DE102008004253B4 - Increased production of acetyl coenzyme A - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft eine rekombinante Hefezelle, die mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt enthält, welches ein Polypeptid kodiert, das eine Substrat-Produkt Umwandlung katalysiert, die aus den folgenden zwei Reaktion ausgewählt ist: Acetaldehyd + Coenzym A + NAD+ zu Acetyl-Coenzym A + NADH+H+ und/oder Pyruvat + Coenzym A zu Acetyl-Coenzym A + Formiat, wobei zumindest ein DNA-Molekül heterolog zu der besagten Hefezelle ist und wobei die besagte Hefezelle eine gesteigerter Acetyl-Coenzym A Produktion aufweist. Des Weiteren befasst sich die Erfindung mit einem Verfahren für eine gesteigerte Bildungsrate von Acetyl-CoA in einer Hefezelle.The present invention relates to a recombinant yeast cell which contains at least one nucleic acid construct which encodes a polypeptide which catalyzes a substrate-product conversion which is selected from the following two reactions: acetaldehyde + coenzyme A + NAD + to acetyl-coenzyme A + NADH + H + and / or pyruvate + coenzyme A to acetyl-coenzyme A + formate, with at least one DNA molecule being heterologous to said yeast cell and with said yeast cell having an increased acetyl-coenzyme A production. The invention also relates to a method for an increased rate of formation of acetyl-CoA in a yeast cell.
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Entwicklung enzymatischer Umgehungsreaktionen der Pyruvat-Dehydrogenase, um aus Pyruvat, Coenzym A und NAD+ die Moleküle Acetyl-Coenzym A, NADH+H+ und CO2 herzustellen, ohne dabei Energieäquivalente, wie z. B. in Form von ALP zu verbrauchen. Diese Umgehungsreaktion besteht entweder aus den Aktivitäten einer Pyruvat-Decarboxylase zusammen mit einer Coenzym A-abhängigen Aldehyd-Dehydrogenase oder aus den Aktivitäten einer Pyruvat-Formiat-Lyase zusammen mit einer Formiat-Dehydrogenase. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Expression einer oder beider dieser Umgehungsreaktionen im Cytoplasma von lebenden Zellen, dabei bevorzugt von eukaryontischen Zellen. Die Erfindung bezieht sich weiterhin insbesondere auf die Expression in eukaryotischen Zellen von Coenzym A-abhängigen Aldehyd-Dehydrogenasen, dabei bevorzugt Coenzym A-abhängige Acetaldehyd-Dehydrogenasen [auch Acetaldehyd: NAD+ Oxidoreduktase (CoA-acetylierend) oder Acetaldehyd Dehydrogenase (acetylierend) genannt] und/oder von Pyruvat-Formiat-Lyasen zusammen mit ihrem aktivierenden Enzym. Die Erfindung bezieht sich des Weiteren auf Wirtszellen, insbesondere modifizierte Hefe-Stämme, die die Gene für Coenzym A-abhängige Acetaldehyd-Dehydrogenasen zusammen mit solchen für Pyruvat-Decarboxylasen und/oder die die Gene für Pyruvat-Formiat-Lyasen zusammen mit ihrem aktivierenden Enzym und solchen für Formiat-Dehydrogenasen exprimieren und die Polypeptide bilden. Dabei können die Polypeptide entweder einzeln gebildet werden oder auch als Fusionspolypeptide zwischen Pyruvat-Decarboxlyase und Coenzym A-abhängiger Acetaldehyd-Dehydrogenase und/oder zwischen Pyruvat-Formiat-Lyase und Formiat-Dehydrogenase. Bei der Verwendung dieser modifizierten Hefezellen und Inkontaktbringen mit einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle wird die Acetyl-Coenzym A-Produktion im Cytoplasma der Zellen gesteigert. Dieses kann zu einer gesteigerten und effizienteren Produktion von Folgeprodukten führen, insbesondere Acetoacetyl-CoA, Mevalonat, Isoprenoiden, Crotonsäure, 1-Butanol, Sterolen, Malonyl-CoA, Fettsäuren, Lipiden, Alkanen, Malonat, Flavonoiden, Stilbenoiden, malonylierten Sekundärmetaboliten, und anderen Verbindungen, die sich aus den genannten ergeben oder von diesen ableiten lassen (
Acetyl-Coenzym A ist ein zentrales Molekül im Metabolismus fast aller Lebewesen. Es wird in deren Zellen in vielen biochemischen Reaktionen genutzt. Chemisch gesehen ist es ein Thioester zwischen Essigsäure (Acetat) und Coenzym A. Coenzym A (auch Coenzym A, kurz CoA oder CoASH) ist ein Coenzym, das zur „Aktivierung” von Alkansäuren und deren Derivaten dient und am Energiestoffwechsel beteiligt ist. Acetyl-Coenzym A (kurz Acetyl-CoA) ist ein „aktivierter” Essigsäurerest (CH3CO-). Dieser ist an die SH-Gruppe des Thioethanolamin-Anteils von Coenzym A gebunden.Acetyl coenzyme A is a key molecule in the metabolism of almost all living things. It is used in their cells in many biochemical reactions. Chemically, it is a thioester between acetic acid (acetate) and coenzyme A. Coenzyme A (also Coenzyme A, CoA short or CoASH) is a coenzyme, which is used for the "activation" of alkanoic acids and their derivatives and is involved in energy metabolism. Acetyl coenzyme A (acetyl-CoA for short) is an "activated" acetic acid residue (CH 3 CO-). This is bound to the SH group of the thioethanolamine portion of coenzyme A.
Acetyl-CoA ist ein zentraler Intermediärmetabolit, der zwischen katabole und anabole Prozesse geschaltet ist. Acetyl-CoA entsteht z. B. beim oxidativen Abbau von Fettsäuren, bestimmten Aminosäuren und Kohlenhydraten. Es dient als Vorstufe für die Biosynthese einer großen Vielzahl von Metaboliten und Biochemikalien. Da zelluläre Membranen undurchlässig für Acetyl-CoA sind, muss es in eukaryontischen Zellen entweder in jedem membranumgrenzten Kompartiment separat hergestellt oder über die Membranen hinweg transportiert werden: dazu zählen z. B. Mitochondrien, Plastiden, Peroxisomen und das Cytosol. In den eukaryontischen Mitochondrien und im Cytosol prokaryontischer Zellen wird Acetyl-CoA vor allen Dingen durch die Pyruvat-Dehydrogenase Reaktion aus Pyruvat und bei der Oxidation der Fettsäuren bereitgestellt und in den Zitronensäurezyklus eingeschleust.Acetyl-CoA is a central intermediate metabolite that is switched between catabolic and anabolic processes. Acetyl CoA arises z. As in the oxidative degradation of fatty acids, certain amino acids and carbohydrates. It serves as a precursor to the biosynthesis of a wide variety of metabolites and biochemicals. Since cellular membranes are impermeable to acetyl-CoA, it must be prepared separately in eukaryotic cells either in each membrane-bound compartment or transported across the membranes: these include e.g. Mitochondria, plastids, peroxisomes and the cytosol. In the eukaryotic mitochondria and in the cytosol of prokaryotic cells, acetyl-CoA is provided above all by the pyruvate dehydrogenase reaction from pyruvate and in the oxidation of the fatty acids and introduced into the citric acid cycle.
Im Cytosol kann Acetyl-CoA für die Synthese einer Vielzahl von Verbindungen benötigt werden: Acetoacetyl-CoA, Mevalonat, Isoprenoide, Sterole, Sesquiterpene, Polyprenole, Terpenoide, Malonyl-CoA, Flavonoide, Stilbenoide, Malonat, malonylierte Sekundärmetabolite, D-Aminosäuren, N-Malonyl-Aminocyclopropancarboxylsäure, Fettsäuren, Lipide, Öle, Wachse, Cystein, Glucosinolat, Xenobiotica, Pestizide, Biokunststoffe, Polyhydroxybutyrat, Aroma-aktive Ester aus einem Alkohol und einer Fettsäure, Butanol, Alkane, Butylacetat, und sämtliche anderen Verbindungen, die sich aus den genannten ableiten lassen. Dieses gilt nicht nur für in den Zellen vorkommende natürliche Prozesse, sondern ebenso für die Produktion einer Vielzahl von biobasierten Chemikalien und pharmazeutischen oder medizinischen Wirkstoffen durch rekombinante (transgene) Zellen und Organismen.In the cytosol, acetyl-CoA may be required for the synthesis of a variety of compounds: acetoacetyl-CoA, mevalonate, isoprenoids, sterols, sesquiterpenes, polyprenols, terpenoids, malonyl-CoA, flavonoids, stilbenoids, malonate, malonylated secondary metabolites, D-amino acids, N -Malonyl-aminocyclopropanecarboxylic acid, fatty acids, lipids, oils, waxes, cysteine, glucosinolate, xenobiotics, pesticides, bioplastics, polyhydroxybutyrate, aroma-active esters of an alcohol and a fatty acid, butanol, alkanes, butyl acetate, and all other compounds resulting from derive the said. This applies not only to natural processes occurring in the cells, but also to the production of a variety of bio-based chemicals and pharmaceutical or medicinal agents by recombinant (transgenic) cells and organisms.
Im Cytosol von eukaryotischen Zellen kann Acetyl-CoA nur durch wenige Reaktionen gebildet werden. Eine Möglichkeit ist die Synthese aus Citrat mittels der ATP-Citrat Lyase (z. B. in Vertebraten, Insekten und Pflanzen), eine andere Möglichkeit die Synthese aus Pyruvat mittels der Reaktionsabfolge aus Pyruvat Decarboxylase, Acetaldehyd Dehydrogenase und Acetyl-CoA Synthetase (in Hefen). Diese Reaktionen bzw. Reaktionsabfolgen benötigen Energie, die in der Regel in Form von ATP zur Verfügung gestellt wird. Das gebildete Acetyl-CoA kann dann z. B. durch die Acetyl-CoA Carboxylase carboxyliert werden und Malonyl-CoA bilden. Eine andere Möglichkeit ist die Kondensation zweier Moleküle Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA. Daneben gibt es noch eine Vielzahl weiterer Reaktionsmöglichkeiten. Die entstehenden Intermediate dienen als Ausgangsstoffe für die Synthese einer Vielzahl von Metaboliten, wie sie oben beschrieben sind.In the cytosol of eukaryotic cells, acetyl-CoA can be formed only by a few reactions. One possibility is the synthesis of citrate by means of ATP citrate lyase (eg in vertebrates, insects and plants), another possibility is the synthesis of pyruvate by means of the reaction sequence of pyruvate Decarboxylase, acetaldehyde dehydrogenase and acetyl-CoA synthetase (in yeasts). These reactions or reaction sequences require energy, which is usually provided in the form of ATP. The formed acetyl-CoA can then z. B. be carboxylated by the acetyl-CoA carboxylase and form malonyl-CoA. Another possibility is the condensation of two molecules acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA. In addition, there are a variety of other reaction options. The resulting intermediates serve as starting materials for the synthesis of a variety of metabolites, as described above.
Im Cytosol eukaryontischer Zellen wird Acetyl-CoA z. B. beim oxidativen Abbau von fermentierbaren Kohlenstoffquellen, insbesondere Kohlenhydrate, vor allen Dingen durch die Reaktionsabfolge aus Pyruvat Decarboxylase, Acetaldehyd Dehydrogenase und Acetyl-CoA Synthetase oder durch die ATP-Citrat Lyase gebildet. Diese beiden Reaktionen haben jedoch den Nachteil, dass sie Energie verbrauchen, die zumeist in Form von ATP-Hydrolyse bereitgestellt wird. Dieses kann sich negativ auf den Energiehaushalt der Zellen auswirken, was z. B. niedrigere Biomassebildung oder niedrigere Produktbildung bewirken kann. Dieses gilt vor allen Dingen unter anaeroben Bedingungen oder bei bestimmten Fermentationen. Viele prokaryotische Zellen können dieses Problem durch den Besitz einer Pyruvat-Dehydrogenase umgehen. Diese bildet aus Pyruvat, NAD+ und CoA die Produkte Acetyl-CoA und NADH+H+. In eukaryontischen Zellen ist diese Reaktion auf die Mitochondrien beschränkt. Das in den Mitochondrien gebildete NADH sowie auch das Acetyl-CoA können nun nicht einfach über die Mitochondrienmembran ins Cytosol diffundieren, sodass das durch die Pyruvat-Dehydrogenase gebildete NADH und Acetyl-CoA für cytosolische Reaktionen nicht einfach zur Verfügung steht.In the cytosol of eukaryotic cells, acetyl-CoA z. As in the oxidative degradation of fermentable carbon sources, especially carbohydrates, especially by the reaction sequence of pyruvate decarboxylase, acetaldehyde dehydrogenase and acetyl-CoA synthetase or formed by the ATP citrate lyase. However, these two reactions have the disadvantage that they consume energy, which is mostly provided in the form of ATP hydrolysis. This can have a negative effect on the energy balance of the cells, which z. B. lower biomass formation or lower product formation can cause. This is especially true under anaerobic conditions or in certain fermentations. Many prokaryotic cells can circumvent this problem by possessing a pyruvate dehydrogenase. This forms from pyruvate, NAD + and CoA the products acetyl-CoA and NADH + H + . In eukaryotic cells, this response is limited to the mitochondria. The NADH formed in the mitochondria as well as the acetyl-CoA can not simply diffuse into the cytosol via the mitochondrial membrane, so that the NADH and acetyl-CoA formed by the pyruvate dehydrogenase are not readily available for cytosolic reactions.
Die meisten oben genannten Folgeprodukte von Acetyl-CoA werden jedoch durch nicht-mitochondriale Reaktionsabfolgen gebildet.However, most of the above-mentioned derivatives of acetyl-CoA are formed by non-mitochondrial reaction sequences.
Die Bier-, Wein- und Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wird aufgrund ihrer Eigenschaft, Zucker zu Alkohol und Kohlendioxid zu fermentieren, schon seit Jahrhunderten für die Brot-, Wein- und Bierherstellung genutzt. In der Biotechnologie findet S. cerevisiae neben der Produktion von heterologen Proteinen vor allem in der Produktion von biobasierten Chemikalien wie z. B. Ethanol und Lactat oder pharmazeutisch-medizinischen Wirkstoffen wie z. B. Artemisinin Verwendung. Auch wurde kürzlich ein rekombinanter Hefestamm beschrieben, der offensichtlich 1-Butanol produzieren kann.The beer, wine and baker's yeast Saccharomyces cerevisiae has been used for centuries for bread, wine and beer production due to its ability to ferment sugar to alcohol and carbon dioxide. In biotechnology, S. cerevisiae is found in addition to the production of heterologous proteins, especially in the production of bio-based chemicals such. As ethanol and lactate or pharmaceutically-medicinal agents such. B. Artemisinin use. Also, recently, a recombinant yeast strain has been described that can apparently produce 1-butanol.
Die Synthese einer Vielzahl von biobasierten Chemikalien und Wirkstoffen geht von Acetyl-CoA aus und beginnt im Cytosol. S. cerevisiae ist aber nicht in der Lage, das Acetyl-CoA, das bei der Pyruvat-Dehydrogenase Reaktion entsteht über die Mitochondrienmembran ins Cytosol zu schleusen. S. cerevisiae besitzt auch keine ATP-Citrat Lyase. S. cerevisiae synthetisiert sein cytosolisches Acetyl-CoA aus Pyruvat mittels der Pyruvat-Decarboxylase, Acetaldehyd Dehydrogenase und Acetyl-CoA Synthetase Reaktionen. Dabei werden aber in der letzten Reaktion zwei Energieäquivalente in Form von ATP verbraucht. Das bedeutet aber, dass bei der Oxidation von 1 Molekül Glucose zu 2 Molekülen Acetyl-CoA insgesamt 2 Moleküle ATP aufgebracht werden müssen. Würde man hingegen eine energieunabhängige Umgehungsreaktion schaffen können, dann ergäbe sich ein Gewinn von 2 Molekülen ATP.The synthesis of a variety of bio-based chemicals and drugs is based on acetyl-CoA and begins in the cytosol. However, S. cerevisiae is not able to transport the acetyl-CoA, which is formed during the pyruvate dehydrogenase reaction, into the cytosol via the mitochondrial membrane. S. cerevisiae also has no ATP citrate lyase. S. cerevisiae synthesizes its cytosolic acetyl-CoA from pyruvate using pyruvate decarboxylase, acetaldehyde dehydrogenase and acetyl-CoA synthetase reactions. However, in the last reaction two energy equivalents in the form of ATP are consumed. However, this means that in the oxidation of 1 molecule of glucose to 2 molecules of acetyl-CoA a total of 2 molecules of ATP must be applied. If, on the other hand, one were able to create an energy-independent bypass reaction, then there would be a gain of 2 molecules of ATP.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Mittel und Wege zur Verfügung zu stellen, die die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile der Synthese von cytosolischem Acetyl-CoA in eukaryotischen Hefezellen, bevorzugt Saccharomyces Spezies, überwinden und zu einer gesteigerten und energieunabhängigen Bereitstellung von Acetyl-CoA im Cytosol führen.It is therefore an object of the present invention to provide means and methods which overcome the disadvantages known from the prior art for the synthesis of cytosolic acetyl-CoA in eukaryotic yeast cells, preferably Saccharomyces species, and for an increased and energy-independent supply of acetyl -CoA lead in the cytosol.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch zur Verfügung stellen von Nukleinsäuremolekülen, die jeweils für ein Polypeptid einer Coenzym A-abhängigen Acetaldehyd-Dehydrogenase oder einer Pyruvat-Formiat-Lyase kodieren. Im Falle der Pyruvat-Formiat-Lyase muss zusätzlich noch ein Nukleinsäuremolekül, welches für ein Polypeptid eines Pyruvat-Formiat-Lyase aktivierenden Enzyms kodiert, zur Verfügung gestellt werden.The object is achieved according to the invention by providing nucleic acid molecules which each encode a polypeptide of a coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase or a pyruvate formate lyase. In the case of pyruvate-formate lyase, it is additionally necessary to provide a nucleic acid molecule which codes for a polypeptide of a pyruvate-formate-lyase-activating enzyme.
Bei einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül handelt es sich um ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül. Des weiteren umfassen erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle dsDNA, ssDNA, PNA, CNA, RNA oder mRNA oder Kombinationen davon.A nucleic acid molecule according to the invention is a recombinant nucleic acid molecule. Furthermore, nucleic acid molecules according to the invention comprise dsDNA, ssDNA, PNA, CNA, RNA or mRNA or combinations thereof.
Bei der Fermentation von Kohlenstoffquellen, insbesondere Kohlenhydraten, entsteht durch das in der Hefezelle heterolog exprimierte Gen einer Coenzym A-abhängigen Acetaldehyd-Dehydrogenase oder einer Pyruvat-Formiat-Lyase (plus eines Pyruvat-Formiat-Lyase aktivierenden Enzyms) der Zwischenmetabolit Acetyl-CoA. Acetyl-CoA ist ein zentrales Stoffwechselintermediat der Hefezellen und kann in Hefezellen, und insbesondere in rekombinanten Hefezellen, zu einer Vielzahl von Produkten weiter umgesetzt werden.In the fermentation of carbon sources, in particular carbohydrates, produced by the heterologously expressed in the yeast cell gene of a coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase or a pyruvate formate lyase (plus a pyruvate formate lyase activating enzyme), the intermediate metabolite acetyl-CoA. Acetyl-CoA is a central metabolic intermediate of yeast cells and can be further converted into a variety of products in yeast cells, and especially in recombinant yeast cells.
Im Falle der heterolog exprimierten Coenzym A-abhängigen Acetaldehyd-Dehydrogenase muss dabei gleichzeitig eine Pyruvat Decarboxylase exprimiert werden, um aus Pyruvat, Coenzym A und NAD+ die Moleküle Acetyl-Coenzym A, NADH+H+ und CO2 zu bilden. Die Coenzym A-abhängigen Acetaldehyd-Dehydrogenase setzt dabei das von der Pyruvat Decarboxylase gebildete Acetaldehyd zusammen mit Coenzym A und NAD+ zu Acetyl-Coenzym A und NADH+H+ um. S. cerevisiae exprimiert unter diesen Bedingungen normalerweise eine eigene Pyruvat Decarboxylase (Pdc1). Um die gleichzeitige Bildung von Ethanol aus Acetaldehyd zu reduzieren oder zu vermeiden und um die Verfügbarkeit von Acetaldehyd für die Coenzym A-abhängigen Acetaldehyd-Dehydrogenase zu steigern, kann die Expression oder Aktivität der Alkohol Dehydrogenasen der Hefe reduziert oder ausgeschaltet werden. In the case of the heterologously expressed coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase, a pyruvate decarboxylase must be simultaneously expressed in order to form from pyruvate, coenzyme A and NAD + the molecules acetyl coenzyme A, NADH + H + and CO 2 . The coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase sets the acetaldehyde formed by the pyruvate decarboxylase together with coenzyme A and NAD + to acetyl coenzyme A and NADH + H +. S. cerevisiae normally expresses its own pyruvate decarboxylase (Pdc1) under these conditions. To reduce or avoid the concomitant formation of ethanol from acetaldehyde and to increase the availability of acetaldehyde for coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase, the expression or activity of yeast alcohol dehydrogenases can be reduced or eliminated.
Im Falle der heterologen Expression einer Pyruvat-Formiat-Lyase/Pyruvat-Formiat-Lyase aktivierendes Enzym, welche Pyruvat zusammen mit Coenzym A zu Acetyl-CoA und Formiat umsetzt, muss gleichzeitig die Expression oder Aktivität einer cytosolisch lokalisierten Formiat-Dehydrogenase gesteigert werden, um mittels NAD+ das gebildete Formiat zu CO2 und NADH+H+ umzusetzen. Diese Formiat-Dehydrogenase kann entweder ein eigenes Enzym der Hefe sein (Fdh1 oder Fdh2) oder aber auch heterolog exprimiert werden. Da FDH1 und FDH2 von S. cerevisiae jedoch nur schwach exprimiert werden, muss die Expression oder Aktivität z. B. durch die Verwendung eines unter den Fermentationsbedingungen starken Promoters erhöht werden. Dabei wird der natürliche Promoter eines oder beider Formiat Dehydrogenase Gene gegen einen starken Promotor (z. B. HXT7konst, PGK1, ADH1, ...) ausgetauscht. Ebenfalls kann es nützlich sein, die Expression oder Aktivität der Pyruvat Decarboxylasen der Hefe zu reduzieren oder auszuschalten, um die gleichzeitige Bildung von Ethanol zu reduzieren oder zu vermeiden und um die Verfügbarkeit von Pyruvat für die Pyruvat-Formiat-Lyase zu steigern.In the case of heterologous expression of a pyruvate-formate-lyase / pyruvate-formate lyase activating enzyme, which converts pyruvate together with coenzyme A to acetyl-CoA and formate, the expression or activity of a cytosolic localized formate dehydrogenase must be increased simultaneously NAD + to convert the formate formed to CO 2 and NADH + H + . This formate dehydrogenase can either be its own enzyme of yeast (Fdh1 or Fdh2) or heterologously expressed. Since FDH1 and FDH2 of S. cerevisiae, however, are only weakly expressed, the expression or activity z. B. be increased by the use of a strong promoter under the fermentation conditions. The natural promoter of one or both formate dehydrogenase genes is exchanged for a strong promoter (eg HXT7konst, PGK1, ADH1, etc.). Also, it may be useful to reduce or eliminate the expression or activity of the yeast pyruvate decarboxylases, to reduce or avoid the co-generation of ethanol, and to increase the availability of pyruvate for the pyruvate formate lyase.
Bei den Nukleinsäuresequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, die jeweils für ein Polypeptid einer Coenzym A-abhängigen Acetaldehyd-Dehydrogenase kodieren, handelt es sich bevorzugt um Gene aus Prokaryonten (z. B. aus Escherichia coli), nämlich z. B. mhpF, ein mutiertes Allel von adhE mit Coenzym A-abhängigen Acetaldehyd-Dehydrogenase Aktivität oder eine verkürzte Version des mutierten Allels von adhE, die nur die Coenzym A-abhängigen Acetaldehyd-Dehydrogenase Aktivität des bifunktionalen Enzyms kodiert. Dabei kann die jeweilige Nukleinsäuresequenz entweder eine Coenzym A-abhängige Acetaldehyd-Dehydrogenase kodieren oder sie wird als Nukleinsäuresequenzfusion mit einem Gen, das für ein Polypeptid mit Pyruvat-Decarboxylase Aktivität kodiert, wobei ein Polypeptid kodiert wird, welches beide Aktivitäten aufweist.The nucleic acid sequences of the nucleic acid molecules according to the invention, each of which encodes a polypeptide of a coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase, are preferably genes from prokaryotes (eg from Escherichia coli), namely e.g. , MhpF, a mutant allele of adhE with coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase activity or a truncated version of the mutant allele of adhE, which encodes only the coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase activity of the bifunctional enzyme. The particular nucleic acid sequence may either encode a coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase or it may be encoded as a nucleic acid sequence fusion with a gene encoding a polypeptide having pyruvate decarboxylase activity, encoding a polypeptide having both activities.
Das Dokument Ferrandez, A. et al.: Genetic characterization and expression in heterologous hosts of the 3-(3-hydroxyphenyl)propionate catabolic pathway of Escherichia coli K-12. (J. Bacteriol. (1997) 179 (8) 2573–81) beschreibt die Expression des mhp-Clusters, umfassend mhpF in Stämmen der Gattungen Salmonella, Rhizobium oder Pseudomonas. Hefestämme erwähnt dieses Dokument nicht.The document Ferrandez, A. et al .: Genetic characterization and expression in heterologous hosts of the 3- (3-hydroxyphenyl) propionate catabolic pathway of Escherichia coli K-12. (J. Bacteriol. (1997) 179 (8) 2573-81) describes the expression of the mhp cluster comprising mhpF in strains of the genera Salmonella, Rhizobium or Pseudomonas. Yeast strains does not mention this document.
Bei den Nukleinsäuresequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, die jeweils für ein Polypeptid einer Pyruvat-Formiat-Lyase und eines Pyruvat-Formiat-Lyase aktivierenden Enzyms kodieren, handelt es sich bevorzugt um Gene aus Prokaryonten oder anaeroben Chytridiomyceten oder Chlorophyten. Dabei kann die Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid einer Pyruvat-Formiat-Lyase kodiert, entweder dieses Polypeptid alleine kodieren oder sie wird als Nukleinsäuresequenzfusion mit einem Gen, das für ein Polypeptid mit Formiat-Dehydrogenase Aktivität kodiert, wobei ein Polypeptid kodiert wird, welches beide Aktivitäten aufweist.The nucleic acid sequences of the nucleic acid molecules according to the invention, each of which code for a polypeptide of a pyruvate formate lyase and a pyruvate formate lyase activating enzyme, are preferably genes from prokaryotes or anaerobic chytridiomycetes or chlorophytes. Herein, the nucleic acid sequence encoding a polypeptide of pyruvate formate lyase may either encode that polypeptide alone or it may be expressed as a nucleic acid sequence fusion with a gene encoding a polypeptide having formate dehydrogenase activity, encoding a polypeptide both Activities.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle umfassen bevorzugt Nukleinsäuresequenzen, die mit der natürlich vorkommenden Nukleinsäuresequenz identisch sind, einzelne Nukleotidsubstitutionen enthalten oder für eine Verwendung in einer Hefezelle Codon-optimiert sind.The nucleic acid molecules of the invention preferably comprise nucleic acid sequences that are identical to the naturally occurring nucleic acid sequence, contain single nucleotide substitutions, or are codon optimized for use in a yeast cell.
Jede Aminosäure wird auf Genebene durch ein Codon verschlüsselt. Jedoch gibt es mehrere verschiedene Codons, die für eine einzelne Aminosäure codieren. Der genetische Code ist folglich degeneriert. Die bevorzugte Codonwahl für eine entsprechende Aminosäure ist von Organismus zu Organismus verschieden. So kann es bei heterolog exprimierten Genen zu Problemen kommen, wenn der Wirtsorganismus bzw. die Wirtszelle einen sehr unterschiedlichen Codon-Gebrauch aufweist. Das Gen kann überhaupt nicht oder nur langsam exprimiert werden. Sogar in Genen von verschiedenen Stoffwechselwegen innerhalb eines Organismus ist ein unterschiedlicher Codon-Gebrauch festzustellen. Von den Glykolyse-Genen aus S. cerevisiae ist bekannt, dass sie stark exprimiert werden. Sie weisen einen stark restriktiven Codon-Gebrauch auf. Die Anpassung des Codon-Gebrauchs der Gene der Coenzym A-abhängigen Acetaldehyd-Dehydrogenase oder der Pyruvat-Formiat-Lyase an den Codon-Gebrauch von S. cerevisiae führt zu einer Verbesserung der Acetyl-CoA Bildungsrate in Hefe.Each amino acid is encoded at the gene level by a codon. However, there are several different codons that code for a single amino acid. The genetic code is therefore degenerate. The preferred codon choice for a corresponding amino acid differs from organism to organism. For example, heterologously expressed genes can have problems if the host organism or the host cell has very different codon usage. The gene can not be expressed at all or only slowly. Even in genes of different metabolic pathways within an organism, a different codon usage is noted. The glycolysis genes from S. cerevisiae are known to be highly expressed. They have a highly restrictive codon usage. The adaptation of the codon usage of the genes of coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase or the Pyruvate formate lyase on the codon usage of S. cerevisiae leads to an improvement of the acetyl-CoA formation rate in yeast.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch zur Verfügung stellen von Expressionskassetten, umfassend ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül. Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten umfassen weiterhin bevorzugt Promotor- und Terminatorsequenzen. Bevorzugterweise sind Promotorsequenzen ausgewählt aus HXT7, verkürzter HXT7, PFK1, FBA1, PGK1, ADH1, TDH3. Bevorzugterweise sind Terminatorsequenzen ausgewählt aus CYC1, FBA1, PGK1, PFK1, ADH1, TDH3.The object is further achieved according to the invention by providing expression cassettes comprising a nucleic acid molecule according to the invention. The expression cassettes according to the invention furthermore preferably comprise promoter and terminator sequences. Preferably, promoter sequences are selected from HXT7, truncated HXT7, PFK1, FBA1, PGK1, ADH1, TDH3. Preferably, terminator sequences are selected from CYC1, FBA1, PGK1, PFK1, ADH1, TDH3.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch zur Verfügung stellen von Expressionsvektoren, umfassend ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren umfassen weiterhin bevorzugt einen Selektionsmarker. Bevorzugterweise wird der Selektionsmarker ausgewählt aus einem Leucin-Marker, einem Uracil-Marker, den dominanten Antibiotika-Marker Geneticin, Hygromycin und Nourseothricin.The object is further achieved according to the invention by providing expression vectors comprising a nucleic acid molecule according to the invention or an expression cassette according to the invention. The expression vectors according to the invention furthermore preferably comprise a selection marker. Preferably, the selection marker is selected from a leucine marker, a uracil marker, the dominant antibiotic marker geneticin, hygromycin and nourseothricin.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch zur Verfügung stellen von Hefezellen, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, eine erfindungsgemäße Expressionskassette oder einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthalten.The object is further achieved according to the invention by providing yeast cells which contain a nucleic acid molecule according to the invention, an expression cassette according to the invention or an expression vector according to the invention.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, eine erfindungsgemäße Expressionskassette oder ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor in das Genom der Hefezelle stabil integriert.In a particularly preferred embodiment, a nucleic acid molecule according to the invention, an expression cassette according to the invention or an expression vector according to the invention is stably integrated into the genome of the yeast cell.
Eine erfindungsgemäße Hefezelle ist bevorzugt eine Pilzzelle und weiter bevorzugt eine Hefezelle, wie Saccharomyces species, Kluyveromyces sp., Hansenula sp., Pichia sp. oder Yarrowia sp..A yeast cell according to the invention is preferably a fungal cell and more preferably a yeast cell, such as Saccharomyces species, Kluyveromyces sp., Hansenula sp., Pichia sp. or Yarrowia sp ..
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch zur Verfügung stellen von Verfahren zur gesteigerten Bereitstellung von Acetyl-CoA im Cytosol der Hefezelle. Ein erfindungsgemäßes Verfahren umfaßt die Expression eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors in einer Hefezelle.The object is further achieved according to the invention by providing methods for the increased provision of acetyl-CoA in the cytosol of the yeast cell. A method according to the invention comprises the expression of a nucleic acid molecule according to the invention, an expression cassette according to the invention or an expression vector according to the invention in a yeast cell.
Dabei wird das Verfahren bevorzugt in einer erfindungsgemäßen Hefezelle durchgeführt.The process is preferably carried out in a yeast cell according to the invention.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors, einer erfindungsgemäßen Hefezelle mit gesteigerter Acetyl-CoA Produktionsrate.The object is further achieved according to the invention by the use of a nucleic acid molecule according to the invention, an expression cassette according to the invention, an expression vector according to the invention, a yeast cell according to the invention with an increased acetyl-CoA production rate.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors, einer erfindungsgemäßen Hefezelle zur rekombinanten Fermentation von Biomaterial.The object is further achieved according to the invention by the use of a nucleic acid molecule according to the invention, an expression cassette according to the invention, an expression vector according to the invention, a yeast cell according to the invention for the recombinant fermentation of biomaterial.
Durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors, einer erfindungsgemäßen Hefezelle wird die Bildungsrate von cytosolischem Acetyl-CoA gesteigert. Das Resultat ist eine schnellere, effizientere und gesteigerte Produktion von Acetyl-CoA im Cytoplasma der erfindungsgemäßen Hefezelle sowie gegebenenfalls eine gesteigerte Produktion von Folgeprodukten wie sie oben beschrieben wurden.By using a nucleic acid molecule according to the invention, an expression cassette according to the invention, an expression vector according to the invention, a yeast cell according to the invention, the rate of formation of cytosolic acetyl-CoA is increased. The result is a faster, more efficient and increased production of acetyl-CoA in the cytoplasm of the yeast cell according to the invention and optionally an increased production of secondary products as described above.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch zur Verfügung stellen eines Polypeptids, das eine in vitro und/oder in vivo Coenzym A-abhängige Acetaldehyd-Dehydrogenase Aktivität aufweist und/oder eines Polypeptids, das eine in vitro und/oder in vivo Pyruvat-Formiat-Lyase Aktivität aufweist.The object is further achieved according to the invention by providing a polypeptide having an in vitro and / or in vivo coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase activity and / or a polypeptide comprising an in vitro and / or in vivo pyruvate formate Having lyase activity.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch zur Verfügung stellen eines isolierten Nukleinsäuremoleküls, das für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert.The object is further achieved according to the invention by providing an isolated nucleic acid molecule which codes for a polypeptide according to the invention.
Des Weiteren wird die Aufgabe weiterhin erfindungsgemäß gelöst durch zur Verfügung stellen einer Hefezelle, die ein solches isoliertes Nukleinsäuremolekül enthält.Furthermore, the object is further achieved by providing a yeast cell containing such an isolated nucleic acid molecule.
Für bevorzugte Ausführungsformen des isolierten Nukleinsäuremoleküls und der Hefezellen wird hiermit Bezug genommen auf die oben aufgeführten Ausführungsformen.For preferred embodiments of the isolated nucleic acid molecule and the yeast cells, reference is hereby made to the embodiments listed above.
Das erfindungsgemäße Polypeptid, isolierte Nukleinsäuremolekül und die erfindungsgemäße Hefezelle werden bevorzugt verwendet zur Steigerung der Produktion von cytosolischem Acetyl-CoA. The polypeptide of the invention, isolated nucleic acid molecule and the yeast cell of the invention are preferably used to increase the production of cytosolic acetyl-CoA.
Das erfindungsgemäße Polypeptid, isolierte Nukleinsäuremolekül und die erfindungsgemäße Hefezelle werden bevorzugt verwendet zur Steigerung der Produktion von cytosolischem Acetyl-CoA und davon abstammenden Folgeprodukten in Hefezellen, wobei die Hefezellen auch eine oder mehrere zusätzliche Modifikationen, wie Nukleinsäuremoleküle enthalten.The polypeptide, isolated nucleic acid molecule and yeast cell according to the invention are preferably used for increasing the production of cytosolic acetyl-CoA and derived derivatives thereof in yeast cells, wherein the yeast cells also contain one or more additional modifications, such as nucleic acid molecules.
Bei einer solchen zusätzlichen Modifikation handelt es sich beispielsweise um eine Wirtszelle, die aufgrund der Zurverfügungstellung von heterologen Nukleinsäuremolekülen Butanol produziert, wie von den Erfindern in der (
Weiterhin handelt es sich bei einer solchen zusätzlichen Modifikation beispielsweise um eine Wirtszelle, die aufgrund der Zurverfügungstellung von heterologen Nukleinsäuremolekülen Isoprenoidverbindungen produziert, wie von den Erfindern in der (
Weiterhin handelt es sich bei einer solchen zusätzlichen Modifikation beispielsweise um eine Wirtszelle, die aufgrund der Zurverfügungstellung von heterologen Nukleinsäuremolekülen folgende Folgeprodukte produziert: Acetoacetyl-CoA, Mevalonat, Isoprenoide, Sterole, Sesquiterpene, Polyprenole, Terpenoide, Malonyl-CoA, Flavonoide, Stilbenoide, Malonat, malonylierte Sekundärmetabolite, D-Aminosäuren, N-Malonyl-Aminocyclopropancarboxylsäure, Fettsäuren, Lipide, Öle, Wachse, Cystein, Glucosinolat, Xenobiotica, Pestizide, Biokunststoffe, Polyhydroxybutyrat, Aroma-aktive Ester aus einem Alkohol und einer Fettsäure, Butanol, Alkane, Butylacetat, und sämtliche anderen Verbindungen, die sich aus den genannten ableiten lassen.Furthermore, such an additional modification is, for example, a host cell which produces the following secondary products because of the provision of heterologous nucleic acid molecules: acetoacetyl-CoA, mevalonate, isoprenoids, sterols, sesquiterpenes, polyprenols, terpenoids, malonyl-CoA, flavonoids, stilbenoids, malonate , malonylated secondary metabolites, D-amino acids, N-malonyl-aminocyclopropanecarboxylic acid, fatty acids, lipids, oils, waxes, cysteine, glucosinolate, xenobiotics, pesticides, bioplastics, polyhydroxybutyrate, flavor-active esters of an alcohol and a fatty acid, butanol, alkanes, butyl acetate , and all other connections, which can be derived from the above.
Das erfindungsgemäße Polypeptid, isolierte Nukleinsäuremolekül und die erfindungsgemäße Hefezelle werden bevorzugt verwendet zur Steigerung der Produktion von cytosolischem Acetyl-CoA und Folgeprodukten bei der Fermentation von Kohlenstoffquellen.The polypeptide of the invention, isolated nucleic acid molecule and the yeast cell of the invention are preferably used for increasing the production of cytosolic acetyl-CoA and secondary products in the fermentation of carbon sources.
Nutzungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Expressionskassetten, Expressionsvektoren und Hefezellen sind die Herstellung von hochwertigen Vorläufer-Produkten für weitere biochemische und chemische Synthesen.Uses of the nucleic acids according to the invention, expression cassettes, expression vectors and yeast cells are the production of high-quality precursor products for further biochemical and chemical syntheses.
Sobald diese Chemikalien aus Biomaterial durch Biokonversion (z. B. Fermentationen mit Hefen) hergestellt werden, ist es wichtig, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Expressionskassetten, Expressionsvektoren und Hefezellen zur Verfügung zu haben.Once these biomaterial chemicals are prepared by bioconversion (eg, fermentations with yeasts), it is important to have available the nucleic acids, expression cassettes, expression vectors, and yeast cells of the present invention.
Die Erfindung ermöglicht eine gesteigerte und energieunabhängige Bereitstellung von Acetyl-CoA im Cytosol eukaryotischer Hefezellen, insbesondere Saccharomyces Spezies. Da die Bereitstellung von Acetyl-CoA eine limitierende Reaktion bei der biotechnologischen Produktion einer Vielzahl von Folgeprodukten ist, ermöglicht die Erfindung auch die Steigerung der Produktion dieser Folgeprodukte, wie z. B. 1-Butanol, Crotonsäure, Mevalonat, Isoprenoide, Fettsäuren, Alkane, oder Flavonoide, insbesondere in Wirtszellen, die weitere entsprechende heterologe Nukleinsäuren enthalten. Dies gilt insbesondere bei Fermentationen von Biomaterial unter anaeroben oder microaeroben Bedingungen.The invention enables an increased and energy-independent provision of acetyl-CoA in the cytosol of eukaryotic yeast cells, in particular Saccharomyces species. Since the provision of acetyl-CoA is a limiting reaction in the biotechnological production of a variety of derived products, the invention also allows the increase in the production of these secondary products, such as. For example, 1-butanol, crotonic acid, mevalonate, isoprenoids, fatty acids, alkanes, or flavonoids, especially in host cells containing other corresponding heterologous nucleic acids. This applies in particular to fermentations of biomaterial under anaerobic or microaerobic conditions.
Methodenmethods
1. Stämme und Medien1. Tribes and media
– Bakterien- Bacteria
- – E. coli SURF (Stratagene)E. coli SURF (Stratagene)
- – E. coli DH5α (Stratagene)E. coli DH5α (Stratagene)
-
Vollmedium LB 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, pH 7,5 (siehe Maniatis, 1982).Complete
medium LB 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.5 (see Maniatis, 1982).
Für die Selektion auf eine plasmidkodierte Antibiotikaresistenz wurde dem Medium nach dem Autoklavieren 40 μg/ml Ampicillin zugesetzt. Feste Nährmedien enthielten zusätzlich 2% Agar. Die Anzucht erfolgte bei 37°C.For selection for plasmid-encoded antibiotic resistance, 40 μg / ml ampicillin was added to the medium after autoclaving. Solid nutrient media additionally contained 2% agar. The cultivation took place at 37 ° C.
– Hefe - Yeast
- Stämme aus der Serie CEN.PK, IndustriehefenTribes from the CEN.PK series, industrial yeasts
- – synthetisches Komplettselektivmedium SC: 0,67% Yeast nitrogen base w/o amino acids, pH 6,3, Aminosäure/Nukleobase-Lösung, Kohlenstoffquelle in der jeweils angegeben KonzentrationSynthetic Complete Selective Medium SC: 0.67% Yeast nitrogen base w / o amino acids, pH 6.3, amino acid / nucleobase solution, carbon source in the respectively indicated concentration
- – synthetisches Minimalselektivmedium SM: 0,16% Yeast nitrogen base w/o amino acid and ammonium sulphate, 0,5% Ammoniumsulfat, 20 mM Kaliumdihydrogenphosphat, pH 6,3, Kohlenstoffquelle in der jeweils angegeben KonzentrationSynthetic Minimal Selective Medium SM: 0.16% yeast nitrogen base w / o amino acid and ammonium sulfate, 0.5% ammonium sulfate, 20 mM potassium dihydrogen phosphate, pH 6.3, carbon source in the concentration indicated in each case
- – synthetisches Fermentationsmedium (Mineralmedium) SFM: (Verduyn et al., 1992), pH 5,5 Salze: (NH4)2SO4, 5 g/l; KH2PO4, 3 g/l; MgSO4·7H2O, 0,5 g/l Spurenelemente: EDTA, 15 mg/l, ZnSO4·4,5 mg/l; MnCl2·4H2O, 0,1 mg/l; COCl2·6H2O, 0,3 mg/l; CuSO4, 0,192 mg/l; Na2MoO4·2H2O, 0,4 mg/l; CaCl2·2H2O, 4,5 mg/l; FeSO4·7H2O, 3 mg/l; H3BO3, 1 mg/l; KI, 0,1 mg/l Vitamine: Biotin, 0,05 mg/l; p-Aminobenzoesäure, 0,2 mg/l; Nicotinsäure, 1 mg/l; Calciumpantothenat, 1 mg/l; Pyridoxin-HCL, 1 mg/l; Thiamin-HCL, 1 mg/l; Minositol, 25 mg/lSynthetic fermentation medium (mineral medium) SFM: (Verduyn et al., 1992), pH 5.5 Salts: (NH 4 ) 2 SO 4 , 5 g / l; KH 2 PO 4 , 3 g / l; MgSO 4 .7H 2 O, 0.5 g / l. Trace elements: EDTA, 15 mg / l, ZnSO 4. 4.5 mg / l; MnCl 2 .4H 2 O, 0.1 mg / l; COCl 2 • 6H 2 O, 0.3 mg / l; CuSO 4 , 0.192 mg / L; Na 2 MoO 4 .2H 2 O, 0.4 mg / L; CaCl 2 · 2H 2 O, 4.5 mg / l; FeSO 4 .7H 2 O, 3 mg / l; H 3 BO 3 , 1 mg / l; KI, 0.1 mg / L Vitamins: Biotin, 0.05 mg / L; p-aminobenzoic acid, 0.2 mg / l; Nicotinic acid, 1 mg / l; Calcium pantothenate, 1 mg / l; Pyridoxine HCL, 1 mg / L; Thiamine HCL, 1 mg / L; Minositol, 25 mg / l
Konzentration der Aminosäuren und Nukleobasen im synthetischen Komplettmedium (nach Zimmermann, 1975): Adenin (0,08 mM), Arginin (0,22 mM), Histidin (0,25 mM), Isoleucin (0,44 mM), Leucin (0,44 mM), Lysin (0,35 mM), Methionin (0,26 mM), Phenylalanin (0,29 mM), Tryptophan (0,19 mM), Threonin (0,48 mM), Tyrosin (0,34 mM), Uracil (0,44 mM), Valin (0,49 mM). Als Kohlenstoffquelle wurden L-Arabinose und D-Glucose eingesetzt.Concentration of Amino Acids and Nucleobases in Synthetic Complete Medium (Zimmermann, 1975): adenine (0.08 mM), arginine (0.22 mM), histidine (0.25 mM), isoleucine (0.44 mM), leucine (0 , 44mM), lysine (0.35mM), methionine (0.26mM), phenylalanine (0.29mM), tryptophan (0.19mM), threonine (0.48mM), tyrosine (0.34mM) mM), uracil (0.44 mM), valine (0.49 mM). The carbon source used was L-arabinose and D-glucose.
Feste Voll- und Selektivmedien enthielten zusätzlich 1,8% Agar. Die Anzucht der Hefezellen erfolgte bei 30°C. Das für die Fermentationen eingesetzte synthetische Mineralmedium enthielt Salze, Spurenmetalle und Vitamine in den oben aufgelisteten Konzentrationen und L-Arabinose als Kohlenstoffquelle. Von den Spurenmetallen und den Vitaminen wurde eine Stammlösung angesetzt. Beide Lösungen wurden sterilfiltriert. Beide wurden bei 4°C gelagert. Für die Herstellung der Spurenmetalllösung war der pH-Wert von entscheidender Rolle. Die verschiedenen Spurenelemente mussten in der obigen Reihenfolge nacheinander in Wasser vollständig gelöst werden. Nach jeder Zugabe musste der pH-Wert mit KOH auf 6,0 eingestellt werden bevor das nächste Spurenelement zugegeben werden konnte. Am Ende wurde der pH-Wert mit HCL auf 4,0 justiert. Um Schaumbildung zu vermeide, wurde dem Medium 200 μl Antischaum (Antifoam 2004, Sigma) zugegeben. Da die Versuche unter anaeroben Bedingungen durchgeführt wurden, musste dem Medium nach dem Autoklavieren noch 2,5 ml/l einer Tween80-Ergosterol-Lösung zugegeben werden. Diese besteht aus 16,8 g Tween80 und 0,4 g Ergosterol, welche mit Ethanol auf 50 ml aufgefüllt und darin gelöst wurden. Die Lösung wurde sterilfiltriert. Die Salze und der Antischaum wurden gemeinsam mit dem kompletten Fermenter autoklaviert. Die Arabinose wurde getrennt vom restlichen Medium autoklaviert. Nach Abkühlen des Mediums wurden die Spurenelemente sowie die Vitamine hinzugegeben.Solid full and selective media also contained 1.8% agar. The cultivation of the yeast cells was carried out at 30 ° C. The synthetic mineral medium used for the fermentations contained salts, trace metals and vitamins in the concentrations listed above and L-arabinose as carbon source. Of the trace metals and vitamins, a stock solution was prepared. Both solutions were sterile filtered. Both were stored at 4 ° C. For the preparation of the trace metal solution, the pH value was crucial. The various trace elements had to be completely dissolved in water one after the other in the above order. After each addition, the pH had to be adjusted to 6.0 with KOH before the next trace element could be added. At the end, the pH was adjusted to 4.0 with HCL. In order to avoid foaming, 200 μl of antifoam (Antifoam 2004, Sigma) was added to the medium. Since the experiments were carried out under anaerobic conditions, 2.5 ml / l of a Tween80 ergosterol solution had to be added to the medium after autoclaving. This consists of 16.8 g Tween80 and 0.4 g ergosterol, which were made up to 50 ml with ethanol and dissolved therein. The solution was sterile filtered. The salts and the antifoam were autoclaved together with the complete fermenter. The arabinose was autoclaved separately from the remaining medium. After cooling the medium, the trace elements and the vitamins were added.
2. Transformation:2nd transformation:
– Transformation von E. coli- Transformation of E. coli
Die Transformation der E. coli Zellen erfolgte durch die Elektroporationsmethode nach Dower et al. (1988) und Wirth (1993) mittels eines Easyject prima Geräts (EQUIBO).The transformation of E. coli cells was carried out by the electroporation method according to Dower et al. (1988) and Wirth (1993) using an Easyject prima device (EQUIBO).
– Transformation von S. cerevisiae- Transformation of S. cerevisiae
Die Transformation von S. cerevisiae Stämmen mit Plasmid-DNA bzw. DNA-Fragmenten erfolgte nach der Lithiumacetat-Methode von Gietz und Woods (1994).The transformation of S. cerevisiae strains with plasmid DNA or DNA fragments was carried out according to the lithium acetate method of Gietz and Woods (1994).
3. Präparation von DNA 3. Preparation of DNA
– Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli - Isolation of plasmid DNA from E. coli
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli erfolgte nach der Methode der alkalischen Lyse von Birnboim und Doly (1979), modifiziert nach Maniatis et al. (1982) oder alternativ mit dem „QIAprep Spin Miniprep Kit” der Firma Qiagen. Hochreine Plasmid-DNA für Sequenzierungen wurde mit dem „Plasmid Mini Kit” der Firma Qiagen nach Angaben des Herstellers präpariert.The isolation of plasmid DNA from E. coli was carried out by the alkaline lysis method of Birnboim and Doly (1979), modified according to Maniatis et al. (1982) or alternatively with the "QIAprep Spin Miniprep Kit" from Qiagen. High purity plasmid DNA for sequencing was prepared using the "Plasmid Mini Kit" from Qiagen according to the manufacturer's instructions.
– Isolierung von Plasmid-DNA aus S. cerevisiae- Isolation of plasmid DNA from S. cerevisiae
Die Zellen einer stationären Hefekultur (5 ml) wurden durch Zentrifugation geerntet, gewaschen und in 400 μl Puffer P1 (Plasmid Mini Kit, Firma Qiagen) resuspendiert. Nach Zugabe von 400 μl Puffer P2 und 2/3 Volumen Glasperlen (⌀ 0,45 mm) erfolgte der Zellaufschluss durch 5-minütiges Schütteln auf einem Vibrax (Vibrax-VXR von Janke & Kunkel oder IKA). Der Überstand wurde mit ½ Volumen Puffer P3 versetzt, gemischt und für 10 min auf Eis inkubiert. Nach einer 10-minütigen Zentrifugation bei 13000 rpm wurde durch Zugabe von 0,75 ml Isopropanol zum Überstand die Plasmid-DNA bei Raumtemperatur gefällt. Die durch Zentrifugation für 30 min bei 13000 rpm pelletierte DNA wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20 μl Wasser resuspendiert. 1 μl der DNA wurde für die Transformation in E. coli eingesetzt.The cells of a stationary yeast culture (5 ml) were harvested by centrifugation, washed and resuspended in 400 μl of buffer P1 (Plasmid Mini Kit, Qiagen). After addition of 400 μl buffer P2 and 2/3 volume glass beads (⌀ 0.45 mm), the cells were disrupted by shaking for 5 minutes on a Vibrax (Vibrax-VXR from Janke & Kunkel or IKA). The supernatant was mixed with ½ volume buffer P3, mixed and incubated on ice for 10 min. After centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes, the plasmid DNA was precipitated at room temperature by adding 0.75 ml of isopropanol to the supernatant. The DNA pelleted by centrifugation for 30 min at 13000 rpm was washed with 70% ethanol, dried and resuspended in 20 μl water. 1 μl of the DNA was used for transformation into E. coli.
– Bestimmung der DNA-Konzentration- Determination of DNA concentration
Die DNA-Konzentration wurde spektralphotometrisch in einem Wellenlängenbereich von 240–300 nm gemessen. Liegt die Reinheit der DNA, bestimmt durch den Quotient E260nm/E280nm, bei 1,8, so entspricht die Extinktion E260nm = 1,0 einer DNA-Konzentration von 50 μg dsDNA/ml (Maniatis et al., 1982).The DNA concentration was measured spectrophotometrically in a wavelength range of 240-300 nm. If the purity of the DNA, determined by the quotient E 260nm / E 280nm , at 1.8, the extinction E 260nm = 1.0 corresponds to a DNA concentration of 50 ug dsDNA / ml (Maniatis et al., 1982).
– DNA-Amplifikation mittels PCR- DNA amplification by PCR
Verwendung des PhusionTM High Fidelity Systems Die Polymerasekettenreaktion erfolgte in einem Gesamtvolumen von 50 μl mit dem „PhusionTM High Fidelity PCR System” der Firma Finnzymes nach Angaben des Herstellers. Jeder Ansatz bestand aus 1–10 ng DNA oder 1–2 Hefekolonien als Synthesevorlage, 0,2 mM dNTP-Mix, 1 × Puffer 2 (enthält 1,5 mM MgCl2), 1 U Polymerase und je 100 pmol der entsprechenden Oligonukleotidprimer. Die PCR-Reaktion wurde in einem Thermocycler der Firma Techne durchgeführt und die PCR-Bedingungen nach Bedarf wie folgt gewählt:
Nach dem ersten Denaturierungsschritt wurde die Polymerase zugegeben („hot start PCR”). Die Anzahl der Syntheseschritte, die Annealingtemperatur und die Elongationszeit wurden an die spezifischen Schmelztemperaturen der verwendeten Oligonukleotide bzw. an die Größe des zu erwarteten Produkts angepasst. Die PCR-Produkte wurden durch eine Agarosegelelektrophorese überprüft und anschließend aufgereinigt.After the first denaturation step, the polymerase was added ("hot start PCR"). The number of synthesis steps, the annealing temperature and the elongation time were adapted to the specific melting temperatures of the oligonucleotides used or to the size of the expected product. The PCR products were checked by agarose gel electrophoresis and then purified.
– DNA-Aufreinigung von PCR-Produkten- DNA purification of PCR products
Die Aufreinigung der PCR-Produkte erfolgte mit dem „QIAquick PCR Purification Kit” der Firma Qiagen nach Herstellerangaben.The purification of the PCR products was carried out with the "QIAquick PCR Purification Kit" from Qiagen according to the manufacturer.
– Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten - Gel electrophoretic separation of DNA fragments
Die Auftrennung von DNA-Fragmenten mit einer Größe von 0,15–20 kb erfolgte in 0,5-1%igen Agarosegelen mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid. Als Gel- und Laufpuffer wurde 1 × TAE-Puffer (40 mM Tris, 40 mM Essigsäure, 2 mM EDTA) verwendet (Maniatis et al., 1982). Als Größenstandard diente eine mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und HindIII geschnittene Lambda-Phagen-DNA. Die DNA-Proben wurden vor dem Auftragen mit 1/10 Volumen Blaumarker (1 × TAE-Puffer, 10% Glycerin, 0,004% Bromphenolblau) versetzt und nach der Auftrennung durch Bestrahlung mit UV-Licht (254 nm) sichtbar gemacht.The separation of DNA fragments with a size of 0.15-20 kb was carried out in 0.5-1% agarose gels containing 0.5 μg / ml ethidium bromide. As a gel and running buffer, 1 x TAE buffer (40 mM Tris, 40 mM acetic acid, 2 mM EDTA) was used (Maniatis et al., 1982). The size standard used was a lambda phage DNA cut with the restriction endonucleases EcoRI and HindIII. The DNA samples were spiked with 1/10 volume of blue markers (1X TAE buffer, 10% glycerol, 0.004% bromophenol blue) before application and visualized after separation by irradiation with UV light (254 nm).
– Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen- Isolation of DNA fragments from agarose gels
Das gewünschte DNA-Fragment wurde aus dem TAE-Agarosegel unter langwelligem UV-Licht (366 nm) ausgeschnitten und mit dem „QIAquick Gel Extraction Kit” der Firma Qiagen nach Angaben des Herstellers isoliert.The desired DNA fragment was excised from the TAE agarose gel under long-wave UV light (366 nm) and isolated using the "QIAquick Gel Extraction Kit" from Qiagen according to the manufacturer's instructions.
4. Enzymatische Modifikation von DNA4. Enzymatic modification of DNA
DNA-RestriktionDNA restriction
Sequenzspezifische Spaltung der DNA mit Restriktionsendonukleasen wurden unter den vom Hersteller empfohlenen Inkubationsbedingungen für 1 Stunde mit 2–5 U Enzym pro μg DNA durchgeführt.Sequence-specific cleavage of the DNA with restriction endonucleases was performed under the manufacturer's recommended incubation conditions for 1 hour with 2-5 U of enzyme per μg of DNA.
Weitere mögliche Expressionsvektoren sind aus der Serie pRS303X, p3RS305X und p3RS306X. Hierbei handelt es sich um integrative Vectoren, die einen dominanten Antibiotika-Marker besitzen. Nähere Angaben zu diesen Vektoren finden sich bei Taxis und Knop (2006).Further possible expression vectors are from the series pRS303X, p3RS305X and p3RS306X. These are integrative vectors that possess a dominant antibiotic marker. Further details on these vectors can be found in Taxis and Knop (2006).
Referenzenreferences
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Patent Citations (1)
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