DE102008015607A1

DE102008015607A1 - New boswellic acid derivatives are microsomal prostaglandin E-1 synthesis inhibitors, useful to treat e.g. rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, asthma, feverish and painful conditions, cancers, emphysema and multiple sclerosis

Info

Publication number: DE102008015607A1
Application number: DE102008015607A
Authority: DE
Inventors: Oliver Prof. Werz; Ulf Siemoneit; Arne Henkel; Johann Prof. Jauch; Nicole Kather
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date: 2008-03-26
Filing date: 2008-03-26
Publication date: 2009-10-15

Abstract

Boswellic acid derivatives (I) are new. Boswellic acid derivatives of formula (I) are new. R 1>polar or anionic substituents, preferably OH or hydroxyalkyl, carboxyalkyl, hydroxyaryl, carboxyaryl, hydroxyheteroaryl, carboxyheteroaryl, hydroxyalkylaryl, carboxyalkylaryl, hydroxyalkylheteroaryl, carboxyalkylheteroaryl (which is attached over N, O or C to the residue molecule, where the hydroxyaryl, carboxyaryl, hydroxyheteroaryl, carboxyheteroaryl, hydroxyalkylaryl, carboxyalkylaryl, hydroxyalkylheteroaryl or carboxyalkylheteroaryl is further condensed with a ring system, and one or more H atoms are substituted by one or more halo, O, N, S, OH, NH 2, NO 2, SH, (1-10C)alkyl, (2-10C)alkenyl, (2-10C)alkynyl, OCF 3, (1-10C)alkoxy, (1-10C)alkylamine, (1-10C)alkylthio, (1-10C)alkylsilyl, (3-10)cycloalkyl, (3-10C)cycloalkenyl, (3-10C)cycloheteroalkyl, (3-10C)cycloheteroalkenyl, COOH or its corresponding acid addition salt), or phosphate or sulfate (which is connected with optionally substituted aryl, heteroaryl, alkylaryl or alkylheteroaryl); R1a : H or R 1>; R 2>2H, H, OH or O; and R 3>a carboxyl group, carboxylic acid salt with a counterion, (1-5C)carboxylic acid ester or (1-5C)carboxylic amide. [Image] ACTIVITY : Antiarthritic; Antirheumatic; Antiinflammatory; Gastrointestinal-Gen.; Antiasthmatic; Antipyretic; Cytostatic; Respiratory-Gen.; Vasotropic; Neuroprotective. MECHANISM OF ACTION : Microsomal prostaglandin E-1 synthesis inhibitor; Prostaglandin-E2 synthesis inhibitor; Cathepsin G inhibitor. The ability of (I) to inhibit microsomal prostaglandin E-1 synthesis inhibitor was tested in A549 cells. The results showed that 3-O-oxaloyl beta boswellic acid exhibited an IC 50value of approximately 0.03-20 mu M.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von natürlich vorkommenden Boswelliasäuren und synthetischen Boswelliasäurederivaten, insbesondere solche mit einer Estergruppe an Pos. C3, vorzugsweise solche mit endständiger Carboxylfunktion, zur Hemmung der induzierbaren mikrosomalen Prostaglandin E₂ Synthase-1 und zur Hemmung des Cathepsin G. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von Boswelliasäuren und synthetischen Boswelliasäurenderivate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von PGE₂- und/oder Cathepsin G-vermittelter Erkrankungen und krankhafter Zustände.The present invention relates to the use of naturally occurring boswellic acids and synthetic boswellic acid derivatives, in particular those having an ester group at pos. C3, preferably those having terminal carboxyl function, for inhibiting the inducible microsomal prostaglandin E ₂ synthase-1 and for inhibiting cathepsin G. Further The invention relates to the use of boswellic acids and synthetic boswellic acid derivatives for the manufacture of a medicament for the treatment of PGE ₂ and / or cathepsin G-mediated disorders and morbid conditions.

Akute und chronische entzündliche Erkrankungen gehen mit einer erhöhten Aktivität von entzündungsrelvanten Zellen wie z. B. Monozyten, Granulozyten, Lymphozyten und endothelialen Zellen einher, die vermehrt Prostaglandin E₂ (PGE₂) und/oder lysosomale Enzyme, dazugehörend Cathepsin G, Elastase und Proteinase-3, freisetzen. Diese Proteasen und das PGE₂ sind für die Entstehung und Aufrechterhaltung entzündlicher Symptomatik (Schmerz, Schwellung, Rötung, Überwärmung und Funktionsverlust) verantwortlich bzw. wirken fördernd darauf ein.Acute and chronic inflammatory diseases are associated with increased activity of inflammatory cells such. Monocytes, granulocytes, lymphocytes and endothelial cells, which release more prostaglandin E ₂ (PGE ₂ ) and / or lysosomal enzymes, including cathepsin G, elastase and proteinase-3. These proteases and the PGE ₂ are responsible for the development and maintenance of inflammatory symptoms (pain, swelling, redness, overheating and loss of function) or promote it.

Die PG-Biosynthese wird durch die initialen Schritte der Umwandlung von Arachidonsäure zu PGH₂ durch die Cyclooxygenase(COX)-1 oder -2 eingeleitet (1). Gewisse PGs, dazu gehörend das PGE₂, sind Mediatorstoffe bei Entzündungen (v. a. rheumatoide Arthritis), Schmerz und Fieber, und sind des Weiteren bei Krebserkrankungen (Lunge, Kolon, Endometrium) beteiligt, andere PGs dagegen erfüllen wichtige physiologischen Funktionen [1, 2]. Hemmstoffe der COX-1 und -2 unterbinden damit die Synthese aller PGs und weisen aufgrund des Mangels physiologisch wichtiger PGs beträchtliche Nebenwirkungen (Magen, Niere) auf [3]. Die induzierbare mikrosomale Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) ist Mitglied der MAPEG Familie und katalysiert die Umwandlung von PGH₂ zu PGE₂ [4]. PGE₂ weist im Gegensatz zu den physiologisch notwendigen PGs ausgeprägte pathophysiologische Eigenschaften (Entzündung, Schmerz, Fieber, Krebserkrankungen, Angiogenese) auf, obwohl es im Magen und in der Niere ebenfalls zur Homöostase beiträgt. Seit Entdeckung der induzierbaren mPGES-1 im Jahre 1999 ist man deshalb bestrebt, potente und selektive Hemmstoffe gegen die mPGES-1 zu entwickeln, um die PGE₂ Synthese selektiv zu inhibieren, ohne dabei die Bildung der physiologisch wichtigen PGs zu unterdrücken [4, 5]. Dies macht die mPGES-1 zu einem interessanten Arzneistoff-Target v. a. bei chronisch entzündlichen Erkrankungen (rheumatoide Arthritis), die mit Schmerz oder auch mit Fieber einhergehen, aber auch bei diversen Krebserkrankungen. Allerdings ist bislang kein Inhibitor der mPGES-1 als Arzneimittel zur Therapie zugelassen, und die Anzahl verfügbarer Hemmstoffe (wie z. B. MK-886) ist derzeit noch äußerst gering und die Substanzen befinden sich noch in klinischer Prüfung. Die Motivation der pharmazeutischen Forschung sichere und selektive Hemmstoffe der mPGES-1 zu finden ist enorm.PG biosynthesis is initiated by the initial steps of converting arachidonic acid to PGH ₂ through cyclooxygenase (COX) -1 or -2 ( 1 ). Certain PGs, including PGE ₂ , are mediators in inflammation (especially rheumatoid arthritis), pain and fever, and are also involved in cancers (lung, colon, endometrium), while other PGs perform important physiological functions [1, 2]. , Inhibitors of COX-1 and -2 thus prevent the synthesis of all PGs and have considerable side effects (stomach, kidney) due to the lack of physiologically important PGs [3]. The inducible microsomal prostaglandin E2 synthase-1 (mPGES-1) is a member of the MAPEG family and catalyzes the conversion of PGH ₂ to PGE ₂ [4]. In contrast to the physiologically necessary PGs, PGE ₂ has pronounced pathophysiological properties (inflammation, pain, fever, cancers, angiogenesis), although it also contributes to homeostasis in the stomach and kidney. Since the discovery of inducible mPGES-1 in 1999, efforts have therefore been made to develop potent and selective inhibitors of mPGES-1 in order to selectively inhibit PGE ₂ synthesis without suppressing the formation of physiologically important PGs [4, 5 ]. This makes the mPGES-1 an interesting drug target especially in chronic inflammatory diseases (rheumatoid arthritis), which are associated with pain or with fever, but also in various cancers. However, no inhibitor of mPGES-1 is currently approved as a drug for therapy, and the number of available inhibitors (such as MK-886) is currently extremely low and the compounds are still under clinical review. The motivation of pharmaceutical research to find safe and selective inhibitors of mPGES-1 is enormous.

Cathepsin G gehört zur Familie der Cathepsine, sogenannte lysosomale Proteasen mit mehr als 12 Mitgliedern (Cathepsin-A, -B, -D, -E, -G, -L, -K, -S etc.). Sie sind Serin-, Cystein-, oder Aspartat-Proteasen und spielen eine wesentliche Rolle im Immunsystem, indem sie allesamt durch Hydrolyse extrazellulärer Matrixproteine eine molekulare Machinerie zum Eindringen invasiver Zellen darstellen [6].cathepsin G belongs to the cathepsin family, so-called lysosomal proteases more than 12 members (cathepsin A, -B, -D, -E, -G, -L, -K, -S Etc.). They are serine, cysteine, or aspartate proteases and play play a vital role in the immune system by getting it all through Hydrolysis extracellular Matrix proteins a molecular machinery to invade invasive Represent cells [6].

Cathepsin G ist eine neutrale Serinprotease, ähnlich Chymotrypsin und des weiteren mit Chymase und Tryptase, Elastase und Proteinase-3 verwandt [7]. Cathepsin G wird quasi ausschließlich in Neutrophilen und Makrophagen exprimiert, in azurophilien Granula gespeichert und nach Degranulierung freigesetzt. Es spaltet seine Substrate nach Met, Leu, Phe, Lys, Arg, preferentiell nach aromatischen Resten. Zu den Substraten gehören neben den extrazellulären Matrixproteinen [8, 9] auch Chemokine, Rezeptoren und Integrine [7].cathepsin G is a neutral serine protease, similar to chymotrypsin and the further related to chymase and tryptase, elastase and proteinase-3 [7]. Cathepsin G is almost exclusively in neutrophils and macrophages expressed, stored in azurophilic granules and after degranulation released. It splits its substrates into Met, Leu, Phe, Lys, Arg, preferentially for aromatic radicals. The substrates include beside the extracellular Matrix proteins [8, 9] include chemokines, receptors and integrins [7].

Primäre physiologische Funktion des Cathespin G ist die intrazelluläre und extrazelluläre Vernichtung von Mikroorganismen. Pathopysiologische Prozesse die im Zusammenhang mit Cathepsin G stehen sind die Vermittlung des Gewebumbaus an verletzten Stellen, die Aktivierung von Thrombozyten (Aggregation and Sekretion) via PAR-4 [10], die Aktivierung von Neutrophilen via Formyl-Petid-Rezeptor [11], und die Induktion von Leukozytenmigration und -infiltration in Gewebe. Cathepsin-knock-out Mäuse zeigen reduzierte Entzündungsanzeichen und sind resistent gegenüber Arthritis-Induktion durch Anti-Kollagen Antikörper. Insgesamt fördert Cathepsin also allgemein Entzündungsvorgänge. Dementsprechend ergeben sich therapeutische Indikationen für Cathepsin G Inhibitoren, dazu gehörend Asthma, COPD (Chronisch obstruktive Lungenerkrankung), Emphyseme, Reperfusion injury, Psoriasis und rheumatoid Arthritis [12]. Hemmstoffe des Cathepsin G zur Therapie von Erkrankungen sind bislang nicht als Arzneimittel zugelassen.Primary physiological Function of Cathespin G is the intracellular and extracellular destruction of Microorganisms. Pathophysiological processes related With cathepsin G, the mediation of tissue remodeling is injured Sites, activation of platelets (aggregation and secretion) via PAR-4 [10], the activation of neutrophils via the formyl-petid receptor [11], and the induction of leukocyte migration and infiltration in tissue. Cathepsin knock-out Show mice reduced signs of inflammation and are resistant to Arthritis induction by anti-collagen antibodies. Overall cathepsin promotes So in general inflammatory processes. Accordingly there are therapeutic indications for cathepsin G inhibitors, belonging to it Asthma, COPD (chronic obstructive pulmonary disease), emphysema, Reperfusion injury, psoriasis and rheumatoid arthritis [12]. inhibitors of Cathepsin G for the treatment of diseases are not yet approved as a medicinal product.

Zusammenfassend spielen also sowohl Cathepsin G als auch die mPGES-1 Schlüsselrollen bei entzündlichen Erkrankungen, die jedoch hinsichtlich der Wirkungsweisen völlig unterschiedlich sind. Dies impliziert, dass die kombinierte/gleichzeitige Unterdrückung beider Enzyme zu einem additiven oder auch synergistischen Effekt führen kann. Substanzen, die eine duale Hemmung des Cathepsin G und der mPGES-1 bewirken, sind bislang nicht bekannt.In summary, both cathepsin G and mPGES-1 play key roles in inflammatory diseases, which, however, are completely different in their mode of action. This implies that the combined / simultaneous suppression of both enzymes leads to an additive or even synergis table effect. Substances that cause dual inhibition of cathepsin G and mPGES-1 are not yet known.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, erstmalig Substanzen zu identifizieren, die das Cathespin G und die PGE₂ Synthese in einer additiven und/oder synergistischen Weise hemmen und somit entzündlicher Prozesse blockieren. Dabei sollen die Nachteile der bekannten Verfahren (Einsatz von steroidalen Antirheumatika (Glukokorticoide) und von NSAIDs oder sog. Coxiben, nämlich Hemmstoffe der COX Enzyme) umgangen werden und Wirkstoffe, insbesondere Naturstoffe und deren synthetische Derivate, identifiziert werden, die zu Herstellung eines Arzneistoffes zur therapeutischen Behandlung von Cathepsin G- und/oder PGE₂-vermittelten Erkrankungen, insbesondere von chronischen Entzündungen wie rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankungen und Asthma, verwendet werden können, um bei einer hohen Effizienz geringe Nebenwirkungen aufzuweisen.The object of the present invention is therefore to identify, for the first time, substances which inhibit cathespine G and PGE ₂ synthesis in an additive and / or synergistic manner and thus block inflammatory processes. The disadvantages of the known methods (use of steroidal antirheumatics (glucocorticoids) and of NSAIDs or so-called coxibs, namely inhibitors of COX enzymes) are to be circumvented and active ingredients, in particular natural substances and their synthetic derivatives, are identified which can be used to produce a drug therapeutic treatment of cathepsin G and / or PGE ₂ mediated diseases, especially chronic inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease and asthma, can be used to have low side effects at high efficiency.

Diese Aufgabe wird durch die Verwendung von Boswelliasäuren und deren synthetischen Derivaten gelöst, wie es im Anspruch 1 beschrieben ist. Bevorzugte Ausführungen sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 12 genannt.These Task is through the use of boswellic acids and their synthetic Solves derivatives, as described in claim 1. Preferred embodiments are in the dependent Claims 2 called to 12.

Die o. g. Aufgabe wird dadurch gelöst, dass in der vorliegenden Erfindung Boswelliasäuren und deren synthetische Derivate als Hemmstoffe der katalytischen Aktivität der mPGES-1 und des Cathepsin G in zellfreien Systemen identifiziert werden konnten (Tabelle 2, 2–6, 8). Auch hemmen Boswelliasäuren und synthetische Derivate die Biosynthese von PGE₂ im LPS-stimulierten Humanblut (7). Damit sind Boswelliasäuren und deren Derivate direkte Hemmstoffe der mPGES-1 bzw. Hemmstoffe der PGE₂ Synthese.The above object is achieved by identifying boswellic acids and their synthetic derivatives as inhibitors of the catalytic activity of mPGES-1 and of cathepsin G in cell-free systems in the present invention (Table 2, 2 - 6 . 8th ). Boswellic acids and synthetic derivatives also inhibit the biosynthesis of PGE ₂ in LPS-stimulated human blood ( 7 ). Thus, boswellic acids and their derivatives are direct inhibitors of mPGES-1 and inhibitors of PGE ₂ synthesis.

Weiterhin zeigt die Erfindung, dass Boswelliasäuren und die synthetischen Derivate Cathepsin G-vermittelte funktionelle Zellantworten inhibieren. So wird die fMLP-induzierte Invasion von Neutrophilen durch Matrigel hindurch unterbunden (9). Bislang sind weder Boswelliasäuren noch deren synthetischen Derivate als Cathepsin G Inhibitoren oder als duale Hemmstoffe des Cathepsin G und der PGE₂ Synthese beschrieben worden.Furthermore, the invention shows that boswellic acids and the synthetic derivatives inhibit cathepsin G-mediated functional cell responses. Thus, the fMLP-induced invasion of neutrophils is prevented by Matrigel ( 9 ). To date, neither boswellic acids nor their synthetic derivatives have been described as cathepsin G inhibitors or as dual inhibitors of cathepsin G and PGE ₂ synthesis.

In einer Ausführung der Erfindung werden natürlich vorkommende gereinigte Boswelliasäuren verwendet. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird die gereinigte β-Boswelliasäure (β-BA) verwendet. Diese kann z. B. nach dem Verfahren von Jauch et al. [13] aus Weihrauchharzen halbsynthetisch gewonnen werden.In an execution of the invention become natural occurring purified boswellic acids used. In a preferred execution The invention uses the purified β-boswellic acid (β-BA). This can, for. By the method of Jauch et al. [13] from incense resins be obtained semi-synthetically.

In einer weiteren Ausführung werden synthetische Boswelliasäurenderivate verwendet, die eine vergleichbare oder bessere Hemmwirkung auf die mPGES-1- und/oder Cathepsin G-Aktivität als die natürlich vorkommenden Boswelliasäuren haben. Für die synthetischen Boswelliasäurenderivate sind bislang keine biologischen oder pharmakologischen Wirkungen beschrieben worden und die Substanzen sind an sich unbekannt. Die synthetischen Strukturvariationen an den natürlichen Boswelliasäuren führen überraschenderweise hinsichtlich der Muttersubstanzen zu höherer Wirksamkeit.In another embodiment become synthetic boswellic acid derivatives used, which has a comparable or better inhibitory effect on the mPGES-1 and / or Cathepsin G activity as the course occurring boswellic acids to have. For the synthetic boswellic acid derivatives are so far no biological or pharmacological effects have been described and the substances are unknown in itself. The Synthetic structural variations on the natural boswellic acids surprisingly lead with regard to the parent substances to higher efficacy.

Es wurden vor allem Boswelliasäure-Derivate erfolgreich getestet, die an der C3 OH-Funktion verestert oder verethert sind, insbesondere solche die im Rest eine endständige Carboxylfunktion aufweisen.It were mainly boswellic acid derivatives successfully tested, esterified or etherified at the C3 OH function, in particular those which have a terminal carboxyl function in the remainder.

Tabelle 1 umfasst einige strukturelle Modifikationen von Boswelliasäuren.

Table 1 includes some structural modifications of boswellic acids.

Tabelle 2 umfasst einige Beispiele der synthetischen Boswelliasäure-Derivate, die einen Hemmeffekt auf die PGE₂-Synthese und/oder Cathepsin G aufweisen. Substanz mPGES-1 Hemmung (IC₅₀ Werte [μM] Cathepsin G Hemmung β-BA 5 0.8^a) Acetyl-β-BA 30 1.3^a) 11-Keto-β-BA 10 3.9^a) Acetyl-11-Keto-β-BA 3 0.6^a) β-BA-CM-Ether < 1 28,8 ± 7,4^b) Oxaloyl-β-BA 0,3 38,1 ± 6,4^b) Oxaloyl-11-Keto-β-BA 6 93^b) Succinoyl-β-BA 2,5 52,3 ± 12,7^b) Succinoyl-11-Keto-β-BA 9 90,2 ± 9,6^b) Glutaroyl-β-BA 1 24,5 ± 1,7^b) Glutaroyl-11-Keto-β-BA n. d. 49,1 ± 11,0^b) Galloyl-β-BA < 1 n. d. Galloyl-11-Keto-β-BA n. d. 30,9 ± 4,1^b) 11α-Hydroxy-β-BA n. d. 62.9 ± 6,6^b) 11β-Hydroxy-β-BA n. d. 82.7 ± 9^b) α-BA n. d. 77,6 ± 13,6^b) Cis-Diol-β-BA n. d. 73,5 ± 14,1^b)

^a)IC₅₀ [μM],
^b)% Restaktivität bei 10 μM)

Table 2 covers some examples of the synthetic boswellic acid derivatives which have an inhibitory effect on PGE ₂ synthesis and / or cathepsin G.

substance mPGES-1 inhibition (IC ₅₀ values [μM] Cathepsin G inhibition β-BA 5 0.8 ^a) Acetyl-β-BA 30 1.3 ^a) 11-keto-β-BA 10 3.9 ^a) Acetyl-11-keto-β-BA 3 0.6 ^a) β-BA-CM-ether <1 28.8 ± 7.4 ^b) Oxaloyl-β-BA 0.3 38.1 ± 6.4 ^b) Oxaloyl-11-keto-β-BA 6 93 ^b) Succinoyl-β-BA 2.5 52.3 ± 12.7 ^b) Succinoyl-11-keto-β-BA 9 90.2 ± 9.6 ^b) Glutaroyl-β-BA 1 24.5 ± 1.7 ^b) Glutaroyl-11-keto-β-BA nd 49.1 ± 11.0 ^b) Galloyl-β-BA <1 nd Galloyl-11-keto-β-BA nd 30.9 ± 4.1 ^b) 11α-hydroxy-β-BA nd 62.9 ± 6.6 ^b) 11β-hydroxy-β-BA nd 82.7 ± 9 ^b) α-BA nd 77.6 ± 13.6 ^b) Cis-diol-β-BA nd 73.5 ± 14.1b ⁾

^a) IC ₅₀ [μM],
^b) % residual activity at 10 μM)

Die Erfindung umfasst die Verwendung von Zubereitungen zur Hemmung der PGE₂ Synthese, insbesondere zur Hemmung der mPGES-1, und/oder des Cathepsin G, wobei diese Zubereitungen mindestens eine Boswelliasäure und/oder eines ihrer Derivate mit der folgenden Strukturformel enthalten:

wobei R1 für einen polaren oder anionischen Substituenten, insbesondere ein lineares oder verzweigtes Hydroxyalkyl, lineares oder verzweigtes Carboxyalkyl, Hydroxyaryl, Carboxyaryl, Hydroxyheteroaryl, Carboxyheteroaryl, Hydroxyalkylaryl, Carboxyalkylaryl, Hydroxyalkylheteroaryl oder Carboxyalkylheteroaryl steht, das über ein Stickstoff-, Sauerstoff- oder Kohlenstoffatom an das Restmolekül geknüpft ist, wobei das Hydroxyaryl, Carboxyaryl, Hydroxyheteroaryl, Carboxyheteroaryl, Hydroxyalkylaryl, Carboxyalkylaryl, Hydroxyalkylheteroaryl oder Carboxyalkylheteroaryl mit einem weiteren Ringsystem kondensiert sein kann, und ein oder mehrere H-Atome substituiert sein können durch eine oder mehrere Gruppen aus der Substanzklasse Halogen, O, N, S, OH, NH₂, NO₂, SH, (C_1-10)Alkyl, (C_2-10)Alkenyl, (C_2-10)Alkinyl, OCF₃, (C_1-10)Alkoxy, (C_1-10)Alkylamin, (C_1-10)Alkylthio, (C_1-10)Alkylsilyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Cycloheteroalkyl, Cycloheteroalkenyl, COOH, oder das korrespondierende Säureadditionssalz dieser Verbindung, oder R1 für Phosphat oder Sulfat, verknüpft mit substituiertem oder unsubstituiertem Aryl, Heteroaryl, Alkylaryl oder Alkylheteroaryl, und
R2 für zwei Wasserstoffatome oder ein Sauerstoffatom oder eine Hydroxylgruppe stehen.The invention encompasses the use of preparations for inhibiting PGE ₂ synthesis, in particular for inhibiting mPGES-1, and / or cathepsin G, these preparations containing at least one boswellic acid and / or one of its derivatives having the following structural formula:

where R 1 is a polar or anionic substituent, in particular a linear or branched hydroxyalkyl, linear or branched carboxyalkyl, hydroxyaryl, carboxyaryl, hydroxyheteroaryl, carboxyheteroaryl, hydroxyalkylaryl, carboxyalkylaryl, hydroxyalkylheteroaryl or carboxyalkylheteroaryl, which has a nitrogen, oxygen or carbon atom on the Residual molecule is linked, wherein the hydroxyaryl, carboxyaryl, hydroxyheteroaryl, carboxyheteroaryl, hydroxyalkylaryl, carboxyalkylaryl, hydroxyalkylheteroaryl or carboxyalkylheteroaryl may be condensed with another ring system, and one or more H atoms may be substituted by one or more groups from the substance class halogen, O , N, S, OH, NH ₂ , NO ₂ , SH, (C _1-10 ) alkyl, (C _2-10 ) alkenyl, (C _2-10 ) alkynyl, OCF ₃ , (C _1-10 ) alkoxy, (C _1-10 ) alkylamine, (C _1-10 ) alkylthio, (C _1-10 ) alkylsilyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloheteroalkyl, cycloheteroalkenyl, COOH, or the correspon dating acid addition salt of this compound, or R1 for phosphate or sulfate, linked to substituted or unsubstituted aryl, heteroaryl, alkylaryl or alkylheteroaryl, and
R2 represents two hydrogen atoms or an oxygen atom or a hydroxyl group.

Die Erfindung umfasst ferner die Verwendung von Boswelliasäuren oder ihren synthetischen Derivaten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von PGE₂- und/oder Cathepsin G-vermittelten Erkrankungen und krankhaften Zuständen. Bei den PGE₂-vermittelten Erkrankungen handelt es sich insbesondere um akute und chronische Entzündungen, schmerz- und fieberhafte Zustände sowie um Krebserkrankungen. Bei den Cathepsin G-vermittelten krankhaften Zuständen handelt es sich insbesondere um Asthma, COPD (Chronisch obstruktive Lungenerkrankung), Emphyseme, Reperfusion Injury, und rheumatoide Arthritis. Das Arzneimittel kann ferner ein pharmazeutisches Trägermaterial enthalten.The invention further includes the use of boswellic acids or their synthetic derivatives for the manufacture of a medicament for the treatment of PGE ₂ and / or cathepsin G-mediated diseases and disease states. The PGE ₂ -mediated diseases are, in particular, acute and chronic inflammations, painful and feverish conditions as well as cancers. The cathepsin G-mediated disease states are, in particular, asthma, COPD (chronic obstructive pulmonary disease), emphysema, reperfusion injury, and rheumatoid arthritis. The medicament may further contain a pharmaceutical carrier material.

Zur therapeutischen Behandlung von PGE₂- und/oder Cathepsin G-vermittelten Erkrankungen sind Plasmakonzentrationen von ca. 0,1–15 μM, insbesondere 1–10 μM Boswelliasäuren bzw. synthetischer Derivate erstrebenswert, das könnte etwa die p. o. Gabe von etwa 100–1000 mg/Tag sein.For the therapeutic treatment of PGE ₂ - and / or cathepsin G-mediated diseases plasma concentrations of about 0.1-15 uM, in particular 1-10 uM boswellic acids or synthetic derivatives are desirable, which could be about the po dose of about 100-1000 be mg / day.

Die Verabreichung von Boswelliasäuren bzw. synthetischer Derivate oder diese enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Erkrankungen kann oral oder parenteral erfolgen.The Administration of boswellic acids or synthetic derivatives or pharmaceuticals containing them Compositions for the treatment of diseases can be administered orally or done parenterally.

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass für das Arzneistofftarget mPGES-1 mit den Boswelliasäuren bzw. synthetischer Derivate Strukturen identifiziert wurden, die zur Hemmung der Aktivität der mPGES-1 führen. Damit könnte nun selektiv die Synthese des PGE₂ gehemmt werden, ohne dabei, wie bislang mittels Inhibitoren der COX-1 und -2, auch die Synthese anderer (physiologisch wichtiger) PGs zu hemmen. Dies hat zur Folge, dass die Therapie PGE₂-vermittelter Erkrankungen mittels Boswelliasäuren bzw. synthetischer Derivate im Vergleich zu COX-1/2 Inhibitoren weniger Nebenwirkungen aufweisen dürfte.An advantage of the present invention is that the drug target mPGES-1 has been identified with the boswellic acids or synthetic derivatives as structures which lead to the inhibition of the activity of mPGES-1. Thus, the synthesis of PGE ₂ could be selectively inhibited, without inhibiting the synthesis of other (physiologically important) PGs, as hitherto by inhibitors of COX-1 and -2. As a result, the therapy of PGE ₂ -mediated diseases by means of boswellic acids or synthetic derivatives should have fewer side effects compared to COX-1/2 inhibitors.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass Boswelliasäuren bzw. synthetischer Derivate zusätzlich auch das Cathepsin G hemmen. Damit sind synergistische oder zumindest additive Effekte hinsichtlich der Therapie von entzündlich/degenerativen Erkrankungen und von Krebserkrankungen zu erwarten.One Another advantage of the present invention is that boswellic acids or synthetic derivatives in addition also inhibit cathepsin G. This is synergistic or at least additive effects with regard to the treatment of inflammatory / degenerative Diseases and cancers expected.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt darin, dass durch die Verwendung von Boswelliasäuren bzw. synthetischer Derivate der Einsatz bzw. die Dosis von Glukokortikoiden oder nicht-steroidalen Antiphlogistika (Cyclooxygenaseinhibitoren) reduziert und die Dauer der Einnahme verkürzt werden, die wegen ihrer unspezifischen Blockade der Synthese aller Prostaglandine (NSAIDs) bzw. genomischen Effekten (Glukokortikoiden) zu erheblichen Nebenwirkungen führen.One Another advantage of the invention is that through the use of boswellic acids or synthetic derivatives, the use or the dose of glucocorticoids or non-steroidal anti-inflammatory drugs (cyclooxygenase inhibitors) reduced and the duration of intake shortened because of their Non-specific blockade of the synthesis of all prostaglandins (NSAIDs) or genomic effects (glucocorticoids) to significant side effects to lead.

Die Erfindung kann genutzt werden, um alle Formen von Erkrankungen, die mit einer erhöhten Produktion von PGE₂ und/oder Cathepsin G Aktivität einhergehen, zu behandeln. Dabei handelt es sich primär um entzündliche Erkrankungen (v. a. rheumatoide Arthritis), fiebrige und schmerzhafte Zustände, sowie Krebserkrankungen, bei denen PGE₂ eine Rolle spielt oder um Asthma, COPD, Emphyseme, Reperfusion Injury, und rheumatoide Arthritis bei denen Cathepsin G eine Rolle spielt.The invention can be used to treat all forms of diseases associated with increased production of PGE ₂ and / or cathepsin G activity. These are primarily inflammatory diseases (especially rheumatoid arthritis), feverish and painful conditions, as well as cancers in which PGE ₂ plays a role or asthma, COPD, emphysema, reperfusion injury, and rheumatoid arthritis in which cathepsin G plays a role ,

Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung werden nachstehend anhand der Ausführungsbeispiele mit Bezug auf die Zeichnungen beschrieben. In den Zeichnungen zeigen:Further Advantages, features and applications of the invention will be below with reference to the embodiments described with reference to the drawings. In the drawings show:

1: Biosyntheseweg des PGE₂ 1 : Biosynthetic pathway of PGE ₂

2: Konzentrations-Wirkungs-Kurven von 11-Keto-Boswelliasäure (A) und β-Boswelliasäure (B) bezüglich mPGES-1-Aktivität in mikrosomalen Fraktionen von Interleukin-1-stimulierten A549 Zellen. (Mittelwerte + Standardfehler, n = 4–6) 2 : Concentration-response curves of 11-keto-boswellic acid (A) and β-boswellic acid (B) for mPGES-1 activity in microsomal fractions of interleukin-1-stimulated A549 cells. (Mean + standard error, n = 4-6)

3: Konzentrations-Wirkungs-Kurven von 3-O-Acetyl-11-Keto-Boswelliasäure (A) und 3-O-Acetyl-β-Boswelliasäure (B) bezüglich mPGES-1-Aktivität in mikrosomalen Fraktionen von Interleukin-1-stimulierten A549 Zellen. (Mittelwerte + Standardfehler, n = 4–6) 3 : Concentration-response curves of 3-O-acetyl-11-keto-boswellic acid (A) and 3-O-acetyl-β-boswellic acid (B) for mPGES-1 activity in microsomal fractions of interleukin-1-stimulated A549 cells. (Mean + standard error, n = 4-6)

4: Konzentrations-Wirkungs-Kurven von 3-O-Oxaloyl-β-Boswelliasäure (A) und 3-O-Oxaloyl-11-Keto-Boswelliasäure (B) bezüglich mPGES-1-Aktivität in mikrosomalen Fraktionen von Interleukin-1-stimulierten A549 Zellen. (Mittelwerte + Standardfehler, n = 4) 4 : Concentration-response curves of 3-O-oxaloyl-β-boswellic acid (A) and 3-O-oxaloyl-11-keto-boswellic acid (B) for mPGES-1 activity in microsomal fractions of interleukin-1-stimulated A549 cells. (Mean values + standard error, n = 4)

5: Konzentrations-Wirkungs-Kurven von 3-O-Succinoyl-β-Boswelliasäure (A) und 3-O-Succinoyl-11-Keto-Boswelliasäure (B) bezüglich mPGES-1-Aktivität in mikrosomalen Fraktionen von Interleukin-1-stimulierten A549 Zellen. (Mittelwerte + Standardfehler, n = 4) 5 : Concentration-response curves of 3-O-succinoyl-β-boswellic acid (A) and 3-O-succinoyl-11-keto-boswellic acid (B) for mPGES-1 activity in microsomal fractions of interleukin-1-stimulated A549 cells. (Mean values + standard error, n = 4)

6: Hemmung der mPGES-1-vermittelten Synthese von PGE₂ (Prozentuale Aktivität gegenüber der Kontrolle mit DMSO als Solvent) in der mikrosomalen Fraktion von Interleukin-1-stimulierten A549 Zellen (Mittelwerte + Standardfehler, n = 2–3). 1 = DMSO; 2 = MK-886; 3 = 3-O-Glutaroyl-11-Keto-β-Boswelliasäure; 4 = 3-O-Carboxymethyl-11-Boswelliasäure; 5 = 11a-Hydroxy-β-Boswelliasäure; 6 = 3-O-Glutaroyl-β-Boswelliasäure. 6 : Inhibition of mPGES-1 mediated synthesis of PGE ₂ (percent activity versus control with DMSO as solvent) in the microsomal fraction of interleukin-1-stimulated A549 cells (mean + standard error, n = 2-3). 1 = DMSO; 2 = MK-886; 3 = 3-O-glutaroyl-11-keto-β-boswellic acid; 4 = 3-O-carboxymethyl-11-boswellic acid; 5 = 11a-hydroxy-β-boswellic acid; 6 = 3-O-glutaroyl-β-boswellic acid.

7: Hemmung der mPGES-1-vermittelten Synthese von PGE₂ in LPS-stimuliertem humanen Vollblut (Prozentuale Aktivität gegenüber der Kontrolle mit DMSO als Solvent; Mittelwert + Standardfehler, n = 3). 1 = Positivkontrolle (DMSO); 2 = 30 μM MK-886; 3 = 20 μM Indometacin; 4 = 10 μM 3-O-Acetly-11-Keto-Boswelliasäure; 5 = 10 μM 11-Keto-Boswelliasäure; 6 = 10 μM 3-O-Acetly-β-Boswelliasäure; 7 = 10 μM β-Boswelliasäure; 8 = 10 μM 3-O-Oxaloyl-β-Boswelliasäure; 9 = 10 μM 3-O-Oxaloyl-11-Keto-β-Boswelliasäure –. 7 : Inhibition of mPGES-1 mediated synthesis of PGE ₂ in LPS-stimulated human whole blood (percent activity versus control with DMSO as a solvent, mean + standard error, n = 3). 1 = positive control (DMSO); 2 = 30 μM MK-886; 3 = 20 μM indomethacin; 4 = 10 μM 3-O-acetyl-11-keto-boswellic acid; 5 = 10 μM 11-keto-boswellic acid; 6 = 10 μM 3-O-acetyl-β-boswellic acid; 7 = 10 μM β-boswellic acid; 8 = 10 μM 3-O-oxaloyl-β-boswellic acid; 9 = 10 μM 3-O-oxaloyl-11-keto-β-boswellic acid.

8: Hemmung des Cathepsin G (Prozentuale Aktivität gegenüber der Kontrolle mit DMSO als Solvent; Mittelwerte + Standardfehler, n = 3–4). 1 = Positivkontrolle (DMSO); 2 = 3-O-Acetyl-11-Keto-Boswelliasäure; 3 = Keto-Boswelliasäure; 4 = β-Boswelliasäure; 5 = 3-O-Acetyl-β-Boswelliasäure; 6 = 3-O-Glutaroyl-β-Boswelliasäure; 7 = 3-O-Glutaroyl-11-Keto-β-Boswelliasäure; 8 = 3-O-Succinoyl-β-Boswelliasäure; 9 = 3-O-Carboxymethyl-β-Boswelliasäure; 10 = 3-O-Oxaloyl-β-Boswelliasäure; 11 = 3-O-Galloyl-11-Keto-β-Boswelliasäure; 12 = 11α-Hydroxy-β-Boswelliasäure; 13 = 11 β-Hydroxy-β-Boswelliasäure; 14 = Cis-Diol-β-Boswelliasäure; 15 = α-Boswelliasäure. Alle Substanzen wurden bei einer Konzentration von 10 μM eingesetzt. 8th : Inhibition of cathepsin G (percent activity versus control with DMSO as solvent; means + standard error, n = 3-4). 1 = positive control (DMSO); 2 = 3-O-acetyl-11-keto-boswellic acid; 3 = keto-boswellic acid; 4 = β-boswellic acid; 5 = 3-O-acetyl-β-boswellic acid; 6 = 3-O-glutaroyl-β-boswellic acid; 7 = 3-O-glutaroyl-11-keto-β-boswellic acid; 8 = 3-O-succinoyl-β-boswellic acid; 9 = 3-O-carboxymethyl-β-boswellic acid; 10 = 3-O-oxaloyl-β-boswellic acid; 11 = 3-O-galloyl-11-keto-β-boswellic acid; 12 = 11α-hydroxy-β-boswellic acid; 13 = 11 β-hydroxy-β-boswellic acid; 14 = cis-diol-β-boswellic acid; 15 = α-boswellic acid. All substances were used at a concentration of 10 μM.

9: Hemmung der fMLP-induzierten Neutrophilenmigration durch Matrigel (Prozentuale Aktivität gegenüber der Kontrolle (fMLP und DMSO als Solvent); Mittelwerte + Standardfehler, n = 3–4). 1 = Negativkontrolle; 2 = DMSO; 3 = synthetischer Cathepsin G Inhibitor (JNJ-10311795); 4 = 3-O-Acetyl-β-Boswelliasäure; 5 = 3-O-Acetyl-11-Keto-Boswelliasäure. 9 : Inhibition of fMLP-induced neutrophil migration by Matrigel (percent control activity (fMLP and DMSO as solvent): mean + standard error, n = 3-4). 1 = negative control; 2 = DMSO; 3 = synthetic cathepsin G inhibitor (JNJ-10311795); 4 = 3-O-acetyl-β-boswellic acid; 5 = 3-O-acetyl-11-keto-boswellic acid.

Ausführungsbeispieleembodiments

Synthetische Darstellung der BoswelliasäurederivateSynthetic representation of the Boswelliasäurederivate

3-O-Oxaloyl-β-BA3-O-β-BA-Oxaloyl

150 mg β-BA (0,33 mmol) werden in 3,3 ml absolutem THF gelöst und langsam zu 288 μl Oxalylchlorid (3,3 mmol) getropft. Man rührt 30 min. bei Raumtemperatur und gießt anschließend auf 50 ml Eiswasser. Die wässerige Phase wird dreimal mit je 20 ml Diethylether ausgeschüttelt. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser und gesättigter NaCl-Lösung neutral gewaschen. Trocknung mit MgSO₄ und entfernen des Lösungsmittels im Vakuum liefert 140 mg (79%) reine Oxalyl-β-BA.150 mg of β-BA (0.33 mmol) are dissolved in 3.3 ml of absolute THF and slowly added dropwise to 288 μl of oxalyl chloride (3.3 mmol). It is stirred for 30 min. at room temperature and then poured onto 50 ml of ice water. The aqueous phase is shaken out three times with 20 ml of diethyl ether. The combined organic phases are washed neutral with water and saturated NaCl solution. Drying with MgSO ₄ and removal of the solvent in vacuo yields 140 mg (79%) of pure oxalyl-β-BA.

3-O-Oxaloyl-β-KBA3-O-β-Oxaloyl-KBA

250 mg β-KBA (0,53 mmol) werden in 5,3 ml absolutem THF gelöst und langsam zu 463 μl Oxalylchlorid (5,3 mmol) getropft. Man rührt 30 min. bei Raumtemperatur und gießt anschließend auf 50 ml Eiswasser. Die wässerige Phase wird dreimal mit je 20 ml Diethylether ausgeschüttelt. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser und gesättigter NaCl-Lösung neutral gewaschen. Trocknung mit MgSO₄ und entfernen des Lösungsmittels im Vakuum liefert 263 mg (91%) reine Oxalyl-β-KBA.250 mg of β-KBA (0.53 mmol) are dissolved in 5.3 ml of absolute THF and slowly added dropwise to 463 μl of oxalyl chloride (5.3 mmol). It is stirred for 30 min. at room temperature and then poured onto 50 ml of ice water. The aqueous phase is shaken out three times with 20 ml of diethyl ether. The combined organic phases are washed neutral with water and saturated NaCl solution. Drying with MgSO ₄ and removal of the solvent in vacuo yields 263 mg (91%) of pure oxalyl-β-KBA.

3-O-Succinoyl-β-BA3-O-succinoyl-β-BA

100 mg β-BA (0,22 mmol) werden in 2,2 ml absolutem Pyridin gelöst. Man gibt 220 mg Bernsteinsäureanhydrid (2,2 mmol) und 32,6 mg 4-Pyrrolidinopyridin (0,22 mmol) zu und erhitzt 7 Stunden am Rückfluss. Nach dem Abkühlen verdünnt man mit 20 ml Diethylether und wäscht dreimal mit je 10 ml 1 N HCl. Die organische Phase wird mit Wasser und gesättigter NaCl-Lösung neutral gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der bräunliche Rückstand an Kieselgel chromatograohiert (Pentan/Diethylether 2:1 v/v + 1% Essigsäure). Ausbeute: 87 mg (73%).100 mg of β-BA (0.22 mmol) are dissolved in 2.2 ml of absolute pyridine. 220 mg of succinic anhydride (2.2 mmol) and 32.6 mg of 4-pyrrolidinopyridine (0.22 mmol) are added and the mixture is refluxed for 7 hours. After cooling, it is diluted with 20 ml of diethyl ether and washed three times with 10 ml of 1 N HCl. The organic phase is washed neutral with water and saturated NaCl solution and dried over MgSO ₄ . The solvent is removed in vacuo and the brownish residue chromatographed on silica gel (pentane / diethyl ether 2: 1 v / v + 1% acetic acid). Yield: 87 mg (73%).

3-O-Succinoyl-β-KBA3-O-succinoyl-β-KBA

100 mg β-KBA (0,21 mmol) werden in 2,1 ml absolutem Pyridin gelöst. Man gibt 210 mg Bernsteinsäureanhydrid (2,1 mmol) und 31,1 mg 4-Pyrrolidinopyridin (0,21 mmol) zu und erhitzt 7 Stunden am Rückfluss. Nach dem Abkühlen verdünnt man mit 20 ml Diethylether und wäscht dreimal mit je 10 ml 1 N HCl. Die organische Phase wird mit Wasser und gesättigter NaCl-Lösung neutral gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der bräunliche Rückstand an Kieselgel chromatograohiert (Pentan/Diethylether 2:1 v/v + 1% Essigsäure). Ausbeute: 88 mg (71%).100 mg of β-KBA (0.21 mmol) are dissolved in 2.1 ml of absolute pyridine. 210 mg of succinic anhydride (2.1 mmol) and 31.1 mg of 4-pyrrolidinopyridine (0.21 mmol) are added and the mixture is refluxed for 7 hours. After cooling, it is diluted with 20 ml of diethyl ether and washed three times with 10 ml of 1 N HCl. The organic phase is washed neutral with water and saturated NaCl solution and dried over MgSO ₄ . The solvent is removed in vacuo and the brownish residue chromatographed on silica gel (pentane / diethyl ether 2: 1 v / v + 1% acetic acid). Yield: 88 mg (71%).

3-O-Glutaroyl-β-BA3-O-β-glutaroyl-BA

742 mg β-BA (1,6 mmol) werden in 16 ml absolutem Pyridin gelöst. Man gibt 1,83 g Glutarsäureanhydrid (16 mmol) zu und 237 mg 4-Pyrrolidinopyridin (1,6 mmol) und kocht 7 Stunden lang am Rückfluss. Nach dem Abkühlen wird die Reaktionsmischung mit 150 ml Diethylether verdünnt und dreimal mit je 100 ml 1 N HCl gewaschen. Die organische Phase wird mit Wasser und gesättigter NaCl-Lösung neutral gewaschen und mit MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wird an Kieselgel chromatographiert (Pentan/Diethylether 2:1 v/v + 1% Essigsäure). Ausbeute: 694 mg (75%).Dissolve 742 mg of β-BA (1.6 mmol) in 16 ml of absolute pyridine. 1.83 g of glutaric anhydride (16 mmol) are added and 237 mg of 4-pyrrolidinopyridine (1.6 mmol) are refluxed for 7 hours. After cooling, the reaction mixture is diluted with 150 ml of diethyl ether and washed three times with 100 ml of 1 N HCl. The organic phase is washed neutral with water and saturated NaCl solution and dried with MgSO ₄ . After removal of the solvent in vacuo is chromatographed on silica gel (pentane / diethyl ether 2: 1 v / v + 1% acetic acid). Yield: 694 mg (75%).

3-O-Glutaroyl-β-KBA3-O-β-glutaroyl-KBA

607 mg β-KBA (1,3 mmol) werden in 13 ml absolutem Pyridin gelöst. Man gibt 1,49 g Glutarsäureanhydrid (13 mmol) zu und 193 mg 4-Pyrrolidinopyridin (1,3 mmol) und kocht 7 Stunden lang am Rückfluss. Nach dem Abkühlen wird die Reaktionsmischung mit 150 ml Diethylether verdünnt und dreimal mit je 100 ml 1 N HCl gewaschen. Die organische Phase wird mit Wasser und gesättigter NaCl-Lösung neutral gewaschen und mit MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wird an Kieselgel chromatographiert (Pentan/Diethylether 2:1 v/v + 1% Essigsäure). Ausbeute: 570 mg (75%).607 mg of β-KBA (1.3 mmol) are dissolved in 13 ml of absolute pyridine. Add 1.49 g of glutaric anhydride (13 mmol) and 193 mg of 4-pyrrolidinopyridine (1.3 mmol) and reflux for 7 hours. After cooling, the reaction mixture is diluted with 150 ml of diethyl ether and washed three times with 100 ml of 1 N HCl. The organic phase is washed neutral with water and saturated NaCl solution and dried with MgSO ₄ . After removal of the solvent in vacuo is chromatographed on silica gel (pentane / diethyl ether 2: 1 v / v + 1% acetic acid). Yield: 570 mg (75%).

3-O-Carboxymethyl-β-BA3-O-carboxymethyl-β-BA

256 mg 60%ige NaH-Dispersion in Paraffinöl (entsprechend 6,4 mmol NaH) werden mit 3 ml absolutem THF gewaschen und anschließend mit 3 ml absolutem THF dispergiert. Unter heftigem Rühren tropft man dazu eine Lösung von 300 mg β-BA (0,66 mmol) in 2 ml THF und tropft anschließend eine Lösung von 242 mg Chloressigsäure (2,56 mmol) in 1,6 ml THF zu. Danach wird über Nacht am Rückfluss gekocht. Nach dem Abkühlen wird vorsichtig mit 1 N HCl bis zu einem pH-Wert von 2–3 angesäuert. Die wässerige Phase wird dreimal mit je 30 ml Diethylether ausgeschüttelt. Die vereinigten organischen Extrakte werden mit Wasser und gesättigter NaCl-Lösung neutral gewaschen und mit MgSO₄ getrocknet. Nach entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wird an Kieselgel chromatographiert (Dichlormathan/Methanol 15:1 v/v). Ausbeute 119 mg (35%).256 mg of 60% NaH dispersion in paraffin oil (corresponding to 6.4 mmol of NaH) are washed with 3 ml of absolute THF and then dispersed with 3 ml of absolute THF. With vigorous stirring, a solution of 300 mg of β-BA (0.66 mmol) in 2 ml of THF is added dropwise thereto, followed by the dropwise addition of a solution of 242 mg of chloroacetic acid (2.56 mmol) in 1.6 ml of THF. Then it is cooked overnight at reflux. After cooling, it is carefully acidified with 1 N HCl to a pH of 2-3. The aqueous phase is shaken out three times with 30 ml of diethyl ether. The combined organic extracts are washed neutral with water and saturated NaCl solution and dried with MgSO ₄ . After removal of the solvent in vacuo is chromatographed on silica gel (dichloromethane / methanol 15: 1 v / v). Yield 119 mg (35%).

3-O-Carboxymethyl-β-KBA3-O-carboxymethyl-β-KBA

256 mg 60%ige NaH-Dispersion in Paraffinöl (entsprechend 6,4 mmol NaH) werden mit 3 ml absolutem THF gewaschen und anschließend mit 3 ml absolutem THF dispergiert. Unter heftigem Rühren tropft man dazu eine Lösung von 300 mg β-KBA (0,64 mmol) in 2 ml THF und tropft anschließend eine Lösung von 242 mg Chloressigsäure (2,56 mmol) in 1,6 ml THF zu. Danach wird über Nacht am Rückfluss gekocht. Nach dem Abkühlen wird vorsichtig mit 1 N HCl bis zu einem pH-Wert von 2–3 angesäuert. Die wässerige Phase wird dreimal mit je 30 ml Diethylether ausgeschüttelt. Die vereinigten organischen Extrakte werden mit Wasser und gesättigter NaCl-Lösung neutral gewaschen und mit MgSO₄ getrocknet. Nach entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wird an Kieselgel chromatographiert (Dichlormathan/Methanol 15:1 v/v). Ausbeute 206 mg (49%).256 mg of 60% NaH dispersion in paraffin oil (corresponding to 6.4 mmol of NaH) are washed with 3 ml of absolute THF and then dispersed with 3 ml of absolute THF. With vigorous stirring, a solution of 300 mg of β-KBA (0.64 mmol) in 2 ml of THF is added dropwise, followed by the dropwise addition of a solution of 242 mg of chloroacetic acid (2.56 mmol) in 1.6 ml of THF. Then it is cooked overnight at reflux. After cooling, it is carefully acidified with 1 N HCl to a pH of 2-3. The aqueous phase is shaken out three times with 30 ml of diethyl ether. The combined organic extracts are washed neutral with water and saturated NaCl solution and dried with MgSO ₄ . After removal of the solvent in vacuo is chromatographed on silica gel (dichloromethane / methanol 15: 1 v / v). Yield 206 mg (49%).

2α-Hydroxy-β-BA (Diol)2α-hydroxy-β-BA (diol)

1,01 g β-BA (2,22 mmol) werden in 14 ml absolutem Pyridin auf –18°C (Eis/Kochsalz) gelöst. Unter heftigem Rühren werden langsam 740 μl Trifluormethansulfonsäureanhydrid (4,44 mmol) zugetropft. Man rührt weitere 45 min. bei dieser Temperatur und tropft danach noch mal 740 μl Trifluormethansulfonsäureanhydrid zu. Man lässt über Nacht auftauen, versetzt die braune Reaktionsmischung mit 100 ml Diethylether und säuert mit 1 N HCl bis zu einem pH-Wert von 2–3 an. Die organische Phase wird abgetrennt und die wässerige Phase wird mit 100 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser und gesättigter Kochsalzlösung neutral gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand wird in 23 ml Dioxan aufgenommen und mit 2,26 ml 5 N NaOH (11,3 mmol) versetzt und 90 min. lang zum Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen säuert man mit 1 N HCl an (pH 2–3) und extrahiert dreimal mit je 50 ml Diethylether. Die vereinigten organischen Extrakte werden mit Wasser und gesättigter Kochsalzlösung neutral gewaschen, mit MgSO₄ getrocknet und im Vakuum einrotiert. Der erhaltene bräunlich-gelbe Rückstand wird an Kieselgel chromatographisch gereinigt (Pentan/Diethylether 10:1 v/v + 1% Essigsäure). Ausbeute: 538 mg (55%) an 2,3-Dehydro-β-BA.1.01 g of β-BA (2.22 mmol) are dissolved in 14 ml of absolute pyridine at -18 ° C (ice / brine). With vigorous stirring, 740 μl of trifluoromethanesulfonic anhydride (4.44 mmol) are slowly added dropwise. It is stirred for another 45 min. at this temperature and then added dropwise to another 740 ul trifluoromethanesulfonic anhydride. It is allowed to thaw overnight, the brown reaction mixture is mixed with 100 ml of diethyl ether and acidified with 1 N HCl to a pH of 2-3. The organic phase is separated and the aqueous phase is extracted with 100 ml of diethyl ether. The combined organic phases are washed neutral with water and saturated brine and dried over MgSO ₄ . The solvent is removed in vacuo and the residue is taken up in 23 ml of dioxane and treated with 2.26 ml of 5 N NaOH (11.3 mmol) and 90 min. heated to reflux for a long time. After cooling, the mixture is acidified with 1 N HCl (pH 2-3) and extracted three times with 50 ml of diethyl ether. The combined organic extracts are washed neutral with water and saturated brine, dried with MgSO ₄ and evaporated in vacuo. The resulting brownish-yellow residue is purified by chromatography on silica gel (pentane / diethyl ether 10: 1 v / v + 1% acetic acid). Yield: 538 mg (55%) of 2,3-dehydro-β-BA.

100 mg 2,3-Dehydro-β-BA (0,23 mmol) werden zusammen mit 318 mg K₂CO₃ in 7 ml einer Mischung aus tBuOH und Wasser (1:1 v/v) gelöst. Man gibt 25,8 mg DABCO (0,23 mmol) und 757 mg K₃[Fe(CN)₆] (2,3 mmol) zu und versetzt die erhaltene gelbe Lösung mit 72 μl einer 4%igen OsO₄-Lösung in Wasser (12 μmol). Man erwärmt über Nacht auf 40°C. Nach dem Abkühlen gibt man 697 mg festes Na₂SO₃ (5,75 mmol) zu und rührt 90 min bei RT. Man versetzt mit 1 N HCl bis pH 5 und schüttelt dreimal mit je 20 ml Diethylether aus. Die vereinigten organischen Extrakte werden mit MgSO₄ getrocknet und im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wird durch Flashchromatographie gereinigt (Kieselgel, Pentan/Diethylether 1:2 v/v + 1% Essigsäure). Ausbeute: 77,5 mg (70%) an 2α-Hydroxy-β-BA.100 mg of 2,3-dehydro-β-BA (0.23 mmol) are combined with 318 mg K ₂ CO ₃ in 7 ml of a mixture dissolved from tBuOH and water (1: 1 v / v). 25.8 mg of DABCO (0.23 mmol) and 757 mg of K ₃ [Fe (CN) ₆ ] (2.3 mmol) are added, and the resulting yellow solution is admixed with 72 μl of a 4% OsO ₄ solution Water (12 μmol). It is heated to 40 ° C overnight. After cooling, 697 mg of solid Na ₂ SO ₃ (5.75 mmol) are added and the mixture is stirred at RT for 90 min. It is mixed with 1 N HCl to pH 5 and shaken three times with 20 ml of diethyl ether. The combined organic extracts are dried with MgSO ₄ and freed from the solvent in vacuo. The residue is purified by flash chromatography (silica gel, pentane / diethyl ether 1: 2 v / v + 1% acetic acid). Yield: 77.5 mg (70%) of 2α-hydroxy-β-BA.

2α-Hydroxy-β-KBA (Diol)2α-hydroxy-β-KBA (diol)

750 mg β-KBA (1,60 mmol) werden in 10 ml absolutem Pyridin auf –18°C (Eis/Kochsalz) gelöst. Unter heftigem Rühren werden langsam 532 μl Trifluormethansulfonsäureanhydrid (3,20 mmol) zugetropft. Man rührt weitere 45 min. bei dieser Temperatur und tropft danach noch mal 532 μl Trifluormethansulfonsäureanhydrid zu. Man lässt über Nacht auftauen, versetzt die braune Reaktionsmischung mit 100 ml Diethylether und säuert mit 1 N HCl bis zu einem pH-Wert von 2–3 an. Die organische Phase wird abgetrennt und die wässerige Phase wird mit 100 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser und gesättigter Kochsalzlösung neutral gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand wird in 16 ml Dioxan aufgenommen und mit 1,65 ml 5 N NaOH (8,1 mmol) versetzt und 90 min. lang zum Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen säuert man mit 1 N HCl an (pH 2–3) und extrahiert dreimal mit je 50 ml Diethylether. Die vereinigten organischen Extrakte werden mit Wasser und gesättigter Kochsalzlösung neutral gewaschen, mit MgSO₄ getrocknet und im Vakuum einrotiert. Der erhaltene bräunlich-gelbe Rückstand wird an Kieselgel chromatographisch gereinigt (Pentan/Diethylether 4:1 v/v + 1% Essigsäure). Ausbeute: 446 mg (62%) an 2,3-Dehydro-β-KBA.750 mg of β-KBA (1.60 mmol) are dissolved in 10 ml of absolute pyridine at -18 ° C (ice / brine). While stirring vigorously, 532 μl of trifluoromethanesulfonic anhydride (3.20 mmol) are slowly added dropwise. It is stirred for another 45 min. at this temperature and then added dropwise to another 532 ul trifluoromethanesulfonic anhydride. It is allowed to thaw overnight, the brown reaction mixture is mixed with 100 ml of diethyl ether and acidified with 1 N HCl to a pH of 2-3. The organic phase is separated and the aqueous phase is extracted with 100 ml of diethyl ether. The combined organic phases are washed neutral with water and saturated brine and dried over MgSO ₄ . The solvent is removed in vacuo and the residue is taken up in 16 ml of dioxane and treated with 1.65 ml of 5 N NaOH (8.1 mmol) and 90 min. heated to reflux for a long time. After cooling, the mixture is acidified with 1 N HCl (pH 2-3) and extracted three times with 50 ml of diethyl ether. The combined organic extracts are washed neutral with water and saturated brine, dried with MgSO ₄ and evaporated in vacuo. The resulting brownish-yellow residue is purified by chromatography on silica gel (pentane / diethyl ether 4: 1 v / v + 1% acetic acid). Yield: 446 mg (62%) of 2,3-dehydro-β-KBA.

150 mg 2,3-Dehydro-β-KBA (0,33 mmol) werden zusammen mit 458 mg K₂CO₃ in 10,0 ml einer Mischung aus tBuOH und Wasser (1:1 v/v) gelöst. Man gibt 37,2 mg DABCO (0,33 mmol) und 1,09 g K₃[Fe(CN)₆] (3,3 mmol) zu und versetzt die erhaltene gelbe Lösung mit 104 μl einer 4%igen OsO₄-Lösung in Wasser (17 μmol). Man erwärmt über Nacht auf 40°C. Nach dem Abkühlen gibt man 1,0 g festes Na₂SO₃ (8,3 mmol) zu und rührt 90 min bei RT. Man versetzt mit 1 N HCl bis pH 5 und schüttelt dreimal mit je 20 ml Diethylether aus. Die vereinigten organischen Extrakte werden mit MgSO₄ getrocknet und im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wird durch Flashchromatographie gereinigt (Kieselgel, Pentan/Diethylether 1:5 v/v + 1% Essigsäure). Ausbeute: 151,0 mg (91%) an 2α-Hydroxy-β-KBA.150 mg of 2,3-dehydro-β-KBA (0.33 mmol) are dissolved together with 458 mg K ₂ CO ₃ in 10.0 ml of a mixture of tBuOH and water (1: 1 v / v). 37.2 mg of DABCO (0.33 mmol) and 1.09 g of K ₃ [Fe (CN) ₆ ] (3.3 mmol) are added, and the resulting yellow solution is mixed with 104 μl of a 4% OsO ₄ . Solution in water (17 μmol). It is heated to 40 ° C overnight. After cooling, 1.0 g of solid Na ₂ SO ₃ (8.3 mmol) are added and the mixture is stirred at RT for 90 min. It is mixed with 1 N HCl to pH 5 and shaken three times with 20 ml of diethyl ether. The combined organic extracts are dried with MgSO ₄ and freed from the solvent in vacuo. The residue is purified by flash chromatography (silica gel, pentane / diethyl ether 1: 5 v / v + 1% acetic acid). Yield: 151.0 mg (91%) of 2α-hydroxy-β-KBA.

11α-Hydroxy-β-BA und 11β-Hydroxy-β-BA (Allylalkohole)11α-hydroxy-β-BA and 11β-hydroxy-β-BA (allyl alcohols)

121 mg NaBH₄ (3,2 mmol) werden in 3,5 ml absolutem Diglyme gelöst. Man gibt 278 mg LiBr (3,2 mmol) zu und rührt 30 min bei RT und gibt dann 300 mg β-KBA (0,64 mmol) und erhitzt 1 h zu Sieden. Nach dem Abkühlen wird mit 5 ml Eiswasser verdünnt, man gibt 10 ml Diethylether zu und säuert mit 1 N HCl bis pH 4 an. Man trennt die organische Phase ab und extrahiert die wässerige Phase noch zweimal mit je 20 ml Diethylether. Die vereinigten organischen Extrakte werden mit Wasser und gesättigter Kochsalzlösung neutral gewaschen und mit MgSO₄ getrocknet. Man entfernt das Lösungsmittel im Vakuum (Wasserbad des Rotationsverdampfers max. 25°C), wobei nicht ganz zur Trockene eingeengt wird, um eine Eliminierung der 11-OH-Gruppe zum Dien zu vermeiden! Das erhaltene Rohprodukt wird durch Flashchromatographie an Kieselgel gereinigt (Pentan/Diethylether 1:1 + 0,1% Essigsäure).
Ausbeute: 83,1 mg 11α-Hydroxy-β-BA und 141 mg 11β-Hydroxy-β-BA (insges. 73%).121 mg of NaBH ₄ (3.2 mmol) are dissolved in 3.5 ml of absolute diglyme. 278 mg of LiBr (3.2 mmol) are added and the mixture is stirred at RT for 30 min and then 300 mg of β-KBA (0.64 mmol) are added and the mixture is boiled for 1 h. After cooling, it is diluted with 5 ml of ice-water, 10 ml of diethyl ether are added and the mixture is acidified to pH 4 with 1N HCl. The organic phase is separated off and the aqueous phase extracted twice more with 20 ml of diethyl ether. The combined organic extracts are washed neutral with water and saturated brine and dried with MgSO ₄ . The solvent is removed in vacuo (water bath of the rotary evaporator not more than 25 ° C), which is not completely evaporated to dryness, to avoid elimination of the 11-OH group to the diene! The crude product obtained is purified by flash chromatography on silica gel (pentane / diethyl ether 1: 1 + 0.1% acetic acid).
Yield: 83.1 mg of 11α-hydroxy-β-BA and 141 mg of 11β-hydroxy-β-BA (total 73%).

3-O-Galloyl-β-BA3-O-galloyl-β-BA

Zu einer Suspension aus 980 mg Gallulssäuretribenzylether (2,22 mmol) in 15 ml absolutem Dichlormethan und 15 μl absolutem DMF werden 250 μl Oxalylchlorid (2,5 mmol) getropft. Man rührt 2 h bei RT und entfernt danach das Lösungsmittel im Vakuum und trocknet das erhaltene Säurechlorid noch 1 h im Vakuum. Anschließend gibt man 55 mg DMAP (0,45 mmol) zu und tropft eine Lösung von 205 mg β-BA (0,45 mmol) in 9 ml absolutem Pyridin zu. Man rührt 2 Tage bei RT, gibt dann 0,3 ml Wasser zu und rührt nochmals 2 h bei RT. Man versetzt mit 150 ml 1 N HCl und extrahiert die Mischung dreimal mit je 70 ml Dichlormethan. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser und gesättigter NaCl-Lösung neutral gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wird mittels Flashchromatographie gereinigt (Pentan/Diethylether 4:1 + 1% Essigsäure).
Ausbeute: 184 mg (47%) 3-O-(Tri-O-benzylgalloyl)-β-BA250 μl of oxalyl chloride (2.5 mmol) are added dropwise to a suspension of 980 mg of gallic acid tribenzyl ether (2.22 mmol) in 15 ml of absolute dichloromethane and 15 μl of absolute DMF. The mixture is stirred for 2 h at RT and then the solvent is removed in vacuo and the resulting acid chloride is dried for a further 1 h in vacuo. Then 55 mg of DMAP (0.45 mmol) are added dropwise and a solution of 205 mg of β-BA (0.45 mmol) in 9 ml of absolute pyridine is added dropwise. The mixture is stirred at RT for 2 days, then 0.3 ml of water are added and stirring is continued for 2 h at RT. 150 ml of 1 N HCl are added and the mixture is extracted three times with 70 ml of dichloromethane each time. The combined extracts are washed neutral with water and saturated NaCl solution and dried over MgSO ₄ . After removal of the solvent in vacuo is purified by flash chromatography (pentane / diethyl ether 4: 1 + 1% acetic acid).
Yield: 184 mg (47%) of 3-O- (tri-O-benzylgalloyl) -β-BA

128 mg 3-O-(Tri-O-benzylgalloyl)-β-BA (0,15 mmol) werden in 6 ml THF gelöst. Nach Zugabe von 30 mg Pd/C (10%ig) wird 3 h bei Atmosphärendruck hydriert. Man filtriert über Celite und entfernt das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum. Reinigung durch Flashchromatographie an Kieslgel (Pentan/Diethylether 1:1 v/v + 1% Essigsäure). Ausbeute: 81,1 mg 3-O-Galloyl-β-BA (87%).128 mg of 3-O- (tri-O-benzylgalloyl) -β-BA (0.15 mmol) are dissolved in 6 ml of THF. After adding 30 mg Pd / C (10%) is hydrogenated for 3 h at atmospheric pressure. The mixture is filtered through Celite and the solvent is removed in vacuo on a rotary evaporator. Purification by flash chromatography on silica gel (pentane / diethyl ether 1: 1 v / v + 1% acetic acid). Yield: 81.1 mg of 3-O-galloyl-β-BA (87%).

3-O-Galloyl-β-KBA3-O-galloyl-β-KBA

Zu einer Suspension aus 1,394 g Gallulssäuretribenzylether (3,16 mmol) in 21 ml absolutem Dichlormethan und 21 μl absolutem DMF werden 356 μl Oxalylchlorid (3,56 mmol) getropft. Man rührt 2 h bei RT und entfernt danach das Lösungsmittel im Vakuum und trocknet das erhaltene Säurechlorid noch 1 h im Vakuum. Anschließend gibt man 78 mg DMAP (0,64 mmol) zu und tropft eine Lösung von 300 mg β-BA (0,64 mmol) in 12,8 ml absolutem Pyridin zu. Man rührt 2 Tage bei RT, gibt dann 0,5 ml Wasser zu und rührt nochmals 2 h bei RT. Man versetzt mit 200 ml 1 N HCl und extrahiert die Mischung dreimal mit je 70 ml Dichlormethan. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser und gesättigter NaCl-Lösung neutral gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wird mittels Flashchromatographie gereinigt (Pentan/Diethylether 4:1 + 1% Essigsäure).
Ausbeute: 426 mg (75%) 3-O-(Tri-O-benzylgalloyl)-β-KBA356 μl of oxalyl chloride (3.56 mmol) are added dropwise to a suspension of 1.364 g of gallulic acid tribenzyl ether (3.16 mmol) in 21 ml of absolute dichloromethane and 21 μl of absolute DMF. The mixture is stirred for 2 h at RT and then the solvent is removed in vacuo and the resulting acid chloride is dried for a further 1 h in vacuo. Then, 78 mg of DMAP (0.64 mmol) are added dropwise and a solution of 300 mg of β-BA (0.64 mmol) in 12.8 ml of absolute pyridine is added dropwise. The mixture is stirred for 2 days at RT, then 0.5 ml of water and stirred again for 2 h at RT. It is mixed with 200 ml of 1 N HCl and the mixture extracted three times with 70 ml of dichloromethane. The combined extracts are washed neutral with water and saturated NaCl solution and dried over MgSO ₄ . After removal of the solvent in vacuo is purified by flash chromatography (pentane / diethyl ether 4: 1 + 1% acetic acid).
Yield: 426 mg (75%) of 3-O- (tri-O-benzylgalloyl) -β-KBA

120 mg 3-O-(Tri-O-benzylgalloyl)-β-KBA (0,13 mmol) werden in 6 ml THF gelöst. Nach Zugabe von 30 mg Pd/C (10%ig) wird 3 h bei Atmosphärendruck hydriert. Man filtriert über Celite und entfernt das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum. Reinigung durch Flashchromatographie an Kieslgel (Pentan/Diethylether 1:1 v/v + 1% Essigsäure). Ausbeute: 66,2 mg 3-O-Galloyl-β-KBA (85%).120 mg of 3-O- (tri-O-benzylgalloyl) -β-KBA (0.13 mmol) are dissolved in 6 ml of THF. After addition of 30 mg Pd / C (10%) is at atmospheric pressure for 3 h hydrogenated. It is filtered over Celite and remove the solvent on a rotary evaporator in vacuo. Purification by flash chromatography on silica gel (pentane / diethyl ether 1: 1 v / v + 1% acetic acid). Yield: 66.2 mg of 3-O-galloyl-β-KBA (85%).

Einfluss von Boswelliasäuren und synthetischer Derivate auf die Aktivität der mPGES-1 in mikrosomaler Fraktion von A549 ZellenInfluence of boswellic acids and synthetic derivatives on the activity of mPGES-1 in microsomal Fraction of A549 cells

A549 Zellen wurden mit Interleukin-1 (1 ng/ml) für 72 Stunden inkubiert. Nach Ernte und Zellzahlbestimmung wurden die pelletierten Zellen auf Trockeneis/Ethanol schockgefroren, durch Zugabe von 1 ml Homogensisierungspuffer (4°C) wieder aufgetaut und mittels Ultraschall homogenisiert. Nach Zentrifugation 10.000 g für 10 min bei 4°C wurde der erhaltene Überstand bei 174.000 g und 4°C für 1 h Stunde zentrifugiert um Mitochondrien zu gewinnen. Das Pellet (Mitochondrien) wurde im Homogensierungspuffer gelöst und mit den Testsubstanzen (Boswelliasäuren bzw. DMSO) für 10 min bei 4°C in 96-well Platten vorinkubiert. Dann wurde PGH2 als Substrat zugegeben und die Reaktion nach 1 min bei 4°C mittels Stopplösung (enthält u. a. Fe²⁺, Citronensäure und 11-β-PGE₂ als Standard) beendet. Nach Festphasenextraktion (RP-18-Säulen und Aceton als Elutionsmittel) wurde die Probe mittels HPLC (RP-18, UV-Detektion bei 190 nm) analysiert.A549 cells were incubated with interleukin-1 (1 ng / ml) for 72 hours. After harvesting and cell count determination, the pelleted cells were flash-frozen on dry ice / ethanol, thawed again by addition of 1 ml of homogenization buffer (4 ° C.) and homogenized by means of ultrasound. After centrifuging 10,000 g for 10 min at 4 ° C, the resulting supernatant was centrifuged at 174,000 g and 4 ° C for 1 h hour to recover mitochondria. The pellet (mitochondria) was dissolved in the homogenization buffer and preincubated with the test substances (boswellic acids or DMSO) for 10 min at 4 ° C. in 96-well plates. Then PGH 2 was added as a substrate and the reaction after 1 min at 4 ° C by means of stop solution (contains, inter alia, Fe ²⁺ , citric acid and 11-β-PGE ₂ as standard) ended. After solid phase extraction (RP-18 columns and acetone as eluent), the sample was analyzed by HPLC (RP-18, UV detection at 190 nm).

Es zeigt sich, dass die Vorinkubation der mikrosomalen Fraktion von Interleukin-1-stimulierten A549 Zellen zu einer potenten Hemmung der mGPES-1 Aktivität führt, indem die natürlichen vorkommenden BAs (AKBA, KBA, β-BA oder Aβ-BA) und synthetische Derivate (Oxaloyl-BA, Oxaloyl-KBA, Succinoyl-BA, Succinoyl-KBA, Glutaroyl-BA, Galloyl-KBA und Carboxymethyl-BA) die PGE₂-Synthese aus PGH₂ mit IC₅₀ Werten zwischen ca. 0.03 und 20 μM konzentrationsabhängig hemmen (Tabelle 2, 2–5). Die potenteste Verbindung ist dabei die Oxaloyl-BA.It has been shown that preincubation of the microsomal fraction of interleukin-1-stimulated A549 cells results in potent inhibition of mGPES-1 activity by the naturally occurring BAs (AKBA, KBA, β-BA or Aβ-BA) and synthetic derivatives (Oxaloyl BA, oxaloyl-KBA, succinyl-BA, succinoyl-KBA, glutaroyl-BA, galloyl-KBA and carboxymethyl-BA) inhibit the PGE ₂ synthesis from PGH ₂ with IC ₅₀ values between about 0.03 and 20 μM in a concentration-dependent manner (Table 2, 2 - 5 ). The most potent compound is the oxaloyl BA.

Einfluss von Boswelliasäuren auf die Aktivität der mPGES-1 im humanen VollblutInfluence of boswellic acids on the activity the mPGES-1 in human whole blood

Venös entnommenes humanes peripheres Blut gesunder, erwachsener Spender, die 14 Tage vor Blutabnahme keine Medikamente zu sich nahmen, wurde in Heparinröhrchen (20 U/ml) gesammelt. Aliquote (0.8 ml) wurden mit Probenpuffer (10 mM Kaliumphosphat Puffer pH 7.4, 3 mM KCl, 140 mM NaCl und 6 mM D-Glucose) auf 1 ml gefüllt. Nach Vorbehandlung mit den Testsubstanzen (Boswelliasäuren und deren synthetische Derivate, Indometacin, MK-886 oder DMSO als Negativkontrolle) bei RT für 5 min, wurden die Proben mit LPS (10 μg/ml) für 5 hrs bei 37°C inkubiert. Die dabei stattfindende PGE₂ Bildung wurde abgestoppt (Eiskühlung), die Proben wurden zentrifugiert (2300 × g, 10 min, 4°C) und zum Überstand wurde Citronensäure (30 μl, 2 M) gegeben. Nach weiterer Zentrifugation (2300 × g, 10 min, 4°C), erfolgte die Festphasenextraktion und HPLC Analyse des PGE₂. Der PGE₂ Peak (3 ml), wurde durch die Koelution mit authentischem externen Standard festgelegt, das Eluat wurde gesammelt und Acetonitril unter einem Stickstoffstrom entfernt. Der pH wurde durch Zugabe von 10 × PBS buffer pH 7.2 (230 μl) auf 7.2 gestellt bevor der PGE₂ Gehalt mittels PGE₂ High Sensitivity EIA Kit (Assay Designs, Michigan, MI) nach Angaben des Herstellers bestimmt wurde.Venous human peripheral blood taken from healthy, adult donors who did not take any medication for 14 days before taking blood was collected in heparin tubes (20 U / ml). Aliquots (0.8 ml) were filled to 1 ml with sample buffer (10 mM potassium phosphate buffer pH 7.4, 3 mM KCl, 140 mM NaCl and 6 mM D-glucose). After pretreatment with the test substances (boswellic acids and their synthetic derivatives, indomethacin, MK-886 or DMSO as negative control) at RT for 5 min, the samples were incubated with LPS (10 μg / ml) for 5 hrs at 37 ° C. The resulting PGE ₂ formation was stopped (ice cooling), the samples were centrifuged (2300 x g, 10 min, 4 ° C) and to the supernatant was added citric acid (30 μl, 2 M). After further centrifugation (2300 × g, 10 min, 4 ° C), the solid phase extraction and HPLC analysis of PGE _{2 was carried out} . The PGE ₂ peak (3 ml) was determined by coelution with authentic external standard, the eluate was collected and acetonitrile removed under a stream of nitrogen. The pH was adjusted to 7.2 by addition of 10x PBS buffer pH 7.2 (230 μl) before the PGE ₂ content was determined by PGE ₂ High Sensitivity EIA Kit (Assay Designs, Michigan, MI) according to the manufacturer's instructions.

Auch im Vollblut ist eine deutliche Hemmung der PGE₂ Bildung durch natürlich vorkommende BAs (KBA, β-BA oder Aβ-BA) und durch synthetische Derivate (Oxaloyl-BA, Oxaloyl-KBA) erkennbar (7). β-BA und Oxaloyl-KBA sind hierbei die potentesten Verbindungen und hemmen bei einer Konz. von 10 μM zu fast 50%.Clear inhibition of PGE ₂ formation by naturally occurring BAs (KBA, β-BA or Aβ-BA) and by synthetic derivatives (oxaloyl BA, oxaloyl KBA) is also evident in whole blood ( 7 ). β-BA and oxaloyl-KBA are the most potent compounds and almost inhibit at a concentration of 10 μM 50%.

Höhere Konz. (100 μM) an BAs oder synthetischer Derivate führen zu keiner nennenswerten Steigerung der Hemmung. Für die 50%-ige Hemmung der PGE₂ Synthese durch MK-886 sind mehr als 30 μM Substanz notwendig sind und der COX Inhibitor Indometacin hemmt bereits bei einer Konz. von 20 μM zu fast 50%, das heißt, 10 μM β-BA oder auch Oxaloyl-KBA führen nahezu zur gleichen Hemmung wie 20 μM Indometacin und sind zusammenfassend potenter als MK-886.Higher concentrations (100 μM) of BAs or synthetic derivatives lead to no appreciable increase in inhibition. For the 50% inhibition of PGE ₂ synthesis by MK-886 more than 30 μM substance are necessary and the COX inhibitor indomethacin inhibits already at a conc of 20 uM to almost 50%, that is, 10 uM β-BA or oxaloyl-KBA cause almost the same inhibition as 20 μM indomethacin and are collectively more potent than MK-886.

Einfluss von Boswelliasäuren und synthetischer Derivate auf die Aktivität des humanen Cathepsin GInfluence of boswellic acids and synthetic derivatives on the activity of human cathepsin G

Zur Analyse von rohem Cathepsin G wurde das Enzym frisch aus menschlichen Neutrophilen präpariert. Dazu wurden 2,5 × 10⁷ Neutrophile/ml mit 10 μM Cytochalasin B und 2,5 μM fMLP für 5 min bei 37°C stimuliert. Nach Zentrifugation bei 1200 × g für 5 min bei 4°C wurde der resultierende Überstand (enthält ca. 10 μg Cathepsin G/ml) sofort für die Cathepsin G-Aktivitätbestimmung verwendet. Für die Analyse von vollständig gereinigtem Cathepsin G, wurde das Enzym aus menschlichen Neutrophilen aufegreinigt (Elastin-Sepharose, und schwacher Kationenaustauscher). Das Testsystem setzt sich aus Cathepsin G (20 μl Überstand mit ca. 0.2 μg Cathepsin G) oder alternativ 0.2 μg gereinigtes Enzym, jeweils in 200 μl HEPES 0.1 M, NaCl 0.5 M, pH 7.4, 10% DMSO verdünnt. Als Substrat für Cathepsin G wird das N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Suc-AAPF-pNA) (1 mM) verwendet. Die Absorption, verursacht durch freies p-Nitrophenol, wurde bei 410 nm und 25°C gemessen.For the analysis of crude cathepsin G, the enzyme was freshly prepared from human neutrophils. For this purpose, 2.5 × 10 ⁷ neutrophils / ml were stimulated with 10 μM cytochalasin B and 2.5 μM fMLP for 5 min at 37 ° C. After centrifugation at 1200 x g for 5 min at 4 ° C, the resulting supernatant (containing ca. 10 μg cathepsin G / ml) was used immediately for cathepsin G activity determination. For the analysis of fully purified cathepsin G, the enzyme was purified from human neutrophils (elastin-sepharose, and weak cation exchanger). The test system consists of cathepsin G (20 μl supernatant with about 0.2 μg of cathepsin G) or alternatively 0.2 μg of purified enzyme, each diluted in 200 μl HEPES 0.1 M, NaCl 0.5 M, pH 7.4, 10% DMSO. The substrate for cathepsin G is N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Suc-AAPF-pNA) (1 mM). The absorption caused by free p-nitrophenol was measured at 410 nm and 25 ° C.

Die Untersuchungen zeigen, dass die natürlich vorkommenden BAs (AKBA, KBA, β-BA oder Aβ-BA) und synthetische Derivate (Oxaloyl-BA, Oxaloyl-KBA, Succinoyl-BA, Succinoyl-KBA, Glutaroyl-BA, Galloyl-KBA und Carboxymethyl-BA) bei einer Konz von 10 μM die Cathepsin G-Aktivität effektiv hemmen (Tabelle 2, 8).The studies show that the naturally occurring BAs (AKBA, KBA, β-BA or Aβ-BA) and synthetic derivatives (oxaloyl-BA, oxaloyl-KBA, succinoyl-BA, succinoyl-KBA, glutaroyl-BA, galloyl-KBA and Carboxymethyl-BA) at a conc of 10 μM effectively inhibit cathepsin G activity (Table 2, 8th ).

Chemotaxis- und Migrations-AssayChemotaxis and migration assay

Die Migration von Neutrophilen entlang eines chemotaktischen Gradienten durch Matrigel wurde mit Ausnahme kleiner Änderungen gemäß der Vorschrift von Steadman et al. [14] durchgeführt. Dazu wurden frisch isolierte Neutrophile (2 × 10⁶) in 1 ml HEPES-gepuffertem RPMI 1640 Medium mit 10% (vol/vol) fötalem Kälberserum mit den Testverbindungen vorinkubiert. 150 μl der Zellsuspension wurden in das obere Kompartiment einer Boydenkammer (5 μm pore-size filters) im 24-well Format gegeben. Das untere Kompartiment enthält entweder Puffer (Negativkontrolle) oder chemotaktisch wirkendes fMLP (0.1 μM). Die Migration der Neutrophilen (die durch Proteolyse des Matrigels mittels freigesetztem Cathepsin G vermittel wird) durch Matrigel überzogene Porenfilter wurde nach 40 Minuten gestoppt. Zellen im unteren Kompartiment wurden durch 3,7% Formaldehyd fixiert, mit Gramsviolet angefärbt, gewaschen und der Farbstoff in Essigsäure gelöst. Die Absorption des eluierten Farbstoffs wurde bei 570 nm/620 nm vermessen. Es zeigt sich, dass fMLP die Migration der Neutrophilen gegenüber Lösungsmittelbehandelten Zellen um Faktor 4,1 erhöht. Vorinkubation der Neutrophilen mit einem synthetischen Cathepsin G Inhibitor (0.5 μM) und auch durch Aβ-BA oder AKβ-BA (jeweils 10 μM) supprimiert die Migration der Neutrophilen (9) Migration of neutrophils along a chemotactic gradient through Matrigel was monitored except for small changes according to the protocol of Steadman et al. [14] performed. For this, freshly isolated neutrophils (2 × 10 ⁶ ) in 1 ml of HEPES-buffered RPMI 1640 medium with 10% (vol / vol) fetal calf serum were preincubated with the test compounds. 150 μl of the cell suspension was added to the upper compartment of a Boyden chamber (5 μm pore-size filters) in 24-well format. The lower compartment contains either buffer (negative control) or chemotactic fMLP (0.1 μM). The migration of neutrophils (which is mediated by proteolysis of the matrigel by cathepsin G released) by Matrigel coated pore filters was stopped after 40 minutes. Cells in the lower compartment were fixed by 3.7% formaldehyde, stained with Gramsviolet, washed and the dye dissolved in acetic acid. The absorbance of the eluted dye was measured at 570 nm / 620 nm. It has been shown that fMLP increases the migration of neutrophils over solvent-treated cells by a factor of 4.1. Preincubation of the neutrophils with a synthetic cathepsin G inhibitor (0.5 μM) and also by Aβ-BA or AKβ-BA (in each case 10 μM) suppresses the migration of the neutrophils ( 9 )

Literaturliterature

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Claims

Use of preparations containing at least one boswellic acid and / or one of its synthetic derivatives for inhibiting PGE ₂ synthesis, in particular for inhibiting mPGES-1, and / or cathepsin G.

Use according to claim 1, characterized that the boswellic acids Naturally occurring or artificial synthesized boswellic acids are.

Use according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the boswellic acids are derived from Boswellia species were.

Use according to one of the preceding claims, characterized in that the boswellic acid derivatives have the general structural formula

in which R 1 is a polar or anionic substituent, in particular a linear or branched hydroxyalkyl, linear or branched carboxyalkyl, hydroxyaryl, carboxyaryl, hydroxyheteroaryl, carboxyheteroaryl, hydroxyalkylaryl, carboxyalkylaryl, hydroxyalkylheteroaryl or carboxyalkylheteroaryl, via a nitrogen, oxygen or carbon atom wherein the hydroxyaryl, carboxyaryl, hydroxyheteroaryl, carboxyheteroaryl, hydroxyalkylaryl, carboxyalkylaryl, hydroxyalkylheteroaryl or carboxyalkylheteroaryl may be condensed with another ring system, and one or more H atoms may be substituted by one or more halogen groups , O, N, S, OH, NH ₂ , NO ₂ , SH, (C _1-10 ) alkyl, (C _2-10 ) alkenyl, (C _2-10 ) alkynyl, OCF ₃ , (C _1-10 ) Alkoxy, (C _1-10 ) alkylamine, (C _1-10 ) alkylthio, (C _1-10 ) alkylsilyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloheteroalkyl, cycloheteroalkenyl, COOH, or da s corresponding acid addition salt of this compound, or R1 is phosphate or sulfate, linked to substituted or unsubstituted aryl, heteroaryl, alkylaryl or alkylheteroaryl, and R2 are two hydrogen atoms, an oxygen atom or a hydroxy group.

Use according to one of the preceding claims for the preparation of a medicament for the inhibition of PGE ₂ synthesis, in particular for the inhibition of mPGES-1, and / or of cathepsin G.

Use according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the medicament is further a pharmaceutical support material contains.

Use according to one of the preceding claims for the manufacture of a medicament for the treatment of PGE ₂ -mediated diseases and / or pathological conditions.

Use according to one of the preceding claims Preparation of a medicament for the treatment of cathepsin G-mediated Diseases and / or pathological conditions.

Use according to one of the preceding claims for the manufacture of a medicament for the treatment of PGE ₂ and cathepsin G-mediated diseases and / or pathological conditions.

Use according to one of the preceding claims, characterized in that the PGE ₂ -mediated diseases and / or pathological conditions inflammatory diseases, eg. As rheumatoid arthritis, feverish and painful conditions, and cancers are.

Use according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the cathepsin G-mediated diseases and / or pathological conditions Asthma, COPD, emphysema, reperfusion injury, and rheumatoid arthritis are.

Use according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the plasma concentrations of boswellic acids or synthetic derivatives after application about 0.1-15 μM, in particular 1-10 μM.