DE102008033381B4

DE102008033381B4 - Modulation of the immune response by the receptor NKp65 and its ligands

Info

Publication number: DE102008033381B4
Application number: DE200810033381
Authority: DE
Inventors: Dr. Steinle Alexander; Jessica Spreu
Original assignee: Individual
Current assignee: STEINLE, ALEXANDER, DR., DE
Priority date: 2008-07-07
Filing date: 2008-07-07
Publication date: 2013-12-24
Anticipated expiration: 2028-07-08
Also published as: WO2010003635A1; DE102008033381A1

Abstract

Verwendung einer Substanz zum Blockieren des NKp65-Rezeptors zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von entzündlichen und autoimmunen Erkrankungen, insbesondere der Haut, wobei die Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend anti-NKp65-Antikörper, anti-CLEC2A-Antikörper, lösliches NKp65, lösliches CLEC2A, oder funktionale Fragmente davon.Use of a substance for blocking the NKp65 receptor for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of inflammatory and autoimmune diseases, in particular of the skin, wherein the substance is selected from the group comprising anti-NKp65 antibodies, anti-CLEC2A antibodies, soluble NKp65, soluble CLEC2A, or functional fragments thereof.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Modulation der Aktivität von Immunzellen, insbesondere Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), sowie ein neues Protein und dessen Verwendung in der Behandlung von Krankheiten, insbesondere entzündlichen und autoimmunen Hautkrankheiten.The present invention relates to methods for modulating the activity of immune cells, in particular natural killer (NK) cells, as well as a novel protein and its use in the treatment of diseases, in particular inflammatory and autoimmune skin diseases.

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems und u. a. auch an der Elimination von Virus-infizierten und malignen Körperzellen beteiligt. In jüngerer Zeit konnte gezeigt werden, dass die NK-Zell-Erkennung durch eine Balance von Signalen aktivierender und inhibierender Rezeptoren diktiert wird. Die Bindung von aktivierenden NK-Rezeptoren – ggf. in Verbindung mit Adaptoren zur Bildung eines Rezeptorkomplexes – an ihre Liganden, löst Effektormechanismen von NK-Zellen, wie Cytotoxizität und Cytokinsekretion, aus. Bestimmte aktivierende NK-Rezeptoren werden auch von T Zellen, wie z. B. CD8 T Zellen und γδ T Zellen exprimiert, und wirken auf diesen kostimulatorisch.Natural killer cells (NK cells) are an important part of the innate immune system and u. a. also involved in the elimination of virus-infected and malignant body cells. More recently, it has been shown that NK cell recognition is dictated by a balance of signals from activating and inhibiting receptors. The binding of activating NK receptors - optionally in conjunction with adapters to form a receptor complex - to their ligands triggers effector mechanisms of NK cells, such as cytotoxicity and cytokine secretion. Certain activating NK receptors are also recognized by T cells, such as T cells. B. CD8 T cells and γδ T cells expressed, and act on these costimulatory.

Um ihre cytotoxische und cytokinsekretorische Aktivität zu steuern, besitzen NK-Zellen zwei Arten von Oberflächenrezeptoren, nämlich aktivierende Rezeptoren, die die Effektorfunktion der NK Zellen auslösen, und inhibierende Rezeptoren, die diese Aktivierung inhibieren, und auch verhindern, dass NK-Zellen „gesunde” körpereigene Zellen abtöten. Die aktivierenden Rezeptoren auf NK-Zellen erkennen Selbst-Proteine, die unter bestimmten Bedingungen auf den Oberflächen anderer körpereigener Zellen exprimiert werden.To control their cytotoxic and cytokine secretory activity, NK cells have two types of surface receptors, namely activating receptors that trigger the effector function of NK cells, and inhibitory receptors that inhibit this activation, and also prevent NK cells from becoming "healthy". kill the body's own cells. The activating receptors on NK cells recognize self-proteins that are expressed under certain conditions on the surfaces of other endogenous cells.

Beim Menschen wurden bisher einige aktivierende NK Rezeptoren identifiziert, darunter NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 und NKG2D. Gleichwohl sind längst nicht alle NK Rezeptoren und/oder deren Liganden identifiziert.In humans, several activating NK receptors have been identified, including NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, and NKG2D. Nevertheless, not all NK receptors and / or their ligands are identified by far.

Insbesondere bei Autoimmunkrankheiten spielt die Interaktion zwischen aktivierendem NK-Rezeptor und dem entsprechenden Ligand eine große Rolle, da hierdurch cytotoxische Lymphozyten wie NK-Zellen und CD8 T Zellen aktiviert bzw. stimuliert werden.Especially in autoimmune diseases, the interaction between activating NK receptor and the corresponding ligand plays a major role, as this cytotoxic lymphocytes such as NK cells and CD8 T cells are activated or stimulated.

So nimmt man an, dass allergische Reaktionen der Haut und entzündliche bzw. autoimmune Hautkrankheiten immunologische Krankheiten darstellen, bei welchen auch NK-Zellen und cytotoxische CD8 T Zellen eine wichtige Rolle spielen.Thus, it is believed that skin allergic reactions and inflammatory or autoimmune skin diseases are immunological diseases in which NK cells and cytotoxic CD8 T cells also play an important role.

Gegenwärtig werden Hautkrankheiten (Dermatosen) insbesondere durch eine äußere Behandlung mit Salben, Licht- und/oder Badetherapien behandelt; ferner werden bei bestimmten Erkrankungen, bspw. der Schuppenflechte (Psoriasis), auch in Kombination hierzu immunmodulierende Substanzen eingesetzt.At present, skin diseases (dermatoses) are treated in particular by external treatment with ointments, light and / or bath therapies; Furthermore, in certain diseases, for example psoriasis, immunomodulatory substances are also used in combination therewith.

Da bei vielen Hautkrankheiten die Entstehung und die Auslöser der Krankheiten immer noch unbekannt sind, ist oftmals eine effiziente Behandlung oder Therapie unmöglich, so dass nach wie vor ein großes Interesse an der Aufklärung der Pathogenese von Hautkrankheiten im Allgemeinen, und spezifischer von autoimmunen Hautkrankheiten, sowie deren Behandlung besteht.Since many skin diseases still have unknown causes and causes of the disease, efficient treatment or therapy is often impossible, so that there is still much interest in elucidating the pathogenesis of skin diseases in general, and more specifically autoimmune skin diseases, as well as their treatment exists.

Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung neue Mechanismen und Substanzen bereitzustellen, über welche Hautkrankheiten effizient behandelt werden können.Against this background, it is an object of the present invention to provide new mechanisms and substances through which skin diseases can be treated efficiently.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird diese Aufgabe durch die Verwendung einer Substanz zum Blockieren des NKp65-Rezeptors bzw. des NKp65-Liganden CLEC2A zur Behandlung und/oder Prävention von entzündlichen Krankheiten, allergischen Krankheiten, Autoimmunkrankheiten, insbesondere der Haut, gelöst.According to the present invention, this object is achieved by the use of a substance for blocking the NKp65 receptor or the NKp65 ligand CLEC2A for the treatment and / or prevention of inflammatory diseases, allergic diseases, autoimmune diseases, in particular of the skin.

Die Erfindung wird ferner durch die Bereitstellung einer neuen pharmazeutischen Zusammensetzung gelöst, die als aktive Substanz eine Substanz enthält, die die Interaktion zwischen dem NKp65-Rezeptor und seinen Liganden blockiert.The invention is further achieved by the provision of a novel pharmaceutical composition containing as active substance a substance which blocks the interaction between the NKp65 receptor and its ligands.

Die Erfindung betrifft ferner das neu entdeckte Rezeptor-Protein NKp65, die NKp65-kodierenden Polynukleotide, sowie das NKp65-Protein exprimierende Zellen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verwendungen von NKp65 in der Forschung und in der Therapie.The invention further relates to the newly discovered receptor protein NKp65, the NKp65-encoding polynucleotides, as well as the NKp65 protein expressing cells. Furthermore, the present invention relates to uses of NKp65 in research and in therapy.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur in vitro Modulation der Aktivität von NKp65 und/oder CLEC2A exprimierenden Zellen, wobei die Zellen jeweils mit CLEC2A oder funktionellen Fragmenten davon, und/oder mit NKp65 oder funktionellen Fragmenten davon, und/oder mit spezifischen Antikörpern gegen NKp65 und/oder CLEC2A, oder Fragmenten davon, in Kontakt gebracht werden. The invention further relates to a method for in vitro modulation of the activity of NKp65 and / or CLEC2A expressing cells, wherein the cells each with CLEC2A or functional fragments thereof, and / or with NKp65 or functional fragments thereof, and / or with specific antibodies against NKp65 and / or CLEC2A, or fragments thereof.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.The object underlying the invention is completely solved in this way.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung konnten nämlich den neuen Rezeptor NKp65 identifizieren, seine aktivierende Funktion beschreiben und zeigen, dass dieser der Rezeptor für das kürzlich identifizierte Protein CLEC2A ist.Namely, the inventors of the present application were able to identify the new receptor NKp65, describe its activating function and show that it is the receptor for the recently identified protein CLEC2A.

CLEC2A stellt ein Transmembranprotein dar, das nahezu exklusiv in der menschlichen Haut und einigen wenigen myeloiden Zellen exprimiert wird (Spreu et al., „A novel, alternatively spliced and skin-associated member of the NKC-encoded AICL-CD69-LLT1 family”, Immunogenetics (2007), 59:903-012). Der dieses Protein bindende Rezeptor, NKp65, stellt keinen bisher bekannten Rezeptor dar und war bisher nicht, auch nicht auf genomischer Ebene, identifiziert worden.CLEC2A is a transmembrane protein that is expressed almost exclusively in human skin and a few myeloid cells (Spreu et al., "A novel, spliced and skin-shared member of the NKC-encoded AICL-CD69-LLT1 family", Immunogenetics (2007), 59: 903-012). The protein binding receptor, NKp65, is not a previously known receptor and has not previously been identified, even at the genomic level.

Durch eigene Versuche konnten die Erfinder die Interaktion zwischen CLEC2A und NKp65 darlegen, nämlich indem sie die Bindung von löslichem CLEC2A an NKp65 transfizierte Zellen zeigten, sowie die Bindung von löslichem NKp65 an mit CLEC2A transfizierte Zellen. Die Erfinder konnten ferner in eigenen Versuchen darlegen, dass mit CLEC2A transfizierte Zellen NK-Zellen stimulieren, was ganz offensichtlich auf die Bindung von CLEC2A an seinen aktivierenden Rezeptor NKp65 zurückzuführen ist.Through in-house experiments, the inventors were able to demonstrate the interaction between CLEC2A and NKp65, by demonstrating the binding of soluble CLEC2A to NKp65 transfected cells, and the binding of soluble NKp65 to cells transfected with CLEC2A. The inventors have also been able to demonstrate in their own experiments that cells transfected with CLEC2A stimulate NK cells, which is obviously due to the binding of CLEC2A to its activating receptor NKp65.

Dadurch wird mit der nun entdeckten Interaktion zwischen CLEC2A und dem neu identifizierten Rezeptor NKp65 ein Ansatz bereitgestellt, mit dem gezielt eine ungewollte bzw. Krankheitssymptome-induzierende Stimulierung von NK-Zellen und anderen NKp65 exprimierenden Immunzellen beeinflusst und ggf. blockiert werden kann.Thus, with the now discovered interaction between CLEC2A and the newly identified receptor NKp65, an approach is provided which can specifically influence and, if necessary, block unwanted or disease-symptom-inducing stimulation of NK cells and other NKp65-expressing immune cells.

Vorliegend soll „Substanz zum Blockieren” jede Substanz bedeuten, mit denen die Interaktion von NKp65 und seinen Liganden, insbesondere CLEC2A, und damit die Stimulation von NK Zellen und anderen NKp65-exprimierenden Immunzellen blockiert werden kann. Daher sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht nur Substanzen geeignet, die die Bindung von NKp65 durch seine Liganden spezifisch blockieren, sondern auch Substanzen, die, durch Bindung von entweder CLEC2A oder NKp65, eine Interaktion zwischen CLEC2A und NKp65 inhibieren. Ferner sind auch Substanzen gemeint, die zwar nicht die NKp65/Liganden-Bindung inhibieren, aber die aktivierende Interaktion zwischen NKp65 und seinen Liganden inhibieren. Dies können bspw. Antikörper sein, die gegen CLEC2A oder NKp65, oder Fragmente davon, gerichtet sind. Darüber hinaus können auch lösliche Liganden, wie bspw. lösliches CLEC2A und oder Fragmente davon, die an NKp65 binden können, eingesetzt werden, oder aber lösliches NKp65 oder Fragmente davon, die die NKp65-Liganden binden können.In the present context, "substance for blocking" is intended to mean any substance which can block the interaction of NKp65 and its ligands, in particular CLEC2A, and thus the stimulation of NK cells and other NKp65-expressing immune cells. Therefore, within the scope of the present invention, it is not only substances which specifically block the binding of NKp65 by its ligands but also substances which, by binding of either CLEC2A or NKp65, inhibit an interaction between CLEC2A and NKp65. Also meant are substances which, while not inhibiting NKp65 / ligand binding, inhibit the activating interaction between NKp65 and its ligands. These may be, for example, antibodies directed against CLEC2A or NKp65, or fragments thereof. In addition, soluble ligands such as soluble CLEC2A and / or fragments thereof capable of binding to NKp65 may also be used, or soluble NKp65 or fragments thereof capable of binding the NKp65 ligands.

Vorliegend sollen die Begriffe „funktionale Fragmente” oder „funktionelle Fragmente”, wie sie in der Anmeldung verwendet werden, Substanzen bedeuten, die Teile/Abschnitte größerer Verbindungen oder Substanzen darstellen, wobei diese Teile/Abschnitte immer noch die funktionellen Eigenschaften der größeren Verbindungen/Substanzen zeigen und besitzen, von denen sie abgeleitet sind.As used herein, the terms "functional fragments" or "functional fragments" as used in the application are intended to mean substances which constitute portions / portions of larger compounds or substances, which parts / portions still retain the functional properties of the larger compounds show and possess, from which they are derived.

Vorliegend sollen sich die Begriffe „funktionale Fragmente” oder „funktionelle Fragmente” von Antikörpern, wie sie in der Anmeldung verwendet werden, Substanzen bedeuten, die Teile/Abschnitte der Antikörper darstellen und die immer noch die funktionellen Eigenschaften, insbesondere die Zell-Bindungseigenschaften, der Antikörper zeigen und besitzen, von denen sie abgeleitet sind. Dabei können diese Fragmente entweder als solche oder aber in Kombination mit anderen Fragmenten als modifizierte, bspw. als humanisierte, Antikörper eingesetzt werden.As used herein, the terms "functional fragments" or "functional fragments" of antibodies as used in the application are intended to mean substances that are parts / portions of the antibodies and still retain the functional properties, particularly cell binding properties Show and possess antibodies from which they are derived. These fragments can be used either as such or in combination with other fragments as modified, for example as humanized, antibodies.

Die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeigneten Antikörper sind vorzugsweise monoklonal, wobei ausgehend von den identifizierten Peptiden CLEC2A und NKp65 oder ausgehend von bereits gegen diese Peptide gerichteten Antikörpern, weitere Antikörper gewonnen werden können.The antibodies suitable for the purposes of the present invention are preferably monoclonal, it being possible to obtain further antibodies starting from the identified peptides CLEC2A and NKp65 or starting from antibodies already directed against these peptides.

Vorliegend sind aber auch Fragmente solcher Antikörper, wie bspw. Fab, F(ab)'₂ oder scFv Fragmente, und andere Fragmente wie CDR („complementarity-determining region”, hypervariable Region) als Antikörper im Sinne und Rahmen der vorliegenden Erfindung gemeint, so lange wie sie ihre Funktionalität, d. h. die spezifischen Bindungseigenschaften wie die „ganzen” Antikörper, von denen sie abgeleitet sind, besitzen. Solche Antikörper-Fragmente können bspw. auch rekombinant unter Verwendung im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden.In the present case, however, also fragments of such antibodies, such as, for example, Fab, F (ab) ' ₂ or scFv fragments, and other fragments such as CDR ("complementarity-determining region", hypervariable region) are meant as antibodies within the meaning and scope of the present invention, as long as they have their functionality, ie the specific binding properties, like the "whole" antibodies from which they are derived. Such For example, antibody fragments can also be produced recombinantly using methods known in the art.

Wie bereits weiter oben erwähnt können humanisierte Antikörper bspw. chimäre Antikörper sein, bei welchen die konstanten Regionen der tierischen Antikörper (bspw. von Maus- oder Kaninchen-Antikörpern) durch die entsprechenden Regionen menschlicher Antikörper, bspw. den Fc-Fragmenten, ersetzt wurden. Alternativ kann auch die CDR der tierischen Antikörper mit menschlichen Antikörpern verbunden werden.As already mentioned above, humanized antibodies may, for example, be chimeric antibodies in which the constant regions of the animal antibodies (for example of mouse or rabbit antibodies) have been replaced by the corresponding regions of human antibodies, for example the Fc fragments. Alternatively, the CDR of the animal antibody can be linked to human antibodies.

Vorliegend wird ferner der Rezeptor NKp65 u. a. auch mit „Protein” oder „Peptid” bezeichnet, wobei zwar der Begriff „Peptid” in der Regel kürzere Aminosäureketten bezeichnet, und „Protein” auch größere und komplexe Aminosäuren-Polymere, beide Begriffe aber in der vorliegenden Anmeldung synonym verwendet werden.In the present case, the receptor NKp65 u. a. Also referred to as "protein" or "peptide", although the term "peptide" usually denotes shorter amino acid chains, and "protein" also larger and complex amino acid polymers, both terms are used synonymously in the present application.

Die Erkenntnis, dass CLEC2A ein Ligand für den neu entdeckten Rezeptor NKp65 ist, ermöglicht die spezifische Modulation der Interaktion zwischen CLEC2A und NKp65, Dies eröffnet wiederum die Möglichkeit, Krankheiten zu behandeln, bei denen NKp65 und sein Ligand CLEC2A eine Rolle spielen. Hierbei kommen bspw. Krankheiten wie entzündliche Krankheiten, Autoimmunkrankheiten, Krebs, etc., in Betracht, bzw. allgemein Krankheiten, in deren Verlauf eine konstante oder transiente Stimulation von NK Zellen und/oder anderen NKp65 exprimierenden Immunzellen durch die Wechselwirkung von NKp65 mit CLEC2A entsprechende Symptome-induzierende Reaktionen verursacht; solche Reaktionen sind bspw. chronische Entzündungsreaktionen und die Freisetzung von entzündlichen Cytokinen, wie es bspw. der Fall bei Autoimmunkrankheiten der Haut ist, bspw. bei Psoriasis, Lupus erythematodes, etc. Da die Erfinder darüber hinaus erkannt haben, dass CLEC2A vor allem spezifisch auf Hautzellen exprimiert wird, können insbesondere die vorgenannten Krankheiten der Haut behandelt werden.The finding that CLEC2A is a ligand for the newly discovered receptor NKp65 allows specific modulation of the interaction between CLEC2A and NKp65, which in turn opens the possibility to treat diseases in which NKp65 and its ligand CLEC2A play a role. In this case, for example, diseases such as inflammatory diseases, autoimmune diseases, cancer, etc., come into consideration, or in general diseases in the course of a constant or transient stimulation of NK cells and / or other NKp65 expressing immune cells by the interaction of NKp65 with CLEC2A corresponding Causes symptoms-inducing reactions; such reactions are, for example, chronic inflammatory reactions and the release of inflammatory cytokines, as is the case with autoimmune diseases of the skin, for example in psoriasis, lupus erythematosus, etc. Since the inventors have also recognized that CLEC2A is especially specific for Skin cells is expressed, in particular, the aforementioned diseases of the skin can be treated.

Psoriasis (Schuppenflechte) ist eine Hautkrankheit, die sich nach außen hin im Wesentlichen durch einige stark schuppende, punktförmige bis handtellergroße Hautstellen, insbesondere an den Knien, Ellenbogen und der Kopfhaut, äußert. Schuppenflechte ist zu einem erheblichen Anteil erblich bedingt. Man geht davon aus, dass sie durch das Zusammenwirken von Varianten verschiedener Gene und Umwelteinflüssen ausgelöst wird. Die Ursachen, ob und wann diese genetische Veranlagung auch tatsächlich zum Ausbruch der Krankheit führt, sind jedoch bis heute weitestgehend unerforscht. Eine Heilung der Psoriasis ist heutzutage aufgrund der bisherigen medizinischen Forschungsergebnisse nicht möglich, da es bisher nicht gelungen ist, diesen ursprünglichen genetischen Defekt zu beheben.Psoriasis (psoriasis) is a skin disease that manifests itself to the outside mainly by some strongly scaly, punctate to palm-sized skin areas, especially on the knees, elbows and scalp. Psoriasis is to a considerable extent hereditary. It is believed that it is triggered by the interaction of variants of different genes and environmental influences. However, the causes of whether and when this genetic predisposition actually leads to the onset of the disease are still largely unexplored. A cure for psoriasis is not possible today because of the medical research results so far, since it has not been able to fix this original genetic defect.

Lupus erythematodes ist eine chronisch verlaufende Autoimmunkrankheit, wobei man je nach Organmanifestation und Auslösemechanismus verschiedene Formen der Erkrankung unterscheidet. Symptome sind u. a. scheibenförmige Hautrötungen, vorwiegend an Wangen, Nase und Stirn, sowie beim Lupus erythematodes profundus derbe Knoten im subkutanen Fettgewebe von Gesicht, Schultern, Gesäß und Extremitäten. Eine mögliche Ursache dieser multifaktoriellen Erkrankung scheint die unkontrollierte Differenzierung autoreaktiver B-Lymphocyten zu sein. Auch exogene Faktoren, wie bspw. starke Sonnenbestrahlung, bestimmte Pharmaka, etc., und endogene Faktoren, wie bspw. Störungen im Hormonhaushalt, scheinen bei der Ausprägung eines Lupus erythematodes eine Rolle zu spielen.Lupus erythematosus is a chronic autoimmune disease characterized by different forms of the disease, depending on the organ's manifestation and triggering mechanism. Symptoms are u. a. Discogenic erythema, predominantly on the cheeks, nose and forehead, as well as in the lupus erythematosus profundus severe nodules in the subcutaneous adipose tissue of the face, shoulders, buttocks and extremities. One possible cause of this multifactorial disease seems to be the uncontrolled differentiation of autoreactive B lymphocytes. Also, exogenous factors, such as strong sunlight, certain drugs, etc., and endogenous factors, such as disorders in hormone balance, appear to play a role in the manifestation of lupus erythematosus.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Substanz dabei ausgewählt aus anti-NKp65-Antikörpern, anti-CLEC2A-Antikörpern, löslichem NKp65, löslichem CLEC2A, oder funktionalen Fragmenten davon. Insbesondere ist bevorzugt, wenn als anti-CLEC2A-Antikörper der Antikörper OMA2 eingesetzt werden, der von Hybridomzellen produziert wird, die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) hinterlegt sind.In a preferred embodiment, the substance is selected from anti-NKp65 antibodies, anti-CLEC2A antibodies, soluble NKp65, soluble CLEC2A, or functional fragments thereof. In particular, it is preferred if the antibody OMA2 used as anti-CLEC2A antibody is produced by hybridoma cells deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ).

Mit den aufgeführten Substanzen kann die Interaktion zwischen NKp65 und CLEC2A selektiv blockiert werden. Insbesondere konnten die Erfinder der vorliegenden Anmeldung in eigenen Versuchen zeigen, dass eine Vorinkubation von CLEC2A-Transfektanten mit dem Antikörper OMA2 die Bindung von löslichem NKp65 blockierte. Da ohne Vorinkubation mit dem Antikörper OMA2 eine Bindung von löslichem NKp65 an die CLEC2A-Transfektanten stattfand, wurde in Verbindung mit den Vorinkubationsversuchen somit eine spezifische Blockierung der Bindung von NKp65 und CLEC2A durch den Antikörper OMA2 dargelegt.With the listed substances, the interaction between NKp65 and CLEC2A can be selectively blocked. In particular, the inventors of the present application were able to show in their own experiments that preincubation of CLEC2A transfectants with the antibody OMA2 blocked the binding of soluble NKp65. Since binding of soluble NKp65 to the CLEC2A transfectants took place without preincubation with the antibody OMA2, a specific blocking of the binding of NKp65 and CLEC2A by the antibody OMA2 was thus explained in connection with the preincubation experiments.

Die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeigneten Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein, die einfach gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren durch Fachleute gewonnen werden können. Eine Anleitung zur Gewinnung von monoklonalen Antikörpern veröffentlichten Köhler und Milstein („Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity”, Nature, (1975), 256:495-497).The antibodies useful for the purposes of the present invention can be polyclonal or monoclonal, which can be readily obtained by those skilled in the art according to methods known in the art. A guideline for obtaining monoclonal antibodies was published by Köhler and Milstein ("Continuous cultures of fused cells secreting antibodies of predefined specificity", Nature, (1975), 256: 495-497).

Wie bereits weiter oben erwähnt, sind vorliegend auch Fragmente solcher Antikörper, wie bspw. Fab, F(ab)'₂ oder scFv Fragmente, und andere Fragmente wie CDR („complementarity-determining region”, hypervariable Region) als Antikörper im Sinne und Rahmen der vorliegenden Erfindung gemeint, so lange wie sie ihre Funktionalität, d. h. die spezifischen Bindungseigenschaften wie die „ganzen” Antikörper, von denen sie abgeleitet sind, besitzen. Solche Antikörper-Fragmente können bspw. auch rekombinant unter Verwendung im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. As already mentioned above, in the present case, fragments of such antibodies, such as, for example, Fab, F (ab) ' ₂ or scFv fragments, and other fragments such as CDR ("complementarity-determining region", hypervariable region) as antibodies in the sense and scope As long as they have their functionality, ie the specific binding properties as the "whole" antibodies from which they are derived. For example, such antibody fragments can also be produced recombinantly using methods known in the art.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden humanisierte Antikörper oder Fragmente davon eingesetzt.In a preferred embodiment, humanized antibodies or fragments thereof are used.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein anti-NKp65-Antikörper eingesetzt, der von Hybridomzellen produziert wird, die durch Immunisierung mit der löslichen NKp65 Ektodomäne generiert werden. Hierzu wird diese Ektodomäne für die Immunisierung von hierfür geeigneten Tieren, bspw. Mäusen, eingesetzt, anschließend werden die anti-NKp65-Antikörper produzierenden lymphoiden Zellen isoliert und mit Myelom-Zellen fusioniert. Unter „geeigneten Tieren” ist dabei jedes Tier zu verstehen, das mit Antigenen immunisiert werden kann, und das anschließend Antikörper-produzierende lymphoide Zellen generiert. Üblicherweise sind solche Tiere Mäuse oder Kaninchen, und die lymphoiden Zellen sind Milzzellen bzw. B-Zellen der Milz.In a preferred embodiment, an anti-NKp65 antibody is used which is produced by hybridoma cells generated by immunization with the soluble NKp65 ectodomain. For this purpose, this ectodomain is used for the immunization of animals suitable for this purpose, for example mice. Subsequently, the anti-NKp65 antibody-producing lymphoid cells are isolated and fused with myeloma cells. By "suitable animals" is meant any animal that can be immunized with antigens and subsequently generates antibody-producing lymphoid cells. Usually, such animals are mice or rabbits, and the lymphoid cells are spleen cells or spleen B cells.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Substanz eingesetzt, die eine Aminosäuresequenz aufweist oder besitzt, die mit der SEQ ID Nr. 1 des beigefügten Sequenzprotokolls dargestellt ist, Fragmente oder Homologe davon.In another embodiment of the invention, a substance having or having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the attached Sequence Listing, fragments or homologs thereof is used.

Die SEQ ID Nr. 1 in dem beigefügten Sequenzprotokoll zeigt die vollständige Länge der Aminosäuresequenz von NKp65 (207 Aminosäuren). Mit der SEQ ID Nr. 2 ist die für den NKp65-Rezeptor kodierende Nukleotidsequenz des NKp65-Gens angegeben.SEQ ID NO: 1 in the attached sequence listing shows the full length of the amino acid sequence of NKp65 (207 amino acids). SEQ ID NO: 2 indicates the NKp65 receptor-encoding nucleotide sequence of the NKp65 gene.

Insbesondere ist bevorzugt, wenn eine Substanz ausgewählt ist, die eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend

a) SEQ ID Nr. 1, oder
b) SEQ ID Nr. 1, Aminosäuren Asp 52 bis Val 207 des beigefügten Sequenzprotokolls.
c) Fragmente der Sequenzen gemäß a) oder b), die die biologische Aktivität des Peptids gemäß a) oder b) in einem Test betreffend die Bindung von CLEC2A betreffen,
d) Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, welche die Fähigkeit besitzt, unter stringenten Bedingungen mit der Nukleotidsequenz mit der SEQ ID Nr. 2 von Nukleotid 154 bis Nukleotid 621 zu hybridisieren, und
e) Fragmente mit einer Sequenz, die mindestens zu 80%, vorzugsweise mindestens zu zwischen 80% und 99%, insbesondere zu 85%, 90%, 95%, identisch ist mit einer der in a) bis d) aufgeführten Sequenzen.

In particular, it is preferable if a substance having an amino acid sequence selected from the group consisting is selected

a) SEQ ID NO: 1, or
b) SEQ ID NO: 1, amino acids Asp 52 to Val 207 of the attached Sequence Listing.
c) fragments of the sequences according to a) or b) which relate to the biological activity of the peptide according to a) or b) in a test concerning the binding of CLEC2A,
d) an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence which has the ability to hybridize under stringent conditions to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 from nucleotide 154 to nucleotide 621, and
e) fragments having a sequence which is at least 80%, preferably at least 80% to 99%, in particular 85%, 90%, 95%, identical to one of the sequences listed in a) to d).

Mit der unter b) aufgeführten (Teil-)Sequenz 52 bis 207 der vollständigen Länge von NKp65 ist die Ektodomäne von NKp65 angegeben.With the (partial) sequence 52 to 207 of the complete length of NKp65 listed under b), the ectodomain of NKp65 is indicated.

Dem Fachmann wird beim Lesen der vorliegenden Erfindung klar sein, dass auch mit den aufgeführten Sequenzen verwandte Sequenzen im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sein können, die sich aber von ersteren durch Modifikationen, bspw. Aminosäurenaustausche, -deletionen, -additionen, unterscheiden, die aber immer noch die charakteristischen Eigenschaften, insbesondere die Bindungseigenschaften der hierin aufgeführten Sequenzen aufweisen.It will be apparent to those skilled in the art upon reading the present invention that sequences related to the listed sequences may also be useful in the present invention, but differing from the former by modifications, for example amino acid substitutions, deletions, additions, but still have the characteristic properties, in particular the binding properties of the sequences listed herein.

Der Begriff ”Hybridisierung unter stringenten Bedingungen” bedeutet im Zusammenhang dieser Erfindung, dass die Hybridisierung in vitro unter Bedingungen durchgeführt wird, die stringent genug sind, um eine spezifische Hybridisierung zu gewährleisten. Der Begriff ”spezifische Hybridisierung” bezieht sich auf den Umstand, dass ein Molekül unter stringenten Bedingungen präferentiell an eine bestimmte Nukleinsäuresequenz, die Zielsequenz, bindet, wenn diese Teil einer komplexen Mischung- von z. B. DNA- oder RNA-Molekülen ist, aber nicht oder zumindest wesentlich reduziert an andere Sequenzen. Die genauen Bedingungen für eine Stringenz hängen von entsprechenden Umständen, bspw. hinsichtlich des verwendeten Materials, ab. Typischerweise sind stringente Bedingungen solche, bei denen eine Hybridisierung zwischen den genannten Nukleotidsequenzen unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der genannten Nukleotidsequenzen stattfindet. Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen sind bspw. solche, bei denen eine Lösung aus 5× oder 6 × SSPE (oder SSC), 1% oder 0,5% SDS, 1 × Denhardts-Lösung verwendet wird, und die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst mit 2 × SSC, 1% SDS und danach mit 0,2×/0,1 × SSC bei Temperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE, SSC und Denhardts-Lösung siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)).The term "hybridization under stringent conditions" in the context of this invention means that the hybridization is performed in vitro under conditions that are stringent enough to ensure specific hybridization. The term "specific hybridization" refers to the fact that a molecule preferentially binds to a particular nucleic acid sequence, the target sequence, under stringent conditions, when these are part of a complex mixture - e.g. DNA or RNA molecules, but not or at least substantially reduced to other sequences. The exact conditions for stringency depend on appropriate circumstances, for example with regard to the material used. Typically, stringent conditions are those in which hybridization between said nucleotide sequences occurs under conventional conditions, especially at 20 ° C below the melting point of said nucleotide sequences. Preferred hybridization conditions are, for example, those in which a solution of 5 × or 6 × SSPE (or SSC), 1% or 0.5% SDS, 1 × Denhardts solution is used, and the hybridization temperatures between 35 ° C and 70 ° C, preferably at 65 ° C. After hybridization, washing is preferably carried out first with 2 × SSC, 1% SDS and then with 0.2 × / 0.1 × SSC at temperatures between 35 ° C. and 70 ° C., preferably at 65 ° C. (to define SSPE, For SSC and Denhardts solution, see Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)).

Der Begriff ”Sequenzhomologie” oder ”Sequenzidentiät” bezeichnet den Anteil der zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen übereinstimmenden Basen oder den Anteil der zwischen zwei Aminosäuresequenzen übereinstimmenden Aminosäuren. Wenn die Sequenzhomologie als Prozentsatz ausgedrückt wird, z. B. 90%, bezeichnet der Prozentsatz den Anteil der Übereinstimmungen über die Länge der Sequenz, die mit einer anderen Sequenz verglichen wird.The term "sequence homology" or "sequence identity" denotes the proportion of the bases that match two nucleic acid sequences or the proportion of the amino acids that match two amino acid sequences. If the sequence homology is expressed as a percentage, e.g. 90%, the percentage refers to the proportion of matches over the length of the sequence compared to another sequence.

Vorliegend ist bevorzugt, wenn die Substanzen, also bspw. lösliches NKp65 oder lösliches CLEC2A rekombinant hergestellt werden. Hier kann es ausreichend sein, nur die für die Bindung relevante Domäne zu exprimieren, und nicht das Peptid mit der vollen Länge. Geeignete Zelllinien für die Expression sind bspw. Insektenzelllinien, wie bspw. Sf9 oder eukaryontische Zelllinien, wie bspw. 293T oder COS7.In the present case, preference is given to producing the substances, that is to say, for example, soluble NKp65 or soluble CLEC2A recombinantly. Here it may be sufficient to express only the domain relevant for the binding and not the full length peptide. Suitable cell lines for expression are, for example, insect cell lines, such as, for example, Sf9 or eukaryotic cell lines, such as, for example, 293T or COS7.

Daher werden in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung lösliche Ektodomänen von CLEC2A und NKp65 eingesetzt, vorzugsweise Tetramere der NKp65- oder CLEC2A-Ektodomänen.Therefore, in a preferred embodiment of the invention, soluble ectodomains of CLEC2A and NKp65 are used, preferably tetramers of the NKp65 or CLEC2A ectodomains.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Substanz eine Substanz enthält, die die Interaktion zwischen dem NKp65-Rezeptor und seinen Liganden, insbesondere CLEC2A, auf Hautzellen blockiert, sowie zumindest einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger.The present invention further relates to a pharmaceutical composition containing as active substance a substance which blocks the interaction between the NKp65 receptor and its ligands, in particular CLEC2A, on skin cells, and at least one pharmaceutically acceptable carrier.

„Pharmazeutisch akzeptierbarer Träger” bedeutet vorliegend ein nicht-toxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität der aktiven Substanz in der Zusammensetzung nicht beeinträchtigt.As used herein, "pharmaceutically acceptable carrier" means a non-toxic material that does not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active substance in the composition.

Insbesondere ist bevorzugt, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung als aktive Substanz eine Substanz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend anti-NKp65-Antikörper, anti-CLEC2A-Antikörper, insbesondere humanisierte anti-NKp65- und CLEC2A-Antikörper, lösliches NKp65, lösliches CLEC2A, oder funktionale Fragmente davon, sowie ggf. einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger.In particular, it is preferable that the pharmaceutical composition contains as active substance a substance selected from the group consisting of anti-NKp65 antibodies, anti-CLEC2A antibodies, especially humanized anti-NKp65 and CLEC2A antibodies, soluble NKp65, soluble CLEC2A , or functional fragments thereof, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.

Es versteht sich ferner, dass die pharmazeutische Zusammensetzung in einer weiteren Ausführungsform weitere therapeutisch und/oder pharmazeutisch aktive Substanzen enthält, die in Abhängigkeit der zu behandelnden Krankheit(en) zusätzlich in der pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht wird.It is further understood that in a further embodiment, the pharmaceutical composition contains further therapeutically and / or pharmaceutically active substances, which is additionally administered in the pharmaceutical composition depending on the disease (s) to be treated.

Die zu behandelnde Krankheit ist dabei vorzugsweise eine Krankheit des Menschen.The disease to be treated is preferably a human disease.

Die pharmazeutische Zusammensetzung kann systemisch verabreicht werden, d. h. bspw. oral, subkutan, intravenös, rektal, parenteral, intramuskulär, interperitoneal, transdermal, oder topisch, wobei die Verabreichungsart von der Art der Erkrankung dem Krankheitsbild, sowie der Zustand der Patienten abhängen wird. Ebenso kann die Verabreichung wiederholt oder einmalig stattfinden, wobei die Verabreichung im ersteren Fall einmal oder mehrmals am Tag, und/oder über einen längeren Zeitraum hinweg erfolgen kann.The pharmaceutical composition can be administered systemically, i. H. for example, orally, subcutaneously, intravenously, rectally, parenterally, intramuscularly, interperitoneally, transdermally, or topically, the mode of administration depending on the nature of the disease, the clinical picture, as well as the condition of the patients. Likewise, the administration can take place repeatedly or once, wherein the administration in the former case can take place once or several times a day, and / or over a longer period of time.

Zusätzlich zu den aktiven Substanzen kann die pharmazeutische Zusammensetzung auch noch Puffer, Verdünnungsmittel und/oder Additive enthalten. Geeignete Puffer schließen bspw. Tris-HCl, Glycin und Phosphat mit ein, und geeignete Verdünnungsmittel bspw. wässrige NaCl-Lösungen, Lactose oder Mannitol. Geeignete Additive schließen bspw. Detergentien, Lösungsmittel, Antioxidantien und Konservierungsstoffe mit ein. Eine Übersicht über solche zusätzlichen Inhaltsstoffe findet sich bspw. in A. Kibbe.: „Handbook of Pharmaceutical Excipients”, 3rd Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.In addition to the active substances, the pharmaceutical composition may also contain buffers, diluents and / or additives. Suitable buffers include, for example, Tris-HCl, glycine and phosphate, and suitable diluents, for example, aqueous NaCl solutions, lactose or mannitol. Suitable additives include, for example, detergents, solvents, antioxidants and preservatives. For an overview of such additional ingredients, see, for example, A. Kibbe: "Handbook of Pharmaceutical Excipients," 3rd ed., 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.

Wie bereits weiter oben erwähnt, betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren zur in vitro Modulation der Aktivität von Zellen, die NKp65 und/oder CLEC2A exprimieren, wobei die Zellen jeweils mit CLEC2A oder Fragmenten davon, und/oder mit NKp65 oder Fragmenten davon in Verbindung gebracht werden.As already mentioned above, the invention further relates to a method for in vitro modulation of the activity of cells expressing NKp65 and / or CLEC2A, which cells are each associated with CLEC2A or fragments thereof, and / or with NKp65 or fragments thereof become.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, die Interaktion zwischen Zellen, die NKp65 und/oder seine Liganden, insbesondere CLEC2A, exprimieren, zu beeinflussen. Da die Erfinder der vorliegenden Anmeldung NKp65 als Rezeptor von CLEC2A identifiziert haben, ist es möglich, den NKp65 Rezeptor durch Vermittlung der Bindung seines Liganden, insbesondere CLEC2A, oder durch einen NKp65-spezifischen Antikörper zu aktivieren, und dadurch die Freisetzung von Cytokinen zu stimulieren.With the method according to the invention it is possible to influence the interaction between cells which express NKp65 and / or its ligands, in particular CLEC2A. Since the present inventors have identified NKp65 as the receptor of CLEC2A, it is possible to activate the NKp65 receptor by mediating the binding of its ligand, particularly CLEC2A, or by an NKp65-specific antibody, thereby stimulating the release of cytokines.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die NKp65 und/oder CLEC2A exprimierenden Zellen mit zumindest einem der folgenden in Kontakt gebracht:

a) mit CLEC2A oder Fragmenten davon,
b) mit NKp65 oder Fragmenten davon,
c) mit anti-NKp65-Antikörpern,
d) anti-CLEC2A-Antikörpern,
e) mit NKp65-exprimierenden und/oder
f) mit CLEC2A-exprimierenden Zellen.

In a preferred embodiment, the NKp65 and / or CLEC2A expressing cells are contacted with at least one of the following:

a) with CLEC2A or fragments thereof,
b) with NKp65 or fragments thereof,
c) with anti-NKp65 antibodies,
d) anti-CLEC2A antibodies,
e) with NKp65-expressing and / or
f) with CLEC2A-expressing cells.

Dabei werden in einer bevorzugten Ausführungsform die NKp65 exprimierenden Zellen mit zumindest einem der folgenden in Kontakt gebracht:

a) CLEC2A, insbesondere mit der SEQ ID Nr. 3,
b) einem Fragment von CLEC2A, insbesondere mit der der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 von den Aminosäuren Ala 47 bis Leu 174 (Ektodomäne CLEC2A).
c) Fragmenten der Sequenzen gemäß a) oder b), die die biologische Aktivität des Peptids gemäß a) oder b) in einem Test betreffend die Bindung von NKp65 betreffen,
d) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, welche die Fähigkeit besitzt, unter stringenten Bedingungen mit der Nukleotidsequenz mit der SEQ ID Nr. 4 von Nukleotid 139 bis Nukleotid 522 zu hybridisieren, und
e) Fragmenten mit einer Sequenz, die mindestens zu 80%, vorzugsweise mindestens zu zwischen 80% und 99%, insbesondere zu 85%, 90%, 95%, identisch ist mit einer der in a) bis d) aufgeführten Sequenzen.

In a preferred embodiment, the NKp65 expressing cells are contacted with at least one of the following:

a) CLEC2A, in particular with SEQ ID No. 3,
b) a fragment of CLEC2A, in particular that of the amino acid sequence according to SEQ ID No. 3 from the amino acids Ala 47 to Leu 174 (ectodomain CLEC2A).
c) fragments of the sequences according to a) or b) which relate to the biological activity of the peptide according to a) or b) in a test relating to the binding of NKp65,
d) an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having the ability to hybridize under stringent conditions to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 from nucleotide 139 to nucleotide 522, and
e) fragments having a sequence which is at least 80%, preferably at least 80% to 99%, in particular 85%, 90%, 95%, identical to one of the sequences listed in a) to d).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden die CLEC2A exprimierenden Zellen mit zumindest einem der folgenden in Kontakt gebracht werden:

a) NKp65, insbesondere mit der SEQ ID Nr. 1,
b) einem Fragment von NKp65, insbesondere mit der der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 von den Aminosäuren Asp 52 bis Val 207.
c) Fragmenten der Sequenzen gemäß a) oder b), die die biologische Aktivität des Peptids gemäß a) oder b) in einem Test betreffend die Bindung von CLEC2A betreffen,
d) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, welche die Fähigkeit besitzt, unter stringenten Bedingungen mit der Nukleotidsequenz mit der SEQ ID Nr. 2 von Nukleotid 154 bis Nukleotid 621 zu hybridisieren, und
e) Fragmenten mit einer Sequenz, die mindestens zu 80%, vorzugsweise mindestens zu zwischen 80% und 99%, insbesondere zu 85%, 90%, 95%, identisch ist mit einer der in a) bis d) aufgeführten Sequenzen.

In a further preferred embodiment of the method, the cells expressing CLEC2A are contacted with at least one of the following:

a) NKp65, in particular with SEQ ID No. 1,
b) a fragment of NKp65, in particular with the amino acid sequence according to SEQ ID No. 1 of the amino acids Asp 52 to Val 207th
c) fragments of the sequences according to a) or b) which relate to the biological activity of the peptide according to a) or b) in a test concerning the binding of CLEC2A,
d) an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence which has the ability to hybridize under stringent conditions to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 from nucleotide 154 to nucleotide 621, and
e) fragments having a sequence which is at least 80%, preferably at least 80% to 99%, in particular 85%, 90%, 95%, identical to one of the sequences listed in a) to d).

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Screenen von Substanzen, die für die Behandlung und/oder Prävention von Hautkrankheiten geeignet sind, wobei bei dem Verfahren die Substanzen hinsichtlich ihrer Eigenschaft zur Blockierung der Interaktion zwischen NKp65 und CLEC2A oder Fragmenten davon ausgewählt werden.The invention further relates to a method for screening substances which are suitable for the treatment and / or prevention of skin diseases, wherein in the method the substances are selected for their property for blocking the interaction between NKp65 and CLEC2A or fragments thereof.

Dabei versteht sich der Ausdruck „Blockierung der Interaktion zwischen” dahingehend, dass die Substanzen hinsichtlich ihrer Fähigkeit gescreent werden, die Aktivierung von NKp65 exprimierenden Zellen durch CLEC2A oder CLEC2A exprimierende Zellen, die sich bspw. in einer Cytotoxizität oder Cytokinsekretion äußert, bspw. durch Bindung an NKp65 oder an CLEC2A zu inhibieren, und dadurch die aktivierende Interaktion zwischen den beiden Rezeptoren zu blockieren.The term "blocking of the interaction between" is understood to mean that the substances are screened for their ability to activate NKp65-expressing cells by cells expressing CLEC2A or CLEC2A, for example, by cytotoxicity or cytokine secretion, for example by binding at NKp65 or at CLEC2A, thereby blocking the activating interaction between the two receptors.

Beispiele für Substanzen, die auf diese Weise arbeiten, sind bspw. Antikörper, insbesondere anti-NKp65- oder anti-CLEC2A-Antikörper, oder Fragmente davon, vorzugsweise monoklonale Antikörper, und noch bevorzugter humanisierte Antikörper.Examples of substances that work in this way are, for example, antibodies, in particular anti-NKp65 or anti-CLEC2A antibodies, or fragments thereof, preferably monoclonal antibodies, and more preferably humanized antibodies.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird also das System aus NKp65 und CLEC2A bereitgestellt, bzw. funktionellen Fragmenten davon, und potentiell wirksame Substanzen werden daraufhin untersucht, ob sie die Bindung von CLEC2A an seinen Rezeptor blockieren können. Ferner kann mit dem neuen Verfahren getestet werden, ob die potentiell wirksamen Substanzen nicht nur die Bindung blockieren, sondern ob durch die Blockade der Bindung von CLEC2A und NKp65 auch eine Aktivierung von NK-Zellen unterbleibt.In the method according to the invention, therefore, the system of NKp65 and CLEC2A is provided, or functional fragments thereof, and potentially effective substances are examined to see if they can block the binding of CLEC2A to its receptor. Furthermore, it can be tested with the new method, whether the potentially active substances not only block the binding, but whether by blocking the binding of CLEC2A and NKp65 also fails to activate NK cells.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein – isoliertes oder synthetisches – Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

a) der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2,
b) der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 von Nukleotid 154 bis Nukleotid 621,
c) einer Nukleotidsequenz, die von der Sequenz der Nukleotidsequenz, die in a) oder b) spezifiziert ist, infolge der Degeneration des genetischen Codes abweicht; und
d) einer Nukleotidsequenz, die für ein Spezieshomolog der Sequenz SEQ ID Nr. 1 kodiert, wobei die Nukleotidsequenz für ein Peptid kodiert, welches die biologische Aktivität des NKp65 Peptids, wie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt, besitzt, und zwar in einem Test betreffend die Bindung und/oder Interaktion von CLEC2A und NKp65.

Furthermore, the present invention relates to a - isolated or synthetic - polynucleotide having a nucleotide sequence selected from the group consisting of:

a) the nucleotide sequence SEQ ID No. 2,
b) the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2 from nucleotide 154 to nucleotide 621,
c) a nucleotide sequence different from the sequence of the nucleotide sequence specified in a) or b) due to the degeneracy of the genetic code; and
d) a nucleotide sequence encoding a species homologue of the sequence SEQ ID NO: 1, wherein the nucleotide sequence encodes a peptide having the biological activity of the NKp65 peptide as shown in SEQ ID NO: 1, in a test concerning the binding and / or interaction of CLEC2A and NKp65.

Die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 von Nukleotid 154 bis Nukleotid 621 kodiert für die Ektodomäne von NKp65.The nucleotide sequence SEQ ID NO: 2 from nucleotide 154 to nucleotide 621 encodes the ectodomain of NKp65.

Damit schließt die vorliegende Erfindung auch allelische Varianten der unter SEQ ID Nr. 2 aufgeführten Nukleotidsequenzen mit ein, d. h. natürlich vorkommende alternative Formen des isolierten Polynukleotids mit der SEQ ID Nr. 2, die auch für NKp65 kodieren, insbesondere diejenigen Peptide, die eine biologische Aktivität von NKp65 aufweisen. Ebenfalls einbezogen sind isolierte Polynukleotide, die unter stringenten Bedingungen (z. B. 0,1 × SSC bei 65°C) mit der unter SEQ ID Nr. 2 aufgeführten Sequenz hybridisieren. Isolierte Polynukleotide, die für NKp65 kodieren, die sich aber infolge der Degeneration des genetischen Codes von der unter SEQ ID Nr. 2 aufgeführten Verbindung unterscheiden, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.Thus, the present invention also includes allelic variants of the nucleotide sequences listed under SEQ ID NO: 2, d. H. naturally occurring alternative forms of the isolated polynucleotide having SEQ ID NO: 2 which also encode NKp65, in particular those peptides having a biological activity of NKp65. Also included are isolated polynucleotides that hybridize under stringent conditions (eg, 0.1X SSC at 65 ° C) to the sequence listed under SEQ ID NO: 2. Isolated polynucleotides which code for NKp65, but which differ from the compound listed under SEQ ID No. 2 as a result of the degeneracy of the genetic code, are likewise provided by the present invention.

Die Erfindung betrifft ferner ein isoliertes, synthetisches oder rekombinantes Peptid, das die Sequenz SEQ ID Nr. 1 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll aufweist, oder ein Homolog oder ein Fragment davon.The invention further relates to an isolated, synthetic or recombinant peptide having the sequence SEQ ID NO: 1 from the attached sequence listing, or a homologue or a fragment thereof.

Die Erfindung betrifft ferner ein synthetisches, isoliertes oder rekombinantes Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1,
b) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 von den Aminosäuren Asp 52 bis Val 207,
c) Fragmenten der Sequenzen gemäß a) oder b), die die biologische Aktivität des Peptids gemäß a) oder b) in einem Test betreffend die Bindung von CLEC2A betreffen, und
d) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleotidsequenz kodiert wild, welche die Fähigkeit besitzt, unter stringenten Bedingungen mit der Nukleotidsequenz mit der SEQ ID Nr. 2 von Nukleotid 154 bis Nukleotid 621 zu hybridisieren
e) Fragmenten mit einer Sequenz, die mindestens zu 80%, vorzugsweise mindestens zu zwischen 80% und 99%, insbesondere zu 85%, 90%, 95%, identisch ist mit einer der in a) bis d) aufgeführten Sequenzen.

The invention further relates to a synthetic, isolated or recombinant peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

a) the amino acid sequence according to SEQ ID No. 1,
b) the amino acid sequence according to SEQ ID No. 1 from the amino acids Asp 52 to Val 207,
c) fragments of the sequences according to a) or b), which relate to the biological activity of the peptide according to a) or b) in a test concerning the binding of CLEC2A, and
d) an amino acid sequence encoding a nucleotide sequence which has the ability to hybridize under stringent conditions to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 from nucleotide 154 to nucleotide 621
e) fragments having a sequence which is at least 80%, preferably at least 80% to 99%, in particular 85%, 90%, 95%, identical to one of the sequences listed in a) to d).

Die Erfindung betrifft daher auch Zellen, die die Nukleotidsequenzen, die für das genannten Peptid kodieren, enthalten, vorzugsweise in einem Expressionsvektor, und in denen damit das Peptid exprimiert wird. Hierzu können die Polynukleotide mit geeigneten Expressionskontrollsequenzen funktionell verbunden werden, um das betreffende Peptid rekombinant herzustellen. Viele geeignete Expressionskontrollsequenzen sind im Stand der Technik bekannt. Allgemeine Verfahren zur Expression von rekombinanten Proteinen sind ebenfalls bekannt und beispielhaft von Kaufman in Methods in Enzymology (1990), 185:537-566 beschrieben.The invention therefore also relates to cells which contain the nucleotide sequences coding for said peptide, preferably in an expression vector, and in which the peptide is expressed therewith. For this purpose, the polynucleotides can be functionally linked to suitable expression control sequences in order to produce the relevant peptide recombinantly. Many suitable expression control sequences are known in the art. General methods for expression of recombinant proteins are also known and exemplified by Kaufman in Methods in Enzymology (1990), 185: 537-566.

Verschiedene Zelltypen können als Wirtszellen für die Expression der erfindungsgemäßen Proteine/Peptide dienen, beispielhaft werden hier geeignete Säugetierwirtszellen genannt, wie bspw. COS-Zellen von Affen, ovariale Zellen von Hamstern (CHO-Zellen), humane Nieren-293 Zellen, humane Epidermal-431-Zellen, humane Co-1o205-Zellen, CV-1-Zellen, andere transformierte Zelllinien von Primaten, aus in vitro Kulturen von primärem Gewebe oder primären Explantaten gewonnene Zelllinien, etc.Various cell types can serve as host cells for the expression of the proteins / peptides according to the invention, by way of example suitable mammalian host cells are mentioned, such as monkey COS cells, ovarian cells of hamsters (CHO cells), human kidney 293 cells, human epidermal 431 cells, human Co-1o205 cells, CV-1 cells, other transformed primate cell lines, cell lines derived from in vitro cultures of primary tissue or primary explants, etc.

Geeignet sind ferner auch Insektenexpressionssysteme. Hier werden die erfindungsgemäßen Polynukleotide mit Kontrollsequenzen in Insektenexpressionsvektoren verbunden. Diese Techniken sind im Stand der Technik ebenfalls bekannt. Alternativ können die Proteine/Peptide auch in niederen Eukaryonten, wie bspw. Hefe, oder in Prokaryonten, wie bspw. Bakterien, hergestellt werden. Beispielhaft werden hier Saccharomyces ssp. sowie Escherichia coli genannt, die heterologe Proteine exprimieren können.Also suitable are insect expression systems. Here, the polynucleotides of the invention are linked to control sequences in insect expression vectors. These techniques are also known in the art. Alternatively, the proteins / peptides may also be produced in lower eukaryotes, such as yeast, or in prokaryotes, such as bacteria. By way of example, Saccharomyces ssp. and Escherichia coli, which can express heterologous proteins.

Zur Isolierung der in den beispielhaft aufgeführten Zellen exprimierten Proteine, werden die entsprechend transformierten Zellen unter geeigneten Bedingungen kultiviert, um das Protein/Peptid zur Expression zu bringen. Anschließend kann das Protein aus Kulturüberständen oder aus Zellextrakten isoliert und mit im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt werden.To isolate the proteins expressed in the exemplified cells, the appropriately transformed cells are cultured under suitable conditions to bring the protein / peptide to expression. Subsequently, the protein can be isolated from culture supernatants or from cell extracts and purified by methods known in the art.

Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein solches Peptid sowie ggf. einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger aufweist. The invention further relates to a pharmaceutical composition comprising such a peptide and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch ein wie oben definiertes isoliertes, synthetisches oder rekombinantes Peptid zur Verwendung in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, insbesondere einer Krankheit, die auf eine Interaktion des Rezeptors NKp65 mit seinem Liganden CLEC2A zurückzuführen ist.Moreover, the invention also relates to an isolated, synthetic or recombinant peptide as defined above for use in the manufacture of a medicament for the treatment of a disease, in particular a disease resulting from an interaction of the receptor NKp65 with its ligand CLEC2A.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird dabei das Peptid zur Verwendung in der Behandlung von entzündlichen oder autoimmunen Krankheiten, insbesondere der Haut, eingesetzt.In a preferred embodiment, the peptide is used for the treatment of inflammatory or autoimmune diseases, in particular of the skin.

Mit den Ergebnissen und Erkenntnissen der vorliegenden Erfindung ist es nun möglich, selektiv die Interaktion zwischen NKp65 und CLEC2A zu blockieren, und dadurch die durch NKp65-CLEC2A Interaktion stimulierte Cytotoxizität und Cytokinsekretion von NK Zellen und anderen NKp65 exprimierenden Zellen gegenüber CLEC2A exprimierenden Zellen zu inhibieren, wobei diese Erkenntnis bei der Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten der Haut, insbesondere Autoimmunkrankheiten der Haut, mit der vorliegenden Anmeldung umgesetzt wird.With the results and findings of the present invention, it is now possible to selectively block the interaction between NKp65 and CLEC2A and thereby inhibit NKp65-CLEC2A interaction-stimulated cytotoxicity and cytokine secretion of NK cells and other NKp65 expressing cells to CLEC2A expressing cells, wherein this finding is implemented in the treatment and / or prevention of diseases of the skin, in particular autoimmune diseases of the skin, with the present application.

Es versteht sich, dass die oben genannten und nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendet werden können, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It is understood that the features mentioned above and below can be used not only in the combination given, but also in other combinations or in isolation, without departing from the scope of the present invention.

Beschreibung bevorzugter AusführungsformenDescription of preferred embodiments

Kurze Beschreibung der FigurenBrief description of the figures

Weitere Vorteile ergeben sich aus der beigefügten Beschreibung der Beispiele sowie den beigefügten Figuren. Es zeigen:Further advantages will become apparent from the accompanying description of the examples and the accompanying figures. Show it:

1 CLEC2A ist ein homodimerer Zelloberflächenrezeptor A) Lysate von COS7-Zellen, die mit myc-getaggter CLEC2A1- und FLAG-getaggter AICL cDNA transfiziert wurden, wurden mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen aufgetrennt, und durch Immunoblots mit anti-c-myc und anti-FLAG mAb analysiert. B) Lysate von CLEC2A1-transfizierten COS7-Zellen, analysiert durch Immunoblot mit anti-Histidin-Tag-Antikörpern. C) Coomassie-Färbung von aufgereinigtem rCLEC2A1 (rekombinant hergestellte CLEC2A-Ektodomäne) nach der SDS-PAGE. D) Größenbeurteilung von rCLEC2A1 und rAICL durch Gelfiltration im Vergleich zu BSA (66 kDa), rNKG2D (41 kDa) und Chymotrypsinogen (25 kDa). E) P815-CLEC2A (durchgehende Linie) und P815-HTR (gepunktete Linie), gefärbt mit anti-c-myc mAb. F) COS7, transient transfiziert mit CLEC2A-pIRES-DsRed und 293T-CLEC2A gefärbt mit CLEC2A-spezifischem mAb OMA1 (durchgehende Linie). OMA1 färbt keine AICL-transfizierten Zellen oder 293T-AICL. G) Zelloberflächenexpression von CLEC2A auf Zelllinien, detektiert mit OMA1 (durchgehende Linie). Eine Vorbehandlung von OMA1 mit rCLEC2A verhindert die Färbung (gepunktet). H) Färbungen der Monocyten ex vivo mit OMA1 (durchgehende Linie) lässt keine CLEC2A-Expression erkennen. OMA1 nach Vorinkubation mit rCLEC2A (gepunktet). 1 CLEC2A is a Homodimeric Cell Surface Receptor A) Lysates of COS7 cells transfected with myc-tagged CLEC2A1 and FLAG-tagged AICL cDNA were resolved by SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions, and immunoblots with anti-c -myc and anti-FLAG mAb analyzed. B) Lysates of CLEC2A1 transfected COS7 cells analyzed by immunoblot with anti-histidine tag antibodies. C) Coomassie staining of purified rCLEC2A1 (recombinantly produced CLEC2A ectodomain) after SDS-PAGE. D) Size evaluation of rCLEC2A1 and rAICL by gel filtration compared to BSA (66 kDa), rNKG2D (41 kDa) and chymotrypsinogen (25 kDa). E) P815-CLEC2A (solid line) and P815-HTR (dotted line) stained with anti-c-myc mAb. F) COS7, transiently transfected with CLEC2A-pIRES-DsRed and 293T-CLEC2A stained with CLEC2A-specific mAb OMA1 (solid line). OMA1 does not stain AICL-transfected cells or 293T-AICL. G) Cell surface expression of CLEC2A on cell lines detected with OMA1 (solid line). Pre-treatment of OMA1 with rCLEC2A prevents staining (dotted). H) Monocyte staining ex vivo with OMA1 (solid line) reveals no CLEC2A expression. OMA1 after preincubation with rCLEC2A (dotted).

2 CLEC2A stimuliert NK Effektor-Funktionen A) Degranulierung von ruhenden oder aktivierten NK Zellen, die mit CLEC2A-, AICL, oder mock-transfizierten COS7-Zellen kokultiviert wurden. Die Prozentsätze von CD107a⁺ NK Zellen (CD56⁺) sind in den jeweiligen Dot plots dargestellt. B) Lyse von 293T-neo oder 293T-CLEC2A durch frisch isolierte NK Zellen, bestimmt mittels eines Chromfreisetzungs-experiments C) Intrazelluläre Färbung von IFNγ oder TNF, produziert in aktivierten NK Zellen, die mit CLEC2A-, AICL-, ULBP2- oder mock-transfizierten COS7-Zellen jeweils kokultiviert wurden. Angegeben sind die Prozentsätze von IFNγ oder TNF⁺ NK Zellen (CD56⁺). D) Oberflächenexpression von NKp80 oder NKR-P1A auf frisch isolierten NK Zellen nach einer Kokultivierung über Nacht mit 293T-neo (ausgefülltes Histogramm), 293T-CLEC2A (durchgehende Linie), 293T-AICL (gepunktete Linie). E) Bindung von rNKp80 oder rNKG2D Tetrameren an COS7-Zellen, die transient entweder mit AICL cDNA (gepunktete Linie), mit CLEC2A1 cDNA (durchgehende Linie) oder mit einem Kontrollvektor transfiziert waren. 2 CLEC2A stimulates NK effector functions A) Degranulation of quiescent or activated NK cells cocultured with CLEC2A, AICL, or mock-transfected COS7 cells. The percentages of CD107a ⁺ NK cells (CD56 ⁺ ) are shown in the respective dot plots. B) Lysis of 293T-neo or 293T-CLEC2A by freshly isolated NK cells as determined by a chromium release experiment. C) Intracellular staining of IFNγ or TNF produced in activated NK cells treated with CLEC2A, AICL, ULBP2 or mock transfected COS7 cells were co-cultivated, respectively. Indicated are the percentages of IFNγ or TNF ⁺ NK cells (CD56 ⁺ ). D) Surface expression of NKp80 or NKR-P1A on freshly isolated NK cells after cocultivation overnight with 293T-neo (solid histogram), 293T-CLEC2A (solid line), 293T-AICL (dotted line). E) binding of rNKp80 or rNKG2D tetramers to COS7 cells transiently transfected with either AICL cDNA (dotted line), CLEC2A1 cDNA (solid line), or a control vector.

3 NKp65 ist der Rezeptor für CLEC2A COS7-Zellen wurden transient mit full-length CLEC2A cDNA (A, B) oder mit full-length NKp65 (bicistronisch mit EGFP markiert) (C) transfiziert. A) lösliches NKp65 bindet an CLEC2A auf COS7-Zellen. Der Nachweis der Oberflächenexpression von CLEC2A erfolgt mit den CLEC2A-spezifischen mAb OMA1 und OMA2. Eine vergleichbare Bindung wurde mit der löslichen Ektodomäne von NKp65 gezeigt (rekombinant produziert in 293T-Zellen). Die Anfärbung von löslichem His-tag markiertem NKp65 (sNKp65) erfolgte über biotinylierte His-Tag-Antikörper und Streptavidin-APC. Schattiert sind die Bindungen an Kontroll-transfizierte COS7-Zellen. B) Die Vorinkubation mit OMA2, blockiert die Bindung von löslichem NKp65 (durchgehende Linie). Das ausgefüllte Histogramm zeigt die sNKp65 Bindung ohne OMA2-Blockade aus A). C) links: NKp65-pIRES-EGFP transfizierte (durchgehende Linie), nicht aber kontroll-transfizierte (ausgefülltes Histogramm) COS7-Zellen fluoreszieren grün; mitte, links: lösliches CLEC2A1, nicht aber lösliches CLEC2A2, bindet an COS7-Zellen, die mit NKp65 transfiziert sind (durchgehende Linien). Die Bindung an Kontroll-transfizierte COS7-Zellen sind als ausgefüllte Histogramme wiedergegeben. 3 NKp65 is the receptor for CLEC2A COS7 cells were transiently transfected with full-length CLEC2A cDNA (A, B) or with full-length NKp65 (bicistronically labeled with EGFP) (C). A) soluble NKp65 binds to CLEC2A on COS7 cells. The surface expression of CLEC2A is detected with the CLEC2A-specific mAbs OMA1 and OMA2. A comparable binding was demonstrated with the soluble ectodomain of NKp65 (produced recombinantly in 293T cells). Staining of soluble His tag labeled NKp65 (sNKp65) was carried out via biotinylated His-tag antibodies and streptavidin-APC. Shaded are the bonds to control-transfected COS7 cells. B) Pre-incubation with OMA2 blocks the binding of soluble NKp65 (solid line). The filled histogram shows the sNKp65 binding without OMA2 blockade from A). C) left: NKp65-pIRES-EGFP transfected (solid line), but not control-transfected (filled histogram) COS7 cells fluoresce green; middle, left: soluble CLEC2A1, but not soluble CLEC2A2, binds to COS7 cells transfected with NKp65 (solid lines). Binding to control-transfected COS7 cells are shown as solid histograms.

4 Die Blockade der NKp65-vermittelten Zytotoxizität durch Zugabe von löslichem CLEC2A. 4 The blockade of NKp65-mediated cytotoxicity by addition of soluble CLEC2A.

Zelluläre Cytotoxizität von frisch isolierten, menschlichen NK Zellen gegenüber Kontroll-transfizierten (293T-neo) und CLEC2A-transfizierten (293T-CLEC2A) Zellen der humanen embryonalen Nierenzelllinie 293T. Die Zelllyse der 293T Zellen wurde nach 4-stündiger Koinkubation von NK Zellen (Effektorzellen) und 293T Zellen (Targetzellen) in unterschiedlichen Anteilen (E:T Verhältnis) in einem Chromfreisetzungsexperiment bestimmt. Durch Zugabe von rekombinant hergestelltem, löslichem CLEC2A (10 μg/ml) (Ansatz 293T-CLEC2A + sCLEC2A) wurde die erhöhte Zelllyse von 293T-CLEC2A Zellen auf das Niveau der Zelllyse von 293T-neo Zellen vermindert.Cellular cytotoxicity of freshly isolated human NK cells over control transfected (293T-neo) and CLEC2A-transfected (293T-CLEC2A) cells of human embryonic kidney cell line 293T. The cell lysis of the 293T cells was determined after 4 hours of co-incubation of NK cells (effector cells) and 293T cells (target cells) in different proportions (E: T ratio) in a chromium release experiment. By adding recombinantly produced soluble CLEC2A (10 μg / ml) (293T-CLEC2A + sCLEC2A approach), the increased cell lysis of 293T-CLEC2A cells was reduced to the level of cell lysis of 293T-neo cells.

5 A) Aminosäuresequenz von NKp65 mit Angabe der unterschiedlichen Domänen (SEQ ID Nr. 1). B) Nukleotidsequenz, die für NKp65 kodiert (SEQ ID NR. 2). C) Aminosäuresequenz von CLEC2A mit Angabe der unterschiedlichen Domänen (SEQ ID Nr. 3). D) Nukleotidsequenz, die für CLEC2A kodiert (SEQ ID Nr. 4). 5 A) Amino acid sequence of NKp65 indicating the different domains (SEQ ID NO: 1). B) Nucleotide sequence encoding NKp65 (SEQ ID NO: 2). C) Amino acid sequence of CLEC2A with indication of the different domains (SEQ ID No. 3). D) Nucleotide sequence encoding CLEC2A (SEQ ID NO: 4).

BeispieleExamples

Material und Methodenmaterial and methods

Zellen und zelluläre AssaysCells and cellular assays

PBMC wurden durch Ficoll Dichtegradienten-Zentrifugation aus venösem Blut gesunder Spender isoliert. NK Zellen wurden durch eine negative Selektion unter Verwendung eines NK Zellen Isolierungs-Kits (Miltenyi, Deutschland) gereinigt. Gereinigte NK Zellen wurden über Nacht mit mock-, CLEC2A-, AICL- oder ULBP2-transfizierten COS7-Zellen in Gegenwart (aktivierte NK-Zellen) oder Abwesenheit (ruhende NK-Zellen) von IL-2 (100 U/ml) kokultiviert, und anschließend hinsichtlich der Oberflächenexpression von CD107a oder des intrazellulären IFNγ oder TNF analysiert. Frisch gereinigte NK Zellen wurden in einem standardisierten Chromium-Freisetzungs-Assay über 4 Stunden hinsichtlich der Cytotoxizität gegenüber 293T-Transfektanten untersucht.PBMC were isolated by Ficoll density gradient centrifugation from venous blood of healthy donors. NK cells were purified by negative selection using an NK cell isolation kit (Miltenyi, Germany). Purified NK cells were cocultured overnight with mock, CLEC2A, AICL or ULBP2 transfected COS7 cells in the presence (activated NK cells) or absence (quiescent NK cells) of IL-2 (100 U / ml), and subsequently analyzed for surface expression of CD107a or intracellular IFNγ or TNF. Freshly purified NK cells were assayed for cytotoxicity to 293T transfectants for 4 hours in a standard chromium release assay.

Antikörper und rekombinante ProteineAntibodies and recombinant proteins

CLEC2A-spezifische mAb OMA1 (IgG2a) und OMA2 (IgA) wurden durch Immunisierung von BALG/c Mäusen mit P815-CLEC2A unter Einsatz von Standard-Verfahren gewonnen. Hybridom-Überstände wurden hinsichtlich einer Bindung an 293T-CLEC2A im Vergleich zu nicht-transfizierten 293T-Zellen gescreent. Die lösliche CLEC2A-Ektodomäne (rCLEC2A; Ile 47 bis Leu 117) mit einem aminoterminalen BirA-tag und carboxyterminalen His- und c-myc-Tags wurden aus Überständen transfizierter 293T Zellen gereinigt.CLEC2A-specific mAbs OMA1 (IgG2a) and OMA2 (IgA) were obtained by immunization of BALG / c mice with P815-CLEC2A using standard procedures. Hybridoma supernatants were screened for binding to 293T-CLEC2A compared to untransfected 293T cells. The soluble CLEC2A ectodomain (rCLEC2A; Ile 47 to Leu 117) with an amino-terminal BirA tag and carboxy-terminal His and c-myc tags were purified from supernatants of transfected 293T cells.

Lösliche NKG2D-Ektodomänen (rNKG2D) wurden in E. coli produziert. rNKp80 und rNKG2D Tetramere wurden wie zuvor beschrieben generiert. Lösliche Ektodomänen anderer aktivierender NK Rezeptoren wurden von R & D Systems käuflich erworben.Soluble NKG2D ectodomains (rNKG2D) were produced in E. coli. rNKp80 and rNKG2D tetramers were generated as previously described. Soluble ectodomains of other activating NK receptors were purchased from R & D Systems.

Immunoblotimmunoblot

Zelllysate von transfizierten COS7-Zellen wurden durch 15% SDS-PAGE fraktioniert, und auf Nitrocellulose-Membranen (Amersham) überführt. Die Membranen wurden mit anti-Histidin Antikörpern (Bethyl Laboratories) oder anti-myc mAb und anti-FLAG mAb (Sigma) inkubiert und mit Meerrettich-Peroxidase konjugierten sekundären Antikörpern detektiert.Cell lysates from transfected COS7 cells were fractionated by 15% SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membranes (Amersham). The membranes were incubated with anti-histidine antibodies (Bethyl Laboratories) or anti-myc mAb and anti-FLAG mAb (Sigma) and detected with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies.

ErgebnisseResults

1A ist zu entnehmen, dass in Lysaten transfizierter COS7-Zellen CLEC2A mit einem Molekulargewicht von ca. 32 kDa unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen detektiert werden konnte. Im Gegensatz dazu erschien AICL als Monomer (ca. 28 kDa) unter reduzierenden Bedingungen und als Dimer (ca. 55 kDa) unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Die Entfernung von N-gekoppelten Zuckern reduzierte das Molekulargewicht von CLEC2A auf ca. 20 kDa (1B). Die Ektodomäne von CLEC2A (rCLEC2A) wurde in 293T Zellen produziert und mittels Affinitätschromatographie aus den Überständen gereinigt. Bei der Gelfiltration eluierten rCLEC2A und rAICL bei einem ähnlichen Volumen, und früher als rNKG2D Homodimere (1D). 1A It can be deduced that in lysates of transfected COS7 cells CLEC2A with a molecular weight of about 32 kDa could be detected under reducing and non-reducing conditions. In contrast, AICL appeared as a monomer (about 28 kDa) under reducing conditions and as a dimer (about 55 kDa) under non-reducing conditions. The removal of N-linked sugars reduced the molecular weight of CLEC2A to about 20 kDa ( 1B ). The ectodomain of CLEC2A (rCLEC2A) was produced in 293T cells and purified from the supernatants by affinity chromatography. In gel filtration, rCLEC2A and rAICL eluted at a similar volume, and earlier than rNKG2D homodimers ( 1D ).

Zur näheren Untersuchung von CLEC2A wurden durch Immunisierung von Mäusen mit P815-CLEC2A CLEC2A-spezifische mAb generiert (1E). Der Antikörper OMA1 färbte 293T-Zellen, die stabil mit getaggter CLEC2A cDNA transifziert waren, ebenso wie COS7-Zellen, die transient mit einem tag-freien CLEC2A-pIRES-dsRed-Konstrukt transfiziert waren, jedoch nicht die Kontrollen (siehe 1F).To further investigate CLEC2A, CLEC2A-specific mAbs were generated by immunizing mice with P815-CLEC2A ( 1E ). The antibody OMA1 stained 293T cells stably transfected with tagged CLEC2A cDNA, as well as COS7 cells transiently transfected with a day-free CLEC2A pIRES-dsRed construct, but not the controls (see 1F ).

Im Weiteren wurde eine Reihe von Zelllinien auf die Expression von CLEC2A untersucht. Dabei zeigte sich, dass auf den myeloiden Zelllinien U937 und AML01 eine Oberflächen-expression zu beobachten war, jedoch nicht auf anderen untersuchten hämatopoietischen Zelllinien (1G und Daten nicht gezeigt).Furthermore, a number of cell lines were examined for the expression of CLEC2A. It was found that surface expression could be observed on the myeloid cell lines U937 and AML01, but not on other hematopoietic cell lines investigated ( 1G and data not shown).

Um die Rolle bei CLEC2A bei Immunantworten zu untersuchen, wurden gereinigte NK-Zellen mit Kontroll-, CLEC2A- und AICL-transfizierten COS7-Zellen kokultiviert, und anschließend auf die Freisetzung von cytotoxischen Granulae mittels CD107a Oberflächenexpression untersucht. Eine ektopische Expression von CLEC2A auf COS7-Zellen resultierte in einer stark erhöhten Degranulierung von NK Zellen im Vergleich zu Kontroll-transfizierten Zellen (2A). Eine erhöhte Degranulierung als Antwort auf CLEC2A korrespondierte mit einer verstärkten Cytolyse von CLEC2A-exprimierenden 293T-Zellen durch menschliche NK Zellen (2B). Die ektopische Expression von CLEC2A auf COS7-Zellen erhöhte auch den Anteil von NK Zellen, die IFNγ und TNF sezernieren (2C). Auch hier waren wiederum die NK-Zell-Antworten, die durch CLEC2A stimuliert wurden, vergleichbar mit denjenigen, die durch die ektopische Expression von AICL oder ULBP2 (2C) induziert wurden.To investigate the role of CLEC2A in immune responses, purified NK cells were co-cultivated with control, CLEC2A and AICL-transfected COS7 cells, and then assayed for release of cytotoxic granules by CD107a surface expression. Ectopic expression of CLEC2A on COS7 cells resulted in greatly increased degranulation of NK cells as compared to control transfected cells (Fig. 2A ). Increased degranulation in response to CLEC2A corresponded to increased cytolysis of CLEC2A-expressing 293T cells by human NK cells (Fig. 2 B ). Ectopic expression of CLEC2A on COS7 cells also increased the proportion of NK cells secreting IFNγ and TNF ( 2C ). Once again, the NK cell responses stimulated by CLEC2A were comparable to those obtained by the ectopic expression of AICL or ULBP2 (FIG. 2C ) were induced.

Zusammenfassend konnte daher gezeigt werden, dass CLEC2A ein nicht-disulfidbrücken-gekoppelter, homodimerer C-Typ lektin-ähnlicher Rezeptor ist, der auf der Oberfläche z. B. der myeloiden Zelllinien U937 und AML01 exprimiert wird, jedoch nicht auf Monozyten oder peripheren Blutlymphozyten. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass die ektopische Expression von CLEC2A die Cytotoxizität und die Cytokin-Sekretion von frisch isolierten menschlichen NK-Zellen stark stimuliert.In summary, it could therefore be shown that CLEC2A is a non-disulfide bridge-coupled, homodimeric C-type lectin-like receptor, which on the surface z. Myeloid cell lines U937 and AML01, but not on monocytes or peripheral blood lymphocytes. In particular, it has been shown that ectopic expression of CLEC2A strongly stimulates the cytotoxicity and cytokine secretion of freshly isolated human NK cells.

In weiteren Versuchen wurde versucht, den Rezeptor von CLEC2A unter den bereits identifizierten NK-Rezeptoren zu identifizieren. Hierfür wurde in Kokultivierungs-Versuchen gezeigt, dass AICL-transfizierte, jedoch nicht CLEC2A-transfizierte 293T-Zellen NKp80 auf frisch isolierten NK Zellen herunter regulierten (2D). Auch färbten NKp80-Tetramere lediglich AICL-, jedoch nicht CLEC2A-transfizierte COS7-Zellen (2E). NKG2D-Tetramere zeigten keine erhöhte Bindung an AICL- oder CLEC2A-transfizierte Zellen (2E). Ebenso zeigten Versuche mit den löslichen, kommerziell erworbenen Ektodomänen der aktivierenden NK Rezeptoren NKp46, NKp44, NKp30, DNAM-1, und 2B4 keine Bindung an CLEC2A-transfizierte Zellen. Eine 293T-CLEC2A Kokultur beeinflusste auch nicht die Oberflächenexpression von NKR-P1A auf NK Zellen (2D). Daher scheiden die erwähnten, bereits bekannten aktivierenden NK Rezeptoren als CLEC2A-Rezeptoren aus.Further attempts were made to identify the receptor of CLEC2A among the already identified NK receptors. Co-culture experiments have shown that AICL-transfected, but not CLEC2A-transfected 293T cells downregulated NKp80 on freshly isolated NK cells ( 2D ). Also, NKp80 tetramers stained only AICL but not CLEC2A-transfected COS7 cells ( 2E ). NKG2D tetramers did not show increased binding to AICL or CLEC2A transfected cells ( 2E ). Similarly, experiments with the soluble, commercially-acquired ectodomains of activating NK receptors NKp46, NKp44, NKp30, DNAM-1, and 2B4 showed no binding to CLEC2A-transfected cells. A 293T-CLEC2A co-culture also did not affect the surface expression of NKR-P1A on NK cells ( 2D ). Therefore, the mentioned, already known activating NK receptors excrete as CLEC2A receptors.

In weiteren Versuchen haben nun die Erfinder gezeigt, dass der bislang noch nicht bekannte NKp65 der Rezeptor für CLEC2A ist. Hierzu wurden COS7-Zellen transient mit full-length CLEC2A cDNA (siehe 3, A, B) oder mit full-length NKp65 (bicistronisch mit EGFP markiert) (3, C) transfiziert.In further experiments, the inventors have now shown that the hitherto unknown NKp65 is the receptor for CLEC2A. For this, COS7 cells were transiently transfected with full-length CLEC2A cDNA (see 3 , A, B) or with full-length NKp65 (bicistronially labeled with EGFP) ( 3 , C) transfected.

3 ist zu entnehmen, dass lösliches NKp65 an CLEC2A auf COS7-Zellen bindet (siehe 3, A)). Der Nachweis der Oberflächenexpression von CLEC2A erfolgte mit dem CLEC2A-spezifischen mAb OMA1 und OMA2 (siehe weiter oben). Eine vergleichbare Bindung wurde mit der löslichen Ektodomäne von NKp65 gezeigt (rekombinant produziert in 293T-Zellen). Die Anfärbung von löslichem NKp65 (sNKp65) erfolgte über biotinylierte His-Tag-Antikörper und Streptavidin-APC. 3, B) zeigt, dass die Vorinkubation mit OMA2 die Bindung von löslichem NKp65 blockiert. 3, C) zeigt, dass lösliches CLEC2A1 an COS7-Zellen bindet, die mit NKp65 transfiziert sind. 3 it can be seen that soluble NKp65 binds to CLEC2A on COS7 cells (see 3 , A)). The surface expression of CLEC2A was detected with the CLEC2A-specific mAb OMA1 and OMA2 (see above). A comparable binding was demonstrated with the soluble ectodomain of NKp65 (produced recombinantly in 293T cells). Soluble NKp65 (sNKp65) was stained by biotinylated His-tag antibodies and streptavidin-APC. 3 , B) shows that preincubation with OMA2 blocks the binding of soluble NKp65. 3 , C) shows that soluble CLEC2A1 binds to COS7 cells transfected with NKp65.

In weiteren Versuchen wurde die Blockade der NKp65-vermittelten Cytotoxizität durch Zugabe von löslichem CLEC2A nachgewiesen. Hierzu untersuchten die Erfinder die zelluläre Zytotoxizität von frisch isolierten, menschlichen NK Zellen gegenüber Kontroll-transfizierten (293T-neo) und CLEC2A-transfizierten (293T-CLEC2A) Zellen der humanen embryonalen Nierenzelllinie 293T. Die Zelllyse der 293T Zellen wurde noch 4-stündiger Koinkubation von NK Zellen (Effektorzellen) und 293T Zellen (Targetzellen) in unterschiedlichen Anteilen (E:T Verhältnis) in einem Chromfreisetzungsexperiment bestimmt.In further experiments, the blockade of NKp65-mediated cytotoxicity was detected by the addition of soluble CLEC2A. For this purpose, the inventors investigated the cellular cytotoxicity of freshly isolated human NK cells against control-transfected (293T-neo) and CLEC2A-transfected (293T-CLEC2A) cells of the human embryonic kidney cell line 293T. The cell lysis of the 293T cells was still 4-hour co-incubation of NK cells (effector cells) and 293T cells (target cells) in different proportions (E: T ratio) determined in a chromium release experiment.

Durch Zugabe von rekombinant hergestelltem, löslichem CLEC2A (10 μg/ml) (Ansatz 293Z-CLEC2A + sCLEC2A) wurde die erhöhte Zelllyse von 293T-CLEC2A Zellen auf das Niveau der Zelllyse von 293T-neo Zellen vermindert (siehe 4).By adding recombinantly produced soluble CLEC2A (10 μg / ml) (293Z-CLEC2A + sCLEC2A approach), the increased cell lysis of 293T-CLEC2A cells was reduced to the level of cell lysis of 293T-neo cells (see 4 ).

Zusammenfassend konnten die Erfinder also anhand von Bindungsstudien mit löslichem CLEC2A (das an NKp65 transfizierte Zellen bindet) und mit löslichem NKp65 (das an CLEC2A transfizierte Zellen bindet) zeigen, dass NKp65 der aktivierende Rezeptor für CLEC2A ist und dass sich die NKp65 vermittelte Aktivierung von NK Zellen durch Zugabe von löslichem CLEC2A blockieren lässt. In summary, therefore, the inventors were able to demonstrate by binding studies with soluble CLEC2A (which binds to NKp65 transfected cells) and soluble NKp65 (which transfects cells transfected to CLEC2A) that NKp65 is the activating receptor for CLEC2A and that NKp65 mediated activation of NK Block cells by adding soluble CLEC2A.

SEQUENZ PROTOKOLL

SEQUENCE PROTOCOL

Claims

Use of a substance for blocking the NKp65 receptor for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of inflammatory and autoimmune diseases, in particular of the skin, wherein the substance is selected from the group comprising anti-NKp65 antibodies, anti-CLEC2A antibodies, soluble NKp65, soluble CLEC2A, or functional fragments thereof.

Use of a substance for blocking the interaction between NKp65 and its ligands for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of diseases, wherein the substance is selected from the group comprising anti-NKp65 antibodies, anti-CLEC2A antibodies, soluble NKp65, soluble CLEC2A, or functional fragments thereof.

Use according to claim 2, characterized in that the ligand is CLEC2A.

Use according to any one of claims 1 to 3, wherein the skin disease is selected from the group consisting of skin allergies, atopy, scleroderma, atopic dermatitis, psoriasis, acne, eczema, erythema, lupus erythematosus, collagenosis, pemphigus vulgaris.

Use according to one of claims 1 to 4, characterized in that a substance is selected which has an amino acid sequence which is selected from the group comprising a) SEQ ID No. 1, or b) SEQ ID No. 1, amino acids Asp 52 to Val 207 of the attached sequence listing. c) fragments of the sequences according to a) or b) which relate to the biological activity of the peptide according to a) or b) in a test for the binding of CLEC2A, d) an amino acid sequence which is encoded by a nucleotide sequence which has the ability to hybridize under stringent conditions with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 from nucleotide 154 to nucleotide 621, and e) fragments having a sequence which is at least 80%, preferably at least 80% to 99%, identical to one of the sequences listed in a) to d).

Use according to claim 1, characterized in that the antibodies are humanized antibodies or fragments of humanized antibodies.

Use according to claim 1, characterized in that the anti-NKp65 antibody is produced by hybridoma cells obtained using the soluble NKp65 ectodomain or NKp65-expressing cells to immunize suitable animals.

Use according to claim 1, characterized in that the anti-CLEC2A antibody is produced by hybridoma cells obtained using the soluble CLEC2A ectodomain or CLEC2A expressing cells for the immunization of suitable animals.

Use according to claim 1, characterized in that the soluble ectodomain of NKp65 is used.

Use according to claim 1, characterized in that the soluble ectodomain of CLEC2A is used.

A pharmaceutical composition containing as active substance a substance which blocks the interaction between the NKp65 receptor and its ligands, which substance is selected from the group comprising anti-NKp65 antibodies, anti-CLEC2A antibodies, soluble NKp65, soluble CLEC2A , or functional fragments thereof, optionally in association with a pharmaceutically acceptable carrier.

A pharmaceutical composition containing as active substance a substance which blocks the interaction between the NKp65 receptor and CLEC2A on skin cells, optionally in association with a pharmaceutically acceptable carrier, the substance being selected from the group comprising anti-NKp65 antibodies, anti-CLEC2A antibody, soluble NKp65, soluble CLEC2A, or functional fragments thereof, optionally in association with a pharmaceutically acceptable carrier.

A pharmaceutical composition according to claim 12, characterized in that the anti-NKp65 antibody is a humanized anti-NKp65 antibody and the anti-CLEC2A antibody is a humanized anti-CLEC2A antibody.

Method for in vitro modulation of the activity of cells expressing NKp65 and / or CLEC2A, characterized in that the cells are each brought into contact with at least one of the following: a) with CLEC2A or fragments thereof, b) with NKp65 or fragments thereof, c) with anti-NKp65 antibodies, d) anti-CLEC2A antibodies, e) with NKp65-expressing and / or f) with CLEC2A-expressing cells.

A method according to claim 14, characterized in that the NKp65 expressing cells are contacted with at least one of the following: a) CLEC2A, in particular with SEQ ID No. 3, b) a fragment of CLEC2A, in particular that of the amino acid sequence according to SEQ ID No. 3 from the amino acids Ala 47 to Leu 174 (ectodomain CLEC2A). c) fragments of the sequences according to a) or b) which relate to the biological activity of the peptide according to a) or b) in a test relating to the binding of NKp65, d) an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having the ability to hybridize under stringent conditions to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 from nucleotide 139 to nucleotide 522, and e) fragments having a sequence which is at least 80%, preferably at least 80% to 99%, identical to one of the sequences listed in a) to d).

A method according to claim 14, characterized in that the CLEC2A expressing cells are contacted with at least one of the following: a) NKp65, in particular with SEQ ID No. 1, b) a fragment of NKp65, in particular with the amino acid sequence according to SEQ ID No. 1 of the amino acids Asp 52 to Val 207. c) fragments of the sequences according to a) or b ) concerning the biological activity of the peptide according to a) or b) in a test for the binding of CLEC2A, d) an amino acid sequence which is encoded by a nucleotide sequence which has the ability under stringent conditions with the nucleotide sequence with the SEQ ID No. 2 from nucleotide 154 to nucleotide 621, and e) fragments having a sequence which is at least 80%, preferably at least 80% to 99%, identical to any of the sequences listed in a) to d) ,

A method for screening substances suitable for the treatment and / or prevention of skin diseases, characterized in that the substances are selected for their property of blocking the interaction between NKp65 and CLEC2A or fragments thereof.

A synthetic, isolated or recombinant peptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of: a) the amino acid sequence according to SEQ ID No. 1, b) the amino acid sequence according to SEQ ID No. 1 from the amino acids Asp 52 to Val 207, c) fragments of the sequences according to a) or b), which relate to the biological activity of the peptide according to a) or b) in a test concerning the binding of CLEC2A, and d) an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence which has the ability to hybridize under stringent conditions to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 from nucleotide 154 to nucleotide 621 e) fragments having a sequence which is at least 80%, preferably at least 80% to 99%, identical to one of the sequences listed in a) to d).

A pharmaceutical composition comprising at least one peptide according to claim 18 and a pharmaceutically acceptable carrier.

A peptide according to claim 18 for use in the manufacture of a medicament for the treatment of a disease, in particular a disease resulting from an interaction of the receptor NKp65 with its ligand CLEC2A.

A peptide according to claim 20, for use in the manufacture of a medicament for the treatment of an inflammatory or autoimmune disease, especially of the skin.

An antibody that specifically reacts with a peptide according to claim 18.

Use of an antibody according to claim 22 for the treatment of an inflammatory or autoimmune skin disease.

An isolated, synthetic or recombinant polynucleotide for use in expressing a peptide according to claim 18 which consists of a nucleotide sequence selected from the group consisting of: a) the nucleotide sequence SEQ ID No. 2, b) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 from nucleotide 154 to 621; c) a nucleotide sequence different from the sequence of the nucleotide sequence specified in a) or b) due to the degeneracy of the genetic code; and d) a nucleotide sequence encoding a species homologue of the sequence SEQ ID NO: 1, wherein the nucleotide sequence encodes a peptide having the biological activity of the NKp65 peptide as shown in SEQ ID NO: 1, in a test concerning the binding and / or interaction of CLEC2A and NKp65.

Polynucleotide according to claim 24, characterized in that it is functionally linked to an expression control sequence.

A host cell transfected with a polynucleotide according to claim 25.