften und sind dabei schaumarm, so dass sie sich insbesondere für den Einsatz in maschinellen Wasch- oder Reinigungsverfahren eignen. Eingesetzt werden können aber auch Gemini-Polyhydroxyfettsäureamide oder Poly-Polyhydroxyfettsäureamide. Geeignet sind auch die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid ethoxylierten geradkettigen oder verzweigten C7-C21-Alkohole, wie 2-Methylverzweigte C9-C11-Alkohole mit im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder C12-C18-Fettalkohole mit 1 bis 4 EO. Zu den bevorzugten Aniontensiden gehören auch die Salze der Alkylsulfobernsteinsäure, die auch als Sulfosuccinate oder als Sulfobernsteinsäureester bezeichnet werden, und die Monoester und/oder Diester der Sulfobernsteinsäure mit Alkoholen, vorzugsweise Fettalkoholen und insbesondere ethoxylierten Fettalkoholen darstellen. Bevorzugte Sulfosuccinate enthalten C8- bis C18-Fettalkoholreste oder Mischungen aus diesen. Insbesondere bevorzugte Sulfosuccinate enthalten einen Fettalkoholrest, der sich von ethoxylierten Fettalkoholen ableitet, die für sich betrachtet nichtionische Tenside darstellen. Dabei sind wiederum Sulfosuccinate, deren Fettalkohol-Reste sich von ethoxylierten Fettalkoholen mit eingeengter Homologenverteilung ableiten, besonders bevorzugt. Ebenso ist es auch möglich, Alk(en)ylbernsteinsäure mit vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatomen in der Alk(en)ylkette oder deren Salze einzusetzen. Als weitere anionische Tenside kommen Fettsäure-Derivate von Aminosäuren, beispielsweise von N-Methyltaurin (Tauride) und/oder von N-Methylglycin (Sarkoside) in Betracht. Insbesondere bevorzugt sind dabei die Sarkoside beziehungsweise die Sarkosinate und hier vor allem Sarkosinate von höheren und gegebenenfalls einfach oder mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie Oleylsarkosinat. Als weitere anionische Tenside kommen insbesondere Seifen in Betracht. Geeignet sind insbesondere gesättigte Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, hydrierten Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere aus natürlichen Fettsäuren, zum Beispiel Kokos-, Palmkern- oder Talgfettsäuren, abgeleitete Seifengemische. Zusammen mit diesen Seifen oder als Ersatzmittel für Seifen können auch die bekannten Alkenylbernsteinsäuresalze eingesetzt werden.The polyhydroxy fatty acid amides are preferably derived from reducing sugars having 5 or 6 carbon atoms, in particular from glucose. The group of polyhydroxy fatty acid amides also includes compounds of the formula (IV) in the R 3 is a linear or branched alkyl or alkenyl radical having 7 to 12 carbon atoms, R 4 is a linear, branched or cyclic alkylene radical or an arylene radical having 2 to 8 carbon atoms and R 5 is a linear, branched or cyclic alkyl radical or a Aryl radical or an oxy-alkyl radical having 1 to 8 carbon atoms, wherein C 1 -C 4 alkyl or phenyl radicals are preferred, and [Z] is a linear polyhydroxyalkyl radical whose alkyl chain is substituted with at least two hydroxyl groups, or alkoxylated, preferably ethoxylated or propoxylated derivatives of this group. [Z] is also obtained here preferably by reductive amination of a sugar such as glucose, fructose, maltose, lactose, galactose, mannose or xylose. The N-alkoxy- or N-aryloxy-substituted compounds can then be converted into the desired polyhydroxy fatty acid amides, for example by reaction with fatty acid methyl esters in the presence of an alkoxide as catalyst. Another class of preferred nonionic surfactants used either as the sole nonionic surfactant or in combination with other nonionic surfactants, in particular together with alkoxylated fatty alcohols and / or alkyl glycosides, are alkoxylated, preferably ethoxylated or ethoxylated and propoxylated fatty acid alkyl esters, preferably from 1 to 4 carbon atoms in the alkyl chain, especially fatty acid methyl ester. Nonionic surfactants of the amine oxide type, for example N-cocoalkyl-N, N-dimethylamine oxide and N-tallowalkyl-N, N-dihydroxyethylamine oxide, and the fatty acid alkanolamides may also be suitable. The amount of these nonionic surfactants is preferably not more than that of the ethoxylated fatty alcohols, especially not more than half thereof. Other suitable surfactants are so-called gemini surfactants. These are generally understood as meaning those compounds which have two hydrophilic groups per molecule. These groups are usually separated by a so-called "spacer". This spacer is typically a carbon chain that should be long enough for the hydrophilic groups to be spaced sufficiently apart for them to act independently of each other. Such surfactants are generally characterized by an unusually low critical micelle concentration and the ability to greatly reduce the surface tension of the water. In exceptional cases, the term gemini surfactants not only such "dimer", but also corresponding to "trimeric" surfactants understood. Suitable gemini surfactants are, for example, sulfated hydroxy mixed ethers or dimer alcohol bis and trimer alcohol tris sulfates and ether sulfates. End-capped dimeric and trimeric mixed ethers are characterized in particular by their bi- and multi-functionality. Thus, the end-capped surfactants mentioned have good wetting properties and are low foaming, so that they are particularly suitable for use in machine washing or cleaning processes. However, it is also possible to use gemini-polyhydroxy fatty acid amides or poly-polyhydroxy fatty acid amides. Also suitable are the sulfuric acid monoesters of straight-chain or branched C 7 -C 21 -alcohols ethoxylated with from 1 to 6 mol of ethylene oxide, such as 2-methyl-branched C 9 -C 11 -alcohols having on average 3.5 mol of ethylene oxide (EO) or C 12 - C 18 -fatty alcohols with 1 to 4 EO. To the preferred anionic surfactants also include the salts of alkylsulfosuccinic acid, which are also referred to as sulfosuccinates or as sulfosuccinic acid esters, and the monoesters and / or diesters of sulfosuccinic acid with alcohols, preferably fatty alcohols and in particular ethoxylated fatty alcohols. Preferred sulfosuccinates contain C 8 - C 18 fatty alcohol radicals or mixtures thereof. Particularly preferred sulfosuccinates contain a fatty alcohol residue derived from ethoxylated fatty alcohols, which by themselves are nonionic surfactants. Sulfosuccinates, whose fatty alcohol residues are derived from ethoxylated fatty alcohols with a narrow homolog distribution, are again particularly preferred. Likewise, it is also possible to use alk (en) ylsuccinic acid having preferably 8 to 18 carbon atoms in the alk (en) yl chain or salts thereof. Suitable further anionic surfactants are fatty acid derivatives of amino acids, for example N-methyltaurine (Tauride) and / or N-methylglycine (sarcosides). Particularly preferred are the sarcosides or the sarcosinates and here especially sarcosinates of higher and optionally monounsaturated or polyunsaturated fatty acids such as oleyl sarcosinate. As further anionic surfactants are particularly soaps into consideration. Particularly suitable are saturated fatty acid soaps, such as the salts of lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, hydrogenated erucic acid and behenic acid and, in particular, soap mixtures derived from natural fatty acids, for example coconut, palm kernel or tallow fatty acids. Together with these soaps or as a substitute for soaps, it is also possible to use the known alkenylsuccinic acid salts.
Die anionischen Tenside, einschließlich der Seifen, können in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze sowie als lösliche Salze organischer Basen, wie Mono-, Di- oder Triethanolamin, vorliegen. Vorzugsweise liegen die anionischen Tenside in Form ihrer Natrium- oder Kaliumsalze, insbesondere in Form der Natriumsalze vor.The anionic surfactants, including soaps in the form of their sodium, potassium or ammonium salts and as soluble Salts of organic bases, such as mono-, di- or triethanolamine, are present. The anionic surfactants are preferably in the form of their sodium or potassium salts, especially in the form of the sodium salts.
Tenside sind in erfindungsgemäßen Mitteln in Mengenanteilen von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von 8 Gew.-% bis 30 Gew.-%, enthalten.surfactants are in proportions in inventive compositions of preferably 5% by weight to 50% by weight, in particular 8% by weight to 30 wt .-%, contained.
Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält vorzugsweise mindestens einen wasserlöslichen und/oder wasserunlöslichen, organischen und/oder anorganischen Builder. Zu den wasserlöslichen organischen Buildersubstanzen gehören Polycarbonsäuren, insbesondere Citronensäure und Zuckersäuren, monomere und polymere Aminopolycarbonsäuren, insbesondere Methylglycindiessigsäure, Nitrilotriessigsäure und Ethylendiamintetraessigsäure sowie Polyasparaginsäure, Polyphosphonsäuren, insbesondere Aminotris(methylenphosphonsäure), Ethylendiamintetrakis(methylenphosphonsäure) und 1-Hydroxyethan-1,1-diphosphonsäure, polymere Hydroxyverbindungen wie Dextrin sowie polymere (Poly-)carbonsäuren, insbesondere die durch Oxidation von Polysacchariden beziehungsweise Dextrinen zugänglichen Polycarboxylate, polymere Acrylsäuren, Methacrylsäuren, Maleinsäuren und Mischpolymere aus diesen, die auch geringe Anteile polymerisierbarer Substanzen ohne Carbonsäurefunktionalität einpolymerisiert enthalten können. Die relative Molekülmasse der Homopolymeren ungesättiger Carbonsäuren liegt im allgemeinen zwischen 3 000 und 200 000, die der Copolymeren zwischen 2 000 und 200 000, vorzugsweise 30 000 bis 120 000, jeweils bezogen auf freie Säure. Ein besonders bevorzugtes Acrylsäure-Maleinsäure-Copolymer weist eine relative Molekülmasse von 30 000 bis 100 000 auf. Handelsübliche Produkte sind zum Beispiel Sokalan® CP 5, CP 10 und PA 30 der Firma BASF. Geeignete, wenn auch weniger bevorzugte Verbindungen dieser Klasse sind Copolymere der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Vinylethern, wie Vinylmethylethern, Vinylester, Ethylen, Propylen und Styrol, in denen der Anteil der Säure mindestens 50 Gew.-% beträgt. Als wasserlösliche organische Buildersubstanzen können auch Terpolymere eingesetzt werden, die als Monomere zwei ungesättigte Säuren und/oder deren Salze sowie als drittes Monomer Vinylalkohol und/oder einem veresterten Vinylalkohol oder ein Kohlenhydrat enthalten. Das erste saure Monomer beziehungsweise dessen Salz leitet sich von einer monoethylenisch ungesättigten C3-C8-Carbonsäure und vorzugsweise von einer C3-C4-Monocarbonsäure, insbesondere von (Meth)-acrylsäure ab. Das zweite saure Monomer beziehungsweise dessen Salz kann ein Derivat einer C4-C8-Dicarbonsäure, wobei Maleinsäure besonders bevorzugt ist, und/oder ein Derivat einer Allylsulfonsäure, die in 2-Stellung mit einem Alkyl- oder Arylrest substituiert ist, sein. Derartige Polymere weisen im Allgemeinen eine relative Molekülmasse zwischen 1 000 und 200 000 auf. Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die als Monomere vorzugsweise Acrolein und Acrylsäure/Acrylsäuresalze beziehungsweise Vinylacetat aufweisen. Die organischen Buildersubstanzen können, insbesondere zur Herstellung flüssiger Mittel, in Form wäßriger Lösungen, vorzugsweise in Form 30- bis 50-gewichtsprozentiger wäßriger Lösungen eingesetzt werden. Alle genannten Säuren werden in der Regel in Form ihrer wasserlöslichen Salze, insbesondere ihre Alkalisalze, eingesetzt.An agent according to the invention preferably contains at least one water-soluble and / or water-insoluble, organic and / or inorganic builder. The water-soluble organic builder substances include polycarboxylic acids, in particular citric acid and sugar acids, monomeric and polymeric aminopolycarboxylic acids, in particular methylglycinediacetic acid, nitrilotriacetic acid and ethylenediaminetetraacetic acid and polyaspartic acid, polyphosphonic acids, in particular aminotris (methylenephosphonic acid), ethylenediaminetetrakis (methylenephosphonic acid) and 1-hydroxyethane-1,1-diphosphonic acid, polymeric hydroxy compounds such as dextrin and also polymeric (poly) carboxylic acids, in particular the polycarboxylates obtainable by oxidation of polysaccharides or dextrins, polymeric acrylic acids, methacrylic acids, maleic acids and copolymers thereof, which may also contain polymerized small amounts of polymerizable substances without carboxylic acid functionality. The molecular weight of the homopolymers of unsaturated carboxylic acids is generally between 3,000 and 200,000, of the copolymers between 2,000 and 200,000, preferably 30,000 to 120,000, each based on the free acid. A particularly preferred acrylic acid-maleic acid copolymer has a molecular weight of from 30,000 to 100,000. Commercial products are, for example Sokalan ® CP 5, CP 10 and PA 30 from BASF. Suitable, although less preferred, compounds of this class are copolymers of acrylic or methacrylic acid with vinyl ethers, such as vinylmethyl ethers, vinyl esters, ethylene, propylene and styrene, in which the acid content is at least 50% by weight. It is also possible to use terpolymers which contain two unsaturated acids and / or salts thereof as monomers and also vinyl alcohol and / or an esterified vinyl alcohol or a carbohydrate as the third monomer as water-soluble organic builder substances. The first acidic monomer or its salt is derived from a monoethylenically unsaturated C 3 -C 8 -carboxylic acid and preferably from a C 3 -C 4 -monocarboxylic acid, in particular from (meth) -acrylic acid. The second acidic monomer or its salt may be a derivative of a C 4 -C 8 -dicarboxylic acid, with maleic acid being particularly preferred, and / or a derivative of an allylsulfonic acid which is substituted in the 2-position by an alkyl or aryl radical. Such polymers generally have a molecular weight between 1,000 and 200,000. Further preferred copolymers are those which preferably have as monomers acrolein and acrylic acid / acrylic acid salts or vinyl acetate. The organic builder substances can be used, in particular for the preparation of liquid agents, in the form of aqueous solutions, preferably in the form of 30 to 50 percent by weight aqueous solutions. All of the acids mentioned are generally used in the form of their water-soluble salts, in particular their alkali metal salts.
Derartige organische Buildersubstanzen können gewünschtenfalls in Mengen bis zu 40 Gew.-%, insbesondere bis zu 25 Gew.-% und vorzugsweise von 1 Gew.-% bis 8 Gew.-% enthalten sein. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in pastenförmigen oder flüssigen, insbesondere wasserhaltigen, erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt.such If desired, organic builders may be used in amounts up to 40 wt .-%, in particular up to 25 wt .-% and preferably from 1% by weight to 8% by weight. Quantities near the mentioned Upper limit are preferably in pasty or liquid, in particular hydrous, inventive Funds used.
Als
wasserlösliche anorganische Buildermaterialien kommen insbesondere
Alkalisilikate, Alkalicarbonate und Alkaliphosphate, die in Form
ihrer alkalischen, neutralen oder sauren Natrium- oder Kaliumsalze
vorliegen können, in Betracht. Beispiele hierfür
sind Trinatriumphosphat, Tetranatriumdiphosphat, Dinatriumdihydrogendiphosphat,
Pentanatriumtriphosphat, sogenanntes Natriumhexametaphosphat, oligomeres
Trinatriumphosphat mit Oligomerisierungsgraden von 5 bis 1000, insbesondere
5 bis 50, sowie die entsprechenden Kaliumsalze beziehungsweise Gemische
aus Natrium- und Kaliumsalzen. Als wasserunlösliche, wasserdispergierbare
anorganische Buildermaterialien werden insbesondere kristalline
oder amorphe Alkalialumosilikate, in Mengen von bis zu 50 Gew.-%,
vorzugsweise nicht über 40 Gew.-% und in flüssigen
Mitteln insbesondere von 1 Gew.-% bis 5 Gew.-%, eingesetzt. Unter
diesen sind die kristallinen Natriumalumosilikate in Waschmittelqualität,
insbesondere Zeolith A, P und gegebenenfalls X, allein oder in Mischungen,
beispielsweise in Form eines Co-Kristallisats aus den Zeolithen
A und X (Vegobond® AX, ein Handelsprodukt
der Condea Augusts S. p. A.), bevorzugt. Mengen nahe der genannten
Obergrenze werden vorzugsweise in festen, teilchenförmigen Mitteln
eingesetzt. Geeignete Alumosilikate weisen insbesondere keine Teilchen
mit einer Korngröße über 30 μm
auf und bestehen vorzugsweise zu wenigstens 80 Gew.-% aus Teilchen
mit einer Größe unter 10 μm. Ihr Calciumbindevermögen,
das nach den Angaben der deutschen Patentschrift
Geeignete Substitute beziehungsweise Teilsubstitute für das genannte Alumosilikat sind kristalline Alkalisilikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können. Die in den erfindungsgemäßen Mitteln als Gerüststoffe brauchbaren Alkalisilikate weisen vorzugsweise ein molares Verhältnis von Alkalioxid zu SiO2 unter 0,95, insbesondere von 1:1,1 bis 1:12 auf und können amorph oder kristallin vorliegen. Bevorzugte Alkalisilikate sind die Natriumsilikate, insbesondere die amorphen Natriumsilikate, mit einem molaren Verhältnis Na2O:SiO2 von 1:2 bis 1:2,8. Als kristalline Silikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können, werden vorzugsweise kristalline Schichtsilikate der allgemeinen Formel Na2SixO2x+1·yH2O eingesetzt, in der x, das sogenannte Modul, eine Zahl von 1,9 bis 22, insbesondere 1,9 bis 4 und y eine Zahl von 0 bis 33 ist und bevorzugte Werte für x 2, 3 oder 4 sind. Bevorzugte kristalline Schichtsilikate sind solche, bei denen x in der genannten allgemeinen Formel die Werte 2 oder 3 annimmt. Insbesondere sind sowohl β- als auch δ-Natriumdisilikate (Na2Si2O5·yH2O) bevorzugt. Auch aus amorphen Alkalisilikaten hergestellte, praktisch wasserfreie kristalline Alkalisilikate der obengenannten allgemeinen Formel, in der x eine Zahl von 1,9 bis 2,1 bedeutet, können in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel wird ein kristallines Natriumschichtsilikat mit einem Modul von 2 bis 3 eingesetzt, wie es aus Sand und Soda hergestellt werden kann. Kristalline Natriumsilikate mit einem Modul im Bereich von 1,9 bis 3,5 werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel eingesetzt. Kristalline schichtförmige Silikate der oben angegebenen Formel (I) werden von der Fa. Clariant GmbH unter dem Handelsnamen Na-SKS vertrieben, z. B. Na-SKS-1 (Na2Si22O45·xH2O, Kenyait), Na-SKS-2 (Na2Si14O29·xH2O, Magadiit), Na-SKS-3 (Na2Si8O17·xH2O) oder Na-SKS-4 (Na2Si4O9·xH2O, Makatit). Von diesen eignen sich vor allem Na-SKS-5 (α-Na2Si2O5), Na-SKS-7 (β-Na2Si2O5, Natrosilit), Na-SKS-9 (NaHSi2O5·3H2O), Na-SKS-10 (NaHSi2O5·3H2O, Kanemit), Na-SKS-11 (t-Na2Si2O5) und Na-SKS-13 (NaHSi2O5), insbesondere aber Na-SKS-6 (δ-Na2Si2O5). In einer bevorzugten Ausgestaltung erfindungsgemäßer Mittel setzt man ein granulares Compound aus kristallinem Schichtsilikat und Citrat, aus kristallinem Schichtsilikat und oben genannter (co-)polymerer Polycarbonsäure, oder aus Alkalisilikat und Alkalicarbonat ein, wie es beispielsweise unter dem Namen Nabion® 15 im Handel erhältlich ist.Suitable substitutes or partial substitutes for the said aluminosilicate are crystalline alkali silicates which may be present alone or in a mixture with amorphous silicates. The alkali metal silicates useful as builders in the compositions according to the invention preferably have a molar ratio of alkali metal oxide to SiO 2 below 0.95, in particular from 1: 1.1 to 1:12, and may be present in amorphous or crystalline form. Preferred alkali metal silicates are the sodium silicates, in particular the amorphous sodium silicates, with a molar ratio of Na 2 O: SiO 2 of 1: 2 to 1: 2.8. The crystalline silicates which may be present alone or in admixture with amorphous silicates, are crystalline layer silicates with the general formula Na 2 Si x O 2x + 1 · are used yH 2 O, in which x, the so-called module, a number from 1.9 to 22, in particular 1.9 to 4 and y is a number from 0 to 33 and preferred values for x are 2, 3 or 4. Preferred crystalline phyllosilicates are those in which x in the abovementioned general formula assumes the values 2 or 3. In particular, both β- and δ-sodium disilicates (Na 2 Si 2 O 5 .yH 2 O) are preferred. Also prepared from amorphous alkali silicates, practically anhydrous crystalline alkali metal silicates of the abovementioned general formula in which x is a number from 1.9 to 2.1, can be used in inventive compositions. In a further preferred embodiment of the composition according to the invention, a crystalline sodium layer silicate with a modulus of 2 to 3 is used, as can be prepared from sand and soda. Crystalline sodium silicates with a modulus in the range from 1.9 to 3.5 are used in a further preferred embodiment of compositions according to the invention. Crystalline layer-form silicates of formula (I) given above are sold by Clariant GmbH under the trade name Na-SKS, eg. Na-SKS-1 (Na 2 Si 22 O 45 .xH 2 O, Kenyaite), Na-SKS-2 (Na 2 Si 14 O 29 .xH 2 O, magadiite), Na-SKS-3 (Na 2 Si 8 O 17 .xH 2 O) or Na-SKS-4 (Na 2 Si 4 O 9 .xH 2 O, Makatite). Of these, especially Na-SKS-5 (α-Na 2 Si 2 O 5 ), Na-SKS-7 (β-Na 2 Si 2 O 5 , natrosilite), Na-SKS-9 (NaHSi 2 O 5 · 3H 2 O), Na-SKS-10 (NaHSi 2 O 5 · 3H 2 O, kanemite), Na-SKS-11 (t-Na 2 Si 2 O 5) and Na-SKS-13 (NaHSi 2 O 5 ), but especially Na-SKS-6 (δ-Na 2 Si 2 O 5 ). In a preferred embodiment of inventive compositions is a granular compound of crystalline phyllosilicate and citrate, of crystalline layered silicate and aforementioned (co) polymeric polycarboxylic acid or of alkali silicate and alkali metal as it is available, for example under the name Nabion ® 15 commercially ,
Buildersubstanzen sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise in Mengen bis zu 75 Gew.-%, insbesondere 5 Gew.-% bis 50 enthalten.builders are preferred in the compositions according to the invention in amounts up to 75 wt .-%, in particular 5 wt .-% to 50 included.
Als für den Einsatz in erfindungsgemäßen Mitteln geeignete Persauerstoffverbindungen kommen insbesondere organische Persäuren beziehungsweise persaure Salze organischer Säuren, wie Phthalimidopercapronsäure, Perbenzoesäure oder Salze der Diperdodecandisäure, Wasserstoffperoxid und unter den Waschbedingungen Wasserstoffperoxid abgebende anorganische Salze, zu denen Perborat, Percarbonat, Persilikat und/oder Persulfat wie Caroat gehören, in Betracht. Sofern feste Persauerstoffverbindungen eingesetzt werden sollen, können diese in Form von Pulvern oder Granulaten verwendet werden, die auch in im Prinzip bekannter Weise umhüllt sein können. Falls ein erfindungsgemäßes Mittel Persauerstoffverbindungen enthält, sind diese in Mengen von vorzugsweise bis zu 50 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 30 Gew.-%, vorhanden. Der Zusatz geringer Mengen bekannter Bleichmittelstabilisatoren wie beispielsweise von Phosphonaten, Borsten beziehungsweise Metaboraten und Metasilikaten sowie Magnesiumsalzen wie Magnesiumsulfat kann zweckdienlich sein.When for use in the invention Means of suitable peroxygen compounds come in particular organic peracids or peracid salts organic Acids, such as phthalimidopercaproic acid, perbenzoic acid or salts of diperdodecanedioic acid, hydrogen peroxide and under the washing conditions hydrogen peroxide-releasing inorganic Salts, which include perborate, percarbonate, persilicate and / or persulfate like Caroat belong. If solid peroxygen compounds can be used, they can be in the form of powders or granules are used, which are also known in principle Wrapped up. If an inventive Agent contains peroxygen compounds, these are in Amounts of preferably up to 50% by weight, in particular of 5% by weight to 30 wt .-%, present. The addition of small amounts of known bleach stabilizers such as phosphonates, bristles or metaborates and metasilicates and magnesium salts such as magnesium sulfate be expedient.
Als Bleichaktivatoren können Verbindungen, die unter Perhydrolysebedingungen aliphatische Peroxocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder gegebenenfalls substituierte Perbenzoesäure ergeben, eingesetzt werden. Geeignet sind Substanzen, die O- und/oder N-Acylgruppen der genannten C-Atomzahl und/oder gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppen tragen. Bevorzugt sind mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere Tetraacetylethylendiamin (TAED), acylierte Triazinderivate, insbesondere 1,5-Diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazin (DADHT), acylierte Glykolurile, insbesondere Tetraacetylglykoluril (TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoylsuccinimid (NOSI), acylierte Phenolsulfonate, insbesondere n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- bzw. iso-NOBS), Carbonsäureanhydride, insbesondere Phthalsäureanhydrid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere Triacetin, Ethylenglykoldiacetat, 2,5-Diacetoxy-2,5-dihydrofuran und Enolester sowie acetyliertes Sorbitol und Mannitol beziehungsweise deren beschriebene Mischungen (SORMAN), acylierte Zuckerderivate, insbesondere Pentaacetylglukose (PAG), Pentaacetylfruktose, Tetraacetylxylose und Octaacetyllactose sowie acetyliertes, gegebenenfalls N-alkyliertes Glucamin und Gluconolacton, und/oder N-acylierte Lactame, beispielsweise N-Benzoylcaprolactam. Die hydrophil substituierten Acylacetale und die Acyllactame werden ebenfalls bevorzugt eingesetzt. Auch Kombinationen konventioneller Bleichaktivatoren können eingesetzt werden. Derartige Bleichaktivatoren können, insbesondere bei Anwesenheit obengenannter Wasserstoffperoxid-liefernder Bleichmittel, im üblichen Mengenbereich, vorzugsweise in Mengen von 0,5 Gew.-% bis 10 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis 8 Gew.-%, bezogen auf gesamtes Mittel, enthalten sein, fehlen bei Einsatz von Percarbonsäure als alleinigem Bleichmittel jedoch vorzugsweise ganz.Suitable bleach activators are compounds which, under perhydrolysis conditions, have aliphatic peroxycarboxylic acids having preferably 1 to 10 C atoms, in particular 2 to 4 C atoms, and / or, where appropriate substituted perbenzoic acid, can be used. Suitable substances are those which carry O- and / or N-acyl groups of the stated C atom number and / or optionally substituted benzoyl groups. Preference is given to polyacylated alkylenediamines, in particular tetraacetylethylenediamine (TAED), acylated triazine derivatives, in particular 1,5-diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazine (DADHT), acylated glycolurils, in particular tetraacetylglycoluril (TAGU), N- Acylimides, in particular N-nonanoylsuccinimide (NOSI), acylated phenolsulfonates, in particular n-nonanoyl or isononanoyloxybenzenesulfonate (n- or iso-NOBS), carboxylic anhydrides, in particular phthalic anhydride, acylated polyhydric alcohols, in particular triacetin, ethylene glycol diacetate, 2,5-diacetoxy- 2,5-dihydrofuran and enol esters and also acetylated sorbitol and mannitol or mixtures thereof (SORMAN), acylated sugar derivatives, in particular pentaacetylglucose (PAG), pentaacetylfruktose, tetraacetylxylose and octaacetyllactose as well as acetylated, optionally N-alkylated glucamine and gluconolactone, and / or N- acylated lactams, for example N-benzoyl-caprolactam. The hydrophilic substituted acyl acetals and the acyl lactams are also preferably used. Combinations of conventional bleach activators can also be used. Such bleach activators can, in particular in the presence of the abovementioned hydrogen peroxide-producing bleach, in the usual amount range, preferably in amounts of from 0.5 wt .-% to 10 wt .-%, in particular 1 wt .-% to 8 wt .-%, based on However, total agent, be included, missing when using percarboxylic acid as the sole bleach, preferably completely.
Zusätzlich zu den konventionellen Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können auch Sulfonimine und/oder bleichverstärkende Übergangsmetallsalze beziehungsweise Übergangsmetallkomplexe als sogenannte Bleichkatalysatoren enthalten sein.additionally to the conventional bleach activators or in their place also sulfonimines and / or bleach-enhancing transition metal salts or transition metal complexes as so-called Be included bleach catalysts.
Zu den in den erfindungsgemäßen Mitteln, insbesondere wenn sie in flüssiger oder pastöser Form vorliegen, neben Wasser verwendbaren organischen Lösungsmitteln gehören Alkohole mit 1 bis 4 C-Atomen, insbesondere Methanol, Ethanol, Isopropanol und tert.-Butanol, Diole mit 2 bis 4 C-Atomen, insbesondere Ethylenglykol und Propylenglykol, sowie deren Gemische und die aus den genannten Verbindungsklassen ableitbaren Ether. Derartige wassermischbare Lösungsmittel sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise in Mengen nicht über 30 Gew.-%, insbesondere von 6 Gew.-% bis 20 Gew.-%, vorhanden.To in the inventive compositions, in particular if they are in liquid or pasty form, include water-usable organic solvents Alcohols having 1 to 4 carbon atoms, in particular methanol, ethanol, isopropanol and tert-butanol, diols having 2 to 4 C atoms, in particular ethylene glycol and propylene glycol, as well as mixtures thereof and those mentioned Classes of derivable ether. Such water-miscible Solvents are in the inventive Preferably in amounts not exceeding 30% by weight, in particular from 6% to 20% by weight.
Zur Einstellung eines gewünschten, sich durch die Mischung der übrigen Komponenten nicht von selbst ergebenden pH-Werts können die erfindungsgemäßen Mittel system- und umweltverträgliche Säuren, insbesondere Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Apfelsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure und/oder Adipinsäure, aber auch Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure, oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide, enthalten. Derartige pH-Regulatoren sind in den erfindungsgemäßen Mitteln in Mengen von vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%, enthalten.to Setting a desired, through the mixture the remaining components are not self-generating pH the agents according to the invention can be and environmentally friendly acids, in particular citric acid, Acetic acid, tartaric acid, malic acid, lactic acid, Glycolic acid, succinic acid, glutaric acid and / or adipic acid, but also mineral acids, especially sulfuric acid, or bases, in particular ammonium or alkali hydroxides. Such pH regulators are in the inventive compositions in amounts of preferably not more than 20% by weight, in particular from 1.2% by weight to 17% by weight, contain.
Vergrauungsinhibitoren haben die Aufgabe, den von der Textilfaser abgelösten Schmutz in der Flotte suspendiert zu halten. Hierzu sind wasserlösliche Kolloide meist organischer Natur geeignet, beispielsweise Stärke, Leim, Gelatine, Salze von Ethercarbonsäuren oder Ethersulfonsäuren der Stärke oder der Cellulose oder Salze von sauren Schwefelsäureestern der Cellulose oder der Stärke. Auch wasserlösliche, saure Gruppen enthaltende Polyamide sind für diesen Zweck geeignet. Weiterhin lassen sich andere als die obengenannten Stärkederivate verwenden, zum Beispiel Aldehydstärken. Bevorzugt werden Celluloseether, wie Carboxymethylcellulose (Na-Salz), Methylcellulose, Hydroxyalkylcellulose und Mischether, wie Methylhydroxyethylcellulose, Methylhydroxypropylcellulose, Methylcarboxymethylcellulose und deren Gemische, beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Mittel, eingesetzt.graying have the task of removing the dirt from the textile fiber to keep suspended in the fleet. These are water-soluble Colloids mostly organic nature suitable, such as starch, Glue, gelatin, salts of ether carboxylic acids or ether sulfonic acids starch or cellulose or salts of acidic sulfuric acid esters cellulose or starch. Also water-soluble, Acidic group-containing polyamides are for this purpose suitable. Furthermore, other than the above-mentioned starch derivatives can be used use, for example, aldehyde levels. To be favoured Cellulose ethers, such as carboxymethyl cellulose (Na salt), methyl cellulose, Hydroxyalkylcellulose and mixed ethers, such as methylhydroxyethylcellulose, Methylhydroxypropylcellulose, methylcarboxymethylcellulose and their Mixtures, for example in amounts of 0.1 to 5 wt .-%, based on the means used.
Erfindungsgemäße Textilwaschmittel können als optische Aufheller beispielsweise Derivate der Diaminostilbendisulfonsäure beziehungsweise deren Alkalimetallsalze enthalten, obgleich sie für den Einsatz als Colorwaschmittel vorzugsweise frei von optischen Aufhellern sind. Geeignet sind zum Beispiel Salze der 4,4'-Bis(2-anilino-4-morpholino-1,3,5-triazinyl-6-amino)stilben-2,2'-disulfonsäure oder gleichartig aufgebaute Verbindungen, die anstelle der Morpholino-Gruppe eine Diethanolaminogruppe, eine Methylaminogruppe, eine Anilinogruppe oder eine 2-Methoxyethylaminogruppe tragen. Weiterhin können Aufheller vom Typ der substituierten Diphenylstyryle anwesend sein, zum Beispiel die Alkalisalze des 4,4'-Bis(2-sulfostyryl)-diphenyls, 4,4'-Bis(4-chlor-3-sulfostyryl)-diphenyls, oder 4-(4-Chlorstyryl)-4'-(2-sulfostyryl)-diphenyls. Auch Gemische der vorgenannten optischen Aufheller können verwendet werden.invention Textile detergents can be used as optical brighteners, for example Derivatives of Diaminostilbendisulfonsäure or their alkali metal salts, although they are for the Use as a color detergent preferably free of optical brighteners are. For example, salts of 4,4'-bis (2-anilino-4-morpholino-1,3,5-triazinyl-6-amino) stilbene-2,2'-disulfonic acid are suitable or similar compounds, instead of the morpholino group a diethanolamino group, a methylamino group, an anilino group or carry a 2-methoxyethylamino group. Furthermore you can Brighteners of the type of substituted diphenylstyrene may be present for example, the alkali salts of 4,4'-bis (2-sulfostyryl) -diphenyl, 4,4'-bis (4-chloro-3-sulfostyryl) -diphenyls, or 4- (4-chlorostyryl) -4 '- (2-sulfostyryl) -diphenyls. Mixtures of the aforementioned optical brightener can be used.
Insbesondere beim Einsatz in maschinellen Verfahren kann es von Vorteil sein, den Mitteln übliche Schauminhibitoren zuzusetzen. Als Schauminhibitoren eignen sich beispielsweise Seifen natürlicher oder synthetischer Herkunft, die einen hohen Anteil an C18-C24-Fettsäuren aufweisen. Geeignete nichttensidartige Schauminhibitoren sind beispielsweise Organopolysiloxane und deren Gemische mit mikrofeiner, gegebenenfalls silanierter Kieselsäure sowie Paraffine, Wachse, Mikrokristallinwachse und deren Gemische mit silanierter Kieselsäure oder Bisfettsäurealkylendiamiden. Mit Vorteilen werden auch Gemische aus verschiedenen Schauminhibitoren verwendet, zum Beispiel solche aus Silikonen, Paraffinen oder Wachsen. Vorzugsweise sind die Schauminhibitoren, insbesondere Silikon- und/oder Paraffin-haltige Schauminhibitoren, an eine granulare, in Wasser lösliche beziehungsweise dispergierbare Trägersubstanz gebunden. Insbesondere sind dabei Mischungen aus Paraffinen und Bistearylethylendiamid bevorzugt.In particular, when used in mechanical processes, it may be advantageous to add conventional foam inhibitors to the compositions. As foam inhibitors are, for example, soaps of natural or synthetic origin, which have a high proportion of C 18 -C 24 fatty acids. Suitable non-surfactant Foam inhibitors are, for example, organopolysiloxanes and mixtures thereof with microfine, optionally silanized silica and paraffins, waxes, microcrystalline waxes and mixtures thereof with silanated silicic acid or bis-fatty acid alkylenediamides. It is also advantageous to use mixtures of various foam inhibitors, for example those of silicones, paraffins or waxes. The foam inhibitors, in particular silicone- and / or paraffin-containing foam inhibitors, are preferably bound to a granular, water-soluble or dispersible carrier substance. In particular, mixtures of paraffins and bistearylethylenediamide are preferred.
Die zu wählenden Inhaltsstoffe wie auch die Bedingungen, unter denen das Mittel eingesetzt wird, wie beispielsweise Temperatur, pH-Wert, Ionenstärke, Redox-Verhältnisse oder mechanische Einflüsse, sollten für das jeweilige Reinigungsproblem optimiert sein. So liegen übliche Temperaturen für Wasch- und Reinigungsmittel in Bereichen von 10°C über 40°C und 60°C bis hin zu 95° bei maschinellen Mitteln oder bei technischen Anwendungen. Da bei modernen Wasch- und Spülmaschinen die Temperatur meist stufenlos einstellbar ist, sind auch alle Zwischenstufen der Temperatur eingeschlossen. Vorzugsweise werden die Inhaltsstoffe der betreffenden Mittel aufeinander abgestimmt. Bevorzugt sind Synergien hinsichtlich der Reinigungsleistung. Besonders bevorzugt sind Synergien, die in einem Temperaturbereich zwischen 10°C und 60°C vorhanden sind, insbesondere in einem Temperaturbereich von 10°C bis 60°C, von 10°C bis 50°C, von 10°C bis 40°C, von 10°C bis 30°C, von 15°C bis 30°C von 10°C bis 25°C und von 15°C bis 25°C.The to select ingredients as well as the conditions under which the agent is used, such as temperature, pH, ionic strength, redox ratios or mechanical influences, should be for the respective Cleaning problem to be optimized. So are usual temperatures for detergents and cleaners in ranges of 10 ° C over 40 ° C and 60 ° C up to 95 ° for mechanical Means or in technical applications. Because with modern washing and dishwashers the temperature usually infinitely adjustable Also, all intermediate temperatures are included. Preferably, the ingredients of the respective agents become one upon another Voted. Synergies in terms of cleaning performance are preferred. Particularly preferred are synergies in a temperature range between 10 ° C and 60 ° C are present, in particular in a temperature range from 10 ° C to 60 ° C, from 10 ° C to 50 ° C, from 10 ° C to 40 ° C, from 10 ° C to 30 ° C, from 15 ° C to 30 ° C from 10 ° C to 25 ° C and from 15 ° C to 25 ° C.
Die Herstellung erfindungsgemäßer fester Mittel bietet keine Schwierigkeiten und kann auf bekannte Weise, zum Beispiel durch Sprühtrocknen oder Granulation, erfolgen, wobei Enzyme und eventuelle weitere thermisch empfindliche Inhaltsstoffe wie zum Beispiel Bleichmittel gegebenenfalls später separat zugesetzt werden. Zur Herstellung erfindungsgemäßer Mittel mit erhöhtem Schüttgewicht, insbesondere im Bereich von 650 g/l bis 950 g/l, ist ein einen Extrusionschritt aufweisendes Verfahren bevorzugt.The Preparation of inventive solid means provides no difficulties and can be done in a known way, for example by spray-drying or granulation, enzymes being used and any other thermally sensitive ingredients like for example bleach, if appropriate later separately be added. For the production according to the invention Agents with increased bulk density, in particular in the range of 650 g / l to 950 g / l, is an extrusion step preferred method.
Zur Herstellung von erfindungsgemäßen Mitteln in Tablettenform, die einphasig oder mehrphasig, einfarbig oder mehrfarbig und insbesondere aus einer Schicht oder aus mehreren, insbesondere aus zwei Schichten bestehen können, geht man vorzugsweise derart vor, dass man alle Bestandteile – gegebenenfalls je einer Schicht – in einem Mischer miteinander vermischt und das Gemisch mittels herkömmlicher Tablettenpressen, beispielsweise Exzenterpressen oder Rundläuferpressen, mit Preßkräften im Bereich von etwa 50 bis 100 kN, vorzugsweise bei 60 bis 70 kN verpreßt. Insbesondere bei mehrschichtigen Tabletten kann es von Vorteil sein, wenn mindestens eine Schicht vorverpreßt wird. Dies wird vorzugsweise bei Preßkräften zwischen 5 und 20 kN, insbesondere bei 10 bis 15 kN durchgeführt. Man erhält so problemlos bruchfeste und dennoch unter Anwendungsbedingungen ausreichend schnell lösliche Tabletten mit Bruch- und Biegefestigkeiten von normalerweise 100 bis 200 N, bevorzugt jedoch über 150 N. Vorzugsweise weist eine derart hergestellte Tablette ein Gewicht von 10 g bis 50 g, insbesondere von 15 g bis 40 g auf. Die Raumform der Tabletten ist beliebig und kann rund, oval oder eckig sein, wobei auch Zwischenformen möglich sind. Ecken und Kanten sind vorteilhafterweise abgerundet. Runde Tabletten weisen vorzugsweise einen Durchmesser von 30 mm bis 40 mm auf. Insbesondere die Große von eckig oder quaderförmig gestalteten Tabletten, welche überwiegend über die Dosiervorrichtung beispielsweise der Geschirrspülmaschine eingebracht werden, ist abhängig von der Geometrie und dem Volumen dieser Dosiervorrichtung. Beispielhaft bevorzugte Ausführungsformen weisen eine Grundfläche von (20 bis 30 mm) × (34 bis 40 mm), insbesondere von 26 × 36 mm oder von 24 × 38 mm auf.to Preparation of agents according to the invention in tablet form, the one-phase or multi-phase, monochrome or multicolor and in particular from one or more layers, in particular two layers can exist, it is preferable to proceed in such a way that all components - if necessary one layer each - in a mixer mixed together and the mixture by means of conventional Tablet presses, for example eccentric presses or rotary presses, with compressive forces in the range of about 50 to 100 kN, preferably compressed at 60 to 70 kN. Especially for multi-layered tablets, it may be advantageous if at least a layer is pre-pressed. This is preferably included Pressing forces between 5 and 20 kN, in particular carried out at 10 to 15 kN. You get so easily unbreakable and yet sufficiently fast under conditions of use soluble tablets with breaking and bending strengths of normally 100 to 200 N, but preferably over 150 N. Preferably, a tablet produced in this way has a weight from 10 g to 50 g, especially from 15 g to 40 g. The spatial form the tablets are arbitrary and can be round, oval or angular, although intermediate forms are possible. Corners and edges are advantageously rounded. Round tablets preferably have a diameter of 30 mm to 40 mm. Especially the big one of square or cuboid tablets, which predominantly over the metering device, for example, the dishwasher is introduced depends on the geometry and the volume of this metering device. Exemplary preferred embodiments have a footprint of (20 to 30 mm) × (34 to 40 mm), in particular 26 × 36 mm or 24 × 38 mm up.
Flüssige beziehungsweise pastöse erfindungsgemäße Mittel in Form von übliche Lösungsmittel enthaltenden Lösungen werden in der Regel durch einfaches Mischen der Inhaltsstoffe, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer gegeben werden können, hergestellt. Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Wasch- oder Reinigungsmittel stellen demnach einen eigenen Erfindungsgegenstand dar. Alle Verfahren, mit denen ein Wasch- oder reinigungsmittel, wie es in der vorliegenden Anmeldung beschrieben ist, erhalten werden kann, werden in den Schutzbereich dieses Erfindungsgegenstandes eingeschlossen.liquid or pasty invention Agent in the form of common solvents Solutions are usually made by simply mixing the Ingredients that are in substance or as a solution in one automatic mixer can be given. Process for the production of laundry detergents according to the invention or cleaning agents accordingly constitute a separate subject of the invention All processes by which a washing or cleaning as described in the present application can be obtained can be in the scope of this subject invention locked in.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen somit alle festen, pulverförmigen, flüssigen, gelförmigen oder pastösen Darreichungsformen der Mittel, die gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen bestehen können sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellen daher Mittel dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie als Einkomponentensystem vorliegen. Solche Mittel bestehen bevorzugt aus einer Phase. Dagegen sind Mittel, die aus mehreren Phasen bestehen, dadurch gekennzeichnet sind, dass es in mehrere Komponenten aufgeteilt ist. Zu den erfindungsgemäßen festen Darreichungsformen zählen ferner Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches, die sowohl in Großgebinden als auch portionsweise abgepackt vorliegen können.embodiments The present invention thus encompasses all solid, pulverulent, liquid, gel or pasty Dosage forms of the funds, which may also consist of several Phases can exist as well as in compressed or not compressed form may be present. Another embodiment The invention therefore provides means characterized are that they are present as a one-component system. Such means preferably consist of one phase. On the other hand, funds are out consist of several phases, characterized in that it is in several components is split. To the invention solid dosage forms also include extrudates, granules, Tablets or pouches, both in bulk containers as may also be packaged in portions.
Ein erfindungsgemäßes Mittel kann als rieselfähiges Pulver vorliegen, insbesondere mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l oder 600 g/l bis 850 g/l. Alternativ können erfindungsgemäße Mittel auch flüssig, gelförmig oder pastös sein. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist daher dadurch gekennzeichnet, dass das Wasch- oder Reinigungsmittel in flüssiger, gelförmiger oder pastöser Form vorliegt, insbesondere in Form eines nicht-wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wässrigen Paste oder in Form eines wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste.An agent according to the invention can be present as a free-flowing powder, in particular with a bulk weight of 300 g / l to 1200 g / l, in particular 500 g / l to 900 g / l or 600 g / l to 850 g / l. Alternatively, agents according to the invention may also be liquid, gelatinous or pasty. A further embodiment of the invention is therefore characterized in that the washing or cleaning agent is in liquid, gel or pasty form, in particular in the form of a non-aqueous liquid detergent or a non-aqueous paste or in the form of an aqueous liquid detergent or a water-containing paste.
Das erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel kann in einem Behältnis, vorzugsweise einem luftdurchlässigen Behältnis, verpackt sein, aus dem es kurz vor Gebrauch oder während des Waschvorgangs freigesetzt wird. Insbesondere kann die in dem Mittel enthaltene Protease und/oder weitere Inhaltsstoffe des Mittels mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für das Enzym undurchlässigen Substanz umhüllt sein, welche unter Anwendungsbedingungen des Mittels durchlässig für das Enzym wird. Eine solche Ausführungsform der Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet, dass die Protease mit einer bei Raumtemperatur und/oder bei Abwesenheit von Wasser für die Protease undurchlässigen Substanz umhüllt ist.The Detergents or cleaning agents according to the invention can in a container, preferably an air-permeable Container, be packaged, out of it just before use or released during the washing process. Especially may be the protease contained in the agent and / or other ingredients of the agent at room temperature or in the absence of Water for the enzyme impermeable substance which under application conditions of the agent becomes permeable to the enzyme. Such an embodiment The invention is thus characterized in that the protease with one at room temperature and / or in the absence of water is enveloped for the protease impermeable substance.
Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel können ausschließlich eine Protease enthalten. Alternativ können sie auch weitere hydrolytische Enzyme oder andere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration enthalten. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen, wobei prinzipiell alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar sind. Als weitere Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere eine insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, β-Glucosidase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase, sowie vorzugsweise deren Gemische. Diese Enzyme sind im Prinzip natürlichen Ursprungs; ausgehend von den natürlichen Molekülen stehen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Varianten zur Verfügung, die entsprechend bevorzugt eingesetzt werden.invention Detergents or cleaners can only contain a protease. Alternatively, they can also have more hydrolytic enzymes or other enzymes in one for the Efficacy of the agent appropriate concentration contain. Another object of the invention thus provide Means further comprising one or more further enzymes, being in principle all of the prior art for these purposes established enzymes can be used. Preferred as further enzymes all enzymes which can be used in the invention Means can develop a catalytic activity, especially one in particular a protease, amylase, cellulase, Hemicellulase, mannanase, tannase, xylanase, xanthanase, β-glucosidase, Carrageenase, perhydrolase, oxidase, oxidoreductase or a lipase, and preferably mixtures thereof. These enzymes are in principle of natural origin; starting from the natural ones Molecules are available for use in washing and washing Cleaning agents improved variants available which are preferably used accordingly.
Erfindungsgemäße
Mittel enthalten Enzyme vorzugsweise in Gesamtmengen von 1 × 10–8
bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein. Bevorzugt sind
die Enzyme von 0,001 bis 5 Gew.-%, weiter bevorzugt von 0,01 bis
5 Gew.-%, noch weiter bevorzugt von 0,05 bis 4 Gew.-% und besonders
bevorzugt von 0,075 bis 3,5 Gew.-% in erfindungsgemäßen
Mitteln enthalten, wobei jedes enthaltene Enzym in den genannten
Mengenverhältnissen vorliegen kann. Die Proteinkonzentration
kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren
(Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure)
oder dem Biuret-Verfahren (
Die
Proteaseaktivität in derartigen Mitteln kann nach der in
Bei dem Vergleich der Leistungen zweier Waschmittelenzyme muss zwischen proteingleichem und aktivitätsgleichem Einsatz unterschieden werden. Insbesondere bei gentechnisch erhaltenen, weitgehend nebenaktivitätsfreien Präparationen ist der proteingleiche Einsatz angebracht. Denn damit ist eine Aussage darüber möglich, ob dieselben Proteinmengen – als Maß für den Ertrag der fermentativen Produktion – zu vergleichbaren Ergebnissen führen. Klaffen die jeweiligen Verhältnisse von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) auseinander, so ist ein aktivitätsgleicher Vergleich zu empfehlen, weil hierüber die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften verglichen werden. Generell gilt, daß eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann.at The comparison of the performance of two detergent enzymes must be between distinguished from the same and the same activity become. Especially when genetically engineered, largely free of side activity Preparations the same protein use is appropriate. Because that is a statement about whether it is possible the same amount of protein - as a measure of the yield of fermentative production - comparable Results. Gap the respective conditions from active substance to total protein (the values of the specific activity) apart, so is an activity-same comparison too recommend because this is the respective enzymatic properties be compared. Generally, that has a low specific activity balanced by adding a larger amount of protein can be.
Besonders bevorzugt unterstützen die weiteren Enzyme die Wirkung des Mittels, beispielsweise die Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels, hinsichtlich bestimmter Anschmutzungen oder Flecken. Besonders bevorzugt zeigen die Enzyme synergistische Effekte hinsichtlich ihrer Wirkung gegenüber bestimmter Anschmutzungen oder Flecken, d. h. die in der Mittelzusammensetzung enthaltenen Enzyme unterstützen sich in ihrer Reinigungsleistung gegenseitig. Synergistische Effekte können nicht nur zwischen verschiedenen Enzymen, sondern auch zwischen einem oder mehreren Enzymen und weiteren Inhaltsstoffen des erfindungsgemäßen Mittels auftreten.Especially Preferably, the other enzymes support the effect agent, for example the cleaning performance of a washing or cleaning agent, with regard to certain stains or Stains. Most preferably, the enzymes show synergistic effects in terms of their effect on certain soils or stains, d. H. those contained in the middle composition Enzymes support each other in their cleaning performance. Synergistic effects can not only be between different Enzymes, but also between one or more enzymes and more Ingredients of the inventive agent occur.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittels zur Entfernung von Anschmutzungen, insbesondere von protease-sensitiven Anschmutzungen, auf Textilien oder harten Oberflächen, d. h. zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, dar.a own subject of the invention provides the use of an inventive Washing or cleaning agent to remove soiling, in particular of protease-sensitive soiling, on textiles or hard surfaces, d. H. for cleaning textiles or hard surfaces.
Denn erfindungsgemäße Mittel können, insbesondere auf Grund der vorstehend beschriebenen Eigenschaften der enthaltenen Protease, vorteilhaft dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen entsprechende Verunreinigungen zu beseitigen. Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen beispielsweise die Handwäsche, die manuelle Entfernung von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen oder die Verwendung im Zusammenhang mit einem maschinellen Verfahren dar.For means according to the invention can, in particular due to the egg described above properties of the contained protease, can be advantageously used to remove contaminants from textiles or from hard surfaces. Embodiments of this subject invention include, for example, hand washing, manual removal of stains from fabrics or hard surfaces, or use in conjunction with a machine process.
Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehende erfindungsgemäße Verwendung gilt. In bevorzugten Ausführungsformen dieser Verwendung werden die betreffenden Wasch- oder Reinigungsmittel daher nach einer der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen bereitgestellt.All Facts, objects and embodiments, for washing or Cleaning agents are described are also on this subject of the invention applicable. Therefore, it is explicitly stated here the revelation in the appropriate place with the reference, that this disclosure also for the above inventive Use applies. In preferred embodiments of this Use are the relevant detergents or cleaning agents Therefore, according to one of the embodiments described above provided.
Einen weiteren Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar, bei denen wenigstens in einem der Verfahrensschritte ein erfindungsgemäßes Mittel verwendet wird. Das Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen ist demnach dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein erfindungsgemäßes Mittel angewendet ist.a Another subject of the invention provide methods for the purification of Textiles or hard surfaces where at least in one of the method steps an inventive Medium is used. The procedure for cleaning textiles or hard surfaces is thus characterized that in at least one method step, an inventive Medium is applied.
Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren aufgrund ihrer präziseren Steuerbarkeit, was beispielsweise die eingesetzten Mengen und Einwirkzeiten angeht, bevorzugt sind.this includes fall both manual and mechanical procedures, whereby machine Method because of their more precise controllability, what For example, the amounts used and exposure times, preferably are.
Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung bzw. Verdünnung dieses Mittels behandelt wird. Entsprechendes gilt für Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, insbesondere von harten Oberflächen. Alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um die Anwendung eines erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittels bereichert werden und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren gilt.method for the cleaning of textiles are generally characterized from that in several process steps different cleaning active Substances applied to the items to be cleaned and after the exposure time be washed off, or that the items to be cleaned in any other way with a detergent or a solution or dilution this agent is treated. The same applies to Process for cleaning all materials other than textiles, especially hard surfaces. All conceivable washing or purification processes may be used in at least one of Process steps to the application of an inventive Detergent or cleaning agent are enriched and then put Embodiments of the present invention. All Facts, objects and embodiments, for washing or Detergents are described are also applicable to this subject invention. Therefore, explicit reference is made to the disclosure at this point Corresponding body with the reference that this disclosure also for the above inventive Procedure applies.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Protease katalytisch aktiv ist, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Proteasen beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren gilt.a Another object of the invention provide methods for cleaning of textiles or hard surfaces that result are characterized in that in at least one method step a protease of the invention catalytically active is, in particular such that the protease in an amount of 40 micrograms 4 g, preferably from 50 μg to 3 g, more preferably from 100 μg to 2 g, and most preferably from 200 μg to 1 g per application is used. All facts, objects and embodiments suitable for the invention Proteases are described are also on this subject invention applicable. Therefore, it is explicitly stated here the revelation in the appropriate place with the reference, that this disclosure also for the above inventive Procedure applies.
Da erfindungsgemäße Proteasen natürlicherweise bereits eine hydrolytische Aktivität besitzen und diese auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner und/oder der einziger Schritt eines solchen Verfahrens darin bestehen, dass gewünschtenfalls als einzige reinigungsaktive Komponente eine solche Protease mit der Anschmutzung in Kontakt gebracht wird, bevorzugt in einer Pufferlösung oder in Wasser. Dies stellt eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstandes dar.There Proteases of the invention naturally already have a hydrolytic activity and this also unfold in media that otherwise have no cleaning power as in mere buffer, a single and / or the only step in such a process is if desired, as the only detergent-active component such a protease is brought into contact with the soil, preferably in a buffer solution or in water. This poses a further embodiment of this subject invention represents.
Alternative Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen auch Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, bei denen in wenigstens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Protease aktiv wird. Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen bevorzugt, und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.alternative Embodiments of this subject invention provide also processes for the treatment of textile raw materials or for textile care in which in at least one method step, an inventive Protease becomes active. These include processes for textile raw materials, Prefers fibers or textiles with natural ingredients, and especially for those with wool or silk.
Es kann sich dabei beispielsweise um Verfahren handeln, in denen Materialien zur Verarbeitung in Textilien vorbereitet werden, etwa zur Antifilzausrüstung, oder beispielsweise um Verfahren, welche die Reinigung getragener Textilien um eine pflegende Komponente bereichern. Wegen der oben beschriebenen Wirkung von Proteasen auf natürliche, proteinhaltige Rohstoffe handelt es sich in bevorzugten Ausführungsformen um Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen, insbesondere mit Wolle oder Seide.It This may be, for example, processes in which materials prepared for processing in textiles, such as anti-fungal finishing, or, for example, methods which carried the cleaning Enrich textiles with a nourishing component. Because of the above described effect of proteases on natural, protein-containing Raw materials are in preferred embodiments to processes for the treatment of textile raw materials, fibers or textiles with natural ingredients, especially with wool or Silk.
Erfindungsgemäße Enzyme sind entsprechend der vorstehenden Ausführungen vorteilhaft in erfindungsgemäßen Mitteln, insbesondere Wasch- und Reinigungsmitteln, und Verfahren, insbesondere Wasch- und Reinigungsverfahren, einsetzbar. Sie können also dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen proteinhaltige Verunreinigungen zu beseitigen.invention Enzymes are as described above advantageous in agents according to the invention, in particular Detergents and cleaners, and processes, in particular washing and cleaning Cleaning method, can be used. So you can use that be proteinaceous of textiles or hard surfaces Eliminate impurities.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildet daher die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease, wie sie vorstehend beschreiben wurde zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen. Bevorzugt wird die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Proteasen beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehende erfindungsgemäße Verwendung gilt. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung werden die betreffenden erfindungsgemäßen Enzyme im Rahmen eines erfindungsgemäßen Mittels, vorzugsweise eines erfindungsgemäßen Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittels, bereitgestellt.a Another object of the invention is therefore the use of a protease according to the invention, as described above has been described for cleaning textiles or hard surfaces. Preferably, the protease is added in an amount of 40 μg 4 g, preferably from 50 μg to 3 g, more preferably from 100 μg to 2 g, and most preferably from 200 μg used up to 1 g per application. All facts, objects and embodiments suitable for the invention Proteases are described are also on this subject invention applicable. Therefore, it is explicitly stated here the revelation in the appropriate place with the reference, that this disclosure also for the above inventive Use applies. In a preferred embodiment of this Use are the relevant invention Enzymes in the context of a composition according to the invention, Preferably, a washing or Detergent provided.
Eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Wasch- oder Reinigungsmitteln dar.A further embodiment of this subject invention provides the use of a protease according to the invention for activating or deactivating ingredients of laundry detergents or detergents.
Denn Protein-Bestandteile von Wasch- oder Reinigungsmitteln können durch das Einwirken einer Protease inaktiviert werden. Diesen ansonsten eher unerwünschten Effekt gezielt einzusetzen, ist ebenfalls ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Ebenso ist es wie oben beschrieben möglich, dass durch Proteolyse eine andere Komponente erst aktiviert wird, etwa, wenn sie ein Hybridprotein aus dem eigentlichen Enzym und dem dazu passenden Inhibitor darstellt. Ein anderes Beispiel für eine solche Regulation ist die, bei der eine aktive Komponente zum Schutz oder zur Kontrolle ihrer Aktivität in einem Material verkapselt vorliegt, das durch Proteolyse angegriffen wird. Erfindungsgemäße Proteasen können somit zu Inaktivierungs-, Aktivierungs- oder Freisetzungsreaktionen verwendet werden, insbesondere in mehrphasigen Mitteln.Because Protein components of detergents or cleaners can be inactivated by the action of a protease. This otherwise to use more unwanted effect targeted, is also an aspect of the present invention. It is the same as above possible that by proteolysis another component only is activated, for example, if it is a hybrid protein from the actual Enzyme and the appropriate inhibitor. Another example for such regulation is that in which an active component to protect or control their activity in one Material is encapsulated, which is attacked by proteolysis. Proteases according to the invention can thus used for inactivation, activation or release reactions especially in multi-phase means.
Ferner stellen auch folgende Verwendungen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar:
- – Die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung, insbesondere zum Entfernen von Schutzschichten auf Geweben;
- – die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege und hierunter bevorzugt
- – die entsprechende Verwendung für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.
- The use of a protease according to the invention for the recovery or treatment of raw materials or intermediates in textile production, in particular for the removal of protective layers on fabrics;
- The use of a protease according to the invention for the treatment of textile raw materials or for textile care and is preferred among these
- - the corresponding use for textile raw materials, fibers or textiles with natural components and especially for those with wool or silk.
Die vorliegende Erfindung wird auch in Form von solchen eine erfindungsgemäße Protease enthaltenden Mitteln verwirklicht, bei denen es sich um Kosmetika handelt. Hierunter werden alle Arten von reinigenden und pflegenden Mitteln für menschliche Haut oder Haar verstanden, insbesondere reinigende Mittel.The The present invention is also in the form of such an inventive Protease-containing agents, which are Cosmetics are. Below are all kinds of cleansing and caring products for human skin or hair, especially cleansers.
Denn Proteasen spielen auch im Zellerneuerungsprozess der menschlichen Haut (Desquamation) eine entscheidende Rolle. Dementsprechend werden Proteasen auch als bioaktive Komponenten in Hautpflegemitteln verwendet, um den Abbau der in trockener Haut vermehrten Desmosomenstrukturen zu unterstützen. Wie vorstehend ausführlich erläutert können erfindungsgemäße Proteasen weiterentwickelt werden, beispielsweise über Aminosäuresubstitutionen und/oder weitere Mutationen. Somit eignen sich auch erfindungsgemäße Proteasen, insbesondere solche, die etwa nach Mutagenese oder durch Zugabe entsprechender, mit ihnen wechselwirkender Stoffe in ihrer Aktivität kontrolliert sind, als aktive Komponenten in Haut- oder Haar-Reinigungs- oder Pflegemitteln. Besonders bevorzugt sind solche Präparationen dieser Enzyme, die wie oben beschrieben, beispielsweise durch Kopplung an makromolekulare Träger stabilisiert und/oder durch Substitutionen an hochallergenen Positionen verändert oder derivatisiert sind, so dass sie für den Menschen eine höhere Hautverträglichkeit aufweisen.Because Proteases also play in the cell renewal process of the human Skin (desquamation) plays a crucial role. Accordingly, become Proteases also used as bioactive components in skin care products, to the degradation of desmosome structures that are increased in dry skin to support. As explained in detail above proteases of the invention can be further developed be, for example via amino acid substitutions and / or other mutations. Thus, also inventive Proteases, in particular those which are present after mutagenesis or by Add appropriate, interacting with them in their materials Activity are controlled as active components in Skin or hair cleaning or care products. Especially preferred are such preparations of these enzymes as described above, for example, by coupling to macromolecular carrier stabilized and / or by substitutions in highly allergenic positions modified or derivatized, so that they are for the people have a higher skin tolerance.
Dementsprechend werden auch entsprechende kosmetische Reinigungs- und Pflegeverfahren und die Verwendung derartiger proteolytischer Enzyme zu kosmetischen Zwecken in diesen Erfindungsgegenstand einbezogen, insbesondere in entsprechenden Mitteln, wie beispielsweise Shampoos, Seifen oder Waschlotionen, oder in Pflegemitteln, die beispielsweise in Form von Cremes angeboten werden. Auch die Verwendung in einem schälenden Arzneimittel, beziehungsweise zu dessen Herstellung ist eingeschlossen.Accordingly also appropriate cosmetic cleaning and care procedures and the use of such proteolytic enzymes in cosmetic Purposes included in this subject of the invention, in particular in appropriate means, such as shampoos, soaps or washing lotions, or in care products, for example, in the form of creams offered become. Also use in a peeling drug, or for its production is included.
Neben
dem Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln und Kosmetika sind im
Stand der Technik zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten von
Proteasaen, insbesondere Subtilasen etabliert. Einen Überblick
hierüber bietet beispielsweise das Handbuch
- – die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur biochemischen Analyse oder zur Synthese von niedermolekularen Verbindungen oder von Proteinen;
- – darunter bevorzugt die Verwendung zur Endgruppenbestimmung im Rahmen einer Peptid-Sequenzanalyse;
- – die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen;
- – die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Synthese von Proteinen oder anderen niedermolekularen chemischen Verbindungen;
- – die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen, insbesondere zur Oberflächenbehandlung, ganz besonders zur Behandlung von Leder;
- – die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Behandlung von photographischen Filmen, insbesondere zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten; und
- – die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln.
- The use of a protease according to the invention for biochemical analysis or for the synthesis of low molecular weight compounds or of proteins;
- - including preferred use for end-group determination in a peptide sequence analysis;
- The use of a protease according to the invention for the preparation, purification or synthesis of natural substances or biological valuable substances;
- The use of a protease according to the invention for the synthesis of proteins or other low molecular weight chemical compounds;
- The use of a protease according to the invention for the treatment of natural raw materials, in particular for surface treatment, especially for the treatment of leather;
- The use of a protease according to the invention for the treatment of photographic films, in particular for the removal of gelatin-containing or similar protective layers; and
- - The use of a protease according to the invention for the production of food or animal feed.
Grundsätzlich wird der Einsatz erfindungsgemäßer Proteasen in allen weiteren Technikgebieten in den Schutzbereich der vorliegenden Anmeldung eingeschlossen, für die es sich als geeignet herausstellt.in principle is the use of proteases according to the invention in all other technical fields within the scope of the present Registration included, for which it is suitable it turns.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter, ohne sie jedoch darauf einzuschränken.The The following examples further illustrate the invention, but without restricting it.
BeispieleExamples
Alle
molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie
sie beispielsweise in dem Handbuch von
Beispiel 1example 1
Isolierung und Identifizierung des proteolytisch aktiven BakterienstammsIsolation and identification of the proteolytic active bacterial strain
0,1 g einer Bodenprobe wurden in 1 ml sterilen 0,9%iger NaCl-Lösung suspendiert und auf milchpulverhaltigen Agarplatten (1,5% Agar, 0,1% K2HPO4, 0,5% Hefeextrakt, 1% Pepton, 1% Milchpulver, 0,02% MgSO4·7H2O, 0,4% Na2CO3, pH 10) ausplattiert und bei 30°C inkubiert. Anhand eines Klärungshofes wurde ein proteolytisch aktives Bakterium isoliert, welches von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) als Bacillus pumilus identifiziert wurde (ID 08-100).0.1 g of a soil sample was suspended in 1 ml of sterile 0.9% NaCl solution and on agar plates containing milk powder (1.5% agar, 0.1% K 2 HPO 4 , 0.5% yeast extract, 1% peptone, 1% milk powder, 0.02% MgSO 4 .7H 2 O, 0.4% Na 2 CO 3 , pH 10) and incubated at 30 ° C. A proteolytically active bacterium was isolated on the basis of a clarification laboratory, which was identified by the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) as Bacillus pumilus (ID 08-100).
Beispiel 2Example 2
Isolierung und Klonierug der neuen Serinprotease aus dem BodenIsolation and cloning of the new serine protease from the soil
Das
proteolytisch aktive Bakterium wurde in TBY-Medium (0,5% NaCl, 0,5%
Hefeextrakt, 1% Trypton, pH 7,4) für 16 h bei 30°C
kultiviert. Die Gesamt-DNA dieses Bakteriums wurde nach Standardmethoden
präpariert, mit dem Restriktionsenzym Sau 3A behandelt
und in einen Bacillusvektor (Derivat des pBC16;
Die Transformanden wurden zunächst auf DM3-Medium regeneriert und dann auf milchpulverhaltige Agarplatten (TBY-Skimmilk-Platten; siehe Beispiel 1) überimpft. Proteolytisch aktive Klone wurden anhand ihrer Lysehöfe identifiziert. Aus den erhaltenen proteolytisch aktiven Klonen wurde einer ausgewählt, dessen Plasmid (Vektor) isoliert und das in diesem Vektor enthaltene Genfragment (Insert) nach Standardmethoden sequenziert.The Transformants were first regenerated on DM3 medium and then on milk powder agar plates (TBY Skimmilk plates; see Example 1). Proteolytically active clones were identified by their lysis farms. From the preserved proteolytically active clones were selected one whose plasmid (Vector) isolated and the gene fragment contained in this vector (Insert) sequenced by standard methods.
Das Insert enthält einen offenen Leserahmen von ca. 1,2 kb, dessen DNA-Sequenz für eine Protease vom Subtilisin-Typ codiert. Die Sequenz wurde mittels PCR amplifiziert, in der E. coli Vektor pUC19 kloniert und gemäß dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Nummer DSM 21891 hinterlegt.The insert contains an open reading frame of about 1.2 kb, its DNA sequence for a protease of subtilisin type. The sequence was amplified by PCR, cloned into the E. coli vector pUC19 and deposited under the Budapest Treaty with the DSMZ under the number DSM 21891.
Beispiel 3Example 3
Ermittlung der Reinigungsleistung bei Einsatz in einem handelsüblichen pulverförmigen WaschmittelDetermination of the cleaning performance at Use in a commercially available powdery laundry detergent
Für dieses Beispiel wurden standardisiert verschmutze Textilien eingesetzt, die von der EMPA Testmaterialien AG (St. Gallen, Schweiz), der wfk Testgewebe GmbH (Brüggen-Bracht, Deutschland) oder dem Center For Testmaterials (CFT, Vlaardingen, Niederlande) bezogen worden waren. Dabei wurden folgende Anschmutzungen und Textilien verwendet:
- A: Gras auf Baumwolle: Produkt Nr. 164 von der Firma Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Schweiz;
- B: Erdnuss Öl-Pigment/Tusche auf Polyester/Baumwolle: Produkt Nr. PC-10 von CFT (Center For Testmaterials) B. V. Vlaardingen, Niederlande;
- C: Schokoladenmilch/Ruß auf Baumwolle: Produkt Nr. C-03 von CFT (Center For Testmaterials) B. V. Vlaardingen, Niederlande.
- A: Grass on cotton: product no. 164 from the company Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Switzerland;
- B: Peanut oil pigment / ink on polyester / cotton: Product No. PC-10 from CFT (Center For Test Materials) BV Vlaardingen, The Netherlands;
- C: Chocolate milk / soot on cotton: Product No. C-03 from CFT (Center For Test Materials) BV Vlaardingen, The Netherlands.
Mit diesem Testmaterial wurden verschiedene Waschmittelrezepturen auf ihre Reinigungsleistung hin untersucht. Dafür wurden die Ansätze für 60 Minuten bei einer Temperatur von 40°C gewaschen. Die Dosierung lag bei 5,9 g des Waschmittels pro Liter Waschflotte. Es wurde mit Stadtwasser mit einer Wasserhärte von etwa 16° deutscher Härte gewaschen.With This test material was based on various detergent formulations investigated their cleaning performance. For that were the Bake for 60 minutes at a temperature of 40 ° C washed. The dosage was 5.9 g of the detergent per liter of wash liquor. It was made with city water with a water hardness of washed about 16 ° German hardness.
Als
Kontroll-Waschmittel diente eine Waschmittel-Basis-Rezeptur folgender
Zusammensetzung (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 10% lineares
Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz), 1,5% C12-C18-Fettalkoholsulfat
(Natrium-Salz), 2,0% C12-C18-Fettalkohol mit 7 EO, 20% Natriumcarbonat,
6,5% Natriumhydrogencarbonat, 4,0% amorphes Natriumdisilikat, 17%
Natriumcarbonatperoxohydrat, 4,0% TAED, 3,0% Polyacrylat, 1,0% Carboxymethylcellulose,
1,0% Phosphonat, 25% Natriumsulfat, Rest: Schauminhibitoren, optischer
Aufheller, Duftstoffe. Die Waschmittel-Basis-Rezeptur wurde für
die verschiedenen Versuchsreihen aktivitätsgleich (5 PE/ml
Endkonzentration) mit folgenden Proteasen versetzt: erfindungsgemäße
Protease umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ
ID NO. 3 (Ansatz 1), Protease aus Bacillus pumilus gemäß
Nach
dem Waschen wurde der Weißheitsgrad der gewaschenen Textilien
gemessen. Die Messung erfolgte an einem Spektrometer Minolta CM508d
(Lichtart D65, 10°). Das Gerät wurde zuvor mit
einem mitgelieferten Weißstandard kalibriert. Die erhaltenen
Ergebnisse sind die Differenzremissionen zwischen einem Waschvorgang
mit einem Waschmittel enthaltend eine Protease und einem parallel
durchgeführten Kontrollwaschgang mit einem Waschmittel
ohne Protease. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle
1 zusammengestellt und erlauben einen unmittelbaren Rückschluss
auf den Beitrag des jeweils enthaltenen Enzyms zur Reinigungsleistung
des verwendeten Mittels. Tabelle 1: Waschergebnisse mit einem pulverförmigen
Waschmittel bei 40°C
Es wird deutlich, dass eine erfindungsgemäße Protease bereits in ihrer Wildtyp-Form eine bessere Reinigungsleistung zeigt im Vergleich zu einer bekannten Protease aus Bacillus pumilus, die eine ähnliche Aminosäuresequenz aufweist, sowie selbst im Vergleich mit der leistungsverbesserten Proteasevariante gemäß Ansatz 3, die kein Wildtyp-Molekül ist.It it becomes clear that a protease according to the invention already shows a better cleaning performance in its wild-type form in comparison to a known protease from Bacillus pumilus, the has a similar amino acid sequence, as well even in comparison with the performance-enhanced protease variant according to approach 3, which is not a wild-type molecule is.
Beschreibung der FigurenDescription of the figures
Darin bedeuten:
- 1: Protease aus Bacillus lentus DSM
5483 (
WO 92/21760 A1 - 2: Erfindungsgemäße Protease gemäß SEQ ID NO. 3 (reifes Enzym)
- 3: reife (mature) Protease gemäß Datenbankeintrag Q5XPN0 aus Bacillus pumilus (Q5XPN0_BACPU; „Organic solvent tolerant protease”; Bacillus pumilus (Bacillus mesentericus); vgl. SEQ ID NO. 6)
- 1: Protease from Bacillus lentus DSM 5483 (
WO 92/21760 A1 - 2: Protease according to the invention according to SEQ ID NO. 3 (mature enzyme)
- 3: Mature protease according to database entry Q5XPN0 from Bacillus pumilus (Q5XPN0_BACPU; "Organic solvent tolerant protease"; Bacillus pumilus (Bacillus mesentericus), see SEQ ID NO.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION
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Zitierte PatentliteraturCited patent literature
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PCT/EP2009/065201 WO2010060822A1 (en) | 2008-11-27 | 2009-11-16 | Novel proteases and compositions comprising these proteases |
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Patent Citations (6)
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Also Published As
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