DE102007056488A1 - Composition, useful e.g. transfection comprises a non-viral gene delivery system containing e.g. cationic lipid, and an agent for partial suppression and/or activation of innate intracellular and/or intercellular immune defense - Google Patents
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Abstract
Description
Stand der TechnikState of the art
Bei
Immunantworten des Körpers (
Gäbe es nur diese Art der Immunabwehr wäre der Organismus vor der ersten Infektion völlig ungeschützt. Das ist jedoch nicht der Fall, da es noch eine weitere sehr ursprüngliche Immunabwehr gibt, die als angeborene Immunabwehr bezeichnet wird und von der Fliege Drosophila bis zu Säugetieren, ja sogar bei Pflanzen gefunden wird. Diese Immunabwehr ist die erste Abwehrfront gegen Krankheitserreger und stellt ein evolutionär sehr altes System dar.would it would only be this type of immune defense that the organism would have before the first infection completely unprotected. This is however, not the case, as there is another very original one Immune defense exists, which is called innate immune defense and from the fly Drosophila to mammals, yes even is found in plants. This immune defense is the first defense front against pathogens and represents an evolutionary very old system
Bei
der angeborenen Immunabwehr werden über so genannte Toll-like
Rezeptoren (TLR) (
RIG-I-like Helikasen (RLH)RIG-I-like helicases (RLH)
RIG-I
(retinoic inducible gene I) ist ein intrazellulärer Rezeptor
des angeborenen Immunsystems (
Toll-like Rezeptoren (TLR)Toll-like receptors (TLR)
Toll-like
Rezeptoren wurden erstmals in der Mitte der 1990er Jahre entdeckt
(
Bisher sind 13 verschiedene TLRs bekannt (davon 10 beim Menschen), deren Anzahl ausreichend ist für die Erkennung aller pathogenen Erreger, angefangen von Bakterien über Pilze bis zu den Viren. Die Rezeptoren erkennen dabei allen Erregern gemeinsame Strukturen, des Weiteren mitunter auch mehrere Bestandteile gleichzeitig, ohne dass diese sich strukturell ähneln. Beispielsweise erkennt das TLR4 Lipopolysaccharide, aber auch Taxol. Bisher ist nicht bekannt wie die TLRs das leisten können. Die TLRs unterscheiden sich von Spezies zu Spezies nur wenig.
- TLR1: bildet mit TLR2 ein Heterodimer, ist der Rezeptor von triacyliertem Lipoprotein und Zymosan aus Hefen.
- TLR2: ist der Rezeptor für bestimmte Peptidoglykane, Lipopeptide, Glykolipide und verschiedener Bakterien.
- TLR3: erkennt lange dsRNA, wie Sie bei einer Virusreplikation in infizierten Zellen vorkommt.
- TLR4: ist der Rezeptor für Lipopolysaccharide (LPS, auch Endotoxine), verschiedene Hüllglykoproteine (auch von Viren) und Taxol. LPS sind Bestandteile von Bakterienzellwänden.
- TLR5: ist der Rezeptor von Flagellin, einem Hauptbestandteil der Geiseln (Flagellae), mit welchen sich Bakterien fortbewegen.
- TLR6: bildet mit TLR4 ein Heterodimer, ist der Rezeptor von diacyliertem Lipoprotein und bestimmten Peptidoglykanen.
- TLR7&TLR8: beide codierenden Gene liegen auf dem X-Chromosom und weisen ein hohe Homologie auf, es sind Rezeptoren für kurze ssRNA/dsRNA z. B. von RNA-Viren. Es werden letztendlich auch dendritische Zellen und T-Zellen aktiviert.
- TLR9: Ist der Rezeptor für bakterielle DNA, bzw. für nicht methylierte CpG Motive, die in bakterieller DNA gehäuft (20 x häufiger als in Säugerzellen) auftritt. Das CpG Motiv ist in Säugerzellen stark methyliert, wodurch es unterschieden werden kann. Ähnliches wie für bakterielle DNA gilt auch für virale DNA. Es konnte gezeigt werden, dass TLR9 IL-12 aktiviert, das wiederum T-Helferzellen vom Typ I stimuliert. Weiter wird die Induktion von Interferonen vermittelt.
- TLR1: forms a heterodimer with TLR2, is the receptor of triacylated lipoprotein and yeast zymosan.
- TLR2: is the receptor for certain peptidoglycans, lipopeptides, glycolipids and various bacteria.
- TLR3: Detects long dsRNA, as occurs in virus replication in infected cells.
- TLR4: is the receptor for lipopolysaccharides (LPS, also endotoxins), various envelope glycoproteins (also of viruses) and taxol. LPS are components of bacterial cell walls.
- TLR5: is the receptor of flagellin, a major constituent of hostages (flagellae), with which bacteria move.
- TLR6: forms a heterodimer with TLR4, is the receptor of diacylated lipoprotein and certain peptidoglycans.
- TLR7 & TLR8: both coding genes are located on the X chromosome and have a high homology, they are receptors for short ssRNA / dsRNA z. B. of RNA viruses. Finally, dendritic cells and T cells are also activated.
- TLR9: Is the receptor for bacterial DNA, or for non-methylated CpG motifs that accumulates in bacterial DNA (20 times more abundant than in mammalian cells). The CpG motif is highly methylated in mammalian cells, allowing it to be distinguished. Similar to bacterial DNA also applies to viral DNA. It has been shown that TLR9 activates IL-12, which in turn stimulates Type I helper T cells. Furthermore, the induction of interferons is mediated.
Über
die immunstimulatorische Eigenschaft von bakterieller DNA berichtete
schon Anfang der 80er Jahre die Gruppe um Dr. Tokunaga. Als zugehöriger
Rezeptor wurde von der Gruppe um Dr. Shizuo Akira der TLR9 Rezeptor
identifiziert (Aufklärung der Rollen von Toll-Rezeptoren
und ihrer Signaltransduktionskaskaden mittels Gen-Targeting, Robert-Koch-Vorlesung
von
- TLR10: Ligand noch nicht bekannt
- TLR11: Ist Rezeptor für das urpathogene Bakterium Escherichia coli und dem Profilinähnlichen Protein des Urtierchens Toxoplasma gondii
- TLR12: Funktion und Ligand noch unbekannt
- TLR13: Funktion und Ligand noch unbekannt
- TLR10: ligand not yet known
- TLR11: is the receptor for the pathogenic bacterium Escherichia coli and the profilin-like protein of the predator Toxoplasma gondii
- TLR12: Function and ligand still unknown
- TLR13: Function and ligand still unknown
Lokalisation der TLR:Localization of the TLR:
TLR2,
4, 5 und 6 sitzen insbesondere in den Plasmamembranen von Monozyten,
natürlichen Killerzellen, Mastzellen oder myaloiden dendritischen
Zellen., 7, 8, und 9 befinden sich insbesondere in Endosomen von
Immunzellen (
Signaltransduktionskaskaden:signal transduction:
Die
Signaltransduktionswege der unterschiedlichen TLRs (
Welche Proteine neben den Adaptermolekülen noch mitwirken hängt vom jeweiligen TLR ab.Which Proteins next to the adapter molecules still participate hangs from the respective TLR.
Signaltransduktionskaskade über TLR3:Signal transduction cascade over TLR3:
Aktiviert nach Bindung passender Liganden die Transkriptionsfaktoren „interferone regulating factor 3" (IRF3) und NF-kB durch das Adaptormolekül TRIF. Die weitere Signaltransduktionkaskade nach TRIF ist inzwischen bekannt. TRIF rekrutiert die IRF-Kinase TBK1 oder PKR (dsRNA activated Protein Kinase). Nach der Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors „interferone regulatory factor 3" (IRF3) dimerisiert dieser und kann als solcher in den Zellkern gelangen, wo er Zytokine (Interferone vom Typ 1 bzw. Interferon -beta) induziert (L. Martinez-Sobrido et al). Zur vollen Aktivität von IRF sind zusätzlich die Phosphatidylinositol 3-Kinase und weitere „Downstreamkinasen" notwendig. PKR gehört im Übrigen zu einer Klasse von 20 dsRNA bindenden Proteinen. Sie wird auch durch diese Bindung aktiviert und kann damit auch unabhängig von TLR3 zu einer Immunantwort führen.enabled after binding of appropriate ligands, the transcription factors "interferons regulating factor 3 "(IRF3) and NF-kB by the adapter molecule TRIF. The further signal transduction cascade according to TRIF is now known. TRIF recruits the IRF kinase TBK1 or PKR (dsRNA activated Protein kinase). After phosphorylation of the transcription factor "interferone regulatory factor 3 "(IRF3) dimerizes this and can as such into the cell nucleus, where it releases cytokines (Type I interferons) or interferon-beta) (L. Martinez-Sobrido et al.). to full activity of IRF are additionally the phosphatidylinositol 3-kinase and other downstream kinases necessary PKR Incidentally, it belongs to a class of 20 dsRNA binding proteins. It is also activated by this bond and can therefore also independent of TLR3 to an immune response to lead.
Signaltransduktionskaskaden über TLR7, TLR8 und TLR9Signal transduction cascades over TLR7, TLR8 and TLR9
Die Induktion von Typ I Interferonen durch TLR7/8 und TLR9 läuft hauptsächlich über das Adaptermolekül MyD88. Letztendlich wird der Transkriptionsfaktor „Interferone regulatory factor 7" (IRF7) über Phosphorylierung durch Kinasen (IRAK-1, IRAK-4, IKK-alpha) aktiviert, worauf er in den Zellkern wandert und die Transkription von Interferonen vom Typ I induziert. Eine andere Variante erfolgt über den Transkriptionsfaktor IRF1, allerdings ist hier der genaue Mechanismus noch nicht bekannt.The Induction of type I interferons by TLR7 / 8 and TLR9 runs mainly via the adapter molecule MyD88. Finally, the transcription factor "interferons regulatory factor 7 "(IRF7) via phosphorylation by Kinases (IRAK-1, IRAK-4, IKK-alpha) activated, whereupon he in the Nucleus migrates and the transcription of interferons of the type I induced. Another variant is via the transcription factor IRF1, but the exact mechanism is not known yet.
TLRs sind von großem therapeutischem Interesse. TLR Agonisten werden z. B. als Adjuvantien in Impfstrategien oder in der Krebstherapie eingesetzt. Beispiele sind die Behandlung von Basalzellkarzinom durch die TLR7/8 Agonisten Imiquimod/Resiquimod oder von Blasenkrebs durch einen TLR2 Agonisten. Der TLR9 Rezeptor wird durch ein synthetisches CpG-haltiges Oligonukleotid (CpG 7909 und CpG 10101) für die Therapie von Autoimmunerkrankungen, Krebs und Infektionskrankheiten angesteuert. Kommerzialisiert werden TLR9 basierende Therapiestrategien von der Firma Coley Pharmaceuticals.TLRs are of great therapeutic interest. TLR agonists be z. As adjuvants in vaccination strategies or in cancer therapy used. Examples are the treatment of basal cell carcinoma by the TLR7 / 8 agonists imiquimod / resiquimod or from bladder cancer through a TLR2 agonist. The TLR9 receptor is made by a synthetic CpG-containing oligonucleotide (CpG 7909 and CpG 10101) for the therapy of autoimmune diseases, cancer and infectious diseases driven. TLR9-based therapeutic strategies are being commercialized from the company Coley Pharmaceuticals.
Aber auch durch eine Überreaktion der angeborenen Immunabwehr können zahlreiche Krankheiten ausgelöst werden, beispielsweise Autoimmunerkrankungen wie rheumatische Arthritis und systemischer Lupus erythematodes. Hier reagieren TLRs mit Zerfallsprodukten körpereigener Zellen und leiten damit die Immunabwehr fehl.But also by an overreaction of the innate immune system many diseases can be triggered For example, autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. Here, TLRs react with decomposition products the body's own cells and thus cause the immune system to fail.
Die TLRs stehen sogar im Verdacht, ursächlich mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen im Zusammenhang zu stehen. Entzündungsreaktionen am Herz können zur Bildung von arteriosklerotischen Plaques beitragen, die letztendlich durch Gefäßverschluss zum Infarkt führen können.The TLRs are even suspected of causing cardiovascular disease to be related. Inflammatory reactions in the heart can contribute to the formation of arteriosclerotic plaques, which ultimately by vascular occlusion to the infarction being able to lead.
Zytokine/Cytokines:Cytokines / Cytokines:
Zytokine sind multifunktionale Signalstoffe. Es handelt sich dabei um zuckerhaltige Proteine, die eine regulierende Funktion für das Wachstum und die Differerenzierung von Körperzellen haben. Einige von ihnen werden daher auch als Wachstumsfaktoren bezeichnet. Viele Zytokine spielen zudem eine wichtige Rolle bei immunologischen Reaktionen und werden daher auch Mediatoren genannt. Zytokine werden von den Zellen durch Sekretion in das umgebende Medium abgegeben und stimulieren andere Zellen, wenn diese einen passenden Rezeptor besitzen. Man unterscheidet 5 Hauptgruppen von Zytokinen:cytokines are multifunctional signaling substances. These are sugary Proteins that have a regulatory function for growth and have the differentiation of body cells. Some They are therefore also called growth factors. Lots Cytokines also play an important role in immunological reactions and are therefore also called mediators. Cytokines are used by the Secretions release cells into the surrounding medium and stimulate them other cells, if they have a suitable receptor. you distinguishes 5 main groups of cytokines:
1. Interferone (IFN)1. Interferons (IFN)
Interferone weisen Zellen an, Proteine zu bilden, die eine virale Infektion erschweren oder unterbinden. Auch können Interferone antitumorale Wirkung haben.interferons cells indicate to form proteins that cause a viral infection complicate or prevent. Also, interferons may be antitumoral Have effect.
2. Interleukine (IL)2. Interleukins (IL)
Interleukine dienen der Kommunikation von Immunabwehrzellen untereinander und erhöhen dadurch die Koordination bei der Abwehr von Krankheitserregern und der Tumorbekämpfunginterleukins serve the communication of immune cells with each other and thereby increase the coordination in the defense against pathogens and the fight against tumors
3. Koloniestimulierende Faktoren3. Colony stimulating factors
Koloniestimulierende Faktoren werden in der Niere gebildet. Es handelt sich um Wachstumsfaktoren für Blutkörperchencolony stimulating Factors are formed in the kidney. These are growth factors for blood corpuscle
4. Tumornekrosefaktoren (TNF)4. Tumor Necrosis Factors (TNF)
Die wichtigste Funktion von TNFs ist, die Aktivität verschiedener Immunzellen zu regeln. Sie werden hauptsächlich von Makrophagen ausgeschüttet. TNFs können den Zelltod (Apoptose), Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Ausschüttung anderer Zytokine anregen.The most important function of TNFs is the activity of different To regulate immune cells. They are mainly of macrophages distributed. TNFs can cause cell death (apoptosis), Cell proliferation, cell differentiation and secretion stimulate other cytokines.
5. Chemokine5. Chemokines
Chemokine sind Chemoattraktoren, die Zellen mit passenden Rezeptoren veranlassen durch Chemotaxis zur Quelle der Chemokine zu wandernchemokines are chemoattractants that cause cells with matching receptors to migrate through chemotaxis to the source of chemokines
Von
besonderer Bedeutung als Mediatoren für immunologische
Prozesse sind die Interferone (IFN), insbesondere die Interferone
vom Typ I. Das erste Interferon dieser Art wurde 1957 von Isaacs
und Lindemann gefunden (
Die IFN-alpha Proteine kommen in 13 Subtypen vor, die als IFNAX (x = 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 16, 17 und 21) bezeichnet werden. Alle ihre Gene liegen clusterartig auf dem Chromosom 9.The IFN-alpha proteins are present in 13 subtypes known as IFNAX (x = 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 16, 17 and 21). All of their genes are clustered on chromosome 9.
Von den IFN-beta Proteinen sind zwei beschrieben. Es handelt sich um IFNB1 und IFNB3. Ein als IFNB2 beschriebenes Protein konnte später als ein bekanntes Interleukin identifiziert werden.From Two of the IFN-beta proteins are described. It is a matter of IFNB1 and IFNB3. A protein described as IFNB2 could later be identified as a known interleukin.
Über eine Signaltransduktionskaskade wird nach der Bindung an den in der äußeren Zellmembran liegenden Interferon-Typ-1-Rezeptor der Transkriptionsfaktor „interferone stimulated gene factor 3" (ISGF3), ein Heterotrimer und Aktivator der Transkription der Transkriptionsfaktoren STAT1, STAT2 und „IFN regulatory factor 9 (IRF9), welche in den Zellkern wandern und dort die Transkription von Hunderten von Effektormolekülen (über so genannte IFN induzierbare Gene) induziert. Diese Effektormoleküle beeinflussen direkt die Proteinsynthese, das Zellwachstum und das Überleben im Prozess der Etablierung des so genannten „antiviralen Status" (antiviral state). In diesem Status wird die Infektiösität der Viren z. B. durch verringerte Replikationsraten abgewehrt oder zumindest verringert.about a signal transduction cascade is formed after binding to the in the outer cell membrane lying interferon type 1 receptor the transcription factor "interferon stimulated gene factor 3 "(ISGF3), a heterotrimer and activator of the transcription of the Transcription factors STAT1, STAT2 and "IFN regulatory factor 9 (IRF9), which migrate into the cell nucleus and there the transcription of hundreds of effector molecules (via so-called IFN inducible genes). These effector molecules directly affect protein synthesis, cell growth and survival in the process of establishing the so-called "antiviral Status "(antiviral state) .In this status becomes infectiousness the virus z. B. repelled by reduced replication rates or at least reduced.
Zusätzlich wird das adaptive Immunsystem aktiviert, indem die Reifung von dendritischen Zellen ausgelöst, die Antikörperantwort der B Zellen und die T Zellantwort aktiviert wird. Es werden Lymphozyten und Monozyten durch induzierte Chemokine zum Ort der Infektion rekrutiert.additionally The adaptive immune system is activated by the maturation of dendritic Cells elicited the antibody response of B Cells and the T cell response is activated. There are lymphocytes and monocytes recruited by induced chemokines to the site of infection.
Nicht virale GenliefermethodenNon-viral gene delivery methods
Das
Einbringen von genetischem Material in eukariotische Zellen (Transfektion),
insbesondere Säugerzellen ist heute eine Methode, die aus
der modernen Forschung nicht mehr wegzudenken ist (
Den enormen Möglichkeiten, die das Einbringen von genetischem Material in eukariotische Zellen mit sich bringt, steht ein Arsenal von Methoden gegenüber, die nur unbefriedigende Leistungsfähigkeit aufweisen. Die jeweils spezifisch auftretenden Mängel bis dato vorhandener Methoden betreffen im Wesentlichen die wichtigen Parameter Effizienz, Toxizität, Immunogenität, Targeting, Restriktion bzgl. der Größe des genetischen Materials, Möglichkeiten der in vivo/in vitro Anwendung, Möglichkeit von High-Throughput-Anwendungen, Gefahrenpotential, Einfachheit der Methode und Kosten der Methode. Kein Verfahren ist in der Lage, alle diese Parameter ausreichend zu erfüllen und so wird dem Fehlen eines geeigneten Gen-Carriersystems zugeschrieben, dass sich bis heute trotz erheblicher Forschungsaufwendungen keine auf Gentherapie beruhende medizinische Therapie etablieren konnte.The enormous opportunities involving the introduction of genetic Material in eukaryotic cells brings with it an arsenal of methods that only have unsatisfactory performance exhibit. The specific occurring defects until existing methods essentially concern the important ones Parameters efficiency, toxicity, immunogenicity, Targeting, restriction on the size of the genetic Materials, possibilities of in vivo / in vitro application, Possibility of high-throughput applications, potential dangers, Simplicity of the method and cost of the method. No procedure is able to meet all these parameters adequately and so is attributed to the lack of a suitable gene carrier system, that until today despite considerable research expenditures no could establish gene therapy based medical therapy.
In den vergangenen Jahren erlangte die Erforschung so genannter Genliefermethoden (Gene Delivery Systems), die sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden können, enorme Bedeutung, da jenen große Chancen eingeräumt werden, der Gentherapie zum Durchbruch zu verhelfen. Ein Schwerpunkt der Gentherapieforschung besteht darin, Viren als Carriersysteme zu nutzen. Da das Einbringen von DNA oder RNA in Fremdzellen ein integraler Bestandteil des Vermehrungszyklus der Viren ist, wurde diese Fähigkeit durch einen natürlichen, evolutiven Prozess in der Entwicklungsgeschichte der Viren soweit verfeinert, dass es bis heute keine effektiveren Gen-Carrier gibt. Die natürlich vorkommenden Viren werden gentechnisch so manipuliert, dass sie Ihre Fähigkeit zur Reproduktion und ihre Pathogenität verlieren, jedoch eine Zelle mit rekombinant eingebrachtem genetischem Material infizieren können. Da Viren außer aus genetischem Material im Wesentlichen aus Proteinen bestehen, bieten Sie dem Immunsystem allerdings eine große Angriffsfläche. Dabei hat das Immunsystem in einem ebenso evolutionären Anpassungsprozess Strategien entwickelt, sich diesen Eindringlingen zur Wehr zu setzen. Daher wird die Immunantwort des Körpers als ein besonders bedeutender Faktor bezüglich gescheiterter Gentherapiestudien genannt.In In recent years, research into so-called gene delivery methods has been achieved (Gene Delivery Systems) used both in vitro and in vivo be enormous, because there are great opportunities be granted to help gene therapy to a breakthrough. One focus of gene therapy research is on viruses as a To use carrier systems. As the introduction of DNA or RNA into foreign cells is an integral part of the multiplication cycle of viruses, this ability was provided by a natural, evolutionary process in the developmental history of the virus so far refines that to date there are no more effective gene carriers. The naturally occurring viruses are genetically engineered that manipulates your ability to reproduce and lose their pathogenicity, but a cell with recombinant introduced can infect genetic material. Because viruses except consisting of genetic material consisting essentially of proteins, However, they offer the immune system a large attack surface. In doing so, the immune system has an equally evolutionary one Adaptation strategies are developed to meet these invaders to defend. Therefore, the immune response of the body as a particularly significant factor regarding failed Called gene therapy studies.
Die gegenwärtig zur Verfügung stehenden Genliefermethoden können in die zwei Hauptgruppen virale Systeme und nicht-virale Systeme unterteilt werden. Die nicht viralen Systeme können wiederum in chemische und physikalische Methoden unterschieden werden.The currently available gene delivery methods can be divided into the two main groups viral systems and non-viral Systems are divided. The non-viral systems can again be differentiated into chemical and physical methods.
Von den nicht-viralen Systemen, die auf chemischen Methoden beruhen, sind insbesondere solche erwähnenswert, die auf kationischen Lipiden (sog. Lipofektion) oder kationischen Polymeren (sog. Polyfektion) beruhen. Deren Effizienz liegt in der Regel weit hinter den viralen Systemen.From Non-viral systems based on chemical methods In particular, those worth mentioning are those on cationic Lipids (so-called lipofection) or cationic polymers (so-called polyfection) are based. Their efficiency is usually far behind the viral systems.
Allseits
bekannte kationische Polymere sind beispielsweise Poly-L-Lysin (PLL),
(
Kommerziell erhältliche Produkte solcher kationischer Polymere sind z. B. Superfect, Polyfect (Qiagen), ExGen500 (Biomol) und jetPEI (Qbiogene).Commercially available products of such cationic polymers z. Superfect, Polyfect (Qiagen), ExGen500 (Biomol), and jetPEI (Qbiogene).
Ebenso
bekannte kationische Lipide (
Kationische Lipide und kationische Polymere bilden in Anwesenheit von DNA oder RNA aufgrund der gegenläufigen Ladungsverhältnisse spontan so genannte Lipoplexe oder Polyplexe. Die DNA wird dabei durch die Kompensation der negativen Ladung am Phosphatrest kondensiert, also in ihrer Größe minimiert. Im Allgemeinen hängt die Transfektionseffizienz von Lipoplexen oder Polyplexen von einer Vielzahl von Parametern ab. Die wichtigsten sind das Mengenverhältnis von genetischem Material zu kationischer Komponente bei der Herstellung der Lipo/Polyplexe, Ionenstärke während der Herstellung der Lipo/Polyplexe, Absolutmenge von Lipo/Polyplexen pro Zelle, Zelltyp, Proliferationszustand der Zellen, physiologischer Status der Zellen, Zellteilungsrate, Inkubationszeit etc. Diese Einflussparameter sind Ausdruck eines komplizierten Transfektionsgeschehens, bei der die Lipo/Polyplexe bzw. die enthaltenen genetischen Materialien eine Vielzahl von zellulären Barrieren überwinden müssen.cationic Lipids and cationic polymers form in the presence of DNA or RNA due to the opposite charge conditions spontaneously called lipoplexes or polyplexes. The DNA will be there condensed by the compensation of the negative charge on the phosphate radical, so minimized in size. In general depends on the transfection efficiency of lipoplexes or polyplexes from a variety of parameters. The most important are the quantity ratio from genetic material to cationic component in manufacture the lipo / polyplexes, ionic strength during production the lipo / polyplexes, absolute amount of lipo / polyplexes per cell, Cell type, proliferation status of cells, physiological status cells, cell division rate, incubation time, etc. These influence parameters are an expression of a complicated Transfektionsgeschehens, in which the lipo / polyplexes or the contained genetic materials overcome a variety of cellular barriers have to.
Die erste Barriere stellt die äußere negativ geladene Zellmembran dar. Es wird angenommen, dass transfektionsaktive Lipoplexe, die eine positive Nettoladung haben müssen, durch adsorptive Endocytose oder Flüssigphasenendocytose in das Innere der Zelle gelangen. Durch die Endocytose, die einen aktiven Transportprozess der Zelle darstellt, wird Material auf der Zelloberfläche mit Zellmembran ummantelt und als Vesikel (Endosom) internalisiert. Durch Verschmelzung mit so genannten Lysosomen, die ein komplexes Gemisch von Enzymen beinhalten, werden die in den Endosomen enthaltenen Stoffe abgebaut.The first barrier represents the outer negatively charged one Cell membrane. It is believed that transfection-active lipoplexes, which must have a net positive charge, by adsorptive Endocytosis or liquid phase endocytosis in the interior of the Cell. By endocytosis, which is an active transport process represents the cell becomes material on the cell surface encased with cell membrane and internalized as a vesicle (endosome). By merging with so-called lysosomes, which is a complex Containing a mixture of enzymes, those contained in the endosomes Substances degraded.
Da zu diesem Abbau ein niedriger pH-Wert nötig ist, besitzen Endosomen Protonenpumpen, die solange Protonen in die Endosomen pumpen, bis ein entsprechender pH-Wert erreicht wird. Um Ladungsneutralität zu wahren, strömen im gleichen Ausmaß Chloridionen in die Endosomen.There for this degradation, a low pH is necessary possess Endosomes proton pumps that protons into the endosomes pump until a suitable pH is reached. To charge neutrality to maintain chloride ions flow to the same extent into the endosomes.
Viele moderne kationische Lipide oder Polymere besitzen aus diesem Grund Puffereigenschaften. Auf diese Weise wird der niedrige pH-Wert nicht erreicht und es kommt zu einem Eintrag an Ionen in die Endosomen, der die Endosomen durch den entstehenden osmotischen Druck zum Platzen bringt. Auf diese Weise gelangen diese Lipo/Polyplexe in das Cytosol. Da auch eine Reihe transfektionsaktiver Lipide und Polymere ohne Puffereigenschaften bekannt sind, muss ein weiterer Mechanismus existieren, der die Lipo/Polyplexe in das Cytosol gelangen lässt. Man vermutet zumindest im Falle der Lipide eine Fusion der beteiligten Membranen und damit einhergehend eine Destabilisierung. Ob dabei vorwiegend der Lipoplex oder die enthaltende DNA/RNA als solches in das Cytosol gelangt ist unklar. Es wird jedoch vermutet, dass die DNA im Cytosol aus dem Lipoplex freigesetzt wird, da Versuche scheiterten, durch Mikroinjektion von Lipoplexen direkt in den Zellkern eine Proteinexpression zu erreichen. Es scheint, als ob die in den Lipoplexen gebundene DNA dem Transkriptionsapparat nicht zugänglich ist.Lots modern cationic lipids or polymers possess this reason Buffering properties. In this way, the low pH does not reached and there is an entry of ions into the endosomes, the endosomes burst due to the resulting osmotic pressure brings. In this way, these lipo / polyplexes enter the cytosol. As a number of transfection-active lipids and polymers without Buffer properties are known, another mechanism must be exist that allows the lipo / polyplexes to enter the cytosol. At least in the case of lipids, one suspects a fusion of the involved ones Membranes and concomitant destabilization. Whether there predominantly the lipoplex or the containing DNA / RNA as such got into the cytosol is unclear. However, it is believed that the DNA in the cytosol is released from the lipoplex, as experiments failed by microinjection of lipoplexes directly into the nucleus to achieve protein expression. It seems like those in the Lipoplexes bound DNA not accessible to the transcription apparatus is.
Handelt es sich um gegen mRNA gerichtete Antisense Moleküle oder siRNA, ist der biologische Wirkort erreicht und die Dauer der Wirkung hängt im wesentlichen von der Konzentration cytosolischer RNasen und der Rate der Freisetzung aus den Lipo/Polyplexen ab. DNA kann als solche nicht in den Zellkern eindringen, was als „Nuclear Barrier" bezeichnet wird. Sie gelangt allerdings während der Zellteilung an ihren Wirkort und führt so zur Expression von Proteinen.These it is antisense molecules directed against mRNA or siRNA, the biological action site is reached and the duration of the effect depends essentially on the concentration of cytosolic RNases and the rate of release from the lipo / polyplexes. As such, DNA can not penetrate the nucleus, what is called "nuclear Barrier ", but it does arrive during the cell division at their site of action and thus leads to the expression of proteins.
Als weitere nicht-virale Methoden, die auf chemischen Methoden basieren, seien Systeme genannt, die ein DNA-bindenden Molekülteil sowie einen Liganden tragen, der rezeptorvermittelte Endozytose auszulösen vermag (Beispiele Transferrinfektion).When other non-viral methods based on chemical methods, be called systems that a DNA-binding moiety and carry a ligand, receptor-mediated endocytosis can trigger (examples Transferrinfektion).
Das
bedeutendste Beispiel einer nicht-viralen Methode, die auf einem
physikalischen Verfahren beruht, stellt die Elektroporation dar.
Dabei werden die zu transfizierenden Zellen zwischen zwei Elektroden
verbracht, an die ein typischer Spannungsverlauf angelegt wird.
Auf diese Weise werden die Zellen einem intensiven elektrischen
Stromstoß (Puls) ausgesetzt, der zur einer reversiblen Öffnung
(Poren) der Zellmembran führt. Durch diese Poren können
Substanzen, wie z. B. genetisches Material, die sich in unmittelbarer
Umgebung der Poren befinden in die Zelle eindringen. Der Puls (also
Spannungsverlauf) als einer der wichtigsten Erfolgsparameter muss
für jeden Zelltyp optimiert werden. Es gibt inzwischen
einige kommerzielle Anbieter für Elektroporatoren (z. B.
Eppendorf/Multiporator,
Als weitere physikalische Methoden seien Mikroinjektion, Hydrodynamische Methoden, ballistische Methoden (Genegun) oder Methoden, die Ultraschall benutzen genannt oder auch die Injektion nackter DNA in verschiedene Organe, die zu geringer Expression der entsprechenden Gene führt.When other physical methods are microinjection, hydrodynamic Methods, ballistic methods (Genegun) or methods that use ultrasound called use or even the injection of naked DNA into different Organs that lead to low expression of the corresponding genes.
Zu den Verfahren die physikalische Methoden als auch chemische Methoden vereinen, zählt insbesondere auch die Magnetofektion, die DNA-bindende Moleküle auf magnetischen Nanoteilchen nutzt um über eine magnetischen Feldgradienten DNA auch der Oberfläche von Zellen anzureichern und Endozytose auszulösenTo the methods the physical methods as well as chemical methods In particular, magnetofection, the Uses DNA-binding molecules on magnetic nanoparticles in order to have a magnetic field gradient DNA also the surface enriched cells and cause endocytosis
Beschreibung der ErfindungDescription of the invention
Mit repetitiven Lipofektionsversuchen, bei denen zunächst eine Transfektion mit einer spezifisch gegen ein bestimmtes Protein gerichteten siRNA durchgeführt wurde und anschließend eine Plasmidtransfektion mit einem Reportergen folgte, konnte festgestellt werden, dass der Transfektionserfolg der Plasmidtransfektion ausblieb, obwohl die Zellen einen gesunden Eindruck machten. Nur bei sehr geringen siRNA Mengen konnte eine geringe Menge des Reporterproteins detektiert werden.With repetitive Lipofektionsversuchen, where initially a Transfection with a specific targeted against a specific protein siRNA was performed and then a Plasmid transfection followed with a reporter gene was found that the transfection success of plasmid transfection did not occur, although the cells made a healthy impression. Only at very low siRNA levels could detect a small amount of the reporter protein become.
Um auszuschließen, dass es sich um einen OFF-Target-Effekt der spezifischen siRNA handelt, wurde der Versuch mit einer unspezifischen siRNA wiederholt, die gegen das humane Erbgut „geblastet" wurde. Das Ergebnis blieb jedoch dasselbe.Around exclude that it is an off-target effect the specific siRNA, the experiment was conducted with a nonspecific repeated siRNA, which "bred" against the human genome has been. The result, however, remained the same.
Da bekannt ist, dass auch die Proliferation der Zellen einen Einfluss bei der Lipofektion hat, wurde untersucht, ob die Zellen in Ihrem Proliferationsverhalten durch die Vortransfektion mit siRNA beeinträchtigt wurden. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Proliferationsraten bei höheren siRNA Mengen sinken, jedoch eine ausreichende Proliferation bei den Experimenten gegeben, war, als die der Vortransfektion folgende Plasmidtransfektion fehlschlug. Es schien, als ob die Zellen sich überraschenderweise gegen die zweite Transfektion wehren können.There It is known that the proliferation of cells also has an influence When lipofection has, it has been studied whether the cells in your Proliferation behavior affected by pre-transfection with siRNA were. It was found that the proliferation rates at higher siRNA levels decrease, but sufficient Proliferation was given in the experiments, than that of pre-transfection following plasmid transfection failed. It seemed as if the cells surprisingly against the second transfection can fight back.
Mit repetitiven Transfektionsversuchen, bei denen zwei Plasmidtransfektionen hintereinander geschaltet wurden, konnte ein ähnliches Ergebnis erhalten werden, wenn auch nicht mit der oben genannten Deutlichkeit. Der zweite Transfektionschritt war in der Regel entweder sehr ineffizient oder kontraproduktiv. Auch hier wurden ähnliche Untersuchungen, wie oben genannt, durchgeführt, um sicherzustellen, dass es sich nicht um toxische Effekte handelt. Es stellt sich daher die Aufgabe, die Transfektionseffizienz insbesondere bei wiederholter Transfektion zu steigern.With repetitive transfection experiments involving two plasmid transfections could be switched in a row, could a similar Result will be obtained, though not with the above Clarity. The second transfection step was usually either very inefficient or counterproductive. Also here were similar Investigations, as mentioned above, carried out to ensure that they are not toxic effects. It turns, therefore the task, the transfection efficiency, especially with repeated To increase transfection.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Steigerung der Transfektionseffizienz eines nicht viralen Genliefersystems gelöst, bei dem das nicht virale Genliefersystem insbesondere ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, ein kationisches Protein oder eine Verbindung umfasst, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und rezeptorvermittelte Endozytose auslösen kann, oder bei dem das nicht virale Genliefersystem insbesondere auf einer physikalischen Methode wie Elektroporation, Mikroinjektion, Ultraschall oder einer ballistischen oder hydrodynamischen Methode beruht, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene Immunabwehr verringert wird.These The object is achieved by a method to increase the transfection efficiency of a non-viral gene delivery system in which the non-viral gene delivery system in particular a cationic lipid, a cationic polymer, a cationic one Protein or a compound comprising a DNA and / or RNA-binding Domain and induce receptor-mediated endocytosis or in which the non-viral gene delivery system in particular on a physical method like electroporation, microinjection, Ultrasound or a ballistic or hydrodynamic method based, characterized in that the innate immune defense is reduced.
Das heißt, dass insbesondere die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade ausgehend von den TLRs, über die Adaptermoleküle, über die entsprechenden Kinasen, die die Transkriptionsfaktoren phosphorylieren, welche wiederum die Interferone induzieren, unterbrochen werden kann. Weiter kann die Signalübertragung durch Botenstoffe zwischen den Zellen unterbrochen werden. Da es sich dabei allesamt um Proteine handelt, werden erfindungsgemäß vorzugsweise aktivitätssteigernde oder aktivitätsmindernde Effektoren wie Antikörper, Aptamere, Antagonisten oder Inhibitoren gegen diese Proteine eingesetzt. Dabei können die entsprechenden Wirkstoffe als solches oder mit entsprechenden Hilfsmolekülen an oder in die Zellen verbracht werden, je nach Zellgängigkeit oder Zielort. So können z. B. Wirkstoffe über liposomale Carrier in die Endosomen verbracht werden. Ist der Zielort das Zytosol, bieten sich insbesondere Elektroporation oder spezielle Peptidsequenzen an, die in der Lage sind, die Zellwände zu permeabilisieren. Handelt es sich bei den Wirkstoffen um Peptide oder Proteine, so können diese erfindungsgemäß auch durch Transfektion geeigneten genetischen Materials intrazellulär gebildet werden und falls nötig mit Lokalisationssequenzen zu den entsprechenden Zellkompartimenten dirigiert werden. Will man über siRNA Gene stilllegen, die für entscheidende Proteine des Signatransduktionapparates kodieren, stehen erfindungsgemäß die bekannten Transfektionssysteme zur Verfügung. Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die erfindungsgemäße Verwendung kann sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden bzw. erfolgen.That is, in particular, the intracellular signal transduction cascade from the TLRs, via the adapter molecules, via the corresponding kinases that phosphorylate the transcription factors, which in turn induce the interferons, can be disrupted. Furthermore, the signal transmission through messenger substances between the cells can be interrupted. Since these are all proteins, preferably activity-increasing or activity-reducing effectors such as antibodies, aptamers, antagonists or inhibitors against these proteins are used according to the invention. In this case, the corresponding active ingredients can be spent as such or with appropriate auxiliary molecules on or in the cells, depending on cell permeability or destination. So z. B. agents are transported via liposomal carrier into the endosomes. If the target site is the cytosol, particular preference is given to electroporation or special peptide sequences capable of permeabilizing the cell walls. If the active substances are peptides or proteins, then according to the invention they can also be genetically modified by transfection material are formed intracellularly and, if necessary, with localization sequences to the appropriate cell compartments are directed. If one wishes to shut down siRNA genes which code for crucial proteins of the sign transduction apparatus, the known transfection systems are available according to the invention. The method according to the invention or the use according to the invention can be used or take place both in vitro and in vivo.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann z. B. mindestens einer der TLR3, 7, 8, 9, eine oder mehrere RIG-I Helikasen und/oder eine oder mehrere RIG-I-like Helikasen blockiert werden.at the process of the invention can, for. At least one of the TLR3, 7, 8, 9, one or more RIG-I helicases and / or one or more RIG-I-like helicases are blocked.
So sind Antikörper gegen die Toll Like Rezeptoren TLR7, TLR8 und TLR9 bekannt und kommerziell erhältlich. Diese könnten zusammen mit Endozytose auslösenden Lipo- oder Polyplexen als solche oder verpackt in Liposomen in die Endosomen geschleust werden und so die Rezeptoren blockieren. Auch gegen TLR3 ist ein Antikörper bekannt und kommerziell erhältlich. Da sich TLR3 nach bisherigen Erkenntnissen an der Oberfläche der Zellen befindet, reicht in diesem Fall eine Zugabe zum extrazellulären Raum. Die Wahl des zu blockierenden Rezeptors hängt erfindungsgemäß natürlich von der Art des zu transfizierenden genetischen Materials ab.So are antibodies against the Toll Like receptors TLR7, TLR8 and TLR9 are known and commercially available. These could together with endocytosis-inducing lipo- or polyplexes as such or packed in liposomes into the endosomes and so block the receptors. Also against TLR3 is a Antibodies are known and commercially available. As TLR3 according to previous findings on the surface the cells is in this case, an addition to the extracellular is sufficient Room. The choice of the receptor to be blocked of course depends on the invention on the type of genetic material to be transfected.
Aber
auch Inhibitoren bzw. Antagonisten für verschiedene TLRs
sind bekannt und werden erfindungsgemäß in bevorzugter
Weise eingesetzt. So hat man festgestellt, dass bestimmte DNA Sequenzen
viralen Ursprungs den TLR9 Rezeptor blockieren können (
Auch ist es möglich, durch Knock-down mit siRNA zumindest ein Gen auszuschalten, das für ein zur Signaltransduktion notwendiges Protein codiert.Also it is possible by knocking down with siRNA at least one Turn off the gene necessary for a signal transduction necessary Protein encoded.
Aber
auch Inhibitoren, die das wichtige Adaptermolekül MyD88
und/oder TRIF attackieren, sind bekannt und auch kommerziell erhältlich
und werden erfindungsgemäß in bevorzugter Weise
eingesetzt. So bietet die Firma IMGENEX (San Diego, USA) ein Peptid
an, das die zur Wirkung von MyD88 notwendige Homodimerisierung unterbindet.
Das dafür bevorzugte Peptidmotiv ist RDVLPGT (
Weiter kann die interzelluläre Signalweiterleitung erfindungsgemäß z. B. durch Antikörper oder Aptamere unterbrochen werden, die gegen Interferone oder deren Rezeptoren gerichtet sind. Entsprechende Antikörper sind wiederum kommerziell erhältlich.Further can the intercellular signal transmission according to the invention z. B. be interrupted by antibodies or aptamers, which are directed against interferons or their receptors. Appropriate Antibodies are in turn commercially available.
Erfindungsgemäß kann weiterhin zumindest eine der Kinasen IRF-Kinase TBK1, Phosphatidylinositol 3-Kinase, IRAK-1, IRAK-4, IKK-alpha oder PKR oder zumindest einer der Transkriptionsfaktoren IRF1, IRF3, IRF7, IRF9, IRF2, IRF4, IRF5, IRF6, IRF8, STAT1, STAT2, ISGF3 oder NF-kB blockiert werden.According to the invention at least one of the kinases IRF kinase TBK1, phosphatidylinositol 3-kinase, IRAK-1, IRAK-4, IKK-alpha or PKR or at least one of the transcription factors IRF1, IRF3, IRF7, IRF9, IRF2, IRF4, IRF5, IRF6, IRF8, STAT1, STAT2, ISGF3 or NF-KB blocked.
Auch ist es erfindungsgemäß möglich, zumindest ein Zytokin, zumindest einen Tumornekrosefaktor, zumindest ein Interleukin und/oder zumindest ein Interferon zu blockieren. Als zu blockierendes Interferon kommt zum Beispiel ein Interferon des Typs I, insbesondere ein Interferon–alpha oder Interferon-beta in Betracht.Also it is possible according to the invention, at least a cytokine, at least one tumor necrosis factor, at least one interleukin and / or block at least one interferon. As to be blocked Interferon comes, for example, an interferon type I, in particular an interferon-alpha or interferon-beta into consideration.
Auch kann zumindest ein Rezeptor für Zytokine oder zumindest ein Rezeptor für Interferone des Typs I blockiert werden.Also can be at least one receptor for cytokines or at least a receptor for type I interferons are blocked.
Erfindungsgemäß wird ferner eine Zusammensetzung bereitgestellt, die zumindest zwei der folgenden Komponenten umfasst:
- a) ein nicht virales Genliefersystem,
- b) einen Wirkstoff, und
- c) ein Mittel zur Verringerung der angeborenen Immunabwehr.
- a) a non-viral gene delivery system,
- b) an active substance, and
- c) a means of reducing innate immune defense.
Auch wird erfindungsgemäß ein Kit of Parts vorgesehen, der zumindest zwei der folgenden Komponenten umfasst:
- a) ein nicht virales Genliefersystem,
- b) einen Wirkstoff, und
- c) ein Mittel zur Verringerung der angeborenen Immunabwehr.
- a) a non-viral gene delivery system,
- b) an active substance, and
- c) a means of reducing innate immune defense.
Dabei umfasst das nicht virale Genliefersystem insbesondere ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, ein kationisches Protein und/oder eine Verbindung, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und rezeptorvermittelte Endozytose auslösen kann.there For example, the non-viral gene delivery system includes, in particular, a cationic one Lipid, a cationic polymer, a cationic protein and / or a compound having a DNA and / or RNA-binding domain and can induce receptor-mediated endocytosis.
Erfindungsgemäß kann als Wirkstoff, wie z. B. ein Wirkstoff zur Reparatur eines Gendefekts, z. B. genetisches Material wie modifizierte oder unmodifizierte ssDNA, modifizierte oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte oder unmodifizierte ssRNA, modifizierte oder unmodifizierte dsRNS und/oder modifizierte oder unmodifizierte siRNA eingesetzt werden.According to the invention as an active ingredient, such as. B. an agent for repairing a gene defect, z. B. genetic material such as modified or unmodified ssDNA, modified or unmodified dsDNA, modified or unmodified ssRNA, modified or unmodified dsRNA and / or modified or unmodified siRNA can be used.
Das Mittel zur Verringerung der angeborenen Immunabwehr kann einen aktivitätsmindernden oder aktivitätssteigernden Effektor, oder einen Antikörper, Intrabody, Aptamer, Antagonist, Inhibitor und/oder eine siRNA umfassen, wobei der Antikörper, Intrabody, Aptamer, Antagonist, Inhibitor und/oder die siRNA vorzugsweise zumindest eine Signaltransduktionskaskade des angeborenen Immunsystems blockiert.The Means for reducing innate immune defense can be an activity-reducing or activity-enhancing effector, or an antibody, Include intrabody, aptamer, antagonist, inhibitor and / or siRNA, wherein the antibody, intrabody, aptamer, antagonist, inhibitor and / or the siRNA preferably at least one signal transduction cascade of the innate immune system blocked.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Mittel zur Verringerung der angeborenen Immunabwehr die Rasensequenz TTAGGG.According to one particularly preferred embodiment comprises the agent to reduce the innate immune system the TTATGG.
Auch kann das Mittel zur Verringerung der angeborenen Immunabwehr genetisches Material umfassen, das einen Knock-down eines Proteins einer Signaltransduktionskaskade des angeborenen Immunsystems bewirkt oder das zur Expression eines Proteins führt, welches die Aktivität eines Proteins einer Signaltransduktionskaskade des angeborenen Immunsystems blockiert.Also may be the means of reducing the innate immunity genetic Material that involves a knockdown of a signal transduction cascade protein of the innate immune system causes or the expression of a Protein that performs the activity of a protein blocked a signal transduction cascade of the innate immune system.
Insbesondere kann ein Peptid mit dem Strukturmotiv RDVLPGT eingesetzt werden.Especially a peptide with the structural motif RDVLPGT can be used.
Insbesondere können die vorstehend genannten Komponenten auch jeweils einzeln oder zu mehreren eingesetzt werden: So können zwei, drei oder mehrere verschiedene Komponenten a) und/oder b) und/oder c) eingesetzt werden.Especially For example, the above-mentioned components may also be respectively be used individually or in groups: So two, three or more different components a) and / or b) and / or c) be used.
Bei dem erfindungsgemäßen Kit of Parts können:
- – alle Komponenten getrennt voneinander vorliegen, oder
- – die Komponenten a) und b) gemeinsam, oder
- – die Komponenten a) und c) gemeinsam, oder
- – die Komponenten b) und c) gemeinsam vorliegen.
- - all components are separate, or
- - Components a) and b) together, or
- - the components a) and c) together, or
- - The components b) and c) are present together.
So können die Komponenten entweder getrennt voneinander z. B. in Glas- oder Plastikbehälter vorliegen, die gemeinsam verpackt sind, oder die Komponenten können zu zweit oder zu mehreren in entsprechenden Behältern bereitgestellt werden.So The components can be separated from each other z. B. in glass or plastic container, which together are packaged, or the components can be twos or provided to several in respective containers become.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung und/oder der erfindungsgemäße Kit of Parts können zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden.The Composition according to the invention and / or the Kit of Parts according to the invention can for carrying out a method according to the invention Procedure can be used.
Erfindungsgemäß wird weiter die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder eines erfindungsgemäßen Kit of Parts zur Behandlung von einer durch einen Gendefekt ausgelösten Krankheit offenbart.According to the invention further the use of an inventive Composition or a kit according to the invention of Parts for the treatment of a gene defect Illness revealed.
Bei der Krankheit kann es sich z. B. um cystische Fibrose, Muskeldystrophie, Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie, Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel, Hypercholesterinämie, Hämophilie, β-Thalassämie, Krebs, eine Viruserkrankung, eine Degeneration der Macula, Amyotropische Lateral-Sklerose und/oder eine Entzündungserkrankung handeln.at the disease can be, for. Cystic fibrosis, muscular dystrophy, Phenylketonuria, maple syrup disease, propionic acidemia, Methylmalonic acidemia, adenosine deaminase deficiency, hypercholesterolemia, hemophilia, β-thalassemia, Cancer, a viral disease, degeneration of the macula, amyotrophic Act lateral sclerosis and / or an inflammatory disease.
Beispiel 1example 1
Material:Material:
- 1. Hela-Zellen1. Hela cells
- 2. Metafectene Pro, Lot AD 2, Biontex Laborstories GmbH2. Metafectene Pro, Lot AD 2, Biontex Laboratories
- 3. 24-Well-Platte, TPP, Produktnummer 920243. 24-well plate, TPP, product number 92024
- 4. DMEM, PAA, Kat-Nr. E15-8834. DMEM, PAA, cat. No. E15-883
- 5. FCS Mycoplex, PAA, Kat-Nr. E15-7735. FCS Mycoplex, PAA, cat. No. E15-773
- 6. pCMV-lacZ, Lot PF462-060207, Plasmidfactory, c = 1 mg/ml in WFI6. pCMV-lacZ, Lot PF462-060207, Plasmid Factory, c = 1 mg / ml in WFI
- 7. Sheep Polyclonal Antibody against human IFNβ, FBI Biomedical Laborstories, Product Number 31400-1, 0,25 mg/ml (estimate), 2 × 104 Units/ml.7. Sheep Polyclonal Antibody Against Human IFNβ, FBI Biomedical Laboratory Stories, Product Number 31400-1, 0.25 mg / ml (estimate), 2 × 10 4 units / ml.
- 8. β-Galaktosidase Assay Kit, Stratagene8. β-galactosidase assay kit, Stratagene
Detaillierte Versuchsbeschreibung:Detailed experimental description:
1. Tag:1 day:
Es werden HeLa Zellen in eine 24 Well Platte ausgesät. Dabei wird eine Zellzahl von 2,3·105 Zellen in ein Well in 500 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.HeLa cells are seeded in a 24 well plate. A cell count of 2.3 × 10 5 cells is plated out in a well in 500 μl of complete medium (10% FCS). It is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
2. Tag:2 day:
Zunächst
wird der Antikörper (Sheep Polyclonal Antibody against
human IFNβ) aufgetaut. Anschließend wird er mit
400 μl PBS (Phosphate Buffered Saline) versetzt und sanft
gemischt. Er hat jetzt eine Konzentration von 0,05 μg/μl.
Anschließend werden die Wells der 24 Well Platte mit folgenden
Mengen Antikörper versorgt:
Anschließend wird im Inkubator für 0,5 h inkubiert. Derweilen werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 26 μl DNA (pCMV-lacZ) in 1300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 104 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 1300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert.Subsequently is incubated in the incubator for 0.5 h. Meanwhile the lipoplexes produced. For this purpose, 26 .mu.l of DNA (pCMV-lacZ) pipetted into 1300 μl of PBS and gently boosted Pipette mixed. 104 μl of Metafectene Pro will also be added pipetted into 1300 μl PBS and gently opened and closed Pipette mixed. Now both solutions are mixed and incubated for 15 min.
Am Ende werden jeweils 100 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.At the end, 100 μl of the lipoplex solution are added to each well. It is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
3. Tag:3rd day:
Am dritten Tag wird das Medium der Zeilen C und D erneuert. Die Schritte Lipoplexherstellung und Transfektion werden für diese Zeilen wiederholt. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.On the third day, the medium of lines C and D is renewed. The steps of lipoplex production and transfection are repeated for these lines. It is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
4. Tag4th day
Reportergenassay:reporter gene:
Die Effizienz der Transfektion wird mit dem β-Galaktosidase Assay Kit nach Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Die Platten werden so lange entwickelt bis im Mikroplate-Reader eine Gelbfärbung mit einer Absorption von 1–2 gemessen wird und anschließend sofort gestoppt. Die Inkubationszeit wird anschließend notiert. Die Werte werden mit dem Mikroplate-Reader ausgelesen, βund der Mittelwert gebildet.The efficiency of the transfection is carried out with the β-galactosidase assay kit according to the manufacturer's instructions. The plates are developed as long as the microplate reader a yellowing with an Ab sorption of 1-2 is measured and then immediately stopped. The incubation period is then noted. The values are read out with the microplate reader, and the mean value is formed.
Ergebnis:Result:
- Inkubationszeit 9,5 minIncubation time 9.5 min
Mittelwert von 3 Messungen:
Die
Zeilen A und B stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Zeilen C und D stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
Beispiel 2Example 2
Material:Material:
- 1. Hela-Zellen1. Hela cells
- 2. Metafectene Pro, Lot AD 2, Biontex Laborstories GmbH2. Metafectene Pro, Lot AD 2, Biontex Laboratories
- 3. 24-Well-Platte, TPP, Produktnummer 920243. 24-well plate, TPP, product number 92024
- 4. DMEM, PAA, Kat-Nr. E15-8834. DMEM, PAA, cat. No. E15-883
- 5. FCS Mycoplex, PAA, Kat-Nr. E15-7735. FCS Mycoplex, PAA, cat. No. E15-773
- 6. pCMV-lacZ, Lot PF462-060207, Plasmidfactory, c = 1 mg/ml in WFI6. pCMV-lacZ, Lot PF462-060207, Plasmid Factory, c = 1 mg / ml in WFI
- 7. β-Galaktosidase Assay Kit, Stratagene7. β-galactosidase assay kit, Stratagene
- 8. Mouse monoclonal Antibody against Human Interferone Alpha/Beta Receptor Chain 2 (CD118), clone MMHAR-2, Isotype Ig2a, C = 0,5 mg/ml in PBS (Phosphat buffered saline) containing 0,1% bovine serum albumin (BSA), PBL Biomedical Laborstories, Product-No: 213858. Mouse monoclonal antibody against human interferons alpha / beta Receptor Chain 2 (CD118), clone MMHAR-2, Isotype Ig2a, C = 0.5 mg / ml in phosphate buffered saline (PBS) containing 0.1% bovine serum albumin (BSA), PBL Biomedical Laboratory Stories, Product-No: 21385
Detaillierte Versuchsbeschreibung:Detailed experimental description:
1. Tag:1 day:
Es werden HeLa Zellen in eine 24 Well Platte ausgesäht. Dabei wird eine Zellzahl von 2,3·105 Zellen in ein Well in 500 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.HeLa cells are sown in a 24 well plate. In this case, a cell count of 2.3 x 10 5 cells were plated (10% FCS) in a well in 500 ul complete medium. It is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
2. Tag:2 day:
Zunächst
wird der Antikörper (Mouse monoclonal Antibody against
Human Interferone Alpha/Beta Receptor Chain) aufgetaut. Anschließend
wird er mit 400 μl PBS (Phosphate Buffered Saline) versetzt
und sanft gemischt. Er hat jetzt eine Konzentration von 0,1 μg/μl.
Anschließend werden die Wells der 24 Well Platte mit folgenden
Mengen Antikörper versorgt:
Anschließend wird im Inkubator für 5 h inkubiert.Subsequently is incubated in the incubator for 5 h.
Darauf folgend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 26 μl DNA (pCMV-lacZ) in 1300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 104 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 1300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Anschließend werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert. Am Ende werden jeweils 100 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.Subsequently, the lipoplexes are prepared. For this purpose, 26 μl of DNA (pCMV-lacZ) are pipetted into 1300 μl PBS and mixed by gently pipetting up and down. 104 μl Metafectene Pro are also pipetted into 1300 μl PBS and mixed by gently pipetting up and down. Subsequently, both solutions are mixed and incubated for 15 min. At the end, 100 μl of the lipoplex solution are added to each well. It is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
3. Tag:3rd day:
Am dritten Tag wird das Medium der Zeilen C und D erneuert. Die Schritte Lipoplexherstellung und Transfektion werden für diese Zeilen wiederholt.At the third day, the medium of lines C and D is renewed. The steps Lipoplex preparation and transfection are used for these lines repeated.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.It is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
4. Tag4th day
Reportergenassay:reporter gene:
Die Effizienz der Transfektion wird mit dem β-Galaktosidase Assay Kit nach Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Die Platten werden so lange entwickelt bis im Microplate-Reader eine Gelbfärbung mit einer Absorption von 1–2 gemessen wird und anschließend sofort gestoppt. Die Inkubationszeit wird anschließend notiert. Die Werte werden mit dem Mikroplate-Reader ausgelesen, und der Mittelwert gebildet.The Efficiency of transfection is enhanced with the β-galactosidase Assay kit according to manufacturer's instructions. The Plates are developed until the microplate reader Yellow staining measured with an absorbance of 1-2 and then stopped immediately. The incubation period is then noted. The values are with the microplate reader read out, and the mean value formed.
Ergebnis:Result:
- Inkubationszeit: 4minIncubation period: 4min
Mittelwert von 3 Messungen:
Die
Zeilen A und B stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Zeilen C und D stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
Beispiel 3Example 3
Material:Material:
- 1. Hela-Zellen1. Hela cells
- 2. Metafectene Pro, Lot AD 2, Biontex Laborstories GmbH2. Metafectene Pro, Lot AD 2, Biontex Laboratories
- 3. 24-Well-Platte, TPP, Produktnummer 920243. 24-well plate, TPP, product number 92024
- 4. DMEM, PAA, Kat-Nr. E15-8834. DMEM, PAA, cat. No. E15-883
- 5. FCS Mycoplex, PAA, Kat-Nr. E15-7735. FCS Mycoplex, PAA, cat. No. E15-773
- 6. pCMV-lacZ, Lot PF462-060207, Plasmidfactory, c = 1 mg/ml in WFI6. pCMV-lacZ, Lot PF462-060207, Plasmid Factory, c = 1 mg / ml in WFI
- 7. β-Galaktosidase Assay Kit, Stratagene7. β-galactosidase assay kit, Stratagene
- 8. ODN (Full PTO = Phosphothioatoligo): Seq.: 5'TTT AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G-3'; 0,2 μmol synthesis scale, Purification: HPLC + NAP, lyophilisiert, 213,8 μg; TLR9 Antagonist8. ODN (Full PTO = Phosphothioatoligo): Seq .: 5'TTT AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G-3 '; 0.2 μmol synthesis scale, Purification: HPLC + NAP, lyophilized, 213.8 μg; TLR9 antagonist
Detaillierte Versuchsbeschreibung:Detailed experimental description:
1. Tag:1 day:
Es werden HeLa Zellen in eine 24 Well Platte ausgesäht. Dabei wird eine Zellzahl von 2,3·105 Zellen in ein Well in 500 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.HeLa cells are sown in a 24 well plate. A cell count of 2.3 × 10 5 cells is plated out in a well in 500 μl of complete medium (10% FCS). It is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
2. Tag:2 day:
Zunächst wird der TLR9 Antagonist (ODN). Anschließend wird es in 956 μl sterilem bidest Wasser gelöst. Er hat jetzt eine Konzentration von 0,25 μg/μl.First becomes the TLR9 antagonist (ODN). Then it will be in Dissolve 956 μl sterile redistilled water. He has now a concentration of 0.25 μg / μl.
Lipoplexherstellung:lipoplexes:
Lipoplexe
folgender Zusammensetzung werden für die Zellen der jeweiligen
Wells der 24 Well Platte mit den Zellen hergestellt (DNA= pCMV-LacZ;
ODN= TLR9 Antagonist):
Die DNA für jedes Well wird in 100 μl PBS gelöst und die entsprechende Menge ODN zupipettiert und gemischt. Anschließend werden die entsprechenden Mengen Metafectene Pro zupipettiert und nochmals gemischt. Danach wird für 15 min inkubiert und die Lipoplexe auf die Zellen in den korrespondierenden Wells gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.The DNA for each well is dissolved in 100 μl of PBS and the appropriate amount of ODN is pipetted in and mixed. The appropriate amounts of Metafectene Pro are then pipetted in and mixed again. It is then incubated for 15 min and the lipoplexes are added to the cells in the corresponding wells. It is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
3. Tag:3rd day:
Am dritten Tag wird das Medium der Zeilen C und D erneuert. Die Schritte Lipoplexherstellung und Transfektion werden für diese Zeilen wiederholt. Des Weiteren werden bei den Zeilen A und B je 500 μl Medium in die Wells hinzugegeben.At the third day, the medium of lines C and D is renewed. The steps Lipoplex preparation and transfection are used for these lines repeated. Furthermore, in the case of lines A and B 500 μl each Medium added to the wells.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.It is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
4. Tag4th day
Reportergenassay:reporter gene:
Die Effizienz der Transfektion wird mit dem β-Galaktosidase Assay Kit nach Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Die Platten werden so lange entwickelt bis im Microplate-Reader eine Gelbfärbung mit einer Absorption von 1–2 gemessen wird und anschließend sofort gestoppt. Die Inkubationszeit wird anschließend notiert. Die Werte werden mit dem Mikroplate-Reader ausgelesen, und der Mittelwert gebildet.The Efficiency of transfection is enhanced with the β-galactosidase Assay kit according to manufacturer's instructions. The Plates are developed until the microplate reader Yellow staining measured with an absorbance of 1-2 and then stopped immediately. The incubation period is then noted. The values are with the microplate reader read out, and the mean value formed.
Ergebnis:Result:
- Inkubationszeit: 80 minIncubation time: 80 min
Mittelwert von 3 Messungen:
Die
Zeilen A und B stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Zeilen C und D stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
Beispiel 4Example 4
Der TLR7, 8 und 9 detektieren fremde RNA oder DNA in den Endosomen. Auf deren cytosolischer Seite bindet das Adaptermolekül MyD88. Dieses Protein besteht aus zwei Proteinketten, die durch Homodimerierung das biologisch aktive Adaptormolekül bilden. Peptide mit dem Sequenzmotiv RDVLPGT verhindern diese Homodimerisierung, indem sie selbst an die Monomeren binden. Diese Peptide sind allerdings in der Regel nicht zellgängig. Sie können aber mit einer „Protein transduction sequence" (PTO) versehen werden. Eine solche Sequenz ist z. B. DRQIKIWFQNRRMKWKK. Das komplette Peptid ist damit in der Lage in Zellen einzudringen und die Signaltransduktion der TLRs zu unterbindet. Ein solches komplettes Peptid wird von der Firma Imgenex kommerziell angeboten.Of the TLR7, 8 and 9 detect foreign RNA or DNA in the endosomes. On the cytosolic side of the adapter molecule binds MyD88. This protein consists of two protein chains, through Homodimerization form the biologically active adapter molecule. Peptides with the sequence motif RDVLPGT prevent this homodimerization, by themselves binding to the monomers. These peptides are, however usually not cell-like. But you can provided with a "protein transduction sequence" (PTO) become. Such a sequence is z. B. DRQIKIWFQNRRMKWKK. The complete Peptide is thus able to penetrate cells and signal transduction TLRs to stop. Such a complete peptide is used by the company Imgenex commercially offered.
Material:Material:
- 9. Hela-Zellen9. Hela cells
- 10. Metafectene Pro, Lot AD 2, Biontex Laborstories GmbH10. Metafectene Pro, Lot AD 2, Biontex Laboratories
- 11. 24-Well-Platte, TPP, Produktnummer 9202411. 24-well plate, TPP, product number 92024
- 12. DMEM, PAA, Kat-Nr. E15-88312. DMEM, PAA, cat. No. E15-883
- 13. FCS Mycoplex, PAA, Kat-Nr. E15-77313. FCS Mycoplex, PAA, cat. No. E15-773
- 14. pCMV-lacZ, Lot FF462-060207, Plasmidfactory, c = 1 mg/ml in WFI14. pCMV-lacZ, Lot FF462-060207, plasmid factory, c = 1 mg / ml in WFI
- 15. β-Galaktosidase Assay Kit, Stratagene15. β-galactosidase assay kit, Stratagene
- 16. Imgenex, MyD88 homodimerisation Inhibitory Peptide Set, Product Nr. IMG, 2005-1, 2 mg, lyophilisiert, MW 3100, Sequence: DRQIKIWFQNRRMKWKK RDVLPGT16. Imgenex, MyD88 Homodimerization Inhibitory Peptide Set, Product No. IMG, 2005-1, 2 mg, lyophilized, MW 3100, Sequence: DRQIKIWFQNRRMKWKK RDVLPGT
Detaillierte Versuchsbeschreibung:Detailed experimental description:
1. Tag:1 day:
Es werden HeLa Zellen in eine 24 Well Platte ausgesäht. Dabei wird eine Zellzahl von 1,5·105 Zellen in ein Well in 200 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.HeLa cells are sown in a 24 well plate. In this case, a cell count of 1.5 × 10 5 cells is plated in a well in 200 μl of complete medium (10% FCS). It is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
Vorbereiten des Inhibitors:Preparing the inhibitor:
Von dem MyD88-Homodimerisation-Inhibitor Peptid wird, den Angaben des Herstellers folgend, eine 5 mM Lösung in PBS hergestellt.From the MyD88 homodimerization inhibitor peptide becomes the data of the Following the manufacturer, prepared a 5 mM solution in PBS.
Anschließend
werden die Wells mit folgenden Mengen Inhibitor versorgt, um die
entsprechenden Konzentrationen einzustellen:
Anschließend wird für 24 h im CO2-Inkubator (10%) inkubiert.It is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
2. Tag:2 day:
Zuerst werden 3 μl komplettes Medium zu jedem Well gegeben.First Add 3 μl of complete medium to each well.
Darauf folgend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 13 μl DNA (pCMV-lacZ) in 650 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 52 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 650 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Anschließend werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert. Am Ende werden jeweils 100 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.Subsequently, the lipoplexes are prepared. For this purpose, 13 μl of DNA (pCMV-lacZ) are pipetted into 650 μl PBS and mixed by gently pipetting up and down. 52 μl Metafectene Pro are also pipetted into 650 μl PBS and mixed by gently pipetting up and down. Subsequently, both solutions are mixed and incubated for 15 min. At the end, 100 μl of the lipoplex solution are added to each well. Followed by 24 h in a CO 2 incubator (10%) is incubated.
4. Tag4th day
Reportergenassay:reporter gene:
Die Effizienz der Transfektion wird mit dem β-Galaktosidase Assay Kit nach Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Die Platten werden so lange entwickelt bis im Microplate-Reader eine Gelbfärbung mit einer Absorption von 1–2 gemessen wird und anschließend sofort gestoppt. Die Inkubationszeit wird anschließend notiert. Die Werte werden mit dem Mikroplate-Reader ausgelesen und der Mittelwert gebildet.
- Ergebnis: Inkubationszeit: 4 min
- Result: incubation time: 4 min
Mittelwert aller 3 Messungen:
Wie bereits ausgeführt, kann die Erfindung zu Therapiezwecken eingesetzt werden. Insbesondere kann die Erfindung für die Gentherapie von zum Beispiel Cystischer Fibrose, Muskeldystrophie, Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie, Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel und Hypercholesterinämie, Hämophilie, β-Thalassämie genutzt werden. Gentherapeutische Behandlungsmethoden sind weiters interessant, wenn Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytotoxine oder immunomodulierend wirkende Proteine im Organismus synthetisiert werden sollen. Für die oben genannten Zwecke können DNA-Fragmente mittels der Erfindung hocheffektiv in Zellen gebracht werden, in denen diese DNA die gewünschte Wirkung entfalten soll. Die gewünschte Wirkung kann der Ersatz fehlender oder defekter DNA-Bereiche oder die Inhibition von DNA-Bereichen (zum Beispiel durch Antisense-DNA/RNA oder siRNA), die die Erkrankung auslösen, im erkrankten Zelltyp sein. Auf diese Weise können z. B. tumorunterdrückende Gene in der Krebs-Therapie eingesetzt werden oder durch die Einführung cholesterolregulierender Gene ein Beitrag zur Vorbeugung von Herz- und Blutgefäßkrankheiten geleistet werden. Weiters kann DNA, welche Ribozyme, siRNA oder shRNA kodiert, oder Ribozyme oder siRNA selbst in erkrankte Zellen eingeschleust werden. Die Translation jener DNA erzeugt aktive Ribozyme oder siRNA, die an spezifischen Stellen m-RNA katalytisch spalten und auf diese Weise die Transkription verhindern. Auf diese Weise kann zum Beispiel virale m-RNA gespalten werden, ohne eine andere zelluläre m-RNA in Mitleidenschaft zu ziehen. Der Vermehrungszyklus von Viren (HIV, Herpes, Hepatitis B und C, respiratorisches Syncytial Virus) kann auf diesem Wege unterbrochen werden. Weitere Erkrankungen, die speziell über die Behandlung mit siRNA geheilt werden sollen sind die altersbedingte Degeneration der Macula (Augenerkrankung), Leberkrebs, solide Tumoren, Amyotropische Lateral-Sklerose und Entzündungserkrankungen sind derzeit im Focus klinischer Studien.As already stated, the invention for therapeutic purposes be used. In particular, the invention for the gene therapy of, for example, cystic fibrosis, muscular dystrophy, Phenylketonuria, maple syrup disease, propionic acidemia, Methylmalonic acidemia, adenosine deaminase deficiency and hypercholesterolemia, Hemophilia, β-thalassemia can be used. Gentherapeutic treatment methods are also interesting, when hormones, growth factors, cytotoxins or immunomodulatory acting proteins in the organism to be synthesized. For The purposes mentioned above can be DNA fragments by means of the invention be brought highly effective in cells in which these DNA should develop the desired effect. The desired Effect can be the replacement of missing or defective DNA areas or the inhibition of DNA regions (for example by antisense DNA / RNA or siRNA) that cause the disease in the diseased Be cell type. In this way, for. B. tumor suppressive Genes used in cancer therapy or by the introduction cholesterol-regulating genes contribute to the prevention of heart disease. and blood vessel diseases. Furthermore, may encode DNA, which ribozymes, siRNA or shRNA, or ribozymes or siRNA itself be introduced into diseased cells. The Translation of that DNA generates active ribozymes or siRNA that binds to specifically cleave m-RNA catalytically and in this way prevent transcription. That way, for example viral mRNA can be cleaved without any other cellular affect m-RNA. The multiplication cycle of viruses (HIV, Herpes, Hepatitis B and C, Respiratory Syncytial Virus) can be interrupted in this way. Other diseases, which are specifically cured by treatment with siRNA are the age-related degeneration of the macula (eye disease), Liver cancer, solid tumors, amyotrophic lateral sclerosis and inflammatory diseases are currently in the focus of clinical trials.
Auch in der Krebstherapie spielt Transfektion zur Herstellung von Krebsvakzinen eine immer größer werdende Rolle. Damit ist jene auch mögliches Anwendungsgebiet für die Erfindung.Also In cancer therapy, transfection plays a role in the production of cancer vaccines an ever-increasing role. With that is that also possible field of application for the invention.
Eine weitere Anwendung kann die Erfindung zum Beispiel in Impfverfahren finden, die auf der Basis der Expression von DNA, welche immunogene Peptide kodiert, im Körper von Mensch und Tier funktionieren. Dazu werden z. B. Lipid/DNA-Komplexe als Impfstoffe benutzt. Die Einschleusung der DNA in die Körperzellen führt zur Expression des immunogenen Peptids und löst somit die adaptive Immunantwort aus.A the invention can be used further, for example, in vaccination processes find, based on the expression of DNA, which immunogenic Peptides encoded in the body of humans and animals work. To be z. B. lipid / DNA complexes used as vaccines. The infiltration DNA into body cells leads to expression of the immunogenic peptide and thus triggers the adaptive immune response out.
Im folgenden werden erfindungsgemäß beispielhafte, aber keinesfalls beschränkende Definitionen aufgeführt:in the The following are exemplary according to the invention, but by no means limiting definitions:
Transfektion:transfection:
Einschleusen von genetischem Material in eukariotische Zellen.infiltrate of genetic material into eukaryotic cells.
Transfektionseffizienztransfection
Menge einer Proteinexpression einer Zellpopulation in Folge von Transfektionsprozessen mit genetischem Material, welches unter anderem dieses exprimierte Protein codiert oder Ausmaß eines Knock-downs einer Proteinexpression einer Zellpopulation in Folge von Transfektionsprozessen mit genetischem Material, welches einen solchen Knock-Down auslösen kann, insbesondere siRNA oder Ribozyme oder DNA, die für shRNA oder Ribozyme codiert oder Anteil der Zellen einer Gesamtpopulation von Zellen, die die biologische Wirksamkeit des eingeschleusten genetischen Materials in Folge von Transfektionsprozessen zeigt.amount protein expression of a cell population as a result of transfection processes with genetic material, which among other things expressed this Protein encoded or extent of knockdown of protein expression a cell population as a result of transfection processes with genetic Material that can trigger such a knock-down, in particular siRNA or ribozymes or DNA coding for shRNA or ribozyme encodes or proportion of cells of a total population of cells that infiltrated the biological efficacy of the genetic material as a result of transfection processes.
Nicht virales Genliefersystem:Non-viral gene delivery system:
Nicht virale Genliefersysteme werden nicht durch Rekombination genetischen Materials von natürlich vorkommenden Viren erzeugt. Sie sind in der Lage genetisches Material in eukariotische Zellen einzuschleusen. Insbesondere handelt es sich bei den nicht viralen Genliefersystemen um physikalische Methoden und chemische Methoden. Physikalische Methoden lokalisieren mindestens das genetische Material in der Nähe der Zelle, insbesondere nutzen physikalische Verfahren jedoch Energiezufuhr insbesondere in Form von thermischer, kinetischer, elektrischer oder sonstiger Energie um einen Transport des genetischen Materials durch die Zellmembran zu vermitteln. Chemische Methoden beruhen entweder auf einer chemischen Veränderung oder Derivatisierung der Nukleinsäuren, die sie insbesondere zellgängig machen oder bestehen insbesondere aus Stoffen, die DNA binden und einen Transport durch die Zellmembran vermitteln können. Insbesondere nutzen diese zur Bindung der Nukleinsäuren elektrostatische Kräfte oder Wasserstoffbrückenbindungen. Wiederum insbesondere geschieht der Transport der DNA durch die Zellmembran durch einen aktiven Transportmechanismus der Zelle, der Endozytose. Stoffe, die diese Eigenschaften aufweisen enthalten insbesondere kationische Lipide, kationische Polymere, kationische Peptide oder auch Moleküle die eine Domäne haben, die DNA oder RNA binden kann und zugleich eine zweite Domäne haben, die eine Liganden enthält, der von einem Rezeptor auch der Zelloberfläche erkannt wird und durch diesen Erkennungsprozess Endozytose auslöst. Die Stoffe können auch besonders formuliert sein, insbesondere als Micellen oder Liposomen und auch aus mehreren Komponenten insbesondere mit unterschiedlicher Funktion bestehen.Non-viral gene delivery systems are not produced by recombination of genetic material from naturally occurring viruses. They are able to infect genetic material into eukaryotic cells. In particular, the non-viral gene delivery systems are physical methods and chemical methods. Physical methods locate at least the genetic material in the vicinity of the cell, but in particular physical methods use energy input, in particular in the form of thermal, kinetic, electrical or other energy to mediate transport of the genetic material through the cell membrane. Chemical methods are based either on a chemical modification or derivatization of the nucleic acids, which in particular make them cell-permeable, or consist in particular of substances which bind DNA and can mediate transport through the cell membrane. In particular, these use electrostatic forces or hydrogen bonds to bind the nucleic acids. Again, in particular, the transport of DNA through the cell membrane occurs through an active transport mechanism of the cell, endocytosis. Substances which exhibit these properties contain, in particular, cationic lipids, cationic polymers, cationic peptides or also molecules which have a domain which DNA or RNA can bind and at the same time have a second domain containing a ligand, which is recognized by a receptor of the cell surface and triggers endocytosis by this recognition process. The substances can also be specially formulated, in particular as micelles or liposomes and also consist of several components, in particular with different functions.
GentherapieGene Therapy
Therapie zur Heilung oder Linderung von Krankheiten bei der als Wirkstoff modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren eingesetzt werden.therapy to cure or alleviate disease when used as an active ingredient modified or unmodified nucleic acids used become.
Angeborene ImmunabwehrInnate immune defense
Die angeborene Immunabwehr grenzt sich von der erworbenen oder adaptiven Immunabwehr dahingehen ab, dass sie einen Erreger abwehrt, ohne dass es vorher jemals zu einem Kontakt mit dem Erreger gekommen sein muss. Die angeborene Immunabwehr ist den meisten Zelltypen zu eigen und nutzt die Erkennung von Pathogenen zuzuordnenden molekularen Strukturen durch Rezeptoren. Diese Rezeptoren stoßen insbesondere Signaltransduktionskaskaden an, die insbesondere durch Expression vieler zelleigener Gene in einem „antiviralen Status" der Zellen münden. Weiters ist das Auslösen eines „Antiviralen Status" in anderen, insbesondere benachbarten Zellen durch Botenstoffe (insbesondere Zytokine), die wiederum an Rezeptoren der anderen Zellen andocken und wiederum eine Signaltransduktionskaskade auslösen, Bestandteil der angeborenen Immunabwehr.The innate immune defense is different from the acquired or adaptive Immune defense depart from the fact that it fends off a pathogen, without that it had ever come to a contact with the pathogen before have to be. The innate immune system is the most common type of cell owns and uses the recognition of pathogens attributable molecular Structures through receptors. In particular, these receptors collide Signal transduction cascades, in particular by expression Many cellular genes in an "antiviral status" of the Cells open. Furthermore, the triggering of an "antiviral Status "in other, especially neighboring cells by messengers (especially cytokines), which in turn respond to receptors of others Dock cells and in turn trigger a signal transduction cascade, Part of the innate immune system.
Antiviraler StatusAntiviral status
Status von Zellen, der sich dadurch auszeichnet, dass die Zelle versucht die mögliche biologische Wirksamkeit von fremden genetischem Material durch Gegenmaßnahmen zu unterbinden.status of cells characterized by the cell trying the potential biological effectiveness of foreign genetic To prevent material by countermeasures.
Transfektion in vivoTransfection in vivo
Das Einschleusen von genetischem Material in eukariotische Zellen findet in einem lebenden Organismus statt.The Introducing genetic material into eukaryotic cells in a living organism.
Transfektion in vitroTransfection in vitro
Das Einschleusen von genetischem Material in eukariotische Zellen findet außerhalb eines lebenden Organismus statt, insbesondere in Gefäßen, die sich zur Kultivierung von eukariotischen Zellen eignen.The Introducing genetic material into eukaryotic cells outside of a living organism, in particular in vessels that are used for the cultivation of eukaryotic Cells are suitable.
Genetisches MaterialGenetic material
Nukleinsäuren, insbesondere Ribonukleinsäuren oder Desoxyribonukleinsäuren, die insbesondere aus zwei wenigstens teilweise komplementären Strängen (doppelsträngig = ds) bestehen z. B. dsDNA und dsRNA, oder die insbesondere aus einem Strang (einzelsträngig = ss) besteht, z. B. ssDNA und ssRNA, der teilweise komplentäre Bereiche aufweisen kann, die über Wasserstoffbrückenbindung miteinander verbunden sein können.nucleic acids, in particular ribonucleic acids or deoxyribonucleic acids, in particular of two at least partially complementary Strands (double-stranded = ds) exist z. B. dsDNA and dsRNA, or in particular from one strand (single-stranded = ss), z. B. ssDNA and ssRNA, which is partially complementary May have regions that are via hydrogen bonding can be connected to each other.
Modifiziertes genetisches MaterialModified genetic material
Natürliche Nukleinsäuren die durch Modifikation in ihren Eigenschaften verändert wurden. Dabei können diese Modifikationen insbesondere chemische Veränderungen sein, die insbesondere das Phaphatgerüst, die Zucker oder Basen betreffen, was insbesondere die Stabilität der Nukleinsäuren gegen Nukleasen und Ribonukleasen erhöhen soll. Weiters können Moleküle (Labels) an die Nukleinsäuren kovalent oder nicht-kovalent angeheftet werden, die zu neuen Eigenschaften der Nukleinsäuren führen, insbesondere zu optischer Verfolgbarkeit durch Fluoreszenzlabels oder Labels, die die Nukleinsäuren zu einen bestimmen Ort in der Zelle dirigieren (Lokalisationselemente) oder Labels, die den Durchtritt von Nukleinsäuren durch Membranen vermitteln und so Nukleinsäuren beispielsweise zellgängig machen.natural Nucleic acids by modification in their properties were changed. These modifications can be made In particular, be chemical changes, in particular the phakat framework that affects sugar or bases, what in particular the stability of the nucleic acids against nucleases and ribonucleases. Furthermore, can molecules (labels) to the nucleic acids covalently or non-covalently attached to new properties the nucleic acids lead, in particular to optical Traceability through fluorescent labels or labels containing the nucleic acids to direct to a certain place in the cell (localization elements) or labels that detect the passage of nucleic acids through Communicate membranes and so nucleic acids, for example make it cell-like.
siRNA (short interfering RNA):siRNA (short interfering RNA):
Kurze dsRNA (bis 28 bp) die durch RNA-Interferenz den Knock-Down eines Proteins bewirken kann.short dsRNA (up to 28 bp) knocked down by RNA interference Can cause protein.
shRNA (short hairpin RNA):shRNA (short hairpin RNA):
Kurze ssRNA, die am 3'-Ende und am 5'-Ende komplementäre Bereiche besitzt und dadurch über Wasserstoffbrückenbindung hybridisieren kann und eine Haarnadelstruktur ausbilden kann. shRNA kann durch RNA-Interferenz den Knock-Down eines Proteins bewirken.short ssRNA, the 3'-end and the 5'-end complementary regions owns and thereby over hydrogen bond can hybridize and form a hairpin structure. shRNA can cause the knock-down of a protein by RNA interference.
Rezeptor:Receptor:
Molekül, das in der Lage ist einen Stoff zu detektieren und damit eine biologische Reaktion auslöst, Insbesondere handelt es sich bei Rezeptoren um Proteine.Molecule, which is able to detect a substance and thus a biological Reaction triggers, in particular, are receptors to proteins.
Blockierung:Blocking:
Verhinderung der biologischen Funktion, insbesondere von Proteinen.prevention the biological function, in particular of proteins.
DNA/RNA-bindende Domäne:DNA / RNA binding domain:
Bereich in einem Molekül das DNA kovalent oder über nicht kovalente Wechselwirkungen gebunden trägt, insbesondere sind die nicht kovalenten Wechselwirkungen elektrostatische Kräfte und Wasserstoffbrückenbindungen.Area in a molecule, the DNA is covalent or not carries covalent interactions bound, in particular are the non-covalent interactions electrostatic forces and hydrogen bonds.
Signaltransduktionskaskadesignal transduction
Ausgehend von einem Rezeptor, der die Anwesenheit eines Stoffes durch Anlagerung dieses Stoffes an den Rezeptor detektiert, wird die Information über die Anwesenheit dieses Stoffes in ein Signal umgewandelt und über eine Kette von Molekülen durch Signaltransduktion weitergetragen. Am Ende steht eine biologische Reaktion. Insbesondere wird das durch den Rezeptor erzeugte Signal von Adaptermolekülen aufgenommen und insbesondere über Kinasen insbesondere an Transkriptionsfaktoren weitergetragen. Die Transkriptionsfaktoren stimulieren die Expression von Genen, die die biologische Reaktion vermitteln.outgoing from a receptor, the presence of a substance by attachment This substance is detected at the receptor, the information is transmitted via the presence of this substance is converted into a signal and over a chain of molecules carried by signal transduction. At the end there is a biological reaction. In particular, this is through The signal generated by receptor molecules of adapter molecules and in particular via kinases, in particular to transcription factors carried on. The transcription factors stimulate expression of genes that mediate the biological response.
Knock-downKnock-down
Abschwächung oder Ausschaltung der Expression eines Gens.attenuation or elimination of the expression of a gene.
Antikörperantibody
Moleküle, insbesondere Proteine, die in der Lage sind molekulare Strukturen, insbesondere andere Proteine, zu erkennen und durch Bindung dessen biologische Wirkung beeinflussen.molecules especially proteins that are capable of molecular structures, especially other proteins, to recognize and by binding of it affect biological effect.
Intrabodiesintrabodies
Intrazellular exprimierte Antikörper.intracellularly expressed antibodies.
Aptamereaptamers
RNA-Moleküle, die durch Ausbildung einer Tertiärstruktur in der Lage sind molekulare Strukturen, insbesondere Proteine, ähnlich einem Antikörper zu erkennen und durch Bindung dessen biologische Wirkung beeinflussen. Aptamere können aus modifizierter oder unmodifizierter RNA bestehen.RNA molecules, able by training a tertiary structure are similar to molecular structures, especially proteins to recognize an antibody and by binding its biological Influence effect. Aptamers can be modified from or unmodified RNA.
Antagonistantagonist
Substanz, die einen Agonisten durch Blockierung eines entsprechenden Rezeptors in seiner Wirkung hemmt, ohne selbst einen Effekt auszulösen. Ein Agonist ist im Gegenzug in der Lage durch Bindung an einen Rezeptor eine biologische Wirkung zu erzielen.Substance, the one agonist by blocking a corresponding receptor inhibits its effect without triggering an effect itself. In turn, an agonist is capable of binding to a receptor to achieve a biological effect.
Inhibitoreninhibitors
Moleküle, die die biologische Wirkung eines anderen Moleküls, insbesondere von Proteinen inhibieren können. Insbesondere sind die Inhibitoren selbst Proteine, modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren oder kleine organische Moleküle.molecules the biological effect of another molecule, in particular of proteins. In particular, the Inhibitors themselves proteins, modified or unmodified nucleic acids or small organic molecules.
TLRs, RIG-I-Helikase, RIG-I-like HelikaseTLRs, RIG-I helicase, RIG-I-like helicase
Rezeptoren die speziesübergreifend in Gruppen nach ihrer Funktion zusammengefasst werden.receptors cross-species in groups according to their function be summarized.
Adaptermoleküleadapter molecules
Moleküle die ein Signal von Rezeptoren übernehmen und die speziesübergreifend in Gruppen nach ihrer Funktion zusammengefasst werden.molecules who take a signal from receptors and cross-species be summarized in groups according to their function.
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Zitierte PatentliteraturCited patent literature
- - EP 388758 [0032] - EP 388758 [0032]
- - WO 9602655 [0032] WO 9602655 [0032]
- - WO 9502397 [0032] WO 9502397 [0032]
- - WO 9715680 [0032] WO 9715680 [0032]
- - US 4946787 [0034] US 4946787 [0034]
- - EP 394111 [0034] - EP 394111 [0034]
- - WO 9405624 [0034] WO 9405624 [0034]
- - WO 97002419 [0034] - WO 97002419 [0034]
- - US 5264618 [0034] US 5264618 [0034]
- - WO 9640067 [0034] WO 9640067 [0034]
- - US 6008038 [0041] - US 6008038 [0041]
- - US 4750100 [0041] US 4750100 [0041]
- - US 5869326 [0041] - US 5869326 [0041]
Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature
- - Luke A. et al.; Spektrum der Wissenschaft, August 2005, Seiten 68–75 [0001] Luke A. et al .; Spectrum of Science, August 2005, pages 68-75 [0001]
- - Heine H. et al.; Int. Arch. Allergy Immunol. 2003; 130; 180–192 [0003] Heine H. et al .; Int. Arch. Allergy Immunol. 2003; 130; 180-192 [0003]
- - Uematsu S. et al., J. Biol. Chem. 2007, May 25; 282 (21); 15319–23) [0003] Uematsu S. et al., J. Biol. Chem. 2007, May 25; 282 (21); 15319-23) [0003]
- - Perry A. K. et al; Cell Research 2005; 15 (6); 407–422 [0004] - Perry AK et al; Cell Research 2005; 15 (6); 407-422 [0004]
- - Kawai T. et al.; J. Biochem; 2007; 141; 137–145) [0004] Kawai T. et al .; J. Biochem; 2007; 141; 137-145) [0004]
- - Zimmer A. et al.; PNAS, 1999; 96 (10), 5780–5785 [0005] - Zimmer A. et al .; PNAS, 1999; 96 (10), 5780-5785 [0005]
- - Dr. Shizuo Akira, Allgemeine Presseinformation 2002 [0007] - Dr. Shizuo Akira, General Press Release 2002 [0007]
- - www.robertkoch.stiftung.de [0007] - www.robertkoch.stiftung.de [0007]
- - Siegmund-Schultze N., www.aerzteblatt.de [0008] - Siegmund-Schultze N., www.aerzteblatt.de [0008]
- - Perry A. K. et al; Cell Research 2005; 15 (6); 407–422 [0009] - Perry AK et al; Cell Research 2005; 15 (6); 407-422 [0009]
- - Kawai T. et al.; J. Biochem; 2007; 141; 137–145 [0009] Kawai T. et al .; J. Biochem; 2007; 141; 137-145 [0009]
- - Isaacs, A. et al.; J. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 147, 258–267 [0022] Isaacs, A. et al .; J. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 147, 258-267 [0022]
- - Domb A. J.; Review in Molecules; 2005; 10; 34 [0027] - Domb AJ; Review in Molecules; 2005; 10; 34 [0027]
- - Xiang G; Keun-Sik K.; Dexi L.; Review in The AAPS Journal; 2007 [0027] - Xiang G; Keun-Sik K .; Dexi L .; Review in The AAPS Journal; 2007 [0027]
- - http://www.aapsj.org [0027] - http://www.aapsj.org [0027]
- - J. P. Behr et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1995; 92; 7297 [0032] JP Behr et al .; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1995; 92; 7297 [0032]
- - S. C. De Smedt et al.; Phar. Res.; 2000; 17; 113 [0032] - SC De Smedt et al .; Phar. Res .; 2000; 17; 113 [0032]
- - F. C. Szoka et al.; Bioconjug. Chem.; 1996; 7; 703 [0032] - Szoka FC et al .; Bioconjug. Chem .; 1996; 7; 703 [0032]
- - W. Guang Liu et al.; J. Control. Release; 2002; 83; 1 [0032] W. Guang Liu et al .; J. Control. release; 2002; 83; 1 [0032]
- - P. van de Wetering et al.; J. Gene Med.; 1999; 1; 156 [0032] P. van de Wetering et al .; J. Gene Med .; 1999; 1; 156 [0032]
- - J. P. Behr; Bioconjugate Chem.; 1994; 5; 382 [0034] - JP Behr; Bioconjugate Chem .; 1994; 5; 382 [0034]
- - Leventis et al.; Biochim. Biophys. Acta; 1990; 1023; 124 [0034] Leventis et al .; Biochim. Biophys. Acta; 1990; 1023; 124 [0034]
- - Huang et al; Biochem. Biophys. Res. Commun.; 1991; 179; 280 [0034] - Huang et al; Biochem. Biophys. Res. Commun .; 1991; 179; 280 [0034]
- - Krieg A. M. et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1998; 95 (21); 12631–6 [0052] - War AM et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1998; 95 (21); 12631-6 [0052]
- - Kaufman R. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1999; 96 (21); 11693–5 [0052] Kaufman RJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1999; 96 (21); 11693-5 [0052]
- - Loiarro M. et al.; J. Biol. Chem.; 2005; 16; 15809–14 [0054] Loiarro M. et al .; J. Biol. Chem. 2005; 16; 15809-14 [0054]
- - Derossi D. at al. J. Biol. Chem. 1994, 269; 10444–10459 [0054] - Derossi D. at al. J. Biol. Chem. 1994, 269; 10444-10459 [0054]
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010133369A1 (en) * | 2009-05-20 | 2010-11-25 | Biontex Laboratories Gmbh | Transfection method for nonviral gene delivery systems with improved activity by blocking the innate immune system |
Citations (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4750100A (en) | 1986-06-06 | 1988-06-07 | Bio-Rad Laboratories | Transfection high voltage controller |
US4946787A (en) | 1985-01-07 | 1990-08-07 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
EP0388758A1 (en) | 1989-03-16 | 1990-09-26 | BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH | Protein-polycation conjugate |
EP0394111A1 (en) | 1989-04-17 | 1990-10-24 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Lipopolyamines, their preparation and use |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
WO1994005624A1 (en) | 1992-08-28 | 1994-03-17 | Life Technologies, Inc. | Cationic lipids |
WO1995002397A1 (en) | 1993-07-14 | 1995-01-26 | The Regents Of The University Of California | Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations |
WO1996002655A1 (en) | 1994-07-13 | 1996-02-01 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Nucleic acid containing composition, preparation and uses of same |
WO1996040067A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Cationic lipid acid salt of 3 beta [n-(n',n'-dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholesterol |
WO1997002419A1 (en) | 1995-07-05 | 1997-01-23 | Societe Hispano-Suiza | Single-clamshell turbojet thrust reverser |
WO1997015680A1 (en) | 1995-10-25 | 1997-05-01 | Octoplus B.V. | Cationic polyacrylates and poly(alkyl) acrylates or the corresponding acrylamides for use in synthetic transfection or blocking systems |
US5869326A (en) | 1996-09-09 | 1999-02-09 | Genetronics, Inc. | Electroporation employing user-configured pulsing scheme |
US6008038A (en) | 1997-03-21 | 1999-12-28 | Eppendorf-Netheler-Hinz Gmbh | Method and a circuit arrangement for the electropermeation of living cells |
US20050013812A1 (en) * | 2003-07-14 | 2005-01-20 | Dow Steven W. | Vaccines using pattern recognition receptor-ligand:lipid complexes |
EP1263446B1 (en) * | 2000-03-11 | 2005-09-21 | Biognostik Gesellschaft für biomolekulare Diagnostik mbH | Mixture comprising an inhibitor or suppressor of a gene and a molecule binding to an expression product of that gene |
EP1469075B1 (en) * | 1993-08-26 | 2007-04-25 | Baylor College Of Medicine | Gene-therapy for solid tumors, papillomas and warts |
-
2007
- 2007-11-22 DE DE102007056488A patent/DE102007056488A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4946787A (en) | 1985-01-07 | 1990-08-07 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4750100A (en) | 1986-06-06 | 1988-06-07 | Bio-Rad Laboratories | Transfection high voltage controller |
EP0388758A1 (en) | 1989-03-16 | 1990-09-26 | BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH | Protein-polycation conjugate |
EP0394111A1 (en) | 1989-04-17 | 1990-10-24 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Lipopolyamines, their preparation and use |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
WO1994005624A1 (en) | 1992-08-28 | 1994-03-17 | Life Technologies, Inc. | Cationic lipids |
WO1995002397A1 (en) | 1993-07-14 | 1995-01-26 | The Regents Of The University Of California | Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations |
EP1469075B1 (en) * | 1993-08-26 | 2007-04-25 | Baylor College Of Medicine | Gene-therapy for solid tumors, papillomas and warts |
WO1996002655A1 (en) | 1994-07-13 | 1996-02-01 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Nucleic acid containing composition, preparation and uses of same |
WO1996040067A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Cationic lipid acid salt of 3 beta [n-(n',n'-dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholesterol |
WO1997002419A1 (en) | 1995-07-05 | 1997-01-23 | Societe Hispano-Suiza | Single-clamshell turbojet thrust reverser |
WO1997015680A1 (en) | 1995-10-25 | 1997-05-01 | Octoplus B.V. | Cationic polyacrylates and poly(alkyl) acrylates or the corresponding acrylamides for use in synthetic transfection or blocking systems |
US5869326A (en) | 1996-09-09 | 1999-02-09 | Genetronics, Inc. | Electroporation employing user-configured pulsing scheme |
US6008038A (en) | 1997-03-21 | 1999-12-28 | Eppendorf-Netheler-Hinz Gmbh | Method and a circuit arrangement for the electropermeation of living cells |
EP1263446B1 (en) * | 2000-03-11 | 2005-09-21 | Biognostik Gesellschaft für biomolekulare Diagnostik mbH | Mixture comprising an inhibitor or suppressor of a gene and a molecule binding to an expression product of that gene |
US20050013812A1 (en) * | 2003-07-14 | 2005-01-20 | Dow Steven W. | Vaccines using pattern recognition receptor-ligand:lipid complexes |
Non-Patent Citations (26)
Title |
---|
Derossi D. at al. J. Biol. Chem. 1994, 269; 10444-10459 |
Domb A. J.; Review in Molecules; 2005; 10; 34 |
Dr. Shizuo Akira, Allgemeine Presseinformation 2002 |
F. C. Szoka et al.; Bioconjug. Chem.; 1996; 7; 703 |
Heine H. et al.; Int. Arch. Allergy Immunol. 2003; 130; 180-192 |
http://www.aapsj.org |
Huang et al; Biochem. Biophys. Res. Commun.; 1991; 179; 280 |
Isaacs, A. et al.; J. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 147, 258-267 |
J. P. Behr et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1995; 92; 7297 |
J. P. Behr; Bioconjugate Chem.; 1994; 5; 382 |
Kaufman R. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1999; 96 (21); 11693-5 |
Kawai T. et al.; J. Biochem; 2007; 141; 137-145 |
Kawai T. et al.; J. Biochem; 2007; 141; 137-145) |
Krieg A. M. et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1998; 95 (21); 12631-6 |
Leventis et al.; Biochim. Biophys. Acta; 1990; 1023; 124 |
Loiarro M. et al.; J. Biol. Chem.; 2005; 16; 15809-14 |
Luke A. et al.; Spektrum der Wissenschaft, August 2005, Seiten 68-75 |
P. van de Wetering et al.; J. Gene Med.; 1999; 1; 156 |
Perry A. K. et al; Cell Research 2005; 15 (6); 407-422 |
S. C. De Smedt et al.; Phar. Res.; 2000; 17; 113 |
Siegmund-Schultze N., www.aerzteblatt.de |
Uematsu S. et al., J. Biol. Chem. 2007, May 25; 282 (21); 15319-23) |
W. Guang Liu et al.; J. Control. Release; 2002; 83; 1 |
www.robertkoch.stiftung.de |
Xiang G; Keun-Sik K.; Dexi L.; Review in The AAPS Journal; 2007 |
Zimmer A. et al.; PNAS, 1999; 96 (10), 5780-5785 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010133369A1 (en) * | 2009-05-20 | 2010-11-25 | Biontex Laboratories Gmbh | Transfection method for nonviral gene delivery systems with improved activity by blocking the innate immune system |
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