DE102007048625A1 - Biotechnological production of crotonic acid - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft die biotechnologische Herstellung von Crotonsäure, Butanol und verwandten Verbindungen sowie Mittel und Organismen, die zur Verwendung dazu geeignet sind.The invention relates to the biotechnological production of crotonic acid, butanol and related compounds as well as agents and organisms suitable for use therewith.

Description

Die Erfindung betrifft die biotechnologische Herstellung von Crotonsäure, Butanol und verwandten Verbindungen sowie Mittel und Organismen, die zur Verwendung dazu geeignet sind.The Invention relates to the biotechnological production of crotonic acid, Butanol and related compounds as well as agents and organisms, which are suitable for use.

Stand der TechnikState of the art

Crotonsäure stellt ein vielversprechendes Produkt der biotechnologischen Synthese dar. Crotonsäure kann als Alternative zur Acrylsäure bei der Herstellung von Polymeren und Kunststoffen eingesetzt werden. Die Verwendung von Crotonsäure zur Herstellung von Misch- oder Reinpolymeren, Polycrotonaten und Polycrotonylestern ist schon seit vielen Jahrzehnten bekannt. Crotonsäure ist außerdem die Kohlenstoffquelle verschiedener mikrobieller Prozesse, z. B. zur Herstellung von Carnitin und bei der erst kürzlich entdeckten Umwandlung von Crotonat in Cyclohexan-Carboxylat.crotonic represents a promising product of biotechnological synthesis Crotonic acid can be used as an alternative to acrylic acid used in the production of polymers and plastics. The Use of crotonic acid for the production of mixed or Pure polymers, polycrotonates and polycrotonyl esters have been around known for many decades. Crotonic acid is also the carbon source of various microbial processes, e.g. B. for the production of carnitine and in the recently discovered conversion of crotonate to cyclohexane carboxylate.

Crotonsäure kann biotechnologisch entweder aus einem Thioester oder aus Butanoat durch Reduktion gebildet werden. Die Thioester sind Bestandteile der üblichen Fettsäure-Stoffwechselwege (Crotonsäure ist eine „trans-ungesättigte C4-Fettsäure") und als Fettsäurederivate Bestandteil verschiedener Abbauwege (z. B. Glutarat, Lysin, Tryptophan, Benzoat).crotonic can be biotechnologically derived either from a thioester or from butanoate be formed by reduction. The thioesters are components the usual fatty acid metabolic pathways (crotonic acid is a "trans-unsaturated C4 fatty acid") and as fatty acid derivatives part of various degradation pathways (eg glutarate, lysine, tryptophan, benzoate).

Es besteht der Bedarf an einem verbesserten Weg zur Herstellung von Crotonsäure, insbesondere an einem Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Crotonsäure.It There is a need for an improved way of producing Crotonic acid, in particular on a method for biotechnological Preparation of crotonic acid.

Weiter ist bekannt, dass Crotonsäure beziehungsweise der Crotonsäure-Vorläufer im Stoffwechselweg von biologischen Zellen Crotonyl-CoA das Zwischenprodukt zur biotechnologischen Herstellung von Butanol ist. Die WO 2007/041269 A2 beschreibt die fermentative Herstellung von C4-Alkoholen, besonders von Butanol, mittels rekombinanten Mikroorganismen, wobei die intrazelluläre Butanolsynthese über den Acetoacetyl-CoA-Weg und über das Zwischenprodukt Crotonyl-CoA erfolgt. Dieses Verfahren ist verbesserungswürdig. Nachteilhaft ist hierbei vor allem die starke Abhängigkeit der Produktsynthese vom im Stoffwechsel ubiquitären Acetyl-CoA, welches über die Produktsynthese hinaus einer Vielzahl konkurrierender Biosynthesen dient.It is also known that crotonic acid or the crotonic acid precursor in the metabolic pathway of biological cells crotonyl-CoA is the intermediate for the biotechnological production of butanol. The WO 2007/041269 A2 describes the fermentative production of C4-alcohols, especially of butanol, by means of recombinant microorganisms, whereby the intracellular butanol synthesis takes place via the acetoacetyl-CoA pathway and via the intermediate crotonyl-CoA. This process is in need of improvement. Disadvantageous here is above all the strong dependence of the product synthesis on ubiquitous acetyl-CoA, which, beyond the product synthesis, serves a multiplicity of competing biosyntheses.

Aufgabenstellungtask

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Crotonsäure und Butanol über Crotonyl-CoA sowie Mittel zur Durchführung des Verfahrens bereitzustellen. Das technische Problem besteht auch darin, ein solches Verfahren besonders bei bekannten, in biotechnologischen/fermentativen Prozessen verwendeten Mikroorganismen beziehungsweise Zelllinien, die meist mittels üblicher und etablierter Rekombinationstechnologien in an sich bekannter Weise und unter geringem Aufwand transfiziert werden können, einsetzbar zu machen. Gleichzeitig soll das technische Problem gelöst werden, eine stabile Synthese von Crotonsäure beziehungsweise Butanol aus C3- bis C6-Körpern zu ermöglichen, die sowohl in anaeroben als gegebenenfalls auch in aeroben Prozessen ablaufen kann. Weiter soll das technische Problem gelöst werden, eine bestimmte Substratspezifität des Herstellprozesses zu erreichen.Of the Invention is based on the technical problem, an improved Process for the biotechnological production of crotonic acid and butanol via crotonyl-CoA as well as means of carrying it out of the method. The technical problem also exists therein, such a method especially in known, in biotechnological / fermentative Processes used microorganisms or cell lines, mostly by means of conventional and established recombination technologies transfected in a conventional manner and with little effort can be used to make it usable. At the same time the technical problem to be solved, a stable synthesis of crotonic acid or butanol from C3 to C6 bodies to allow for both anaerobic and if necessary can also occur in aerobic processes. Next is the technical Problem to be solved, a specific substrate specificity to achieve the manufacturing process.

Das technische Problem wird primär gelöst durch Bereitstellung einer transgenen biologischen Zelle, besonders eines rekombinanten Mikroorganismus, worin in exprimierbarer Form, besonders im Genom, mindestens ein heterologes Nucleinsäuremolekül enthalten ist, welches für mindestens eine Enzymaktivität des Hydroxyglutarat-Wegs von Mikroorganismen codiert, und wobei diese Enzymaktivität oder Enzymaktivitäten in der Zelle exprimiert wird oder werden.The technical problem is solved primarily by providing a transgenic biological cell, especially a recombinant one Microorganism in which expressible form, especially in the genome, at least one heterologous nucleic acid molecule which is at least one enzyme activity of the hydroxyglutarate pathway of microorganisms, and wherein this enzyme activity or enzyme activities in the Cell is or will be expressed.

Gegenstand der Erfindung ist somit eine transgene biologische Zelle, enthaltend im Genom mindestens ein heterologes Nucleinsäuremolekül, codierend für Enzymaktivität, ausgewählt aus:
2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase-Aktivität,
(E)-Glutaconat-CoA-Transferase-Aktivität,
(R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA-Dehydratase-Aktivität und
Glutaconyl-CoA-Decarboxylase-Aktivität.The invention thus relates to a transgenic biological cell containing in the genome at least one heterologous nucleic acid molecule coding for enzyme activity, selected from:
2-hydroxy glutarate dehydrogenase activity,
(E) -Glutaconat-CoA transferase activity,
(R) -2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase activity and
Glutaconyl-CoA decarboxylase activity.

Es versteht sich, dass die Zelle mindestens eine der vorstehend definierten Enzymaktivitäten exprimiert. Bevorzugt exprimiert die Zelle zwei, mehrere und besonders bevorzugt alle der vorstehend definierten Enzymaktivitäten. Dazu ist das mindestens eine Nucleinsäuremolekül operativ verbunden mit einem Expressionssystem, das heißt mit einem Promotor oder Promotor-System. Es versteht sich, dass bevorzugt ein konstitutiver Promotor einsetzt wird. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zelle wird der Wildtyp bevorzugt mit einem geeigneten Expressionsvektor, der die Expressionskassette enthält, transformiert.It is understood that the cell expresses at least one of the enzyme activities defined above. Preferably, the cell expresses two, more, and most preferably all of the enzyme activities defined above. For this purpose, the at least one nucleic acid molecule is operatively linked to an expression sion system, ie with a promoter or promoter system. It is understood that preferably a constitutive promoter is used. To produce the cell according to the invention, the wild type is preferably transformed with a suitable expression vector containing the expression cassette.

Gegenstände der Erfindung sind auch eine Expressionskassette und ein diese Expressionskassette enthaltender Vektor, welche geeignet sind, die Expression der erfindungsgemäß vorgesehenen Enzymaktivitäten in der Wirtszelle zu vermitteln.objects The invention also provides an expression cassette and a cassette containing this expression cassette Vector, which are suitable, the expression of the invention provided To mediate enzyme activities in the host cell.

Die erfindungsgemäß bereitgestellte Enzymausstattung erlaubt die Synthese von Crotonyl-CoA aus dem Zwischenprodukt 2-Oxoglutarat (alpha-Ketoglutarat). Die Syntheseweg aus Acetyl-CoA zu Crotonyl-CoA braucht nicht mehr beschritten werden. Dies ermöglicht eine Synthese von Produkten wie Crotonsäure und Butanol aus Crotonyl-CoA, die weitgehend vom Acetyl-CoA-Haushalt der Zelle unabhängig ist. Besonders vorteilhaft ermöglicht die irreversible Reaktion der Glutaconyl-CoA-Dehydrogenase eine verstärkte Steuerung der Produktivität. Eine effiziente Produktsynthese (z. B. Crotonsäure, Butanol) kann vorteilhafterweise auch bei hohen Produktkonzentrationen stattfinden. Gleichzeitig ist es nicht notwendig, dazu auch die Konzentration des Precursors hoch zu halten.The Enzyme equipment provided according to the invention allows the synthesis of crotonyl-CoA from the intermediate 2-oxoglutarate (Alpha-ketoglutarate). The synthetic route from acetyl-CoA to crotonyl-CoA needs no longer be trodden. This allows a synthesis of products such as crotonic acid and butanol from crotonyl-CoA, largely independent of the acetyl-CoA budget of the cell is. Particularly advantageous allows the irreversible Reaction of glutaconyl-CoA dehydrogenase enhanced Control of productivity. An efficient product synthesis (For example, crotonic acid, butanol) may advantageously also take place at high product concentrations. At the same time it is not necessary, as well as the concentration of the precursor high to keep.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Lösung liegt in der gegenüber bekannten Stoffwechselwegen (z. B. Umkehrung der beta-Oxidation) deutlich erhöhten Substratspezifität bezüglich der Kettenlänge.One Another advantage of the solution according to the invention lies in the known metabolic pathways (z. Reversal of beta oxidation) markedly increased substrate specificity in terms of chain length.

Unter einer 2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase-Aktivität, wird vorliegend die Fähigkeit zur katalytischen Umwandlung des Substrats 2-Oxoglutarat (alpha-Ketoglutarat) in das Produkt 2-Hydroxyglutarat verstanden. Bevorzugt wird darunter die Aktivität der 2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase (EC 1.1.99.2) verstanden. Bevorzugt stammt die 2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), besonders das Enzym EC 1.1.99.2 (FN 0487), oder ist daraus abgeleitet. Die diese 2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase-Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 1; diese 2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase weist bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 auf.Under a 2-hydroxyglutarate dehydrogenase activity is present the ability to catalytically transform the substrate 2-Oxoglutarate (alpha-ketoglutarate) in the product 2-hydroxyglutarate Understood. Preferred is the activity of 2-hydroxyglutarate dehydrogenase (EC 1.1.99.2) understood. Preferably, the 2-hydroxyglutarate dehydrogenase activity is derived from the microorganism Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), especially the enzyme EC 1.1.99.2 (FN 0487), or is derived therefrom. The these 2-hydroxyglutarate dehydrogenase activity-encoding nucleotide sequence is SEQ ID NO: 1; this 2-hydroxyglutarate dehydrogenase is preferred the amino acid sequence SEQ ID NO: 2.

Unter einer (E)-Glutaconat-CoA-Transferase-Aktivität, wird vorliegend die Fähigkeit zur katalytischen Umwandlung des Substrats 2-Hydroxyglutarat in das Produkt 2-Hydroxyglutarat-CoA (2-Hydroxyglutarat-Coenzyme A) verstanden. Bevorzugt wird darunter die Aktivität der (E)-Glutaconat-CoA-Transferase (EC 2.8.3.12) verstanden. Bevorzugt stammt die (E)-Glutaconat-CoA-Transferase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), besonders das Enzym EC 2.8.3.12 (FN 0202 und FN 0203), oder ist daraus abgeleitet. Die diese (E)-Glutaconat-CoA-Transferase-Aktivität codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 3 für Untereinheit A (subunit A) sowie SEQ ID NO: 5 für Untereinheit B (subunit B); diese (E)-Glutaconat-CoA-Transferase weist bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 4 für Untereinheit A (subunit A) sowie SEQ ID NO: 6 für Untereinheit B (subunit B) auf.Under an (E) -glutaconate-CoA transferase activity, is present the ability to catalytically transform the substrate 2-hydroxyglutarate in the product 2-hydroxyglutarate-CoA (2-hydroxyglutarate-coenzymes A) understood. Preferred is the activity of the (E) -glutaconate-CoA transferase (EC 2.8.3.12) understood. Prefers the (E) -glutaconate-CoA transferase activity originates the microorganism Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), especially the enzyme EC 2.8.3.12 (FN 0202 and FN 0203), or is derived therefrom. Those encoding this (E) -glutaconate CoA transferase activity Nucleotide sequences are SEQ ID NO: 3 for subunit A (subunit A) and SEQ ID NO: 5 for subunit B (subunit B); this (E) -glutaconate CoA transferase preferably has the amino acid sequences SEQ ID NO: 4 for subunit A (subunit A) and SEQ ID NO: 6 for subunit B (subunit B).

Unter einer (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA-Dehydratase-Aktivität, wird vorliegend die Fähigkeit zur katalytischen Umwandlung des Substrats 2-Hydroxyglutarat-CoA (2-Hydroxyglutarat-Coenzyme A) in das Produkt Glutaconyl-CoA (Glutaconyl-Coenzyme A) verstanden. Bevorzugt wird darunter die Aktivität der (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA-Dehydratase (EC 4.2.1.-) verstanden. Bevorzugt stammt die (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA-Dehydratase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), besonders das Enzym EC 4.2.1.- (FN 0206, FN 0207 und FN 0208), oder ist daraus abgeleitet. Die diese (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA-Dehydratase-Aktivität codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 7 für Untereinheit alpha (alpha-subunit) und SEQ ID NO: 9 für Untereinheit beta (beta-subunit) sowie SEQ ID NO: 11 für die Aktivator-Einheit; diese (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA-Dehydratase weist bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 8 für Untereinheit alpha (alpha-subunit) und SEQ ID NO: 10 für Untereinheit beta (beta-subunit) sowie SEQ ID NO: 12 für die Aktivator-Einheit auf.Under (R) -2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase activity, In the present case, the ability for catalytic conversion of the substrate 2-hydroxyglutarate-CoA (2-hydroxyglutarate-coenzymes A) in the product glutaconyl-CoA (glutaconyl-coenzymes A) understood. Preferred among them is the activity of (R) -2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase (EC 4.2.1.-) understood. Preferably, the (R) -2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase activity is derived from the microorganism Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), especially the enzyme EC 4.2.1.- (FN 0206, FN 0207 and FN 0208), or is from it derived. This (R) -2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase activity encoding nucleotide sequences are SEQ ID NO: 7 for subunit alpha (alpha subunit) and SEQ ID NO: 9 for subunit beta (beta-subunit) and SEQ ID NO: 11 for the activator unit; This (R) -2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase preferably has the Amino acid sequences SEQ ID NO: 8 for subunit alpha (alpha subunit) and SEQ ID NO: 10 for subunit beta (beta subunit) and SEQ ID NO: 12 for the activator unit on.

Unter einer Glutaconyl-CoA-Decarboxylase-Aktivität, wird vorliegend die Fähigkeit zur katalytischen Umwandlung des Substrats Glutaconyl-CoA (Glutaconyl-Coenzyme A) in das Produkt Crotonyl-CoA (Crotonyl-Coenzyme A) verstanden. Bevorzugt wird darunter die Aktivität der Glutaconyl-CoA-Decarboxylase-Aktivität (EC 4.1.1.70) verstanden. Bevorzugt stammt die Glutaconyl-CoA-Decarboxylase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), besonders das Enzym EC 4.1.1.70 (FN 0204, FN 0201, FN 0200 und FN 0199), oder ist daraus abgeleitet. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist die Glutaconyl-CoA-Decarboxylase EC 4.1.1.70 ein Heterotetramer aus 4 Untereinheiten. Die diese Glutaconyl-CoA-Decarboxylase-Aktivität codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 19 für Untereinheit alpha (alpha-subunit), SEQ ID NO: 17 für Untereinheit beta (beta-subunit) und SEQ ID NO: 15 für Untereinheit gamma (gamma-subunit), das heißt die Biotin-Carboxyl-Carrier-Einheit, sowie gegebenenfalls SEQ ID NO: 13 für die vierte Untereinheit; diese Glutaconyl-CoA-Decarboxylase weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 20 für Untereinheit alpha (alpha-subunit), SEQ ID NO: 18 für Untereinheit beta (beta-subunit) und SEQ ID NO: 16 für Untereinheit gamma (gamma-subunit) sowie bevorzugt SEQ ID NO: 14 für die vierte Untereinheit auf.Under a glutaconyl-CoA decarboxylase activity, in the present case, the ability to catalytically convert the substrate glutaconyl-CoA (glutaconyl-coenzymes A) in the product crotonyl-CoA (crotonyl-coenzyme A) understood. This is preferably understood as meaning the activity of glutaconyl-CoA decarboxylase activity (EC 4.1.1.70). The glutaconyl-CoA decarboxylase activity preferably originates from the microorganism Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), in particular the enzyme EC 4.1.1.70 (FN 0204, FN 0201, FN 0200 and FN 0199), or is derived therefrom. According to the current state of knowledge, glutaconyl-CoA-decarboxylase EC 4.1.1.70 is a 4-subunit heterotetramer. The nucleotide sequences encoding this glutaconyl-CoA decarboxylase activity are SEQ ID NO: 19 for subunit alpha (alpha subunit), SEQ ID NO: 17 for subunit beta (beta subunit), and SEQ ID NO: 15 for subunit gamma (gamma -subunit), that is the biotin-carboxyl-carrier unit, and optionally SEQ ID NO: 13 for the fourth Subunit; This glutaconyl-CoA decarboxylase thus preferably has the amino acid sequences SEQ ID NO: 20 for subunit alpha (alpha subunit), SEQ ID NO: 18 for subunit beta (beta subunit) and SEQ ID NO: 16 for subunit gamma (gamma) subunit) and preferably SEQ ID NO: 14 for the fourth subunit.

Die Erfindung betrifft auch 2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase-Aktivität, (E)-Glutaconat-CoA-Transferase-Aktivität, (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA-Dehydratase-Aktivität und Glutaconyl-CoA-Decarboxylase-Aktivität, die von anderen Organismen abgeleitet sind, sofern sie für die erfindungsgemäßen Zwecke einsetzbar sind. Der Fachmann kann diese anhand von Vergleichen mit den vorstehend konkret beschriebenen erfindungsgemäßen Enzymen finden. Alternative Quellen von erfindungsgemäß verwendbaren heterologen Genen sind die Gene der Glutaconyl-CoA-Decarboxylase aus Acidaminococcus fermentans.The Invention also relates to 2-hydroxyglutarate dehydrogenase activity, (E) -glutaconate-CoA transferase activity, (R) -2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase activity and glutaconyl-CoA decarboxylase activity by others Organisms are derived, provided they are for the invention Purpose can be used. The skilled person can compare these with the invention specifically described above Find enzymes. Alternative sources of usable according to the invention heterologous genes are the genes of glutaconyl-CoA decarboxylase from Acidaminococcus fermentans.

Die Erfindung betrifft also eine transgene biologische Zelle, vorzugsweise also einen Wirtsorganismus, der im Genom zumindest eine heterologe Nucleotidsequenz aufweist, die für eine der vorgenannten Enzymaktivitäten codiert.The The invention thus relates to a transgenic biological cell, preferably that is, a host organism that has at least one heterologous gene in the genome Having nucleotide sequence, which for one of the aforementioned Enzyme activities encoded.

Neben den vorstehend bevorzugt genannten Nucleotidsequenzen und zugehörigen Aminosäuresequenzen können vergleichbare Gene aus dem Genom von weiteren Mikroorganismen in an sich bekannter Weise gefunden werden. Es wird auf die gängigen und an sich bekannten Tools und Datenbanken der Bioinformatik verwiesen. Ist ein entsprechender Mikroorganismus, welcher die gewünschte Nucleotidsequenz in seinem Genom trägt, identifiziert, so können die entsprechenden Nucleinsäuremoleküle (DNA) mit den üblichen Verfahren daraus isoliert und amplifiziert werden.Next the above-mentioned nucleotide sequences and associated Amino acid sequences can be comparable genes from the genome of other microorganisms in a conventional manner being found. It is on the common and known Referenced tools and databases of bioinformatics. Is a corresponding Microorganism containing the desired nucleotide sequence carries in his genome, identifies, so can the corresponding nucleic acid molecules (DNA) isolated and amplified with the usual methods become.

Die Erfindung betrifft eine Zelle, worin das heterologe Nucleinsäuremolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

  • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 enthalten oder daraus bestehen;
  • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
  • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Enzymaktivität, ausgewählt aus: 2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase-Aktivität, (E)-Glutaconat-CoA-Transferase-Aktivität, (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA-Dehydratase-Aktivität und Glutaconyl-CoA-Decarboxylase-Aktivität, codieren.
The invention relates to a cell wherein the heterologous nucleic acid molecule is selected from the group consisting of:
  • a) nucleic acid molecules which contain or consist of the sequences SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19;
  • b) nucleic acid molecules coding for amino acid molecules containing or consisting of the sequences SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20; and
  • c) nucleic acid molecules which have at least 50%, preferably at least 60%, 70%, 80%, particularly preferably at least 90% or more homology with the nucleic acid molecules described under a) and b) and preferably an enzyme activity selected from: 2- Encode hydroxyglutarate dehydrogenase activity, (E) -glutaconate-CoA transferase activity, (R) -2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase activity, and glutaconyl-CoA decarboxylase activity.

Die Transformation der erfindungsgemäßen Zellen und der Einbau der isolierten Nucleinsäuremoleküle erfolgt in an sich bekannter Weise, bevorzugt durch entsprechend geeignete Expressionsvektoren beziehungsweise in Verbindung mit entsprechenden Expressionskassetten, bevorzugt inklusive entsprechender Expressionsvektoren. Alternativ erfolgt eine de novo-Synthese von Nucleinsäurepolymeren mit gewünschten Nucleotidsequenzen, gegebenenfalls einer kompletten Expressionskassette in einem geeigneten Synthesesystem.The Transformation of the cells of the invention and the incorporation of the isolated nucleic acid molecules takes place in a conventional manner, preferably by appropriately suitable expression vectors or in conjunction with corresponding expression cassettes, preferably including appropriate Expression vectors. Alternatively, a de novo synthesis of Nucleic acid polymers with desired nucleotide sequences, optionally a complete expression cassette in a suitable Synthesis system.

Die Erfindung umfasst dabei bevorzugt solche transgenen oder rekombinanten Zellen, die aus Bakterien, Cyanobakterien, Pilzen und Hefen ausgewählt sind. Bevorzugt ist die Zelle ausgewählt aus Bakterien der Gattungen Escherichia, Corynebacterium, Ralstonia, Clostridium, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus und Lactococcus. Besonders bevorzugt ist die Zelle ausgewählt aus Bakterien der Spezies Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Ralstonia eutropha und Clostridium acetobutylicum.The The invention preferably comprises such transgenic or recombinant Cells selected from bacteria, cyanobacteria, fungi and yeasts are. Preferably, the cell is selected from bacteria of the genera Escherichia, Corynebacterium, Ralstonia, Clostridium, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus and Lactococcus. Especially preferably, the cell is selected from bacteria of the species Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Ralstonia eutropha and Clostridium acetobutylicum.

Die Erfindung umfasst auch solche biologischen Zellen die ein synthetischer Mikroorganismus sind oder davon abgeleitet sind. Unter einer Zelle werden vorliegend auch Membranvesikel, Membrankompartimente sowie Teile und Fragmente davon verstanden. Erfindungsgemäß bevorzugt befinden sich die Enzymaktivitäten im „Inneren" beziehungsweise Cytosol oder Cytoplasma der Zelle. Alternativ oder zusätzlich liegt mindestens eine der Enzymaktivitäten an einer Membran, besonders an einer Zellmembran assoziiert vor. Die Erfindung umfasst demgemäß auch oder Teile oder Fragmente eines erfindungsgemäßen transgenen Mikroorganismus, welche bevorzugt und in an sich bekannter Weise und unter Erhalt der Enzymaktivität an Trägerstrukturen assoziiert oder gebunden sind.The The invention also encompasses those biological cells which are synthetic Are or derived from microorganism. Under a cell In the present case, membrane vesicles, membrane compartments as well as Parts and fragments of it understood. According to the invention preferred are the enzyme activities in the "interior" or cytosol or cytoplasm of the cell. Alternatively or In addition, at least one of the enzyme activities on a membrane, especially associated with a cell membrane. The invention accordingly also includes or parts or fragments of a transgenic invention Microorganism, which preferably and in a conventional manner and preserving enzyme activity on support structures are associated or bound.

Die Erfindung umfasst auch einen Biokatalysator, worin die Enzymaktivitäten durch isolierte oder synthetisierte Enzymproteine mit den vorliegend angegebenen Aminosäuresequenzen realisiert sind. Dies geschieht vorzugsweise unter Umgehung zellulärer Expressions- und Translationssysteme durch Inkorporation der Enzymproteine in die Zelle oder Biokatalysator.The The invention also encompasses a biocatalyst wherein the enzyme activities by isolated or synthesized enzyme proteins with the present ones specified amino acid sequences are realized. this happens preferably bypassing cellular expression and Translation systems by incorporation of the enzyme proteins in the Cell or biocatalyst.

Rekombinante Zellen, besonders rekombinante Mikroorganismen, welche die erfindungsgemäßen Gene enthalten und exprimieren, werden in an sich bekannter Weise durch übliche Rekombinati onstechnologien hergestellt. Es versteht sich, dass die für die Rekombination ausgewählten Zellen oder Mikroorganismen gegenüber den gewünschten Stoffwechselendprodukten ausreichende Resistenz aufweisen und in der Lage sind, die angebotenen Substrate, besonders die C3- bis C6-Kohlenstoffquelle, in ausreichender Menge aufzunehmen und zu verstoffwechseln. Bevorzugt sind solche Zellen und Mikroorganismen, für die in der biotechnologischen Produktion standardisierte Kultivierungsbedingungen etabliert sind, sodass sich eine aufwändige Anpassung der etablierten biotechnologischen Prozessführung minimieren oder weitgehend vermeiden lässt.recombinant Cells, particularly recombinant microorganisms containing the genes of the invention contain and express, are in a conventional manner by conventional Recombination technologies produced. It is understood that the cells selected for recombination or Microorganisms towards the desired metabolic end products have sufficient resistance and are able to offer the offered Substrates, especially the C3 to C6 carbon source, in sufficient Intake and metabolize. Preferred are such Cells and microorganisms for use in biotechnology Production standardized cultivation conditions are established, so that an elaborate adaptation of the established biotechnological Minimize or largely avoid litigation.

Vom Umfang der Erfindung sind auch solche Zellen beziehungsweise Mikroorganismen und Zelllinien erfasst, die bereits in der nicht rekombinierten/transgenen Form zumindest eines oder mehrere der Gene beinhalten und exprimieren, die für eine der erfindungsgemäß vorgesehenen Enzymaktivitäten codieren. Es versteht sich, dass je nach Aktivität des vorhanden homologen Gens gegebenenfalls keine entsprechende Rekombination mit den analogen heterologen Genen erfolgen braucht. Gegebenenfalls werden an sich bekannte Maßnahmen zur Sicherstellung der homologen Expression beziehungsweise Überexpression des homologen Gens getroffen, um den Hydroxyglutarat-Weg von 2-Oxoglutarat bis Crotonyl-CoA vollständig zu realisieren.from Scope of the invention are also such cells or microorganisms and cell lines already detected in the non-recombined / transgenic Contain and express at least one or more of the genes, for one of the inventively provided Encoding enzyme activities. It is understood that depending on Activity of the homologous gene present may be none corresponding recombination with the analogous heterologous genes needs. If necessary, be known measures to ensure homologous expression or overexpression of the homologous gene taken to the hydroxyglutarate pathway of 2-oxoglutarate to fully realize crotonyl-CoA.

Je nach Enzymausstattung des Ausgangsorganismus kann es zusätzlich erforderlich sein, eventuell vorhandene konkurrierende Stoffwechselwege auszuschalten beziehungsweise zu unterdrücken. Dies kann durch an sich bekannte Maßnahmen erfolgen. Bevorzugte Ausgestaltungen solcher „enzymhemmender" Maßnahmen sind nachstehend beispielhaft für Mikroorganismen der Gattungen Esche richia und Corynebacterium dargestellt. Zellen beziehungsweise Mikroorganismen, die entsprechende Deletionen zur Unterdrückung von konkurrierenden Stoffwechselwegen aufweisen, sind ebenfalls von der Erfindung umfasst.ever after enzyme equipment of the parent organism it may additionally be necessary, possibly existing competing metabolic pathways switch off or suppress. This can be done by measures known per se take place. Preferred embodiments such "enzyme inhibiting" measures are below exemplary of microorganisms of the genus ash richia and Corynebacterium. Cells or microorganisms, the corresponding deletions for the suppression of competing Metabolic pathways are also included in the invention.

Eine bevorzugte Ausführung der Erfindung ist eine transgene beziehungsweise rekombinante E. coli Zelle, beispielsweise abgeleitet aus den Zelllinien K12. Eine alternative bevorzugte Ausführung der Erfindung ist eine transgene beziehungsweise rekombinante Corynebacterium glutamicum Zelle, beispielsweise abgeleitet aus der Zelllinie Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.A preferred embodiment of the invention is a transgenic or recombinant E. coli cell, for example derived from the cell lines K12. An alternative preferred embodiment The invention is a transgenic or recombinant Corynebacterium glutamicum cell, for example, derived from the cell line Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.

Die Erfindung macht sich die überraschende Erkenntnis zunutze, dass in einer geeigneten transgenen beziehungsweise rekombinanten biologischen Zelle durch rekombinante Expression der vorgenannten Enzyme beziehungsweise Enzymaktivitäten des Hydroxyglutarat-Wegs die Umwandlung von 2-Oxoglutarat in das Stoffwechselzwischenprodukt Crotonyl-CoA ermöglicht wird. Die Ausbeute und der Stofffluss von 2-Oxoglutarat zu Crotonyl-CoA ist überraschend hoch. Das derart hoch effektiv gebildete Crotonyl-CoA wird in der Zelle, je nach Enzymausstattung, schließlich bevorzugt in Crotonat, Butyrat und/oder Butanol weiter verstoffwechselt. Der bekannte Stoffwechselweg über Acetoacetyl-CoA zu Crotonyl-CoA braucht nicht beschritten werden.The Invention takes advantage of the surprising insight that in a suitable transgenic or recombinant biological cell by recombinant expression of the aforementioned Enzymes or enzyme activities of the hydroxyglutarate pathway the conversion of 2-oxoglutarate into the metabolic intermediate Crotonyl-CoA is enabled. The yield and the material flow from 2-oxoglutarate to crotonyl-CoA is surprisingly high. The highly effective crotonyl CoA formed in the cell will ever after enzyme equipment, finally preferred in Crotonat, Butyrate and / or butanol further metabolized. The known metabolic pathway over Acetoacetyl-CoA to crotonyl-CoA need not be trodden.

Die Erfindung sieht dazu auch vor, dass in der erfindungsgemäßen Zelle zusätzlich eine Coenzym A-Transferase-Aktivität in ausreichendem Maß vorhanden ist. Dies geschieht bevorzugt durch Sicherstellung der Expression einer Coenzym A-Transferase. Vorzugsweise wird dies in E. coli erreicht durch homologe Überexpres sion der Coenzym A-Transferase atoAD (EC 2.8.3.8), beziehungsweise durch alternative oder zusätzliche rekombinante/heterologe Expression einer Coenzym A-Transferase-Aktivität. Dies wird bevorzugt erreicht durch alternative und bevorzugt zusätzliche heterologe Expression mindestens einer der Enzymaktivitäten ausgewählt aus:
Coenzym A-Transferase-Aktivität,
Phosphotransbutyrylase-Aktivität,
Butyrat-Kinase-Aktivität,
2-Enoat-Reduktase-Aktivität und
Butyryl-CoA-Acetat-Coenzym A-Transferase-Aktivität;
besonders durch Expression eines oder mehrerer der Enzyme Coenzym A-Transferase atoA und atoD (EC 2.8.3.8) aus E. coli, codiert durch die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 31 und 29 bevorzugt, mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 32 und 30; Phosphotransbutyrylase (CAC3076) aus Clostridium acetobutylicum, codiert durch die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 21, bevorzugt mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 22; Butyrat-Kinase (CAC1660 oder CAC3075) aus Clostridium acetobutylicum, codiert durch die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 23 oder 25, bevorzugt mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 24 beziehungsweise 26; 2-Enoat-Reduktase (CAA71086, EC 1.3.1.31) aus Clostridium tyrobutyricum, codiert durch die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 27, bevorzugt mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 28; sowie Butyryl-CoA-Acetat-Coenzym A-Transferase actA (EC 2.8.3.8) aus Corynebacterium glutamicum, codiert durch die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 55, bevorzugt mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 56; oder davon abgeleiteter Enzymaktivitäten.The invention also provides that in the cell according to the invention additionally a coenzyme A transferase activity is sufficiently present. This is preferably done by ensuring expression of a coenzyme A transferase. This is preferably achieved in E. coli by homologous overexpression of coenzyme A transferase atoAD (EC 2.8.3.8), or by alternative or additional recombinant / heterologous expression of a coenzyme A transferase activity. This is preferably achieved by alternative and preferably additional heterologous expression of at least one of the enzyme activities selected from:
Coenzyme A transferase activity,
Phosphotransbutyrylase activity
Butyrate kinase activity,
2-enoate reductase activity and
Butyryl-CoA-acetate coenzyme A transferase activity;
especially by expression of one or more of the enzymes coenzyme A-transferase atoA and atoD (EC 2.8.3.8) from E. coli encoded by the nucleotide sequences SEQ ID NO: 31 and 29 preferably, having the amino acid sequences SEQ ID NO: 32 and 30; Phosphotransbutyrylase (CAC3076) from Clostridium acetobutylicum encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 21, preferably with the amino acid sequence SEQ ID NO: 22; Butyrate kinase (CAC1660 or CAC3075) from Clostridium acetobutylicum encoded by the nucleotide sequences SEQ ID NO: 23 or 25, preferably with the amino acid sequences SEQ ID NO: 24 and 26, respectively; 2-enoate reductase (CAA71086, EC 1.3.1.31) from Clostridium tyrobutyricum encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 27, preferably with the amino acid sequence SEQ ID NO: 28; and butyryl-CoA-acetate coenzyme A-transferase actA (EC 2.8.3.8) from Corynebacterium glutamicum encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 55, preferably with the amino acid sequence SEQ ID NO: 56; or derived enzyme activities.

In Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten E. coli-Zelle sieht die Erfindung dazu bevorzugt vor: die homologe Expression oder Überexpression der E. coli-eigenen Coenzym A-Transferase atoA, atoD (EC 2.8.3.8) sowie bevorzugt zusätzlich die rekombinante/heterologe Expression der Phosphotransbutyrylase (CAC3076) und Butyrat-Kinase (CAC1660/CAC3075) aus Clostridium acetobutylicum und/oder 2-Enoat-Reduktase (CAA71086, EC 1.3.1.31) aus Clostridium tyrobutyricum.In connection with the use of a recombinant E. coli cell, the invention preferably provides for this: the homologous expression or overexpression of E. coli's own coenzyme A-transferase atoA , atoD (EC 2.8.3.8) and preferably additionally the recombinant / heterologous Expression of phosphotransbutyrylase (CAC3076) and butyrate kinase (CAC1660 / CAC3075) from Clostridium acetobutylicum and / or 2-enoate reductase (CAA71086, EC 1.3.1.31) from Clostridium tyrobutyricum.

In Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten Corynebacterium glutamicum Zelle sieht die Erfindung bevorzugt vor: die homologe Überexpression der Corynebacterium-eigenen Butyryl-CoA-Acetat-Coenzym A-Transferase actA (EC 2.8.3.8) sowie bevorzugt zusätzlich die rekombinante/heterologe Expression der Coenzym A-Transferase atoA, atoD (EC 2.8.3.8) aus E. coli und/oder 2-Enoat-Reduktase (CAA71086, EC 1.3.1.31) aus Clostridium tyrobutyricum.In connection with the use of a recombinant Corynebacterium glutamicum cell, the invention preferably provides: the homologous overexpression of Corynebacterium's own butyryl-CoA-acetate coenzyme A-transferase actA (EC 2.8.3.8) and preferably additionally the recombinant / heterologous expression of the coenzyme A-transferase atoA , atoD (EC 2.8.3.8) from E. coli and / or 2-enoate reductase (CAA71086, EC 1.3.1.31) from Clostridium tyrobutyricum.

Bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist deshalb eine Zelle, die im Genom mindestens ein Nucleinsäuremolekül mit Nucleotidsequenz, codierend für Coenzym A-Transferase-Aktivität aufweist, wobei die Coenzym A-Transferase-Aktivität bevorzugt die Aktivität der Coenzym A-Transferase atoA/atoD aus E. coli ist, wobei das Nucleinsäuremolekül bevorzugt ausgewählt ist aus:

  • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 29 und 31 enthalten oder daraus bestehen;
  • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO: 30 und 32 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
  • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, be vorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und die Aktivität der Coenzym A-Transferase atoA/atoD codieren.
Therefore, the preferred subject matter of the invention is a cell having in the genome at least one nucleic acid molecule with nucleotide sequence coding for coenzyme A transferase activity, wherein the coenzyme A transferase activity preferably the activity of coenzyme A transferase atoA / atoD from E. coli, wherein the nucleic acid molecule is preferably selected from:
  • a) nucleic acid molecules which contain or consist of the sequences SEQ ID NO: 29 and 31;
  • b) nucleic acid molecules encoding amino acid molecules containing or consisting of sequences SEQ ID NOS: 30 and 32; and
  • c) nucleic acid molecules which have at least 50%, preferably at least 60%, 70%, 80%, particularly preferably at least 90% or more, homology with the nucleic acid molecules described under a) and b) and the activity of coenzyme A transferase atoA / atoD code.

Bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist auch eine Zelle, die im Genom mindestens ein Nucleinsäuremolekül mit Nucleotidsequenz, codierend für Phosphotransbutyrylase-Aktivität. aufweist, wobei die Phosphotransbutyrylase-Aktivität bevorzugt die Aktivität der Phosphotransbutyrylase (CAC3076) aus Clostridium acetobutylicum ist, wobei das Nucleinsäuremolekül bevorzugt ausgewählt ist aus:

  • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenz SEQ ID NO: 21 enthalten oder daraus bestehen;
  • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenz SEQ ID NO: 22 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
  • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und die Aktivität der Phosphotransbutyrylase codieren.
A preferred subject matter of the invention is also a cell having in the genome at least one nucleic acid molecule with nucleotide sequence coding for phosphotransbutyrylase activity. in which the phosphotransbutyrylase activity is preferably the activity of phosphotransbutyrylase (CAC3076) from Clostridium acetobutylicum, where the nucleic acid molecule is preferably selected from:
  • a) nucleic acid molecules which contain or consist of the sequence SEQ ID NO: 21;
  • b) nucleic acid molecules coding for amino acid molecules containing or consisting of the sequence SEQ ID NO: 22; and
  • c) nucleic acid molecules which have at least 50%, preferably at least 60%, 70%, 80%, particularly preferably at least 90% or more homology with the nucleic acid molecules described under a) and b) and encode the activity of phosphotransbutyrylase.

Bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist auch eine Zelle, die im Genom mindestens ein Nucleinsäuremolekül mit Nucleotidsequenz, codierend für Butyrat-Kinase-Aktivität aufweist, wobei die Butyrat-Kinase-Aktivität bevorzugt die Aktivität der Butyrat-Kinase (CAC1660 oder CAC3075) aus Clostridium acetobutylicum ist, wobei das Nucleinsäuremolekül bevorzugt ausgewählt ist aus:

  • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenz SEQ ID NO: 23 und/oder 25 enthalten oder daraus bestehen;
  • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenz SEQ ID NO: 24 und/oder 26 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
  • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und die Aktivität der Butyrat-Kinase codieren.
A preferred subject matter of the invention is also a cell having in the genome at least one nucleic acid molecule with nucleotide sequence coding for butyrate kinase activity, wherein the butyrate kinase activity is preferably the activity of the butyrate kinase (CAC1660 or CAC3075) from Clostridium acetobutylicum , wherein the nucleic acid molecule is preferably selected from:
  • a) nucleic acid molecules which contain or consist of the sequence SEQ ID NO: 23 and / or 25;
  • b) nucleic acid molecules coding for amino acid molecules containing or consisting of the sequence SEQ ID NO: 24 and / or 26; and
  • c) nucleic acid molecules which have at least 50%, preferably at least 60%, 70%, 80%, particularly preferably at least 90% or more homology with the nucleic acid molecules described under a) and b) and encode the activity of the butyrate kinase.

Bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist auch eine Zelle, die im Genom mindestens ein Nucleinsäuremolekül mit Nucleotidsequenz, codierend für 2-Enoat-Reduktase-Aktivität aufweist, wobei die 2-Enoat-Reduktase-Aktivität bevorzugt die Aktivität der 2-Enoat-Reduktase (CAA71086, EC 1.3.1.31) aus Clostridium tyrobutyricum ist, wobei das Nucleinsäuremolekül bevorzugt ausgewählt ist aus:

  • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenz SEQ ID NO: 27 enthalten oder daraus bestehen;
  • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenz SEQ ID NO: 28 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
  • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und die Aktivität der 2-Enoat-Reduktase codieren.
A preferred subject of the invention is also a cell which has in the genome at least one nucleic acid molecule with nucleotide sequence coding for 2-enoate reductase activity, wherein the 2-enoate reductase activity preferably the activity of 2-enoate reductase (CAA71086, EC 1.3.1.31) from Clostridium tyrobutyricum, wherein the nucleic acid molecule is preferably selected from:
  • a) nucleic acid molecules which contain or consist of the sequence SEQ ID NO: 27;
  • b) nucleic acid molecules encoding amino acid molecules containing or consisting of the sequence SEQ ID NO: 28; and
  • c) nucleic acid molecules which have at least 50%, preferably at least 60%, 70%, 80%, particularly preferably at least 90% or more homology with the nucleic acid molecules described under a) and b) and encode the activity of 2-enoate reductase.

Bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist auch eine Zelle, die im Genom mindestens ein Nucleinsäuremolekül mit Nucleotidsequenz, codierend für Butyryl-CoA-Acetat-Coenzym A-Transferase-Aktivität aufweist, wobei die Butyryl-CoA-Acetat-Coenzym A-Transferase-Aktivität bevorzugt die Aktivität der Butyryl-CoA-Acetat-Coenzym A-Transferase actA (EC 2.8.3.8) aus Corynebacterium glutamicum ist, wobei das Nucleinsäuremolekül bevorzugt ausgewählt ist aus:

  • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenz SEQ ID NO: 55 enthalten oder daraus bestehen;
  • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenz SEQ ID NO: 56 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
  • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und die Aktivität der Butyryl-CoA-Acetat-Coenzym A-Transferase codieren.
A preferred subject matter of the invention is also a cell having in the genome at least one nucleic acid molecule with nucleotide sequence coding for butyryl-CoA-acetate-coenzyme A transferase activity, wherein the butyryl-CoA-acetate coenzyme A transferase activity preferably the Activity of the butyryl CoA acetate coenzyme A transferase actA (EC 2.8.3.8) from Corynebacterium glutamicum, wherein the nucleic acid molecule is preferably selected from:
  • a) nucleic acid molecules which contain or consist of the sequence SEQ ID NO: 55;
  • b) nucleic acid molecules coding for amino acid molecules containing or consisting of the sequence SEQ ID NO: 56; and
  • c) nucleic acid molecules which have at least 50%, preferably at least 60%, 70%, 80%, particularly preferably at least 90% or more homology with the nucleic acid molecules described under a) and b), and the activity of the butyryl-CoA acetate Coenzyme A-transferase encode.

Je nach Enzymausstattung des zur Rekombination verwendeten Mikroorganismus sieht die Erfindung bevorzugt vor, Enzyme der Glutamatsynthese, vor allem eine Glutamat-Dehydrogenase-Aktivität und eine Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase-Aktivität zu unterdrücken oder zu hemmen. Dies geschieht durch an sich bekannte Maßnahmen, bevorzugt durch Deletion der diese Enzyme codieren den Nucleotidsequenzen. In Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten Corynebacterium glutamicum-Zelle sieht die Erfindung dazu bevorzugt vor: die Hemmung der Corynebacteriumeigenen Glutamat-Dehydrogenase-Aktivität durch Deletion mindestens des Gens für gdh, dargestellt durch SEQ ID NO: 49 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 50, sowie alternativ oder bevorzugt zusätzlich die Hemmung der Corynebacteriumeigenen Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase-Aktivität durch Deletion mindestens des Gens für gltB, dargestellt durch die SEQ ID NO: 51 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 52, und/oder für gltD, dargestellt durch die SEQ ID NO: 53 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 54.Depending on the enzyme equipment of the microorganism used for recombination, the invention preferably provides to suppress or inhibit enzymes of glutamate synthesis, in particular a glutamate dehydrogenase activity and a glutamine-oxoglutarate aminotransferase activity. This is done by measures known per se, preferably by deletion of these enzymes encode the nucleotide sequences. In connection with the use of a recombinant Corynebacterium glutamicum cell, the invention preferably provides for this: the inhibition of Corynebacterium's own glutamate dehydrogenase activity by deletion of at least the gene for gdh , represented by SEQ ID NO: 49 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO : 50, and alternatively or preferably additionally, the inhibition of Corynebacterium's own glutamine-oxoglutarate aminotransferase activity by deleting at least the gene for gltB , represented by SEQ ID NO: 51 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 52, and / or gltD represented by SEQ ID NO: 53 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 54.

Zur Unterstützung des 2-Oxoglutarat-Crotonyl-CoA-Stoffwechselwegs sieht die Erfindung bevorzugt vor, den potentiellen Abbau von 2-Oxoglutarat zu unterdrücken. Dies geschieht erfindungsgemäß bevorzugt durch Hemmung einer gegebenenfalls in der erfindungsgemäßen Zelle vorhandenen 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Aktivität und/oder ähnlichen Enzymaktivitäten, bevorzugt durch Hemmung der Expression und/oder Deletion der diese Enzymaktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen/Gene.to Support of the 2-oxoglutarate-crotonyl-CoA pathway For example, the invention contemplates the potential degradation of 2-oxoglutarate to suppress. This happens according to the invention preferably by Inhibition of any in the inventive Cell present 2-oxoglutarate dehydrogenase activity and / or similar enzyme activities by inhibiting the expression and / or deletion of these enzyme activities coding nucleotide sequences / genes.

In Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten E. coli Zelle sieht die Erfindung dazu bevorzugt vor: die Hemmung der E. coli-eigenen 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Aktivität durch Deletion mindestens eines der Gene für sucA, dargestellt durch die SEQ ID NO: 71 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 72, und sucB, dargestellt durch die SEQ ID NO: 73 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 74.In connection with the use of a recombinant E. coli cell, the invention preferably provides for this: the inhibition of E. coli's own 2-oxoglutarate dehydrogenase activity by deletion of at least one of the genes for sucA , represented by SEQ ID NO: 71 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 72, and sucB represented by SEQ ID NO: 73 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 74.

In Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten Corynebacterium glutamicum Zelle sieht die Erfindung bevorzugt vor: die Hemmung der Corynebacterium-eigenen 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Aktivität durch Deletion mindestens des Gens für kgd, dargestellt durch die SEQ ID NO: 57 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 58.In connection with the use of a recombinant Corynebacterium glutamicum cell, the invention preferably provides: the inhibition of Corynebacterium's own 2-oxoglutarate dehydrogenase activity by deleting at least the gene for kgd represented by SEQ ID NO: 57 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 58.

Es ist erfindungsgemäß bevorzugt vorgesehen, eine Zelle bereitzustellen, worin zusätzlich der potentielle Abbau von gebildetem Crotonyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA beziehungsweise zu Acetyl-CoA unterdrückt ist. Dies wird bevorzugt erreicht durch Bereitstellen einer erfindungsgemäßen Zelle mit gehemmter Aktivität von 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenasen, Crotonasen, Enoyl-CoA-Hydratasen, Acyl-Dehydratasen und/oder Acetyl-CoA-Acetyl-Transferasen und/oder ähnlichen Enzymaktivitäten, bevorzugt durch gehemmte oder unterdrückte Expression und/oder Deletion der diese Enzymaktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen/Gene. Durch diese Merkmale der erfindungsgemäßen Zelle wird außerdem vorteilhaft erreicht, dass Crotonyl-CoA, und schließlich bevorzugt Crotonat, Butyrat und/oder Butanol, ausschließlich aus 2-Oxoglutarat und nicht aus dem Aceto-acetyl-CoA-basierten Stoffwechselweg heraus produziert wird; der Stofffluss Acetoacetyl-CoA beziehungsweise Acetyl-CoA zu Crotonyl-CoA und umgekehrt ist vernachlässigbar gering.It is preferably provided according to the invention, a Cell, wherein additionally the potential Degradation of formed crotonyl-CoA to acetoacetyl-CoA respectively is suppressed to acetyl-CoA. This is preferably achieved by providing a cell according to the invention with inhibited activity of 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenases, Crotonases, enoyl-CoA hydratases, acyl dehydratases and / or acetyl-CoA-acetyl-transferases and / or similar enzyme activities by inhibited or suppressed expression and / or deletion the nucleotide sequences encoding these enzyme activities / genes. By these features of the cell of the invention will It also advantageously achieves that crotonyl-CoA, and finally preferably crotonate, butyrate and / or butanol, exclusively from 2-oxoglutarate and not from the aceto-acetyl-CoA-based pathway is produced out; the substance flow acetoacetyl-CoA respectively Acetyl-CoA to crotonyl-CoA and vice versa is negligible low.

In Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten E. coli Zelle sieht die Erfindung dazu bevorzugt vor: die Hemmung der E. coli-eigenen 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase-Aktivität durch Deletion der Gene für fadB, dargestellt durch die SEQ ID NO: 35 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 36, und fadJ, dargestellt durch die SEQ ID NO: 39 oder codierend für die Aminosäure sequenz SEQ ID NO: 40, sowie gegebenfalls alternativ, bevorzugt zusätzlich durch Deletion des Gens für paaH, dargestellt durch die SEQ ID NO: 43 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 44, vor allem um den Abbau von Crotonyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA zu vermeiden. In Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten E. coli Zelle sieht die Erfindung dazu alternativ oder bevorzugt zusätzlich vor: die Hemmung der E. coli-eigenen Acetyl-CoA-Acetyl-Transferase-Aktivität durch Deletion der Gene für atoB, dargestellt durch die SEQ ID NO: 41 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 42, sowie gegebenfalls alternativ, bevorzugt zusätzlich durch Deletion der Gene für fadA, dargestellt durch die SEQ ID NO: 33 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 34, und fadB, dargestellt durch die SEQ ID NO: 35 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 36, vor allem um den Abbau von Crotonyl-CoA zu Acetyl-CoA zu vermeiden.In connection with the use of a recombinant E. coli cell, the invention preferably provides for this: the inhibition of E. coli's own 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase activity by deletion of the genes for fadB , represented by SEQ ID NO: 35 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 36, and fadJ , represented by the SEQ ID NO: 39 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 40, and optionally alternatively, preferably additionally by deletion of the gene for paaH , represented by the SEQ ID NO: 43 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 44, especially to the degradation of Cro tonyl-CoA to avoid acetoacetyl-CoA. In connection with the use of a recombinant E. coli cell, the invention additionally or alternatively additionally provides for this: the inhibition of E. coli's own acetyl-CoA-acetyl-transferase activity by deletion of the genes for atoB , represented by the SEQ ID NO: 41 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 42, and optionally alternatively, preferably additionally by deletion of the genes for fadA , represented by SEQ ID NO: 33 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 34, and fadB , shown by SEQ ID NO: 35 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 36, especially to avoid the degradation of crotonyl-CoA to acetyl-CoA.

In Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten Corynebacterium glutamicum Zelle sieht die Erfindung dazu bevorzugt vor: die Hemmung der Corynebacterium-eigenen Enoyl-CoA-Dehydrogenase-Aktivität durch Deletion mindestens des Gens für cg1049, dargestellt durch die SEQ ID NO: 59 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 60, vor allem um den Abbau von Crotonyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA zu vermeiden. In Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten Corynebacterium glutamicum Zelle sieht die Erfindung dazu alternativ oder bevorzugt zusätzlich vor: die Hemmung der Corynebacterium-eigenen Acyl-Dehydratase-Aktivität (EC 4.2.1.17) durch Deletion mindestens des Gens für cg0347, dargestellt durch die SEQ ID NO: 61 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 62, vor allem um den Abbau von Crotonyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA zu vermeiden. In Verbindung mit der Ver wendung einer rekombinanten Corynebacterium glutamicum Zelle sieht die Erfindung dazu alternativ oder bevorzugt zusätzlich vor: die Hemmung der Corynebacterium-eigenen 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase-Aktivitäten (EC 1.1.1.35 und/oder EC 1.1.1.36) durch Deletion mindestens des Gens für cg1049, dargestellt durch die SEQ ID NO: 59 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 60 und/oder des Gens für NCgl2358, dargestellt durch die SEQ ID NO: 63 oder codierend für die SEQ ID NO: 64, vor allem um den Abbau von Crotonyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA zu vermeiden. In Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten Corynebacterium glutamicum Zelle sieht die Erfindung dazu alternativ oder bevorzugt zusätzlich vor: die Hemmung der Corynebacterium-eigenen Acetyl-CoA-Acetyltransferase-Aktivitäten (EC 2.3.1.9) durch Deletion mindestens des Gens für cg2625, dargestellt durch die SEQ ID NO: 65 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 66 und/oder des Gens für cg3022, dargestellt durch die SEQ ID NO: 67 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 68, vor allem um den Abbau von Crotonyl-CoA zu Acetyl-CoA zu vermeiden.In connection with the use of a recombinant Corynebacterium glutamicum cell, the invention preferably provides for this: the inhibition of Corynebacterium's own enoyl-CoA dehydrogenase activity by deletion of at least the gene for cg1049 , represented by SEQ ID NO: 59 or coding for the Amino acid sequence SEQ ID NO: 60, especially to avoid the degradation of crotonyl-CoA to acetoacetyl-CoA. In connection with the use of a recombinant Corynebacterium glutamicum cell, the invention provides alternatively or preferably additionally: the inhibition of Corynebacterium's own acyl dehydratase activity (EC 4.2.1.17) by deletion of at least the gene for cg0347 , represented by the SEQ ID NO: 61 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 62, especially to avoid the degradation of crotonyl-CoA to acetoacetyl-CoA. In connection with the use of a recombinant Corynebacterium glutamicum cell, the invention alternatively or preferably additionally provides: the inhibition of Corynebacterium's own 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase activities (EC 1.1.1.35 and / or EC 1.1.1.36) A deletion of at least the gene for cg1049 represented by SEQ ID NO: 59 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 60 and / or the gene for NCgl2358 represented by SEQ ID NO: 63 or coding for SEQ ID NO: 64 especially to avoid the degradation of crotonyl-CoA to acetoacetyl-CoA. In connection with the use of a recombinant Corynebacterium glutamicum cell, the invention provides alternatively or preferably additionally: the inhibition of Corynebacterium's own acetyl-CoA acetyltransferase activities (EC 2.3.1.9) by deletion of at least the gene for cg2625 represented by the SEQ ID NO: 65 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 66 and / or the gene for cg3022 , represented by SEQ ID NO: 67 or coding for the amino acid sequence SEQ ID NO: 68, especially for the degradation of crotonyl CoA to avoid acetyl-CoA.

Es ist erfindungsgemäß bevorzugt vorgesehen, eine Zelle bereitzustellen, worin zusätzlich eine Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität im ausreichenden Maß vorhanden ist. So wird erreicht, im Stoffwechselprozess entstehendes Formiat über Glycin und/oder Serin in den Stoffwechselweg zurückzuführen (siehe 2). Dies wird bevorzugt erreicht durch rekombinante/heterologe Expression einer Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität, welche bevorzugt die Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität ftFL aus Methylobacterium extorquens ist.It is preferably provided according to the invention to provide a cell in which in addition a formyl-tetrahydrofolate ligase activity is present to a sufficient extent. Thus, it is achieved that formate formed in the metabolic process is returned to the metabolic pathway via glycine and / or serine (see 2 ). This is preferably achieved by recombinant / heterologous expression of a formyl-tetrahydrofolate ligase activity, which is preferably the formyl-tetrahydrofolate ligase activity ftFL from Methylobacterium extorquens.

Zusätzlich ist eine Formfiat-Dehydrogenase-Aktivität erforderlich. In Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten E. coli-Zelle sieht die Erfindung dazu bevorzugt vor: Die homologe Expression oder Überexpression der E. coli-eigenen Formiat-Dehydrogenase fdhF (cytosolische Formiat-Dehydrogenase). Ist die Formiat-Dehydrogenase-Aktivität kein homologes Gen der erfindungsgemäßen Zelle, so wird die Expression dieser Enzymaktivität durch Rekombination eines entsprechenden Gens und die rekombinante/heterologe Expression sichergestellt. Als heterologes Gen wird bevorzugt die Formiat-Dehydrogenase fdhF aus E. coli eingesetzt.In addition, formate dehydrogenase activity is required. In connection with the use of a recombinant E. coli cell, the invention preferably provides for this: homologous expression or overexpression of E. coli's own formate dehydrogenase fdhF (cytosolic formate dehydrogenase). If the formate dehydrogenase activity is not a homologous gene of the cell according to the invention, the expression of this enzyme activity is ensured by recombination of a corresponding gene and recombinant / heterologous expression. The heterologous gene used is preferably the formate dehydrogenase fdhF from E. coli.

Die Expression einer Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität sowie einer Formiat-Dehydrogenase-Aktivität ist Voraussetzung für eine effiziente Synthese von Crotonsäure/Crotonat aus Crotonyl-CoA gemäß der Erfindung, um die Bildung zwangsweise produzierter Nebenprodukte, welche durch Bindung von im Prozess entstehenden Reduktionsäquivalenten entstehen, zu vermindern oder zu verhindern. Für die erfindungsgemäße Verwendung zur Herstellung von Butanol ist die Expression dieser Enzymaktivitäten optional, aber bevorzugt, falls die maximale Ausbeute des Produkts (Butanol) zur Aufnahme der Reduktionsäquivalente im Prozess nicht erreicht werden sollte.The Expression of Formyl Tetrahydrofolate Ligase Activity and formate dehydrogenase activity is a prerequisite for an efficient synthesis of crotonic acid / crotonate from crotonyl-CoA according to the invention to the formation forcibly produced by-products, which by binding of arise in the process of reducing equivalents, to lessen or prevent. For the inventive Use for the production of butanol is the expression of these Enzyme activities optional, but preferred if the maximum Yield of the product (butanol) to take up the reduction equivalents in the process should not be achieved.

Bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist demgemäß auch eine Zelle, die im Genom mindestens ein Nucleinsäuremolekül mit Nucleotidsequenz, codierend für Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität aufweist, wobei die Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität bevorzugt die Aktivität der Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase ftfL aus Methylobacterium extorquens ist und wobei das Nucleinsäuremolekül bevorzugt ausgewählt ist aus:

  • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenz SEQ ID NO: 69 enthalten oder daraus bestehen;
  • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenz SEQ ID NO: 70 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
  • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und die Aktivität der Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase codieren.
Accordingly, a preferred subject of the invention is also a cell having in the genome at least one nucleotide sequence nucleic acid molecule encoding formyl-tetrahydrofolate ligase activity, wherein the formyl-tetrahydrofolate ligase activity is preferably the activity of formyl-tetrahydrofolate ligase ftfL Methylobacterium extorquens and wherein the nucleic acid molecule is preferably selected from:
  • a) nucleic acid molecules which contain or consist of the sequence SEQ ID NO: 69;
  • b) nucleic acid molecules coding for amino acid molecules containing or consisting of the sequence SEQ ID NO: 70; and
  • c) nucleic acid molecules containing at least the nucleic acid molecules described under a) and b) 50%, preferably at least, 60%, 70%, 80%, more preferably at least 90% or more homology and encode the activity of formyl tetrahydrofolate ligase.

Vorzugsweise weist die Zelle im Genom auch mindestens ein homologes oder heterologes Gen, das heißt Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, codierend für Formiat-Dehydrogenase-Aktivität auf, wobei die Formiat-Dehydrogenase-Aktivität bevorzugt die Aktivität der cytosolischen Formiat-Dehydrogenase fdhF aus E. coli ist und wobei das Nucleinsäuremolekül bevorzugt ausgewählt ist aus:

  • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenz SEQ ID NO: 77 enthalten oder daraus bestehen;
  • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenz SEQ ID NO: 78 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
  • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und die Aktivität der Formiat-Dehydrogenase codieren.
Preferably, the cell in the genome also has at least one homologous or heterologous gene, that is nucleic acid molecule having a nucleotide sequence coding for formate dehydrogenase activity, wherein the formate dehydrogenase activity is preferably the activity of E. coli cytosolic formate dehydrogenase fdhF and wherein the nucleic acid molecule is preferably selected from:
  • a) nucleic acid molecules which contain or consist of the sequence SEQ ID NO: 77;
  • b) nucleic acid molecules coding for amino acid molecules which contain or consist of the sequence SEQ ID NO: 78; and
  • c) nucleic acid molecules which have at least 50%, preferably at least 60%, 70%, 80%, particularly preferably at least 90% or more homology with the nucleic acid molecules described under a) and b) and encode the activity of formate dehydrogenase.

Die Erfindung sieht bevorzugt weiter vor, dass in der erfindungsgemäßen Zelle eine Expression beziehungsweise Überexpression einer Phosphoenolpyruvat-Synthase-Aktivität erfolgt. In Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten E. coli-Zelle wird dies zur Ausbeutesteigerung vorzugsweise in Kombination mit einem PTS als ausschließlichem Aufnahmesystem der C3- bis C6-Körper, insbesondere von Glucose, vorgesehen. Die maximale Ausbeute wird dadurch um etwa weitere 10% gesteigert.The Invention preferably further provides that in the inventive Cell expression or overexpression of a Phosphoenolpyruvate synthase activity occurs. In connection with the use of a recombinant E. coli cell, this becomes Yield increase preferably in combination with a PTS as exclusive uptake system of C3 to C6 bodies, in particular glucose. The maximum yield is increased by about another 10%.

Bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist demgemäß auch eine Zelle, worin eine Expression oder homologe Überexpression einer Phosphoenolpyruvat-Synthase-Aktivität auftritt. Die homologe Überexpression wird durch in an sich bekannte Maßnahmen erreicht. In Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten E. coli-Zelle sieht die Erfindung bevorzugt vor: die homologe Expression oder Überexpression der E. coli-eigenen Phosphoenolpyruvat-Synthase-Aktivität, durch Expression mindestens des Gens pps, dargestellt durch die SEQ ID NO: 75, codierend für die SEQ ID NO: 76.Accordingly, a preferred subject of the invention is also a cell in which an expression or homologous overexpression of a phosphoenolpyruvate synthase activity occurs. Homologous overexpression is achieved by measures known per se. In connection with the use of a recombinant E. coli cell, the invention preferably provides: the homologous expression or overexpression of E. coli's own phosphoenolpyruvate synthase activity, by expression of at least the gene pps represented by SEQ ID NO: 75 coding for SEQ ID NO: 76.

Als bevorzugte Ausführung ist die erfindungsgemäße Zelle geeignet, um zur Synthese von Butanol gemäß der Erfindung eingesetzt zu werden. Dabei wird Butanol ausgehend von Crotonyl-CoA, welches gemäß der Erfindung aus 2-Oxoglutarat gebildet wird, über zusätzliche Enzymaktivitäten aus der Gruppe Butyryl-CoA-Dehydrogenase und Aldehyd-Dehydrogenase, Butanol-Dehydrogenase erhalten.When preferred embodiment is the invention Cell suitable for the synthesis of butanol according to the Invention to be used. Butanol is starting from Crotonyl-CoA, which according to the invention from 2-oxoglutarate is formed, via additional Enzyme activities from the group butyryl-CoA dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase, butanol dehydrogenase.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist daher eine vorbeschriebene erfindungsgemäße Zelle, die im Genom zusätzlich min destens ein Nucleinsäuremolekül mit Nucleotidsequenz, codierend für Butyryl-CoA-Dehydrogenase-Aktivität, Butyraldehyd-Dehydrogenase-Aktivität, Butanol-Dehydrogenase-Aktivität und Kombinationen davon aufweist. In diesem Zusammenhang ist der bevorzugte Gegenstand eine Zelle, die im Genom mindestens ein Nucleinsäuremolekül mit Nucleotidsequenz, codierend für Butyryl-CoA-Dehydrogenase-Aktivität aufweist, wobei die Butyryl-CoA-Dehydrogenase-Aktivität bevorzugt die Aktivität der Butyryl-CoA-Dehydrogenase (CAC0462) aus Clostridium acetobutylicum ist und wobei das Nucleinsäuremolekül bevorzugt ausgewählt ist aus:

  • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenz SEQ ID NO: 45 enthalten oder daraus bestehen;
  • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenz SEQ ID NO: 46 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
  • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und die Aktivität der Butyryl-CoA-Dehydrogenase codieren.
A preferred subject of the invention is therefore a cell according to the invention described above, which additionally comprises at least one nucleic acid molecule with nucleotide sequence coding for butyryl-CoA dehydrogenase activity, butyraldehyde dehydrogenase activity, butanol dehydrogenase activity and combinations thereof in the genome. In this context, the preferred article is a cell having in the genome at least one nucleic acid molecule with nucleotide sequence coding for butyryl-CoA dehydrogenase activity, wherein the butyryl-CoA dehydrogenase activity preferably the activity of butyryl-CoA dehydrogenase (CAC0462 ) is from Clostridium acetobutylicum and wherein the nucleic acid molecule is preferably selected from:
  • a) nucleic acid molecules which contain or consist of the sequence SEQ ID NO: 45;
  • b) nucleic acid molecules coding for amino acid molecules containing or consisting of the sequence SEQ ID NO: 46; and
  • c) nucleic acid molecules which have at least 50%, preferably at least 60%, 70%, 80%, particularly preferably at least 90% or more homology with the nucleic acid molecules described under a) and b) and encode the activity of butyryl-CoA dehydrogenase ,

Diese Zelle weist dazu, bevorzugt zusätzlich, im Genom auch mindestens ein Nucleinsäuremolekül mit Nucleotidsequenz, codierend für Aldehyd-Dehydrogenase- und Butanol-Dehydrogenase-Aktivität auf, wobei Aldehyd-Dehydrogenase- und Butanol-Dehydrogenase-Aktivität bevorzugt die Aktivität der Aldehyd-Dehydrogenase (CAP0162) aus Clostridium acetobutylicum ist und wobei das Nucleinsäuremolekül bevorzugt ausgewählt ist aus:

  • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenz SEQ ID NO: 47 enthalten oder daraus bestehen;
  • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenz SEQ ID NO: 48 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
  • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und Aldehyd-Dehydrogenase- und Butanol-Dehydrogenase-Aktivität codieren.
For this purpose, this cell additionally has, preferably additionally, in the genome also at least one nucleic acid molecule with nucleotide sequence coding for aldehyde dehydrogenase and butanol dehydrogenase activity, aldehyde dehydrogenase and butanol dehydrogenase activity preferably the activity of the aldehyde dehydrogenase ( CAP0162) from Clostridium acetobutylicum and wherein the nucleic acid molecule is preferably selected from:
  • a) nucleic acid molecules which contain or consist of the sequence SEQ ID NO: 47;
  • b) nucleic acid molecules coding for amino acid molecules containing or consisting of the sequence SEQ ID NO: 48; and
  • c) nucleic acid molecules which have at least 50%, preferably at least 60%, 70%, 80%, particularly preferably at least 90% or more homology with the nucleic acid molecules described under a) and b) and aldehyde dehydrogenase and butanol dehydrogenase Code activity.

Die vorstehend charakterisierten erfindungsgemäßen rekombinanten Mikroorganismen beziehungsweise transgenen biologischen Zellen sind besonders geeignet für die biotechnologische Synthese von Crotonsäure und/oder Butanol sowie gegebenenfalls Buttersäure aus dem Stoffwechselzwischenprodukt Crotonyl-CoA, wobei Crotonyl-CoA in der erfindungsgemäßen Zelle überwiegend und bevorzugt ausschließlich über den 2-Hydroxyglutarat-Weg aus dem Zwischenprodukt 2-Oxoglutarat gebildet wird. 2-Oxoglutarat ist in der erfindungsgemäßen Zelle ein Stoffwechselprodukt, bevorzugt das überwiegende oder einzige Stoffwechselprodukt der bevorzugt fermentativen Verstoffwechselung der C3- bis C6-Körper, welche als Substrat dienen.The above-characterized recombinant microorganisms according to the invention example, transgenic biological cells are particularly suitable for the biotechnological synthesis of crotonic acid and / or butanol and optionally butyric acid from the metabolic intermediate crotonyl-CoA, wherein crotonyl-CoA in the cell of the invention predominantly and preferably exclusively via the 2-hydroxyglutarate route from the intermediate 2 Oxoglutarate is formed. 2-Oxoglutarate is in the cell according to the invention a metabolite, preferably the predominant or only metabolite of the preferably fermentative metabolism of the C3 to C6 body, which serve as a substrate.

Bevorzugt werden C3- bis C6-Körper als Substrat für die biotechnologische Herstellung von Crotonsäure, Butanol beziehungsweise Buttersäure mittels der erfindungsgemäßen Zelle eingesetzt. Die C3- bis C6-Kohlenstoffquelle ist bevorzugt ausgewählt aus Hexosen, Pentosen, Oligosacchariden, Polysacchariden und einwertigen und mehrwertigen Alkoholen. Bevorzugt ist die als Substrat verwendete Kohlenstoffquelle Glucose. In einer alternativen Variante ist die als Substrat verwendet Kohlenstoffquelle Glycerol.Prefers be C3 to C6 body as a substrate for the biotechnological production of crotonic acid, butanol or butyric acid by means of the invention Cell used. The C3 to C6 carbon source is preferred selected from hexoses, pentoses, oligosaccharides, polysaccharides and monohydric and polyhydric alcohols. Preferably, as the substrate used carbon source glucose. In an alternative variant is the carbon source used as a substrate glycerol.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Zelle zur Herstellung von Crotonsäure, zur Herstellung von Butanol sowie zur Herstellung von Buttersäure. Aus den 1 bis 4 sind die Stoffwechselwege bevorzugter Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Zelle dargestellt. Der Fachmann ist in der Lage, die dort dargestellten Stoffwechselwege soweit zu modifizieren, dass das primäre Stoffwechselendprodukt, entstehend aus Crotonyl-CoA, Crotonsäure, Buttersäure oder Butanol ist.The invention also relates to the use of the cell according to the invention for the production of crotonic acid, for the production of butanol and for the production of butyric acid. From the 1 to 4 the metabolic pathways of preferred embodiments of the cell according to the invention are shown. The person skilled in the art is able to modify the metabolic pathways shown there to such an extent that the primary metabolic end product resulting from crotonyl-CoA, crotonic acid, butyric acid or butanol is.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Crotonsäure aus einer C3- bis C6-Kohlenstoffquelle als Substrat, wobei in Schritt (a) eine erfindungsgemäße Zelle, das heißt besonders ein erfindungsgemäßer rekombinanter Mikroorganismus bereitgestellt wird, in einem Schritt (b) die Zelle mit dem Substrat in Kontakt gebracht wird und in Schritt (c) die Zelle unter Bedingungen kultiviert wird, unter denen das Substrat umgesetzt und in der Zelle über die erfindungsgemäße Enzymausstattung Crotonsäure gebildet wird. Die Kultivierung findet bevorzugt in Kulturmedium statt. In einem weiteren Schritt (d) wird die synthetisierte Crotonsäure aus dem Kulturmedium und/oder der Zelle isoliert und gegebenenfalls aufgereinigt. Üblicherweise wird die intrazellulär gebildete Crotonsäure aus der Zelle in das Extrazellulärmedium abgegeben. Gegebenenfalls verbleibt die Crotonsäure als kurzkettige Fettsäure zu einem gewissen Anteil, gegebenenfalls zum überwiegenden Teil in der Zelle. In diesem Fall wird die Crotonsäure nach Abschluss der Umsetzung, gegebenenfalls durch Aufschließen der Zelle, aus dieser isoliert.object The invention is also a method for biotechnological production of crotonic acid from a C3 to C6 carbon source as substrate, wherein in step (a) an inventive Cell, that is, in particular, an inventive recombinant microorganism is provided in a step (b) the cell is brought into contact with the substrate and in step (C) the cell is cultured under conditions under which the Substrate reacted and in the cell via the invention Enzyme composition crotonic acid is formed. The cultivation preferably takes place in culture medium. In a further step (d) the synthesized crotonic acid is removed from the culture medium and / or the cell isolated and optionally purified. Usually is the intracellular crotonic acid formed delivered to the cell in the extracellular medium. Possibly the crotonic acid remains as a short-chain fatty acid to a certain extent, if necessary for the most part Part in the cell. In this case, the crotonic acid after completion of the reaction, if necessary by digestion the cell, isolated from this.

Es ist bevorzugt vorgesehen, die Zelle dabei unter anaeroben Bedingungen zu kultivieren. Vor allem die erfindungsgemäß vorgesehene 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratase ist sauerstoffempflindlich. Je nach Wirtsorganismus ist es in einer alternativen Variante auch vorgesehen, die Zelle unter aeroben Bedingungen zu kultivieren. Dazu ist vorgesehen, die vorstehend näher charakterisierte 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratase-Aktivität durch eine sauerstoffunempfindliche Alternative zu ersetzen, welche bevorzugt aus bekannten sauerstoffunempfindlichen Enzymen durch Mutagenese zur Änderung der Substratspezifität für den 2-Hydroxglutarat-Weg abgeleitet ist. Alternativ ist vorgesehen, die 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratase-Aktivität durch eine sauerstoffunempfindliche Alternative zu ersetzen, welche bevorzugt aus der 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratase durch Mutagenese zur Änderung der Sauerstoffempfindlichkeit abgeleitet ist. Alternativ ist vorgesehen, die 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratase durch niedermolekulare Substanzen wie Azid, zum Beispiel Natriumazid zu schützen.It is preferably provided, the cell under anaerobic conditions to cultivate. Especially the invention provided 2-Hydroxyacyl-CoA dehydratase is oxygen sensitive. Depending on Host organism it is also provided in an alternative variant to cultivate the cell under aerobic conditions. It is intended the above-characterized 2-hydroxyacyl-CoA dehydratase activity by to substitute an oxygen insensitive alternative, which is preferred from known oxygen-insensitive enzymes by mutagenesis for changing the substrate specificity for derived from the 2-hydroxglutarate route. Alternatively, it is intended the 2-hydroxyacyl-CoA dehydratase activity by a to replace oxygen-insensitive alternative, which is preferred from the 2-hydroxyacyl-CoA dehydratase by mutagenesis for modification the oxygen sensitivity is derived. Alternatively, it is intended the 2-hydroxyacyl-CoA dehydratase by low molecular weight substances like azide, for example to protect sodium azide.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein entsprechendes Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Buttersäure aus einer C3- bis C6-Kohlenstoffquelle als Substrat, wobei in Schritt (a) eine erfindungsgemäße Zelle, das heißt besonders ein erfindungsgemäßer rekombinanter Mikroorganismus bereitgestellt wird, in einem Schritt (b) die Zelle mit dem Substrat in Kontakt gebracht wird und in Schritt (c) die Zelle unter Bedingungen kultiviert wird, unter denen das Substrat umgesetzt und in der Zelle über die erfindungsgemäße Enzymausstattung Buttersäure gebildet wird. Die Kultivierung findet bevor zugt in Kulturmedium statt. In einem weiteren Schritt (d) wird die synthetisierte Buttersäure aus dem Kulturmedium und/oder der Zelle isoliert und gegebenenfalls aufgereinigt. Üblicherweise wird die intrazellulär gebildete Buttersäure aus der Zelle in das Extrazellulärmedium abgegeben. Gegebenenfalls verbleibt die Buttersäure als kurzkettige Fettsäure zu einem gewissen Anteil, gegebenenfalls zum überwiegenden Teil in der Zelle. In diesem Fall wird die Buttersäure nach Abschluss der Umsetzung, gegebenenfalls durch Aufschließen der Zelle, aus dieser isoliert.object The invention is also a corresponding method for biotechnological Preparation of butyric acid from a C3 to C6 carbon source as substrate, wherein in step (a) an inventive Cell, that is, in particular, an inventive recombinant microorganism is provided in one step (B) the cell is brought into contact with the substrate and in step (C) the cell is cultured under conditions under which the Substrate reacted and in the cell via the invention Enzyme composition butyric acid is formed. The cultivation takes place before given in culture medium. In a further step (d) the synthesized butyric acid is removed from the culture medium and / or the cell isolated and optionally purified. Usually is the intracellular formed butyric acid delivered to the cell in the extracellular medium. Possibly the butyric acid remains as a short-chain fatty acid to a certain extent, if necessary for the most part Part in the cell. In this case, the butyric acid after completion of the reaction, if necessary by digestion the cell, isolated from this.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein entsprechendes Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Butanol aus einer C3- bis C6-Kohlenstoffquelle als Substrat, wobei in Schritt (a) eine erfindungsgemäße Zelle, das heißt besonders ein erfindungsgemäßer rekombinanter Mikroorganismus bereitgestellt wird, in einem Schritt (b) die Zelle mit dem Substrat in Kontakt gebracht wird und in Schritt (c) die Zelle unter Bedingungen kultiviert wird, unter denen das Substrat umgesetzt und in der Zelle über die erfindungsgemäße Enzymausstattung Butanol gebildet wird. Die Kultivierung findet bevorzugt in Kulturmedium statt. In einem weiteren Schritt (d) wird das synthetisierte Butanol aus dem Kulturmedium und/oder der Zelle isoliert und gegebenenfalls aufgereinigt. Das synthetisierte Butanol liegt im Wesentlichen als 1-Butanol vor.The invention also relates to a corresponding process for the biotechnological production of butanol from a C3 to C6 carbon source as substrate, wherein in step (a) a cell according to the invention, that is to say in particular a recombinant microorganism according to the invention is provided, in a step (b) the cell is brought into contact with the substrate and in step (c) the cell is cultured under conditions under which the substrate is reacted and formed in the cell via the enzyme endowment of the invention butanol. The cultivation preferably takes place in culture medium. In another Step (d) the synthesized butanol is isolated from the culture medium and / or the cell and optionally purified. The synthesized butanol is essentially present as 1-butanol.

Bevorzugte Ausführungen der erfindungsgemäßen Zellen sind in den Figuren dargestellt. Die Figuren zeigen:preferred Embodiments of the cells according to the invention are shown in the figures. The figures show:

1: Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von Glucose in Crotonat durch Escherichia coli, erfindungsgemäß rekombinant erweitert um den Abbauweg von Oxoglutarat über Glutaconyl-Coenzym A, beteiligt sind. Eine Rückführung des als Nebenprodukt der Pyruvat-Formiat-Lyase-Reaktion entstehenden Formiat ist nicht berücksichtigt. 1 : Reaction steps involved in the conversion of glucose into crotonate by Escherichia coli recombinantly extended according to the invention by the degradation pathway of oxoglutarate via glutaconyl-coenzyme A. Recycling of the formate formed as a by-product of the pyruvate-formate-lyase reaction is not considered.

2: Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von Glucose in Crotonat durch Escherichia coli, erfindungsgemäß rekombinant erweitert um den Abbauweg von Oxoglutarat über Glutaconyl-Coenzym A, beteiligt sind. Als Nebenprodukt der Pyruvat-Formiat-Lyase-Reaktion entstehendes Formiat wird über eine rekombinante Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase, den Tetrahydrofolat-Stoffwechsel und die Zwischenprodukte Glycin und Serin zurückgewonnen. 2 : Reaction steps involved in the conversion of glucose into crotonate by Escherichia coli recombinantly extended according to the invention by the degradation pathway of oxoglutarate via glutaconyl-coenzyme A. As a by-product of the pyruvate-formate-lyase reaction resulting formate is recovered via a recombinant formyl-tetrahydrofolate ligase, the tetrahydrofolate metabolism and the intermediates glycine and serine.

3: Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von Glucose in Crotonat durch Corynebacterium glutamicum, erfindungsgemäß rekombinant erweitert um den Abbauweg von Oxoglutarat über Glutaconyl-Coenzym A, eine cytosolische Formiat-Dehydrogenase und eine Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase, beteiligt sind. 3 : Reaction steps involved in the conversion of glucose into crotonate by Corynebacterium glutamicum recombinantly extended according to the invention by the degradation pathway of oxoglutarate via glutaconyl-coenzyme A, a cytosolic formate dehydrogenase and a formyl-tetrahydrofolate ligase.

4: Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von Glucose in Butanol durch Escherichia coli, erfindungsgemäß rekombinant erweitert um den Abbauweg von Oxoglutarat über Glutaconyl-Coenzym A und den Syntheseweg von Butanol, beteiligt sind. 4 : Reaction steps involved in the conversion of glucose into butanol by Escherichia coli recombinantly extended according to the invention by the degradation pathway of oxoglutarate via glutaconyl-coenzyme A and the synthesis route of butanol.

5: Flussverteilung, die das Synthesepotential für Crotonat aus Glucose mit den in 1 dargestellten Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen auf den Aufnahmefluss an Glucose als Substrat (100%). 5 : Flow distribution showing the synthetic potential for crotonate from glucose with the in 1 optimally utilized reaction steps shown. All flows are related to the uptake of glucose as substrate (100%).

6: Flussverteilung, die das Synthesepotential für Crotonat aus Glucose mit den in 2 dargestellten Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Dabei ist erfindungsgemäß zusätzlich eine Coenzym A- Transferase-Aktivität zur Spaltung des Thioesters Crotonyl-Coenzym A realisiert. Alle Flüsse sind bezogen auf den Aufnahmefluss an Glucose als Substrat (100%). 6 : Flow distribution showing the synthetic potential for crotonate from glucose with the in 2 optimally utilized reaction steps shown. In this case, a coenzyme A transferase activity for the cleavage of the thioester crotonyl-coenzyme A is additionally realized according to the invention. All flows are related to the uptake of glucose as substrate (100%).

7: Flussverteilung, die das Synthesepotential für Crotonat aus Glucose mit den in 2 dargestellten Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Dabei ist erfindungsgemäß zusätzlich ein aus Butyryl-CoA-Dehydrogenase, Phosphotransbutyrylase, Butyrat-Kinase und 2-Enoat-Reduktase bestehender Stoffwechselweg zur Spaltung des Thioesters Crotonyl-Coenzym A realisiert. Alle Flüsse sind bezogen auf den Aufnahmefluss an Glucose als Substrat (100%). 7 : Flow distribution showing the synthetic potential for crotonate from glucose with the in 2 optimally utilized reaction steps shown. According to the invention, a metabolic pathway consisting of butyryl-CoA dehydrogenase, phosphotransbutyrylase, butyrate kinase and 2-enoate reductase for cleaving the thioester crotonyl-coenzyme A is additionally realized. All flows are related to the uptake of glucose as substrate (100%).

8: Flussverteilung, die das Synthesepotential für Crotonat aus Glucose mit den in 3 dargestellten Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Dabei ist erfindungsgemäß zusätzlich eine Coenzym A-Transferase-Aktivität zur Spaltung des Thioesters Crotonyl-Coenzym A realisiert. Alle Flüsse sind bezogen auf den Aufnahmefluss an Glucose als Substrat (100%). 8th : Flow distribution showing the synthetic potential for crotonate from glucose with the in 3 optimally utilized reaction steps shown. In this case, a coenzyme A transferase activity for the cleavage of the thioester crotonyl-coenzyme A is additionally realized according to the invention. All flows are related to the uptake of glucose as substrate (100%).

9: Flussverteilung, die das Synthesepotential für Crotonat aus Glucose mit den in 3 dargestellten Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Dabei ist erfindungsgemäß zusätzlich ein aus Butyryl-CoA-Dehydrogenase, Phosphotransbutyrylase, Butyrat-Kinase und 2-Enoat-Reduktase bestehender Stoffwechselweg zur Spaltung des Thioesters Crotonyl-Coenzym A realisiert. Alle Flüsse sind bezogen auf den Aufnahmefluss an Glucose als Substrat (100%). 9 : Flow distribution showing the synthetic potential for crotonate from glucose with the in 3 optimally utilized reaction steps shown. According to the invention, a metabolic pathway consisting of butyryl-CoA dehydrogenase, phosphotransbutyrylase, butyrate kinase and 2-enoate reductase for cleaving the thioester crotonyl-coenzyme A is additionally realized. All flows are related to the uptake of glucose as substrate (100%).

10: Flussverteilung, die das Synthesepotential für Crotonat aus Glucose mit den in 4 dargestellten Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen auf den Aufnahmefluss an Glucose als Substrat (100%). 10 : Flow distribution showing the synthetic potential for crotonate from glucose with the in 4 optimally utilized reaction steps shown. All flows are related to the uptake of glucose as substrate (100%).

Zu dieser Beschreibung gehört ein Sequenzprotokoll; dieses enthält Angaben zu nachstehend aufgelisteten Genen und damit codierten Proteinen: Abkürzung: FN0487 Bezeichnung: 2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase [Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586] EC-Nummer: 1.1.99.2 NCBI-GI: 19703822 NCBI-GeneID: 991766 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 2 Abkürzung: FN0202 Bezeichnung: Glutaconate CoA-transferase subunit A [Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586] EC-Nummer: 2.8.3.12 NCBI-GI: 19703547 NCBI-GeneID: 992901 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 3 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 4 Abkürzung: FN0203 Bezeichnung: Glutaconate CoA-transferase subunit B [Fusobacterium nucleatum susp. nucleatum ATCC 25586] EC-Nummer: 2.8.3.12 NCBI-GI: 19703548 NCBI-GeneID: 993094 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 5 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 6 Abkürzung: FN0207 Bezeichnung: (R)-2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase alpha-subunit [Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586] EC-Nummer: 4.2.1.- NCBI-GI: 19703552 NCBI-GeneID: 992420 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 7 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 8 Abkürzung: FN0208 Bezeichnung: (R)-2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase beta-subunit [Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586] EC-Nummer: 4.2.1.- NCBI-GI: 19703553 NCBI-GeneID: 993108 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 9 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 10 Abkürzung: FN0206 Bezeichnung: Activator of (R)-2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase [Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586] EC-Nummer: - NCBI-GI: 19703551 NCBI-GeneID: 993095 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 11 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 12 Abkürzung: FN0199 Bezeichnung: hypothetical Protein FN0199 [Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586] EC-Nummer: 4.1.1.70 NCBI-GI: 19703544 NCBI-GeneID: 991538 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 13 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 14 Abkürzung: FN0200 Bezeichnung: Biotin carboxyl carrier Protein of glutaconyl-CoA decarboxylase [Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586] EC-Nummer: 4.1.1.70 NCBI-GI: 19703545 NCBI-GeneID: 992688 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 15 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 16 Abkürzung: FN0201 Bezeichnung: Glutaconyl-CoA decarboxylase beta subunit [Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586] EC-Nummer: 4.1.1.70 NCBI-GI: 19703546 NCBI-GeneID: 991411 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 17 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 18 Abkürzung: FN0204 Bezeichnung: Glutaconyl-CoA decarboxylase alpha subunit [Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586] EC-Nummer: 4.1.1.70 NCBI-GI: 19703549 NCBI-GeneID: 991561 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 19 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 20 Abkürzung: CAC3076 ptb Bezeichnung: phosphate butyryltransferase [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] EC-Nummer: 2.3.1.19 NCBI-GI: 15896327 NCBI-GeneID: 1119259 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 21 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 22 Abkürzung: CAC1660 Bezeichnung: butyrate kinase [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] EC-Nummer: 2.7.2.7 NCBI-GI: 15894937 NCBI-GeneID: 1117843 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 23 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 24 Abkürzung: CAC3075 buk Bezeichnung: butyrate kinase [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] EC-Nummer: 2.7.2.7 NCBI-GI: 15896326 NCBI-GeneID: 1119258 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 25 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 26 Abkürzung: CAA71086 enr Bezeichnung: 2-enoate reductase [Clostridium tyrobutyricum] EC-Nummer: 1.3.1.31 NCBI-GI: 2765040 NCBI-GeneID: DNA-Sequenz SEQ ID NO: 27 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 28 Abkürzung: atoD Bezeichnung: acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase, alpha subunit [Escherichia coli K12] EC-Nummer: 2.8.3.8 NCBI-GI: 16130158 NCBI-GeneID: 947525 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 29 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 30 Abkürzung: atoA Bezeichnung: acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase, beta subunit [Escherichia coli K12] EC-Nummer: 2.8.3.8 NCBI-GI: 16130159 NCBI-GeneID: 946719 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 31 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 32 Abkürzung: fadA Bezeichnung: 3-ketoacyl-CoA thiolase (thiolase I) [Escherichia coli K12] EC-Nummer: 2.3.1.16 NCBI-GI: 49176430 NCBI-GeneID: 948324 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 33 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 34 Abkürzung: fadB Bezeichnung: fused 3-hydroxybutyryl-CoA epimerase/delta(3)-cis-delta(2)-trans-enoyl-CoA isomerase/enoyl-CoA hydratase/3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase [Escherichia coli K12] EC-Nummer: 1.1.1.35/4.2.1.17/5.3.3.8/5.1.2.3 NCBI-GI: 16131692 NCBI-GeneID: 948336 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 35 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 36 Abkürzung: fadl (= yfcY) Bezeichnung: beta-ketoacyl-CoA thiolase, anaerobic, subunit [Escherichia coli K12] EC-Nummer: 2.3.1.16 NCBI-GI: 16130275 NCBI-GeneID: 948823 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 37 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 38 Abkürzung: fadJ (= yfcX) Bezeichnung: fused enoyl-CoA hydratase and epimerase and isomerase/3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase [Escherichia coli K12] EC-Nummer: 1.1.1.35/4.2.1.17/5.3.3.8/5.1.2.3 NCBI-GI: 16130274 NCBI-GeneID: 949097 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 39 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 40 Abkürzung: atoB Bezeichnung: acetyl-CoA acetyltransferase [Escherichia coli K12] EC-Nummer: 2.3.1.9 NCBI-GI: 16130161 NCBI-GeneID: 946727 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 41 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 42 Abkürzung: paaH Bezeichnung: 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase [Escherichia coli K12] EC-Nummer: 1.1.1.157 NCBI-GI: 16129356 NCBI-GeneID: 945940 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 43 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 44 Abkürzung: CAC0462 Bezeichnung: Protein of short-chain alcohol dehydrogenase family [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] EC-Nummer: 1.3.1.44 NCBI-GI: 15893753 NCBI-GeneID: 1116645 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 45 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 46 Abkürzung: CAP0162 Bezeichnung: Aldehyde dehydrogenase (NAD+) [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] EC-Nummer: 1.2.1.10/1.1.1.- NCBI-GI: 15004865 NCBI-GeneID: 1116167 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 47 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 48 Abkürzung: gdh Bezeichnung: glutamate dehydrogenase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC-Nummer: 1.4.1.4 NCBI-GI: 62390914 NCBI-GeneID: 3343980 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 49 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 50 Abkürzung: gltB Bezeichnung: glutamine 2-oxoglutarate aminotransferase large subunit [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC-Nummer: 1.4.1.13 NCBI-GI: 62389079 NCBI-GeneID: 3344534 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 51 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 52 Abkürzung: gltD Bezeichnung: glutamine 2-oxoglutarate aminotransferase small subunit [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC-Nummer: 1.4.1.13 NCBI-GI: 62389080 NCBI-GeneID: 3344661 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 53 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 54 Abkürzung: actA Bezeichnung: butyryl-coenzyme A:acetate coenzyme A transferase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC-Nummer: 2.8.3.8 NCBI-GI: 62391407 NCBI-GeneID: 3345037 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 55 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 56 Abkürzung: kgd Bezeichnung: alpha-ketoglutarate decarboxylase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC-Nummer: 1.2.4.2 NCBI-GI: 62390019 NCBI-GeneID: 3343144 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 57 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 58 Abkürzung: cg1049 = NCgl0882 Bezeichnung: enoyl-CoA hydratase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC-Nummer: 4.2.1.17 NCBI-GI: 62389809 NCBI-GeneID: 3345237 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 59 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 60 Abkürzung: cg0347 Bezeichnung: acyl dehydratase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC-Nummer: 4.2.1.17 NCBI-GI: 62389186 NCBI-GeneID: 3343394 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 61 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 62 Abkürzung: NCgl2358 Bezeichnung: short chain dehydrogenase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC-Nummer: 1.1.1.36 NCBI-GI: 19553640 NCBI-GeneID: 1020391 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 63 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 64 Abkürzung: cg2625 = NCgl2309 Bezeichnung: acetyl-CoA acetyltransferase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC-Nummer: 2.3.1.9 NCBI-GI: 62391235 NCBI-GeneID: 3345052 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 65 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 66 Abkürzung: cg3022 Bezeichnung: Acetyl-CoA acetyltransferase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC-Nummer: 2.3.1.9 NCBI-GI: 62391564 NCBI-GeneID: 3343057 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 67 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 68 Abkürzung: ftfL Bezeichnung: Methylobacterium extorquens formatetetrahydrofolate ligase (ftfL) EC-Nummer: 6.3.4.3 NCBI-GI: 30721807 NCBI-GeneID: - DNA-Sequenz SEQ ID NO: 69 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 70 Abkürzung: sucA Bezeichnung: 2-oxoglutarate decarboxylase, thiaminrequiring [Escherichia coli K12] EC-Nummer: 1.2.4.2 NCBI-GI: 16128701 NCBI-GeneID: 945303 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 71 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 72 Abkürzung: sucB Bezeichnung: dihydrolipoyltranssuccinase [Escherichia coli K12] EC-Nummer: 2.3.1.61 NCBI-GI: 16128702 NCBI-GeneID: 945307 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 73 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 74 Abkürzung: pps Bezeichnung: phosphoenolpyruvate synthase [Escherichia coli K12] EC-Nummer: 2.7.9.2 NCBI-GI: 16129658 NCBI-GeneID: 946209 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 75 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 76 Abkürzung: fdhF Bezeichnung: formate dehydrogenase-H [Escherichia coli K12] EC-Nummer: 1.2.1.2 NCBI-GI: 16131905 NCBI-GeneID: 948584 DNA-Sequenz SEQ ID NO: 77 Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 78 This description includes a sequence listing; this contains information on the genes listed below and proteins encoded with them: Abbreviation: FN0487 Description: 2-hydroxyglutarate dehydrogenase [Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum ATCC 25586] EC number: 1.1.99.2 NCBI GI: 19703822 NCBI GeneID: 991766 DNA sequence SEQ ID NO: 1 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 2 Abbreviation: FN0202 Description: Glutaconate CoA-transferase subunit A [Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum ATCC 25586] EC number: 2.8.3.12 NCBI GI: 19703547 NCBI GeneID: 992901 DNA sequence SEQ ID NO: 3 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 4 Abbreviation: FN0203 Description: Glutaconate CoA-transferase subunit B [Fusobacterium nucleatum susp. Nucleatum ATCC 25586] EC number: 2.8.3.12 NCBI GI: 19703548 NCBI GeneID: 993094 DNA sequence SEQ ID NO: 5 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 6 Abbreviation: FN0207 Description: (R) -2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase alpha-subunit [Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum ATCC 25586] EC number: 4.2.1.- NCBI GI: 19703552 NCBI GeneID: 992420 DNA sequence SEQ ID NO: 7 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 8th Abbreviation: FN0208 Description: (R) -2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase beta-subunit [Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum ATCC 25586] EC number: 4.2.1.- NCBI GI: 19703553 NCBI GeneID: 993108 DNA sequence SEQ ID NO: 9 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 10 Abbreviation: FN0206 Description: Activator of (R) -2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase [Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum ATCC 25586] EC number: - NCBI GI: 19703551 NCBI GeneID: 993095 DNA sequence SEQ ID NO: 11 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 12 Abbreviation: FN0199 Description: hypothetical protein FN0199 [Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum ATCC 25586] EC number: 4.1.1.70 NCBI GI: 19703544 NCBI GeneID: 991538 DNA sequence SEQ ID NO: 13 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 14 Abbreviation: FN0200 Description: Biotin carboxyl carrier Protein of glutaconyl-CoA decarboxylase [Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum ATCC 25586] EC number: 4.1.1.70 NCBI GI: 19703545 NCBI GeneID: 992688 DNA sequence SEQ ID NO: 15 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 16 Abbreviation: FN0201 Description: Glutaconyl-CoA decarboxylase beta subunit [Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum ATCC 25586] EC number: 4.1.1.70 NCBI GI: 19703546 NCBI GeneID: 991411 DNA sequence SEQ ID NO: 17 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 18 Abbreviation: FN0204 Description: Glutaconyl-CoA decarboxylase alpha subunit [Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum ATCC 25586] EC number: 4.1.1.70 NCBI GI: 19703549 NCBI GeneID: 991561 DNA sequence SEQ ID NO: 19 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 20 Abbreviation: CAC3076 ptb Description: phosphate butyryltransferase [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] EC number: 2.3.1.19 NCBI GI: 15896327 NCBI GeneID: 1119259 DNA sequence SEQ ID NO: 21 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 22 Abbreviation: CAC1660 Description: butyrate kinase [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] EC number: 2.7.2.7 NCBI GI: 15894937 NCBI GeneID: 1117843 DNA sequence SEQ ID NO: 23 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 24 Abbreviation: CAC3075 buk Description: butyrate kinase [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] EC number: 2.7.2.7 NCBI GI: 15896326 NCBI GeneID: 1119258 DNA sequence SEQ ID NO: 25 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 26 Abbreviation: CAA71086 enr Description: 2-enoate reductase [Clostridium tyrobutyricum] EC number: 1.3.1.31 NCBI GI: 2765040 NCBI GeneID: DNA sequence SEQ ID NO: 27 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 28 Abbreviation: ATOD Description: acetyl-CoA: acetoacetyl-CoA transferase, alpha subunit [Escherichia coli K12] EC number: 2.8.3.8 NCBI GI: 16130158 NCBI GeneID: 947525 DNA sequence SEQ ID NO: 29 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 30 Abbreviation: atoa Description: acetyl-CoA: acetoacetyl-CoA transferase, beta subunit [Escherichia coli K12] EC number: 2.8.3.8 NCBI GI: 16130159 NCBI GeneID: 946719 DNA sequence SEQ ID NO: 31 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 32 Abbreviation: fadA Description: 3-ketoacyl-CoA thiolase (thiolase I) [Escherichia coli K12] EC number: 2.3.1.16 NCBI GI: 49176430 NCBI GeneID: 948324 DNA sequence SEQ ID NO: 33 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 34 Abbreviation: fadB Description: fused 3-hydroxybutyryl-CoA epimerase / delta (3) cis-delta (2) trans-enoyl-CoA isomerase / enoyl-CoA hydratase / 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase [Escherichia coli K12] EC number: 1.1.1.35/4.2.1.17/5.3.3.8/5.1.2.3 NCBI GI: 16131692 NCBI GeneID: 948336 DNA sequence SEQ ID NO: 35 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 36 Abbreviation: fadl (= yfcY) Description: beta-ketoacyl-CoA thiolase, anaerobic, subunit [Escherichia coli K12] EC number: 2.3.1.16 NCBI GI: 16130275 NCBI GeneID: 948823 DNA sequence SEQ ID NO: 37 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 38 Abbreviation: fadJ (= yfcX) Description: fused enoyl-CoA hydratase and epimerase and isomerase / 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase [Escherichia coli K12] EC number: 1.1.1.35/4.2.1.17/5.3.3.8/5.1.2.3 NCBI GI: 16130274 NCBI GeneID: 949097 DNA sequence SEQ ID NO: 39 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 40 Abbreviation: atoB Description: acetyl-CoA acetyltransferase [Escherichia coli K12] EC number: 2.3.1.9 NCBI GI: 16130161 NCBI GeneID: 946727 DNA sequence SEQ ID NO: 41 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 42 Abbreviation: Paah Description: 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase [Escherichia coli K12] EC number: 1.1.1.157 NCBI GI: 16129356 NCBI GeneID: 945940 DNA sequence SEQ ID NO: 43 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 44 Abbreviation: CAC0462 Description: Protein of short-chain alcohol dehydrogenase family [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] EC number: 1.3.1.44 NCBI GI: 15893753 NCBI GeneID: 1116645 DNA sequence SEQ ID NO: 45 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 46 Abbreviation: CAP0162 Description: Aldehyde dehydrogenase (NAD +) [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] EC number: 1.2.1.10/1.1.1.- NCBI GI: 15004865 NCBI GeneID: 1116167 DNA sequence SEQ ID NO: 47 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 48 Abbreviation: gdh Description: glutamate dehydrogenase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC number: 1.4.1.4 NCBI GI: 62390914 NCBI GeneID: 3343980 DNA sequence SEQ ID NO: 49 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 50 Abbreviation: gltB Description: glutamine 2-oxoglutarate aminotransferase large subunit [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC number: 1.4.1.13 NCBI GI: 62389079 NCBI GeneID: 3344534 DNA sequence SEQ ID NO: 51 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 52 Abbreviation: gltD Description: glutamine 2-oxoglutarate aminotransferase small subunit [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC number: 1.4.1.13 NCBI GI: 62389080 NCBI GeneID: 3344661 DNA sequence SEQ ID NO: 53 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 54 Abbreviation: actA Description: butyryl-coenzyme A: acetate coenzyme A transferase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC number: 2.8.3.8 NCBI GI: 62391407 NCBI GeneID: 3345037 DNA sequence SEQ ID NO: 55 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 56 Abbreviation: kgd Description: alpha-ketoglutarate decarboxylase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC number: 1.2.4.2 NCBI GI: 62390019 NCBI GeneID: 3343144 DNA sequence SEQ ID NO: 57 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 58 Abbreviation: cg1049 = NCgl0882 Description: enoyl-CoA hydratase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC number: 4.2.1.17 NCBI GI: 62389809 NCBI GeneID: 3345237 DNA sequence SEQ ID NO: 59 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 60 Abbreviation: cg0347 Description: acyl dehydratase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC number: 4.2.1.17 NCBI GI: 62389186 NCBI GeneID: 3343394 DNA sequence SEQ ID NO: 61 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 62 Abbreviation: NCgl2358 Description: short chain dehydrogenase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC number: 1.1.1.36 NCBI GI: 19553640 NCBI GeneID: 1020391 DNA sequence SEQ ID NO: 63 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 64 Abbreviation: cg2625 = NCgl2309 Description: acetyl-CoA acetyltransferase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC number: 2.3.1.9 NCBI GI: 62391235 NCBI GeneID: 3345052 DNA sequence SEQ ID NO: 65 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 66 Abbreviation: cg3022 Description: Acetyl-CoA acetyltransferase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032] EC number: 2.3.1.9 NCBI GI: 62391564 NCBI GeneID: 3343057 DNA sequence SEQ ID NO: 67 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 68 Abbreviation: FTFL Description: Methylobacterium extorquens formatetetrahydrofolate ligase (ftfL) EC number: 6.3.4.3 NCBI GI: 30721807 NCBI GeneID: - DNA sequence SEQ ID NO: 69 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 70 Abbreviation: sucA Description: 2-oxoglutarate decarboxylase, thiaminrequiring [Escherichia coli K12] EC number: 1.2.4.2 NCBI GI: 16128701 NCBI GeneID: 945303 DNA sequence SEQ ID NO: 71 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 72 Abbreviation: sucB Description: dihydrolipoyltranssuccinase [Escherichia coli K12] EC number: 2.3.1.61 NCBI GI: 16128702 NCBI GeneID: 945307 DNA sequence SEQ ID NO: 73 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 74 Abbreviation: pps Description: phosphoenolpyruvate synthase [Escherichia coli K12] EC number: 2.7.9.2 NCBI GI: 16129658 NCBI GeneID: 946209 DNA sequence SEQ ID NO: 75 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 76 Abbreviation: fdhF Description: formate dehydrogenase-H [Escherichia coli K12] EC number: 1.2.1.2 NCBI GI: 16131905 NCBI GeneID: 948584 DNA sequence SEQ ID NO: 77 Amino Acid Sequence SEQ ID NO: 78

Ausführungsbeispiel: Synthese von Crotonsäure in einem rekombinanten E. coli-StammExemplary embodiment: Synthesis of crotonic acid in a recombinant E. coli strain

Ausgangspunkt für die Transformation ist der E. coli-Stamm K12. Nucleinsäuremoleküle enthaltend die Gene für 2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase-Aktivität, für Glutaconat-CoA-Transferase-Aktivität, für 2-Hydroxyglutaryl-CoA-Dehydratase-Aktivität und für Glutaconyl-CoA-Decarboxylase-Aktivität, speziell Nucleinsäuremoleküle mit den Sequenzen SEQ-ID No: 1; 3 und 5; 7, 9 und 11; 13, 15, 17 und 19, werden in Expressionsvektoren pUC oder pPCU18 oder ähnliche cloniert/ligiert. Die Ligation der Plasmid-DNA erfolgt in an sich bekannter Weise. Beispielsweise wird der Vektor durch Hydrolyse mit Restriktionsendonuclease geöffnet und die entsprechenden DNA-Sequenzen inseriert. Die Ligation erfolgt beispielsweise durch Kassettenmutagenese.starting point for transformation is E. coli strain K12. nucleic acid molecules containing the genes for 2-hydroxyglutarate dehydrogenase activity, for glutaconate-CoA transferase activity, for 2-Hydroxyglutaryl-CoA dehydratase activity and for Glutaconyl-CoA decarboxylase activity, especially nucleic acid molecules with the sequences SEQ ID No: 1; 3 and 5; 7, 9 and 11; 13, 15, 17 and 19, are expressed in expression vectors pUC or pPCU18 or the like cloned / ligated. The ligation of the plasmid DNA is carried out in a known manner Wise. For example, the vector is prepared by hydrolysis with restriction endonuclease opened and the appropriate DNA sequences inserted. The ligation is carried out, for example, by cassette mutagenesis.

Die Transformation transformationskompetenter E. coli-Zellen sowie die Herstellung transformationskompetenter E. coli-Zellen erfolgt vorzugsweise nach dem Protokoll von Hanahan, 1985 ( Hanahan, D. in Glover, D.M. (ed.) DNA Cloning: „A Practical Approach" IRL Press Oxford 109–135 ).The transformation of transformation-competent E. coli cells and the production of transformation-competent E. coli cells is preferably carried out according to the protocol of Hanahan, 1985 ( Hanahan, D. in Glover, DM (ed.) DNA Cloning: "A Practical Approach" IRL Press Oxford 109-135 ).

Zur Herstellung der transformationskompetenten E. coli-Zellen werden E. coli K12-Stämme, beispielsweise TH1, TH2, TH5, TH5α, C600, Top 10, XL1-Blue und deren Derivate eingesetzt. Aus einer Vorabkultur aus einer Dauerkultur wird eine frische Zellkolonie in 5 ml SOB-Medium suspendiert und unter Schütteln bei 37°C bis zu einer Zelldichte von 1 bis 2 × 108/m1 kultiviert. Anschließend wird 1:1 mit 40% Glycerol/60% SOB-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bacto- Trypton-mmol/l NaCl, 2,5 mmol/l KCl, nach Autoklavieren auf 10 mmol/l MgCl2 und MgSO4 einstellen) verdünnt und auf Eis gekühlt. Aus der Vorabkultur wird ein Zellausstrich auf eine LM-Platte angelegt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Daraus werden jeweils 5 Kolonien mit einem Durchmesser von etwa 0,5 bis 1 mm abgeimpft und in 50 ml SOB-Medium angeimpft; die Zellen werden für etwa 3 Stunden bis zu einer Dichte von 4 bis 7 × 107/ml bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Die Zellen werden auf Eis gekühlt und in Zentrifugenröhrchen überführt und bei 2500 rpm bei 4°C für 5 Minuten sedimentiert. Das Sediment wird mit 17 ml LM-Agar-FSB-Puffer resuspendiert und in Eis inkubiert. Der Vorgang wird gegebenenfalls wiederholt. Schließlich wird das Sediment in 5 ml LM-Agar-FSB-Puffer resuspendiert und 5 Minuten in Eis inkubiert. Dann werden 140 μl DMSO zugegeben, 5 Minuten in Eis inkubiert, nochmals 140 μl DMSO zugegeben, und 5 Minuten in Eis inkubiert. Die Zellsuspension kann beispielsweise in 1,5 ml-Reaktionsgefäßen nach langsamen Tieffrieren bei –70°C mehrere Monate aufbewahrt werden.To prepare the transformation-competent E. coli cells, E. coli K12 strains, for example TH1, TH2, TH5, TH5α, C600, Top 10, XL1-Blue and their derivatives are used. From a preliminary culture from a permanent culture, a fresh cell colony is suspended in 5 ml of SOB medium and cultured with shaking at 37 ° C to a cell density of 1 to 2 × 10 8 / ml. Subsequently, 1: 1 with 40% glycerol / 60% SOB medium (1% yeast extract, 2% Bacto-Tryptone-mmol / l NaCl, 2.5 mmol / l KCl, after autoclaving to 10 mmol / l MgCl 2 and MgSO 4 ) diluted and cooled on ice. From the pre-culture, a cell smear is applied to an LM plate and incubated overnight at 37 ° C. From each of 5 colonies are inoculated with a diameter of about 0.5 to 1 mm and inoculated in 50 ml of SOB medium; the cells are cultured for about 3 hours to a density of 4 to 7 x 10 7 / ml at 37 ° C with shaking. The cells are cooled on ice and transferred to centrifuge tubes and sedimented at 2500 rpm at 4 ° C for 5 minutes. The sediment is resuspended with 17 ml LM agar FSB buffer and incubated in ice. The process is repeated if necessary. Finally, the sediment is resuspended in 5 ml LM agar FSB buffer and incubated for 5 minutes in ice. Then 140 ul DMSO are added, incubated for 5 minutes in ice, added again 140 ul DMSO, and incubated for 5 minutes in ice. For example, the cell suspension can be stored in 1.5 ml reaction vessels after slow deep freezing at -70 ° C. for several months.

Die Ligation wird in einem molaren Verhältnis von DNA zu Vektor-DNA von 1:1 bis 1:3 durchgeführt. Der Ligationsansatz: 4 μl steriles Wasser, 2 μl 5 × Ligasepuffer (250 mmol/l Tris-HCl, pH 7,6, 50 mmol/l MgCl2, 5 mmol/l ATP, 5 mmol/l DTT, 25% PEE (w/v)), 1 ml amplifizierte DNA, 2 μl Vektor-DNA (mit 3'-T-Überhang in 1 μl T4-Ligase, wird in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß vorgelegt und nach Vermischen über Nacht bei 14°C inkubiert. Jeweils 1–5 μl des Ansatzes werden zur Transformation von transformationskompetenten E. coli-Zellen eingesetzt; gegebenenfalls kann der Ligationsansatz bei –20°C gelagert werden.The ligation is carried out in a molar ratio of DNA to vector DNA of 1: 1 to 1: 3. The ligation mixture: 4 μl of sterile water, 2 μl of 5 × ligase buffer (250 mmol / l Tris-HCl, pH 7.6, 50 mmol / l MgCl 2 , 5 mmol / l ATP, 5 mmol / l DTT, 25% PEE ( w / v)), 1 ml of amplified DNA, 2 .mu.l of vector DNA (with 3'-T overhang in 1 .mu.l T4 ligase) is placed in a 1.5 ml reaction vessel and after mixing overnight at 14 ° C. Each 1-5 μl of the mixture is used to transform transformation-competent E. coli cells and, if appropriate, the ligation mixture can be stored at -20 ° C.

Zur Transformation der kompetenten E. coli-Zellen werden jeweils 30 μl der zu tranformierenden DNA vorgelegt und bei Kühlung in Eis je 200 μl der Zellsuspension zugegeben und etwa 30 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wird für 90 Minuten bei 42°C ohne Schütteln inkubiert und danach für 2 Minuten auf Eis abgekühlt. Nach Zugabe von 800 μl SOC-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Tryptonmmol/l NaCl, 2,5 mmol/l KCl, nach Autoklavieren auf 10 mmol/l MgCl2 und MgSO4 einstellen und zusätzlich auf 20 mmol/l Glucose einstellen) wird bei 37°C bei etwa 200 RPM für etwa 1 Stunde inkubiert. Je 200 μl einer geeigneten Verdünnung des Transformationsansatzes wird auf LB-AMP-Platten ausplattiert. Die Inkubation erfolgt bei 37°C über Nacht.In order to transform the competent E. coli cells, in each case 30 .mu.l of the DNA to be transformed are introduced and, when cooled in ice, 200 .mu.l of the cell suspension are added and incubated on ice for about 30 minutes. The mixture is then incubated for 90 minutes at 42 ° C without shaking and then cooled for 2 minutes on ice. After addition of 800 .mu.l SOC medium (1% yeast extract, 2% Bacto-tryptonmmol / l NaCl, 2.5 mmol / l KCl, after autoclaving to 10 mmol / l MgCl 2 and MgSO 4 and in addition to 20 mmol / l Glucose ) is incubated at 37 ° C at about 200 RPM for about 1 hour. 200 μl each of a suitable dilution of the transformation mixture is plated out on LB-AMP plates. Incubation is at 37 ° C overnight.

Zur Selektion der rekombinanten Zellen werden Selektionsplatten verwendet, wobei jeweils 100 μl einer Mischung aus 10 μl 100 mmol/l IPTG, 40 μl 3% X-Gal und 50 μl SOC-Medium auf einer LB-AMP-Agarplatte ausplattiert werden und diese für etwa 1 Stunde bei 37°C inkubiert werden. Nach Inkubation werden jeweils 200 μl der Zellsuspension auf der Selektionsplatte ausplattiert. Anhand des α-Komplementationstests lassen sich die Kolonien, die kein rekombinantes Plasmid enthalten, aufgrund der Blaufärbung von den rekombinanten Clonen, welche keine Färbung aufweisen, leicht unterscheiden. Die stabile heterlologe Expression in den so erhältlichen rekombinanten E. coli Zellen wird in an sich bekannter Weise verifiziert.to Selection of recombinant cells, selection plates are used, in each case 100 .mu.l of a mixture of 10 .mu.l 100 mmol / l IPTG, 40 μl 3% X-Gal and 50 μl SOC medium plated on an LB-AMP agar plate and this for are incubated at 37 ° C for about 1 hour. After incubation in each case 200 .mu.l of the cell suspension on the selection plate plated. On the basis of the α-complementation test can be colonies containing no recombinant plasmid due the blue coloration of the recombinant clones, which does not Coloring, slightly different. The stable heterologist Expression in the recombinant E. coli thus obtained Cells are verified in a conventional manner.

Die erhaltenen rekombinanten E. coli Zellen werden nach Inokulation in einem 50 L-Fermenter mit Kulturmedium angesetzt und unter Sauerstoffabschluss bei 25 bis 40°C kultiviert. Die Zugabe des C3-C6-Substrates, hier Glucose oder alternative Glycerol, erfolgt in das Kulturmedium. Das Produkt Crotonsäure wird im Medium in hoher Reinheit gewonnen.The obtained recombinant E. coli cells are after inoculation prepared in a 50 L fermenter with culture medium and under oxygen exclusion cultured at 25 to 40 ° C. The addition of the C3-C6 substrate, here glucose or alternative glycerol, takes place in the culture medium. The product crotonic acid is in the medium in high purity won.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.It follows Sequence listing according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can of the official publication platform of the DPMA become.

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

  • - WO 2007/041269 A2 [0005] - WO 2007/041269 A2 [0005]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

  • - Hanahan, D. in Glover, D.M. (ed.) DNA Cloning: „A Practical Approach" IRL Press Oxford 109–135 [0075] - Hanahan, D. in Glover, DM (ed.) DNA Cloning: "A Practical Approach" IRL Press Oxford 109-135 [0075]

Claims (19)

Transgene biologische Zelle, enthaltend in exprimierbarer Form mindestens ein heterologes Nucleinsäuremolekül, codierend für Enzymaktivität, ausgewählt aus: 2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase-Aktivität, (E)-Glutaconat-CoA-Transferase-Aktivität, (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA-Dehydratase-Aktivität, und Glutaconyl-CoA-Decarboxylase-Aktivität.Transgenic biological cell containing expressible Form at least one heterologous nucleic acid molecule, coding for enzyme activity out: 2-hydroxy glutarate dehydrogenase activity, (E) -Glutaconat-CoA transferase activity, (R) -2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase activity, and Glutaconyl-CoA decarboxylase activity. Zelle nach Anspruch 1, wobei das Nucleinsäuremolekül ausgewählt ist aus: a) Nucleinsäuremolekülen, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19; (b) Nucleinsäuremolekülen, codierend für Aminosäuremoleküle enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20; und (c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter (a) und (b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 60% Homologie aufweisen und die eine in Anspruch 1 definierte Enzymaktivität codieren.The cell of claim 1, wherein the nucleic acid molecule is selected from: a) nucleic acid molecules, containing the sequence SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19; (b) nucleic acid molecules encoding for amino acid molecules containing the Sequence SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20; and (C) Nucleic acid molecules, which with the under (a) and (b) at least 60% of the nucleic acid molecules described. Have homology and the one defined in claim 1 enzyme activity encode. Zelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, ausgewählt aus: Bakterien der Gattungen Escherichia, Corynebacterium, Ralstonia, Clostridium, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus sowie Cyanobakterien, Pilzen und Hefen und synthetischen Mikroorganismen, Membranvesikeln, Membrankompartimenten und Teilen oder Fragmenten davon.Cell according to one of the preceding claims, selected from: bacteria of the genera Escherichia, Corynebacterium, Ralstonia, Clostridium, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus and cyanobacteria, fungi and yeasts and synthetic microorganisms, Membrane vesicles, membrane compartments and parts or fragments from that. Zelle nach Anspruch 3, ausgewählt aus: Bakterien der Spezies Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Ralstonia eutropha und Clostridium acetobutylicum.A cell according to claim 3, selected from: bacteria the species Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Ralstonia eutropha and Clostridium acetobutylicum. Zelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, weiter enthaltend Nucleinsäuremoleküle, codierend für Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität und Formiat-Dehydrogenase-Aktivität.Cell according to one of the preceding claims, further containing nucleic acid molecules encoding for formyl tetrahydrofolate ligase activity and Formate dehydrogenase activity. Zelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, weiter enthaltend Nucleinsäuremoleküle, codierend für Coenzym A-Transferase-Aktivität.Cell according to one of the preceding claims, further containing nucleic acid molecules encoding for coenzyme A transferase activity. Zeile nach Anspruch 6, wobei die Coenzym A-Transferase-Aktivität ausgewählt ist aus: Aktivität der Coenzym A-Transferase atoA/atoD aus E. coli, Phosphobutyrylase-Aktivität, Butyrat-Kinase-Aktivität, 2-Enoat-Reduktase-Aktivität, Butyryl-CoA-Acetat-Coenzym A-Transferase-Aktivität; und Kombinationen davon.A line according to claim 6, wherein the coenzyme A transferase activity is selected from: Activity of coenzyme A-transferase atoA / atoD from E. coli, Phosphobutyrylase activity Butyrate kinase activity, 2-enoate reductase activity, Butyryl-CoA acetate coenzyme A-transferase activity; and Combinations of it. Zelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, weiter enthaltend Nucleinsäuremoleküle, codierend für Phosphoenolpyruvat-Synthase-Aktivität.Cell according to one of the preceding claims, further containing nucleic acid molecules encoding for phosphoenolpyruvate synthase activity. Zelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, weiter enthaltend Nucleinsäuremoleküle, codierend für Butyryl-CoA-Dehydrogenase-Aktivität, Butyraldehyd-Dehydrogenase-Aktivität, Butanol-Dehydrogenase-Aktivität und Kombinationen davon.Cell according to one of the preceding claims, further containing nucleic acid molecules encoding For Butyryl-CoA dehydrogenase activity, Butyraldehyde dehydrogenase activity, Butanol dehydrogenase activity and Combinations of it. Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Crotonsäure aus C3-C6-Kohlenstoffquelle als Substrat, enthaltend die Schritte: a) Bereitstellen einer in einem der Ansprüche 1 bis 8 definierten transgenen biologischen Zelle; b) Inkontaktbringen der Zelle mit dem Substrat; c) Kultivieren der Zelle in Kulturmedium unter Bedingungen, unter denen Substrat umgesetzt und Crotonsäure gebildet wird; d) Isolieren der Crotonsäure aus dem Kulturmedium oder der Zelle.Process for the biotechnological production of Crotonic acid from C3-C6 carbon source as substrate, containing the steps: a) providing one in any of the claims 1 to 8 defined transgenic biological cell; b) bring into contact the cell with the substrate; c) culturing the cell in culture medium under conditions under which substrate reacted and formed crotonic acid becomes; d) isolating the crotonic acid from the culture medium or the cell. Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Butanol aus einer C3-C6-Kohlenstoffquelle als Substrat, enthaltend die Schritte: a) Bereitstellen einer in Anspruch 9 definierten transgenen biologischen Zelle; b) Inkontaktbringen der Zelle mit dem Substrat; c) Kultivieren der Zelle in Kulturmedium unter Bedingungen, unter denen Substrat umgesetzt und Butanol gebildet wird; d) Isolieren des Butanols aus dem Kulturmedium oder der Zelle.Process for the biotechnological production of butanol from a C3-C6 carbon source as substrate, comprising the steps: a) providing a transgenic biological cell as defined in claim 9; b) contacting the cell with the substrate; c) culturing the cell in culture medium under conditions in which substrate is reacted and butanol ge is formed; d) isolating the butanol from the culture medium or the cell. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Zelle unter anaeroben Bedingungen kultiviert wird.The method of claim 10 or 11, wherein the cell is cultivated under anaerobic conditions. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die C3--C6-Kohlenstoffquelle ausgewählt ist aus: Hexosen, Pentosen, Oligo- und Polysacchariden und ein- und mehrwertigen Alkoholen.Method according to one of claims 10 to 12, wherein the C3 - C6 carbon source is selected from: Hexoses, pentoses, oligo- and polysaccharides and mono- and polyvalent ones Alcohols. Verfahren nach Anspruch 13 wobei die Kohlenstoffquelle Glucose ist.The method of claim 13 wherein the carbon source Glucose is. Verfahren nach Anspruch 13 wobei die Kohlenstoffquelle Glycerol ist.The method of claim 13 wherein the carbon source Glycerol is. Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 8 definierten transgenen biologischen Zelle zur biotechnologischen Herstellung von Crotonsäure.Use of in any one of claims 1 to 8 defined transgenic biological cell to biotechnological Preparation of crotonic acid. Verwendung der in Anspruch 9 definierten transgenen biologischen Zelle zur biotechnologischen Herstellung von Butanol.Use of the transgenic defined in claim 9 biological cell for the biotechnological production of butanol. Expressionskassette zur Transformation einer Wirtszelle, enthaltend: Nucleinsäuremolekül, codierend für Enzymaktivität, ausgewählt aus: 2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase-Aktivität, (E)-Glutaconat-CoA-Transferase-Aktivität, (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA-Dehydratase-Aktivität, und Glutaconyl-CoA-Decarboxylase-Aktivität.Expression cassette for transformation of a host cell, containing: nucleic acid molecule encoding Enzyme activity selected from: 2-hydroxy glutarate dehydrogenase activity, (E) -Glutaconat-CoA transferase activity, (R) -2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase activity, and Glutaconyl-CoA decarboxylase activity. Vektor, enthaltend die Expressionskassette nach Anspruch 18, der geeignet ist, die Expression der Enzymaktivitäten in einer Wirtszelle zu vermitteln.Vector containing the expression cassette after Claim 18, which is suitable, the expression of the enzyme activities to mediate in a host cell.
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