DE102008013304A1 - Expressing a heterologous gene comprises inserting a target gene into an expression vector and transforming a Rhodobacter capsulatus strain with the vector - Google Patents

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Abstract

Expressing a heterologous gene comprises inserting a target gene into an expression vector, inserting the resulting recombinant vector into cells of a Rhodobacter capsulatusstrain and expressing the target gene in the cells. Independent claims are also included for: (1) Rhodobacter capsulatus strain (S1) modified by integration of a T7 RNA polymerase gene under the control of the Rhodobacter-specific Pfru promoter into the recA gene of the Rhodobacter capsulatus chromosome; (2) pBBR22b-based expression vector that differs from pBBR22b in deletion of the lacI gene, insertion of the aphII gene of the Tn5 transposon under the control of a Km promoter, insertion of a polylinker downstream of a T7 promoter and/or insertion of a polylinker downstream or upstream of the Km promoter; (3) recombinant vector comprising an expression vector as above with a heterologous target gene downstream of the T7 or Km promoter; (4) cells and cell culture containing a vector as above.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, einen Expressionsstamm und einen Vektor zur Expression heterologer Gene.The The invention relates to a method, an expression strain and a Vector for the expression of heterologous genes.

Der Einsatz von Proteinen mit definierten katalytischen und strukturellen Eigenschaften ist für pharmazeutische und biotechnologische Entwicklungs- und Produktionsverfahren unverzichtbar. Eine unmittelbare Folge dieser Entwicklung ist der exponentiell wachsende Bedarf an biologischen und technischen Verfahren zur Herstellung solcher Biokatalysatoren.Of the Use of proteins with defined catalytic and structural Properties is for pharmaceutical and biotechnological Development and production processes indispensable. An immediate consequence This development is the exponentially growing need for biological and technical processes for producing such biocatalysts.

Die heterologe Expression von Genen ist die bei weitem einfachste und kostengünstigste Art, große Mengen eines bestimmten Proteins für wissenschaftliche und kommerzielle Zwecke zu erzeugen. In den vergangenen drei Jahrzehnten wurde ein breites Spektrum von molekulargenetischen Techniken entwickelt, die es ermöglichen, die Effizienz der Proteinsynthese in einigen gut handhabbaren bakteriellen und eukaryontischen Mikroorganismen empirisch zu optimieren. Die Erzeugung von wirtsfremden Proteinen in Organismen wie dem Bakterium Escherichia coli und der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist mittlerweile ein weltweit verbreitetes Standardverfahren.The heterologous expression of genes is by far the simplest and most most cost-effective way, large quantities of a given Protein for scientific and commercial purposes to create. In the past three decades has been a wide Developed spectrum of molecular genetic techniques that make it possible the efficiency of protein synthesis in some manageable bacterial and empirically optimize eukaryotic microorganisms. The Production of alien proteins in organisms such as the bacterium Escherichia coli and the baker's yeast Saccharomyces cerevisiae is now a standard method used worldwide.

Tatsächlich lassen sich einige rekombinante Proteine sehr einfach produzieren, indem die heterologen Gene in einem schnell wachsenden Organismus wie E. coli in hohen Raten exprimiert werden. Dies ist jedoch leider nur selten der Fall. Der Normalfall ist eine nicht ausreichende Protein-Ausbeute, für die es vielschichtige Ursachen gibt, die auf verschiedenen Ebenen des sehr komplexen Vorgangs der Proteinbiosynthese liegen und von Wirt zu Wirt variieren können. Häufig ist eine ineffiziente Transkription, eine Instabilität des Transkripts oder eine unzureichende Translation die Ursache. Es können jedoch auch zahlreiche Probleme bei der Reifung des Proteins, wie z. B. eine inkorrekte Proteinfaltung oder das Fehlen von essentiellen Kofaktoren auftreten.Indeed some recombinant proteins are very easy to produce, by heterologous genes in a fast-growing organism like E. coli are expressed at high rates. Unfortunately, this is only rarely the case. The normal case is an insufficient one Protein yield, for which there are complex causes, at different levels of the very complex process of protein biosynthesis and vary from host to host. Often is an inefficient transcription, an instability of the transcript or inadequate translation of the cause. However, there are also many problems with maturing of the protein, such as B. an incorrect protein folding or the Lack of essential cofactors occur.

Bei der heterologen Expression erfolgt die Synthese eines beliebigen Zielproteins nicht in dem Ursprungsorganismus, sondern wird stattdessen mithilfe gentechnologischer Verfahren in einem anspruchslosen und genetisch sowie technisch gut handhabbaren Mikroorganismus oder einer Zellkultur durchgeführt. Zu diesem Zweck existiert heutzutage eine Vielfalt etablierter Expressionssysteme, die auf Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen oder auf höheren Organismen wie Insekten, Pflanzen und Tieren basieren.at heterologous expression is the synthesis of any Target protein is not in the original organism, but instead becomes using genetic engineering in an undemanding and genetically and technically easy to handle microorganism or carried out a cell culture. Exists for this purpose Nowadays a variety of established expression systems based on Microorganisms such as bacteria and fungi or higher Organisms such as insects, plants and animals are based.

Von besonderer Bedeutung ist dabei die Expression in prokaryotischen und eukaryotischen Mikroorganismen, da diese sich mithilfe einer Vielzahl genetischer Methoden leicht manipulieren lassen und durch ihre kurzen Generationszeiten und ihre einfache und kostengünstige Kultivierung eine sehr ökonomische Produktion großer Mengen des rekombinanten Genproduktes erlauben. Die Ausbeuten des heterolog exprimierten Proteins können dabei bis zu 50% des Gesamtproteins betragen ( Alldread et al., 1992 ). Es ist jedoch nicht jeder Expressionswirt gleichermaßen für die Expression jedes heterologen Proteins geeignet.Of particular importance is the expression in prokaryotic and eukaryotic microorganisms, as they can be easily manipulated using a variety of genetic methods and allow by their short generation times and their easy and inexpensive cultivation of a very economical production of large quantities of the recombinant gene product. The yields of the heterologously expressed protein can be up to 50% of the total protein ( Alldread et al., 1992 ). However, not every expression host is equally suitable for the expression of any heterologous protein.

Der am häufigsten verwendete Wirt für die Expression heterologer Proteine ist das Gramnegative Enterobakterium Escherichia coli ( Hannig & Makrides, 1998 ; Jana & Deb, 2005 ; Sorensen & Mortensen, 2005 ). In zahllosen Studien wurden sowohl Proteine prokaryotischer als auch eukaryotischer Herkunft erfolgreich in diesem Organismus exprimiert. Dennoch ist die heterologe Expression von Proteinen in E. coli mitunter problematisch.The most commonly used host for the expression of heterologous proteins is the Gram-negative enterobacterium Escherichia coli ( Hannig & Makrides, 1998 ; Jana & Deb, 2005 ; Sorensen & Mortensen, 2005 ). In countless studies, both proteins of prokaryotic and eukaryotic origin have been successfully expressed in this organism. Nevertheless, the heterologous expression of proteins in E. coli is sometimes problematic.

Es ist zum Beispiel bekannt, dass unterschiedliche Organismen häufig verschiedene alternative Codons bevorzugen, um eine bestimmte Aminosäure zu codieren ( Gutman & Hatfield, 1989 ). Diese Präferenz für bestimmte Codons bezeichnet man als „Codon-Bias” ( Carbone et al., 2003 ). Die Bevorzugung bestimmter Codons ist hauptsächlich von der Art des Organismus abhängig, kann allerdings auch innerhalb ein- und derselben Zelle variieren, z. B. zwischen stark und schwach exprimierten Genen oder zwischen Genen, die unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen aktiv sind ( Saier, 1995; Makrides, 1996 ). Ein verwandtes Problem entsteht dadurch, dass manche Organismen nicht den „universellen” genetischen Code verwenden, sondern eine alternative Form ( Santos et al., 2004 ).For example, it is known that different organisms often prefer different alternative codons to encode a particular amino acid ( Gutman & Hatfield, 1989 ). This preference for certain codons is called "codon bias" ( Carbone et al., 2003 ). The preference for certain codons depends mainly on the type of organism, but may also vary within one and the same cell, e.g. Between strong and weakly expressed genes or between genes that are active under different growth conditions ( Saier, 1995; Makrides, 1996 ). A related problem arises because some organisms do not use the "universal" genetic code but an alternative form ( Santos et al., 2004 ).

Bei der funktionellen heterologen Expression kann es leicht zu Problemen kommen, wenn der Ursprungsorganismus eine andere Codon-Verwendung aufweist als der heterologe Expressionswirt. Die Bevorzugung bestimmter Codons geht meist damit einher, dass die spezifischen tRNA-Moleküle für diese Codons im tRNA-Pool der Zelle deutlich stärker vertreten sind als die tRNA-Moleküle, die seltene Codons erkennen. Enthält ein Gen nun viele solcher seltener Codons, wird der Vorrat der kognitiven tRNA-Spezies für diese Codons rasch erschöpft ( Smith, 1996 ; Gustafsson et al., 2004 ). Die Folge davon können Verzögerungen bei der Elongation der Peptidkette während der Translation ( Zahn, 1996 ), Leserasterverschiebungen ( McNulty et al., 2003 ), translationale „Sprünge” ( Kane et al., 1992 ) oder fehlerhafter Einbau anderer Aminosäuren ( Calderone et al., 1996 ; Forman et al., 1998 ; McNulty et al., 2003 ) sein.In functional heterologous expression, problems can easily arise if the parent organism has a different codon usage than the heterologous expression host. The preference for particular codons is usually associated with the fact that the specific tRNA molecules for these codons in the tRNA pool of the cell are significantly more represented than the tRNA molecules that recognize rare codons. If a gene now contains many such rare codons, the supply of cognitive tRNA species for this co dons quickly exhausted ( Smith, 1996 ; Gustafsson et al., 2004 ). The consequence of this may be delays in the elongation of the peptide chain during translation ( Tooth, 1996 ), Frame shifts ( McNulty et al., 2003 ), translational "jumps" ( Kane et al., 1992 ) or incorrect incorporation of other amino acids ( Calderone et al., 1996 ; Forman et al., 1998 ; McNulty et al., 2003 ) be.

Ein anderes Problem bei der heterologen Expression stellen toxische Proteine dar. Eine toxische Wirkung der rekombinanten Proteine kann zur Instabilität der Expressionsplasmide oder sogar zum Tod der Zellen führen, wodurch die Ausbeuten des heterologen Proteins stark gemindert werden. Mitunter lassen sich Expressionsvektoren, die Gene für stark toxische Genprodukte enthalten, nicht einmal in den Zellen etablieren, wenn der Promotor, der ihre Transkription kontrolliert, auch uninduziert einen basalen Expressionslevel aufweist ( Doherty et al., 1993 ).Another problem with heterologous expression is toxic proteins. Toxic effect of the recombinant proteins can lead to instability of the expression plasmids or even death of the cells, thereby greatly reducing the yields of the heterologous protein. Sometimes expression vectors containing genes for highly toxic gene products can not even be established in the cells if the promoter controlling their transcription also has a basal expression level uninduced ( Doherty et al., 1993 ).

Teilweise muss es sich noch nicht einmal um ein toxisches Protein per se handeln, um die Zelle nachhaltig zu schädigen. So kann etwa die Überexpression von nicht-toxischen Proteinen zu einer Überlastung des Metabolismus und damit zu verminderten Wachstumsraten ( Andersson et al., 1996 ) und sogar zum Tod der Zellen führen ( Dong et al., 1995 ). Dies kann damit zusammenhängen, dass die Expression großer Mengen rekombinanten Proteins die Zelle durch die Erhaltung und Replikation der Expressionsplasmide ( Corchero & Villaverde, 1998 ), sowie durch die Expression dieser Gene ( Glick, 1995 ) wichtige Ressourcen und Energie kostet. Das wiederum kann nicht allein die Expression des heterologen Proteins beeinträchtigen, sondern auch die Funktionalität lebenswichtiger Zellprozesse ( Glick, 1995 ; Hoffmann & Rinas, 2001 ).In some cases, it does not even have to be a toxic protein per se in order to sustainably damage the cell. Thus, for example, the overexpression of non-toxic proteins can lead to an overload of the metabolism and thus to reduced growth rates ( Andersson et al., 1996 ) and even death of the cells ( Dong et al., 1995 ). This may be related to the expression of large quantities of recombinant protein by the maintenance and replication of the expression plasmids ( Corchero & Villa Verde, 1998 ), as well as by the expression of these genes ( Glick, 1995 ) costs important resources and energy. This in turn can not only affect the expression of the heterologous protein, but also the functionality of vital cell processes ( Glick, 1995 ; Hoffmann & Rinas, 2001 ).

Eine andere problematische Folge heterologer Überexpression kann die Induktion einer Stress-Antwort der Zelle sein. Dabei werden unter anderem Hitzeschock-Gene und Gene für DNA-Reparatur hochreguliert ( Rinas, 1996 ; Gill et al., 2000 ; Lesley et al., 2002 ). Eine der Folgen ist eine verstärkte proteolytische Aktivität der Zellen aufgrund stärkerer Expression von Proteasen ( Harcum & Bentley, 1999 ; Ramírez & Bentley, 1999 ), welche die Ausbeute des rekombinanten Proteins senken kann.Another problematic consequence of heterologous overexpression may be the induction of a stress response of the cell. Heat-shock genes and genes for DNA repair are up-regulated ( Rinas, 1996 ; Gill et al., 2000 ; Lesley et al., 2002 ). One of the consequences is an increased proteolytic activity of the cells due to stronger expression of proteases ( Harcum & Bentley, 1999 ; Ramírez & Bentley, 1999 ), which can lower the yield of the recombinant protein.

Die Faltung des heterologen Proteins kann ein weiteres Problem bei der heterologen Expression darstellen ( Baneyx & Mujacic, 2004 ). Manche Proteine sind auf spezifische Faltungshelfer, wie Foldasen und Chaperone, angewiesen, die von E. coli teilweise nicht exprimiert werden ( Schlieker et al., 2002 ). Die inkorrekte Faltung eines Proteins begünstigt dessen Abbau durch wirtseigene Proteasen ( Goff & Goldberg, 1985 ; Makrides 1996 ) oder kann zur Aggregation des Proteins und somit zur Bildung von unlöslichen Einschlusskörpern (inclusion bodies) führen ( Wall & Plückthun, 1995 ; Baneyx & Mujacic, 2004 ).The folding of the heterologous protein can represent another problem in heterologous expression ( Baneyx & Mujacic, 2004 ). Some proteins rely on specific folding aids, such as foldases and chaperones, which are partially unexpressed by E. coli ( Schlieker et al., 2002 ). Incorrect folding of a protein favors its degradation by host proteases ( Goff & Goldberg, 1985 ; Makrides 1996 ) or may lead to the aggregation of the protein and thus to the formation of insoluble inclusion bodies (inclusion bodies) ( Wall & Plückthun, 1995 ; Baneyx & Mujacic, 2004 ).

Die Bildung von inclusion bodies ist ein häufig auftretendes Problem bei der heterologen Expression ( Rinas & Bailey, 1993 ; Villaverde & Carrió, 2003 ). Sie wird von verschiedensten Faktoren beeinflusst, darunter von dem Expressionslevel ( Strandberg & Enfors, 1991 ) sowie den strukturellen Eigenschaften des rekombinanten Proteins ( Murby et al., 1995 ).The formation of inclusion bodies is a common problem in heterologous expression ( Rinas & Bailey, 1993 ; Villaverde & Carrió, 2003 ). It is influenced by a variety of factors, including the level of expression ( Strandberg & Enfors, 1991 ) as well as the structural properties of the recombinant protein ( Murby et al., 1995 ).

Einige Proteine sind, damit sie in löslicher und aktiver Form exprimiert werden, auf zusätzliche Komponenten angewiesen. So benötigen manche Membranproteine die Gegenwart spezifischer assoziierter Lipide ( Opekarová & Tanner, 2003 ), die in E. coli nicht synthetisiert werden. Andere Proteine durchlaufen eine Vielzahl von Modifikationen, ehe sie ihre aktive Konformation erreichen ( Wenzel & Müller, 2005 ). Wieder andere Proteine benötigen Kofaktoren oder prosthetische Gruppen, um aktiviert zu werden.Some proteins rely on additional components to be expressed in soluble and active form. Thus, some membrane proteins require the presence of specific associated lipids ( Opekarová & Tanner, 2003 ) which are not synthesized in E. coli. Other proteins undergo a variety of modifications before they reach their active conformation ( Wenzel & Müller, 2005 ). Still other proteins require cofactors or prosthetic groups to be activated.

Alle diese und weitere Probleme können dazu führen, dass ein rekombinantes Protein nicht oder nur mit geringem Ertrag in E. coli exprimiert wird, oder dass nur eine unlösliche und/oder inaktive Form des Proteins synthetisiert wird.All these and other problems can cause that a recombinant protein is not or only with low yield expressed in E. coli, or that only one insoluble and / or inactive form of the protein is synthesized.

In den letzten 30 Jahren wurden zahlreiche Strategien entwickelt, um die genannten Probleme bei der heterologen Expression zu überwinden. Grundsätzlich können dabei zwei unterschiedliche Wege beschritten werden. Zum einen ist es möglich, einen Standartexpressionsstamm mithilfe molekulargenetischer Verfahren gezielt für die Expression eines problematischen Zielproteins zu optimieren. Zum anderen kann die Expression problematischer Proteine jedoch auch in alternativen Wirtsorganismen erfolgen, die aufgrund ihrer physiologischen, genetischen oder strukturellen Eigenschaften für eine effiziente Synthese der Proteine besser geeignet sind.In Over the past 30 years, numerous strategies have been developed to to overcome the mentioned problems in heterologous expression. Basically, two different Paths are taken. For one, it is possible to have one Standard expression strain targeted by molecular genetic methods for the expression of a problematic target protein optimize. On the other hand, the expression of problematic proteins however, also occur in alternative host organisms due to their physiological, genetic or structural characteristics are more suitable for efficient synthesis of the proteins.

Zur Überwindung einer unterschiedlichen Codon-Präferenz gibt es zwei grundsätzliche Methoden. Eine Möglichkeit ist die Koexpression von Genen, die für die kognitiven tRNAs der seltenen Codons codieren ( Forman et al., 1998 ; McNulty et al., 2003 ; Sorensen et al., 2003 ). Die betreffende tRNA muss zu diesem Zweck allerdings überexprimiert werden, und zieht somit einen Teil der gesamten Syntheseleistung der Zelle für ihre eigene Expression ab. Zudem müssen zusätzliche Expressionsplasmide mit den Genen dieser tRNAs im Organismus etabliert und erhalten werden. Dies schränkt zum einen die Auswahl der Expressionsplasmide ein, da Inkompatibilitäten vermieden werden müssen, und kann zum anderen zusätzlichen metabolischen Stress für die Zelle bedeuten.There are two basic methods for overcoming a different codon preference. One possibility is the co-expression of genes coding for the cognitive tRNAs of the rare codons ( Forman et al., 1998 ; McNulty et al., 2003 ; Sorensen et al., 2003 ). The relevant tRNA must be linked to this Purpose, however, overexpressed, and thus subtracts part of the total synthesis of the cell for their own expression. In addition, additional expression plasmids with the genes of these tRNAs must be established and maintained in the organism. This limits the choice of expression plasmids on the one hand, since incompatibilities must be avoided, and on the other hand can mean additional metabolic stress for the cell.

Bei der zweiten Methode zur Überwindung der Codon-Bias werden seltene Codons des Zielgens durch gezielte Mutationen in andere Codons überführt, die für die gleiche Aminosäure codieren, aber von dem Expressionswirt häufiger verwendet werden ( Calderone et al., 1996 ; Deng, 1997 ; Chang et al., 2006 ). Für den Fall, dass sehr viele Veränderungen durchgeführt werden müssen, kann diese Methode bis zur kompletten Neusynthese des betreffenden Gens reichen ( Pan et al., 1999 ; Feng et al., 2000 ; Patterson et al., 2005 ). Diese Codon-Optimierung ist allerdings ein sehr zeit- und kostenaufwändiger Prozess.In the second method for overcoming the codon bias, rare codons of the target gene are transferred by targeted mutations into other codons which code for the same amino acid but are used more frequently by the expression host ( Calderone et al., 1996 ; Deng, 1997 ; Chang et al., 2006 ). In the event that a great many changes have to be made, this method may be sufficient for the complete resynthesis of the gene in question ( Pan et al., 1999 ; Feng et al., 2000 ; Patterson et al., 2005 ). However, this codon optimization is a very time-consuming and costly process.

Die effektivste Methode, ein toxisches Protein in E. coli zu exprimieren, ist die Verwendung strikt regulierter, induzierbarer Promotoren, so dass die Zellen zunächst ausreichend Biomasse bilden können, bevor mit der Expression begonnen wird ( Studier, 1991 ; Rossi & Blau, 1998 ; Wycuff & Matthews, 2000 ; Jonasson et al., 2002 ). Eine weitere Methode ist die Sekretion der rekombinanten Proteine, um die cytoplasmatische Konzentration derselben möglichst gering zu halten ( Hockney, 1994 ; Gumpert & Hoischen, 1998 ; Jana & Deb, 2005 ). Diese Methode setzt allerdings voraus, dass das rekombinante Gen mit einer für die Sekretion spezifischen Signalsequenz fusioniert wird. In anderen Fällen macht man sich die Bildung von inclusion bodies zunutze, in welchen das rekombinante Protein eingeschlossen wird und daher keine toxische Wirkung entfalten kann ( Baneyx & Mujacic, 2004 ). Dabei entsteht allerdings wieder das Problem, dass die Proteine aufwändig aus den inclusion bodies zurückgewonnen werden müssen.The most effective way to express a toxic protein in E. coli is to use strictly regulated, inducible promoters so that the cells can first generate sufficient biomass before starting expression ( Studier, 1991 ; Rossi & Blue, 1998 ; Wycuff & Matthews, 2000 ; Jonasson et al., 2002 ). Another method is the secretion of the recombinant proteins in order to minimize their cytoplasmic concentration ( Hockney, 1994 ; Gumpert & Hoischen, 1998 ; Jana & Deb, 2005 ). However, this method requires that the recombinant gene be fused with a signal sequence specific for secretion. In other cases, one makes use of the formation of inclusion bodies in which the recombinant protein is included and therefore can not develop a toxic effect ( Baneyx & Mujacic, 2004 ). However, the problem arises again that the proteins must be recovered from the inclusion bodies laboriously.

Die Faltung von Proteinen lässt sich zum Beispiel durch die Koexpression von Faltungsmodulatoren verbessern ( Wall & Plückthun, 1995 ; Schlieker et al., 2002 ; Baneyx & Mujacic, 2004 ), wobei allerdings ähnliche Probleme entstehen wie bei der Koexpression von tRNAs. Erfolg brachten in bisherigen Studien vor allem die Koexpression der molekularen Chaperone DnaK, DnaJ und GrpE ( Nishihara et al., 1998 ), GroEL und GroES ( Amrein et al., 1995 ; Yasukawa et al., 1995 ; Nishihara et al., 1998 ) sowie FkpA ( Arie et al., 2001 ). Auch eine Optimierung der Wachstumsbedingungen kann die Ausbeute an korrekt gefaltetem Protein erhöhen ( Georgiou & Valax, 1996 ).The folding of proteins can be improved, for example, by the coexpression of folding modulators ( Wall & Plückthun, 1995 ; Schlieker et al., 2002 ; Baneyx & Mujacic, 2004 ), although similar problems arise as in the co-expression of tRNAs. In previous studies, co-expression of the molecular chaperones DnaK, DnaJ and GrpE ( Nishihara et al., 1998 ), GroEL and GroES ( Amrein et al., 1995 ; Yasukawa et al., 1995 ; Nishihara et al., 1998 ) as well as FkpA ( Arie et al., 2001 ). Optimization of the growth conditions can also increase the yield of correctly folded protein ( Georgiou & Valax, 1996 ).

Der proteolytische Abbau von rekombinanten Proteinen wird häufig durch die Verwendung von Protease-defizienten Expressionsstämmen vermieden ( Nishihara et al., 1998 ; Chen et al., 2004 ; Sorensen et al., 2005 ). Auch die Fusion des rekombinanten Proteins mit stabilisierenden Partnerproteinen ( Martinez et al., 1995 ; Corchero et al., 1996 ; Skosyrev et al., 2003 ) oder die Koexpression stabilisierender Faktoren ( LeThanh et al., 2005 ) führten in einigen Fällen zum Erfolg.The proteolytic degradation of recombinant proteins is often avoided by the use of protease-deficient expression strains ( Nishihara et al., 1998 ; Chen et al., 2004 ; Sorensen et al., 2005 ). The fusion of the recombinant protein with stabilizing partner proteins ( Martinez et al., 1995 ; Corchero et al., 1996 ; Skosyrev et al., 2003 ) or the coexpression of stabilizing factors ( LeThanh et al., 2005 ) led to success in some cases.

Benötigt ein Protein, um in aktiver oder löslicher Form exprimiert zu werden, spezifische zusätzliche Komponenten wie etwa Kofaktoren oder Komplexpartner, kann dieses Problem manchmal durch die Koexpression der notwendigen Komponenten behoben werden ( Weickert et al., 1996 ).When a protein needs to be expressed in active or soluble form, additional specific components such as cofactors or complex partners, this problem can sometimes be resolved by the co-expression of the necessary components ( Weickert et al., 1996 ).

Oft führt die Optimierung eines einzelnen Faktors jedoch nicht zum Ziel oder hat sogar negative Auswirkungen auf die heterologe Expression, so dass weitere Faktoren modifiziert werden müssen.Often however, does not do the optimization of a single factor to the goal or even has negative effects on the heterologous Expression, so that further factors need to be modified.

Die vorgestellten Lösungsstrategien zur Behebung von Expressionsproblemen ermöglichten in vielen Fällen die Synthese von problematischen Proteinen in E. coli. Sie sind jedoch mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden und führen häufig dennoch nicht zum gewünschten Erfolg. Hinzu kommt, dass für jedes „Problemprotein” eine individuelle Optimierung des Expressionswirts vorgenommen werden muss. Daher stellt die Expression in einem alternativen Organismus häufig die bessere Lösung dar. So können andere Organismen eine effektivere Faltungs- oder Sekretionsmaschinerie aufweisen, oder dessen Codon-Verwendung ähnelt dem des ursprünglichen Produzenten des heterologen Proteins.The presented solution strategies for the elimination of expression problems allowed in many cases the synthesis of problematic proteins in E. coli. You are, however, with one high time and cost associated and often lead nevertheless not to the desired success. In addition, that for each "problem protein" an individual Optimization of the expression host must be made. Therefore Represents expression in an alternative organism frequently the better solution. So can other organisms have a more effective folding or secretion machinery, or its codon usage is similar to that of the original one Producers of the heterologous protein.

Ein Beispiel für einen alternativen Expressionsorganismus ist das phototrophe Purpurbakterium Rhodobacter capsulatus.One Example of an alternative expression organism the phototrophic purple bacterium Rhodobacter capsulatus.

R. capsulatus zählt zur Gruppe der phototrophen nicht-Schwefel Purpurbakterien aus der Gruppe der α-Proteobakterien und ist damit ein Vertreter der Familie der Rhodospirillaceae. Das Habitat dieses stäbchenförmigen, Gram-negativen Bakteriums umfasst hauptsächlich die lichtdurchdrungenen Schichten stehender oder langsam fließender Gewässer und Seen ( Weaver et al., 1975 ). Es zeichnet sich unter anderem durch seine rote Pigmentierung aus, die unter phototrophen Wuchsbedingungen durch die Pigmente der Photosyntheseapparate zustande kommt. Die Proteine des Photosynthesekomplexes sind in einer spezialisierten photosynthetischen Membran, der sogenannten intracytoplasmatischen Membran (ICM) eingelagert.R. capsulatus belongs to the group of phototrophic non-sulfur purple bacteria from the group of α-proteobacteria and is therefore a member of the Rhodospirillaceae family. The habitat of this rod-shaped, Gram-negative bacterium mainly comprises the light-penetrated layers of stagnant or slow flowing waters and lakes ( Weaver et al., 1975 ). It is characterized by, among other things ne red pigmentation, which comes about under phototrophic growth conditions by the pigments of the photosynthetic apparatuses. The proteins of the photosynthetic complex are incorporated in a specialized photosynthetic membrane, the so-called intracytoplasmic membrane (ICM).

R. capsulatus ist in der Lage, mehrere unterschiedliche Stoffwechselwege zur Bereitstellung von Energie und Zellbausteinen zu nutzen. So ist er sowohl zur aeroben als auch anaeroben Respiration befähigt ( Zannoni, 1995 ) und kann zudem Lichtenergie zur anoxygenen Photosynthese ausnutzen ( Gregor & Klug, 1999 ; Bauer et al., 2003 ). Bei der anoxygenen Photosynthese wird Lichtenergie in einen Protonengradienten umgewandelt, der wiederum zur Synthese von ATP dient. Im Gegensatz zur Photosynthese in Pflanzen werden dabei weder Sauerstoff noch Redoxäquivalente erzeugt. Die Photosynthese wird von R. capsulatus ausschließlich unter anaeroben Bedingungen als Energiequelle genutzt.R. capsulatus is able to use several different metabolic pathways to provide energy and cell building blocks. Thus it is capable of both aerobic and anaerobic respiration ( Zannoni, 1995 ) and can also exploit light energy for anoxygenic photosynthesis ( Gregor & Klug, 1999 ; Bauer et al., 2003 ). In anoxygenic photosynthesis, light energy is converted into a proton gradient, which in turn serves to synthesize ATP. In contrast to photosynthesis in plants, neither oxygen nor redox equivalents are produced. Photosynthesis is used by R. capsulatus exclusively as an energy source under anaerobic conditions.

Unter Stickstoffmangel ist R. capsulatus in der Lage, atmosphärischen Stickstoff als N-Quelle zu verwenden und somit diazotroph zu wachsen. Zu diesem Zweck besitzt es zwei unterschiedliche Nitrogenase-Komplexe ( Masepohl et al., 2002 ; Drepper et al., 2003 ). Weitere Stoffwechselleistungen in R. capsulatus sind der Wasserstoff-Metabolismus ( Vignais et al., 2000 ) und die CO2-Fixierung ( Tabita, 1995 ).Under nitrogen deficiency, R. capsulatus is able to use atmospheric nitrogen as an N-source and thus grow diazotrophically. For this purpose it has two different nitrogenase complexes ( Masepohl et al., 2002 ; Drepper et al., 2003 ). Other metabolic activities in R. capsulatus are the hydrogen metabolism ( Vignais et al., 2000 ) and CO2 fixation ( Tabita, 1995 ).

Bei diesem Organismus handelt es sich um eines der am besten studierten phototrophen Bakterien. Das R. capsulatus Genom wurde vollständig sequenziert ( Haselkorn et al., 2001 ), wodurch die Grundlage geschaffen wurde, mittels moderner Analyseverfahren (z. B. Microarray-Technologie) globale Prozesse detailliert zu analysieren.This organism is one of the best studied phototrophic bacteria. The R. capsulatus genome was completely sequenced ( Haselkorn et al., 2001 ), which provided the basis for analyzing in detail global processes using modern analysis techniques (eg microarray technology).

In den vergangenen 30 Jahren wurden zahlreiche bakterielle Expressionsvektoren konstruiert, die je nach Anwendung auf unterschiedlichen Promotoren basieren. Solche Expressionsvektoren lassen sich in der Regel nur in einer begrenzten Gruppe nahe verwandter Bakterienspezies replizieren (z. B. Vertreter der Gruppe der Enterobakterien) und werden als narrow range Vektoren (Vektoren mit einem engem Wirtsspektrum) bezeichnet. Darüber hinaus gibt es derzeit wenige Vektoren, die sich in einer größeren Gruppe von Bakterien etablieren lassen. In diesem Fall spricht man von broad host range Vektoren. Häufig werden für die Überexpression Expressionsvektoren mit starken, induzierbaren Promotoren bevorzugt, welche es erlauben die Wachstums- und die Expressionsphase zu trennen. Die Induktion kann dabei je nach Promotor und Expressionswirt z. B. durch das Hinzufügen von Metaboliten oder anderen Verbindungen, den Entzug von Nährstoffen oder einer Temperaturveränderung erfolgen.In Over the past 30 years, numerous bacterial expression vectors have been detected designed, depending on the application on different promoters based. Such expression vectors are usually only replicate in a limited group of closely related bacterial species (eg representatives of the group of enterobacteria) and are called narrow range vectors (vectors with a narrow host spectrum). In addition, there are currently few vectors that are in a larger group of bacteria to let. In this case one speaks of broad host range vectors. Frequently used for overexpression Preferred expression vectors with strong, inducible promoters, which allow to separate the growth and the expression phase. The induction may be depending on the promoter and expression host z. By adding metabolites or other compounds, the withdrawal of nutrients or a change in temperature respectively.

Beispiele für induzierbare Promotoren in E. coli sind etwa der lac-Promotor ( Fuller, 1982 ), der durch Rekombination der Promotoren Plac und Ptrp erzeugte tac-Promotor ( de Boer et al., 1983 ) und der araC-PBAD-Promotor, der auf einer Fusion des Arabinose-abhängigen Promo tors araBAD und dem Regulator araC beruht ( Guzman et al., 1995 ; Newman & Fuqua, 1999 ).Examples of inducible promoters in E. coli are, for example, the lac promoter ( Fuller, 1982 ), the tac promoter produced by recombination of the promoters P lac and P trp ( de Boer et al., 1983 ) and the araC-P BAD promoter, which is based on a fusion of the arabinose-dependent promoter araBAD and the regulator araC ( Guzman et al., 1995 ; Newman & Fuqua, 1999 ).

In R. capsulatus werden Promotoren aus E. coli leider schlecht oder gar nicht erkannt. Stattdessen wurde in diesem Organismus der nifH-Promotor für die Expression verwendet, welcher normalerweise die Transkription der R. capsulatus Gene für die Stickstofffixierung kontrolliert ( Pollock et al., 1988 ). Des Weiteren kamen in R. capsulatus Fruktose- und DMSO-induzierbare Promotoren zum Einsatz ( Duport et al. 1994 , Kappler & McEwan 2002 ).In R. capsulatus, promoters from E. coli are poorly or not recognized at all. Instead, the nifH promoter was used in this organism for expression, which normally controls the transcription of the R. capsulatus genes for nitrogen fixation ( Pollock et al., 1988 ). Furthermore, fructose- and DMSO-inducible promoters were used in R. capsulatus ( Duport et al. 1994 . Kappler & McEwan 2002 ).

Das T7-System nimmt unter den bakteriellen Expressionssystemen einen besonderen Stellenwert ein: Im Fall des T7-Expressionssystems stehen die rekombinanten Zielgene unter der Transkriptionskontrolle eines Promotors aus dem Bakteriophagen T7 ( Tabor & Richardson, 1985 ; Studier & Moffatt, 1986 ). Diese 23 bp lange Sequenz wird ausschließlich von der spezifischen RNA-Polymerase aus dem gleichen Phagen erkannt ( Kochetkov et al., 1998 ). Die wirtseigene bakterielle RNA-Polymerase erkennt diese Promotoren nicht und hat daher keinerlei Einfluss auf die Expression der Zielgene. Die T7-RNA-Polymerase ist eines der einfachsten Enzyme, welche die RNA-Synthese katalysieren: Sie besitzt nur eine einzelne Untereinheit und benötigt keine zusätzlichen Proteinfaktoren. Ihr Mechanismus ist gut untersucht ( Kochetkov et al., 1998 ).The T7 system is of particular importance among bacterial expression systems: in the case of the T7 expression system, the recombinant target genes are under the transcriptional control of a bacteriophage T7 promoter ( Tabor & Richardson, 1985 ; Studier & Moffatt, 1986 ). This 23 bp sequence is recognized exclusively by the specific RNA polymerase from the same phage ( Kochetkov et al., 1998 ). The intrinsic bacterial RNA polymerase does not recognize these promoters and therefore has no influence on the expression of the target genes. T7 RNA polymerase is one of the simplest enzymes to catalyze RNA synthesis: it has only a single subunit and does not require additional protein factors. Your mechanism is well studied ( Kochetkov et al., 1998 ).

Die T7-RNA-Polymerase weist im Vergleich zu bakteriellen RNA-Polymerasen eine sehr hohe Prozessivität auf. Daher können mit T7-RNA-Polymerase basierten Expressionssystemen sehr hohe Proteinausbeuten erzielt werden ( Studier & Moffatt, 1986 ). Für die T7-Polymerase abhängige Expression eines heterologen Zielgens benötigt man grundsätzlich zwei Komponenten: Zum einen werden Expressionsplasmide benötigt, in denen die Zielgene unter die Kontrolle des T7-Promotors gestellt werden können ( Rosenberg et al., 1987 ). Für den Einsatz in E. coli existieren mittlerweile über 40 kommerzielle T7-Expressionsvektoren (z. B. pET-Plasmide der Fa. Novagen). Zum anderen benötigt man das T7-RNA-Polymerasegen, welches unter der Kontrolle eines (induzierbaren) bakteriellen Promotors stehen muss.The T7 RNA polymerase has a very high processivity compared to bacterial RNA polymerases. Therefore, very high protein yields can be achieved with T7 RNA polymerase-based expression systems ( Studier & Moffatt, 1986 ). In principle, two components are required for T7 polymerase-dependent expression of a heterologous target gene: On the one hand, expression plasmids are needed in which the target genes can be placed under the control of the T7 promoter ( Rosenberg et al., 1987 ). There are now more than 40 commercial T7 expression vectors for use in E. coli (eg pET plasmids from Novagen). On the other hand, one needs the T7 RNA polymerase gene, which is under the control of an (inducible) bacterial promoter must be.

In E. coli zählt das T7-Expressionssystem heute zu den am häufigsten eingesetzten Expressionssystemen. Meist wird dazu der Stamm BL21(DE3) verwendet ( Studier & Moffatt, 1986 ), welcher einen Prophagen ins Chromosom integriert trägt, der die T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des induzierbaren Promotors lacUV5 exprimiert. Mittlerweile wurden allerdings auch T7-Expressionssysteme für andere Bakterien, wie z. B.: Pseudomonas aeruginosa ( Brunschwig & Darzins, 1992 ), Pseudomonas putida ( Herrero et al., 1993 ), Salmonella enterica ( McKinney et al., 2002 ; Santiago-Machuca et al., 2002 ) oder Ralstonia eutropha ( Barnard et al., 2004 ) konstruiert.In E. coli, the T7 expression system is one of the most widely used expression systems today. Usually the strain BL21 (DE3) is used ( Studier & Moffatt, 1986 ) carrying a prophage integrated into the chromosome which expresses the T7 RNA polymerase under the control of the inducible promoter lacUV5. Meanwhile, however, T7 expression systems for other bacteria, such. For example: Pseudomonas aeruginosa ( Brunschwig & Darzins, 1992 ), Pseudomonas putida ( Herrero et al., 1993 ), Salmonella enterica ( McKinney et al., 2002 ; Santiago-Machuca et al., 2002 ) or Ralstonia eutropha ( Barnard et al., 2004 ).

Die aus der (Meta)Genom-Forschung erhaltenen Gen-Daten stellen ein ungeahntes Reservoir für neue Biomoleküle mit einem enormen Anwendungspotential für die chemische und pharmazeutische Industrie dar. Jedoch sind für die Nutzung dieses Reservoirs und somit für die Identifizierung und Bereitstellung neuer Enzyme sowie biotechnologisch erzeugter Spezial- und Feinchemikalien effiziente Expressions- und Screeningsysteme die entscheidenden Schlüsseltechnologien.The Gene data obtained from (meta) genome research represent an unimagined one Reservoir for new biomolecules with a huge Application potential for the chemical and pharmaceutical However, for the use of this reservoir and thus for the identification and provision of new enzymes as well as biotechnologically produced special and fine chemicals efficient Expression and screening systems are the key enabling technologies.

Es ist Aufgabe der Erfindung ein effizientes Verfahren zur heterologen Genexpression sowie ein effizientes Expressions- und Screeningsystem zur Verfügung zu stellen.It The object of the invention is an efficient heterologous process Gene expression as well as an efficient expression and screening system to provide.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Expression heterologer Gene gelöst, das die folgenden Schritte umfasst:

  • – Herstellen mindestens eines Expressionsvektors;
  • – Klonieren mindestens eines heterologen Zielgens in den Expressionsvektor;
  • – Herstellen eines Rhodobacter capsulatus Expressionsstamms;
  • – Einbringen des rekombinanten Expressionsvektors in die Zellen des Expressionsstamms; und
  • – Expression des heterologen Zielgens in den Zellen des Expressionsstamms.
The object is achieved by a method for expressing heterologous genes, which comprises the following steps:
  • - producing at least one expression vector;
  • Cloning at least one heterologous target gene into the expression vector;
  • - preparing a Rhodobacter capsulatus expression strain;
  • Introducing the recombinant expression vector into the cells of the expression strain; and
  • - Expression of the heterologous target gene in the cells of the expression strain.

Die Aufgabe wird ferner durch einen Expressionsstamm gelöst, der Zellen des Bakteriums Rhodobacter capsulatus umfasst, welche durch Integration eines T7-RNA-Polymerasegens, das unter der Kontrolle des Rhodobacter-spezifischen Promotors Pfru steht, in das recA-Gen des Rhodobacter capsulatus – Chromosoms modifiziert sind.The object is further achieved by an expression strain of the cells of the bacterium Rhodobacter capsulatus comprises obtained by integration of a T7 RNA polymerase gene is under the control of Rhodobacter-specific promoter P fru, in the recA gene of Rhodobacter capsulatus - chromosome are modified.

Die Aufgabe wird auch durch einen Vektor zur heterologen Expression von Genen gelöst, der auf dem Plasmid pBBR22b basiert, wobei der Vektor sich von pBBR22b durch eine oder mehrere der folgenden Modifikationen unterscheidet:

  • – Deletion des lacI-Gens;
  • – Insertion des aphII-Gens des Tn5-Transposons, das unter der Kontrolle des Km-Promotors steht;
  • – Polylinker stromabwärts eines T7-Promotors; und/oder
  • – Polylinker stromabwärts oder stromaufwärts des Km-Promotors des aphII-Gens.
The object is also achieved by a vector for the heterologous expression of genes based on the plasmid pBBR22b, wherein the vector differs from pBBR22b by one or more of the following modifications:
  • Deletion of the lacI gene;
  • Insertion of the aphII gene of the Tn5 transposon under the control of the Km promoter;
  • Polylinker downstream of a T7 promoter; and or
  • Polylinker downstream or upstream of the Km promoter of the aphII gene.

Gegenstand der Erfindung sind also ein Verfahren und die Bereitstellung eines Expressionssystems, die jeweils auf dem Gram-negativen, phototrophen Bakterium Rhodobacter capsulatus basieren. R. capsulatus ist aufgrund seiner besonderen Physiologie gegenüber anderen mikrobiellen Expressionswirten wie z. B. E. coli besonders geeignet, membranlokalisierte Proteine in großen Mengen zu erzeugen: Unter phototrophen Wuchsbedingungen bildet R. capsulatus ein enorm vergrößertes vesikuläres Membransystem aus, welches eine hohe intrinsische Aufnahmekapazität für Membranproteine aufweist. Aufgrund der hohen Proteinkonzentration in den gebildeten Membranvesikeln werden in diesem Organismus sowohl leistungsfähige Translokationssysteme als auch geeignete Chaperone bereitgestellt.object The invention thus provides a method and the provision of a Expression system, each on the gram-negative, phototrophic Bacterium Rhodobacter capsulatus. R. capsulatus is due its special physiology over other microbial Expression hosts such. B. E. coli particularly suitable membrane-localized proteins in large quantities: under phototrophic growth conditions R. capsulatus forms a tremendously enlarged vesicular Membrane system, which has a high intrinsic absorption capacity for membrane proteins. Due to the high protein concentration in the membrane vesicles formed in this organism both efficient translocation systems as well as suitable ones Provided chaperones.

Darüber hinaus bietet R. capsulatus Vorteile bei der funktionellen Expression von Redoxenzymen und Proteinen die eine O2-Sensitivität aufweisen, oder in Gegenwart von Sauerstoff für den Wirtsorganismus toxisch sind. Unter phototrophen Bedingungen ist dieses Bakterium in der Lage, nahezu alle beschriebenen Redox-Kofaktoren in großen Mengen zu synthetisieren und in entsprechende (heterologe) Proteine einzubauen. Zudem ist der Organismus aufgrund der besonderen Physiologie optimal auf die Proteinproduktion unter anaeroben Bedingungen angepasst.In addition, R. capsulatus provides advantages in the functional expression of redox enzymes and proteins that exhibit O 2 sensitivity or are toxic to the host in the presence of oxygen. Under phototrophic conditions, this bacterium is able to synthesize almost all of the described redox cofactors in large quantities and to incorporate them into corresponding (heterologous) proteins. In addition, due to its special physiology, the organism is optimally adapted to protein production under anaerobic conditions.

Das hier beschriebene Expressionssystem setzt sich aus verschiedenen R. capsulatus Expressionsstämmen sowie aus einem Set neuer maßgeschneiderter (Über)expressionsvektoren zusammen. Es ermöglicht sowohl die Identifizierung neuer Enzyme im Hochdurchsatz-Screening als auch die Überexpression heterologer Problemproteine in R. capsulatus unter aeroben und anaeroben Bedingungen.The here described expression system consists of various R. capsulatus expression strains as well as a set of new ones customized (over) expression vectors together. It allows both the identification of new enzymes in the High-throughput screening as well as overexpression of heterologous Problematic proteins in R. capsulatus under aerobic and anaerobic conditions.

R. capsulatus weist einen hohen GC-Gehalt von 68% auf. Er ist somit für die heterolge Expression GC-reicher Gene besser geeignet als E. coli (51% GC; Blattner et al., 1997 ).R. capsulatus has a high GC content of 68%. It is thus more suitable for the heterogeneous expression of GC-rich genes than E. coli (51% GC; Blattner et al., 1997 ).

Durch die Ausbildung eines intracytoplasmatischen Membransystems erfährt R. capsulatus unter phototrophen Wachstumsbedingungen eine enorme Vergrößerung der Membranoberflache. Diese Eigenschaft kann zur effektiven Überexpression von Membranproteinen ausgenutzt werden, welche in großer Zahl in diese Membran eingebettet werden können, ohne toxische Effekte herbeizuführen.By the formation of an intracytoplasmic membrane system learns R. capsulatus under phototrophic growth conditions an enormous Enlargement of the membrane surface. This property can exploited for the effective overexpression of membrane proteins which are embedded in large numbers in this membrane can be used without causing toxic effects.

Da R. capsulatus bevorzugt unter anaeroben Bedingungen wächst und aufgrund der Photosynthese unter diesen Bedingungen vergleichsweise hohe Zellteilungsraten erreicht, ist er für die heterologe Synthese von sauerstoffsensitiven Proteinen oder Enzymen, die in Gegenwart von O2 eine toxische Wirkung besitzen, besonders geeignet.Since R. capsulatus preferentially grows under anaerobic conditions and achieves comparatively high cell division rates due to photosynthesis under these conditions, it is particularly suitable for the heterologous synthesis of oxygen-sensitive proteins or enzymes which have a toxic effect in the presence of O 2 .

In E. coli werden viele Kofaktoren und prosthetische Gruppen nur in geringen Mengen oder gar nicht synthetisiert. R. capsulatus dagegen synthetisiert unter phototrophen und diazotrophen Bedingungen eine Reihe dieser Komponenten, zum Beispiel Häm-Gruppen ( Lang et al. 1996 ; de Smet et al., 2001a ; Smart et al., 2004 ), Molybdän-Kofaktoren ( Wang et al., 1993 ; Solomon et al., 1999 ), und insbesondere verschiedene Eisen-Schwefel-Cluster ( Jeong & Jouanneau, 2000 ; Chevallet et al., 2003 ) in großen Mengen. Dieses Bakterium ist daher gut für die Expression heterologer Proteine geeignet, die solche Kofaktoren tragen. So konnten bereits mehrere Redoxproteine, die in E. coli nicht exprimierbar sind, in R. capsulatus erfolgreich überexprimiert werden. Dazu zählen zum Beispiel die Sulfit:Cytochrom c Oxido reduktase (SorAB) aus Starkeya novella ( Kappler & McEwan, 2002 ), sowie das Flavocytochrom c aus Purpurbakterien ( de Smet et al., 2001b ). Diese konnten in E. coli nicht synthetisiert werden.In E. coli, many cofactors and prosthetic groups are only synthesized in small amounts or not at all. R. capsulatus, on the other hand, synthesizes a number of these components, for example heme groups, under phototrophic and diazotrophic conditions. Lang et al. 1996 ; de Smet et al., 2001a ; Smart et al., 2004 ), Molybdenum cofactors ( Wang et al., 1993 ; Solomon et al., 1999 ), and in particular various iron-sulfur clusters ( Jeong & Jouanneau, 2000 ; Chevallet et al., 2003 ) in large amounts. This bacterium is therefore well suited for the expression of heterologous proteins carrying such cofactors. Thus, several redox proteins that are not expressible in E. coli have been successfully overexpressed in R. capsulatus. These include, for example, the sulfite: cytochrome c oxido reductase (SorAB) from Starkeya novella ( Kappler & McEwan, 2002 ), as well as the Flavocytochrom c from purple bacteria ( de Smet et al., 2001b ). These could not be synthesized in E. coli.

Erfindungsgemäß wird der Vektor pBBR22b zur Herstellung des Expressionsvektors modifiziert. Wenn der Vektor pBBR22b durch Deletion des lacI-Gens modifiziert wird, wird eine LacI-unabhängige Expression der Zielgene ermöglicht. Zusätzlich oder alternativ kann der Vektor pBBR22b durch Insertion des aphII-Gens des Tn5-Transposons, das unter der Kontrolle des Km-Promotors steht, modifiziert werden. Die Expression dieses Gens verleiht dem Rezipientenstamm eine selektierbare Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Kanamycin.According to the invention the vector pBBR22b modified to produce the expression vector. When the vector modifies pBBR22b by deletion of the lacI gene becomes LacI-independent expression of the target genes allows. Additionally or alternatively, the Vector pBBR22b by insertion of the aphII gene of the Tn5 transposon, which is under the control of the Km promoter. The expression of this gene confers on the recipient strain a selectable Resistance to the antibiotic kanamycin.

In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung wird das heterologe Gen in Leserichtung eines T7-Promotors in den Expressionsvektor kloniert. Wenn bei dieser Ausführungsform das aphII-Gen in entgegengesetzter Orientierung zum T7-Promotor transkribiert wird, unterliegt die Expression eines heterologen Zielgens lediglich der Kontrolle des T7-Promotors. Es kann also auch vorteilhaft sein, das heterologe Gen entgegengesetzt der Leserichtung des Km-Promotors des aphII-Gens in den Expressionsvektor zu klonieren.In Particularly advantageous embodiment of the invention is the heterologous Gene in the reading direction of a T7 promoter in the expression vector cloned. In this embodiment, when the aphII gene transcribed in opposite orientation to the T7 promoter is only subject to the expression of a heterologous target gene the control of the T7 promoter. So it can also be beneficial the heterologous gene opposite to the reading direction of the Km promoter clone the aphII gene into the expression vector.

In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung wird das heterologe Gen in Leserichtung des Km-Promotors des aphII-Gens in den Expressionsvektor kloniert. Wenn das aphII DNA-Fragment beispielsweise zwar den natürlichen Promotor des Gens, jedoch nicht den Transkriptionsterminator enthält, werden alle Zielgene, die in den Polylinker des neuen Expressionsvektors kloniert werden, vom aphII-Promotor konstitutiv exprimiert.In Another advantageous embodiment of the invention is the heterologous Gene in the reading direction of the Km promoter of the aphII gene in the expression vector cloned. For example, if the aphII DNA fragment is the natural one Promoter of the gene, but not containing the transcription terminator, All target genes that are in the polylinker of the new expression vector cloned, constitutively expressed by the aphII promoter.

In weiterer besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass der Expressionsstamm durch Integration eines T7-RNA-Polymerasegens, das unter der Kontrolle des Rhodobacter-spezifischen Promotors Pfru steht, in das recA-Gen von Rhodobacter capsulatus hergestellt wird. Der Expressionsstamm weist dadurch zwei besondere Eigenschaften auf, die für die heterologe Expression von entscheidender Bedeutung sind. Erstens wird durch die Integration des T7-RNA-Polymerasegens in das Chromosom ein genetisch stabiler Expressionswirt erzeugt, der eine in hohem Maße reproduzierbare und kontrollierbare Expression der Phagenpolymerase erlaubt. Zweitens weist der Expressionsstamm durch die Integration des T7-RNA-Polymerasegens in das recA-Gen eine recA-Mutation auf, wodurch homologe Rekombinationsereignisse zwischen Expressionsvektoren und Wirtschromosom komplett unterbunden werden.In a further particularly advantageous embodiment of the invention, it is provided that the expression strain is prepared by integration of a T7 RNA polymerase gene, which is under the control of the Rhodobacter-specific promoter P fru , into the recA gene of Rhodobacter capsulatus. The expression strain thus has two special properties which are of crucial importance for heterologous expression. First, integration of the T7 RNA polymerase gene into the chromosome produces a genetically stable expression host that allows highly reproducible and controllable expression of the phage polymerase. Second, by integrating the T7 RNA polymerase gene into the recA gene, the expression strain has a recA mutation, thereby completely preventing homologous recombination events between expression vectors and host chromosome.

Der erfindungsgemäße Vektor kann ferner ein Chloramphenicol-Resistenzgen oder ein Spectinomycin-Resistenzgen umfassen.Of the The vector of the invention may further comprise a chloramphenicol resistance gene or a spectinomycin resistance gene.

Wenn der Vektor ein His6-Affinitätstag oder ein Strepll-Affinitätstag umfasst, können die heterologen Genprodukte zudem am C-terminalen Ende an einen His6-Tag (z. B. pRhotHi) oder Strepll-Tag (z. B. pRhotS) fusioniert werden, welche jeweils eine einfache Detektion und affinitätschromatographische Aufreinigung erlauben.When the vector comprises a His 6 affinity tag or Strepll affinity tag, the heterologous gene products may also be fused at the C-terminal end to a His 6 tag (e.g., pRhotHi) or Strepll tag (e.g., pRhotS) which each allow easy detection and affinity chromatographic purification.

Erfindungsgemäß kann der Vekor bereits mindestens ein heterologes Zielgen stromabwärts eines T7-Promotors und/oder des Km-Promotors des aphII-Gens umfassen. In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung kann das heterologe Zielgen für ein fluoreszierendes Protein kodieren, vorzugsweise ein Flavin-Mononukleotid-(FMN-)basiertes Protein (FbFP). Ein solcher Vektor kann vorteilhafterweise zur in vivo Fluoreszenzmarkierung von Zellen, insbesondere Gram-negativen Bakterien, verwendet werden.According to the invention the Vekor already has at least one heterologous target gene downstream a T7 promoter and / or the Km promoter of the aphII gene. In a particularly advantageous embodiment of the invention, the encode heterologous target genes for a fluorescent protein, preferably a flavin mononucleotide (FMN) based protein (FbFP). Such a vector may advantageously be used for in vivo fluorescent labeling of cells, especially Gram-negative bacteria.

Die Erfindung umfasst auch ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das mindestens eine Nukleotidsequenz zur Synthese mindestens eines Polypeptids umfasst, wobei die Nukleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

  • a) Nukleotidsequenz, welche den erfindungsgemäßen Vektor umfasst;
  • b) Nukleotidsequenz, welche den erfindungsgemäßen Vektor und mindestens ein heterologes Zielgen umfasst;
  • c) Nukleotidsequenz, welche eine oder mehrere der Sequenzen gemäß SEQ ID NR: 1 bis 8, 10, 11 und 13 bis 18 umfasst;
  • d) Nukleotidsequenz, welche sich von der Nukleotidsequenz gemäß a), b) oder c) durch den Austausch zumindest eines Codons gegen ein synonymes Codon unterscheidet;
  • e) Nukleotidsequenz, deren komplementärer Strang mit den Nukleotid-sequenzen gemäß a), b) oder c) hybridisiert;
  • f) Nukleotidsequenz, welche zu mindestens 85%, vorzugsweise 90%, insbesondere 95%, mit der Nukleotidsequenz gemäß a), b) oder c) identisch ist;
  • g) Nukleotidsequenz, welche dem komplementären Strang der Nukleotidsequenzen gemäß a) bis f) entspricht.
The invention also encompasses a recombinant nucleic acid molecule comprising at least one nucleotide sequence for synthesizing at least one polypeptide, wherein the nucleotide sequence is selected from the group consisting of:
  • a) nucleotide sequence comprising the vector of the invention;
  • b) nucleotide sequence comprising the vector according to the invention and at least one heterologous target gene;
  • c) nucleotide sequence which comprises one or more of the sequences according to SEQ ID NO: 1 to 8, 10, 11 and 13 to 18;
  • d) nucleotide sequence which differs from the nucleotide sequence according to a), b) or c) by the exchange of at least one codon for a synonymous codon;
  • e) nucleotide sequence whose complementary strand hybridizes with the nucleotide sequences according to a), b) or c);
  • f) nucleotide sequence which is identical to at least 85%, preferably 90%, in particular 95%, with the nucleotide sequence according to a), b) or c);
  • g) nucleotide sequence which corresponds to the complementary strand of the nucleotide sequences according to a) to f).

Die Erfindung umfasst ferner einen Kit für die heterologe Expression mindestens eines Gens, welcher mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor umfasst. Dieser Kit kann in vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung zusätzlich den erfindungsgemäßen Expressionsstamm umfassen.The The invention further includes a kit for heterologous expression at least one gene which at least one inventive Vector includes. This kit can in an advantageous embodiment of Invention in addition to the invention Include expression strain.

Die Erfindung umfasst auch eine Zelle, welche mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor und/oder das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül enthält, sowie eine Zellkultur, welche erfindungsgemäße Zellen und/oder Zellen des erfindungsgemäßen Expressionsstamms umfasst.The The invention also encompasses a cell which comprises at least one invention Vector and / or the nucleic acid molecule according to the invention contains, as well as a cell culture, which inventive Cells and / or cells of the expression strain according to the invention includes.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens und Expressionssystems liegt darin, dass es insbesondere zur effektiven Überexpression des Zielgens sowohl unter unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen geeignet ist bzw. verwendet werden kann.One particular advantage of the method according to the invention and expression system is that it is particularly effective for overexpression of the target gene under both aerobic and anaerobic Conditions is suitable or can be used.

Die Erfindung wird im Weiteren anhand der folgenden Abbildungen und Ausführungsbeispiele beispielhaft näher erläutert.The Invention will be further described with reference to the following figures and Exemplary embodiments explained in more detail by way of example.

1: Funktionsmerkmale der neuen Rhodobacter-Expressionsvektoren. Schwarz: die Promotoren für die Expression (in pRhok: Km-Promotor, in pRhot: T7-Promotor); Dunkelgrau: Antibiotikaresistenz (AB); Hellgrau: Replikationsursprung zur Mobilisierung der Vektoren (MOB); Weiß: broad host range ori (REP). 1 : Features of the new Rhodobacter expression vectors. Black: the promoters for expression (in pRhok: Km promoter, in pRhot: T7 promoter); Dark gray: antibiotic resistance (AB); Light gray: origin of replication to mobilize the vectors (MOB); White: broad host range ori (REP).

2: Funktionelle DNA-Elemente der Klonierungs- und Expressionsregionen der pRho-Expressionsvektoren. Schwarzer Pfeil: Der T7-Promotor (der Km-Promotor in pRhok liegt stromaufwärts des T7-Promotors außerhalb des dargestellten Bereichs); Grau: Schnittstellen des Polylinkers (die eingeklammerten Schnittstellen sind nicht singulär); Schwarze Box: Tag-Sequenzen; Weiße Box: Ribosomenbindestelle (RBS) 2 : Functional DNA elements of the cloning and expression regions of the pRho expression vectors. Black arrow: The T7 promoter (the Km promoter in pRhok lies outside the region shown upstream of the T7 promoter); Gray: Interfaces of the polylinker (the bracketed interfaces are not singular); Black box: tag sequences; White Box: Ribosome Binding Site (RBS)

3: Die Rhodobacter-Expressionsvektoren pRhokHi-2 und pRhotHi-2. Schwarz: die Promotoren für die Expression (in pRhok: Km-Promotor, in pRhot: T7-Promotor); Dunkelgrau: Chloramphenicol-Resistenzgen (Cm); Hellgrau: Replikationsursprung zur Mobilisierung der Vektoren (MOB); Weiß: broad host range ori (REP) 3 : The Rhodobacter expression vectors pRhokHi-2 and pRhotHi-2. Black: the promoters for expression (in pRhok: Km promoter, in pRhot: T7 promoter); Dark gray: chloramphenicol resistance gene (Cm); Light gray: origin of replication to mobilize the vectors (MOB); White: broad host range ori (REP)

4: Die Rhodobacter-Expressionsvektoren pRhokHi-6 und pRhotHi-6. Schwarz: die Promotoren für die Expression (in pRhok: Km-Promotor, in pRhot: T7-Promotor); Dunkelgrau: Spectinomycin-Resistenzgen (Sp); Hellgrau: Replikationsursprung zur Mobilisierung der Vektoren (MOB); Weiß: broad host range ori (REP) 4 : The Rhodobacter expression vectors pRhokHi-6 and pRhotHi-6. Black: the promoters for expression (in pRhok: Km promoter, in pRhot: T7 promoter); Dark gray: Spectinomycin resistance gene (Sp); Light gray: origin of replication to mobilize the vectors (MOB); White: broad host range ori (REP)

5: Die Rhodobacter-Expressionsvektoren pRhokS-2 und pRhotS-2. Schwarz: die Promotoren für die Expression (in pRhok: Km-Promotor, in pRhot: T7-Promotor); Dunkelgrau: Chloramphenicol-Resistenzgen (Cm); Hellgrau: Replikationsursprung zur Mobilisierung der Vektoren (MOB); Weiß: broad host range ori (REP) 5 : The Rhodobacter expression vectors pRhokS-2 and pRhotS-2. Black: the promoters for expression (in pRhok: Km promoter, in pRhot: T7 promoter); Dark gray: chloramphenicol resistance gene (Cm); Light gray: origin of replication to mobilize the vectors (MOB); White: broad host range ori (REP)

6: Plasmidkarte des Mutagenesekonstrukts pRc-T7 zur Erzeugung des R. capsulatus T7-Expressionsstamms B10-T7. Weiß: Die Antibiotikaresistenzgene; Dunkelgrau: R. capsulatus recA-Gen; Hellgrau: Fruktose-induzierbarer R. capsulatus Promotor; Schwarz: T7-RNA-Polymerasegen. 6 : Plasmid map of the mutagenesis construct pRc-T7 to produce the R. capsulatus T7 expression strain B10-T7. White: the antibiotic resistance genes; Dark gray: R. capsulatus recA gene; Light gray: fructose-inducible R. capsulatus promoter; Black: T7 RNA polymerase gene.

7: Schema zur Erzeugung des R. capsulatus Expressionsstamms B10S-T7. (A) Da es zwei recA-homologe Regionen auf dem Plasmid pRc-T7 gibt, kann die homologe Rekombination grundsätzlich an zwei unterschiedlichen Orten des Chromosoms stattfinden. Somit können insgesamt drei verschiedene Rekombinationsergebnisse auftreten: Bei einem einfachen Rekombinationsereignis (B) wird das gesamte Plasmid, einschließlich beider Plasmid-codierter Resistenzgene, in das Genom integriert. Da es theoretisch zu einer Excision aus dem Chromosom kommen kann, indem die duplizierten homologen Regionen erneut miteinander rekombinieren, sind diese Plasmidintegrationen nicht stabil. Ein doppeltes Rekombinationsereignis (C) führt hingegen zu einer Insertion der Interposonkassette (Pfru > T7-Pol GmR), während der Rest des Plasmids (einschließlich der KmR) verloren geht. Da es nach diesem Rekombinationsereignis keine Duplikation homologer DNA-Bereiche mehr gibt, kann es zu keiner weiteren Rekombination kommen. (GmR = Gentamycin Resistenzgen; KmR = Kanamycin Resistenzgen; KmS = sensitiv gegen Kanamycin; Pfru = Fruktose-abhängiger Promotor; T7pol = T7-RNA-Polymerase-Gen). 7 : Scheme for the production of the R. capsulatus expression strain B10S-T7. (A) Since there are two recA homologous regions on the plasmid pRc-T7, homologous recombination can in principle occur at two different sites of the chromosome. Thus, a total of three different recombination results can occur: In a simple recombination event (B), the entire plasmid, including both plasmid-encoded resistance genes, is integrated into the genome. Since there may theoretically be excision from the chromosome by recombining the duplicated homologous regions together, these plasmid integrations are not stable. Conversely, a double recombination event (C) results in insertion of the interposon cassette ( Pfru > T7-Pol Gm R ), while the remainder of the plasmid (including Km R ) is lost. Since there is no duplication of homologous DNA regions after this recombination event, no further recombination can occur. (Gm R = gentamycin resistance gene, Km R = kanamycin resistance gene, Km S = kanamycin sensitive, P fru = fructose-dependent promoter, T7pol = T7 RNA polymerase gene).

8: Immunologischer Nachweis der Expression von T7-RNA-Polymerase und YFP in R. capsulatus (A) Nachweis der T7-RNA-Polymerase. (B) Nachweis des YFP. (–F/+F = nicht induziert/induziert; –O2/+O2 = anaerob/aerob; + = Positivkontrolle für T7-RNA-Polymerase und YFP; PKm yfp = R. capsulatus B10S (pRhok-yfp); PT7 yfp = R. capsulatus B10S-T7 (pRhot-yfp) 8th : Immunological detection of expression of T7 RNA polymerase and YFP in R. capsulatus (A) Detection of T7 RNA polymerase. (B) Evidence of YFP. (-F / + F = not induced / induced; -O 2 / + O 2 = anaerobic / aerobic; + = positive control for T7 RNA polymerase and YFP; P Km yfp = R. capsulatus B10S (pRhok-yfp); P T7 yfp = R. capsulatus B10S-T7 (pRhot-yfp)

9: Charakterisierung des neuen R. capsulatus Expressionssystems anhand der heterologen Expression des gelb fluoreszierenden Proteins YFP. Die relative Fluoreszenz wurde bei einer Anregungswellenlänge von 529 nm gemessen und auf eine Zelldichte von 1 (OD660) und ein Probenvolumen von 1 ml bezogen. Nähere Erläuterungen befinden sich im Text. 9 : Characterization of the new R. capsulatus expression system by heterologous expression of the yellow fluorescent protein YFP. The relative fluorescence was measured at an excitation wavelength of 529 nm and related to a cell density of 1 (OD 660 ) and a sample volume of 1 ml. Further explanations are in the text.

10: Synthese und Lokalisation von Bakterio-opsin in R. capsulatus. Bakterio-opsin wurde immunologisch unter Verwendung eines Anti-Hiss-Antiserums in zellfreien Proteinextrakten des R. capsulatus-Stamms B10S-T7 mit pRhotHi2-bop nachgewiesen. Durch Zugabe des Induktors Fruktose (8 mM) wurde die bop-Expression induziert. Mittels Fraktionierung der Proteinextrakte wurden die Zelltrümmer und Einschlusskörper sowohl von Membranen und Membranbestandteilen sowie von löslichen Zellbestandteilen getrennt und ebenfalls immunologisch analysiert. 10 : Synthesis and Localization of Bacterio-opsin in R. capsulatus. Bacterio-opsin was detected immunologically using an anti-Hiss antiserum in cell-free protein extracts of the R. capsulatus strain B10S-T7 with pRhotHi2-bop. By adding the inducer fructose (8 mM), bop expression was induced. By means of fractionation of the protein extracts, the cell debris and inclusion bodies were separated both from membranes and membrane constituents as well as from soluble cell constituents and also analyzed immunologically.

11: Gesamtproteinverteilung im Saccharosedichtegradienten. Zellmembranen und Membranfraktionen wurden durch Ultrazentrifugation im Saccharosedichtegradienten aufgetrennt und mittels Bradford-Analyse in Bezug auf ihren relativen Gesamtproteingehalt untersucht. 11 : Total protein distribution in sucrose density gradient. Cell membranes and membrane fractions were separated by ultracentrifugation in sucrose density gradient and analyzed by Bradford analysis for relative total protein content.

12: Akkumulation von Bakterio-opsin im Saccharosedichtegradienten. Die einzelnen Fraktionen des Saccharosedichtegradienten wurden in Bezug auf Bakterio-opsin immunologisch unter Verwendung eines Anti-His6-Antiserums analysiert. Bop konnte lediglich in Fraktion 29 des Saccharosedichtegradienten nachgewiesen werden. 12 : Accumulation of bacterio-opsin in sucrose density gradient. The individual fractions of the sucrose density gradient were analyzed immunologically with respect to bacterio-opsin using an anti-His 6 antiserum. Bop could only be detected in fraction 29 of the sucrose density gradient.

13: In vivo Fluoreszenzmarkierung von E. coli unter Verwendung der pRhokHi-2-FbFP Vektoren. Die einzelnen FbFP-Fluoreszenzmarker (BsFbFP, EcFbFP und PpFbFP) wurden in E. coli DH5⎕ exprimiert. Anschließend wurde die in vivo Fluoreszenz bestimmt (FbFP-Anregungs-wellenlange: 450 nm, Fluoreszenzdetektion: 495 nm). Das unmodifizierte BsFbFP Wildtyp-Protein YtvA, welches nur schwach fluoresziert, diente als Kontrolle. 13 : In vivo fluorescence labeling of E. coli using the pRhokHi-2-FbFP vectors. The individual FbFP fluorescent markers (BsFbFP, EcFbFP and PpFbFP) were expressed in E. coli DH5⎕. Subsequently, the in vivo fluorescence was determined (FbFP excitation wavelength: 450 nm, fluorescence detection: 495 nm). The unmodified BsFbFP wild type protein YtvA, which fluoresces only weakly, served as a control.

14: In vivo Fluoreszenzmarkierung von E. coli unter Verwendung der pRhotHi-2-FbFP Vektoren. Die einzelnen FbFP-Fluoreszenzmarker (BsFbFP, EcFbFP und PpFbFP) wurden in E. coli BL21(DE3) exprimiert. Anschließend wurde die in vivo Fluoreszenz bestimmt (FbFP-Anregungswellenlänge: 450 nm, Fluoreszenzdetektion: 495 nm). Das unmodifizierte BsFbFP Wildtyp-Protein YtvA, welches nur schwach fluoresziert, diente als Kontrolle. 14 : In vivo fluorescence labeling of E. coli using the pRhotHi-2-FbFP vectors. The individual FbFP fluorescent markers (BsFbFP, EcFbFP and PpFbFP) were expressed in E. coli BL21 (DE3). Subsequently, the in vivo fluorescence was determined (FbFP excitation wavelength: 450 nm, fluorescence detection: 495 nm). The unmodified BsFbFP wild type protein YtvA, which fluoresces only weakly, served as a control.

15: Die Rhodobacter-Expressionsvektoren pRhokHi-2 und pRhotHi-2. Sequenzen siehe SEQ ID NO: 1 und 2. 15 : The Rhodobacter expression vectors pRhokHi-2 and pRhotHi-2. Sequences see SEQ ID NO: 1 and 2.

16: Die Rhodobacter-Expressionsvektoren pRhokS-2 und pRhotS-2. Sequenzen siehe SEQ ID NO: 3 und 4. 16 : The Rhodobacter expression vectors pRhokS-2 and pRhotS-2. Sequences see SEQ ID NO: 3 and 4.

17: Die Rhodobacter-Expressionsvektoren pRhokHi-6 und pRhotHi-6. Sequenzen siehe SEQ ID NO: 5 und 6. 17 : The Rhodobacter expression vectors pRhokHi-6 and pRhotHi-6. Sequences see SEQ ID NO: 5 and 6.

18: Der Rhodobacter-Expressionsvektor pRhokHi-2-YFP. Sequenz siehe SEQ ID NO: 7. 18 : The Rhodobacter expression vector pRhokHi-2-YFP. Sequence see SEQ ID NO: 7.

19: Der Rhodobacter-Expressionsvektor pRhotHi-2-YFP. Sequenz siehe SEQ ID NO: 8. 19 : The Rhodobacter expression vector pRhotHi-2-YFP. Sequence see SEQ ID NO: 8.

20: Der Rhodobacter-Expressionsvektor pRhokHi-2-bop. Sequenz siehe SEQ ID NO: 10. 20 : The Rhodobacter expression vector pRhokHi-2-bop. Sequence see SEQ ID NO: 10.

21: Der Rhodobacter-Expressionsvektor pRhotHi-2-bop. Sequenz siehe SEQ ID NO: 11. 21 : The Rhodobacter expression vector pRhotHi-2-bop. Sequence see SEQ ID NO: 11.

22: Die Rhodobacter-Expressionsvektoren pRhokHi-BsFbFP und pRhotHi-BsFbFP. Sequenzen siehe SEQ ID NO: 13 und 14. 22 : The Rhodobacter expression vectors pRhokHi-BsFbFP and pRhotHi-BsFbFP. Sequences see SEQ ID NO: 13 and 14.

23: Die Rhodobacter-Expressionsvektoren pRhokHi-EcFbFP und pRhotHi-EcFbFP. Sequenzen siehe SEQ ID NO: 15 und 16. 23 : The Rhodobacter expression vectors pRhokHi-EcFbFP and pRhotHi-EcFbFP. Sequences see SEQ ID NO: 15 and 16.

24: Die Rhodobacter-Expressionsvektoren pRhokHi-2-PpFbFP und pRhotHi-2-PpFbFP. Sequenzen siehe SEQ ID NO: 17 und 18. 24 : The Rhodobacter expression vectors pRhokHi-2-PpFbFP and pRhotHi-2-PpFbFP. Sequences see SEQ ID NO: 17 and 18.

Um die physiologischen Vorteile von R. capsulatus für die heterologe Expression beliebiger Zielgene nutzen zu können, wurden zunächst verschiedene broad host range Expressionsvektoren konstruiert. Zusätzlich wurde ein R. capsulatus T7-Expressionsstamm generiert, der eine chromosomale Insertion des T7-RNA-Polymerasegens trägt, welches unter der Kontrolle eines Rhodobacter-spezifischen Promotors liegt.Around the physiological benefits of R. capsulatus for the to use heterologous expression of any target genes, were initially different broad host range expression vectors constructed. In addition, a R. capsulatus T7 expression strain was obtained generated a chromosomal insertion of the T7 RNA polymerase gene which is under the control of a Rhodobacter-specific Promoter lies.

Die funktionellen Eigenschaften der R. capsulatus ExpressionsvektorenThe functional properties of R. capsulatus expression vectors

Um eine Expression heterologer Gene in dem phototrophen Bakterium R. capsulatus zu ermöglichen, wurde ein umfassendes Set von Expressionsvektoren (pRho-Serie) konstruiert. Die generellen Eigenschaften dieser Vektoren sind in 1 dargestellt.To allow expression of heterologous genes in the phototrophic bacterium R. capsulatus, a comprehensive set of expression vectors (pRho series) was constructed. The general properties of these vectors are in 1 shown.

Für die heterologe Expression der rekombinanten Zielgene befinden sich auf den Expressionsvektoren alternativ zwei unterschiedliche Promotoren: (1) Der PKm-Promotor (Promotor des Kanamycin-Resistenzgens aphII) erlaubt eine moderate Expression des Zielgens (pRhok). Da die Expression des Kanamycin-Resistenzgens konstitutiv erfolg, ist keine Induktion der PKm-anhängigen Expression nötig. Die pRhok-Vektoren sind somit ideal für Hochdurchsatz-Screenings von Enzym- oder Metagenombanken. (2) Der T7-Promotor ermöglicht eine induzierbare Überexpression in Abhängigkeit der T7-RNA-Polymerase (pRhot; geeignet für biotechnologische Produktionsprozesse).For the heterologous expression of the recombinant target genes, two different promoters are alternatively present on the expression vectors: (1) The P Km promoter (promoter of the kanamycin resistance gene aphII) allows moderate expression of the target gene (pRhok). Since expression of the kanamycin resistance gene is constitutively successful, no induction of P Km- dependent expression is necessary. The pRhok vectors are thus ideal for high throughput screening of enzyme or metagenomic banks. (2) The T7 promoter enables inducible overexpression depending on the T7 RNA polymerase (pRhot, suitable for biotechnological production processes).

Die Vektoren wurden so konstruiert, dass sich die jeweiligen Zielgene über die NdeI-Restriktionsschnittstelle und eine weitere Schnittstelle des Polylinkers (siehe 2, grau unterlegte Bereiche) einklonieren lassen. Die heterologen Genprodukte können zudem am C-terminalen Ende an einen His6-Tag (z. B. pRhotHi) oder Strepll-Tag (z. B. pRhotS) fusioniert werden, welcher eine einfache Detektion und affinitätschromatographische Aufreinigung erlaubt ( Schmidt & Skerra 2007 ; Lichty et al. 2005 ).The vectors were designed so that the respective target genes via the NdeI restriction site and another interface of the polylinker (see 2 clone in areas with gray background). The heterologous gene products can also be fused at the C-terminal end to a His 6 tag (eg pRhotHi) or Strepll tag (eg pRhotS), which allows easy detection and affinity chromatographic purification ( Schmidt & Skerra 2007 ; Lichty et al. 2005 ).

Der Replikationsursprung mit breitem Wirtsbereich (broad host range ori) ermöglicht zudem den direkten Vergleich der Proteinausbeuten, Proteinlokalisation und Aktivität nach Expression in verschiedenen Gram-negativen Bakterien wie z. B. E. coli. Um einen möglichst flexiblen Einsatz der pRho-Expressionsvektoren in verschiedenen Expressionswirten zu gewährleisten, tragen die Plasmide unterschiedliche Antibiotika-Resistenzgene. Für die His6-Tag Expressionsvektoren stehen wahlweise Varianten mit einem Chioramphenicol- oder Spectinomycin-Resistenzgen zur Verfügung. Die StrepII-Tag Vektoren existieren bislang nur als Chloramphenicol-Varianten. In Tabelle 1 sind die verschiedenen Vektoren mit den namengebenden Eigenschaften und der entsprechenden Vektorbezeichnung aufgeführt. Tab. 1: Die pRho-Expressionsvektoren Km-Promotor T7-Pomotor Cm-Resistenz Sp-Resistenz Cm-Resistenz Sp-Resistenz His6-tag Strep-tag His6-tag Strep-tag His6-tag Strep-tag His6-tag Strep-tag pRhokHi-2 pRhokS-2 pRhokHi-6 - pRhotHi-2 pRhotS-2 pRhotHi-6 - The broad host range ori replication origin also allows for direct comparison of protein yields, protein localization, and activity after expression in various Gram-negative bacteria, such as. E. coli. In order to ensure the most flexible use of pRho expression vectors in different expression hosts, the plasmids carry different antibiotic resistance genes. For the His 6 -day expression vectors, variants with a chioramphenicol or spectinomycin resistance gene are available. The StrepII tag vectors exist so far only as chloramphenicol variants. Table 1 lists the various vectors with the eponymous characteristics and the corresponding vector designation. Tab. 1: The pRho expression vectors Km promoter T7 promoter has Cm resistance Sp resistance Cm resistance Sp resistance His 6-day Strep-tag His 6-day Strep-tag His 6-day Strep-tag His 6-day Strep-tag pRhokHi-2 pRhokS-2 pRhokHi-6 - pRhotHi-2 pRhotS-2 pRhotHi-6 -

Konstruktion der R. capsulatus ExpressionsvektorenConstruction of the R. capsulatus expression vectors

In dem folgenden Abschnitt wird die Konstruktion der R. capsulatus Expressionsvektoren eingehend erläutert.In The following section will discuss the construction of the R. capsulatus Expression vectors explained in detail.

Konstruktion der R. capsulatus Expressionsvektoren pRhokHi und pRhotHiConstruction of the R. capsulatus expression vectors pRhokHi and pRhotHi

Für die Konstruktion der pRho-Vektoren wurde der Expressionsvektor pBBR22b ( Rosenau und Jaeger, 2004 ) als Grundgerüst verwendet. Der pBBR22b-Vektor ist ein Hybridvektor, der aus Teilen des broad host range Vektors pBBR1MCS ( Kovach et al. 1994 ) und des E. coli T7-Expressionvektors pET22b (Novagen) besteht. Dieser Vektor wurde für den Einsatz in R. capsulatus wie folgt modifiziert: (i) Das Vektor-lokalisierte lacI-Gen, das für den Lac- Repressor codiert und in E. coli für die Regulation des T7-Promotors verantwortlich ist, wurde deletiert. Dies soll eine LacI-unabhängige Expression der Zielgene in R. capsulatus ermöglichen. (ii) Da das Chloramphenicol-Resistenzgen des pBBR1MCS in R. capsulatus nicht exprimiert wird, wurde das aphII-Gen des Tn5 Transposons in den Vektor eingesetzt. Die Expression dieses Gens verleiht dem R. capsulatus-Rezipientenstamm eine selektierbare Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Kanamycin.For the construction of the pRho vectors, the expression vector pBBR22b ( Rosenau and Jaeger, 2004 ) used as a backbone. The pBBR22b vector is a hybrid vector consisting of parts of the broad host range vector pBBR1MCS ( Kovach et al. 1994 ) and the E. coli T7 expression vector pET22b (Novagen). This vector was modified for use in R. capsulatus as follows: (i) The vector-localized lacI gene, encoding the lac repressor and responsible for the regulation of the T7 promoter in E. coli, was deleted. This should allow LacI-independent expression of the target genes in R. capsulatus. (ii) Since the chloramphenicol resistance gene of pBBR1MCS is not expressed in R. capsulatus, the aphII gene of the Tn5 transposon was inserted into the vector. The expression of this gene confers on the R. capsulatus recipient strain selectable resistance to the antibiotic kanamycin.

Um die genannten Modifikationen des pBBR22b vorzunehmen, wurde zunächst ein 1,2 kb großes EcoRI-Fragment, welches das aphII-Gen vollständig trägt, aus dem Vektor pBSL15 ( Alexeyev et al. 1995 ) herausgeschnitten. Durch die Restriktion des pBBR22b-Plasmids mit BglII und ApaI wurde der größte Teil des lacI-Gens aus diesem Vektor entfernt. Die bei der Restriktion entstandenen überhängenden Enden beider DNA-Fragmente wurden anschließend durch eine Behandlung mit der T4-DNA-Polymerase zu stumpfen Enden aufgefüllt und anschließend miteinander ligiert. Durch die unforcierte Klonierung wurde das aphII-Resistenzgen in zwei unterschiedlichen Orientierungen kurz oberhalb des T7-Promotors in das pBBR22b-Derivat einkloniert: In der ersten Orientierung entspricht die Leserichtung des aphII-Gens der des T7-Promotors. Da das aphII DNA-Fragment zwar den natürlichen Promotor des Gens, jedoch nicht den Transkriptionsterminator enthält, werden alle Zielgene, die in den Polylinker des neuen Expressionsvektors kloniert werden, vom aphII-Promotor konstitutiv exprimiert. Der neue 6678 bp große Rhodobacter Expressionsvektor wurde als pRhokHi-2 bezeichnet. In der zweiten Orientierung wird das aphII-Gen in entgegengesetzter Orientierung zum T7-Promotor transkribiert. Daher unterliegt in diesem Fall die Expression eines heterologen Zielgens lediglich der Kontrolle des T7-Promotors. Der so entstandene Expressionsvektor trägt den Namen pRhotHi-2. Die beiden rekombinanten Vektoren sind in 3 dargestellt. Für die Konstruktion der Spectinomycin-resistenten Derivate wurde eine 2 kb große ΩSp-Kassette durch eine HindIII-Restriktion aus dem Plasmid pHP45Ω ( Prentki & Krisch, 1984 ) herausgeschnitten. Die Ausgangsplasmide pRhokHi-2 und pRhotHi-2 wurden danach mit dem Restriktionsenzym SphI, dessen Erkennungssequenz in dem Cm-Resistenzgen lokalisiert ist, geöffnet. Die Ligation erfolgte auch hier nach der Auffüllreaktion der überhängenden DNA-Enden. Die beiden 8,7 kb großen, Sp-resistenten Plasmidvarianten pRhokHi-6 und pRhotHi-6 sind in 4 dargestellt.In order to carry out the abovementioned modifications of pBBR22b, initially a 1.2 kb EcoRI fragment which completely carries the aphII gene was obtained from the vector pBSL15 (FIG. Alexeyev et al. 1995 ) cut out. Restriction of the pBBR22b plasmid with BglII and ApaI removed most of the lacI gene from this vector. The resulting in the restriction overhanging ends of both DNA fragments were then made up by blending with the T4 DNA polymerase to blunt ends and then ligated together. Due to the unforced cloning, the aphII resistance gene was cloned into the pBBR22b derivative in two different orientations shortly above the T7 promoter: in the first orientation, the reading direction of the aphII gene corresponds to that of the T7 promoter. Although the aphII DNA fragment contains the natural promoter of the gene, but not the transcription terminator, all target genes that are cloned into the polylinker of the new expression vector are constitutively expressed by the aphII promoter. The new 6678 bp Rhodobacter expression vector was designated pRhokHi-2. In the second orientation, the aphII gene is transcribed in opposite orientation to the T7 promoter. Therefore, in this case, the expression of a heterologous target gene is only subject to the control of the T7 promoter. The resulting expression vector is named pRhotHi-2. The two recombinant vectors are in 3 shown. For the construction of the spectinomycin-resistant derivatives, a 2 kb ΩSp cassette was replaced by a HindIII restriction from the plasmid pHP45Ω ( Prentki & Krisch, 1984 ) cut out. The starting plasmids pRhokHi-2 and pRhotHi-2 were then opened with the restriction enzyme SphI, whose recognition sequence is located in the Cm resistance gene. The ligation was carried out here after the Auffüllreaktion the overhanging DNA ends. The two 8.7 kb, Sp-resistant plasmid variants pRhokHi-6 and pRhotHi-6 are in 4 shown.

Konstruktion der R. capsulatus Expressionsvektoren pRhotS-2 und pRhokS-2Construction of the R. capsulatus expression vectors pRhotS-2 and pRhokS-2

Da die Reinigung von Enzymen mit Metall-Cofaktoren über einen His6-Affinitätstag häufig problematisch ist, wurden zwei weitere pRho-Vektoren erzeugt, die anstelle des His-Tags für einen StreptavidinII-Tag codieren. Der StrepII-Tag ist ein aus acht Aminosäuren bestehendes Peptid (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys), welches eine sehr hohe intrinsische Affinität zu Streptavidin aufweist ( Schmidt und Skerra 2007 ).Since the purification of enzymes with metal cofactors over a His 6 affinity day is often problematic, two further pRho vectors were generated which code for a StreptavidinII tag instead of the His tag. The StrepII tag is an eight amino acid peptide (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys), which has a very high intrinsic affinity for streptavidin ( Schmidt and Skerra 2007 ).

Um den His6-Tag codierenden Bereich der pRhotHi-2 und pRhokHi-2 Vektoren durch eine StrepII-Tag codierende Sequenz zu ersetzen, wurde eine Quickchange-PCR ( Wang & Malcom, 1999 ) durchgeführt. Die Primer wurden so konstruiert, dass die homologen Primer-Bereiche stromaufwärts und stromabwärts der His6-codierenden Sequenz in den Ursprungsvektoren binden können. Zusätzlich besitzen beide Primer einen Bereich, der die vollständige Sequenz für den StrepII-Tag sowie eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym PstI aufweist (Tab. 2). Die StrepII-Tag codierende Sequenz wurde zu diesem Zweck optimal auf den Codongebrauch des Wirtsorganismus R. capsulatus angepasst. Tab. 2: Merkmale der Primer zur Erzeugung der Strep-Tag Vektoren pRhotS-2 und pRhokS-2

Figure 00170001
To replace the His 6 tag coding region of the pRhotHi-2 and pRhokHi-2 vectors with a StrepII-tag coding sequence, a rapid-change PCR was used. Wang & Malcom, 1999 ) carried out. The primers were designed so that the homologous primer regions can bind upstream and downstream of the His 6 coding sequence in the original vectors. In addition, both primers have a region containing the complete sequence for the StrepII tag as well as a recognition sequence for the restriction enzyme Pst I (Table 2). The StrepII tag coding sequence was optimally adapted for this purpose to the codon usage of the host organism R. capsulatus. Tab. 2: Characteristics of the primers for generating the strep-tag vectors pRhotS-2 and pRhokS-2
Figure 00170001

Durch eine Polymerase-Kettenreaktion konnten anschließend die jeweiligen StrepII-Tag codierenden Vektorvarianten pRhotS-2 und pRhokS-2 vollständig amplifiziert werden. Für die Quickchange-PCR wurden die folgenden Ansätze und PCR-Programme verwendet: (1) PCR-Ansätze: Komponente ad 20 μl Endkonz. Template 0,4 μl Primer 100 pM je 2 μl 0,5 μM Puffer 5x 4 μl 1x dNTP Mix 10 mM 0,4 μl 200 μM Phusion Pol. 0,2 μl 0,02 U/μl dH2O 10,4 μl (2) PCR-Programm (PCR-Cycler: EP-Gradient der Fa. Eppendorf)

Figure 00180001
By means of a polymerase chain reaction, the respective StrepII tag-encoding vector variants pRhotS-2 and pRhokS-2 could then be completely amplified. For the rapid change PCR, the following approaches and PCR programs were used: (1) PCR approaches: component ad 20 μl Final conc. template 0.4 μl Primer 100 pM each 2 μl 0.5 μM Buffer 5x 4 μl 1x dNTP mix 10 mM 0.4 μl 200 μM Phusion Pol. 0.2 μl 0.02 U / μl dH 2 O 10.4 μl (2) PCR program (PCR cycler: EP gradient from Eppendorf)
Figure 00180001

Die gewählten Primer und PCR-Methoden eignen sich für die Erzeugung beider StrepII-Tag Expressionsvektoren, da die entscheidenden Parameter, wie etwa die homologen Primersequenzen, in beiden Fällen identisch sind. Das Produkt der PCR-Reaktion ist der jeweilige linearisierte pRho-Expressionsvektor, der an beiden Enden je eine Sequenz für den Streptavidin-Tag aufweist. Um die linearen DNA-Fragmente zu zirkularisieren, wurden die PCR-Produkte zunächst mit dem Restriktionsenzym PstI (die entsprechenden Schnittstellen wurden durch die Primer an beiden Enden des PCR-Produkts erzeugt) behandelt und anschließend wurden die Fragment-Enden miteinander ligiert. Hierdurch wurden die Vektoren pRhokS-2 und pRhotS-2 erzeugt (5).The chosen primers and PCR methods are suitable for the generation of both StrepII tag expression vectors, since the crucial parameters, such as the homologous primer sequences, are identical in both cases. The product of the PCR reaction is the respective linearized pRho expression vector, which has a sequence for the streptavidin tag at both ends. To circularize the linear DNA fragments, the PCR products were first treated with the restriction enzyme PstI (the corresponding cleavage sites were generated by the primers at both ends of the PCR product), and then the fragment ends were ligated together. This generated the vectors pRhokS-2 and pRhotS-2 ( 5 ).

Erzeugung des R. capsulatus Expressionsstamms B10S-T7Generation of the R. capsulatus expression strain B10S-T7

Im Weiteren wurde ein spezieller R. capsulatus T7-Expressionsstamm erzeugt. Bei diesem Expressionsstamm (Stammbezeichnung: R. capsulatus B10S-T7) wurde das T7-RNA-Polymerasegen, welches sich unter der Kontrolle eines Rhodobacter-spezifischen Fruktoseinduzierbaren Promotors (Pfru, Duport er al. 1994 ) befindet, mittels homologer Rekombination in das chromosomal lokalisierte recA-Gen von R. capsulatus integriert. Der Bakterienstamm weist dadurch zwei besondere Eigenschaften auf, die für die heterologe Expression von entscheidender Bedeutung sind: (1) Durch die Integration des T7-RNA-Polymerasegens in das Chromosom wurde ein genetisch stabiler Expressionswirt erzeugt, der eine in hohem Maße reproduzierbare, sowie kontrollierbare Expression der Phagenpolymerase erlaubt. (2) Durch die Integration des T7-RNA-Polymerasegens in das recA-Gen weist der R. capsulatus Stamm B10S-T7 eine recA-Mutation auf, wodurch homologe Rekombinationsereignisse zwischen Expressionsvektoren und Wirtschromosom komplett unterbunden werden.Furthermore, a special R. capsulatus T7 expression strain was generated. In this expression strain (strain: R. capsulatus B10S-T7) was the T7 RNA polymerase gene, which under the control of a Rhodobacter-specific fructose inducible promoter (P fru , Duport he al. 1994 ) is integrated into the chromosomally localized recA gene of R. capsulatus by homologous recombination. The bacterial strain thus has two particular properties which are of crucial importance for heterologous expression: (1) The integration of the T7 RNA polymerase gene into the chromosome has produced a genetically stable expression host which is highly reproducible as well as controllable Expression of phage polymerase allowed. (2) By integrating the T7 RNA polymerase gene into the recA gene, the R. capsulatus strain B10S-T7 has a recA mutation, completely preventing homologous recombination events between expression vectors and host chromosome.

Konstruktion des Mutagenesevektors pRc-T7Construction of the mutagenesis vector pRc-T7

Um ein stabiles R. capsulatus-basiertes T7-Expressionssystem zu erzeugen, sollte das T7 RNA Polymerasegen mittels homologer Rekombination in das chromosomale recA-Gen des Bakteriums integriert werden. Zu diesem Zweck wurde das Plasmid pRc-T7 wie folgt kon struiert: (1) In den Vektor pIC20R ( Marsh et al. 1984 ) wurde zunächst ein 1128 bp langes DNA-Fragment kloniert, welches einen Teil des Gens recA aus R. capsulatus einschließlich der gesamten Promotorregion umfasst. Dazu wurde das entsprechende DNA-Fragment zuvor mit einer PCR spezifisch amplifiziert (Primer: recA-up: 5'-GGAATTCCAGCGCGACGGTGGTGAAGG-3'; recA-down: 5'-GGAATTCCGCATTGCCGCCCGAGGTC-3'). Die Klonierung des entstandenen DNA-Fragments erfolgte dabei über die EcoRI-Schnittstellen, die aufgrund der verwendeten PCR-Primer das PCR-Produkt flankieren (die EcoRI-Schnittstellen sind in den oben genannten Primersequenzen unterstrichen). Der rekombinante Vektor wurde als pIC20R-recA' bezeichnet. (2) Parallel wurde das T7-RNA-Polymerasegen mittels PCR so amplifiziert, dass das PCR-Produkt am 5'-Ende eine NdeI-Schnittstelle (Primer: Pol1-up: 5'-CATATGAACACGATTAACATCGCT-3'; NdeI-Schnittstelle unterstrichen) und am 3'-Ende eine PstI-Schnittstelle (Primer: Pol1-low: 5'-CTGCAGTTACGCGAACGCGAAGTCCGA-3'; XhoI-Schnittstelle unterstrichen) aufwies. Diese Schnittstellen wurden dazu verwendet, das T7-RNA-Polymerasegen in den Vektor pFRKII ( Duport et al. 1994 ) einzuklonieren. Durch diesen Klonierungsschritt wurde eine Kassette erzeugt, die neben einem selektierbaren Resistenzmarker (Gm-Resistenzgen) das T7-RNA-Polymerasegen trägt, welches sich nun unter der Kontrolle des R. capsulatus Fruktose-Promotors befindet. (3) Die so erzeugte 5,7 kb große Pfru > T7-Polymerasegen-GmR-Kassette wurde als HindIII-Fragment aus dem rekombinanten pFRKII-Derivat isoliert und in die singuläre HindIII-Schnittstelle des pIC20R-recA' einkloniert, sodass sich sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts der Kassette ca. 500 bp der homologen recA-Sequenz befinden. (4) Das gesamte 6,8 kb große Insertfragment (recA::Pfru > T7-Polymerasegen-GmR) wurde zuletzt über die flankierenden EcoRI-Schnittstellen in den mobilisierbaren Suizidvektor pSUP401 ( Simon et al. 1983 ) einkloniert. Das entstandene Mutagenesekonstrukt wurde als pRc-T7 bezeichnet und ist in 6 dargestellt.To generate a stable R. capsulatus-based T7 expression system, the T7 RNA polymerase gene should be integrated by homologous recombination into the chromosomal recA gene of the bacterium. For this purpose, the plasmid pRc-T7 was constructed as follows: (1) In the vector pIC20R ( Marsh et al. 1984 ) first cloned a 1128 bp DNA fragment comprising part of the R. capsulatus recA gene, including the entire promoter region. For this, the corresponding DNA fragment was previously amplified specifically with a PCR (primer: recA-up: 5'-G GAATTC CAGCGCGACGGTGGTGAAGG-3 ', recA-down: 5'-G GAATTC CGCATTGCCGCCCGAGGTC-3'). The cloning of the resulting DNA fragment was carried out via the EcoRI interfaces, which flank the PCR product due to the PCR primer used (the EcoRI sites are underlined in the primer sequences mentioned above). The recombinant vector was designated pIC20R-recA '. (2) In parallel, the T7 RNA polymerase gene was PCR amplified so that the PCR product at the 5 'end underlined an NdeI site (primer: Pol1-up: 5'- CATATG AACACGATTAACATCGCT-3', NdeI site ) and at the 3 'end a PstI site (primer: Pol1-low: 5'- CTGCAG TTACGCGAACGCGAAGTCCGA-3'; XhoI site underlined). These interfaces were used to insert the T7 RNA polymerase gene into the vector pFRKII ( Duport et al. 1994 ) einklonieren. This cloning step produced a cassette which, in addition to a selectable resistance marker (Gm resistance gene), carries the T7 RNA polymerase gene, which is now under the control of the R. capsulatus fructose promoter. (3) The 5.7 kb P fru > T7 polymerase gene GmR cassette thus generated was isolated as a HindIII fragment from the recombinant pFRKII derivative and cloned into the unique HindIII site of pIC20R-recA ', so that both 500 bp of the homologous recA sequence are located upstream and downstream of the cassette. (4) The entire 6.8 kb insert fragment (recA :: P fru> T7 polymerase-Gm R) was recently (about flanking EcoRI sites in the mobilizable suicide vector pSUP401 Simon et al. 1983 ) cloned. The resulting mutagenesis construct was named pRc-T7 and is in 6 shown.

Insertion des T7-RNA-Polymerasegens in das R. capsulatus ChromosomInsertion of the T7 RNA Polymerase Gene in the R. capsulatus chromosome

Zur Erzeugung des R. capsulatus T7-Expressionsstamms B10S-T7 wurde zunächst das Plasmid pRc-T7 in den R. capsulatus Wildtyp-Stamm B10S transferiert. Anschließend wurde das T7-RNA-Polymerasegen durch ein doppeltes Rekombinationsereignis über die homologen DNA-Abschnitte des recA-Gens stabil in das Chromosom intergriert (7).To generate the R. capsulatus T7 expression strain B10S-T7, the plasmid pRc-T7 was first transferred to the R. capsulatus wild-type strain B10S. Subsequently, the T7 RNA polymerase gene was stably integrated into the chromosome by means of a double recombination event via the homologous DNA segments of the recA gene ( 7 ).

Die Plasmidintegration (7B) wurde anschließend von der stabilen Interposoninsertion (7C) anhand der nachweisbaren Antibiotikaresistenzen der erzeugten Rhodobacter-Klone unterschieden:
Bei einem single-crossover wird das gesamte Plasmid pRc-T7 in das chromosomale Gen recA integriert. Auf diese Weise gelangt sowohl das Gentamycin-Resistenzgen als auch das Kanamycin-Resistenzgen in das Chromosom von R. capsulatus B10S. Die Anordnung der einzelnen Elemente des Plasmids unterscheidet sich allerdings abhängig vom Rekombinationsort. Kommt es dagegen zu einem Rekombinationsereignis zwischen den homologen Bereichen beider möglicher Rekombinationsorte, wird nur die Interposonkassette mit dem Gm-Resistenzgen in das chromosomale recA-Gen inseriert. Der Rest des Plasmides einschließlich der Kanamycin-Resistenz geht jedoch verloren. Die rekombinanten R. capsulatus-Stämme, die aufgrund des Antibiogramms als putativ positive R. capsulatus B10S-T7 Stämme identifiziert werden konnten, wurden anschließend eingehender charakterisiert. Mittels verschiedener PCR-Nachweismethoden wurde die spezifische Integration des T7-Polymerasegens in das chromosomal lokalisierte recA-Gen nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Der so entstandene R. capsulatus T7-Expressionsstamm wurde im Weiteren funktionell charakterisiert.
Plasmid integration ( 7B ) was subsequently isolated from the stable interposon insertion ( 7C ) based on the detectable antibiotic resistance of the produced Rhodobacter clones:
In a single crossover, the entire plasmid pRc-T7 is integrated into the chromosomal gene recA. In this way, both the gentamicin resistance gene and the kanamycin resistance gene enter the chromosome of R. capsulatus B10S. However, the arrangement of the individual elements of the plasmid differs depending on the recombination site. If, on the other hand, a recombination event occurs between the homologous regions of both possible recombination sites, only the interposon cassette with the Gm resistance gene is inserted into the chromosomal recA gene. The rest of the plasmid, including kanamycin resistance, is lost. The recombinant R. capsulatus strains identified as putative positive R. capsulatus B10S-T7 strains by the antibiogram were then further characterized. By means of various PCR detection methods, the specific integration of the T7 polymerase gene into the chromosomally localized recA gene has been demonstrated (data not shown). The resulting R. capsulatus T7 expression strain was subsequently characterized functionally.

Charakterisierung des T7-Expressionsstammes R. capsulatus B10S-T7Characterization of the T7 expression strain R. capsulatus B10S-T7

Heterologe Expression eines cytoplasmatischen Proteins in R. capsulatusHeterologous expression of a cytoplasmic Protein in R. capsulatus

Die Funktionalität des R. capsulatus T7-Expressionssystems wurde auf zwei Arten überprüft: Zum einen wurde mittels immunologischer Nachweismethoden ermittelt, ob sich in dem R. capsulatus Stamm B10S-T7 die T7-RNA-Polymerase Fruktose-abhängig exprimieren lässt (8). Zum anderen wurde die Funktionalität des Expressionsvektors pRhotHi-2 überprüft, indem das Gen des „gelb fluoreszierenden Proteins” (yellow fluorescent Protein, YFP) in den Rhodobacter-Expressionsvektor einkloniert und anschließend die T7-RNA-Polymerase-abhängige Expression des YFP-Gens mittels immunologischer Methoden qualitativ (8) und anhand der spezifischen YFP-Fluoreszenz quantitativ (9) nachgewiesen wurde.The functionality of the R. capsulatus T7 expression system was tested in two ways: first, it was determined by means of immunological detection methods whether the T7 RNA polymerase could be expressed fructose-dependent in the R. capsulatus strain B10S-T7 ( 8th ). On the other hand, the functionality of the expression vector pRhotHi-2 was checked by cloning the gene of the yellow fluorescent protein (YFP) into the Rhodobacter expression vector and then by means of the T7 RNA polymerase-dependent expression of the YFP gene immunological methods qualitative ( 8th ) and by the specific YFP fluorescence quantitatively ( 9 ) was detected.

Zudem wurde die Expressionsstärke des R. capsulatus T7-Expressionssystems mit der des PKm-abhängigen Systems (pRhok-Vektoren) verglichen. Um festzustellen, ob Sauerstoff einen Einfluss auf das R. capsulatus Expressionssystem ausübt, wurde die Anzucht der unterschiedlichen R. capsulatus Expressionsstämme sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen durchgeführt (8 und 9).In addition, the expression level of the R. capsulatus T7 expression system was compared with that of the P Km- dependent system (pRhok vectors). In order to determine whether oxygen exerts an influence on the R. capsulatus expression system, the cultivation of the different R. capsulatus expression strains was carried out under both aerobic and anaerobic conditions ( 8th and 9 ).

Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden:

  • (i) Das für YFP codierende Zielgen kann sowohl mit dem PKm- als auch mit den T7-Expressionsvektoren pRhokHi-2 und pRhotHi-2 unter phototrophen Wuchsbedingungen (8, Spur 2–6; 9, schwarze Balken) sowie unter aeroben heterotrophen Bedingungen (8, Spur 9–13; 9 graue Balken) exprimiert werden. Die in 9 dargestellte YFP-Fluoreszenz ist dabei ein direktes Maß für die Akkumulation des Fluoreszenzreporters. Durch die PT7-abhängige Expression des YFP-Gens konnte zudem eine zwei- bis dreifach höhere Expressionsrate erzielt werden.
  • (ii) Die T7-RNA-Polymerase sowie das Reporterprotein YFP akkumulieren in dem R. capsulatus T7-Expressionsstamm nur unter induzierenden Bedingungen (8 Spuren 4, 6, 11 und 13; 9 +I) in signifikanten Mengen, wohingegen die PKm-abhängige Expression von YFP, wie erwartet, konstitutiv und somit ohne die Zugabe eines Induktors erfolgt.
  • (iii) Durch Zugabe von 8 mM Fruktose kann eine vollständige Induktion der T7-Polymerase-abhängigen Expression des Reportergens erzielt werden (Daten nicht gezeigt). (iv) Zwei bis vier Stunden nach der Induktion wird in R. capsulatus der maximale Expressionslevel erreicht (Daten nicht gezeigt).
The results can be summarized as follows:
  • (i) The target gene coding for YFP can be labeled with both the P Km and the T7 expression vectors pRhokHi-2 and pRhotHi-2 under phototrophic growth conditions ( 8th , Lane 2-6; 9 , black bars) and under aerobic heterotrophic conditions ( 8th , Lane 9-13; 9 gray bars) are expressed. In the 9 represented YFP fluorescence is a direct measure of the accumulation of the fluorescent reporter. By the P T7- dependent expression of the YFP gene, a two to three times higher expression rate could be achieved.
  • (ii) The T7 RNA polymerase and the reporter protein YFP accumulate in the R. capsulatus T7 expression strain only under inducing conditions ( 8th Lanes 4, 6, 11 and 13; 9 + I) in significant amounts, whereas the P Km- dependent expression of YFP is constitutive, as expected, and thus without the addition of an inducer.
  • (iii) Complete induction of T7 polymerase-dependent reporter gene expression can be achieved by adding 8 mM fructose (data not shown). (iv) Two to four hours after induction, maximum expression level is reached in R. capsulatus (data not shown).

Heterologe Expression eines Membranproteins in R. capsulatusHeterologous expression of a membrane protein in R. capsulatus

Um zu überprüfen, inwieweit die R. capsulatus-Expressionstoolbox dazu verwendet werden kann, heterologe Membranproteine zu exprimieren und diese unter phototrophen Wuchsbedingungen in die ICM des Bakteriums einzubauen, wurde das bop Gen (codiert für das membranständige Bakterio-opsin mit sieben Transmembranhelices) aus dem Archaea Halobacterium salinarum ( Dunn et al. 1981 ) in den Vektor pRhotHi-2 kloniert und anschließend in den R. capsulatus Expressionsstamm B10S-T7 transferiert.To test the extent to which the R. capsulatus expression tool box can be used to express heterologous membrane proteins and incorporate them into the ICM of the bacterium under phototrophic growth conditions, the bop gene (encoded for the membrane-bound bacteriospasm with seven transmembrane helices) was used Archaea Halobacterium salinarum ( Dunn et al. 1981 ) in the vector pRhotHi-2 and then transferred into the R. capsulatus expression strain B10S-T7.

Zur Überprüfung, ob R. capsulatus unter phototrophen Anzuchtbedingungen Bakterio-opsin exprimiert und akkumuliert, wurden zellfreie Proteinextrakte vom Stamm R. capsulatus B10S-T7 mit dem plasmidkodierten bop-Gen (pRhotHi-2-bop) erzeugt. Der Nachweis des Bop-Proteins erfolgte unter Verwendung eines Antiserums (Anti-His6-Antikörper, Fermentas GmbH, St. Leon-Roth Deutschland) mittels Westernblot-Analyse (10).To test whether R. capsulatus expresses and accumulates bacterio-opsin under phototrophic culture conditions, cell-free protein extracts of strain R. capsulatus B10S-T7 were generated with the plasmid-encoded bop gene (pRhotHi-2-bop). The detection of the Bop protein was carried out using an antiserum (anti-His 6 antibody, Fermentas GmbH, St. Leon-Roth Germany) by Western blot analysis ( 10 ).

Das in 10 dargestellte Ergebnis dieser Untersuchung verdeutlicht, dass Bakterio-opsin in R. capsulatus B10S-T7 nur akkumuliert, wenn dem Medium ein geeigneter Induktor zugegeben wurde (distinkte Signale mit einem Molekulargewicht von ca. 30 kDa in Spur 2 und 3). Die Abbildung verdeutlicht ebenfalls, dass Bop hauptsächlich in der Zellmembran und in Membranbestandteilen nachweisbar ist (Spur 3). Weniger Bakterio-opsin akkumuliert in Einschlusskörpern (Spur 2). Kein Bop war nachweisbar in den löslichen Zellbestandteilen (Spur 4).This in 10 The result of this study shows that bacterio-opsin in R. capsulatus only accumulates B10S-T7 when a suitable inducer has been added to the medium (distinct signals with a molecular weight of about 30 kDa in lanes 2 and 3). The figure also shows that Bop is mainly detectable in the cell membrane and in membrane components (lane 3). Less bacterio-opsin accumulates in inclusion bodies (lane 2). No bop was detectable in the soluble cell constituents (lane 4).

Zur Isolierung von Membranvesikeln aus der Membranfraktion (10, Spur 3) wurde ein Aliquot mittels Saccharosedichtegradientenzentrifugation aufgetrennt. Dazu wurde ein kontinuierlicher Saccharosegradient von 10 bis 60% Saccharose (w/w) präpariert und mit zellfreien Membranbestandteilen für 17 Stunden bei 175000 g ultra-zentrifugiert. Anschließend wurden Fraktionen zu je 1 ml abgenommen. In diesen Fraktionen wurde der Proteingehalt mittels Bradford-Analyse sowie der Saccharosegehalt im Refraktometer bestimmt.For the isolation of membrane vesicles from the membrane fraction ( 10 , Lane 3), an aliquot was fractionated by sucrose density gradient centrifugation. For this, a continuous sucrose gradient of 10 to 60% sucrose (w / w) was prepared and ultracentrifuged with cell-free membrane components for 17 hours at 175000 g. Subsequently, fractions of 1 ml each were taken. In these fractions, the protein content was determined by means of Bradford analysis and the sucrose content in the refractometer.

Das in 11 dargestellte Ergebnis dieser Untersuchungen zeigt den höchsten Gesamtproteingehalt in den Membranfraktionen 28 bis 33 sowie einen deutlich geringeren Gesamtproteingehalt in den Fraktionen 2 bis 5.This in 11 The result of these studies shows the highest total protein content in membrane fractions 28 to 33 and a significantly lower total protein content in fractions 2 to 5.

Die Ergebnisse belegen somit eindeutig, dass (i) heterologe Membranproteine mithilfe der neuen Rhodobacter-Expressionstoolbox exprimiert werden können. (ii) Das in den Zellen akkumulierte Membranprotein ist bei phototropher Anzucht der Zellen zu einem großen Anteil in der intracytoplasmatischen Membran intergriert und kann (iii) durch eine Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation in definierten Membranfraktionen identifiziert werden.The Results thus clearly demonstrate that (i) heterologous membrane proteins using the new Rhodobacter Expression Toolbox can. (ii) The membrane protein accumulated in the cells in phototrophic culture of the cells to a large extent integrated into the intracytoplasmic membrane and can (iii) by a sucrose density gradient centrifugation in defined Membrane fractions are identified.

Erzeugung von Broad-host-range Vektoren zur in vivo Fluoreszenzmarkierung Gram-negativer Bakterien auf Basis der pRhot/k-VektorenGeneration of broad-host-range vectors for in vivo fluorescence labeling of Gram-negative bacteria based on pRhot / k vectors

In vivo Fluoreszenzreporter werden in der Molekularbiologie für ein breites Spektrum verschiedener Anwendungen eingesetzt. Sie können zur Untersuchung von regulatorischen Prozessen wie auch zur Analyse der Lokalisation, Interaktion und Faltung von Proteinen verwendet werden. Darüber hinaus werden Fluoreszenzreporter dazu eingesetzt, lebende Zellen so zu markieren, dass sie mit einfachen Methoden identifiziert und lokalisiert werden können. Auf Basis der neu entwickelten pRho-Expressionsvektoren, die ein weites Wirtspektrum aufweisen und so in verschiedenen Gram-negativen Bakterien replizieren, wurden neue Fluoreszenzmarkierungsvektoren erzeugt. Dazu wurden drei unterschiedliche Gene, die für FMN-basierte Fluoreszenzproteine (FbFP) codieren, in die Expressionsvektoren pRhokHi-2 und pRhotHi-2 kloniert. Im Gegensatz zu herkömmlichen Fluoreszenproteinen der GFP-Familie besitzen die FbFPs den Vorteil, dass sie universell in aeroben und anaeroben biologischen Systemen eingesetzt werden können ( Drepper et al., 2007 ). Nach der Erzeugung der rekombinanten pRho-Vektoren (Details sind im Material- & Methodenteil beschrieben) wurden die Fluoreszenzproteine BsFbFP, PpFbFP und EcFbFP in E. coli exprimiert und anschließend die in vivo Fluoreszenz am Fluoreszenzphotometer Luminescence Spectrometer LS50B bestimmt. Anahnd der spezifischen FbFP-Fluoreszenzen konnte gezeigt werden, dass sowohl die PKm-abhängige (13) als auch die PT7-abhängige (14) Expression der FbFP-Proteine zu einer nachweisbaren in vivo Fluoreszenz führt.In vivo fluorescent reporters are used in molecular biology for a wide range of different applications. They can be used to study regulatory processes as well as to analyze the localization, interaction and folding of proteins. In addition, fluorescent reporters are used to mark living cells so that they can be identified and localized with simple methods. Based on the newly developed pRho expression vectors, which have a broad host range and thus replicate in different Gram-negative bacteria, new fluorescence labeling vectors were generated. For this purpose, three different genes coding for FMN-based fluorescent proteins (FbFP) were cloned into the expression vectors pRhokHi-2 and pRhotHi-2. In contrast to conventional GFP family of fluorescent proteins, FbFPs have the advantage that they can be used universally in aerobic and anaerobic biological systems ( Drepper et al., 2007 ). After generation of the recombinant pRho vectors (details are described in the Materials & Methods section), the fluorescent proteins BsFbFP, PpFbFP and EcFbFP were expressed in E. coli and subsequently the in vivo fluorescence was determined on the Luminescence Spectrometer LS50B fluorescence photometer. Based on the specific FbFP fluorescence, it was shown that both the PKm-dependent ( 13 ) as well as the PT7-dependent ( 14 ) Expression of FbFP proteins leads to detectable in vivo fluorescence.

Die Funktionalität der Fluoreszenzmarkierungsvektoren konnte am Beispiel des pRhokHi-2-PpFbFP und pRhotHi-2-PpFbFP auch in den Gram-negativen Bakterien Pseudomonas putida und R. capsulatus nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).The Functionality of the fluorescent labeling vectors could on the example of pRhokHi-2-PpFbFP and pRhotHi-2-PpFbFP also in the Gram-negative bacteria Pseudomonas putida and R. capsulatus have been detected (data not shown).

Konstruktion der Vektoren pRhok/t-YFP, pRhok/t-bop und pRhok/t-FbFPConstruction of the vectors pRhok / t-YFP, pRhok / t-bop and pRhok / t-FbFP

Konstruktion der YFP-Expressionsvektoren pRhokHi-2-YFP und pRhotHi-2-YFPConstruction of YFP expression vectors pRhokHi-2-YFP and pRhotHi-2-YFP

Zur Synthese PT7- und PaphII-abhängiger YFP-pRho-Expressionsvektoren wurde das Gen YFP mittels PCR mit spezifischen Oligonukleotidstartermolekülen amplifiziert (YFPUP: 5'-GGA ATT CCA TAT GGT GAG CAA GGG CGA GGA GCT-3', Tm = 73°C; YFPDWN: 5'-CGG GAT CCT TAC TTG TAC AGC TCG TCC ATG C-3', Tm = 69°C; MWG Biotech AG, Ebersberg, Deutschland). Durch die Oligonukleotidstartermoleküle wurde dem PCR-Produkt am 5'-Ende eine NdeI-Restriktionsschnittstelle und am 3'-Ende eine BamHI-Restriktionsschnittstelle angefügt. Die Sequenz der NdeI-Schnittstelle enthält gleichzeitig das Startkodon AUG des YFP-Gens. Als DNA-Matrize für YFP diente das rekombinante Plasmid pFF19-EYFP ( Timmermans et al., 1990 ), welches u. a. für YFP kodiert. Die flankierenden Restriktionsschnittstellen ermöglichten die Umklonierungen im Rahmen der weiteren Arbeiten.For the synthesis of P T7 and P aph II -dependent YFP-pRho expression vectors, the gene YFP was amplified by means of PCR with specific oligonucleotide starter molecules (YFPUP: 5'-GGA ATT CCA TAT GGT GAG CAA GGG CGA GGA GCT-3 ', T m = 73 ° C; YFPDWN: 5'-CGG GAT CCT TAC TTG TAC AGC TCG TCC ATG C-3 ', Tm = 69 ° C; MWG Biotech AG, Ebersberg, Germany). Through the oligonucleotide starter molecules, an NdeI restriction site was added to the PCR product at the 5 'end and a BamHI restriction site at the 3' end. The sequence of the NdeI site simultaneously contains the start codon AUG of the YFP gene. The DNA template for YFP was the recombinant plasmid pFF19-EYFP ( Timmermans et al., 1990 ), which among other things codes for YFP. The flanking restriction sites allowed the recloning in the context of further work.

Zuvor wurde das amplifizierte DNA-Fragment jedoch mit glatten Enden („blunt end”) in die SmaI-Restriktionsschnittstelle des Sequenziervektors pSVB10 kloniert. Der E. coli Stamm DH5α wurde anschließend mit den resultierenden rekombinanten Plasmiden pSVB10·IYFP und pSVB10·IIYFP transformiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Der Klonierungserfolg wurde durch geeignete Testrestriktionen bestätigt (Daten nicht gezeigt) und die DNA-Sequenz des klonierten Fragments durch Sequenzierung (Sequiserve GmbH, Vaterstetten, Deutschland) überprüft.before However, the amplified DNA fragment was blunt-ended ("blunt end ") into the SmaI restriction site of the sequencing vector pSVB10 cloned. The E. coli strain DH5α was subsequently with the resulting recombinant plasmids pSVB10 · IYFP and pSVB10 · IIYFP transformed and overnight incubated at 37 ° C. The cloning success was by suitable Test restrictions confirmed (data not shown) and the DNA sequence of the cloned fragment by sequencing (Sequiserve GmbH, Vaterstetten, Germany).

Nach erfolgreicher Sequenzierung wurde das YFP-Reportergen mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und BamHI in einer Doppelrestriktion aus den pSVB10-Derivaten herausgeschnitten und in die NdeI- und BamHI-Restriktionsschnittstelle des PKm-Expressionsvektors bzw. des PT7-Expressionsvektors kloniert. Die entstandenen rekombinanten Plasmide tragen die Namen pRhokHi-2-YFP und pRhotHi-2-YFP. Das mit Hilfe der Expressionsplasmide pRhokHi-2-YFP sowie pRhotHi-2-YFP synthetisierte Protein YFP besteht aus 239 Aminosäuren und trägt kein C-terminales Hexahistidinpeptid.After successful sequencing, the YFP reporter gene was excised with the restriction endonucleases NdeI and BamHI in a double restriction from the pSVB10 derivatives and cloned into the NdeI and BamHI restriction sites of the P Km expression vector and the P T7 expression vector, respectively. The resulting recombinant plasmids are named pRhokHi-2-YFP and pRhotHi-2-YFP. The protein YFP synthesized by means of the expression plasmids pRhokHi-2-YFP and pRhotHi-2-YFP consists of 239 amino acids and carries no C-terminal hexahistidine peptide.

Konstruktion der bop-Expressionsvektoren pRhokHi-2-bop und pRhotHi-2-bopConstruction of bop expression vectors pRhokHi-2-bop and pRhotHi-2-bop

Um die konstitutive (aphII-Promotor-abhängige) sowie die T7-RNA-Polymerase-abhängige Synthese von Bakterio-opsin (Bop) zu ermöglichen, wurde das korrespondierende bop-Gen in die Expressionsplasmide pRhokHi-2 (konstitutive Expression) und pRhotHi-2 (T7-RNA-Polymerase-abhängige Expression) kloniert. Dazu wurde bop mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) mit spezifischen Oligonukleotidstartermolekülen amplifiziert (5'-TTT CAT ATG TTG GAG TTA TTG CCA ACA GCA GTG GAG-3'; 5'-AAA CTC GAG GTC GCT GGT CGC GGC CGC-3'; MWG Biotech AG, Ebersberg, Deutschland). Durch die Oligonukleotidstartermoleküle wurde dem PCR-Produkt am 5'-Ende eine NdeI-Restriktionsschnittstelle und am 3'-Ende eine XhoI-Restriktionsschnittstelle angefügt. Die Sequenz der NdeI-Schnittstelle enthält gleichzeitig das Startkodon AUG des bop-Gens. Als DNA-Matrize für das bop-Gen diente das rekombinante Plasmid pAWG/P(T5)His10bop ( Dyczmons, N. G., 2006 ).In order to enable constitutive (aphII promoter-dependent) and T7 RNA polymerase-dependent synthesis of bacterio-opsin (Bop), the corresponding bop gene was transformed into the expression plasmids pRhokHi-2 (constitutive expression) and pRhotHi-2 (T7 RNA polymerase-dependent expression) cloned. For this purpose, bop was amplified by polymerase chain reaction (PCR) with specific oligonucleotide starter molecules (5'-TTT CAT ATG TTG GAG TTA TTG CCA ACA GCA GTG GAG-3 ';5'-AAA CTC GAG GTC GCT GGT CGC GGC CGC-3'; MWG Biotech AG, Ebersberg, Germany). Through the oligonucleotide starter molecules, an NdeI restriction site was added to the PCR product at the 5 'end and an XhoI restriction site at the 3' end. The sequence of the NdeI site simultaneously contains the start codon AUG of the bop gene. As the DNA template for the bop gene, the recombinant plasmid PAWG / P served (T5) His 10 bop ( Dyczmons, NG, 2006 ).

Nach erfolgreicher PCR wurde das amplifizierte DNA-Fragment mit glatten Enden in die SmaI-Restriktionsschnittstelle des Sequenziervektors pSVB10 kloniert. Anschließend wurde der E. coli Stamm DH5α mit den resultierenden rekombinanten Plasmiden pSVB10-bopI und pSVB10-bopII transformiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Der Klonierungserfolg wurde durch geeignete Testrestriktionen überprüft (Daten nicht gezeigt) und die DNA-Sequenz des klonierten Fragments durch Sequenzierung (Sequiserve GmbH, Vaterstetten, Deutschland) bestätigt.To successful PCR, the amplified DNA fragment was smooth Ends in the SmaI restriction site of the sequencing vector pSVB10 cloned. Subsequently, the E. coli strain DH5α with the resulting recombinant plasmids pSVB10-bopI and pSVB10-bopII and incubated overnight at 37 ° C. The cloning success was checked by suitable test restrictions (Data not shown) and the DNA sequence of the cloned fragment by sequencing (Sequiserve GmbH, Vaterstetten, Germany) approved.

Nach erfolgreicher Sequenzierung wurde das bop-Gen mit Hilfe der Restriktionsendonukleasen NdeI und XhoI in einer Doppelrestriktion aus den pSVB10-Derivaten herausgeschnitten und in die korrespondierenden Schnittstellen des aphII-Promotor-abhängigen Expressionsvektor pRhokHi-2 sowie des T7-RNA-Polymerase-abhängigen Expressionsvektors pRhotHi-2 kloniert. Die entstandenen rekombinanten Plasmide tragen die Namen pRhokHi-2-bop bzw. pRhotHi-2-bop.To successful sequencing was the bop gene using the restriction endonucleases NdeI and XhoI in a double restriction from the pSVB10 derivatives cut out and into the corresponding interfaces of the aphII promoter-dependent expression vector pRhokHi-2 as well of the T7 RNA polymerase-dependent expression vector pRhotHi-2 cloned. The resulting recombinant plasmids carry the names pRhokHi-2-bop or pRhotHi-2-bop.

Das mit Hilfe der Expressionsplasmide pRhokHi-2-bop sowie pRhotHi-2-bop rekombinant synthetisierte Protein Bakterio-opsin besteht aus 270 Aminosäuren (inklusive Hexahistidinpeptid) und wird als Präprotein synthetisiert. Die Aminosäuren 1 bis 13 dienen als sogenannte leader-Sequenz, die durch posttranslationale Prozessierung entfernt werden.The with the help of the expression plasmids pRhokHi-2-bop and pRhotHi-2-bop Recombinantly synthesized protein bacterio-opsin consists of 270 Amino acids (including hexahistidine peptide) and is called Preprotein synthesized. The amino acids 1 to 13 serve as a so-called leader sequence by posttranslational processing be removed.

Im Gegensatz dazu besteht das Wildtyp Präprotein aus Halobacterium salinarum aus 261 Aminosäuren, dessen 13 N-terminale Aminosäuren durch posttranslationale Prozessierung entfernt werden. Das Wildtypprotein Bakterio-opsin besteht somit aus 248 Aminosäuren.in the In contrast, the wild type preprotein consists of Halobacterium salinarum consists of 261 amino acids, whose 13 N-terminal amino acids be removed by post-translational processing. The wild type protein Bacterio-opsin thus consists of 248 amino acids.

Konstruktion der FbFP-Expressionsvektoren pRhokHi-2-FbFP und pRhotHi-2-FbFPConstruction of FbFP expression vectors pRhokHi-2-FbFP and pRhotHi-2-FbFP

Um die konstitutive (aphII-Promotor-abhängige) sowie die T7-RNA-Polymerase-abhängige Synthese der in vivo Fluoreszenzmarker BsFbFP, PpFbFP und EcFbFP zu ermöglichen, wurde die korrespondierende Reportergene in die Expressionsplasmide pRhokHi-2 (konstitutive Expression) und pRhotHi-2 (T7-RNA-Polymerase-abhängige Expression) kloniert. Die BsFbFP- und PpFbFP-codierenden Gene lagen im Vektor pET28 vor, wohingegen das EcFbFP-Gen zuvor in den Vektor pBlueskript einkloniert worden war ( Drepper et al. 2007 ). Die Gene EcFbFP (409 bp) und PpFbFP (449 bp) wurden mit NdeI und XhoI aus den Ursprungsvektoren isoliert und über die entsprechenden Schnittstellen in die pRho-Vektoren kloniert. Da das BsFbFP-Gen (790 bp) eine zusätzliche XhoI-Schnittstelle aufweist, wurde das dritte Fluoreszenzreportergen über die NdeI und BamHI Schnittstellen in die broad host range Expressionsvektoren kloniert.To enable constitutive (aphII promoter-dependent) and T7 RNA polymerase-dependent synthesis of the in vivo fluorescent markers BsFbFP, PpFbFP and EcFbFP, the corresponding reporter genes were transformed into the expression plasmids pRhokHi-2 (constitutive expression) and pRhotHi-2 (T7 RNA polymerase-dependent expression) cloned. The BsFbFP- and PpFbFP-encoding genes were present in the vector pET28, whereas the EcFbFP gene had been previously cloned into the vector pBluescript ( Drepper et al. 2007 ). The genes EcFbFP (409 bp) and PpFbFP (449 bp) were isolated with NdeI and XhoI from the original vectors and cloned into the pRho vectors via the corresponding cleavage sites. Since the BsFbFP gene (790 bp) has an additional XhoI site, the third fluorescent reporter gene was cloned into the broad host range expression vectors via the NdeI and BamHI sites.

Ligation von DNA-FragmentenLigation of DNA fragments

Zur Ligation von DNA-Fragmenten und entsprechend hydrolysierter Vektor-DNA wurde die T4-DNA-Ligase (Fermentas) eingesetzt. Das Enzym wurde gemäß den Herstellerangaben im mitgelieferten Puffer eingesetzt und entweder 2 h bei RT oder über Nacht bei 16°C inkubiert. In einem Reaktionsvolumen von 10 bis 20 μl wurden Vektor-DNA und die zu insertierende DNA in einem Verhältnis von 1:3 bis 1:5 eingesetzt.to Ligation of DNA fragments and corresponding hydrolyzed vector DNA T4 DNA ligase (Fermentas) was used. The enzyme was according to the manufacturer's instructions in the supplied buffer used and either at RT for 2 h or overnight at RT Incubated at 16 ° C. In a reaction volume of 10 to 20 ul were vector DNA and the DNA to be inserted in a ratio from 1: 3 to 1: 5.

Nach der Reaktion wurde die Ligase durch 10minütige Inkubation bei 65°C inaktiviert.To The reaction was ligase by incubation for 10 minutes inactivated at 65 ° C.

Transformationtransformation

Herstellung transformationskompetenter ZellenProduction of transformation-competent cell

Nachdem der zu transformierende E. coli-Stamm über Nacht in 5 ml LB-Medium zu einer stationären Wuchsphase angezogen wurde, wurde 1 ml der Kultur in 100 ml LB-Medium inokuliert, welches zuvor mit 2 ml Mg2+-Mix versehen wurde. Bei 37°C wurde die Kultur inkubiert, bis sie eine OD580 von 0,4 bis 0,6 erreicht hatte. Von diesem Moment an mussten die Zellen stets bei 4°C gehalten werden. Mg2+-Mix MgCl2 500 mM MgSO4 500 mM After the E. coli strain to be transformed was grown overnight in 5 ml of LB medium to a stationary growth phase, 1 ml of the culture was inoculated into 100 ml of LB medium previously provided with 2 ml of Mg 2+ mix. At 37 ° C, the culture was incubated until it reached an OD 580 of 0.4 to 0.6. From that moment on, the cells had to be kept at 4 ° C. Mg 2+ mix MgCl 2 500 mM MgSO4 500 mM

Die Zellen wurden 20 min bei 7.000 rpm in einer Kühlzentrifuge pelletiert und anschließend in 50 ml TMF-Puffer (vorgekühlt auf 4°C) resuspendiert. Transformationspuffer (TMF) CaCl2 100 mM RbCl2 50 mM MnCl2 40 mM The cells were pelleted for 20 minutes at 7,000 rpm in a refrigerated centrifuge and then resuspended in 50 ml of TMF buffer (precooled to 4 ° C). Transformation buffer (TMF) CaCl2 100 mM RbCl2 50 mM MnCl2 40 mM

Nach 30- bis 60-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zellen erneut für 20 min bei 7.000 rpm und 4°C zentrifugiert, um danach in 10 ml TMF + 20% (v/v) Glycerol (4°C) resuspendiert zu werden.To The cells were incubated on ice for 30-60 minutes centrifuged again for 20 min at 7,000 rpm and 4 ° C, then resuspended in 10 ml of TMF + 20% (v / v) glycerol (4 ° C) to become.

Es wurden Aliquots der Kultur zu je 200 μl hergestellt und diese bei –80°C gelagert.It 200 μl aliquots of the culture were prepared and stored at -80 ° C.

Hitzeschock-Transformation von E. coli-Zellen mit Plasmid-DNAHeat shock transformation of E. coli cells with plasmid DNA

200 μl transformationskompetente Zellen wurden mit 100 μl eiskaltem TMF-Puffer und einem zuvor präparierten Ligationsansatz oder 1–5 μl isolierter Plasmid-DNA) vermischt. Als Negativkontrolle wurde stets ein Ansatz ohne DNA-Zugabe parallel behandelt.200 μl Transformation competent cells were incubated with 100 μl of ice-cold TMF buffer and a previously prepared ligation batch or 1-5 μl of isolated plasmid DNA). The negative control was always a batch without addition of DNA in parallel treated.

Es erfolgte eine mindestens 30minütige Inkubation auf Eis, nach welcher die Zellen einem Hitzeschock (42°C für 1,5 bis 2,5 min) ausgesetzt wurden. Sofort nach dem Hitzeschock wurde der Ansatz mit 700 μl LB-Medium (ohne Antibiotikum) versetzt. Die Zellen wurden danach abhängig von der durch das Plasmid vermittelten Antibiotikaresistenz für einige Stunden (meist 2 h; bei Gm-Resistenz 4 h) bei 37°C auf einem Brutroller inkubiert zur phänischen Expression. Nach Ablauf dieser Zeit wurde die Kultur 5 min bei 13.000 rpm zentrifugiert, 800 μl Überstand abgenommen und die Zellen im restlichen Überstand resuspendiert. Diese Suspension wurde dann auf selektivem LB-Agar plattiert.It incubation on ice for at least 30 minutes, after which the cells are subjected to a heat shock (42 ° C for 1.5 to 2.5 minutes) were exposed. Immediately after the heat shock was the approach with 700 ul LB medium (without antibiotic) added. The cells were then dependent on the the plasmid mediated antibiotic resistance for some Hours (usually 2 h, with resistance to gm 4 h) at 37 ° C a breeding roller incubated for phenic expression. To At this time the culture was centrifuged for 5 min at 13,000 rpm, 800 ul of supernatant removed and the cells in remaining supernatant resuspended. This suspension was then plated on selective LB agar.

Präparation von Plasmid-DNAPreparation of plasmid DNA

Die Präparation von Plasmid-DNA erfolgte nach dem Prinzip der alkalischen Lyse. Bei Zeitmangel wurde statt der im Folgenden beschriebenen Methode das Perfectprep Plasmid Mini Kit der Firma Eppendorf benutzt; zur Präparation größerer Mengen von Plasmid-DNA diente in jedem Fall das HiSpeed Plasmid Midi Kit der Firma QIAGEN.The Preparation of plasmid DNA was carried out according to the principle of alkaline lysis. In case of lack of time instead of the described below Method used the Eppendorf Perfectprep Plasmid Mini Kit; for the preparation of larger amounts of plasmid DNA In any case, the HiSpeed Plasmid Midi Kit from QIAGEN was used.

1,5 bis 3 ml einer E. coli Übernachtkultur wurden durch 5minütige Zentrifugation bei 13.000 rpm pelletiert und danach in 100 μl Lösung I resuspendiert. Es folgten 5 min Inkubation auf Eis. Dann wurden 200 μl Lösung II zugeben, die Mischung bis zur vollständigen Lyse der Bakterien invertiert und anschließend wieder 5 min auf Eis inkubiert. Dann wurde das Gemisch vorsichtig mit 150 μl Lösung III vermengt und 10 min auf Eis inkubiert. Lösung I (pH 8,0) Glucose 50 mM Tris-HCl 25 mM EDTA 10 mM Lösung II NaOH 0,2 M SDS 1% (w/v) Lösung III (pH 4,8) 5 M Kaliumacetat 60 ml Essigsäure 8,5 ml 1.5 to 3 ml of an E. coli overnight culture were pelleted by centrifugation at 13,000 rpm for 5 minutes and then resuspended in 100 μl of solution I. This was followed by 5 min incubation on ice. Then 200 .mu.l of solution II were added, the mixture was inverted until complete lysis of the bacteria and then incubated again on ice for 5 min. Then the mixture was mixed carefully with 150 .mu.l of solution III and incubated on ice for 10 min. Solution I (pH 8.0) glucose 50 mM Tris-HCl 25 mM EDTA 10mM Solution II NaOH 0.2 M SDS 1% (w / v) Solution III (pH 4.8) 5 M potassium acetate 60 ml acetic acid 8.5 ml

Durch 10minütige Zentrifugation bei 13.000 rpm und 4°C wurden denaturierte chromosomale DNA und Proteine sowie Zelltrümmer sedimentiert. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt und mit der gleichen Menge Isopropanol (vorgekühlt auf 4°C) versetzt. Es folgte eine 10minütige Inkubation auf Eis, nach welcher erneut bei 13.000 rpm und 4°C 10 min zentrifugiert wurde.By 10 minutes centrifugation at 13,000 rpm and 4 ° C were denatured chromosomal DNA and proteins as well as cell debris sedimented. The supernatant was transferred to a new Eppendorf tube and with the same amount of isopropanol (pre-cooled to 4 ° C). This was followed by a 10 minute incubation on ice, after which again at 13,000 rpm and 4 ° C 10 was centrifuged min.

Der Überstand wurde verworfen und das Pellet dreimal mit 1 ml 70% Ethanol (4°C) gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde möglichst viel von dem Ethanolrückstand abgenommen und das Pellet eine halbe Stunde bei 37°C getrocknet, um danach in 35 μl TE-Puffer + RNase A (von Sigma, Endkonzentration 20 μg/ml) resuspendiert zu werden. TE-Puffer (pH 8,0) Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM The supernatant was discarded and the pellet washed three times with 1 ml of 70% ethanol (4 ° C). After the last washing step, as much of the ethanol residue as possible was removed and the pellet was dried for half an hour at 37 ° C., after which it was resuspended in 35 μl of TE buffer + RNase A (from Sigma, final concentration 20 μg / ml). TE buffer (pH 8.0) Tris-HCl 10mM EDTA 1 mm

Es folgte eine 15minütige Inkubation bei 37°C. Die isolierte Plasmid-DNA wurde bei –20°C gelagert.It followed by a 15 minute incubation at 37 ° C. The isolated plasmid DNA was stored at -20 ° C.

Methoden zur Charakterisierung von DNAMethods for characterization of DNA

Hydrolytische Spaltung von DNA durch RestriktionsendonukleasenHydrolytic cleavage of DNA by restriction endonucleases

Zur hydrolytischen Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen (Restriktion) wurden von den jeweiligen Restriktionsenzymen (Firma Fermentas) 1 Enzymeinheit (Unit) pro μg DNA eingesetzt. Um optimale Reaktionsbedingungen zu gewährleisten wurden die vom Hersteller für die jeweiligen Enzyme (oder Enzymkombinationen bei Doppelverdauen) empfohlenen Puffer verwendet. Die Spaltung wurde bei der für das Enzym angegebenen Temperatur über 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Die Inaktivierung der Enzyme nach erfolgter Reaktion geschah durch die Zugabe von 5 μl DNA-Probenpuffer.to hydrolytic cleavage of DNA by restriction endonucleases (Restriction) were from the respective restriction enzymes (company Fermentas) 1 enzyme unit (unit) per μg DNA used. To ensure optimum reaction conditions were by the manufacturer for the respective enzymes (or enzyme combinations used in double digestion) recommended buffer. The split was at the temperature indicated for the enzyme 1 to 2 hours. The inactivation of the enzymes after the reaction was carried out by the addition of 5 .mu.l DNA sample buffer.

Agarosegelelektrophoreseagarose gel electrophoresis

Die Agarosegelelektrophorese wurde zur Größenbestimmung hydrolysierter DNA-Moleküle, zur Mengenabschätzung isolierter DNA sowie zur präparativen Isolierung von DNA-Fragmenten eingesetzt.The Agarose gel electrophoresis was used to sizing hydrolyzed DNA molecules, for quantity estimation isolated DNA and for the preparative isolation of DNA fragments used.

Bei diesem Verfahren kommt es zu einer Trennung unterschiedlich großer DNA-Moleküle. Dank der negativen Ladungen des Zucker-Phosphat-Gerüstes der DNA wandert diese bei Anlegung einer elektrischen Spannung zur Kathode, wobei Konformation und Molekularge wicht für eine unterschiedliche Wandergeschwindigkeit verschieden großer DNA-Fragmente sorgen. Weiteren Einfluss auf die Wandergeschwindigkeit haben die angelegte Spannung und die Konzentration des Agarosegels.at This process results in a separation of different sizes DNA molecules. Thanks to the negative charges of the sugar-phosphate scaffold the DNA migrates to it when an electrical voltage is applied Cathode, where conformation and Molekularge weight for a different traveling speeds of different sizes DNA fragments provide. Have further influence on the traveling speed the applied voltage and the concentration of the agarose gel.

Zur Bereitung des Agarosegels wurde Agarose (zu einer Endkonzentration von 0.6 bis 1% je nach Bedarf) in 0.5fach TBE-Puffer aufgekocht. TBE-Puffer 5fach (pH 8,3): Tris-HCl 89 mM Borat 89 mM EDTA 2,5 mM To prepare the agarose gel, agarose (to a final concentration of 0.6 to 1% as needed) was boiled in 0.5X TBE buffer. TBE buffer 5-fold (pH 8.3): Tris-HCl 89 mM borate 89 mM EDTA 2.5mM

Diese Lösung wurde noch heiß in eine Gelkammer gegossen, ein Gelkamm (mit ausreichend großen Zähnen je nach Menge der aufzutragenden DNA-Probe) eingesetzt und Ethidiumbromid (0,5 μg pro ml Agarose-TBE-Lösung) zugesetzt. Ethidiumbromid interkaliert in die Helix doppelsträngiger DNA und emittiert bei einer Bestrahlung mit UV-Licht sichtbares Licht, so dass die Lage der DNA-Banden angezeigt wird.This solution was poured while still hot into a gel chamber, a gel comb (with sufficiently large teeth depending on the amount of DNA sample to be applied) used and ethidium bromide (0.5 ug per ml Agaro se-TBE solution). Ethidium bromide intercalates into the helix of double-stranded DNA and emits visible light upon exposure to UV light, indicating the location of the DNA bands.

Die Proben wurden mit DNA-Probenpuffer (1/5 Volumen) versetzt. DNA-Probenpuffer (5x): EDTA 100 mM Glycerol 43% (v/v) BPB 0,05% (w/v) The samples were spiked with 1/5 volume DNA sample buffer. DNA sample buffer (5x): EDTA 100 mM glycerol 43% (v / v) BPB 0.05% (w / v)

Nach der Polymerisation des Gels wurde der Gelkamm entfernt, das Gel in eine Gelelektrophorese-Kammer eingesetzt und mit 0,5fach TBE-Puffer überschichtet. Die DNA-Proben wurden in die Geltaschen gefüllt. Zusätzlich wurde ein DNA-Marker (Gibco 1 kb DNA Ladder von Invitrogen) aufgetragen, um nach dem Gellauf die Größe der Banden zu bestimmen. Dann erfolgte das Anlegen einer Spannung von 135 V, bis die gewünschte Trennung erreicht war (gewöhnlich 15 bis 30 min je nach Konzentration des Gels).To In the polymerization of the gel, the gel comb was removed, the gel placed in a gel electrophoresis chamber and overlaid with 0.5X TBE buffer. The DNA samples were filled in the gel pockets. additionally a DNA marker (Gibco 1 kb DNA Ladder from Invitrogen) was applied, to determine the size of the bands after the gel run. Then a voltage of 135 V was applied until the desired Separation was achieved (usually 15 to 30 minutes depending on Concentration of the gel).

Abschließend wurde das Gel mit der Eagle-Eye II-Kamera (Stratagene) fotografiert. Die DNA wurde dabei durch die Bestrahlung mit UV-Licht (λ = 254–366 nm), durch welche das an die DNA gebundene Ethidiumbromid Licht im sichtbaren Bereich (λ = 590 nm) emittiert, sichtbar gemacht.Finally The gel was photographed with the Eagle-Eye II camera (Stratagene). The DNA was thereby irradiated with UV light (λ = 254-366 nm) through which the ethidium bromide bound to the DNA Light in the visible range (λ = 590 nm) emitted, visible made.

DNA-KonzentrationsbestimmungDNA concentration determination

Zur Konzentrationsbestimmung von DNA wurden 5 μl der präparierten DNA-Proben) zusammen mit dem „O'GeneRuler 1 kb ladder”-DNA-Marker (Fermentas) auf einem Agarosegel aufgetragen. Die Stärke der Bande in der DNA-Probe wurde mit den Bandenstärken im DNA-Marker verglichen und anhand der vom Hersteller angegebenen Mengenangaben die DNA-Konzentration in den Proben abgeschätzt.to Concentration determination of DNA was 5 μl of the prepared DNA samples) together with the "O'GeneRuler 1 kb ladder" DNA marker (Fermentas) on an agarose gel. The strenght the band in the DNA sample became with the band strengths compared in the DNA marker and as indicated by the manufacturer Quantities estimated the DNA concentration in the samples.

Elution von DNA-Fragmenten aus AgarosegelenElution of DNA fragments from agarose gels

Nachdem die DNA-Probe mit Restriktionsenzymen hydrolysiert und auf einem Agarosegel aufgetrennt wurde, wurde mit einem Skalpell die gewünschte DNA-Bande aus dem Gel ausgeschnitten und mittels des Perfectprep Gel Cleanup Kit der Firma Eppendorf die DNA eluiert.After this hydrolyzed the DNA sample with restriction enzymes and on a Agarose gel was separated, was with a scalpel the desired Cut out the DNA band from the gel and use the Perfectprep Gel Cleanup Kit from Eppendorf elutes the DNA.

Amplifikation von DNA mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) mit Turbo-Pfu-PolymeraseAmplification of DNA by polymerase chain reaction (PCR) with Turbo-Pfu polymerase

Bei der Polymerasekettenreaktion (PCR) werden spezifische DNA-Bereiche in vitro amplifiziert und dadurch angereichert. Ausgehend von einer Matrize (der DNA mit dem zu amplifizierenden Bereich) und für die beiden Enden des DNA-Bereiches spezifischen Oligonukleotiden (so genannten Startermolekülen oder Primern) synthetisiert eine thermostabile DNA-abhängige DNA-Polymerase den gewünschten DNA-Bereich.at the polymerase chain reaction (PCR) become specific DNA regions amplified in vitro and enriched thereby. Starting from one Template (the DNA with the area to be amplified) and for the both ends of the DNA region specific oligonucleotides (see above mentioned starter molecules or primers) synthesized a thermostable DNA-dependent DNA polymerase the desired DNA region.

Dazu wird zunächst die Matrize denaturiert, woraufhin die Primer an ihre komplementären Sequenzen hybridisieren können. Bei der folgenden Elongation verlängert die DNA-Polymerase die Oligoprimer in 3' → 5'-Richtung, und ergänzt auf diese Weise den fehlenden DNA-Strang. Da dieser Prozess an beiden Strängen der Matrizen-DNA erfolgt, verdoppelt sich die DNA mit jedem Zyklus. Gewöhnlich werden 30 bis 40 Zyklen durchlaufen.To First, the template is denatured, whereupon the primer can hybridize to their complementary sequences. In the following elongation lengthens the DNA polymerase the oligoprimer in 3 '→ 5' direction, and added in this way the missing DNA strand. Because this process at both Strands of the template DNA is done, the doubled DNA with each cycle. Usually, 30 to 40 cycles are run through.

Zur Durchführung der PCR wurde die Turbo-Pfu-Polymerase verwendet. Diese Polymerase besitzt eine 5' → 3' Exonukleasenaktivität (eine so genannte „Proof-Reading-Funktion”), wodurch die Gefahr von Mutationen der amplifizierten DNA durch falsch eingebaute Nukleotide minimiert wird. PCR-Ansatz (50 μl): A. dest. 36,1 μl Template-DNA 1,0 μl Upper Primer 1,0 μl Lower Primer 1,0 μl dNTPs 0,5 μl PCR-Puffer 5,0 μl DMSO 5,0 μl Turbo-Pfu-Polymerase 0,4 μl The turbo-Pfu polymerase was used to carry out the PCR. This polymerase has a 5 '→ 3' exonuclease activity (a so-called "proof-reading function"), which minimizes the risk of mutations of the amplified DNA due to incorrectly incorporated nucleotides. PCR approach (50 μl): A. least. 36.1 μl Template DNA 1.0 μl Upper Primer 1.0 μl Lower primer 1.0 μl dNTPs 0.5 μl PCR buffer 5.0 μl DMSO 5.0 μl Turbo Pfu polymerase 0.4 μl

Turbo-Pfu-Polymerase, PCR-Puffer und dNTPs entstammten dem Turbo-Pfu-Polymerase-Kit (Stratagene). Die Reaktionen wurden in dem PCR-Automaten ep gradient S der Firma Eppendorf durchgeführt.Turbo-Pfu polymerase, PCR buffer and dNTPs were from the Turbo-Pfu polymerase kit (Strata gene). The reactions were carried out in the eppendorf Eppendorf PCR machine ep gradient S.

Es wurde folgendes Programm verwendet: Initiale Denaturierung 98°C 10 min Denaturierung 98°C 1 min Hybridisierung s. u. 1 min Elongation 72°C s. u. Terminale Elongation 72°C 10 min The following program was used: Initial denaturation 98 ° C 10 min denaturation 98 ° C 1 min hybridization su 1 min elongation 72 ° C su Terminal elongation 72 ° C 10 min

Die Schritte Denaturierung, Hybridisierung und Elongation wurden in 30 Zyklen wiederholt. Die Hybridisierungstemperatur hing von den verwendeten Primern ab; wenn die optimale Temperatur noch nicht bekannt war, wurde gegebenenfalls ein Temperaturgradient angelegt. Die Dauer der Elongation war von der Länge des zu amplifizierenden DNA-Abschnitts abhängig (1 min pro 2 kb).The Steps denaturation, hybridization, and elongation were in 30 cycles repeated. The hybridization temperature depended on the used primers; if the optimal temperature is not yet was known, a temperature gradient was optionally applied. The duration of the elongation was of the length of the to be amplified DNA section dependent (1 min per 2 kb).

Die Analyse der amplifizierten DNA erfolgte durch Auftragung von 5 μl jedes PCR-Ansatzes auf ein Agarosegel.The Analysis of the amplified DNA was performed by plating 5 μl each PCR approach on an agarose gel.

Erzeugung der StrepII-tag-Varianten mittels Quick change PCRGeneration of StrepII tag variants by means of Quick change PCR

Die Vektoren pRhokHi-2 und pRhotHi-2 wurden mit den beschriebenen Primern unter den beschriebenen Bedingungen in einer Polymerase Kettenreaktion als Template verwandt um die linearen Vorläufer der Vektoren pRhokS-2 und pRhotS-2 zu erzeugen (6723 bp). Die Proben dieser Polymerase Kettenreaktion wurden mit dem Enzym DpnI behandelt. (Hierbei handelt es sich um ein Restriktionenzym dessen Zielsequenz ein statistisch häufig auftretendes 4-mer (GATC) ist. Das Enzym besitzt aber die Eigenschaft diese Zielsequenz nur dann zu erkennen wenn das Adenosin über eine Methylgruppe verfügt (DNA-Methylierung), dies ist ausschließlich bei der als Template eingesetzten DNA der Fall.) Man verliert durch diesen Schritt die ursprüngliche und unmodifizierte Variante (pRhokHi-2 und pRhotHi-2) der Vektoren.The Vectors pRhokHi-2 and pRhotHi-2 were mixed with the described primers under the conditions described in a polymerase chain reaction as a template related to the linear precursors of the vectors generating pRhokS-2 and pRhotS-2 (6723 bp). The samples of this polymerase Chain reaction was treated with the enzyme DpnI. (This is it is a restriction enzyme whose target sequence is a statistical one frequently occurring 4-mer (GATC) is. The enzyme has but the property of recognizing this target sequence only if the adenosine has a methyl group (DNA methylation), this is exclusively for the template used DNA the case.) One loses by this step the original and unmodified variant (pRhokHi-2 and pRhotHi-2) of the vectors.

In einem weiteren Schritt wurden die Vektoren mit dem Restriktionsenzym PstI behandelt, wobei die Erkennungssequenz dieses Enzyms über den Primerüberhang in den Vektor eingebracht wurde. Die Proben wurden dann mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und das entsprechenden DNA Fragment (6690 bp) aufgereinigt. Anschließend erfolgte eine Transformation mit kompetenten E. coli DH5α-Zellen. Diese Zellen wurden zur Selektion auf LB-Agar Platten mit dem Antibiotikum Kanamycin (50 μg/ml) ausplattiert.In in a further step, the vectors with the restriction enzyme PstI treated, wherein the recognition sequence of this enzyme via the primer overhang was introduced into the vector. The Samples were then separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragment (6690 bp). Subsequently followed a transformation with competent E. coli DH5α cells. These cells were selected for selection on LB agar plates containing the antibiotic Kanamycin (50 ug / ml) plated out.

Von diesen Platten wurden Einzelkolonien gestochert und damit 100 ml LB Medium mit dem Antibiotikum Kanamycin (50 μg/ml) beimpft. Nach einer Kultivierung über 24 h bei 37°C und 120 rpm auf einem Schüttler, wurden die Zellen geerntet und die Vektoren pRhokS-2 und pRhotS-2 daraus isoliert.From these plates were single colonies poked and thus 100 ml Inoculated LB medium with antibiotic kanamycin (50 μg / ml). After culturing for 24 h at 37 ° C and 120 rpm on a shaker, the cells were harvested and the vectors pRhokS-2 and pRhotS-2 isolated therefrom.

Bakterienanzuchtbacterial growth

Antibiotikaantibiotics

Alle Antibiotika wurden vor der Verwendung sterilfiltriert (Millipore-Membranfilter, Porendurchmesser 0,2 μm). Die Lagerung der Antibiotika-Aliquots erfolgte bei –20°C. Tab. 3 Verwendete Antibiotika Antibiotikum (Abk.) Konzentration in LB-Medium Konzentration in PY-Medium Konzentration in RCV-Medium Bezugsquelle Ampicillin (Amp) 100 μg/ml - - Serva Kanamycin (Km) 50 μg/ml 25 μg/ml 25 μg/ml Serva Streptomycin (Sm) 50 μg/ml 200 μg/ml 200 μg/ml GEREU Biotechnik GmbH Gentamycin (Gm) 10 μg/ml 4 μg/ml 4 μg/ml Serva Spectinomycin (Sp) 100 μg/ml 10 μg/ml 10 μg/ml Calbiochem All antibiotics were filter sterilized before use (Millipore membrane filter, pore diameter 0.2 μm). The antibiotic aliquots were stored at -20 ° C. Tab. 3 Antibiotics used Antibiotic (abbreviation) Concentration in LB medium Concentration in PY medium Concentration in RCV medium source Ampicillin (amp) 100 μg / ml - - Serva Kanamycin (Km) 50 μg / ml 25 μg / ml 25 μg / ml Serva Streptomycin (Sm) 50 μg / ml 200 μg / ml 200 μg / ml GEREU Biotechnik GmbH Gentamicin (Gm) 10 μg / ml 4 μg / ml 4 μg / ml Serva Spectinomycin (Sp) 100 μg / ml 10 μg / ml 10 μg / ml calbiochem

Anzucht von E. coliCultivation of E. coli

Die Kultivierung von E. coli erfolgte auf LB-Agar-Platten oder in LB-Flüssigmedium bei 37°C. Zur Selektion bzw. Stabilisierung von Plasmiden wurde gegebenenfalls ein adäquates Antibiotikum zugefügt. Die Inkubationszeit betrug mindestens 12 Stunden. LB-Vollmedium (flüssig) Trypton 10,0 g Hefeextrakt 5,0 g NaCl 5,0 g A. dest. ad 1000 ml Autoklavieren (20 min, 200 kPa, 121°C) LB-Agar: Trypton 10,0 g Hefeextrakt 5,0 g NaCl 5,0 g Agar 15,0 g LB-Medium ad 1000 ml Autoklavieren (20 min, 200 kPa, 121°C) Cultivation of E. coli was carried out on LB agar plates or in LB liquid medium at 37 ° C. For the selection or stabilization of plasmids, an adequate antibiotic was optionally added. In the The incubation period was at least 12 hours. LB full medium (liquid) tryptone 10.0 g yeast extract 5.0 g NaCl 5.0 g A. least. ad 1000 ml Autoclaving (20 min, 200 kPa, 121 ° C) LB agar: tryptone 10.0 g yeast extract 5.0 g NaCl 5.0 g agar 15.0 g LB medium ad 1000 ml Autoclaving (20 min, 200 kPa, 121 ° C)

Flüssigkulturen wurden entweder von Stamm- oder Transformationsplatten mit Einzelkolonien oder aus einer Gefrier- oder Vorkultur mit 1/500 des Endvolumens beimpft, und dann entweder in Reagenzgläsern auf einem Brutroller (bis zu einem Kulturvolumen von 5 ml) oder in Erlenmeyerkolben (Kulturvolumen maximal 1/10 tel des Gefäßvolumens) auf einem Inkubationsschüttler bei 130 rpm inkubiert.liquid cultures were either from stock or transformation plates with single colonies or from a frozen or preculture with 1/500 of the final volume inoculated, and then either in test tubes on one Breeding roller (up to a culture volume of 5 ml) or in Erlenmeyer flasks (Culture volume maximum 1/10 tel of the vessel volume) incubated on an incubator shaker at 130 rpm.

Anzucht von R. capsulatusCultivation of R. capsulatus

Die phototrophe Kultivierung von R. capsulatus erfolgte auf Festmedium (PY-Agar) oder in RCV-Flüssigmedium. Gegebenenfalls wurde ein geeigneter Selektionsdruck angelegt. Die Kulturen wurden für zwei bis drei Tage bei 30°C inkubiert. PY-Agar: Bacto Pepton 10,0 g Hefeextrakt 0,5 g Agar 15,0 g A. dest. Ad 1000 ml Autoklavieren (20 min, 200 kPa, 121°C) Zugaben nach Autoklavieren: 1 M MgCl2 2 ml 1 M CaCl2 2 ml 0,5% FeSO4-HCl (s. u.) 2,4 ml RCV-Minimalmedium: 10% DL-Malat (pH 6,8) 40,0 ml 1% EDTA 2,0 ml 20% MgSO4 1,0 ml Spurenelement-Lösung (s. u.) 1,0 ml 7,5% CaCl2 1,0 ml 0,5% FeSO4-HCl (s. u.) 2,4 ml 0,1% Thiamin 1,0 ml A. dest. ad 1000 ml Autoklavieren (20 min, 200 kPa, 121°C) Zugabe nach Autoklavieren (auf 1000 ml RCV): 10% (NH4)2SO4 10,0 ml 1 M Phosphat-Puffer, pH 6,8 (s. u.) 9,6 ml 0,5% FeSO4-HCl: FeSO4 0,5% (w/v) 32%ige Salzsäure 1 ml A. dest. Ad 200 ml Autoklavieren (20 min, 200 kPa, 121°C) Phosphatpuffer (pH 6,8): KH2PO4 81,3 g K2HPO4 78,7 g A. dest ad 500 ml Autoklavieren (20 min, 200 kPa, 121°C) Spurenelement-Lösung für RCV: MnSO4 × 1H2O 0,4 g H3BO3 0,7 g Cu(NO3)2 × 3H2O 0,01 g ZnSO4 × 7H2O 0,06 g Na2MoO4 × 2H2O 0,02 g A. dest. ad 250 ml Autoklavieren (20 min, 200 kPa, 121°C) The phototrophic cultivation of R. capsulatus was carried out on solid medium (PY agar) or in RCV liquid medium. Optionally, a suitable selection pressure was applied. The cultures were incubated for two to three days at 30 ° C. PY agar: Bacto peptone 10.0 g yeast extract 0.5 g agar 15.0 g A. least. Ad 1000 ml Autoclaving (20 min, 200 kPa, 121 ° C) Additions after autoclaving: 1M MgCl 2 2 ml 1 M CaCl 2 2 ml 0.5% FeSO 4 -HCl (see below) 2.4 ml RCV minimal medium: 10% DL malate (pH 6.8) 40.0 ml 1% EDTA 2.0 ml 20% MgSO4 1.0 ml Trace element solution (see below) 1.0 ml 7.5% CaCl 2 1.0 ml 0.5% FeSO4-HCl (see below) 2.4 ml 0.1% thiamine 1.0 ml A. least. ad 1000 ml Autoclaving (20 min, 200 kPa, 121 ° C) Addition after autoclaving (to 1000 ml RCV): 10% (NH 4 ) 2 SO 4 10.0 ml 1 M phosphate buffer, pH 6.8 (see below) 9.6 ml 0.5% FeSO 4 -HCl: FeSO 4 0.5% (w / v) 32% hydrochloric acid 1 ml A. least. Ad 200 ml Autoclaving (20 min, 200 kPa, 121 ° C) Phosphate buffer (pH 6.8): KH 2 PO 4 81.3 g K 2 HPO 4 78.7 g A. least ad 500 ml Autoclaving (20 min, 200 kPa, 121 ° C) Trace element solution for RCV: MnSO4 × 1H 2 O 0.4 g H3BO3 0.7 g Cu (NO 3) 2 × 3H 2 O 0.01 g ZnSO 4 .7H 2 O 0.06 g Na2 MoO4 × 2H2O 0.02 g A. least. ad 250 ml Autoclaving (20 min, 200 kPa, 121 ° C)

Anaerobe, photoheterotrophe Anzucht:Anaerobic, photoheterotrophic cultivation:

Für die Anzucht auf PY-Agarplatten wurden spezielle Anaerob-Inkubationstöpfe unter Verwendung des Gas-Pack Anaerobic-System (von BBL) verwendet, welches für eine anaerobe Umgebung sorgt.For growing on PY agar plates were special anaerobic incubation pots using the Gas-Pack Anaerobic System (used by BBL), which ensures an anaerobic environment.

Bei Anzucht in Flüssigkultur wurde das Kulturvolumen in Gefäße gegeben, welche mit einem Septum luftdicht verschlossen werden konnten. Nach dem Animpfen wurde das Gefäß verschlossen und dann mit Hilfe einer Injektionsnadel durch dieses Septum hindurch 5 bis 10 min lang Argon oder Stickstoff in das Gefäß eingeleitet, während durch eine zweite Injektionsnadel Luft entweichen konnte, um Überdruck zu vermeiden.at Culture in liquid culture, the culture volume in vessels given, which could be hermetically sealed with a septum. After inoculation, the vessel was capped and then through this septum using a hypodermic needle Argon or nitrogen is introduced into the vessel for 5 to 10 minutes, while escape through a second injection needle air could to avoid overpressure.

Die Inkubation erfolgte im Starklicht (sechs Glühbirnen a 60 W; entspricht 2500 lux).The Incubation took place in the high light (six bulbs a 60 W; corresponds to 2500 lux).

Aerobe, heterotrophe Anzucht:Aerobic, heterotrophic cultivation:

Die aerobe Kultivierung auf PY-Agarplatten erfolgte durch Lagerung der Platten mit den ausgestrichenen Bakterien im Dunkeln.The aerobic cultivation on PY agar plates was carried out by storage of the Plates with the streaked bacteria in the dark.

Für die Anzucht in Flüssigmedium wurden 10 ml RCV-Medium in 100 ml Erlenmeyer-Schüttelkolben gegeben. Die Kulturen wurden dann auf einem Inkubationsschüttler (130 rpm) im Dunkeln inkubiert.For culture in liquid medium was 10 ml RCV medium in Add 100 ml Erlenmeyer shake flask. The cultures were then placed on an incubation shaker (130 rpm) in the Dark incubated.

Kultivierung von R. capsulatus ExpressionskulturenCultivation of R. capsulatus expression cultures

Zur Expression heterologer Gene wurden die Expressionsstämme von R. capsulatus zunächst von möglichst frischen Stammplatten in einem geeigneten Kulturvolumen (abhängig von Anzahl späterer Hauptkulturen, meist 1–2 ml pro geplanter Hauptkultur) RCV-Flüssigmedium (gegebenenfalls unter Selektionsdruck) angeimpft und unter anaeroben Bedingungen inkubiert (auch wenn spätere Hauptkulturen aerob angezogen werden sollten). Aus diesen Vorkulturen wurden Hauptkulturen (Testkulturen) im gewünschten Volumen des gleichen Mediums zu einer OD660 von 0,2 inokuliert. Die Induktion von R. capsulatus B10S-T7, sofern nötig, erfolgte mit 8 mM Fruktose. Die Inkubation der Hauptkulturen erfolgte je nach Bedarf unter anaeroben oder aeroben Wachstumsbedingungen.For the expression of heterologous genes, the expression strains of R. capsulatus were first inoculated from as fresh as possible master plates in a suitable culture volume (depending on the number of later main cultures, usually 1-2 ml per planned main culture) RCV liquid medium (optionally under selection pressure) and incubated under anaerobic conditions (even if later major cultures should be attracted aerobically). From these precultures, major cultures (test cultures) in the desired volume of the same medium were inoculated to an OD 660 of 0.2. The induction of R. capsulatus B10S-T7, if necessary, was done with 8 mM fructose. The main cultures were incubated as needed under anaerobic or aerobic growth conditions.

Aufbewahrung von BakterienstämmenStorage of bacterial strains

Die Aufbewahrung der Bakterien über kurze Zeiträume (maximal zwei Wochen) erfolgte auf Agarplatten des entsprechenden Mediums bei 4°C (E. coli) bzw. Raumtemperatur (R. capsulatus).The Storage of bacteria for short periods (maximum two weeks) was carried out on agar plates of the corresponding Medium at 4 ° C (E. coli) or room temperature (R. capsulatus).

Für längerfristige Lagerung wurden Gefrierkulturen hergestellt:For longer term storage, freezing cultures were prepared:

Gefrierkulturen von E. coli:Freezing cultures of E. coli:

1,3 ml Zellsuspension aus einer Übernachtkultur wurden mit 100 μl DMSO versetzt und bei –20°C eingefroren.1.3 ml of cell suspension from an overnight culture were washed with 100 ul DMSO added and frozen at -20 ° C.

Gefrierkulturen von R. capsulatus:Freezing cultures of R. capsulatus:

R. capsulatus Gefrierkulturen wurden von anaeroben PY-Agarplatten hergestellt, indem zunächst eine größere Menge Zellmaterial in 3 ml RCV-Medium resuspendiert wurden. 1,5 ml der Zellsuspension wurden bei Raumtemperatur 10 min mit 13.000 rpm zentrifugiert und das Pellet anschließend in 1 ml PYG-Puffer resuspendiert. Diese Suspension wurde auf zwei Eppendorfgefäße verteilt und das Volumen der Kultur bestimmt. Beide Kulturen wurden 1:1 mit 87% Glycerol vermengt. Die Lagerung erfolgte bei –20°C. PYG-Puffer: Bacto Pepton 3,0 g Hefeextrakt 3,0 g 20% MgCl2 2,5 ml 7,5% CaCl2 4,0 ml A. dest. ad 1000 ml Autoklavieren (20 min, 200 kPa, 121°C) R. capsulatus freezing cultures were prepared from anaerobic PY agar plates by first resuspending a larger amount of cell material in 3 ml of RCV medium. 1.5 ml of the cell suspension were centrifuged at room temperature for 10 min at 13,000 rpm and the pellet subsequently resuspended in 1 ml of PYG buffer. This suspension was distributed to two Eppendorf tubes and the volume of the culture determined. Both cultures were mixed 1: 1 with 87% glycerol. Storage took place at -20 ° C. PYG-buffer: Bacto peptone 3.0 g yeast extract 3.0 g 20% MgCl2 2.5 ml 7.5% CaCl 2 4.0 ml A. least. ad 1000 ml Autoclaving (20 min, 200 kPa, 121 ° C)

Bestimmung der optischen DichteDetermination of optical density

Die Bestimmung der optischen Dichte (CD) erfolgte nach geeigneter Verdünnung in destilliertem H2O durch photometrische Messung mit einem Spektralphotometer. Der Nullwert wurde ebenfalls mit H2O eingestellt.The determination of the optical density (CD) was carried out after suitable dilution in distilled H 2 O by photometric measurement with a spectrophotometer. The zero value was also set with H 2 O.

Für E. coli wurde eine Wellenlänge von 580 nm verwendet. Eine OD580 von 1 entspricht etwa 2 × 109 Zellen pro ml Kultur. Bei R. capsulatus erfolgte die Messung bei 660 nm; dabei entspricht eine OD660 von 1 ca. 3 × 108 Zellen pro ml Kulturvolumen.For E. coli, a wavelength of 580 nm was used. An OD 580 of 1 corresponds to approximately 2 x 10 9 cells per ml of culture. In R. capsulatus the measurement was at 660 nm; An OD 660 of 1 corresponds to approximately 3 × 10 8 cells per ml of culture volume.

Konjugativer Transfer mobilisierbarer Plasmide von E. coli nach R. capsulatusConjugative transfer mobilizable Plasmids from E. coli to R. capsulatus

Plasmide, welche eine Mobilisationskassette (MOB-Site) besitzen, können von dem konjugationskompetenten E. coli Stamm S17-1 auf R. capsulatus übertragen werden. Dazu dient das Verfahren der Filterkreuzung.plasmids which may have a Mobilization Cassette (MOB site) from the conjugation competent E. coli strain S17-1 to R. capsulatus become. This is done by the method of filter crossing.

Der Rezipient R. capsulatus wurde von einer frischen, phototroph angezogenen Stammplatte in 5 ml RCV-Medium überführt und resuspendiert. Von dieser Suspension wurde 1 ml in einem sterilen 2 ml Eppendorfgefäß vorgelegt. Einige Einzelkolonien des über Nacht frisch auf selektivem LB-Agar kultivierten Donors werden in 1 ml PY-Fe resuspendiert, wobei man mit besonderer Vorsicht vorgehen musste, um die Pili des Donors nicht zu beschädigen. Von der Donor-Suspension wurden 0,5 ml zu der Rezipienten-Suspension gegeben. PY-F (flüssig): Bacto Pepton 10,0 g Hefeextrakt 0,5 g A. dest. Ad 1000 ml Zugaben nach Autoklavieren: 1 M MgCl2 2 ml 1 M CaCl2 2 ml The recipient R. capsulatus was transferred from a fresh phototrophically grown stock plate into 5 ml RCV medium and resuspended. From this suspension, 1 ml was placed in a sterile 2 ml Eppendorf tube. Several single colonies of the donor cultured fresh on selective LB agar overnight are resuspended in 1 ml of PY-Fe, with particular care being taken to avoid damaging donor pili. From the donor suspension, 0.5 ml was added to the recipient suspension. PY-F (liquid): Bacto peptone 10.0 g yeast extract 0.5 g A. least. Ad 1000 ml Additions after autoclaving: 1M MgCl 2 2 ml 1 M CaCl 2 2 ml

Das Donor-Rezipienten-Gemisch wurde 10 min bei 13.000 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand bis auf einen kleinen Rest abgenommen, in welchem das Pellet resuspendiert wurde. Dann wurde die Zellsuspension auf einem Nitrozellulose-Filter (Celluloseacetat, 0.2 μm, Durchmesser 25 mm, Whatman Schleicher & Schuell), aufgelegt auf einer PY-Agarplatte ohne Antibiotikum, plattiert.The donor-recipient mixture was centrifuged for 10 min at 13,000 rpm and room temperature, and the supernatant was removed to a small residue in which the pellet was resuspended. Then wur de the cell suspension on a nitrocellulose filter (cellulose acetate, 0.2 microns, diameter 25 mm, Whatman Schleicher & Schuell), placed on a PY agar plate without antibiotic, plated.

Nach Inkubation über Nacht bei 30°C im Dunkeln wurden die Filter in 1 ml RCV-Medium ohne Antibiotikum resuspendiert. Von dieser Suspension wurden 200 μl auf PY-Agar plattiert. Die Inkubation erfolgte unter phototrophen Bedingungen.To Incubation overnight at 30 ° C in the dark were the filters are resuspended in 1 ml of RCV medium without antibiotic. From 200 μL of this suspension was plated on PY agar. The incubation was carried out under phototrophic conditions.

Proteinbiochemische Methoden & FluoreszenzmessungenProtein Biochemical Methods & Fluorescence Measurements

Proteinbiochemische MethodenProtein biochemical methods

Gesamtproteinisolierung aus R. capsulatus zum Nachweis von T7-Polymerase und YFPTotal protein isolation from R. capsulatus for detection of T7 polymerase and YFP

Nach der Kultivierung der Expressionskulturen wurde die OD660 bestimmt und 1 OD Zellen durch 10minütige Zentrifugation bei 13.000 rpm geerntet.After culturing the expression cultures, the OD 660 was determined and 1 OD cells were harvested by centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes.

Das Pellet jeder Kultur wurde zunächst in 0.125M Tris-HCl (pH 6,8) gewaschen und nach einem erneuten Zentrifugationsschritt in 100 μl SDS-Probenpuffer resuspendiert. Dieser Ansatz wurde 12 min bei 99°C und 1000 rpm aufgekocht. SDS-Probenpuffer 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 1,25 ml 87% Glycerol 1,2 ml 10% SDS 3,0 ml β-Mercaptoethanol 0,5 ml 0,5% BPB 0,6 ml H2O 2,65 ml The pellet of each culture was first washed in 0.125M Tris-HCl (pH 6.8) and resuspended after a new centrifugation step in 100 μl SDS sample buffer. This mixture was boiled for 12 min at 99 ° C and 1000 rpm. SDS sample buffer 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 1.25 ml 87% glycerol 1.2 ml 10% SDS 3.0 ml β-mercaptoethanol 0.5 ml 0.5% BPB 0.6 ml H2O 2.65 ml

Wenn die Proben nicht sofort auf ein SDS-Acrylamid-Gel aufgetragen werden sollen, lassen sie sich bei –20°C lagern; in diesem Fall mussten die Proben nach dem Auftauen erneut 10 min aufgekocht werden.If the samples should not be immediately applied to an SDS acrylamide gel should be stored at -20 ° C; in this Case, the samples had re-boiled for 10 minutes after thawing become.

Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE)Denaturing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

Bei der denaturierenden Proteingelelekrophorese wird ausgenutzt, dass SDS an die Proteine bindet und dabei durch seine negative Ladung die Eigenladung der Proteine aufhebt. Daraufhin trennen sich die SDS-Protein-Komplexe nur noch nach ihrer Molekülgröße auf, nicht aber gemäß ihrer Ladung.at denaturing protein cell electrophoresis is exploited SDS binds to the proteins and thereby by its negative charge eliminates the intrinsic charge of the proteins. As a result, the SDS-protein complexes separate only up to their molecular size, but not according to their charge.

Die SDS-PAGE wurde entweder mit NUPAGE 4–12% Bis-Tris Fertiggelen der Firma Invitrogen (Elektrophoreseapparatur: XCell SureLockTM Electrophoresis Cell) mit einer Laufzeit von 35 min bei 200 V durchgeführt, oder in einer BioRad-Mini-Protein-Gelkammer.The SDS-PAGE was performed either with NUPAGE 4-12% Bis-Tris ready gels from Invitrogen (electrophoresis apparatus: XCell SureLock Electrophoresis Cell) with a transit time of 35 min at 200 V, or in a BioRad mini-protein gel chamber.

In letzterem Fall wurde nach dem Zusammenbau der Gelkammer das Trenngel gegossen, und dieses sofort mit dem Sammelgel überschichtet. Dank des Glycerins in der Trenngel-Lösung entstand ein Zweiphasensystem, und die beiden Gele vermischten sich kaum. Es wurde ein Gelkamm mit ausreichend großen Zähnen für die geplanten Proteinproben eingesetzt und das Gel ca. 30 min zur Polymerisation stehengelassen. 12% SDS-Trenngel (Mengenangaben für 2 Mini-Gele) Acrylamid 4 ml Glycerin 3,4 ml 4x Trenngelpuffer (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8) 2,5 ml 10% SDS 0,1 ml 10% APS 50 μl TEMED 5 μl 5% SDS-Sammelgel (Mengenangaben für 2 Mini-Gele): Acrylamid 0,83 ml 4x Sammelgelpuffer (0,5M Tris-HCl, pH 6,8) 1,25 ml 10% SDS 50 μl A. dest 2,9 ml 10% APS 50 μl TEMED 5 μl In the latter case, the separating gel was poured after assembly of the gel chamber, and this immediately overlaid with the collecting gel. Thanks to the glycerine in the separating gel solution, a two-phase system was formed, and the two gels barely mingled. A gel comb with sufficiently large teeth was used for the planned protein samples, and the gel was left to polymerize for about 30 minutes. 12% SDS separating gel (quantities for 2 mini-gels) acrylamide 4 ml glycerin 3.4 ml 4x separating gel buffer (1.5 M Tris-HCl, pH 8.8) 2.5 ml 10% SDS 0.1 ml 10% APS 50 μl TEMED 5 μl 5% SDS collection gel (amounts for 2 mini-gels): acrylamide 0.83 ml 4x collecting gel buffer (0.5M Tris-HCl, pH 6.8) 1.25 ml 10% SDS 50 μl A. least 2.9 ml 10% APS 50 μl TEMED 5 μl

Nach der Polymerisation wurde das Gel in die Elektrophoresekammer (Mini-Protean Gelkammer IITM von Biorad) eingesetzt und diese mit 1fach SDS-Laufpuffer gefüllt. 10 × SDS-Laufpuffer (pH 8,3): Tris-HCl 30,3 g Glycin 144,0 g SDS 10,0 g H2O ad 1000 ml After polymerization, the gel was placed in the electrophoresis chamber (Mini-Protean Gel Chamber II from Biorad) and filled with 1X SDS running buffer. 10 × SDS running buffer (pH 8.3): Tris-HCl 30.3 g glycine 144.0 g SDS 10.0 g H2O ad 1000 ml

Nachdem der Gelkamm entfernt wurde, wurden die Proteinproben auf das Gel aufgetragen. Zusätzlich wurde ein Proteinmarker (Page RulerTM Prestained Protein Ladder von Fermentas) aufgetragen, um später die Größe der nachgewiesenen Proteine abzuschätzen.After the gel comb was removed, the protein samples were applied to the gel. In addition, a protein marker (Page Ruler Prestained Protein Ladder from Fermentas) was applied to later estimate the size of the proteins detected.

Die Elektrophorese erfolgte zunächst mit 100 V, bis die Proteinproben in das Trenngel eingelaufen waren, dann aber mit 200 V, bis der Blaumarker den unteren Gelrand erreicht hatte.The Electrophoresis was initially done with 100 V until the protein samples had run into the separating gel, but then with 200 V, until the Blue markers had reached the lower gel edge.

Transfer von Proteinen auf PVDF-Membranen (Western Blot)Transfer of proteins to PVDF membranes (Western blot)

Nach der Auftrennung von Proteinen mittels SDS-PAGE wurden die Proteine mittels des Western Blot Verfahrens auf eine PVDF-Membran (Biorad) übertragen.To Separation of proteins by SDS-PAGE became the proteins transferred to a PVDF membrane (Biorad) by Western blotting.

Wurden selbstgegossene Gele verwendet, wurde die Membran zunächst 1 min in Methanol, dann für 5 min in destilliertem Wasser und schließlich für 10 min in 1 × Dunn-Carbonatpuffer äquilibriert. 10 × Dunn-Carbonat-Puffer (pH 9,45): NaHCO3 8,4 g Na2CO3 3,18 g H2O ad 1000 ml 1 × Dunn-Carbonat-Puffer (kurz vor Gebrauch ansetzen): 10 × Dunn-Carbonat-Puffer 100 ml Methanol 200 ml H2O 700 ml When self-cast gels were used, the membrane was first equilibrated in methanol for 1 min, then in distilled water for 5 min, and finally in 1x Dunn carbonate buffer for 10 min. 10 × Dunn carbonate buffer (pH 9.45): NaHCO3 8.4 g Na2CO3 3.18 g H2O ad 1000 ml 1 × Dunn carbonate buffer (prepare shortly before use): 10 × Dunn carbonate buffer 100 ml methanol 200 ml H2O 700 ml

Zum Transfer der Proteine wurde in einer Transferapparatur der Blot aufgebaut, indem die verschiedenen Elemente in folgender Abfolge möglichst frei von Luftblasen übereinander geschichtet wurden: Schwamm, 2x Whatman Papier, Gel, Membran, 2x Whatman Papier, Schwamm. Maximal zwei Blots konnten in einer Transferkammer((Mini-)trans-Blot Elektrophorestic Transfer Cell von Biorad) untergebracht werden.To the Transfer of the proteins was performed in a blot transfer apparatus built by the different elements in the following sequence layered as free of air bubbles as possible were: sponge, 2x Whatman paper, gel, membrane, 2x Whatman paper, Sponge. A maximum of two blots could be in a transfer chamber ((mini) trans-blot Electrophorestic Transfer Cell from Biorad).

Der Transfer geschah 15 min bei 150 mA und weitere 20 min bei 300 mA konstanter Stromstärke in 1fachem Dunn-Carbonatpuffer.Of the Transfer took place at 150 mA for 15 minutes and at 300 mA for a further 20 minutes constant current in 1-fold Dunn carbonate buffer.

Bei der Verwendung von NUPAGE Fertiggelen wurde die Membran ebenfalls 1 min lang in Methanol äquilibriert und dann in Transferpuffer (NUPAGE) eingelegt. Auch die Gele wurden nach dem Gellauf und dem Öffnen der Plastikumhüllung in Transferpuffer gelegt. Der Aufbau des Blots erfolgte dann nach den Angaben des Herstellers in der XCell SureLockTM Elektrophoresekammer. Der Transfer geschah bei 25 V für 1 h.When using NUPAGE ready gels, the membrane was also equilibrated in methanol for 1 min and then loaded in transfer buffer (NUPAGE). The gels were also placed in transfer buffer after gel run and opening the plastic wrap. The blot was then set up according to the manufacturer's instructions in the XCell SureLock TM electrophoresis chamber. The transfer was at 25 V for 1 h.

Immunodetektion von ProteinenImmunodetection of proteins

Nach dem Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran wurde diese über Nacht bei 4°C in TEST +3% Milchpulver blockiert, um freie Bindungsstellen der Membran abzusättigen. TEST-Puffer Tris 50 mM NaCl 150 mM MgCl2 1 mM Tween 20 0,2% After transfer of the proteins to a PVDF membrane, it was blocked overnight at 4 ° C in TEST + 3% milk powder to saturate free binding sites of the membrane. TBST buffer Tris 50 mM NaCl 150 mM MgCl2 1 mm Tween 20 0.2%

Am darauffolgenden Tag wurde die Membran 1 Stunde bei 30°C unter leichtem Schütteln in TEST, welches mit dem entsprechenden ersten Antikörper in geeigneter Verdünnung (s. u.) versetzt wurde, inkubiert. Daraufhin folgten 2 Waschschritte mit TEST für jeweils 30 min. Danach wurde eine Lösung von TEST mit dem zum Erstantikörper passenden Zweitantikörper in geeigneter Verdünnung (s. u.) auf die Membranen gegeben. Daraufhin schlossen sich mehrere Waschschritte in TEST an (30 min, 15 min, 4 × 5 min), um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Schließlich konnte der Chemolumineszenznachweis durchgeführt werden.At the the following day, the membrane was at 30 ° C for 1 hour with gentle shaking in TEST, which with the appropriate first antibody in a suitable dilution (s. u.) was incubated. This was followed by 2 washes with TEST for every 30 min. After that became a solution of TEST with the second antibody matching the first antibody in appropriate dilution (see below) is added to the membranes. thereupon several washes in TEST (30 min, 15 min, 4 x 5 min) to remove unbound antibody. Finally, the chemiluminescence detection was performed become.

Die Detektion erfolgte entweder mit dem Enhanced Chemoluminescence (ECL) Western Blotting Detection System von Amersham nach Herstellerangaben oder mit „selbstgemachten” ECL-Lösungen.The Detection was carried out either with the Enhanced Chemoluminescence (ECL) Western Blotting Detection System from Amersham according to manufacturer's instructions or with "home-made" ECL solutions.

Wurde der Nachweis mit selbst angesetzten ECL-Lösungen durchgeführt, wurden für jede Membran in einem 2 ml Eppendorf-Gefäß 0,3 μl 35% Wasserstoffperoxid vorgelegt. Für den Nachweis wurden 1 ml Lösung A (50 mg Luminol in 500 ml 100 mM Tris/HCl pH 8.6) und 100 μl Lösung B (11 mg p-Cumaric Acid in 10 ml DMSO) zu dem Wasserstoffperoxid gegeben und durch Invertieren gemischt. Die Lösung wurde dann auf die Membran gegeben und mit Hilfe einer Pipette verteilt.Has been Proof with self-applied ECL solutions, For each membrane, 0.3 μl was added to a 2 ml Eppendorf tube 35% hydrogen peroxide submitted. For the proof were 1 ml solution A (50 mg luminol in 500 ml 100 mM Tris / HCl pH 8.6) and 100 μl solution B (11 mg p-Cumaric Acid in 10 ml of DMSO) was added to the hydrogen peroxide and by inverting mixed. The solution was then added to the membrane and distributed with the help of a pipette.

Der Nachweis erfolgte entweder an dem Luminographen der Firma EG&G Berthold oder am STELLA-System der Firma raytech.Of the Detection was carried out either on the luminograph of the company EG & G Berthold or on the STELLA system of raytech.

Nach dem Nachweis der Chemolumineszenz wurden die Membranen 5 bis 10 Minuten unter leichtem Schütteln in Amidoschwarz-Lösung eingelegt, um alle Proteinbanden anzufärben. Danach wurden die Membranen zum Trocknen an der Luft ausgelegt, eine Entfärbung ist nicht notwendig. Amidoblack-Färbelösung: Amidoblack 0,1% (w/v) Ethanol 45% (v/v) Essigsäure 10% (v/v) After detection of chemiluminescence, the membranes were placed in amido black solution for 5 to 10 minutes with gentle shaking to stain all protein bands. Thereafter, the membranes were designed to dry in air, discoloration is not necessary. Amidoblack staining solution: Amidoblack 0.1% (w / v) ethanol 45% (v / v) acetic acid 10% (v / v)

Verwendete AntikörperUsed antibodies

Nachweis von YFP: YFP wurde nachgewiesen durch den Antikörper Kaninchen-anti-GFP (BD Biosciences; Verdünnung 1:10.000); der zweite Antikörper war hierbei Ziege-anti-Kaninchen (Amersham; 1:5.000).proof YFP: YFP was detected by the rabbit anti-GFP antibody (BD Biosciences, dilution 1: 10,000); the second antibody here was goat anti-rabbit (Amersham, 1: 5,000).

Nachweis von T7-RNA-Polymerase: Der Nachweis der T7-RNA-Polymerase erfolgte mit T7-RNA-Polymerase monoklonalem Antikörper (Novagen; Verdünnung 1:10.000). Der dazu gehörende Zweitantikörper war Ziege-anti-Maus (Biorad, 1:3.000).proof T7 RNA polymerase: T7 RNA polymerase was detected with T7 RNA polymerase monoclonal antibody (Novagen; Dilution 1: 10,000). The associated secondary antibody was Goat anti-mouse (Biorad, 1: 3,000).

Nachweis von Proteinen mit His6-Tag: Hier erfolgte der Nachweis mit Anti-His(C-term)-HRP Konjugat Antikörpern. Diese Antikörper sind mit der Meerrettich Peroxidase, die den Chemolumineszenznachweis ermöglicht, konjugiert. Daher wird in diesem Fall kein zweiter Antikörper benötigt.Detection of proteins with His 6 tag: This was detected with anti-His (C-term) -HRP conjugate antibodies. These antibodies are conjugated to horseradish peroxidase, which allows chemiluminescent detection. Therefore, no second antibody is needed in this case.

In vivo-Fluoreszenzmessung für YFPIn vivo fluorescence measurement for YFP

Zur Bestimmung der Fluoreszenzemission des Fluoreszenz-Reporterproteins YFP wurde die optische Dichte der Expressionskulturen bestimmt, und 0,5 OD Zellen durch Zentrifugation (10 min, 13.000 rpm) geerntet. Diese wurden dann in 1 ml 100 mM Tris-HCl pH 8,0 aufgenommen.to Determination of the fluorescence emission of the fluorescent reporter protein YFP was used to determine the optical density of the expression cultures, and 0.5 OD cells were harvested by centrifugation (10 min, 13,000 rpm). These were then taken up in 1 ml of 100 mM Tris-HCl pH 8.0.

Waren die Testkulturen aerob gewachsen, konnten sie sofort für die Fluoreszenzmessungen verwendet werden. Proben aus anaerob kultivierten Kulturen dagegen mussten zunächst mindestens zwei Stunden lang bei geöffnetem Eppendorfgefäß, Raumtemperatur und 1.000 rpm geschüttelt werden, damit der Sauerstoff in der Luft die autokatalytische Bildung des Fluorophors bewirken konnte.If the test cultures were grown aerobically, they could use them immediately for the fluorescence measurements be. On the other hand, samples from anaerobically cultivated cultures had to be shaken for at least two hours with the Eppendorf tube open, room temperature and 1,000 rpm, so that the oxygen in the air could cause the autocatalytic formation of the fluorophore.

Von der Probe wurden 750 μl für die Messung in Quarzküvetten (F3; Firma Hellma) gefüllt. Die Messung erfolgte mit dem Lumineszenz-Spektrometer LS 50B von Perkin Elmer.From The sample was given 750 μl for measurement in quartz cuvettes (F3, company Hellma) filled. The measurement was made with the Luminescence spectrometer LS 50B from Perkin Elmer.

Dazu wurde die Probe bei einer Wellenlänge von 488 nm angeregt und das emittierte Fluoreszenzspektrum über den Bereich 515 bis 615 nm aufgezeichnet. Das Fluoreszenzmaximum von YFP liegt bei 529,5 nm. Weitere Parameter: excitation slit 12,5; emission slit 15; increment 0; Anregung bei 488 nm; scan speed: 240; Anzahl der Scans: 1.To The sample was excited at a wavelength of 488 nm and the emitted fluorescence spectrum over the range 515 to 615 nm recorded. The fluorescence maximum of YFP is at 529.5 nm. Other parameters: excitation slit 12.5; emission slit 15; increment 0; Excitation at 488 nm; scan speed: 240; number the scans: 1.

Nach der Messung wurden die ermittelten Werte hochgerechnet auf eine OD von 1 und 1 ml Probenvolumen.To the measured values were extrapolated to one OD of 1 and 1 ml sample volume.

Nachweis der FbFP-vermittelnten in vivo FluoreszenzDetection of FbFP-mediated in vivo fluorescence

Die Fluoreszenzmessung wurde mit einem Fluoreszenzphotometer Luminescence Spectrometer LS50B der Firma Perkin Elmer durchgeführt. Für die Fluoreszenzmessung ist es notwendig, dass die Zellen mit einer optischen Dichte von 0,5 vorliegen. Nachdem die Kulturen auf diese Dichte eingestellt worden sind, werden die Zellen im Falle von E. coli und P. putida für 2 min bei 13.000 rpm und im Falle von R. capsulatus für 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgenommen und dass Pellet für die Fluoreszenzmessung auf das Ursprungsvolumen mit 100 mM Tris-HCl (pH 7) aufgefüllt. Von diesen Proben wurden dann 750 μl abgenommen und in QS Viertelmikroküvetten (Hellma) übertragen. Die Spalteinstellungen am Fluoreszenzphotometer betrugen 12,5 nm (excitation slit) und 15,0 nm (emmission slit). Die FbFP-Proteine wurden bei 450 nm angeregt und ihre Fluoreszenzemmission zwischen 480 nm und 600 nm detektiert. Die Dokumentation der Spektren erfolgte mit der Fluorescence Data Manager Software der Firma Perkin Elmer, die Auswertung mit Microsoft Excel.The Fluorescence measurement was performed with a fluorescence photometer Luminescence Spectrometer LS50B made by Perkin Elmer. For the fluorescence measurement, it is necessary that the cells with an optical density of 0.5. After the cultures on If this density has been set, the cells will be in the case of E. coli and P. putida for 2 min at 13,000 rpm and in the case of R. capsulatus, centrifuge for 10 min at 13,000 rpm. After centrifugation, the supernatant is removed and that pellet for fluorescence measurement on the original volume filled with 100 mM Tris-HCl (pH 7). From these samples then 750 μl were removed and placed in QS quarter microcuvettes (Hellma) transmitted. The gap settings on the fluorescence photometer were 12.5 nm (excitation slit) and 15.0 nm (emission slit). The FbFP proteins were excited at 450 nm and their fluorescence emission detected between 480 nm and 600 nm. The documentation of the spectra was done with the Fluorescence Data Manager software from Perkin Elmer, the evaluation with Microsoft Excel.

Die jeweilige Fluoreszenzintensität als „relative Fluoreszenzintensität” wurde errechnet aus der gemessenen Fluoreszenzemmission bei einer Wellenlänge von 495 nm pro Zelldichte OD = 1 und 1 ml Zellsuspension.The respective fluorescence intensity as "relative Fluorescence intensity "was calculated from the measured fluorescence emission at a wavelength of 495 nm per cell density OD = 1 and 1 ml of cell suspension.

Synthese von Bakterio-opsin in dem phototrophen Bakterium R. capsulatusSynthesis of bacterio-opsin in the phototrophic Bacterium R. capsulatus

Zur Synthese von Bakterio-opsin (bop) in dem phototrophen Organismus Rhodobacter capsulatus wurde zunächst der E. coli Donorstamm S17I mit dem Expressionsplasmid pRhotHi2-bop transformiert. Anschließend wurde das Plasmid durch konjugativen Transfer in den Expressionswirt R. capsulatus 610S-T7 eingebracht und auf PY-Festmedium unter Selektionsdruck photoheterotroph vermehrt. Von diesem PY-Festmedium wurden geeignete Zellkolonien geerntet und verwendet, um Vorkulturen in RCV-Flüssigmedium anzuimpfen. Nach dreitägigem photoheterotrophen Wachstum wurden diese Vorkulturen eingesetzt, um Testkulturen mit einer Zellzahl, die einer optischen Dichte von 0,5 bei 660 nm entsprach, anzuimpfen. Die Anzucht erfolgte photoheterotroph für 24 Stunden. Zur Induktion der bop-Expression wurde dem RCV-Medium der Testkulturen Fruktose in einer Endkonzentration von 8 mM zugesetzt. Als Kontrolle wurden Testkulturen verwendet, denen kein Induktor zugefügt wurde.to Synthesis of bacterio-opsin (bop) in the phototrophic organism Rhodobacter capsulatus was initially the E. coli donor strain S17I transformed with the expression plasmid pRhotHi2-bop. Subsequently the plasmid was converted into the expression host by conjugative transfer R. capsulatus 610S-T7 and on PY-solid medium under selection pressure photoheterotrophically propagated. From this PY-solid medium were suitable Cell colonies harvested and used to precultures in RCV liquid medium to inoculate. After three days of photoheterotrophic growth These precultures were used to test cultures with a cell number, which corresponded to an optical density of 0.5 at 660 nm, to inoculate. The cultivation took place photoheterotrophically for 24 hours. to Induction of bop expression was the RCV medium of the test cultures fructose added at a final concentration of 8 mM. As control were Used test cultures to which no inducer was added.

Zur Überprüfung, ob R. capsulatus unter den oben beschriebenen Anzuchtbedingungen Bakterio-opsin exprimiert und akkumuliert, wurden zellfreie Proteinextrakte vom Stamm R. capsulatus B10S-T7 mit dem plasmidkodierten bop-Gen (pRhotHi-2-bop) erzeugt und fraktioniert. Der Nachweis des Bop-Proteins erfolgte unter Verwendung eines Antiserums (Anti-His6-(C-Term)-Antikörper, Fermentas GmbH, St. Leon-Roth Deutschland) mittles Westernblot-Analyse.To check whether R. capsulatus expresses and accumulates bacterio-opsin under the culture conditions described above, cell-free protein extracts of strain R. capsulatus B10S-T7 were generated and fractionated with the plasmid-encoded bop gene (pRhotHi-2-bop). The Bop protein was detected using an antiserum (Anti-His 6 (C-Term) antibody, Fermentas GmbH, St. Leon-Roth, Germany) by Western blot analysis.

Herstellung zellfreier Proteinextrakte aus R. capsulatus:Production of cell-free protein extracts from R. capsulatus:

Zur Herstellung zellfreier Proteinextrakte (Ganzzellproteinextrakte, GZE) wurden die respektiven R. capsulatus Stämme drei Tage photoheterotroph unter Selektionsdruck auf PY-Festmedium vermehrt. Von diesem PY-Festmedium wurden geeignete Zellkolonien geerntet und verwendet, um Vorkulturen in RCV-Flüssigmedium anzuimpfen. Nach dreitägigem photoheterotrophen Wachstum wurden diese Vorkulturen eingesetzt, um Testkulturen mit einer Zellzahl, die einer optischen Dichte von 0,5 bei 660 nm entsprach, anzuimpfen. Die Anzucht erfolgte photoheterotroph bis zur spätlogarithmischen Wuchsphase.to Preparation of cell-free protein extracts (whole cell protein extracts, GZE), the respective R. capsulatus strains were given three days Photoheterotrophically increased under selection pressure on PY solid medium. Appropriate cell colonies were harvested from this PY solid medium and used to inoculate precultures in RCV liquid medium. After three days of photoheterotrophic growth, these became Precultures used to test cultures with a cell count, the an optical density of 0.5 at 660 nm, to inoculate. The cultivation took place photoheterotrophically until the late logarithmic Growth phase.

Von den Testkulturen wurden je 1,5 ml sedimentiert (10 min, 16000 g, 20°C) und das Zellsediment in 1 ml Sammelgelpuffer resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation (10 min, 16000 g, 20°C) wurde das Zellsediment in 150 μl SDS-Probenpuffer resuspendiert. Der Ansatz wurde für 15 min bei 99°C unter Agitation inkubiert und anschließend zentrifugiert (5 min, 16000 g, 20°C). Der Überstand wurde für die denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese verwendet.From The test cultures were each sedimented 1.5 ml (10 min, 16000 g, 20 ° C) and the cell pellet resuspended in 1 ml of collecting gel buffer. After renewed centrifugation (10 min, 16000 g, 20 ° C) was resuspend the cell pellet in 150 μl of SDS sample buffer. The batch was agitated for 15 min at 99 ° C incubated and then centrifuged (5 min, 16000 g, 20 ° C). The supernatant was for the denaturing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.

Fraktionierung von R. capsulatus Proben:Fractionation of R. capsulatus samples:

Zur Fraktionierung von R. capsulatus Proben wurde verfahren wie zur Herstellung zellfreier Proteinextrakte. Nachdem das Zellsediment in 1 ml Sammelgelpuffer resuspendiert wurde, wurden die Proben jedoch mittels Ultraschall lysiert (2 × 2,5 min, 50 Zyklen/min, 30% Leistung, Bandelin Sonoplus, UW2070, MS72, Bandelin electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Deutschland). Danch erfolgten zwei Zentrifugationsschritte zur Generierung von drei Fraktionen:

  • (1) Zentrifugation bei 2370 g für 3 min bei 20°C. Das Sediment wurde in 100 μl SDS-Probenpuffer aufgenommen und stellt Fraktion 1 dar (Zelltrümmer und Einschlusskörper).
  • (2) Der Überstand wurde bei 18300 g für 30 min bei 20°C zentrifugiert. Das Sediment wurde in 100 μl SDS-Probenpuffer aufgenommen und stellt Fraktion 2 dar (Zellmembranen und Membranbestandteile).
  • (3) Der Überstand stellt Fraktion 3 dar (lösliche Zellbestandteile). Die löslichen Proteine wurden mittels Fällung mit Trichloressigsäure (TCA) präzipitiert.
For the fractionation of R. capsulatus samples was proceeded as for the production of cell-free protein extracts. However, after the cell pellet was resuspended in 1 ml of collecting gel buffer, the samples were lysed by ultrasound (2 x 2.5 min, 50 cycles / min, 30% power, Bandin Sonoplus, UW2070, MS72, Bandelin electronic GmbH & Co. KG, Berlin , Germany). Then two centrifugation steps were carried out to generate three fractions:
  • (1) Centrifuge at 2370 g for 3 min at 20 ° C. The sediment was taken up in 100 μl SDS sample buffer and represents fraction 1 (cell debris and inclusion body).
  • (2) The supernatant was centrifuged at 18300 g for 30 min at 20 ° C. The sediment was taken up in 100 μl SDS sample buffer and represents fraction 2 (cell membranes and membrane constituents).
  • (3) The supernatant represents fraction 3 (soluble cell components). The soluble proteins were precipitated by precipitation with trichloroacetic acid (TCA).

Dazu wurden 1 Volumen Proteinlösung (Fraktion 3) und 0,1 Volumen TCA (70%) gemischt, kurz gevortext und 10 min bei 20°C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz bei 16000 g, 5 min bei 20°C zentrifugiert. Das Sediment wurde mit Aceton (80%) gewaschen. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment in einer Vakuumzentrifuge (Concentrator 5301, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) getrocknet und in 100 μl SDS-Probenpuffer aufgenommen.To were 1 volume of protein solution (fraction 3) and 0.1 volume TCA (70%) mixed, briefly vortexed and 10 min at 20 ° C incubated. Subsequently, the batch was at 16000 g, 5 centrifuged at 20 ° C min. The sediment was treated with acetone (80%). The supernatant was discarded and the Sediment in a vacuum centrifuge (Concentrator 5301, Eppendorf AG, Hamburg, Germany) and in 100 μl SDS sample buffer added.

Für die Fraktionierung von Literkulturen für die Verwendung in Saccharosedichtegradienten wurde die komplette Kultur bei 16000 g für 30 min bei 4°C sedimentiert. Das Pellet wurde in Tris-HCl-Puffer (100 mM, pH 7,0, 1 Tablette Complete Protease Inhibitor pro 1000 ml Puffer) aufgenommen, so dass ein Gesamtvolumen von 30 ml erreicht wurde. Der anschließende Zellaufschluss erfolgt mit Hilfe eines French Pressure Cell Disruptor (Thermo Electron Corporation) in einer FA-031 Pressure Cell bei 1500 psi. Jede Kultur wurde vier Durchlaufen unterzogen. Die aufgeschlossenen Zellen wurden, wie oben beschrieben, fraktioniert, jedoch nicht in SDS-Probenpuffer aufgenommen. Das Sediment, welches Fraktion 2 (Zellmembranen und Membranbestandteile) darstellt, wurde in 2 ml Tris-HCl-Puffer (100 mM, pH 7,0, 1 Tablette Complete Protease Inhibitor pro 1000 ml Puffer, 2% Saccharose) aufgenommen und der Saccharosedichtgradientenzentrifugation zugeführt.For the fractionation of literary cultures for use in sucrose density gradients the complete culture became 16000 g sedimented for 30 min at 4 ° C. The pellet was dissolved in Tris-HCl buffer (100mM, pH 7.0, 1 tablet Complete Protease Inhibitor per 1000 ml buffer), giving a total volume of 30 ml was reached. The subsequent cell disruption is done with the help of a French Pressure Cell Disruptor (Thermo Electron Corporation) in an FA-031 Pressure Cell at 1500 psi. Every culture was subjected to four runs. The open-minded cells were, as described above, fractionated but not in SDS sample buffer added. The sediment containing fraction 2 (cell membranes and Membrane constituents) was dissolved in 2 ml Tris-HCl buffer (100 mM, pH 7.0, 1 tablet Complete Protease Inhibitor per 1000 ml buffer, 2% sucrose) and sucrose density gradient centrifugation fed.

Saccharosedichtegradientenzentrigugation von R. capsulatus Membranfraktionen:Saccharosedichtegradientenzentrigugation of R. capsulatus membrane fractions:

Zur Isolierung von Membranvesikeln wurden photoheterotrophen Litertestkulturen von R. capsulatus fraktioniert. Fraktion 2 wurde für die Saccharosedichtgradientenzentrifugation verwendet. Die eingesetzte Zellzahl entsprach ungefähr einer optischen Dichte von 1000 bei 660 nm pro Dichtegradient. Mit Hilfe einer Peristaltic Pump P-1 (Pharmacia Fine Chemicals) und eines 21A Multiphor II Gradientenmischers (LKB) wurden kontinuierliche Saccharosegradienten von 10 bis 60% Saccharose gegossen. Die Membranfraktion wurde anschließend auf den Gradienten aufgetragen und bei 175000 g und 4°C für 17 Stunden ultrazentrifugiert. Nach abgeschlossener Zentrifugation wurde der Dichtegradient in 1 ml Aliquots abgenommen. Anschließend wurde die Saccharosekonzentration in einem Refraktometer (Optech Abbe-Refraktometer) sowie die Proteinkonzentration nach Bradford analysiert. Außerdem wurden die entnommen Aliquots immunologisch mit spezifischen Antikörpern (Anti-His6-(C-Term)-Antikörper, Fermentas GmbH, St. Leon-Roth Deutschland) auf ihren Gehalt an Bakterio-opsin untersucht.For the isolation of membrane vesicles photoheterotrophic liter test cultures of R. capsulatus were fractionated. Fraction 2 was used for sucrose density gradient centrifugation. The cell number used corresponded approximately to an optical density of 1000 at 660 nm per density gradient. Continuous sucrose gradients of 10 to 60% sucrose were poured using a Peristaltic Pump P-1 (Pharmacia Fine Chemicals) and a 21A Multiphor II gradient mixer (LKB). The membrane fraction was then applied to the gradient and ultracentrifuged at 175,000 g and 4 ° C for 17 hours. After centrifugation was complete, the density gradient was removed in 1 ml aliquots. Subsequently, the sucrose concentration was analyzed in a refractometer (Optech Abbe refractometer) and the Bradford protein concentration. In addition, the extracted aliquots were examined immunologically with specific antibodies (Anti-His 6 - (C-term) antibodies, Fermentas GmbH, St. Leon-Roth Germany) for their content of bacterio-opsin.

Quantitative Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford:Quantitative determination of protein concentration to Bradford:

Zur quantitativen Bestimmung der Proteinkonzentration nach der Saccharosedichtgradientenzentrifugation wurde der Bradford-Test (Bradford, 1976) verwendet. Dabei handelt es sich um eine photometrische Methode zur quantitativen Bestimmung von Proteinen im Bereich von 1–200 μg/ml Protein mit Hilfe des Triphenylmethanfarbstoffs Coomassie-Brilliant-Blau G-250. Durch Komplexbildung mit Proteinen wird der Farbstoff in seiner blauen, unprotonierten, anionischen Sulfatform mit einem Absorptionsmaximum von 595 nm stabilisiert.to quantitative determination of protein concentration after sucrose density gradient centrifugation the Bradford test (Bradford, 1976) was used. It acts it is a photometric method for quantitative determination of proteins in the range of 1-200 μg / ml protein using the triphenylmethane dye Coomassie Brilliant Blue G-250. By complexing with proteins, the dye in its blue, unprotonated, anionic sulfate form with a Absorption maximum of 595 nm stabilized.

Zur exakten Proteinkonzentrationsbestimmung war es erforderlich, eine Eichreihe mit definierten Proteinkonzentrationen zu vermessen. Dazu wurden jeweils drei Eichproben mit 0,02 mg/ml, 0,04 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,08 mg/ml sowie 0,10 mg/ml Rinderserum Albumin (BSA) in Aqua dest. aus einer Eichlösung (2 mg/ml Albumin Standard, Pierce) vorbereitet. Anschließend wurden 0,1 ml jeder Eichprobe mit 0,9 ml Bradfordreagenz vermischt und bei 595 nm nach einer Inkubationszeit von 5 min bei 20°C photometrisch (Shimadzu UV/VIS 160, Shimadzu GmbH, Duisburg, Deutschland) analysiert.For exact protein concentration determination, it was necessary to have a calibration series with defined Pro teinkonzentrationen to measure. For this purpose, three calibration samples each with 0.02 mg / ml, 0.04 mg / ml, 0.05 mg / ml, 0.08 mg / ml and 0.10 mg / ml bovine serum albumin (BSA) in distilled water. prepared from a calibration solution (2 mg / ml albumin standard, Pierce). Subsequently, 0.1 ml of each calibration sample was mixed with 0.9 ml Bradford reagent and analyzed photometrically (Shimadzu UV / VIS 160, Shimadzu GmbH, Duisburg, Germany) at 595 nm after an incubation time of 5 min at 20 ° C.

Nach Messung aller Eichproben wurden mit den zu analysierenden Proteinlösungen unbekannter Konzentration vergleichbar verfahren. Ab einer gemessenen Absorption von 0,4 wurde die Probe adäquat verdünnt. Aus der linearen Beziehung von Absorption und Proteinkonzentration im Absorptionsmessbereich von 0 bis 0,4 kann mit Hilfe der Daten der Eichproben die Proteinkonzentration der unbekannten Proben errechnet werden.To All calibration samples were measured with the protein solutions to be analyzed of unknown concentration. From a measured Absorption of 0.4, the sample was diluted adequately. From the linear relationship of absorption and protein concentration in the absorbance measuring range from 0 to 0.4 can with the help of data calibration samples are used to calculate the protein concentration of unknown samples.

Zur Herstellung des Bradfordreagenz wurde wie folgt verfahren:
100 mg Coomassie-Brilliant-Blau G-250 wurden in 50 ml Ethanol (absolut) in einer 1000 ml lichtdichten Flasche gelöst. Anschließend wurden 100 ml ortho-Phosphorsäure (85,5%-ig) zugeben und 1 h gerührt bevor mit Aqua dest. auf 1000 ml aufgefüllt wurde. Nach 5 min Rühren wurde die Lösung eine Tag stehen gelassen (Absenkung der Schwebstoffe) oder filtriert und wie oben beschrieben verwendet.
The Bradford reagent was prepared as follows:
100 mg of Coomassie Brilliant Blue G-250 were dissolved in 50 ml of ethanol (absolute) in a 1000 ml light-tight bottle. Then 100 ml of ortho-phosphoric acid (85.5% strength) were added and stirred for 1 h before being distilled with distilled water. was made up to 1000 ml. After stirring for 5 minutes, the solution was allowed to stand for one day (lowering of suspended solids) or filtered and used as described above.

Literatur:Literature:

  • Alexeyev, M. F. 1995. Three kanamycin resistance gene cassettes with different polylinkers. BioTechniques 18(1): 52–56 . Alexeyev, MF 1995. Three kanamycin resistance gene cassettes with different polylinkers. BioTechniques 18 (1): 52-56 ,
  • Alldread RM, Nicholls DJ, Sundaram TK, Scawen MD, Atkinson T (1992): Overexpression of the Thermus aquaticus B malate dehydrogenase-encoding gene in Escherichia coli. Gene 114: 139–143Alldread RM, Nicholls DJ, Sundaram TK, Scawen MD, Atkinson T (1992): Overexpression of the Thermus aquaticus B malate dehydrogenase-encoding genes in Escherichia coli. Gene 114: 139-143
  • Amrein KE, Takacs B, Stieger M, Molnos J, Flint NA, Burn P (1995): Purification and characterization of recombinant human p50 protein-tyrosine kinase from an Escherichia coli expression system overproducing the bacterial chaperones GroES and GroEL. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1048–1052Amrein KE, Takacs B, Stieger M, Molnos J, Flint NA, Burn P (1995): Purification and characterization of recombinant human p50 protein-tyrosine kinase from Escherichia coli expression system overproducing the bacterial chaperones Groes and Groel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1048-1052
  • Andersson L, Yang S, Neubauer P, Enfors S-O (1996): Impact of plasmid presence and induction on cellular responses in fed batch cultures of Escherichia coli. J. Biotechnol. 46: 255–263Andersson L, Yang S, Neubauer P, Enfors S-O (1996): Impact of plasmid presence and induction on cellular responses in fed batch cultures of Escherichia coli. J. Biotechnol. 46: 255-263
  • Arié J-P, Sassoon N, Betton J-M (2001): Chaperone function of FkpA, a heat shock prolyl isomerase, in the periplasm of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 39(1): 199–210Arié J-P, Sassoon N, Betton J-M (2001): Chaperones function of FkpA, a heat shock prolyl isomerase, in the periplasm of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 39 (1): 199-210
  • Baneyx F, Mujacic M (2004): Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 22(11): 1399–1408Baneyx F, Mujacic M (2004): Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 22 (11): 1399-1408
  • Barnard GC, Henderson GE, Srinivasan S, Gerngross TU (2004): High level recombinant protein expression in Ralstonia eutropha using T7 RNA polymerase based amplification. Protein Expr. Purif. 38: 264–271Barnard GC, Henderson GE, Srinivasan S, Gerngross TU (2004): High level recombinant protein expression in Ralstonia eutropha using T7 RNA polymerase based amplification. Protein Expr. Purif. 38: 264-271
  • Bauer C, Elsen S, Swem LR, Swem DL, Masuda S (2003): Redox and light regulation of gene expression in photosynthetic prokaryotes. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 258: 147–154Bauer C, Elsen S, Swem LR, Swem DL, Masuda S (2003): Redox and light regulation of gene expression in photosynthetic prokaryotes. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 258: 147-154
  • Blattner FR, III GP, Bloch CA, Perna NT, Burland V, Riley M, Collado-Vides J, Glasner JD, Rode CK, Mayhew GF, Gregor J, Davis NW, Kirkpatrick HA, Goeden MA, Rose DJ, Mau B, Shao Y (1997): The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 277: 1453–1462Blattner FR, III GP, Bloch CA, Perna NT, Burland V, Riley M, Collado-Vides J, Glasner JD, Rode CK, Mayhew GF, Gregor J, Davis NW, Kirkpatrick HA, Goeden MA, Rose DJ, Mau B, Shao Y (1997): The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 277: 1453-1462
  • Bradford, M. M. (1976): A rapid and sensitive method fort he quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72, 248–254 . Bradford, MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein using the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72, 248-254 ,
  • Brunschwig E, Darzins A (1992): A two-component T7-system for the overexpression of genes in Pseudomonas aeruginosa. Gene 111: 35–41Brunschwig E, Darzins A (1992): A two-component T7 system for the overexpression of genes in Pseudomonas aeruginosa. Gene 111: 35-41
  • Calderone TL, Stevens RD, Oas TG (1996): High-level misincorporation of lysine for arginine at AGA codons in a fusion protein expressed in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 262: 407–412Calderone TL, Stevens RD, Oas TG (1996): High-level misincorporation of lysine for arginine at AGA codons in a fusion protein expressed in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 262: 407-412
  • Carbone A, Zinovyev A, Képès F (2003): Codon adaption index as a measure of dominating codon bias. Bioinformatics 19(16): 2005–2015Carbone A, Zinovyev A, Kepes F (2003): Codon adaptation index as a measure of dominant codon bias. Bioinformatics 19 (16): 2005-2015
  • Chang S-W, Lee G-C, Shaw J-F (2006): Codon optimization of Candida rugosa lip1 gene for improving expression in Pichia pastoris and biochemical characterization of the purified recombinant LIP1 lipase. J. Agric. Food Chem. 54: 815–822Chang S-W, Lee G-C, Shaw J-F (2006): Codon optimization of Candida rugosa lip1 gene for improving expression in Pichia pastoris and biochemical characterization of the purified recombinant LIP1 lipase. J. Agric. Food Chem. 54: 815-822
  • Chef C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland N, Anderson DC, Battersby JE, Champion KM (2004): High-level accumulation of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli requires a triple-mutant (degP prc spr) host strain. Biotechnol. Bioeng. 85(5): 463–474Chief C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland Anderson DC, Battersby JE, Champion KM (2004): High-level accumulation of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli requires a triple-mutant (degP prc spr) host strain. Biotechnol. Bioeng. 85 (5): 463-474
  • Chevallet M, Dupuis A, Issartel J-P, Lunardi J, van Belzen R, Albracht SPJ (2003): Two EPR-detectable [4Fe-4S]-clusters, N2a and N2b, are bound to the NuoI (TYKY) subunit of NADH: ubiquinone oxidoreductase (Complex I) from Rhodobacter capsulatus. Biochim. Biophys. Acta 1557: 51–66Chevallet M, Dupuis A, Issartel J-P, Lunardi J, van Belzen R, Albracht SPJ (2003): Two EPR-detectable [4Fe-4S] Clusters, N2a and N2b are bound to the NuoI (TYKY) subunit of NADH: ubiquinone oxidoreductase (Complex I) from Rhodobacter capsulatus. Biochim. Biophys. Acta 1557: 51-66
  • Corchero JL, Villaverde A (1998): Plasmid maintenance in Escherichia coli is dramatically, steadily, and specifically influenced by features of the encoded proteins. Biotechnol. Bioeng. 58: 625–632Corchero JL, Villaverde A (1998): Plasmid maintenance in Escherichia coli is dramatically, steadily, and specifically influenced by features of the encoded proteins. Biotechnol. Bioeng. 58: 625-632
  • Corchero JL, Viaplana E, Benito A, Villaverde A (1996): The position of the heterologous domain can influence the solubility and proteolysis of beta-galactosidase fusion proteins in E. coli. J. Biotechnol. 48(3): 191–200Corchero JL, Viaplana E, Benito A, Villaverde A (1996): The position of the heterologous domain can influence the solubility and proteolysis of beta-galactosidase fusion proteins in E. coli. J. Biotechnol. 48 (3): 191-200
  • De Boer HA, Comstock LJ, Vasser M (1983): The tac Promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21–25De Boer HA, Comstock LJ, Vasser M (1983): The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25
  • Deng T (1997): Bacterial expression and purification of biologically active mouse c-Fos proteins by selective codon optimization. FERS Lett. 409: 269–272Deng T (1997): Bacterial expression and purification of biologically active mouse c-Fos proteins by selective codon optimization. FERS Lett. 409: 269-272
  • De Smet L, Pettigrew GW, van Beeumen JJ (2001a): Cloning, overproduction and characterization of cytochrome c peroxidase from the purple phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus. Eur. J. Biochem. 268: 6559–6568De Smet L, Pettigrew GW, van Beeumen JJ (2001a): Cloning, overproduction and characterization of cytochrome c peroxidase from the purple phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus. Eur. J. Biochem. 268: 6559-6568
  • De Smet L, Kostanjevecki V, Guisez Y, Van Beeumen J (2001b): A novel system for heterologous expression of flavocytochrome c in phototrophic bacteria using the Allochromatium vinosum rbcA promoter. Arch. Microbiol. 176: 19–28De Smet L, Kostanjevecki V, Guisez Y, Van Beeumen J (2001b): A novel system for heterologous expression of flavocytochrome c in phototrophic bacteria using the Allochromatium vinosum rbcA promoter. Arch. Microbiol. 176: 19-28
  • Doherty AJ, Connolly BA, Worrall AF (1993): Overproduction of the toxic protein, bovine pancreatic DNaseI, in Escherichia coli using a tightly controlled T7-promoter-based vector. Gene 136: 337–340Doherty AJ, Connolly BA, Worrall AF (1993): Overproduction of the toxic protein, bovine pancreatic DNaseI, in Escherichia coli using a tightly controlled T7 promoter-based vector. Gene 136: 337-340
  • Dong H, Nilsson L, Kurland CG (1995): Gratuitous overexpression of genes in Escherichia coli leads to growth inhibition and ribosome destruction. J. Bacteriol. 177(6): 1497–1504Dong H, Nilsson L, Courland CG (1995): Gratuitous overexpression of genes in Escherichia coli leads to growth inhibition and ribosomes destruction. J. Bacteriol. 177 (6): 1497-1504
  • Drepper T, Groß S, Yakunin AF, Hallenbeck PC, Masepohl B, Klipp W (2003): Role of GlnB and GlnK in ammonium control of both nitrogenase systems in the phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus. Microbiology 149: 2203–2212Drepper T, Large S, Yakunin AF, Hallenbeck PC, Masepohl B, Klipp W (2003): Role of GlnB and GlnK in ammonium control of both nitrogenase systems in the phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus. Microbiology 149: 2203-2212
  • Drepper, T., Eggert, T., Circolone, F., Heck, A., Krauß, U., Guterl, J.-K., Wendorff, M., Losi, A., Gärtner, W. & Jaeger, K.-E. (2007): Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen. Nat. Biotechnol. 25, 443–445 . Drepper, T., Eggert, T., Circolone, F., Heck, A., Krauss, U., Guterl, J.-K., Wendorff, M., Losi, A., Gärtner, W. & Jaeger, K.-E. (2007): Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen. Nat. Biotechnol. 25, 443-445 ,
  • Dunn et al. 1981. The bacteriorhodopsin gene. PNAS 78(11): 6744-6748. Duport C, Meyer C, Naud I, Jouannesu Y (1994): A new gene expression system based on a Fructose-dependent promoter from Rhodobacter capsulatus. Gene 145: 103–108Dunn et al. 1981. The bacteriorhodopsin gene. PNAS 78 (11): 6744-6748. Duport C, Meyer C, Naud I, Jouannesu Y (1994): A new gene expression system based on a fructose-dependent promoter from Rhodobacter capsulatus. Gene 145: 103-108
  • Dyczmons, N. G. (2006): Expression und Regulation von Membranproteinen am Beispiel der Cytochrom bd-Oxidase aus Synechocystis sp. PCC 6803, Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum . Dyczmons, NG (2006): Expression and regulation of membrane proteins using cytochrome bd oxidase from Synechocystis sp. PCC 6803, Dissertation to obtain a Doctor of Science degree from the Faculty of Biology of the Ruhr-Universität Bochum ,
  • Feng L, Chan WW, Roderick SL, Cohen DE (2000): High-level expression and mutagenesis of recombinant human phosphatidylcholine transfer protein using a synthetic gene: evidence for a C-terminal membrane binding domain. Biochemistry 39: 15399–15409Feng L, Chan WW, Roderick SL, Cohen DE (2000): High-level expression and mutagenesis of recombinant human phosphatidylcholine transfer protein using a synthetic gene: evidence for a C-terminal membrane binding domain. Biochemistry 39: 15399-15409
  • Forman MD, Stack RF, Masters PS, Hauer CR, Baxter SM (1998): High level, context dependent misincorporation of lysine for arginine in Saccharomyces cerevisiae a1 homeodomain expressed in Escherichia coli. Protein Sci. 7: 500–503Forman MD, Stack RF, Masters PS, Hauer CR, Baxter SM (1998): High level, context dependent misincorporation of lysines for arginine expressed in Saccharomyces cerevisiae a1 homeodomain in Escherichia coli. Protein sci. 7: 500-503
  • Fuller F (1982): A family of cloning vectors containing the lacUV5 promoter. Gene 19: 43–54Fuller F (1982): A family of cloning vectors containing the lacUV5 promoter. Gene 19: 43-54
  • Georgiou G, Valax P (1996): Expression of correctly folded proteins in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 7: 190–197Georgiou G, Valax P (1996): Expression of correctly folded proteins in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 7: 190-197
  • Gill RT, Valdes JJ, Bentley WE (2000): A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli. Metab. Eng. 2: 178–189Gill RT, Valdes JJ, Bentley WE (2000): A Comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli. Metab. Closely. 2: 178-189
  • Glick BR (1995): Metabolic load and heterologous gene expression. Biotechnol. Adv. 13(2): 247–261Glick BR (1995): Metabolic load and heterologous genes expression. Biotechnol. Adv. 13 (2): 247-261
  • Goff SA, Goldberg AL (1985): Production of abnormal proteins in E. coli stimulates transcription of lon and other heat shock genes. Cell 41: 587–595Goff SA, Goldberg AL (1985): Production of Abnormal proteins in E. coli stimulates transcription of lon and other heat shock genes. Cell 41: 587-595
  • Gregor J, Klug G (1999): Regulation of bacterial photosynthesis genes by oxygen and light. FEMS Microbiol. Lett. 179: 1–9Gregor J, Klug G (1999): Regulation of bacterial photosynthesis genes by oxygen and light. FEMS Microbiol. Lett. 179: 1-9
  • Gumpert J, Hoischen C (1998): Use of cell wall-less bacteria (L-forms) for efficient expression and secretion of heterologous gene products. Curr. Opin. Biotechnol. 9: 506–509Gumpert J, Hoischen C (1998): Use of cell wall-less bacteria (L-forms) for efficient expression and secretion of heterologous gene products. Curr. Opin. Biotechnol. 9: 506-509
  • Gustafsson C, Govindarajan S, Minshull J (2004): Codon bias and heterologous protein expression. Trends Biotechnol. 22(4): 346–353Gustafsson C, Govindarajan S, Minshull J (2004): Codon bias and heterologous protein expression. Trends Biotechnol. 22 (4): 346-353
  • Gutman GA, Hatfield GW (1989): Nonrandom utilization of codon pairs in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3699–3703Gutman GA, Hatfield GW (1989): Nonrandom utilization of codon pairs in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3699-3703
  • Guzman LM, Belin D, Carson MJ, Beckwith J (1995): Tight regulation, modulation and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177: 4121–4130Guzman LM, Belin D, Carson MJ, Beckwith J (1995): Tight regulation, modulation and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177: 4121-4130
  • Hanahan D (1983): Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: 557–580Hanahan D (1983): Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: 557-580
  • Hannig G, Makrides SC (1998): Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli. Trends Biotechnol. 16: 54–60Hannig G, Makrides SC (1998): Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli. Trends Biotechnol. 16: 54-60
  • Harcum SW, Bentley WE (1999): Heat-shock and stringent responses have overlapping protease activity in Escherichia coli. Appl. Biochem. Biotechnol. 80(1): 23–37Harcum SW, Bentley WE (1999): Heat-shock and stringent responses have overlapping protease activity in Escherichia coli. Appl. Biochem. Biotechnol. 80 (1): 23-37
  • Haselkorn R, Lapidus A, Kogan Y, Vlcek C, Paces J, Paces V, Ulbrich P, Pecenkova T, Rebrekov D, Milgram A, Mazur M, Cox R, Kyrpides N, Ivanova N, Kapatral V, Los T, Lykidis A, Mikhailova N, Reznik G, Vasieva O, Fonstein M (2001): The Rhodobacter capsulatus genome. Photosynth. Res. 70: 43–52Haselkorn R, Lapidus A, Kogan Y, Vlcek C, Paces J, Paces V, Ulbrich P, Pecenkova T, Rebrekov D, Milgram A, Mazur M, Cox R, Kyrpides N, Ivanova N, Kapatral V, Lot T, Lykidis A, Mikhailova N, Reznik G, Vasieva O, Fonstein M (2001): The Rhodobacter capsulatus genome. Photosynth. Res. 70: 43-52
  • Herrero M, de Lorenzo V, Ensley B, Timmis KN (1993): A T7 RNA polymerase-based system for the construction of Pseudomonas strains with phenotypes dependent on TOL-meta pathways effectors. Gene 134: 103–106Herrero M, de Lorenzo V, Ensley B, Timmis KN (1993): A T7 RNA polymerase-based system for the construction of Pseudomonas strains with phenotypes dependent on TOL meta pathways effectors. Gene 134: 103-106
  • Hockney RC (1994): Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli. Trends Biotechnol. 12: 456–463Hockney RC (1994): Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli. Trends Biotechnol. 12: 456-463
  • Hoffmann F, Rinas U (2001): On-line estimation of the metabolic burden resulting from the synthesis of plasmid-encoded and heat-shock proteins by monitoring respiratory energy generation. Biotechnol. Bioeng. 76: 333–340Hoffmann F, Rinas U (2001): On-line estimation of the metabolic stress resulting from the synthesis of plasmid-encoded and heat-shock proteins by monitoring respiratory energy generation. Biotechnol. Bioeng. 76: 333-340
  • Jana S, Deb JK (2005): Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 67: 289–298Jana S, Deb JK (2005): Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 67: 289-298
  • Jeong H-S, Jouanneau Y (2000): Enhanced nitrogenase activity in strains of Rhodobacter capsulatus that overexpress the rnf genes. J. Bacteriol. 182(5): 1208–1214Jeong H-S, Jouanneau Y (2000): Enhanced nitrogenase activity in strains of Rhodobacter capsulatus that overexpress the few genes. J. Bacteriol. 182 (5): 1208-1214
  • Jonasson P, Liljeqvist S, Nygren P-A, Stahl S (2002): Genetic design for facilitated production and recovery of recombinant proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Appl. Biochem. 35: 91–105Jonasson P, Liljeqvist S, Nygren P-A, Steel S (2002): Genetic design for facilitated production and recovery of recombinant proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Appl. Biochem. 35: 91-105
  • Kane JF, Violand BN, Curran DF, Staten NR, Duffin KL, Bogosian G (1992): Novel inframe two codon translational hop during synthesis of bovine placental lactogen in a recombinant strain of Escherichia coli. Nucl. Acids Res. 20(24): 6707–6712Kane JF, Violand BN, Curran DF, Staten NR, Duffin KL, Bogosian G (1992): Novel inframe two codon translational hop during synthesis of bovine placental lactogen in a recombinant strain of Escherichia coli. Nucl. Acids Res. 20 (24): 6707-6712
  • Kappler U, McEwan AG (2002): A system for the heterologous expression of complex redox proteins in Rhodobacter capsulatus: characterization of recombinant sulphite: cytochrome c oxidoreductase from Starkeya novella. FERS Lett. 529: 208–214Kappler U, McEwan AG (2002): A system for the heterologous expression of complex redox proteins in Rhodobacter capsulatus: characterization of recombinant sulphite: cytochrome c oxidoreductase from Starkeya novella. FERS Lett. 529: 208-214
  • Kovach et al. 1994. pBBR1 MCS: A Broad-Host-Range Cloning Vector. BioTechniques 16 (5): 800–801 . Kovach et al. 1994. pBBR1 MCS: A Broad Host Range Cloning Vector. BioTechniques 16 (5): 800-801 ,
  • Klipp W, Masepohl B, Pühler A (1988): Identification and mapping of nitrogen fixation genes of Rhodobacter capsulatus: duplication of a nifA-nifB region. J. Bacteriol. 170: 693–699Clip W, Masepohl B, Pühler A (1988): Identification and mapping of nitrogen fixation of Rhodobacter capsulatus: duplication of a nifA nifB region. J. Bacteriol. 170: 693-699
  • Kochetkov SN, Rusakova EE, Tunitskaya VL (1998): Recent studies of T7 RNA polymerase mechanism. FERS Lett. 440: 264–267Kochetkov SN, Rusakova EE, Tunitskaya VL (1998): Recent Studies of T7 RNA polymerase mechanism. FERS Lett. 440: 264-267
  • Lang SE, Jenney FE, Daldal F (1996): Rhodobacter capsulatus CycH: a bipartite gene product with pleiotropic effects on the biogenesis of structurally different c-Type cytochromes. J. Bacteriol. 178(17): 5279–5290Lang SE, Jenney FE, Daldal F (1996): Rhodobacter capsulatus CycH: a bipartite gene product with pleiotropic effects on the biogenesis of structurally different c-type cytochromes. J. Bacteriol. 178 (17): 5279-5290
  • Lesley SA, Graziano J, Cho CY, Knuth MW, Klock HE (2002): Gene expression response to misfolded protein as a screen for soluble recombinant protein. Protein Eng. 5(2): 153–160Lesley SA, Graziano J, Cho CY, Knuth MW, Klock HE (2002): Gene expression response to misfolded protein as a screen for soluble recombinant protein. Protein Eng. 5 (2): 153-160
  • LeThanh H, Neubauer P, Hoffmann F (2005): The small heat-shock proteins lbpA and lbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb. Cell Fact. 4: 6–17LeThanh H, Neubauer P, Hoffmann F (2005): The small heat-shock proteins lbpA and lbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb. Cell Fact. 4: 6-17
  • Lichty et al. 2005. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr Purif. 41: 98–105Lichty et al. 2005. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr Purif. 41: 98-105
  • Makrides SC (1996): Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60(3): 512–538Makrides SC (1996): Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60 (3): 512-538
  • Marsh et al. 1984. The plC plasmid and phage vectors with versatile cloning sites for recombinant selection by insertional inactivation. Gene 32(3): 481–485 . Marsh et al. 1984. The plC plasmid and phage vectors with versatile cloning sites for recombinant selection by insertional inactivation. Gene 32 (3): 481-485 ,
  • Martinez A, Knappskog PM, Olafsdottir S, Døskeland AP, Eiken HG, Svebak RM, Bozzini ML, Apold J, Flatmark T (1995): Expression of recombinant human phenylalanine hydroxylase as fusion protein in Escherichia coli circumvents proteolytic degradation by host cell proteases. Biochem. J. 306: 589–597Martinez A, Knappskog PM, Olafsdottir S, Døskeland AP, Eiken HG, Svebak RM, Bozzini ML, Apold J, Flatmark T (1995): Expression of recombinant human phenylalanine hydroxylase as fusion protein in Escherichia coli circumvents proteolytic degradation by host cell proteases. Biochem. J. 306: 589-597
  • Masepohl B, Drepper T, Paschen A, Groß S, Pawlowski A, Raabe K, Riedel KU, Klipp W (2002): Regulation of nitrogen fixation in the phototrophic purple bacterium Rhodobacter capsulatus. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 4(3): 243–248Masepohl B, Drepper T, Paschen A, Big S, Pawlowski A, Raabe K, Riedel KU, Klipp W (2002): Regulation of nitrogen fixation in the phototrophic purple bacterium Rhodobacter capsulatus. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 4 (3): 243-248
  • McKinney J, Guerrir-Takada C, Galán J, Altman S (2002): Tightly regulated gene expression system in Salmonella enterica Serovar Typhimurium. J. Bacteriol. 184(21): 6056–6059McKinney J, Guerrir-Takada C, Galán J, Altman S (2002): Tightly regulated gene expression system in Salmonella enterica serovar Typhimurium. J. Bacteriol. 184 (21): 6056-6059
  • McNulty DE, Claffee BA, Huddleston MJ, Kane JF (2003): Mistranslational errors associated with the rare arginine codon CGG in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 27: 365–374McNulty DE, Claffee BA, Huddleston MJ, Kane JF (2003): Mistranslational errors associated with the rare arginine codon CGG in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 27: 365-374
  • Murby M, Samuelsson E, Nguyen TN, Mignard L, Power U, Binz H, Uhlen M, Stahl S (1995): Hydrophobicity engineering to increase solubility and stability of a recombinant protein from respiratory syncytial virus. Eur. J. Biochem. 230: 38–44Murby M, Samuelsson E, Nguyen TN, Mignard L, Power U, Binz H, Uhlen M, Stahl S (1995): Hydrophobicity engineering to increase solubility and stability of a recombinant protein from respiratory syncytial virus. Eur. J. Biochem. 230: 38-44
  • Newman JR, Fuqua C (1999): Broad-host-range expression vectors that carry the L-arabinose-inducible Escherichia coli araBAD promoter and the araC regulator. Gene 227: 197–203Newman JR, Fuqua C (1999): Broad-host-range expression vectors that carry the L-arabinose-inducible Escherichia coli araBAD promoter and the araC regulator. Gene 227: 197-203
  • Nishihara K, Kanemori M, Kitagawa M, Yanagi H, Yura T (1998): Chaperone coexpression plasmids: differential and synergistic roles of DnaK-DnaJ-GrpE and GroEL-GroES in assisting folding of an allergen of Japanese cedar pollen, Cryj2, in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 64(5): 1694–1699Nishihara K, Kanemori M, Kitagawa M, Yanagi H, Yura T (1998): Chaperone coexpression plasmids: differential and synergistic roles of DnaK-DnaJ-GrpE and GroEL-GroES in assisting folding of allergen of Japanese cedar pollen, Cryj2, in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 64 (5): 1694-1699
  • Opekarová M, Tanner W (2003): Specific lipid requirements of membrane proteins – a putative bottleneck in heterologous expression. Biochim. Biophys. Acta 1610: 11–22Opekarová M, Tanner W (2003): Specific lipid requirements of membrane proteins - a putative bottleneck in heterologous expression. Biochim. Biophys. Acta 1610: 11-22
  • Pan W, Ravot E, Tolle R, Frank R, Mosbach R, Türbachova I, Bujard H (1999): Vaccine candidate MSP-1 from Plasmodium falciparum: a redesigned 4917 bp polynucleotide enables synthesis and isolation of full-length protein from Escherichia coli and mammalian cells. Nucl. Acids Res. 27(4): 1094–1103Pan W, Ravot E, Great R, Frank R, Mosbach R, Türbachova I, Bujard H (1999): Vaccine candidate MSP-1 from Plasmodium falciparum: a redesigned 4917 bp polynucleotide enables synthesis and isolation of full-length protein from Escherichia coli and mammalian cells. Nucl. Acids Res. 27 (4): 1094-1103
  • Patterson SS, Dionisi HM, Gupta RK, Sayler GS (2005): Codon optimization of bacterial luciferase (lux) for expression in mammalian cells. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 32: 115–123Patterson SS, Dionisi HM, Gupta RK, Sayler GS (2005): Codon optimization of bacterial luciferase (lux) for expression in mammalian cells. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 32: 115-123
  • Pollock D, Bauer CE, Scolnik PA (1988): Transcription of the Rhodobacter capsulatus nifHDK operon is modulated by the nitrogen source. Construction of plasmid expression vectors based on the nifHDK promoter. Gene 65: 269–275Pollock D, Bauer CE, Scolnik PA (1988): Transcription of the Rhodobacter capsulatus nifHDK operon is modu lated by the nitrogen source. Construction of plasmid expression vectors based on the nifHDK promoter. Gene 65: 269-275
  • Prentki, P. and Krisch, H. M. 1984. In vitro insertional mutagenesis with a selectable DNA fragment. Gene 29(3): 303–313 . Prentki, P. and Krisch, HM 1984. In Vitro Insertional Mutagenesis with a Selectable DNA Fragment. Gene 29 (3): 303-313 ,
  • Ramírez DM, Bentley WE (1999): Characterization of stress and protein turnover from protein overexpression in fed-batch E. coli cultures. J. Biotechnol. 71: 39–58Ramírez DM, Bentley WE (1999): Characterization overexpression in fed-batch E. coli cultures. J. Biotechnol. 71: 39-58
  • Rinas U (1996): Synthesis rates of cellular proteins involved in translation and protein folding are strongly altered in response to overproduction of basic fibroblast growth factor by recombinant Escherichia coli. Biotechnol. Prog. 12: 196–200Rinas U (1996): Synthesis rates of cellular proteins involved in translation and protein folding are severely altered in response to overproduction of basic fibroblast growth factor by recombinant Escherichia coli. Biotechnol. Prog. 12: 196-200
  • Rinas U, Bailey JE (1993): Overexpression of bacterial hemoglobin causes incorporation of pre-β-lactamase into cytoplasmic inclusion bodies. Appl. Environ. Microbiol. 59(2): 561–566Rinas U, Bailey JE (1993): overexpression of bacterial hemoglobin causes incorporation of pre-β-lactamase into cytoplasmic inclusion bodies. Appl. Environ. Microbiol. 59 (2): 561-566
  • Rosenau, F., and K. E. Jaeger. 2004. Overexpression and secretion of biocatalysts. In Pseudomonas, p. 617–631. In A. Svendsen (ed.), Enzyme functionality: design, engineering and screening. Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y.Rosenau, F., and K.E. Jaeger. 2004. Overexpression and secretion of biocatalysts. In Pseudomonas, p. 617-631. In A. Svendsen (ed.), Enzyme functionality: design, engineering and screening. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.
  • Rosenberg AH, Lade BN, Chui D-S, Lin S-W, Dunn JJ, Studier FW (1987): Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene 56: 125–135Rosenberg AH, Lade BN, Chui D-S, Lin S-W, Dunn JJ, Studier FW (1987): vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene 56: 125-135
  • Rossi FMV, Blau HM (1998): Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9: 451–456Rossi FMV, Blue HM (1998): Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9: 451-456
  • Saier MH Jr. (1995): Differential codon usage: a safeguard against inappropriate expression of specialized genes? FERS Lett. 362: 1–4Saier MH Jr. (1995): Differential codon usage: a safeguard against inappropriate expression of specialized genes? FERS Lett. 362: 1-4
  • Santiago-Machuca AE, Ruiz-Pérez F, Delgado-Dominguez JS, Becker I, Isibasi A, González-Bonilla CR (2002): Attenuated Salmonella enterica Serovar Typhi live vector with inducible chromosomal expression of the T7 RNA polymerase and its evaluation with reporter genes. Plasmid 47: 108–119Santiago-Machuca AE, Ruiz-Pérez F, Delgado-Dominguez JS, Becker I, Isibasi A, González-Bonilla CR (2002): Attenuated Salmonella enterica Serovar Typhi live vector with inducible chromosomal Expression of the T7 RNA polymerase and its evaluation with reporter genes. Plasmid 47: 108-119
  • Santos MAS, Moura G, Massey SE, Tuite MF (2004): Driving change: the evolution of alternative genetic codes. Trends Genet. 20(2): 95–102Santos MAS, Moura G, Massey SE, Tuite MF (2004): Driving change: the evolution of alternative genetic codes. Trends Genet. 20 (2): 95-102
  • Schlieker C, Bukau B, Mogk A (2002): Prevention and reversion of protein aggregation by molecular chaperones in the E. coli cytosol: implications for their applicability in biotechnology. J. Biotechnol. 96: 13–21Schlieker C, Bukau B, Mogk A (2002): Prevention and reversion of protein aggregation by molecular chaperones in the E. coli cytosol: implications for their applicability in biotechnology. J. Biotechnol. 96: 13-21
  • Schmidt T. G. and Skerra A. 2007. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat Protoc: 2: 1528–1535 ; Schmidt TG and Skerra A. 2007. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat Protoc: 2: 1528-1535 ;
  • Simon R, Priefer U, Pühler A (1983): A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Biotechnology (N. Y.) 1: 784–791Simon R, Priefer U, Pühler A (1983): A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Biotechnology (N.Y.) 1: 784-791
  • Skosyrev VS, Kulesskiy EA, Yakhnin AV, Temirov YV, Vinokurov LM (2003): Expression of the recombinant antibacterial peptide sarcotoxin IA in Escherichia coli cells. Protein Expr. Purif. 28(2): 350–356Skosyrev VS, Kulesskiy EA, Yakhnin AV, Temirov YV, Vinokurov LM (2003): Expression of the recombinant antibacterial peptide sarcotoxin IA in Escherichia coli cells. Protein Expr. Purif. 28 (2): 350-356
  • Smart JL, Willett JW, Bauer CE (2004): Regulation of hem gene expression in Rhodobacter capsulatus by redox and photosystem regulators RegA, CrtJ, FnrL and AerR. J. Mol. Biol. 342: 1171–1186Smart JL, Willett JW, Bauer CE (2004): Regulation of Hem gene expression in Rhodobacter capsulatus by redox and photosystem regulators RegA, CrtJ, FnrL and AerR. J. Mol. Biol. 342: 1171-1186
  • Smith DWE (1996): Problems of translating heterologous genes in expression systems: the role of tRNA. Biotechnol. Prog. 12: 417–422Smith DWE (1996): Problems of translating heterologous genes in expression systems: the role of tRNA. Biotechnol. Prog. 12: 417-422
  • Solomon PS, Shaw AL, Lane I, Hanson GR, Palmer T, McEwan AG (1999): Characterization of a molybdenum cofactor biosynthetic gene cluster in Rhodobacter capsulatus which is specific for the biogenesis of dimethylsulfoxide reductase. Microbiology 145: 1421–1429Solomon PS, Shaw AL, Lane I, Hanson GR, Palmer T, McEwan AG (1999): Characterization of a molybdenum cofactor biosynthetic gene cluster in Rhodobacter capsulatus which is specific for the biogenesis of dimethyl sulfoxide reductase. Microbiology 145: 1421-1429
  • Sorensen HP, Sperling-Petersen HU, Mortensen KK (2003): Production of recombinant thermostable proteins expressed in Escherichia coli: completion of protein synthesis is the bottleneck. J. Chromatogr. B, 786: 207–214Sorensen HP, Sperling-Petersen HU, Mortensen KK (2003): Production of recombinant thermostable proteins expressed in Escherichia coli: completion of protein synthesis is the bottleneck. J. Chromatogr. B, 786: 207-214
  • Sørensen HP, Mortensen KK (2005): Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J. Biotechnol. 115: 113–128Sørensen HP, Mortensen KK (2005): Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J. Biotechnol. 115: 113-128
  • Strandberg L, Enfors SO (1991): Factors influencing inclusion body formation in the production of a fused protein in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 57(6): 1669–1674Strandberg L, Enfors SO (1991): Factors influencing inclusion body formation in the production of a fused protein in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 57 (6): 1669-1674
  • Studier FW, Moffatt BA (1986): Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189: 113–130Studier FW, Moffatt BA (1986): Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189: 113-130
  • Studier FW (1991): Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system. J. Mol. Biol. 219: 37–44Studier FW (1991): Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system. J. Mol. Biol. 219: 37-44
  • Tabita FR (1995): The biochemistry and metabolic regulation of carbon metabolism and CO₂ fixation in purple bacteria. In: Robert E. Blankenship, Michael T. Madigan, Carl E. Bauer (Ed.) – Advances in Photosynthesis – Anoxygenic Photosynthetic Bacteria (Kluwer Academic Publishers)Tabita FR (1995): The biochemistry and metabolic regulation of carbon metabolism and CO₂ fixation in purple bacteria. In: Robert E. Blankenship, Michael T. Madigan, Carl E. Bauer (Ed.) - Advances in Photosynthesis - Anoxygenic Photosynthetic Bacteria (Kluwer Academic Publishers)
  • Tabor S, Richardson CC (1985): A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1074–1078Tabor S, Richardson CC (1985): A bacteriophage T7 RNA polymerase / promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1074-1078
  • Timmermans, M. C., Maliga, P., Vieira, J., Messing, J. (1999): The pFF plasmids: cassettes utilising CaMV sequences for expression of foreign genes in plants. J. Biotechnol 14, 333–344 . Timmermans, MC, Maliga, P., Vieira, J., Messing, J. (1999): The pFF plasmids: cassettes utilizing CaMV sequences for expression of foreign genes in plants. J. Biotechnol. 14, 333-344 ,
  • Vignais PM, Dimon B, Zorin NA, Tomiyama M, Colbeau A (2000): Characterization of the hydrogen-deuterium exchange activities of the energy-transducing HupSL hydrogenase and H₂-signaling HupUV hydrogenase in Rhodobacter capsulatus. J. Bacteriol. 182(21): 5997–6004Vignais PM, Dimon B, Zorin NA, Tomiyama M, Colbeau A (2000): Characterization of the hydrogen-deuterium exchange activities of the energy-transducing HupSL hydrogenase and H₂ signaling HupUV hydrogenase in Rhodobacter capsulatus. J. Bacteriol. 182 (21): 5997-6004
  • Villaverde A, Carrio MM (2003): Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies. Biotechnol. Lett. 25: 1385–1395Villaverde A, Carrio MM (2003): Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies. Biotechnol. Lett. 25: 1385-1395
  • Wall JG, Plückthun A (1995): Effects of overexpressing folding modulators on the in vivo folding of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 6: 507–516Wall JG, Plückthun A (1995): Effects of overexpressing folding modulators on the in vivo folding of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 6: 507-516
  • Wang G, Angermüller S, Klipp W (1993): Characterization of Rhodobacter capsulatus genes encoding a molybdenum transport system and putative molybdenum-pterin-binding proteins. J. Bacteriol. 175(10): 3031–3042Wang G, Angermüller S, Klipp W (1993): Characterization of Rhodobacter capsulatus genes encoding a molybdenum transport system and putative molybdenum-pterin-binding proteins. J. Bacteriol. 175 (10): 3031-3042
  • Wang, W. and Malcolm, B. A. 1999. Two-Stage PCR Protocol Allowing Introduction of Multiple Mutations, Deletions and Insertions Using QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis. BioTechniques 26(4): 680–682 . Wang, W. and Malcolm, BA 1999. Two-Stage PCR Protocol Allowing Introduction of Multiple Mutations, Deletions and Insertions Using QuikChange ™ Site-Directed Mutagenesis. BioTechniques 26 (4): 680-682 ,
  • Weaver PF, Wall JD, Gest H (1975): Characterization of Rhodopseudomonas capsulate. Arch. Microbiol. 105: 207–216Weaver PF, Wall JD, Gest H (1975): Characterization of Rhodopseudomonas capsulate. Arch. Microbiol. 105: 207-216
  • Weickert MJ, Doherty DH, Best EA, Olins PO (1996): Optimization of heterologous protein production in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 7: 494–499Weickert MJ, Doherty DH, Best EA, Olins PO (1996): Optimization of heterologous protein production in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 7: 494-499
  • Wenzel S, Müller R (2005): Recent developments towards the heterologous expression of complex bacterial natural product biosynthetic pathways. Curr. Opin. Biotechnol. 16: 594–606Wenzel S, Müller R (2005): Recent developments towards the heterologous expression of complex bacterial natural product biosynthetic pathways. Curr. Opin. Biotechnol. 16: 594-606
  • Wycuff DR, Matthews KS (2000): Generation of an araC-araBAD promoter-regulated T7-expression system. Anal. Biochem. 277: 67–73Wycuff DR, Matthews KS (2000): Generation of araC-araBAD promoter-regulated T7-expression system. Anal. Biochem. 277: 67-73
  • Yasukawa T, Kanei-Ishii C, Maekawa T, Fujimoto J, Yamamoto T, Ishii S (1995): Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin. J. Biol. Chem. 270(43): 25328–25331Yasukawa T, Kanei-Ishii C, Maekawa T, Fujimoto J, Yamamoto T, Ishii S (1995): Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin. J. Biol. Chem. 270 (43): 25328-25331
  • Zahn K (1996): Overexpression of an mRNA dependent on rare codons inhibits protein synthesis and cell growth. J. Bacteriol. 178(10): 2926–2933Zahn K (1996): overexpression of mRNA dependent on rare codons inhibits protein synthesis and cell growth. J. Bacteriol. 178 (10): 2926-2933
  • Zannoni D (1995): Aerobic and anaerobic electron transport chains in anoxygenic phototrophic bacteria. In: Robert E. Blankenship, Michael T. Madigan, Carl E. Bauer (Ed.) – Advances in Photosynthesis – Anoxygenic Photosynthetic Bacteria (Kluwer Academic Publishers)Zannoni D (1995): Aerobic and anaerobic electron transport chains in anoxygenic phototrophic bacteria. In: Robert E. Blankenship, Michael T. Madigan, Carl E. Bauer (Ed.) - Advances in Photosynthesis - Anoxygenic Photosynthetic Bacteria (Kluwer Academic Publishers)

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Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

  • - Alldread et al., 1992 [0006] Alldread et al., 1992 [0006]
  • - Hannig & Makrides, 1998 [0007] - Hannig & Makrides, 1998 [0007]
  • - Jana & Deb, 2005 [0007] - Jana & Deb, 2005 [0007]
  • - Sorensen & Mortensen, 2005 [0007] - Sorensen & Mortensen, 2005 [0007]
  • - Gutman & Hatfield, 1989 [0008] - Gutman & Hatfield, 1989 [0008]
  • - Carbone et al., 2003 [0008] Carbone et al., 2003 [0008]
  • - Saier, 1995; Makrides, 1996 [0008] - Saier, 1995; Makrides, 1996 [0008]
  • - Santos et al., 2004 [0008] Santos et al., 2004 [0008]
  • - Smith, 1996 [0009] Smith, 1996 [0009]
  • - Gustafsson et al., 2004 [0009] Gustafsson et al., 2004 [0009]
  • - Zahn, 1996 [0009] - Tooth, 1996 [0009]
  • - McNulty et al., 2003 [0009] McNulty et al., 2003 [0009]
  • - Kane et al., 1992 [0009] Kane et al., 1992 [0009]
  • - Calderone et al., 1996 [0009] Calderone et al., 1996 [0009]
  • - Forman et al., 1998 [0009] Forman et al., 1998 [0009]
  • - McNulty et al., 2003 [0009] McNulty et al., 2003 [0009]
  • - Doherty et al., 1993 [0010] Doherty et al., 1993 [0010]
  • - Andersson et al., 1996 [0011] Andersson et al., 1996 [0011]
  • - Dong et al., 1995 [0011] Dong et al., 1995 [0011]
  • - Corchero & Villaverde, 1998 [0011] - Corchero & Villaverde, 1998 [0011]
  • - Glick, 1995 [0011] - Glick, 1995 [0011]
  • - Glick, 1995 [0011] - Glick, 1995 [0011]
  • - Hoffmann & Rinas, 2001 [0011] - Hoffmann & Rinas, 2001 [0011]
  • - Rinas, 1996 [0012] - Rinas, 1996 [0012]
  • - Gill et al., 2000 [0012] Gill et al., 2000 [0012]
  • - Lesley et al., 2002 [0012] - Lesley et al., 2002 [0012]
  • - Harcum & Bentley, 1999 [0012] - Harcum & Bentley, 1999 [0012]
  • - Ramírez & Bentley, 1999 [0012] - Ramírez & Bentley, 1999 [0012]
  • - Baneyx & Mujacic, 2004 [0013] - Baneyx & Mujacic, 2004 [0013]
  • - Schlieker et al., 2002 [0013] - Schlieker et al., 2002 [0013]
  • - Goff & Goldberg, 1985 [0013] - Goff & Goldberg, 1985 [0013]
  • - Makrides 1996 [0013] - Makrides 1996 [0013]
  • - Wall & Plückthun, 1995 [0013] - Wall & Plückthun, 1995 [0013]
  • - Baneyx & Mujacic, 2004 [0013] - Baneyx & Mujacic, 2004 [0013]
  • - Rinas & Bailey, 1993 [0014] - Rinas & Bailey, 1993 [0014]
  • - Villaverde & Carrió, 2003 [0014] - Villaverde & Carrió, 2003 [0014]
  • - Strandberg & Enfors, 1991 [0014] - Strandberg & Enfors, 1991 [0014]
  • - Murby et al., 1995 [0014] - Murby et al., 1995 [0014]
  • - Opekarová & Tanner, 2003 [0015] - Opekarová & Tanner, 2003 [0015]
  • - Wenzel & Müller, 2005 [0015] - Wenzel & Müller, 2005 [0015]
  • - Forman et al., 1998 [0018] - Forman et al., 1998 [0018]
  • - McNulty et al., 2003 [0018] McNulty et al., 2003 [0018]
  • - Sorensen et al., 2003 [0018] Sorensen et al., 2003 [0018]
  • - Calderone et al., 1996 [0019] Calderone et al., 1996 [0019]
  • - Deng, 1997 [0019] - Deng, 1997 [0019]
  • - Chang et al., 2006 [0019] - Chang et al., 2006 [0019]
  • - Pan et al., 1999 [0019] - Pan et al., 1999 [0019]
  • - Feng et al., 2000 [0019] Feng et al., 2000 [0019]
  • - Patterson et al., 2005 [0019] - Patterson et al., 2005 [0019]
  • - Studier, 1991 [0020] - Study, 1991 [0020]
  • - Rossi & Blau, 1998 [0020] - Rossi & Blue, 1998 [0020]
  • - Wycuff & Matthews, 2000 [0020] - Wycuff & Matthews, 2000 [0020]
  • - Jonasson et al., 2002 [0020] - Jonasson et al., 2002 [0020]
  • - Hockney, 1994 [0020] - Hockney, 1994 [0020]
  • - Gumpert & Hoischen, 1998 [0020] - Gumpert & Hoischen, 1998 [0020]
  • - Jana & Deb, 2005 [0020] - Jana & Deb, 2005 [0020]
  • - Baneyx & Mujacic, 2004 [0020] - Baneyx & Mujacic, 2004 [0020]
  • - Wall & Plückthun, 1995 [0021] - Wall & Plückthun, 1995 [0021]
  • - Schlieker et al., 2002 [0021] - Schlieker et al., 2002 [0021]
  • - Baneyx & Mujacic, 2004 [0021] - Baneyx & Mujacic, 2004 [0021]
  • - Nishihara et al., 1998 [0021] Nishihara et al., 1998 [0021]
  • - Amrein et al., 1995 [0021] Amrein et al., 1995 [0021]
  • - Yasukawa et al., 1995 [0021] Yasukawa et al., 1995 [0021]
  • - Nishihara et al., 1998 [0021] Nishihara et al., 1998 [0021]
  • - Arie et al., 2001 [0021] Arie et al., 2001 [0021]
  • - Georgiou & Valax, 1996 [0021] - Georgiou & Valax, 1996 [0021]
  • - Nishihara et al., 1998 [0022] Nishihara et al., 1998 [0022]
  • - Chen et al., 2004 [0022] - Chen et al., 2004 [0022]
  • - Sorensen et al., 2005 [0022] Sorensen et al., 2005 [0022]
  • - Martinez et al., 1995 [0022] - Martinez et al., 1995 [0022]
  • - Corchero et al., 1996 [0022] Corchero et al., 1996 [0022]
  • - Skosyrev et al., 2003 [0022] - Skosyrev et al., 2003 [0022]
  • - LeThanh et al., 2005 [0022] - LeThanh et al., 2005 [0022]
  • - Weickert et al., 1996 [0023] - Weickert et al., 1996 [0023]
  • - Weaver et al., 1975 [0027] Weaver et al., 1975 [0027]
  • - Zannoni, 1995 [0028] - Zannoni, 1995 [0028]
  • - Gregor & Klug, 1999 [0028] - Gregor & Klug, 1999 [0028]
  • - Bauer et al., 2003 [0028] - Bauer et al., 2003 [0028]
  • - Masepohl et al., 2002 [0029] Masepohl et al., 2002 [0029]
  • - Drepper et al., 2003 [0029] Drepper et al., 2003 [0029]
  • - Vignais et al., 2000 [0029] - Vignais et al., 2000 [0029]
  • - Tabita, 1995 [0029] - Tabita, 1995 [0029]
  • - Haselkorn et al., 2001 [0030] - Haselkorn et al., 2001 [0030]
  • - Fuller, 1982 [0032] Fuller, 1982 [0032]
  • - de Boer et al., 1983 [0032] - de Boer et al., 1983 [0032]
  • - Guzman et al., 1995 [0032] Guzman et al., 1995 [0032]
  • - Newman & Fuqua, 1999 [0032] - Newman & Fuqua, 1999 [0032]
  • - Pollock et al., 1988 [0033] Pollock et al., 1988 [0033]
  • - Duport et al. 1994 [0033] Duport et al. 1994 [0033]
  • - Kappler & McEwan 2002 [0033] - Kappler & McEwan 2002 [0033]
  • - Tabor & Richardson, 1985 [0034] - Tabor & Richardson, 1985 [0034]
  • - Studier & Moffatt, 1986 [0034] - Studier & Moffatt, 1986 [0034]
  • - Kochetkov et al., 1998 [0034] Kochetkov et al., 1998 [0034]
  • - Kochetkov et al., 1998 [0034] Kochetkov et al., 1998 [0034]
  • - Studier & Moffatt, 1986 [0035] - Studier & Moffatt, 1986 [0035]
  • - Rosenberg et al., 1987 [0035] Rosenberg et al., 1987 [0035]
  • - Studier & Moffatt, 1986 [0036] - Studier & Moffatt, 1986 [0036]
  • - Brunschwig & Darzins, 1992 [0036] - Brunschwig & Darzins, 1992 [0036]
  • - Herrero et al., 1993 [0036] - Herrero et al., 1993 [0036]
  • - McKinney et al., 2002 [0036] McKinney et al., 2002 [0036]
  • - Santiago-Machuca et al., 2002 [0036] - Santiago-Machuca et al., 2002 [0036]
  • - Barnard et al., 2004 [0036] Barnard et al., 2004 [0036]
  • - Blattner et al., 1997 [0045] Blattner et al., 1997 [0045]
  • - Lang et al. 1996 [0048] Lang et al. 1996 [0048]
  • - de Smet et al., 2001a [0048] - de Smet et al., 2001a [0048]
  • - Smart et al., 2004 [0048] - Smart et al., 2004 [0048]
  • - Wang et al., 1993 [0048] Wang et al., 1993 [0048]
  • - Solomon et al., 1999 [0048] Solomon et al., 1999 [0048]
  • - Jeong & Jouanneau, 2000 [0048] - Jeong & Jouanneau, 2000 [0048]
  • - Chevallet et al., 2003 [0048] Chevallet et al., 2003 [0048]
  • - Kappler & McEwan, 2002 [0048] - Kappler & McEwan, 2002 [0048]
  • - de Smet et al., 2001b [0048] - de Smet et al., 2001b [0048]
  • - Schmidt & Skerra 2007 [0088] - Schmidt & Skerra 2007 [0088]
  • - Lichty et al. 2005 [0088] - Lichty et al. 2005 [0088]
  • - Rosenau und Jaeger, 2004 [0091] - Rosenau and Jaeger, 2004 [0091]
  • - Kovach et al. 1994 [0091] - Kovach et al. 1994 [0091]
  • - Alexeyev et al. 1995 [0092] Alexeyev et al. 1995 [0092]
  • - Prentki & Krisch, 1984 [0092] - Prentki & Krisch, 1984 [0092]
  • - Schmidt und Skerra 2007 [0093] - Schmidt and Skerra 2007 [0093]
  • - Wang & Malcom, 1999 [0094] - Wang & Malcom, 1999 [0094]
  • - Duport er al. 1994 [0097] - Duport he al. 1994 [0097]
  • - Marsh et al. 1984 [0098] - Marsh et al. 1984 [0098]
  • - Duport et al. 1994 [0098] Duport et al. 1994 [0098]
  • - Simon et al. 1983 [0098] Simon et al. 1983 [0098]
  • - Dunn et al. 1981 [0104] - Dunn et al. 1981 [0104]
  • - Drepper et al., 2007 [0110] Drepper et al., 2007 [0110]
  • - Timmermans et al., 1990 [0112] Timmermans et al., 1990 [0112]
  • - Dyczmons, N. G., 2006 [0115] - Dyczmons, NG, 2006 [0115]
  • - Drepper et al. 2007 [0120] Drepper et al. 2007 [0120]

Claims (25)

Verfahren zur Expression heterologer Gene, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Herstellen mindestens eines Expressionsvektors; – Klonieren mindestens eines heterologen Zielgens in den Expressionsvektor; – Herstellen eines Rhodobacter capsulatus Expressionsstamms; – Einbringen des rekombinanten Expressionsvektors in die Zellen des Expressionsstamms; und – Expression des heterologen Zielgens in den Zellen des Expressionsstamms.A method for the expression of heterologous genes, wherein the method comprises the following steps: - Produce at least one expression vector; - Clone at least a heterologous target gene in the expression vector; - Produce a Rhodobacter capsulatus expression strain; - bring in the recombinant expression vector into the cells of the expression strain; and - Expression of the heterologous target gene in the cells of the expression strain. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor pBBR22b zur Herstellung des Expressionsvektors modifiziert wird.Method according to claim 1, characterized in that the vector modifies pBBR22b to produce the expression vector becomes. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor pBBR22b durch Deletion des lacI-Gens modifiziert wird.Method according to claim 2, characterized in that the vector modifies pBBR22b by deletion of the lacI gene becomes. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor pBBR22b durch Insertion des aphII-Gens des Tn5-Transposons, das unter der Kontrolle des Km-Promotors steht, modifiziert wird.Method according to claim 2 or 3, characterized that the vector pBBR22b by insertion of the aphII gene of the Tn5 transposon, which is under the control of the Km promoter is modified. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Zielgen in Leserichtung eines T7-Promotors in den Expressionsvektor kloniert wird.Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the heterologous target gene in reading direction a T7 promoter is cloned into the expression vector. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Zielgen in Leserichtung des Km-Promotors des aphII-Gens in den Expressionsvektor kloniert wird.Method according to claim 4 or 5, characterized that the heterologous target gene in the reading direction of the Km promoter of aphII gene is cloned into the expression vector. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Zielgen entgegengesetzt der Leserichtung des Km-Promotors des aphII-Gens in den Expressionsvektor kloniert wird.Method according to claim 4 or 5, characterized that the heterologous target gene is opposite to the reading direction of the Km promoter of the aphII gene is cloned into the expression vector. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsstamm durch Integration eines T7-RNA-Polymerasegens, das unter der Kontrolle des Rhodobacter-spezifischen Promotors Pfru steht, in das recA-Gen von Rhodobacter capsulatus hergestellt wird.Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that the expression strain is prepared by integration of a T7 RNA polymerase gene, which is under the control of the Rhodobacter-specific promoter P fru , in the recA gene of Rhodobacter capsulatus. Expressionsstamm umfassend Zellen des Bakteriums Rhodobacter capsulatus, welche durch Integration eines T7-RNA-Polymerasegens, das unter der Kontrolle des Rhodobacter-spezifischen Promotors Pfru steht, in das recA-Gen des Rhodobacter capsulatus – Chromosoms modifiziert sind.Expression strain comprising cells of the bacterium Rhodobacter capsulatus, which are modified by integration of a T7 RNA polymerase gene, which is under the control of the Rhodobacter-specific promoter P fru , into the recA gene of the Rhodobacter capsulatus chromosome. Vektor zur heterologen Expression von Genen, basierend auf dem Plasmid pBBR22b, wobei der Vektor sich von pBBR22b durch eine oder mehrere der folgenden Modifikationen unterscheidet: – Deletion des lacI-Gens; – Insertion des aphII-Gens des Tn5-Transposons, das unter der Kontrolle des Km-Promotors steht; – Polylinker stromabwärts eines T7-Promotors; und/oder – Polylinker stromabwärts oder stromaufwärts des Km-Promotors des aphII-Gens.Vector for the heterologous expression of genes based on the plasmid pBBR22b, the vector being different from pBBR22b one or more of the following modifications distinguishes: - Deletion the lacI gene; Insertion of the aphII gene of the Tn5 transposon, which is under the control of the Km promoter; - polylinker downstream of a T7 promoter; and or - polylinker downstream or upstream of the Km promoter of the aphII gene. Vektor nach Anspruch 10, mit mindestens einem heterologen Zielgen stromabwärts eines T7-Promotors und/oder eines Km-Promotors eines aphII-Gens.Vector according to claim 10, having at least one heterologous Target gene downstream of a T7 promoter and / or a Km promoter of an aphII gene. Vektor nach Anspruch 10 oder 11, welcher ein Chloramphenicol-Resistenzgen umfasst.A vector according to claim 10 or 11 which is a chloramphenicol resistance gene includes. Vektor nach Anspruch 10 oder 11, welcher ein Spectinomycin-Resistenzgen umfasst.A vector according to claim 10 or 11 which is a spectinomycin resistance gene includes. Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 13, welcher ein His6-Affinitätstag umfasst.A vector according to any one of claims 10 to 13 which comprises a His 6 affinity tag. Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 13, welcher ein StrepII-Affinitätstag umfasst.Vector according to one of claims 10 to 13, which comprises a StrepII affinity tag. Vektor nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Zielgen für ein fluoreszierendes Protein kodiert.Vector according to one of claims 11 to 15, characterized in that the heterologous target gene for a encodes fluorescent protein. Vektor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das fluoreszierende Protein ein Flavin-Mononukleotid-(FMN-)basiertes Protein (FbFP) ist.Vector according to claim 16, characterized in that that the fluorescent protein is a flavin mononucleotide (FMN) based Protein (FbFP) is. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das mindestens eine Nukleotidsequenz zur Synthese mindestens eines Polypeptids umfasst, wobei die Nukleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleotidsequenz, welche den Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 17 umfasst; b) Nukleotidsequenz, welche den Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 17 und mindestens ein heterologes Zielgen umfasst; c) Nukleotidsequenz, welche eine oder mehrere der Sequenzen gemäß SEQ ID NR: 1 bis 8, 10, 11 und 13 bis 18 umfasst; d) Nukleotidsequenz, welche sich von der Nukleotidsequenz gemäß a), b) oder c) durch den Austausch zumindest eines Codons gegen ein synonymes Codon unterscheidet; e) Nukleotidsequenz, deren komplementärer Strang mit den Nukleotidsequenzen gemäß a), b) oder c) hybridisiert; f) Nukleotidsequenz, welche zu mindestens 85%, vorzugsweise 90%, insbesondere 95%, mit der Nukleotidsequenz gemäß a), b) oder c) identisch ist; g) Nukleotidsequenz, welche dem komplementären Strang der Nukleotidsequenzen gemäß a) bis f) entspricht.Recombinant nucleic acid molecule which minimizes at least one nucleotide sequence for synthesis at least one polypeptide, wherein the nucleotide sequence is selected from the group consisting of: a) nucleotide sequence comprising the vector according to any one of claims 10 to 17; b) a nucleotide sequence comprising the vector of any one of claims 10 to 17 and at least one heterologous target gene; c) nucleotide sequence which comprises one or more of the sequences according to SEQ ID NO: 1 to 8, 10, 11 and 13 to 18; d) nucleotide sequence which differs from the nucleotide sequence according to a), b) or c) by the exchange of at least one codon for a synonymous codon; e) nucleotide sequence whose complementary strand hybridizes with the nucleotide sequences according to a), b) or c); f) nucleotide sequence which is identical to at least 85%, preferably 90%, in particular 95%, with the nucleotide sequence according to a), b) or c); g) nucleotide sequence which corresponds to the complementary strand of the nucleotide sequences according to a) to f). Kit für die heterologe Expression mindestens eines Gens, welcher mindestens einen Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 17 umfasst.Kit for heterologous expression at least of a gene containing at least one vector according to one of the claims 10 to 17. Kit nach Anspruch 19, welcher zusätzlich den Expressionsstamm nach Anspruch 9 umfasst.Kit according to claim 19, which additionally the expression strain according to claim 9. Zelle, welche mindestens einen Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 17 und/oder das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 18 enthält.Cell which has at least one vector after one of claims 10 to 17 and / or the nucleic acid molecule according to claim 18. Zellkultur, welche Zellen nach Anspruch 21 und/oder Zellen des Expressionsstamms nach Anspruch 9 umfasst.Cell culture, which cells according to claim 21 and / or Cells of the expression strain according to claim 9. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, des Expressionsstamms nach Anspruch 9, des Vektors nach einem der Ansprüche 10 bis 17, des Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 18, des Kits nach Anspruch 19 oder 20, der Zelle nach Anspruch 21 und/oder der Zellkultur nach Anspruch 22 zur Fluoreszenzmarkierung von Zellen.Use of the method according to one of the claims 1 to 8, of the expression strain according to claim 9, of the vector according to any one of claims 10 to 17, the nucleic acid molecule according to claim 18, of the kit according to claim 19 or 20, of the cell according to Claim 21 and / or the cell culture according to claim 22 for fluorescence labeling of cells. Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Gramnegative Bakterien sind.Use according to claim 23, characterized that the cells are Gram-negative bacteria. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, des Expressionsstamms nach Anspruch 9, des Vektors nach einem der Ansprüche 10 bis 17, des Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 18, des Kits nach Anspruch 19 oder 20, der Zelle nach Anspruch 21 und/oder der Zellkultur nach Anspruch 22 zur Überexpression des Zielgens unter aeroben oder anaeroben Bedingungen.Use of the method according to one of the claims 1 to 8, of the expression strain according to claim 9, of the vector according to any one of claims 10 to 17, the nucleic acid molecule according to claim 18, of the kit according to claim 19 or 20, of the cell according to Claim 21 and / or the cell culture according to claim 22 for overexpression of the target gene under aerobic or anaerobic conditions.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102010036997A1 (en) * 2010-08-16 2012-07-26 Evocatal Gmbh LOV domains Protein for photosensitive defunctionalization

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070059768A1 (en) * 2005-08-15 2007-03-15 Ryan Gill Broad host range vectors for shotgun and expression library cloning in Gram negative bacteria
DE102005048828A1 (en) * 2005-10-12 2007-04-19 Forschungszentrum Jülich GmbH New light, oxygen, voltage domains, and proteins containing them, useful as fluorescent markers, e.g. in gene therapy, cloning and cell sorting, are altered to prevent covalent bonding to flavine mononucleotide
US20070212782A1 (en) * 2003-03-14 2007-09-13 Brookhaven Science Associates, Llc High Density Growth of T7 Expression Strains with Auto-Induction Option

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070212782A1 (en) * 2003-03-14 2007-09-13 Brookhaven Science Associates, Llc High Density Growth of T7 Expression Strains with Auto-Induction Option
US20070059768A1 (en) * 2005-08-15 2007-03-15 Ryan Gill Broad host range vectors for shotgun and expression library cloning in Gram negative bacteria
DE102005048828A1 (en) * 2005-10-12 2007-04-19 Forschungszentrum Jülich GmbH New light, oxygen, voltage domains, and proteins containing them, useful as fluorescent markers, e.g. in gene therapy, cloning and cell sorting, are altered to prevent covalent bonding to flavine mononucleotide

Non-Patent Citations (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Adams, Th.: Funktionelle Charakteresierung potentieller Pathogenitätsfaktoren aus Pseudomonas aeruginosa mittels biochemischer und evolutiver Methoden. Dissertation, Georg-August Universität Göttingen, 2004, S.24-25 *
Alldread et al., 1992
Amrein et al., 1995
Andersson et al., 1996
Arie et al., 2001
Baneyx & Mujacic, 2004
Bauer et al., 2003
Brunschwig & Darzins, 1992
Calderone et al., 1996
Carbone et al., 2003
Chang et al., 2006
Chen et al., 2004
Corchero & Villaverde, 1998
Corchero et al., 1996
de Boer et al., 1983
Deng, 1997
Doherty et al., 1993
Dong et al., 1995
Drepper et al., 2003
Drepper, T. (u.a.): High-level transcription of large gene regions: a novel T7 RNA-polymerase-based system for expression of functional hydrogenases in the phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus. In: Biochem. Soc. Trans., 2005, Vol. 33, S. 56-58 *
Drepper, T. (u.a.): High-level transcription of large gene regions: a novel T7 RNA-polymerase-based system for expression of functional hydrogenases in the phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus. In: Biochem. Soc. Trans., 2005, Vol. 33, S. 56-58 Elsen, S. (u.a.): Interaction between the H2 sensor HupUV and histidine kunase HupT controls HupSL hydrogenase synthesis in Rhodobacter capsulator. In: J. Bacteriol., 2003, Vol. 185, S. 7111-7119 Adams, Th.: Funktionelle Charakteresierung potentieller Pathogenitätsfaktoren aus Pseudomonas aeruginosa mittels biochemischer und evolutiver Methoden. Dissertation, Georg-August Universität Göttingen, 2004, S.24-25
Duport et al. 1994
Elsen, S. (u.a.): Interaction between the H2 sensor HupUV and histidine kunase HupT controls HupSL hydrogenase synthesis in Rhodobacter capsulator. In: J. Bacteriol., 2003, Vol. 185, S. 7111-7119 *
Feng et al., 2000
Forman et al., 1998
Fuller, 1982
Georgiou & Valax, 1996
Gill et al., 2000
Glick, 1995
Goff & Goldberg, 1985
Gregor & Klug, 1999
Gumpert & Hoischen, 1998
Gustafsson et al., 2004
Gutman & Hatfield, 1989
Guzman et al., 1995
Hannig & Makrides, 1998
Harcum & Bentley, 1999
Haselkorn et al., 2001
Herrero et al., 1993
Hockney, 1994
Hoffmann & Rinas, 2001
Jana & Deb, 2005
Jonasson et al., 2002
Kane et al., 1992
Kappler & McEwan 2002
Kochetkov et al., 1998
Lesley et al., 2002
LeThanh et al., 2005
Makrides 1996
Martinez et al., 1995
Masepohl et al., 2002
McNulty et al., 2003
Murby et al., 1995
Newman & Fuqua, 1999
Nishihara et al., 1998
Opekarová & Tanner, 2003
Pan et al., 1999
Patterson et al., 2005
Pollock et al., 1988
Ramírez & Bentley, 1999
Rinas & Bailey, 1993
Rinas, 1996
Rosenberg et al., 1987
Rossi & Blau, 1998
Saier, 1995; Makrides, 1996
Santos et al., 2004
Schlieker et al., 2002
Skosyrev et al., 2003
Smith, 1996
Sorensen & Mortensen, 2005
Sorensen et al., 2003
Sorensen et al., 2005
Strandberg & Enfors, 1991
Studier & Moffatt, 1986
Studier, 1991
Tabita, 1995
Tabor & Richardson, 1985
Vignais et al., 2000
Villaverde & Carrió, 2003
Wall & Plückthun, 1995
Weaver et al., 1975
Weickert et al., 1996
Wenzel & Müller, 2005
Wycuff & Matthews, 2000
Yasukawa et al., 1995
Zahn, 1996
Zannoni, 1995

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102010036997A1 (en) * 2010-08-16 2012-07-26 Evocatal Gmbh LOV domains Protein for photosensitive defunctionalization
DE102010036997A8 (en) * 2010-08-16 2012-09-27 Evocatal Gmbh LOV domains Protein for photosensitive defunctionalization

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Ramos et al. Cloning and expression of the inorganic pyrophosphatase gene from the amino acid producer Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869

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