DE102007049644A1

DE102007049644A1 - Transporter protein detector for time-dependent in-situ detection of transport of fluorescent substrate e.g. coumarin-dye, has laser e.g. argon ion laser, provided as light source and emitting radiation that is focused on sample

Info

Publication number: DE102007049644A1
Application number: DE200710049644
Authority: DE
Inventors: Carola Kryschi; Andrea Netter
Original assignee: Kryschi Carola Prof Dr
Current assignee: Kryschi Carola Prof Dr
Priority date: 2007-10-17
Filing date: 2007-10-17
Publication date: 2009-04-23

Abstract

The detector has a continuously working laser e.g. argon ion laser and sapphire-laser, provided as a light source for emitting monochrome radiation that is focused on a sample, where the sample in a conditioned sample chamber is surrounded by a vessel. The vessel is divided into two volumes by a membrane filter that is made of polycarbonate. A dispersion unit i.e. optical band-pass filter, is provided for extracting fluorescent radiation emitted from the sample, and a photodetector detects the radiation intensity based on the time, where the photodetector is a photodiode or photomultiplier.

Description

FachgebietArea of Expertise

Pharmacology Pharmacokinetics

Stand der TechnikState of the art

Die Behandlung von Krebserkrankungen mit Zytostatika ist oft durch Resistenzen der Tumorzellen gegen viele Arzneimittel (Multidrug Resistance) stark eingeschränkt oder ohne jede Aussicht auf Heilung. Diese Arzneimittelresistenz wird meist durch Proteine der ATP-Binding-Cassette-Transporter verursacht. Ein bekanntes Mitglied dieser ABC-Transporter-Familie ist P-Glykoprotein, das bevorzugt an der apikalen Oberfläche der Plasmamembran von Tumorzellen überexprimiert wird [1–3]. P-Glykoprotein schützt die Tumorzellorganellen während einer Chemotherapie, indem es aktiv (ATP-abhängig) die Zytostatika aus der Tumorzelle transportiert und damit die intrazelluläre Zytostatika-Konzentration erheblich erniedrigt [4]. Der Transport von meist lipophilen Wirkstoffen in die Tumorzelle (Absorption) erfolgt über die Plasmamembran als eine vom Konzentrationsgradienten getriebene Diffusion und wird damit von P-Glykoprotein nicht beeinflusst. Das Spektrum der P-Glykoprotein-Substrate reicht von einer Vielzahl von Zytostatika (z. B. Anthracycline, Taxane) über Herzmedikamente (z. B. Verapamil, Diltiazem) bis zu anti-AIDS-Wirkstoffen (Saquinavir) [5–6]. Ein hervorragendes zelluläres in-vitro-Zellmodell für die Untersuchung der Transporteigenschaften von P-Glykoprotein im intestinalen Epithelium des Gastrointestinal-traktes stellen die humanen Darmkrebszellen, die sogenannten Caco-2-Zellen, dar [5, 7–13].The Treatment of cancers with cytotoxic drugs is often due to drug resistance the tumor cells against many drugs (multidrug resistance) severely limited or without any hope of recovery. These Drug resistance is mostly due to ATP binding cassette transporter proteins caused. A well-known member of this ABC transporter family is P-glycoprotein, which is preferentially attached to the apical surface the plasma membrane of tumor cells is overexpressed [1-3]. P-glycoprotein protects the tumor cell organelles during chemotherapy by actively (ATP-dependent) the Cytostatics transported from the tumor cell and thus the intracellular Cytostatic concentration significantly lowered [4]. The transport of mostly lipophilic active ingredients in the tumor cell (absorption) is via the plasma membrane as one of the concentration gradient driven diffusion and is therefore not affected by P-glycoprotein. The spectrum of P-glycoprotein substrates ranges from a variety of cytostatics (eg anthracyclines, taxanes) via heart medications (eg verapamil, diltiazem) to anti-AIDS drugs (saquinavir) [5-6]. An excellent cellular in vitro cell model for the study of the transport properties of P-glycoprotein in the intestinal epithelium of the gastrointestinal tract the human colon cancer cells, the so-called Caco-2 cells [5, 7-13].

Die Wirkung von Zytostatika auf die Tumorzelle wird von ihrer Wechselwirkungszeit mit den Zellorganellen und damit von ihrer Aufenthaltszeit im Zytosol bestimmt. Ausreichende Aufenthaltszeiten von Zytostatika sind essentiell für den Erfolg einer Krebsbehandlung und können nur durch Inhibierung der Transporterfunktion von P-Glykoprotein erreicht werden. Ein aktuell eingesetzter Inhibitor in der Chemotherapie ist beispielsweise das von Novartis entwickelte PSC833.The Effect of cytotoxic drugs on the tumor cell is determined by their interaction time with the cell organelles and thus their residence time in the cytosol certainly. Sufficient residence times of cytostatic drugs are essential for the success of a cancer treatment and can only by inhibiting the transporter function of P-glycoprotein be achieved. A currently used inhibitor in chemotherapy is, for example, the PSC833 developed by Novartis.

Die Weiterentwicklung von wirksamen Inhibitoren für die Transporterfunktion von P-Glykoprotein setzt Routine-Messtechniken voraus, die die direkte Messung des durch P-Glykoprotein vermittelten Transportes von geeigneten Substraten leisten sollten. Da die Absorption der Zytostatika als passiver Transport in apikal-nach-basaler Richtung durch die Plasmembran der Tumorzelle erfolgt, beeinflussen Inhibitoren nur den basal-nach-apikalen Transport der Zytostatika (Sekretion), so dieser der P-Glykoprotein-Transporterfunktion zugeschrieben wird.The Further development of effective inhibitors for transporter function of P-glycoprotein requires routine measurement techniques that involve direct measurement of P-glycoprotein-mediated transport of appropriate Substrates should afford. Since the absorption of cytostatic drugs as passive transport in apical-to-basal direction through the plasma membrane the tumor cell occurs, inhibitors affect only the basal-to-apical Transport of cytostatics (secretion), so this the P-glycoprotein transporter function is attributed.

Die Standardtechniken für die pharmakokinetische Charakterisierung von P-Glykoprotein-Inhibitoren nutzen die zeitabhängige Messung von geeignet detektierbaren Substraten aus, deren Transport von P-Glykoprotein vermittelt wird.The Standard Techniques for Pharmacokinetic Characterization Of P-glycoprotein inhibitors use the time-dependent Measurement of suitably detectable substrates, their transport is mediated by P-glycoprotein.

Ergebnisse aus der PatentrechercheResults from the patent search

Eine Patentrecherche mit Suchbegriffen wie „protein, transport*, P-Glykoprotein, fluorescence, in-situ detection" ergab keinen Hinweis auf ein Messgerät, das auch nur annähernd in der Funktion und dem Konzept mit der hier dargestellten Erfindung übereinstimmt. Die Ergebnisse der Patentrecherche sind die Patente mit den internationalen Veröffentlichungsnummern WO 2001/053871 und WO 2002/028273 .

1. WO 2001/053871 : „In-vivo tissue inspection and sampling". Dieses Patent beschreibt eine fluoreszenzspektroskopische Messtechnik für die in-vivo Unterscheidung zwischen normalem und krankem Gewebe. Dafür wird das zu untersuchende Gewebe mit einem geeigneten Fluoreszenzreagens inkubiert. Die Veränderung der Fluoreszenzeigenschaften des Reagens im Gewebe lässt Rückschlüsse auf den Zustand des Gewebes zu. Die dafür eingesetzte Messtechnik ist ein stationäres Verfahren, das für schnelle Routine-Diagnosen zur Entlastung der abbildenden Endoskopie eingesetzt werden soll.
2. WO 2002/028273 : „Multi-spectral fluorescence imaging and spectroscopy device". Dieses Patent beschreibt eine abbildende fluoreszenzspektroskopische Messtechnik, die für die in-situ Diagnose und Behandlung von krankem Gewebe eingesetzt werden soll. Dafür wurde eine spezielle Anregungslicht-Proben-Detektor-Geometrie entwickelt, die größere Variationen der Anregungslichtintensität erlauben. Das bedeutet, dass Gewebe auf Tumore hin mit kleinen Anregungslichtintensitäten untersucht werden kann, während die Zerstörung der Tumore mit hohen Lichtintensitäten durchgeführt wird. Auch diese fluoreszenzspektroskopische Mess-technik ist ein stationäres Messverfahren und keineswegs für die zeitaufgelöste Untersuchung der Transporterfunktion von Proteinen geeignet.

A patent search using search terms such as "protein, transport *, P-glycoprotein, fluorescence, in-situ detection" revealed no indication of a measuring instrument that even approximately corresponds in function and concept with the invention presented here are the patents with international publication numbers WO 2001/053871 and WO 2002/028273 ,

1. WO 2001/053871 "In vivo tissue inspection and sampling." This patent describes a fluorescence spectroscopic measurement technique for in vivo differentiation between normal and diseased tissue by incubating the tissue to be examined with a suitable fluorescent reagent and allowing the change in the fluorescence properties of the reagent in the tissue Conclusions on the condition of the tissue The measuring technique used for this purpose is a stationary procedure, which is to be used for fast routine diagnoses to relieve the imaging endoscopy.
Second WO 2002/028273 : "Multi-spectral fluorescence imaging and spectroscopy device." This patent describes an imaging fluorescence spectroscopic measurement technique to be used for the in-situ diagnosis and treatment of diseased tissue by the development of a special excitation light sample-detector geometry This means that tissue can be examined for tumors with small excitation light intensities while destroying the tumors at high light intensities.This fluorescence spectroscopic measurement technique is also a stationary measurement technique and by no means for the time-resolved study of transporter function of proteins.

Bisherige LösungsversuchePrevious attempts at solution

Die pharmakokinetische Charakterisierung von P-Glykoprotein-Inhibitoren wurde bisher erfolgreich mittels drei verschiedener Messtechniken durchgeführt.The Pharmacokinetic characterization of P-glycoprotein inhibitors has been successfully carried out using three different measuring techniques.

Die von Fromm et al. [5] inzwischen etablierte Messtechnik nutzt für die Detektion der von P-Glykoprotein vermittelten Transportdynamiken radioaktiv markierte Substrate (z. B. [3H]-Digoxin und [3H]-Inulin), deren zeitabhängige Konzentrationsänderungen mit dem flüssigen Szintillation-Kostenzähler gemessen werden. Als Proben werden konfluente Monolagen durch Aufwachsen der Tumorzellen auf Polycarbonat-Membranfilter (Transwells) generiert. Die polarisiert aufgewachsenen Zellen exprimieren P-Glykoprotein an ihrer apikalen Plasmamembranoberfläche, so dass für den Substrat-Transport über die Zell-Monolagen zwischen basal-nach-apikaler und apikal-nach-basaler Richtung unterschieden wird. Der Membranfilter mit der Zell-Monolage wird derart in eine Küvette eingesetzt, dass er diese in zwei gleich große Volumina unterteilt. In dem sogenannten Donorvolumen wird das Substrat mit bekannter Konzentration vorgegeben, während die zeitabhängige Konzentrationszunahme des Substrates im jeweils anderen Küvettenabschnitt, dem Akzeptorvolumen, mit dem flüssigen Szintillation-Kostenzähler gemessen wird. Dafür werden dem Akzeptorvolumen im Zeitabstand von 1 h Probenvolumina entnommen, die mit der entsprechend geeigneten Szintillationssubstanz versetzt im Szintillation-Kostenzähler für die Konzentrationsbestimmung des Substrates verwendet werden. Der jeweilige Transport wird als relative Substratkonzentration gegen die Zeit dargestellt. Der basal-nach-apikale Substrat-Transport wird gemessen, indem der basale Gefäßabschnitt als Donorvolumen gewählt und die Konzentrationszunahme des Substrates auf der apikalen Seite bestimmt wird. Für den apikal-nach-basalen Substrat-Transport werden die Donor- und Akzeptorvolumina entsprechend umgekehrt gewählt. Der Nettotransport wird aus der Differenz des basal-nach-apikalen und des apikal-nach-basalen Tranportes bestimmt. Systematische Messfehler ergeben sich aus der Entnahme von Probenvolumina, die für die Bestimmung der Substratkonzentration notwendig sind. Damit wird nicht nur die absolute Substratkonzentrat sondern auch der Konzentrationsgradienten im Akzeptorvolumen verfälscht. Ein weiterer Nachteil der flüssigen Szintillation-Kostenzähler-Messtechnik besteht im gefährlichen Umgang mit radioaktiven Substanzen, deren Anschaffung und deren Entsorgung kostenintensiv sind. Hinzu kommen die erforderlichen teueren Sicherheitsvorkehrungen im Sinne der Strahlenschutzanweisung (§ 4 StrlSchV).The data from Fromm et al. [5] In the meantime established measuring technology uses radiolabelled substrates (eg [3H] -digoxin and [3H] -inulin) for the detection of P-glycoprotein-mediated transport dynamics, whose time-dependent concentration changes be measured with the liquid scintillation counter. As samples, confluent monolayers are generated by growing the tumor cells on polycarbonate membrane filters (Transwells). The polarized grown cells express P-glycoprotein at their apical plasma membrane surface so that a distinction is made between basal-post-apical and apical-to-basal directions for substrate transport across the cell monolayers. The membrane filter with the cell monolayer is inserted into a cuvette in such a way that it divides it into two equal volumes. In the so-called donor volume, the substrate is given a known concentration, while the time-dependent increase in the concentration of the substrate in the other cuvette section, the acceptor volume, is measured with the liquid scintillation counter. For this purpose, sample volumes are taken from the acceptor volume at a time interval of 1 h, which are mixed with the appropriate suitable scintillant substance and used in the scintillation counter for the concentration determination of the substrate. The respective transport is shown as relative substrate concentration versus time. The basal-to-apical substrate transport is measured by selecting the basal vascular segment as the donor volume and determining the concentration increase of the substrate on the apical side. For apical-to-basal substrate transport, the donor and acceptor volumes are correspondingly reversed. The net transport is determined from the difference between basal-to-apical and apical-to-basal tranport. Systematic measurement errors result from the extraction of sample volumes, which are necessary for the determination of the substrate concentration. This not only falsifies the absolute substrate concentrate but also the concentration gradients in the acceptor volume. Another disadvantage of the liquid scintillation counter measurement technique is the dangerous handling of radioactive substances, the purchase and disposal of which are expensive. Added to this are the necessary expensive safety precautions in the sense of the radiation protection directive (§ 4 StrlSchV).

Eine wesentlich preiswertere und deshalb intensiver eingesetzte Alternative zur Messtechnik mit dem flüssigen Szintillation-Kostenzähler basiert auf der Fluoreszenzspektrosko pie. Als Substrate für P-Glykoprotein werden meist Rhodamin-Farbstoffe und insbesondere Rhodamin 123 eingesetzt [6–12]. Diese Farbstoffe verfügen nicht nur über ausgezeichnete Substrat-Eigenschaften für P-Glykoprotein, sondern zeichnen sich auch noch durch hohe Fluoreszenz-quantenausbeuten (> 90%) aus. Die Probenpräparation für diese Messtechnik erfolgt analog zur Methode mit dem Szintillation-Kostenzähler. Die Caco-2-Zellen werden ebenfalls als konfluente Zellmonolagen auf Polycarbonat-Membranfilter kultiviert. Ebenso werden die Membranfilter in eine geeignete Küvette derart eingesetzt, dass zwischen Donor- und Akzeptorvolumen über der apikalen beziehungsweise unter der basalen Zelloberfläche (vice versa) unterschieden werden kann. Der wesentliche Vorteil dieser Messtechnik besteht darin, dass anstelle des radioaktiv markierten Substrates ein fluoreszierendes Substrat verwendet wird. Die Konzentrationsbestimmung des Substrates im Akzeptorvolumen wird in Zeitabschnitten von einigen Minuten bis zu einer Stunde mittels eines Fluoreszenz-spektrometers durchgeführt. Da die Fluoreszenzintensität nur in einem begrenzten Konzentrationsbereich linear proportional zur Substratkonzentration ist, setzt diese Messtechnik die Erstellung von Kalibrationsmessungen voraus.A much cheaper and therefore more intensively used alternative to the measurement technique with the liquid scintillation counter based on fluorescence spectroscopy. As substrates for P-glycoprotein For the most part, rhodamine dyes and in particular rhodamine 123 are used [6-12]. These dyes do not only have over excellent substrate properties for P-glycoprotein, but also characterized by high fluorescence quantum yields (> 90%) off. The sample preparation for this measurement technique is analogous to the method with the Scintillation counter. The Caco-2 cells will also be as confluent cell monolayers on polycarbonate membrane filter cultivated. As well The membrane filters are placed in a suitable cuvette used that between donor and acceptor volume over the apical or under the basal cell surface (vice versa) can be distinguished. The main advantage of this Measurement technique is that instead of the radioactively marked Substrates a fluorescent substrate is used. The determination of concentration of the substrate in the acceptor volume is in periods of some Minutes to one hour using a fluorescence spectrometer carried out. Because the fluorescence intensity only in a limited concentration range is linearly proportional to the substrate concentration, this measurement technique sets the preparation of calibration measurements.

Die dritte Messtechnik nutzt für die Charakterisierung der Transporterfunktion von P-Glykoprotein die Fluoreszenzdurchflusszytometrie [13, 14]. Dafür werden Tumorzellen auf Membranfiltern kultiviert und mit dem fluoreszierenden Substrat in unterschiedlichen Konzentrationen inkubiert. Die Wirkung des jeweils interessierenden Inhibitors auf P-Glykoprotein wird durch anschließende Inkubation in Gegenwart des Inhibitors untersucht. Anschließend werden die Tumorzellen mit einem geeigneten Puffer gewaschen, von dem jeweiligen Membranfilter abgelöst und mit bekannter Konzentration in eine Pufferlösung gegeben. Die Konzentration des intrazellulären Substrates wird mittels der Fluoreszenzdurchflusszytometrie bestimmt. Diese Messtechnik stellt damit nur ein indirektes Verfahren für die Charakterisierung der P-Glykoprotein-Transporterfunktion dar, da nur das von den Tumorzellen absorbierte Substrat gemessen wird. Ein weiterer Nachteil dieser Messtechnik besteht darin, dass die Tumorzellen nach dem Ablösen vom Substrat ihre polarisierte Form aufgeben und damit isotrope Absorptions- und Sekretionseigenschaften während der Messung mit der Fluoreszenzdurchflusszytometrie zeigen. Außerdem wird die interzelluläre Substrat-konzentration im Substrat-freien Puffer gemessen, was zu einem systematischen Messfehler aufgrund von passiver Diffusion des Substrates aus der Tumorzelle führen kann.The third measuring technique uses for the characterization of the Transporter function of P-glycoprotein fluorescence flow cytometry [13, 14]. For this purpose, tumor cells are cultivated on membrane filters and with the fluorescent substrate in different concentrations incubated. The effect of the respective inhibitor of interest P-glycoprotein is purified by subsequent incubation in the presence of Inhibitors examined. Subsequently, the tumor cells washed with a suitable buffer, from the respective membrane filter detached and added with known concentration in a buffer solution. The concentration of the intracellular substrate is determined by means of determined by fluorescence flow cytometry. This measurement technology thus provides only an indirect method for characterization of the P-glycoprotein transporter function, since only that of the tumor cells absorbed substrate is measured. Another disadvantage of this Measurement technique is that the tumor cells after detachment from the Substrate abandon their polarized form and thus isotropic absorption and secretion properties during the measurement with the Show fluorescence flow cytometry. In addition, the Intercellular substrate concentration in the substrate-free Buffer measured, resulting in a systematic measurement error due lead from passive diffusion of the substrate from the tumor cell can.

Nachteile, die die Erfindung behebt:Disadvantages that the invention remedies:

Die Erfindung, der Transporterproteindetektor, wird als kostensparende online-screening Technik für die zeitaufgelöste Charakterisierung der Transporterfunktion von P-Glykoprotein in Gegenwart von therapeutisch relevanten Wirkstoffen (z. B. Inhibitoren) eingesetzt. Dafür leistet die Erfindung die in-situ Detektion des basal-nach-apikalen Transports von fluoreszierenden Substraten über eine konfluente Tumorzellmonolage, die auf einem Polycarbonat-Membranfilter (Transwell) kultiviert wird. Die Tumorzellmonolage besteht aus polarisiert aufgewachsenen Tumorzellen, die bevorzugt P-Glykoprotein in der apikalen Plasmamembran exprimieren, während sie mit der basalen Plasmamembran auf dem Membranfilter adhäriert sind. Für die vollständige Messung des basal-nach-apikalen Transportprozesses wird nur ein Membranfilter mit aufgewachsener Tumorzellmonolage benötigt, was kosten- und zeitsparend im Vergleich zu den bisher verwendeten Messmethoden ist. Die weiteren Nachteile der beiden erst genannten, diskontinuierlich arbeitenden Messmethoden ergeben sich aus den Probenentnahmen, die für die Konzentrationsbestimmung des Substrates notwendig sind. Jede Messung ist mit mindestens 5 Probenentnahmen verbunden, was zu systematischen Volumen- und damit zu Konzentrationsfehlern führt. Im Gegensatz dazu erfordert die Erfindung, die in-situ das transportierte Substrat detektiert, keine Probenentnahmen und keine weiteren Manipulationen, die beispielsweise in der Zugabe von Szintillationssubstanz und der Messung in einem externen Gerät bestehen. Damit werden mit der Erfindung nicht nur unnötige systematische experimentelle Fehler vermieden, sondern auch noch Arbeitszeit und Arbeitsaufwand gespart.The invention, the transporter protein detector, is used as a cost-saving on-line screening technique for the time-resolved characterization of transporter function of P-glycoprotein in the presence of therapeutically relevant agents (eg, inhibitors). For this, the invention provides the in-situ detection of basal-to-apical transport of fluorescent substrates via a confluent tumor cell monolayer which is cultured on a polycarbonate membrane filter (Transwell). The tumor cell monolayer consists of polarized tumor cells preferentially P-glycoprotein in of the apical plasma membrane while adhering to the basal plasma membrane on the membrane filter. For the complete measurement of the basal-to-apical transport process, only a membrane filter with grown tumor cell monolayer is needed, which is cost and time saving compared to the previously used measurement methods. The other disadvantages of the two first-mentioned, discontinuous measuring methods result from the sampling, which are necessary for the determination of the concentration of the substrate. Each measurement is associated with at least 5 samples, resulting in systematic volume and thus concentration errors. In contrast, the invention which detects in-situ the transported substrate requires no sampling and no further manipulations consisting, for example, in the addition of scintillation substance and the measurement in an external device. Thus, the invention not only avoids unnecessary systematic experimental errors, but also saves labor time and labor.

Beschreibung der Erfindung durch Ausführungsbeispiele und Skizzen:Description of the invention by embodiments and sketches:

Die Erfindung, der Transporterproteindetektor, basiert auf der zeitabhängigen in-situ Detektion von fluoreszierenden Substraten, deren basal-nach-apikaler Transport über eine konfluente Tumorzellmonolage von P-Glykoprotein vermittelt wird. Das dafür entwickelte Gerät besteht aus der Anregung, der Probe und der Detektion (s. 1). Als Anregungslichtquelle wird ein kontinuierlich arbeitender Laser (z. B. Argonionenlaser oder Saphir-Laser) eingesetzt, dessen monochrome Strahlung mittels einer Glasfaser auf die Probe (rotes Quadrat) fokussiert wird. Die Probe besteht aus einem, an der Unterseite abge-schmolzenen Glasröhrchen (Küvette), das mit einem für Tumorzellen geeigneten Puffer befüllt wird. Die Tumorzellen adhärieren als Monolage auf einem Polycarbonat-Membranfilter (Transwell). Der Membranfilter unterteilt die Küvette in zwei Volumina, die als Donor- und Akzeptorvolumen genutzt werden (s. 2). In 2 ist eine der beiden möglichen Konfigurationen dargestellt. Das Donorvolumen befindet sich in dieser Konfiguration unterhalb und das Akzeptor volumen oberhalb des Membranfilters, was die Messung des basal-nach-apikalen Transportes erlaubt. In der Konfiguration für den apikal-nach-basalen Transport werden Donor- und Akzeptorvolumenn ausgetauscht. Das Donorvolumen erhält zum Startzeitpunkt der Messung das Substrat mit bekannter Konzentration, das in geeigneter Pufferlösung gelöst ist. Das Akzeptorvolumen wird mit der monochromen Laserstrahlung kontinuierlich angeregt. Die Fluoreszenz des über die Tumorzellmonolage transportierten Substrates wird mittels eines Kollimators eingesammelt und über einen Glasfaser-angekoppelten Fluoreszenz-spektrometer polychromatisch detektiert. Die relative Fluoreszenzintensität wird durch numerische Integration des Fluoreszenzspektrums ermittelt und als Funktion der Transportzeit dargestellt, wobei die Zeitauflösung im Bereich von wenigen Sekunden liegt.The invention, the transporter protein detector, is based on the time-dependent in situ detection of fluorescent substrates whose basal-to-apical transport is mediated via a confluent tumor cell monolayer of P-glycoprotein. The device developed for this consists of the excitation, the sample and the detection (s. 1 ). The excitation light source used is a continuously operating laser (eg argon ion laser or sapphire laser) whose monochromatic radiation is focused onto the sample (red square) by means of a glass fiber. The sample consists of a glass tube (cuvette) which has been melted at the bottom and filled with a buffer suitable for tumor cells. The tumor cells adhere as a monolayer on a polycarbonate membrane filter (Transwell). The membrane filter divides the cuvette into two volumes, which are used as donor and acceptor volumes (s. 2 ). In 2 one of the two possible configurations is shown. The donor volume in this configuration is below and the acceptor volume is above the membrane filter, allowing the measurement of basal-to-apical transport. In the apical-to-basal transport configuration, donor and acceptor volumes are exchanged. The donor volume receives at the start time of the measurement, the substrate of known concentration, which is dissolved in a suitable buffer solution. The acceptor volume is continuously excited by the monochrome laser radiation. The fluorescence of the transported via the tumor cell monolayer substrate is collected by means of a collimator and detected polychromatically via a glass fiber-coupled fluorescence spectrometer. The relative fluorescence intensity is determined by numerical integration of the fluorescence spectrum and represented as a function of the transport time, the time resolution being in the range of a few seconds.

Zur Kompensation von Intensitätsinstabilitäten der Laseranregung wird die Laserintensität parallel zur Messung des jeweiligen Fluoreszenzspektrums detektiert und für die Korrektur der Fluoreszenzintensitätswerte genutzt. Die Temperatur und Luftfeuchtigkeit im Probenraum wird mittels eines Wasserdampfentwickler und Thermostat konstant gehalten. Damit werden reproduzierbare Messbedingungen während jeder Transportmessung und insbesondere für den Vergleich mit und ohne den jeweiligen zu charakterisierenden Inhibitor gewährleistet (s. 3). In 4 sind typische Messergebnisse aus den in-situ Detektionen des basal-nach-apikalen Transportes von Rhodamin 6G in Gegenwart (s. rote Linie) und in Abwesenheit (s. schwarze Linie) des P-Glykoprotein-Inhibitors PSC833 dargestellt. Der Transport wird in % aufgetragen und bezeichnet die Fluoreszenzintensitätszunahme im Akzeptorvolumen.To compensate for intensity instabilities of the laser excitation, the laser intensity is detected parallel to the measurement of the respective fluorescence spectrum and used for the correction of the fluorescence intensity values. The temperature and humidity in the sample chamber is kept constant by means of a steam generator and thermostat. This ensures reproducible measurement conditions during each transport measurement and in particular for the comparison with and without the respective inhibitor to be characterized (cf. 3 ). In 4 For example, typical measurement results from the in situ detection of basal-to-apical transport of rhodamine 6G in the presence (see red line) and in the absence (see black line) of the P-glycoprotein inhibitor PSC833 are shown. The transport is plotted in% and indicates the increase in fluorescence intensity in the acceptor volume.

Die Fluoreszenzintensität nimmt direkt proportional zur Konzentration des Substrates zu, dessen basal-nach-apikaler Transport im Wesentlichen von P-Glykoprotein vermittelt wird. Wie die Messergebnisse eindeutig zeigen, reduziert der Inhibitor PSC833 den Transport des Substrates um mehr als 70%.The Fluorescence intensity increases directly proportional to the concentration of the substrate, whose basal-to-apical transport is essentially of P-glycoprotein is mediated. As the results clearly show that the inhibitor PSC833 reduces the transport of the substrate by more than 70%.

5 zeigt die Fotographien der Erfindung in der Seitenansicht (links) und der Sicht in die geöffnete Probenkammer (rechts). Die Messküvette in der schwarz lackierten Probenkammer wird mittels eines Badthermostaten auf konstante Temperatur gehalten (links). Das weiße Gefäß ist der Wasserverdampfer, der für eine konstante Luftfeuchtigkeit sorgt, während im Zentrum vom Probenraum der Küvettenhalter mit Küvette und angekoppelten Glasfasern für die Anregung und Detektion zu erkennen sind (rechts). 5 shows the photographs of the invention in the side view (left) and the view into the open sample chamber (right). The measuring cuvette in the black-painted sample chamber is kept at a constant temperature by means of a bath thermostat (left). The white vessel is the water evaporator, which ensures a constant humidity, while in the center of the sample chamber the cuvette holder with cuvette and coupled glass fibers for excitation and detection can be recognized (right).

Wesentliche Neuheit der Erfindung (Kern der Erfindung):Substantial novelty of the invention (Kern the invention):

Die wesentliche Neuheit der Erfindung besteht in der zeitaufgelösten in-situ Detektion des Transportes von fluoreszierenden Substraten, die durch Transporterproteine aus der Tumorzelle befördert werden. Die in-situ Detektion mittels Glasfaser-angekoppelten Fluoreszenzspektrometer ermöglicht die kontinuierliche Messung der Konzentrationszunahme des Substrates im Akzeptorvolumen, die direkt mit der Transporterfunktion von P-Glykoprotein korreliert werden kann. Da der Fluoreszenzspektrometer polychromatisch arbeitet, kann eine Zeitauflösung von Millisekunden erreicht werden.The essential novelty of the invention is the time-resolved in situ detection of the transport of fluorescent substrates carried by transporter proteins from the tumor cell. In-situ detection by means of a glass-fiber-coupled fluorescence spectrometer allows continuous measurement of the increase in the concentration of the substrate in the acceptor volume, which can be correlated directly with the transporter function of P-glycoprotein. Since the fluorescence spectrometer works polychromatically, a Zeitauflö milliseconds.

Vorteile gegenüber dem Stand der Technik:Advantages over the stand of the technique:

Der erste Vorteil der Erfindung besteht in der in-situ Detektion des basal-nach-apikalen Transportes von Substraten, die eine kontinuierliche Messung der Konzentrationszunahme des Substrates im Akzeptorvolumen leistet.Of the The first advantage of the invention is the in-situ detection of the basal-to-apical transport of substrates containing a continuous Measurement of the concentration increase of the substrate in the acceptor volume guaranteed.

Der zweite Vorteil ergibt sich ebenfalls aus der kontinuierlichen Arbeitsweise der Messtechnik: für jede Messung wird nur eine auf dem Membranfilter präparierte Tumorzellmonolage benötigt, was im Vergleich zu den diskontinuierlich arbeitenden Messtechniken mit dem Szintillation-Kostenzähler und der externen Fluoreszenzspektroskopie Arbeitszeit, Präparationsaufwand, Tumorzellen, Poly-carbonat-Membranfilter und damit auch erheblich Kosten spart.Of the second advantage also results from the continuous operation the metrology: for each measurement is only one on the Membrane filter requires prepared tumor cell monolayer, what compared to the discontinuous measuring techniques with scintillation counter and external fluorescence spectroscopy Working time, preparation costs, tumor cells, polycarbonate membrane filters and thus saves considerable costs.

Der dritte Vorteil ist die bedeutend höhere Zeitauflösung der Erfindung.Of the third advantage is the significantly higher time resolution the invention.

Als vierter Vorteil wird die Probenkammer verstanden, in der die relevanten Messbedingungen, die in der konstanten Temperatur und Luftfeuchtigkeit bestehen, über die gesamte Messung konstant gehalten werden.When fourth advantage is the sample chamber understood in the relevant Measuring conditions that exist in the constant temperature and humidity over the entire measurement is kept constant.

Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung:Applications of the invention:

Die Erfindung soll als schnelle kostensparende Routine-Messtechnik für das Screening von Wirkstoffen eingesetzt werden, deren Einfluss auf die Transporterfunktion von Membranproteinen für die Optimierung von Chemotherapien quantitativ erfasst werden muss.The Invention is intended as a fast cost-saving routine measurement technique for the screening of drugs are used whose influence on the transporter function of membrane proteins for optimization of chemotherapy must be quantified.

Weitere detaillierte Ausführungen, die Bestandteil dieser Beschreibung sind, finden sich in der beiliegenden Dissertation [15].Further detailed explanations, which are part of this description are found in the attached dissertation [15].

Verzeichnis der Abbildungen: Fluoreszenzspektroskopische in-situ Detektion der Pharmakokinetik von TransporterproteinenList of figures: Fluorescence spectroscopic in situ detection of the pharmacokinetics of transporter proteins

1: Schematische Darstellung des Transporterproteindetektors. 1 : Schematic representation of the transporter protein detector.

2: Messküvette (rechts) mit der Halterung (links). 2 : Measuring cuvette (right) with the holder (left).

3: Probenraum mit Klimatisierung. 3 : Rehearsal room with air conditioning.

4: Messergebnisse aus den in-situ Detektionen des basal-nach-apikalen Transportes von Rhodamin 6G in Abwesenheit von PSC833 (schwarze Messkurve) und in Anwesenheit von PSC833 (rote Messkurve). 4 : Measurement results from the in situ detection of basal-to-apical transport of rhodamine 6G in the absence of PSC833 (black trace) and in the presence of PSC833 (red trace).

5: Fotographien des Messaufbaus der Erfindung in der Seitenansicht (unten) und in der Sicht von oben (oben). 5 : Photographs of the measuring structure of the invention in the side view (bottom) and in the view from above (top).

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

WO 2001/053871 [0005, 0005]
- WO 2002/028273 [0005, 0005]

Claims

A spectroscopic device for the time-dependent in-situ detection of basal-to-lateral transport of fluorescent substrates via confluent tumor cell monolayers consists of excitation, sample and detection.

The spectroscopic device according to claim 1 provides the selective optical excitation of the fluorescent substrates with a continuous monochromatic laser or a pulsed monochromatic laser whose radiation is over a glass fiber or with optical lenses or with mirrors on the Sample is focused. The fluorescence emitted by the sample is spectrally selected with an optical dispersion element, and the radiation intensity is using a photodetector as a function of time with a time resolution measured from milliseconds to minutes.

The excitation laser according to claim 2 may be an argon ion laser, Nd: YAG laser, Nd: glass laser, Nd: VO ₄ laser, sapphire laser or a titanium sapphire laser.

The sample according to claim 2 is located in an air-conditioned sample chamber and is surrounded by a cuvette. The cuvette can be a quartz tube, a glass tube or a transparent polymer tube, which is still closed at the bottom. The cuvette is subdivided by a membrane filter in two volumes, the donor volume and the acceptor volume. The tumor cells to be examined adhere in a confluent monolayer on top of the membrane filter. In the donor volume, the fluorescent substrate is dissolved in a concentration range of 10 ^-6 mol / L to 10 ^-3 mol / L in a tumor cell-compatible buffer solution. The acceptor volume contains only the pure buffer solution.

The membrane filter according to claim 4 may be made of polycarbonate or another cell-compatible Polymer exist. The membrane filter must be permeable to be the ions and molecules dissolved in water.

The fluorescent substrates according to claim 4 must be completely water-soluble and may contain xanthene dyes such as rhodamine 123, rhodamine 6G, rhodamine B, rhodamine 101, sulforhodamine 101, sulforhodamine B, Coumarin dyes or anthraquinone dyes.

The cell-compatible buffer solutions according to claim 4 are transparent buffer solutions like the Krebs-Ringer buffer and the phosphate buffer PBS, which has a Adjust pH of 7-7.5 and isotonic solutions represent for the tumor cells.

The air-conditioned sample chamber according to claim 4 is with a steam generator, a heating coil and a Measuring device for temperature and humidity measurement fitted.

The steam generator according to claim 8 can with an ultrasonic source, an infrared light source or be operated a resistance heater.

The heating coil according to claim 8 is a heating tube operated with water. The water can by means of a bath thermostat constantly to the incubation temperature the cells are adjusted.

The optical dispersion element according to claim 2, a spectrally limiting color glass filter, an optical bandpass filter, a prism or grating monochromator, a prism or grating polychromator be.

The photodetector according to claim 2, a photomultiplier, a photodiode, a diode array or to be a CCD camera.

The CCD camera or the diode array according to claims 11 and 12 are either with the prism polychromator or with combined with the grid polychromator.

Measurement of basal-to-lateral transport of fluorescent substrates via the tumor cell monolayers on the membrane filter according to claims 1 and 2 take place immediately after the addition of the fluorescent Substrate. Either the donor volume is excited to fluoresce and the intensity of fluorescence from the donor volume measured as a function of time or it becomes the acceptor volume excited to fluorescence and the intensity of fluorescence measured from the acceptor volume as a function of time.