DE102008024526A1 - Arrangement for detecting estrogen in aqueous solution, has silicon-based light emitter on which bioactive layer is applied by cleaning, hybridizing and signaling - Google Patents

Arrangement for detecting estrogen in aqueous solution, has silicon-based light emitter on which bioactive layer is applied by cleaning, hybridizing and signaling Download PDF

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Abstract

The arrangement has a silicon-based light emitter on which a bioactive layer is applied by cleaning, hybridizing and signaling. The three phase cleaning takes place with an aqueous 1,1,1-trichloroethane solution, an acetone solution and a methanol solution. The hybridizing takes place with 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid hydrate-catalyze solution. The signaling takes place with N,N'-Bis(3-aminopropyl)-2-butene-1,4-diamine solution or (3-mercaptopropyl) trimethoxysilanesolution or N-Propyl trimethoxysilane solution. An independent claim is included for a method for detecting estrogen in aqueous solution.

Description

Die Bedeutung der Spurenanalytik nimmt sowohl in der Trinkwasserversorgung als auch in der Lebensmittelindustrie und bei der Diagnostik von Erkrankungen zu, wobei insbesondere die Trinkwasseranalyse im Mittelpunkt steht.The Importance of trace analysis increases both in the drinking water supply as well as in the food industry and in the diagnostics of Diseases, in particular the drinking water analysis in the center stands.

Zur Online-Überwachung der Wasserqualität wurde das RIANA-(RIver ANAlyzer) [ Rodriguez S, Reder S, Lopez de Alda M, Gauglitz G and Barceló D.: Biosens Bioelectron. (19) 633–640, 2004 .] und das AWACS-System (Automated Water Analyzer Computer supported System) [ Tschmelak J. et al.: Intern. J. Environ. Anal. Chem. (85) 837–852, 2005 ] entwickelt, die beide auf der Methode der totalen internen Reflexions-Fluoreszenz (TIRF) basieren. Dabei wird das Licht einer externen Laserdiode in einen Wellenleiter eingekoppelt, auf dessen Oberfläche ein farbstoffmarkierter Analyt immobilisiert ist. Das evaneszente Feld der den Wellenleiter durchlaufenden Lichtwelle kann den Farbstoff anregen, dessen Fluoreszenz durch ein Array von Fotodioden detektiert wird. Die Intensität dieser Fluoreszenz ist ein Maß für die Konzentration des Analyten. Diese Systeme weisen bereits einen hohen Automatisierungsgrad auf und können stationär zur Überwachung der Wasserqualität eingesetzt werden.For online monitoring of water quality, the RIANA (RIver ANAlyzer) [ Rodriguez S, Reder S, Lopez de Alda M, Gauglitz G and Barceló D .: Biosens Bioelectron. (19) 633-640, 2004 .] and the AWACS system (Automated Water Analyzer Computer Supported System) [ Tschmelak J. et al .: Intern. J. Environ. Anal. Chem. (85) 837-852, 2005 ], both of which are based on the method of total internal reflection fluorescence (TIRF). In this case, the light of an external laser diode is coupled into a waveguide, on the surface of which a dye-labeled analyte is immobilized. The evanescent field of the lightwave passing through the waveguide can excite the dye whose fluorescence is detected by an array of photodiodes. The intensity of this fluorescence is a measure of the concentration of the analyte. These systems already have a high degree of automation and can be used stationary for monitoring the water quality.

Östrogene sind hormonaktive Substanzen, die sich in vier Klassen einteilen lassen: die endogenen Östrogene, die Phytoestrogene, die synthetischen Östrogene (z. B. Ethinylestradiol, das in der „Pille” enthalten ist) und die Xenoestrogene. [ Proll G.: Biosensorsystem für vollständig automatisierte ultrasensitive Multianalyt-Immunoassays, Dissertation, Universität Tübingen, 2005 .]. Etablierte Nachweismethoden im Labormaßstab wie die Gas- und Flüssigkeitschromatographie, die mit einem nicht unerheblichen apparativen und finanziellen Aufwand verbunden sind, werden zurzeit benutzt. Bei diesen Methoden muss man mit einer Reaktionszeit zwischen Probenentnahme und Ergebnis von ein bis drei Tagen rechnen.Estrogens are hormone-active substances that can be divided into four classes: the endogenous estrogens, the phytoestrogens, the synthetic estrogens (eg ethinyl estradiol that is contained in the pill) and the xenoestrogens. [ Proll G .: Biosensor System for Fully Automated Ultrasensitive Multianalyte Immunoassays, Dissertation, University of Tübingen, 2005 .]. Established laboratory-scale detection methods such as gas and liquid chromatography, which are associated with considerable equipment and financial expenditure, are currently being used. With these methods one must count on a reaction time between sampling and result of one to three days.

Ziel der Erfindung ist es, schnelle, sensitive, kostengünstige und einfach zu bedienende analytische Nachweismethoden von Östrogen in wässrigen Lösungen zu entwickeln, die in ein portables Gerät integriert werden können. Dieses Biosensorsystem soll einen deutlich höheren Grad an Portabilität aufweisen als bestehende Systeme und schnelle Vor-Ort-Tests ermöglichen.aim The invention is fast, sensitive, inexpensive and easy-to-use analytical detection methods of estrogen to develop in aqueous solutions in a portable device can be integrated. This Biosensor system aims for a significantly higher degree of portability have as existing systems and allow rapid on-site testing.

Die hier beschriebene Erfindung umfasst ein Verfahren zum Nachweis von Östrogen in wässrigen Lösungen sowie eine geeignete Anordnung zu dessen Durchführung. Die Neuheit des Lösungsansatzes besteht vor allem darin, dass keine externe Lichtquelle verwendet wird, sondern diese auf einem Chip integriert ist. Dies ermöglicht eine deutliche Reduzierung der Geräteabmessungen, verbunden mit einer entsprechenden Ersparnis an Ressourcen, Energie und Herstellungskosten.The The invention described herein includes a method for detecting estrogen in aqueous solutions as well as a suitable arrangement for its implementation. The novelty of the solution Above all, there is no external light source used but this is integrated on a chip. this makes possible a significant reduction in device dimensions, connected with a corresponding saving in resources, energy and production costs.

Die Erfindung wird nachstehend an einem Ausführungsbeispiel für die Anordnung und für das Verfahren näher erläutert.The Invention will be described below by way of example for the arrangement and for the procedure closer explained.

Die zugehörigen Abbildungen zeigen:The corresponding pictures show:

1: Hybridisierte Sensor-Oberfläche 1 : Hybridized sensor surface

2: Silanisierte Sensor-Oberfläche 2 : Silanized sensor surface

3: XPS-Spektrum für silanisierte SiO2-Oberflächen, die der Passivierungsschicht des Sensors entspricht. Die Abbildung zeigt den N1s-Peak an einer sauberen und an einer mit APS bedeckten Oberfläche nach verschiedenen Silanisierungszeiten 3 : XPS spectrum for silanized SiO 2 surfaces corresponding to the passivation layer of the sensor. The figure shows the N1s peak on a clean and on an APS-covered surface after various silanization times

4: Aufbau des Sensors nach der Silanisierung und der Anbindung der Rezeptoren an die silanisierte Chip-Oberfläche 4 : Structure of the sensor after silanization and the connection of the receptors to the silanized chip surface

5: Aufbringen der kontaminierten Wasserprobe auf der Sensor-Oberfläche 5 : Application of the contaminated water sample on the sensor surface

6: Aufbringen der Referenzlösung auf der Sensor-Oberfläche 6 : Application of the reference solution on the sensor surface

7: Messprinzip des Sensors 7 : Measuring principle of the sensor

8: Auswertungsbeispiel des Messsignals 8th : Evaluation example of the measuring signal

Der für das Verfahren zu verwendende Sensor besteht aus einem Si-basierten Lichtemitter [ DE 101 30 568 A1 ], der erst gereinigt, dann hybridisiert und silanisiert wird.The sensor to be used for the method consists of a Si-based light emitter [ DE 101 30 568 A1 ], which is first purified, then hybridized and silanized.

Für die Reinigungsprozedur werden folgende Schritte ausgeführt:

  • • Der Chip wird in eine 1,1,1-trichloroethane-Lösung für 5 Minuten getaucht und danach mit N2-Gas getrocknet. Als Basis für die wässrige 1,1,1-trichloreethane Lösung kommt vorzugsweise CH3CCl zum Einsatz.
  • • Der Chip wird in einer Aceton-Lösung für 5 Minuten getaucht und anschließend wieder mit N2-Gas getrocknet.
  • • Der Chip wird für 5 Minuten in eine Methanol-Lösung eingetaucht und danach wieder mit N2-Gas getrocknet.
For the cleaning procedure, the following steps are carried out:
  • • The chip is dipped in a 1,1,1-trichloroethane solution for 5 minutes and then dried with N 2 gas. As a basis for the aqueous 1,1,1-trichloroethane solution is preferably CH 3 CCl used.
  • • The chip is immersed in an acetone solution for 5 minutes and then dried again with N 2 gas.
  • • The chip is immersed for 5 minutes in a methanol solution and then dried again with N 2 gas.

Auf dem Sensor befindet sich eine 200 nm dicke SiO2 Oberfläche. Die in-situ-Hybridisierung dieser Schicht wird in einem gasdichten Reaktionsraum (Hybridisierungskammer) durchgeführt. In der Hybridisierungskammer wird die Katalyselösung MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfone-Hydrate-Säure mit der Summenformel C6H13NO4S·xH2O) pipettiert. Die anschließende in-situ-Hybridisierung erfolgt vorteilhafter Weise bei Temperaturen um 50°C (1).On the sensor is a 200 nm thick SiO 2 surface. The in-situ hybridization of this layer is carried out in a gas-tight reaction space (hybridization chamber). In the Hybri the catalyst solution MES (2- (N-morpholino) ethanesulfone hydrates acid having the empirical formula C 6 H 13 NO 4 S xH 2 O) is pipetted. The subsequent in situ hybridization is advantageously carried out at temperatures around 50 ° C ( 1 ).

Die Silanisierung der Lichtemitter-Oberfläche ist von der Hybridisierungsqualität stark abhängig. Die Hybridisierung mit der Katalyselösung MES begünstigt die anschließende Silanisierung der Oberfläche. Die Silanisierung wird vorteilhafterweise mit einer APS-Lösung (N,N'-Bis(3-aminopropyl)-2-butene-1,4-diamine) durchgeführt. Die Chips werden für 1 bis 10 Minuten in die APS-Lösung getaucht.The Silanization of the light emitter surface is of the hybridization quality strongly dependent. Hybridization with the catalysis solution MES favors the subsequent silanization the surface. The silanization is advantageously with an APS solution (N, N'-bis (3-aminopropyl) -2-butenes-1,4-diamine) carried out. The chips will last for 1 to 10 minutes dipped in the APS solution.

Nach der Silanisierungsphase wird der Chip wieder mit Trichlorethan, Ethanol und destilliertes Wasser gereinigt, wobei nach jeder Reinigungsphase der Chip mit Stickstoffgas getrocknet wird (2).After the silanization phase, the chip is again cleaned with trichloroethane, ethanol and distilled water, wherein after each cleaning phase the chip is dried with nitrogen gas ( 2 ).

An die reaktiven NH2-Gruppen folgt dann die kovalente Adsorption der Rezeptoren. Dafür kommen verschiedene Rezeptoren in Frage, die käuflich erwerbbar sind. Die Rezeptoren weisen eine starke Wechselwirkung mit dem entsprechenden Östrogen auf, die nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip erfolgt (4).The reactive NH 2 groups are then followed by covalent adsorption of the receptors. For this purpose, various receptors come into question, which are commercially available. The receptors have a strong interaction with the corresponding estrogen, which takes place according to the key-lock principle ( 4 ).

Die Silanisierung kann im Falle von Östrogen auch mit anderen MPS ((3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane), NPS(n-propyltrimethoxysilane)-Lösungen mit jeweils -SH bzw. -CH3 als funktionelle Gruppe je nach Rezeptortyp (z. B. aus der nicht-konventionellen Hefe Arxula adeninivorans gewonnenen menschliche Östrogen Rezeptor α (hERα) [ Kunze et al. 2006 ]) durchgeführt werden.In the case of estrogen, silanization can also be carried out with other MPS ((3-mercaptopropyl) trimethoxysilanes), NPS (n-propyltrimethoxysilane) solutions each having -SH and -CH 3 as a functional group, depending on the type of receptor (eg from US Pat non-conventional yeast Arxula adeninivorans gained human estrogen receptor α (hERα) [ Kunze et al. 2006 ]) be performed.

Längere Silanisierungsprozesse sind im Fall von Östrogen nicht notwendig. 3 zeigt die XPS-Intensitäten bei unterschiedlichen Einwirkzeiten der APS-Lösung. Die Silanisierungsprozesse mit der APS-Lösung zeigen nach einer, nach fünf und nach zehn Minuten, dass sich auf der silanisierten Oberfläche ausreichend freien NH2-Gruppen gebildet haben. Diese funktionelle Gruppe ist reaktiv auf den Östrogen-Rezeptor.Longer silanization processes are not necessary in the case of estrogen. 3 shows the XPS intensities at different exposure times of the APS solution. After one, five and ten minutes, the silanization processes with the APS solution show that sufficient free NH 2 groups have formed on the silanized surface. This functional group is reactive to the estrogen receptor.

Beim Messverfahren kommt eine Referenzprobe zum Einsatz, die aus farbstoffmarkierten Hormonmolekülen besteht. Die optische Anregungswellenlänge des verwendeten Farbstoffs muss hinreichend gut mit der Emissionswellenlänge des integrierten Lichtemitters übereinstimmen.At the Measuring method is a reference sample used, which consists of dye-labeled Hormone molecules exists. The excitation optical wavelength the dye used must be sufficiently good with the emission wavelength of the integrated light emitter match.

Das Messverfahren besteht aus drei Schritten:

  • • Das Aufbringen der kontaminierten Probe auf die Chip-Oberfläche durch Pipettieren, Eintauchen oder Vorbeiströmen in einer Mikrofluidik (5). Eventuell vorhandene Östrogenmoleküle werden an den Rezeptoren immobilisiert.
  • • Das Spülen der Probe mit destilliertem Wasser, um leicht gebundene Östrogenmoleküle bzw. Fremdmoleküle zu beseitigen.
  • • Das Aufbringen einer Referenzprobe auf die Chip-Oberfläche durch Pipettieren, Eintauchen oder Vorbeiströmen in einer Mikrofluidik (6).
  • • Durch Anlegen einer Spannung regt der integrierte Lichtemitter den Farbstoff der Referenzprobe zur Photolumineszenz an. Das Lichtsignal des Farbstoffes wird mit Hilfe eines Filters vom Signal des integrierten Lichtemitters getrennt und mit einem Detektor gemessen (7).
The measuring procedure consists of three steps:
  • The application of the contaminated sample to the chip surface by pipetting, dipping or passing in a microfluidic device ( 5 ). Any existing estrogen molecules are immobilized on the receptors.
  • • Rinse the sample with distilled water to remove lightly bound estrogen or foreign molecules.
  • • Applying a reference sample to the chip surface by pipetting, dipping or flowing past in a microfluidic device ( 6 ).
  • • By applying a voltage, the integrated light emitter excites the dye of the reference sample for photoluminescence. The light signal of the dye is separated by a filter from the signal of the integrated light emitter and measured with a detector ( 7 ).

Für die Verwendung dieses Verfahrens sind nur sehr geringe Farbstoffmengen in der Referenzprobe notwendig, damit werden die Kosten pro Nachweis reduziert.For the use of this method are only very small amounts of dye necessary in the reference sample, hence the cost per proof reduced.

Je nach Kontaminierungsgrad der Probe ergeben sich unterschiedliche Signalstärken, die in 8 dargestellt sind.

  • • Eine östrogenfreie Wasserprobe ergibt ein Fluoreszenz-Signal von 100%, da alle Rezeptoren mit farbstoffmarkierten Hormonen der Referenzprobe belegt werden können (8a).
  • • Eine mit Östrogen kontaminierte Wasserprobe ergibt ein Fluoreszenz-Signal zwischen 0 und 100% (z. B. 75%), da nur ein Teil der Rezeptoren mit farbstoffmarkierten Östrogen belegt ist (8b).
  • • Eine mit Östrogen stark kontaminierte Wasserprobe liefert kein Fluoreszenz-Signal, da alle imobilisierten Rezeptoren vollständig mit Östrogen aus der Wasserprobe belegt sind (8c).
Depending on the degree of contamination of the sample, different signal strengths result 8th are shown.
  • • An estrogen-free water sample gives a fluorescence signal of 100%, since all receptors can be labeled with dye-labeled hormones from the reference sample ( 8a ).
  • • A water sample contaminated with estrogen gives a fluorescence signal between 0 and 100% (eg 75%), as only part of the receptors are labeled with dye-labeled estrogen ( 8b ).
  • • A water sample heavily contaminated with estrogen does not give a fluorescence signal because all immobilized receptors are completely filled with estrogen from the water sample ( 8c ).

Die Verminderung des Fluoreszenzsignals ist dabei proportional zu der in der Wasserprobe enthaltenen Hormon-Konzentration.The Reduction of the fluorescence signal is proportional to the hormone concentration contained in the water sample.

Durch die Anpassung der Silangruppe an existierende Rezeptoren anderer Hormone, ist dieses Verfahren auch für den Nachweis dieser Hormone geeignet.By the adaptation of the silane group to existing receptors of others Hormones, this procedure is also for the proof of this Hormones suitable.

APSAPS
N,N'-Bis(3-aminopropyl)-2-butene-1,4-diamineN, N'-bis (3-aminopropyl) -2-butene-1,4-diamine
MPSMPS
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane(3-mercaptopropyl) trimethoxysilane
NPSNPS
n-propyltrimethoxysilanen-propyltrimethoxysilanes
ITOITO
Indium Oxide Filmindium Oxide film
MESMES
2-(N-Morpholino)ethanesulfone-Hydrate-Säure2- (N-morpholino) ethanesulfone hydrates acid
11
Keine SilanisierungNone silanization
22
1 min-APS1 min-APS
33
5 min-APS5 min-APS
44
10 min APS10 min APS
55
120 min APS120 min APS
66
240 min APS240 min APS
77
Chip-OberflächeChip surface
88th
Rezeptorreceptor
99
Silangruppesilane
1010
Si-Subtrat mit LichtemitterSi Subtrat with light emitter
1111
Wässrige Lösungaqueous solution
1212
Östrogenestrogen
1313
Östrogenfreie Substanzenestrogen Free substances
1414
Referenzlösungreference solution
1515
Detektordetector
1616
Filterfilter

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

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Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

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  • - Kunze et al. 2006 [0022] Kunze et al. 2006 [0022]

Claims (7)

Anordnung zum Nachweis von Östrogen in wässrigen Lösungen besteht aus einem Si-basierten Lichtemitter, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Lichtemitter eine bioaktive Schicht aufgebracht wird.Arrangement for the detection of estrogen in aqueous solutions consists of a Si-based light emitter, characterized in that a bioactive layer is applied to the light emitter. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die bioaktive Schicht durch Reinigung, Hybridisierung und Sinalisierung aufgebracht wird.Arrangement according to claim 1, characterized that the bioactive layer through purification, hybridization and sinalization is applied. Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die dreistufige Reinigung mit einer wässrige 1,1,1-trichloreethane Lösung, einer Aceton-Lösung und einer Methanol-Lösung erfolgt, wobei nach jeder Stufe eine Trocknung mit Stickstoffgas erfolgt.Arrangement according to claim 2, characterized that the three-step purification with an aqueous 1,1,1-trichloroethane Solution, an acetone solution and a methanol solution carried out, wherein after each stage, a drying with nitrogen gas takes place. Anordnung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierung mit einer MES-Katalyselösung erfolgt.Arrangement according to claim 3, characterized that the hybridization takes place with an MES catalysis solution. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Sinalisierung mit einer APS- oder einer MPS-Lösung oder NPS-Lösung erfolgt und b. danach eine dreistufige Reinigung mit Trichlorethan, Ethanol und destilliertes Wasser erfolgt, wobei nach jeder Reinigungsstufe die Anordnung mit Stickstoffgas getrocknet wird.Arrangement according to claim 4, characterized that a. Sinalization with an APS or MPS solution or NPS solution takes place and b. then a three-stage Purification with trichloroethane, ethanol and distilled water, wherein after each purification step the arrangement with nitrogen gas is dried. Verfahren zum Nachweis von Östrogen in wässrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Referenzprobe mit farbstoffmarkierten Östrogenmolekülen verwendet wird, bei der die optische Anregungswellenlänge des verwendeten Farbstoff hinreichend gut mit der Emissionswellenlänge des integrierten Lichtemitters übereinstimmt.Method for the detection of estrogen in aqueous Solutions, characterized in that a reference sample used with dye-labeled estrogen molecules is at which the optical excitation wavelength of the used Dye sufficiently good with the emission wavelength of the integrated light emitter coincides. Verfahren zum Nachweis von Östrogen in wässrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, dass a. auf die Anordnung nach den Ansprüchen 1 und 2 eine Probenlösung aufgebracht wird, b. danach die Anordnung vorzugsweise mit destilliertem Wasser gereinigt wird, c. danach auf die Anordnung die Referenzprobe nach Anspruch 6 aufgebracht wird und d. danach eine elektrischen Spannung an die Anordnung angelegt wird und an einem Detektor das Messergebnis abgelesen werden kann.Method for the detection of estrogen in aqueous Solutions, characterized in that a. on the Arrangement according to claims 1 and 2, a sample solution is applied, b. then preferably with the arrangement purified of distilled water, c. afterwards on the arrangement the reference sample according to claim 6 is applied and d. after that an electrical voltage is applied to the device and on a detector, the measurement result can be read.
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