DE102007046388A1 - Development of a binding assay and presentation of novel inhibitors of the myelin associated glycoprotein - Google Patents

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Abstract

Kommt es durch Unfälle oder Erkrankungen zu Verletzungen des adulten zentralen Nervensystems, so sind die betroffenen Körperfunktionen im Allgemeinen dauerhaft eingeschränkt oder verloren. Aufgrund der fehlenden Regenerationsfähigkeit der zentralen Nervenbahnen und des Gehirns ist dies in fast allen Fällen irreversibel.1 Für die Betroffenen bedeutet der so entstandene Verlust der Motorik und der normalen Körperfunktionen, wie z. B. der Kontrolle über die Blase und den Mastdarm, extreme Einschränkungen im Alltag. Zusätzlich ist in den gelähmten Bereichen die Schmerzwahrnehmung sowie das Temperatur- und Tastempfinden verloren. Querschnittsgelähmte Patienten sind oft nicht mehr in der Lage, ihren Alltag alleine zu bewältigen. In Deutschland treten jährlich ca. 1000 neue Fälle von Querschnittslähmungen auf. Für die USA gibt die National Spinal Cord Injury Association (NSCIA) 11000 neue Fälle von Spinal Cord Injury (SCI) pro Jahr an. 80% der Betroffenen sind Männer. Die häufigsten Ursachen für SCI sind Kraftfahrzeugunfälle mit 47,5% und Stürze mit 22,9%.2 Im Gegensatz zum zentralen Nervensystem (ZNS) ist das periphere Nervensystem (PNS) zur Regeneration nach Verletzungen fähig. Die nervösen Verknüpfungen können hier unter Rückerhalt der Funktionen meist vollständig wiederhergestellt werden. Diese Tatsache kann zur Erforschung genutzt werden, welche Unterschiede des PNS zum ZNS diese Regeneration ermöglichen. Es könnten so Möglichkeiten gefunden werden, ...If accidents or diseases lead to injuries of the adult central nervous system, the affected body functions are generally permanently restricted or lost. Due to the lack of ability to regenerate the central nervous system and the brain, this is irreversible in almost all cases.1 For those affected, the resulting loss of motor function and normal body functions, such As the control of the bladder and rectum, extreme restrictions in everyday life. In addition, in the paralyzed areas the perception of pain and the temperature and tactile sensation is lost. Paraplegics are often no longer able to cope with their everyday lives alone. In Germany, about 1000 new cases of paraplegia occur each year. For the US, the National Spinal Cord Injury Association (NSCIA) lists 11,000 new cases of Spinal Cord Injury (SCI) per year. 80% of those affected are men. The most common causes of SCI are vehicle accidents at 47.5% and falls at 22.9% .2 In contrast to the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of regeneration after injury. The nervous connections can usually be completely restored here while retaining the functions. This fact can be exploited to explore which differences in PNS to CNS allow for this regeneration. It could be found ways to ...

Description

Das Myelin-assoziierte Glycoprotein ist ein Protein des Nervensystems mit fünf extrazellulären, einer Transmembran- und zwei intrazellulären Domänen. Es gehört zur Familie der Sialic acid binding immunglobulin-like lectins (Siglecs). Im Gegensatz zu OMgp und Nogo-A wird MAG nicht auf Neuronen, sondern nur auf Gliazellen exprimiert. MAG macht mit weniger als 1% einen relativ kleinen Anteil an den Proteinen des Myelins aus. Es gehört zu den am höchsten konservierten Proteinen, was auf einen starken Selektionsdruck für seine Funktionen hindeutet. MAG spielt eine Rolle im Aufbau und in der Erhaltung der Myelinscheiden und fördert das Neuritenwachstum von neonatalen Dorsal Root Ganglien (DRG). Des Weiteren wirkt es aber auch bei der Inhibierung des Neuritenwachstums von adulten DRG- und anderen Nervenzelltypen mit. MAG gilt zwar als potenter Wachstumsinhibitor in vitro, aber MAG-Knock-Out-Mäuse zeigen keine oder nur eine geringe Erhöhung des Neuritenwachstums im Rückenmark. Slow-Regenerating-Mäuse erhärten aber den Verdacht, dass MAG inhibierend auf die axonale Regeneration in vivo wirken kann: die Regeneration ist erhöht, wenn das MAG-Gen ausgeschaltet ist. MAG existiert in zwei Isoformen, dem L- und dem S-MAG, mit 67 kDa bzw. 72 kDa Gewicht, die sich in Sekundärstruktur und Topologie gleichen, aber geringfügige Variationen im cytoplasmatischen Carboxyterminus zeigen (1). S-MAG ist die vorherrschende Form im PNS, L-MAG dagegen die vorherrschende Form im ZNS. Die Glycostrukturen des MAG machen ca. 30% seines Gewichtes aus. Es liegt bisher keine Röntgenkristallstruktur von MAG vor, daher ist genaueres über die 3D-Struktur des Proteins nicht bekannt.The myelin-associated glycoprotein is a nervous system protein with five extracellular, one transmembrane and two intracellular domains. It belongs to the family of sialic acid binding immunoglobulin-like lectins (Siglecs). Unlike OMgp and Nogo-A, MAG is not expressed on neurons but only on glial cells. MAG makes up a relatively small proportion of the proteins of myelin, less than 1%. It is one of the most highly conserved proteins, indicating a strong selection pressure for its functions. MAG plays a role in the formation and maintenance of myelin sheaths and promotes neurite outgrowth of neonatal dorsal root ganglia (DRG). Furthermore, it also has an effect on the inhibition of neurite outgrowth of adult DRG and other neuronal types. Although MAG is considered a potent growth inhibitor in vitro, MAG knock-out mice show no or only a slight increase in neurite outgrowth in the spinal cord. Slow Regenerating mice, however, support the suspicion that MAG may have an inhibiting effect on axonal regeneration in vivo: the regeneration is increased when the MAG gene is switched off. MAG exists in two isoforms, the L- and the S-MAG, with 67 kDa and 72 kDa weight, respectively, which are similar in secondary structure and topology, but show slight variations in the cytoplasmic carboxy terminus ( 1 ). S-MAG is the predominant form in the PNS, while L-MAG is the predominant form in the CNS. The glycostructures of MAG account for about 30% of its weight. There is no X-ray crystal structure of MAG so far, therefore, more detailed information about the 3D structure of the protein is not available.

1: Schematische Darstellung der zwei Isoformen des MAG. Der Unterschied dieser beiden Formen liegt in Varationen im intrazellulären Carboxyterminus. In der N-terminalen V-set Domäne befindet sich die für die Sialinsäurebindung wichtige Aminosäure Arginin 118. 1 Schematic representation of the two isoforms of MAG. The difference between these two forms lies in variations in the intracellular carboxy terminus. The amino acid arginine 118, which is important for sialic acid binding, is located in the N-terminal V-set domain.

MAG ist aus fünf intern-homologen Regionen aufgebaut, die zu fünf Immunglobulinähnlichen Domänen im extrazellulären Aminoterminus führen. In Richtung des Carboxyterminus befindet sich die einzige Transmembrandomäne (zwischen ~510 aa bis ~530 aa).LIKE is made up of five internally homologous regions that belong to five immunoglobulin-like domains in the lead to extracellular amino terminus. In the direction of the carboxy terminus is the only transmembrane domain (between ~ 510 aa to ~ 530 aa).

MAG bewirkt den growth cone collaps einerseits über die komplexen Ganglioside des Nervensystems. Andererseits konkurriert MAG mit Nogo-66 und OMgp um die Bindung an den NgR. Diese Bindung ist im Gegensatz zur Gangliosidbindung sialinsäure-unabhängig. Die NgR-Bindungsdomäne ist bisher nicht identifiziert. Es gibt aber Hinweise darauf, dass sie sich C-terminal zur dritten Ig-ähnlichen Domäne und N-terminal zur Transmembrandomäne befindet. MAG ist in der Lage in nanomolarer Konzentration growth cone collapse in Neuronen zu verursachen, die mit NgR transfiziert wurden.LIKE causes the growth cone collapses on the one hand over the complex ones Gangliosides of the nervous system. On the other hand, MAG competes with it Nogo-66 and OMgp bind to the NgR. This tie is in Unlike ganglioside binding, sialic acid-independent. The NgR binding domain is not identified yet. It But there is evidence that they are C-terminal to the third Ig-like domain and N-terminal to the transmembrane domain located. MAG is capable of nanomolar concentration growth cause cone collapse in neurons that transfected with NgR were.

Inhibierende Eigenschaften des MAGInhibiting properties of MAG

MAG übt wie Nogo-A und OMgp im adulten ZNS eine inhibierende Wirkung auf die Axonregeneration aus. Es wirkt durch die Bindung an den NgR. Über die Corezeptoren des NgR wird dann eine Kaskade ausgelöst, die den growth cone collapse zur Folge hat. Für MAG ist noch ein zweiter Weg nachgewiesen worden. Dabei übermittelt MAG seine Wirkung durch Bindung an das Gangliosid GT1b, das auf Neuronenoberflächen exprimiert wird. Zusammen mit dem Corezeptor p75NTR löst es die gleiche Signalkaskade aus wie durch Bindung an den NgR. Es ist bislang nicht bekannt, ob diese beiden Kaskaden unabhängig voneinander agieren, oder ob sie einander bedingen.Like Nogo-A and OMgp in the adult CN, MAG exerts an inhibitory effect on axon regeneration. It works by binding to the NgR. A cascade is triggered via the core receptors of the NgR, resulting in the growth cone collapse. For MAG, a second way has been proven. MAG mediates its action by binding to the ganglioside GT1b, which is expressed on neuronal surfaces. Together with the p75 NTR coreceptor, it triggers the same signal cascade as it does by binding to the NgR. It is not yet known if these two cascades act independently of each other, or if they cause each other.

Um die Wirkung des MAG zu unterdrücken und eine Regeneration der zerstörten Axone zu ermöglichen, blockierten DeBellard et al. das MAG mit Sialinsäure und Sialyllactose. Hierfür verwendeten sie einen Neuritenwachstumsassay, bei dem die Länge der Neuriten in Gegenwart von MAG mit unterschiedlichen Saccharidkonzentrationen gemessen wurden. Dabei war eine Abhängigkeit der Neuritenlänge von der Konzentration der Saccharide zu erkennen. So zeigten Neuriten z. B. ein Wachstum von 64% bei einer Zugabe von 20 mM Sialinsäure.To suppress the effect of the MAG and allow regeneration of the destroyed axons blocked DeBellard et al. the MAG with sialic acid and sialyllactose. To do this, they used a neurite growth assay in which the lengths of the neurites were measured in the presence of MAG at different saccharide concentrations. A dependence of the neurite length on the concentration of the saccharides could be recognized. For example, neurites showed B. a growth of 64% with the addition of 20 mM sialic acid.

Die Inhibitoren des MAG in der LiteraturThe inhibitors of MAG in the literature

Ausgehend von der Struktur der komplexen Ganglioside des Nervensystems wurden bisher mehrere Ansätze zur Entwicklung von Inhibitoren für das MAG durchgeführt.outgoing from the structure of the complex gangliosides of the nervous system were so far several approaches to the development of inhibitors performed for the MAG.

Strenge et al. untersuchten die Glycanspezifität von MAG anhand verschiedener synthetischer Oligosaccharide. Dabei zeigte das MAG eine fünffach höhere Bindungsaffinität an α2,3-verknüpfte Neu5Ac als an α2,6-verknüpfte Neu5Ac. Bei einer α-Verknüpfung liegt die Carboxylgruppe in axialer Position vor, was sich somit als notwendig für die Bindung an das MAG herausstellte. Außerdem ergab sich, dass MAG bestimmten Veränderungen der Neu5Ac gegenüber nicht tolerant war. So nahm die Bindungsaffinität stark ab, wenn die Hydroxylgruppen an der 8- oder 9-Position entfernt wurden. Auch die Carboxylgruppe und die N-Acetylgruppe zeigten sich in dieser Analyse als wichtige funktionelle Gruppen für die Bindung von Neu5Ac an das MAG. Allerdings zeigte MAG eine höhere Bindungsaffinität zu Neu5Ac-Derivaten mit halogenierter N-Acetylgruppe. Ein weiterer Anstieg der Bindungsaffinität konnte durch Einführung einer Thioacetylgruppe anstelle der N-Acetylgruppe erreicht werden. Außerdem erwiesen sich Methyl- oder Benzylglycoside der Neu5Ac als potente Bindungspartner für das MAG. Als weiterhin positiv für die Bindungsaffinität wurden Veränderungen der 9-Position gefunden. So zeigten Derivate der Neu5Ac mit Alkylsubstituenten oder aromatischen Substituenten an der 9-Position eine stark erhöhte Bindung an das MAG. 2003 meldeten Kelm und Brossmer ein Patent über Siglec-Inhibitoren an, in dem diese Modifikationen der Neu5Ac und ihr Effekt auf die Bindung an das MAG zusammengefasst sind. Strenge et al. investigated the glycan specificity of MAG using various synthetic oligosaccharides. The MAG showed a fivefold higher binding affinity to α2,3-linked Neu5Ac than to α2,6-linked Neu5Ac. In an α-linkage, the carboxyl group is in the axial position, which is so with as necessary for the binding to the MAG turned out. It also showed that MAG was not tolerant to certain changes in the Neu5Ac. Thus, the binding affinity decreased sharply when the hydroxyl groups were removed at the 8 or 9 position. The carboxyl group and the N-acetyl group were also shown to be important functional groups in this analysis for the binding of Neu5Ac to the MAG. However, MAG showed a higher binding affinity to Neu5Ac derivatives with halogenated N-acetyl group. A further increase in binding affinity could be achieved by introducing a thioacetyl group instead of the N-acetyl group. In addition, methyl or benzyl glycosides of the Neu5Ac proved to be potent binding partners for the MAG. As further positive for the binding affinity, changes in the 9-position were found. Thus, derivatives of the Neu5Ac with alkyl substituents or aromatic substituents at the 9-position showed a strongly increased binding to the MAG. In 2003, Kelm and Brossmer filed a patent for Siglec inhibitors, summarizing these modifications of the Neu5Ac and its effect on binding to the MAG.

Die Analyse verschiedener Tetrasaccharidderivate abgeleitet von der Substruktur Neu5Ac-α2,3-Gal-β1,3-(Neu5Ac-α2,6-)GalNAc des komplexen Gangliosides GQ1ba mittels STD NMR Spektroskopie betonte die Wichtigkeit der terminalen α2,3-verknüpften Neu5Ac für die MAG-Bindung. 2006 wurden die Strukturen verschiedener Tetrasaccharidmimetika abgeleitet von dieser Substruktur als neue Antagonisten für das MAG veröffentlicht. In diesen Verbindungen ist die Gal-β1,3-GalNAc-Struktur gegen einen Biphenyllinker zwischen den beiden Neu5Ac ausgetauscht. Da die Orientierung der beiden Neu5Ac zueinander in diesen neuen Verbindungen nicht vollständig der Orientierung im Tetrasaccharid entspricht, zeigen die Verbindungen etwas schwächere Bindungsaffinitäten an das MAG als das Tetrasaccharid. Allerdings führte der Biphenylsubstituent zu einer Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften der neuen Verbindungsklasse. Die bisher erfolgreichsten Inhibitoren für das MAG sind zweifach aromatisch substituierte Neuraminoside, zu denen auch die Referenzsubstanz SH-81 gehört. Diese zeigten im Hapten-Inhibitionsassay eine um mehr als den Faktor > 700 erhöhte Bindungsaffinität an das MAG verglichen mit den Trisaccharid Neu5Ac-α2,3-Gal-β1,3-GalNAc-OSE. Hierbei wies SH-81 als am Benzamidsubstituenten der 9-Position einfach chlorierte Verbindung das höchste Inhibitionspotential mit 1074 verglichen mit dem Trisaccharid auf. Weitere Halogenierungen ließen das Inhibitionspotential sinken.The Analysis of various tetrasaccharide derivatives derived from the Substructure Neu5Ac-α2,3-Gal-β1,3- (Neu5Ac-α2,6-) GalNAc of the complex ganglioside GQ1ba using STD NMR spectroscopy the importance of the terminal α2,3-linked New5Ac for the MAG binding. 2006 were the structures various tetrasaccharide mimetics derived from this substructure published as new antagonists for the MAG. In these compounds, the Gal-β1,3-GalNAc structure is exchanged for a biphenyl linker between the two Neu5Ac. Because the orientation of the two Neu5Ac to each other in this new Compounds not completely orientated in the tetrasaccharide corresponds, the compounds show somewhat weaker binding affinities to the MAG as the tetrasaccharide. However, the led Biphenyl substituent to improve the pharmacokinetic Properties of the new connection class. The most successful so far Inhibitors for the MAG are di-aromatic substituted Neuraminosides, which include the reference substance SH-81. These showed in the hapten inhibition assay increased by more than the factor> 700 Binding affinity to the MAG compared to the trisaccharide Neu5Ac-α2,3-Gal-β1,3-GalNAc-OSE. Here, SH-81 was as simple as the benzamide substituent at the 9-position chlorinated compound the highest inhibition potential with 1074 compared to the trisaccharide. Further halogenations let the inhibition potential sink.

Mitteilung der ErfindungMessage of the invention

Entwicklung eines SPR-Systems für das MAGDevelopment of an SPR system for the MAG

Die Kupplung als Amid ist die Standardimmobilisierungsmethode für Moleküle auf CM5-Chips. Hierbei werden die Carboxylfunktionen der Dextranmatrix mit Hilfe von N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid Hydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS), im Verhältnis 1:1 eingesetzt, aktiviert. Die resultierenden Aktivester reagieren mit freien Aminogruppen des Liganden (z. B. Lysine in Proteinen). Das Reaktionsschema der Kupplung ist in 2 verdeutlicht.The coupling as amide is the standard immobilization method for molecules on CM5 chips. Hereby, the carboxyl functions of the dextran matrix are activated with the aid of N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS), used in a ratio of 1: 1. The resulting active esters react with free amino groups of the ligand (eg, lysines in proteins). The reaction scheme of the coupling is in 2 clarified.

2: Das Reaktionsschema der Aminkupplung. Die Carboxylfunktionen der Dextranmatrix des CM5-Chips reagieren nach Umsetzung mit NHS/EDC (1:1) zum Aktivester mit den Aminogruppen des Proteins unter Ausbildung einer Amidfunktion. 2 : The Reaction Scheme of the Amine Coupling. The carboxyl functions of the dextran matrix of the CM5 chip react after reaction with NHS / EDC (1: 1) to the active ester with the amino groups of the protein to form an amide function.

Zur Immobilisation des MAG war die Verwendung der Aminkupplung nach Standardbedingungen nicht möglich, da das immobilisierte Protein auf dem Chip seine Aktivität verlor. Als Grund für den Aktivitätsverlust wurde angenommen, dass das Lysin 67 der MAG-Bindungstasche, welches in vorangegangenen Arbeiten als für die Bindung wichtige Aminosäure gezeigt wurde, ebenfalls bei der Aminkupplung reagiert hat. Um dies zu verhindern, wurde der Immobilisierungslösung des MAG ein potenter Ligand im 50fachen Überschuss hinzugesetzt. Auf Grundlage der Ergebnisse der STD NMR-Messungen wurde der Ligand SV-8 mit einem KD von 8 ± 3 μM ausgewählt (s. Kapitel 0). Der Zusatz im 50fachen Überschuss sollte bewirken, dass bei einem Grossteil des MAG die Bindungstasche und so das Lysin 67 durch Interaktion mit dem Liganden SV-8 belegt sind und nicht mehr für die Kupplung bei der Immobilisierung zur Verfügung stehen. Auf diese Weise blieb die Aktivität des MAG erhalten, wie der anschließende Funktionalitätstest mit der Standardsubstanz N-Acetylneuraminsäure zeigte.For the immobilization of the MAG, the use of the amine coupling was not possible under standard conditions, since the immobilized protein on the chip lost its activity. As a reason for the loss of activity, it was assumed that the lysine 67 of the MAG binding pocket, which in previous work was shown to be the amino acid important for binding, also reacted in the amine coupling. To prevent this, a potent ligand was added to the immobilization solution of the MAG in 50-fold excess. Based on the results of the STD NMR measurements, the ligand SV-8 was selected with a K D of 8 ± 3 μM (see Chapter 0). The addition in 50-fold excess should cause that in a large part of the MAG the binding pocket and thus the lysine 67 are occupied by interaction with the ligand SV-8 and are no longer available for the coupling in the immobilization. In this way, the activity of the MAG remained, as the subsequent functionality test with the standard substance N-acetylneuraminic acid showed.

Funktionalitätstest mit N-AcetylneuraminsäureFunctionality test with N-acetylneuraminic acid

Um sicherzustellen, dass die Funktionalität des MAG nach der Immobilisierung auf dem Chip erhalten geblieben war, wurden verschiedene Konzentrationen von Neu5Ac als Standard vermessen. 3 zeigt die erhaltenen Sensorgramme.To ensure that the functionality of the MAG remained intact after immobilization on the chip, various concentrations of Neu5Ac were measured as standard. 3 shows the received sensorgrams.

3: Die Sensorgramme der SPR-Messung verschiedener Konzentrationen der Standardsubstanz N-Acetylneuraminsäure. Es wurden Konzentrationen von 100 μM bis 2500 μM vermessen, wobei die höchste Konzentration zweimal analysiert wurde, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu überprüfen. Die zunehmenden RU-Antworten belegen, dass eine konzentrationsabhängige Bindung der Neu5Ac an das MAG stattfindet. 3 : The sensorgrams of the SPR measurement of various concentrations of the standard substance N-acetylneuraminic acid. Concentrations of 100 μM to 2500 μM were measured, with the highest concentration being analyzed twice to check the reproducibility of the results. Increasing RU responses indicate that concentration-dependent binding of Neu5Ac to MAG occurs.

Bei der Auftragung der ermittelten RUmax-Werte gegen die Konzentration in μM wurde die in 4 gezeigte Kurve erhalten. Durch den Fit nach dem one site binding-Modell ergab sich ein KD-Wert von 1.5 ± 0.3 mM für die Bindung von Neu5Ac an das MAG. Die von Kelm et al. bestimmten rIP- und IC50-Werte für verschiedene Neu5Ac-Derivate bei der Bindung an MAG deuten auf eine Bindungskonstante im mM-Bereich für reine Neu5Ac an das MAG hin. Die beobachtete Bindung zeigte, dass der größte Teil des MAG nach der Immobilisierung seine Aktivität behielt. Aus den erhaltenen Sensorgrammen wurde eine RU-Antwort von 31 RU für die höchste vermessene Neu5Ac-Konzentration erhalten. D. h., dass das immobilisierten MAG zu 91% seine Aktivität behielt. Die Blockade seiner Bindungstasche und so des Lysin 67 durch den Liganden SV-8 konnte die Bindungstasche schützen und eine Reaktion der hier liegenden Aminosäuren in der Aminkupplung verhindern.When plotting the determined RU max values against the concentration in μM, the in 4 obtained curve shown. Fit to the one site binding model resulted in a K D value of 1.5 ± 0.3 mM for the binding of Neu5Ac to the MAG. The of Kelm et al. specific rIP and IC 50 values for various Neu5Ac derivatives upon binding to MAG indicate a binding constant in the mM range for pure Neu5Ac to the MAG. The observed binding showed that most of the MAG retained its activity after immobilization. From the resulting sensorgrams, an RU response of 31 RU was obtained for the highest measured Neu5Ac concentration. That is, the immobilized MAG retained 91% of its activity. The blockade of his binding pocket and thus the lysine 67 by the ligand SV-8 could protect the binding pocket and prevent a reaction of the amino acids located here in the amine coupling.

4: SPR-Messung der Standardsubstanz N-Acetylneuraminsäure: Die Auftragung der RUmax-Werte gegen die Konzentrationen der Neu5Ac von 100 μM bis 2500 μM lässt sich mit Hilfe des one site binding-Modells fitten. Dabei wird eine Dissoziationskonstante von KD = 1.5 ± 0.3 mM für die Bindung von Neu5Ac an das MAG erhalten. 4 : SPR measurement of the standard substance N-acetylneuraminic acid: The application of the RUmax values to the concentrations of the Neu5Ac from 100 μM to 2500 μM can be fitted using the one site binding model. A dissociation constant of KD = 1.5 ± 0.3 mM for the binding of Neu5Ac to the MAG is obtained.

Synthese der Aminosäurekonjugate der trunkierten Neuraminsäure als neue Inhibitoren für das MAGSynthesis of amino acid conjugates truncated neuraminic acid as new inhibitors of the MAG

Neuraminsäurederivate mit aromatischen Substituenten an 2- und 9-Position zeigten bisher die besten Bindungseigenschaften an das MAG. Daher wurde dieser Ansatz mit SH-81 als Referenzsubstanz weiterverfolgt: Um weitere funktionelle Gruppen, die zu einer höheren Bindungsaffinität beitragen können, in das Molekül einzuführen, wurden Aminosäure-Neuraminsäure-Derivate entworfen und synthetisiert. Als Aminosäuren kamen ausschließlich aromatische Aminosäuren in Betracht, da die zweifache aromatische Substitution des Neu5Ac-Grundgerüstes beibehalten werden sollte. In 5 sind die entworfenen Aminosäure-Neu5Ac-Derivate dargestellt.Neuraminic acid derivatives with aromatic substituents at 2- and 9-position have so far shown the best binding properties to the MAG. Therefore, this approach was followed up with SH-81 as a reference substance: In order to introduce more functional groups that can contribute to higher binding affinity into the molecule, amino acid neuraminic acid derivatives were designed and synthesized. As amino acids only aromatic amino acids came into consideration, since the two-fold aromatic substitution of Neu5Ac backbone should be retained. In 5 the designed amino acid Neu5Ac derivatives are shown.

5: Die synthetisierten Aminosäure-trunkierte Neu5Ac-Konjugate. 5 : The synthesized amino acid truncated Neu5Ac conjugates.

Die 6, 7 und 8 zeigen den Syntheseweg der Aminosäure-trunkierte Neu5Ac-Derivate. Die Synthese erfolgte in acht Synthesestufen. Im ersten Schritt wurde die Carboxylgruppe der Neu5Ac als Methylester geschützt. Hier diente der saure Ionenaustauscher Dowex 50X8(H+) als Katalysator. Die freien Hydroxylgruppen wurden nach Standardmethode als Acetylgruppen geschützt. Die Hydroxylgruppe in 2-Position zeigt aufgrund des -I-Effektes der benachbarten Carboxylgruppe eine schwächere Reaktivität als die anderen Hydroxylgruppen. Daher entstand ein Produktgemisch aus Penta- und Hexaacetat. Für die weiteren Syntheseschritte spielte dies keine Rolle, so dass das Produktgemisch unaufgereinigt weiter eingesetzt werden konnte.The 6 . 7 and 8th show the synthetic route of the amino acid truncated Neu5Ac derivatives. The synthesis was carried out in eight synthesis steps. In the first step, the carboxyl group of the Neu5Ac was protected as a methyl ester. Here, the acidic ion exchanger Dowex 50X8 (H + ) served as a catalyst. The free hydroxyl groups were protected by standard method as acetyl groups. The hydroxyl group in the 2-position shows a weaker reactivity than the other hydroxyl groups due to the -I effect of the adjacent carboxyl group. Therefore, a product mixture of penta and hexaacetate was formed. For the further synthesis steps, this did not matter, so that the product mixture could be used untreated further.

6: Syntheseweg der Aminosäurekonjugate der trunkierten Neu5Ac ausgehend von Neu5Ac bis zur um eine Methylengruppe kürzeren Neu5Ac-Spezies nach der Periodatspaltung (Stufe 6). 6 : Synthesis pathway of the Neu5Ac truncated amino acid conjugates from Neu5Ac to the Neu5Ac species shorter by one methylene group after periodate cleavage (step 6).

Zur Aktivierung der 2-Position für die Substitution mit Benzylalkohol wurde diese Position chloriert. Hierfür wurde Acetylchlorid mit Methanol versetzt, wobei in situ HCl entstand. Diese reagierte dann in einer nucleophilen Substitution mit der acetylierten Neu5Ac zum β-Sialylchlorid. Aufgrund der thermodynamischen Kontrolle, der diese Reaktion unterliegt, entstand das β-Sialylchlorid in guter Ausbeute anomerenrein. In der nächsten Stufe wurde das β-Sialylchlorid mit Benzylalkohol und Silbercarbonat umgesetzt, wobei der Benzylalkohol an die 2-Position gekuppelt wurde. Anschließend wurden die Acetylschutzgruppen durch die Deacetylierung nach Zémplen abgespalten. Die Bindung zwischen der 8- und der 9-Position wurde mittels Periodatspaltung gespalten. Zur Minimierung der möglichen Nebenreaktion zur zweifachtrunkierten Neu5Ac wurde das Periodat in äquimolaren Mengen eingesetzt.to Activation of the 2-position for substitution with benzyl alcohol this position was chlorinated. This was acetyl chloride added with methanol, where in situ HCl was formed. This responded then in a nucleophilic substitution with the acetylated Neu5Ac to the β-sialyl chloride. Due to the thermodynamic control, which undergoes this reaction, the β-sialyl chloride was formed anomerically pure in good yield. In the next stage was the β-sialyl chloride with benzyl alcohol and silver carbonate reacted, with the benzyl alcohol was coupled to the 2-position. Subsequently, the acetyl protecting groups were replaced by the deacetylation split off after Zémplen. The bond between the 8- and the 9-position was cleaved by periodate cleavage. To minimize the possible side reaction to the doubly truncated Neu5Ac the periodate was used in equimolar amounts.

Die Aminosäure wurde in Form ihres Methylesters über eine reduktive Aminierung mit NaCNBH3 an die bei der Periodatspaltung entstandene Aldehydfunktion an Position 8 geknüpft. Im Anschluss wurden die Methylester an den beiden Carboxylfunktionen mit 0.1 N Natronlauge verseift. Die Produkte wurden mittels Biogel-P2-Säule und RP-HPLC mit Acetonitril/Wasser-Gradienten aufgereinigt (7).The amino acid was attached in the form of its methyl ester via a reductive amination with NaCNBH 3 to the aldehyde function formed at the periodate cleavage at position 8. Subsequently, the methyl esters were saponified at the two carboxyl functions with 0.1 N sodium hydroxide solution. The products were purified by Biogel P2 column and RP-HPLC with acetonitrile / water gradient ( 7 ).

7: Die reduktive Aminierung mit NaCNBH3 und anschließende Kupplung der Aminosäure an die um eine Methylengruppe verkürzte Neu5Ac führte zu den Liganden SV-8, SV-10 und SV-14. 7 : Reductive amination with NaCNBH3 followed by coupling of the amino acid to the Neu5Ac truncated by one methyl group led to ligands SV-8, SV-10, and SV-14.

Bei der Periodatspaltung entstand auch das um zwei Methylengruppen verkürzte N-Acetyl-neuraminsäurederivat (8). Die Nachbarschaft der Aldehydgruppe zur 7-Position der gewünschten Spezies erlaubt keine säulenchromatographische Aufreinigung mittels Kieselgel, da sonst die Gefahr einer Epimerisierung des asymmetrischen Zentrums an der 7-Position bestand. So entstanden bei der nachfolgenden Kupplung der Aminosäure zwei Spezies der Aminosäure-Neu5Ac-Derivate mit unterschiedlich langen Glycerolseitenketten. Die chemische Ähnlichkeit dieser beiden Spezies erschwerte ihre Trennung. Die gewünschte Spezies wurde nur in niedrigen Ausbeuten erhalten. Die als Nebenprodukte entstandenen Derivate der zweifachtrunkierten Neu5Ac wurden ebenfalls auf ihre Bindungsaktivität untersucht. Die Annahme, dass die Hydroxylgruppe an der 7-Position der 8er-Spezies die Bindungsaffinität erhöht, konnte mit Hilfe der SPR-Analyse bewiesen werden (siehe Kapitel 0).In periodate cleavage, the N-acetyl-neuraminic acid derivative shortened by two methylene groups ( 8th ). The proximity of the aldehyde group to the 7-position of the desired species does not allow purification by column chromatography on silica gel, otherwise there is a risk of epimerization of the asymmetric center at the 7-position. Thus, in the subsequent coupling of the amino acid, two species of the amino acid Neu5Ac derivatives with glycerol side chains of different lengths were formed. The chemical similarity of these two species made their separation difficult. The desired species was obtained only in low yields. The by-product derivatives of the doubly truncated Neu5Ac were also tested for binding activity. The assumption that the hydroxyl group at the 7-position of the 8-species increases the binding affinity was demonstrated by SPR analysis (see Chapter 0).

8: Die reduktive Aminierung mit NaCNBH3 und anschließende Kupplung der Aminosäure an die um zwei Methylengruppen verkürzte Neu5Ac führte zu den Liganden SV-16 und SV-18. 8th : Reductive amination with NaCNBH3 followed by coupling of the amino acid to Neu5Ac, which is truncated by two methylene groups, resulted in ligands SV-16 and SV-18.

Untersuchung der Bindungskonstanten der Aminosäure-konjugate der trunkierten Neuraminsäure mittels SPRInvestigation of the binding constants the amino acid conjugates of truncated neuraminic acid by means of SPR

Die Aminosäure-trunkierte Neu5Ac-Konjugate wurden mittels SPR auf ihre Bindungsaffinität an das MAG untersucht. 9 zeigt die erhaltenen Bindungskurven für die Aminosäurekonjugate der einfachtrunkierten Neu5Ac SV-8, SV-10 und SV-14. Der Fit unter Verwendung des one site binding-Modells ergab für den Phenylalaninliganden SV-8 einen KD-Wert von 14 ± 2 μM. Für den Tyrosinliganden SV-14 wurde eine Bindungskonstante von 11 ± 5 μM ermittelt. Der Tryptophanligand SV-10 dagegen zeigte eine Bindungskostante von 77 ± 7 μM. Die geringere Bindungsaffinität dieses Liganden könnte mit dem größeren Raumbedarf des Tryptophansubstituenten erklärt werden.The amino acid truncated Neu5Ac conjugates were screened for their binding affinity to the MAG by SPR. 9 shows the binding curves obtained for the amino acid conjugates of the single truncated Neu5Ac SV-8, SV-10 and SV-14. The fit using the one site binding model yielded a K D value of 14 ± 2 μM for the phenylalanine ligand SV-8. For the tyrosine ligand SV-14, a binding constant of 11 ± 5 μM was determined. The tryptophan ligand SV-10 showed a binding constant of 77 ± 7 μM. The lower binding affinity of this ligand could be explained by the larger space requirement of the tryptophan substituent.

Alle Aminosäurekonjugate der einfachtrunkierten Neu5Ac zeigten somit in der SPR-Analyse hohe Bindungsaffinitäten. Die zweite Carboxylgruppe, die durch den Aminosäuresubstituenten in das Molekül eingeführt wurde, trug vermutlich durch Salz- oder Wasserstoffbrückenbindung zu dieser hohen Bindungsaffinität bei. Allerdings wurde die positive Wirkung der zweiten Carboxylgruppe im Tryptophanliganden durch die Größe des aromatischen Restes anscheinend aufgehoben.All Amino acid conjugates of single truncated Neu5Ac showed thus high binding affinities in the SPR analysis. The second carboxyl group represented by the amino acid substituent was introduced into the molecule probably carried by salt or hydrogen bonding to this high Binding affinity. However, the positive effect was of the second carboxyl group in the tryptophan ligand by size the aromatic residue seems to have been abolished.

9: Die Bindungskurven der Aminosäurekonjugate der einfachtrunkierten Neu5Ac (8er-Spezies) und die KD-Werte der SPR-Analyse. Es wurden Konzentrationen von 1.52 μM bis 500 μM vermessen. Der Fit mit Hilfe des one site binding-Modells ergab für den Phenylalaninliganden SV-8 einen KD-Wert von 14 ± 2 μM, für den Tryptophanliganden einen KD-Wert von 77 ± 7 μM und für den Tyrosinliganden einen KD-Wert von 11 ± 5 μM. 9 : The binding curves of the amino acid conjugates of the single truncated Neu5Ac (8 species) and the KD values of the SPR analysis. Concentrations of 1.52 μM to 500 μM were measured. The fit using the one site binding model yielded a KD value of 14 ± 2 μM for the phenylalanine ligand SV-8, a KD value of 77 ± 7 μM for the tryptophan ligand, and a KD value of 11 ± for the tyrosine ligand 5 μM.

Im Rahmen der Synthese waren zudem die Histidin- und Tyrosinderivate der zweifachtrunkierten Neu5Ac erhalten worden. 10 zeigt einen Vergleich der Bindungskurven des Tyrosin-einfachtrunkierte Neu5Ac-Konjugates SV-14 und des Tyrosin-zweifachtrunkierte Neu5Ac-Konjugates SV-18.In the synthesis, the histidine and tyrosine derivatives of the doubly truncated Neu5Ac were also obtained. 10 Figure 4 shows a comparison of the binding curves of the tyrosine single-truncated Neu5Ac conjugate SV-14 and the tyrosine duplex Neu5Ac conjugate SV-18.

Während das entsprechende Tyrosin-einfachtrunkierte Neu5Ac-Derivat SV-14 mit einem KD-Wert von 11 ± 5 μM die höchste Bindungsaffinität von allen Derivaten zeigte, nahm diese beim Tyrosin-zweifachtrunkierte Neu5Ac-Derivat SV-18 um den Faktor 17 auf 185 ± 54 μM ab. Das Fehlen der Hydroxylgruppe an der 7-Position und die verkürzte Molekülstruktur bewirken eine starke Abnahme der Bindungsaffinität an MAG.While the corresponding tyrosine single-truncated Neu5Ac derivative SV-14 with a K D value of 11 ± 5 μM showed the highest binding affinity of all derivatives, this increased by a factor 17 to 185 ± in the tyrosine duplex Neu5Ac derivative SV-18 54 μM off. The lack of the hydroxyl group at the 7-position and the shortened molecular structure cause a strong decrease of the binding affinity to MAG.

Für den Histidinliganden SV-16, der ebenfalls das um zwei Methylengruppe verkürzte Neu5Ac-Grundgerüst besitzt, konnte in der SPR-Analyse keine Bindung an das MAG gezeigt werden. Der Grund hierfür könnte in den unterschiedlichen Ladungen des Histidins im Gegensatz zu den anderen Liganden liegen. Histidin liegt bei dem pH-Wert des Laufpuffers protoniert vor und ist somit positiv geladen. Tyrosin dagegen besitzt einen Aromaten mit Elektronenüberschuss. Dies scheint die Wechselwirkung mit MAG zu erleichtern, während Histidin sich mit seiner positiven Ladung als ungeeignet erweist.For the histidine ligand SV-16, which also contains two methylene groups has truncated Neu5Ac backbone, could in SPR analysis shows no binding to MAG. The reason this could be in the different charges of histidine in contrast to the other ligands. Histidine is located protonated at the pH of the running buffer and is therefore positive loaded. Tyrosine, on the other hand, has an excess of aromatics. This seems to facilitate the interaction with MAG while histidine turns out to be unsuitable with its positive charge.

10: Vergleich der SPR-Ergebnisse der 8er-Spezies und der 7er-Spezies der Aminosäure-Neu5Ac-Derivate anhand der Tyrosin-Neu5Ac-Derivate SV-14 und SV-18. Es wurden Konzentrationen von 1.52 μM bis 500 μM vermessen. Der Fit nach dem one site binding-Modell ergab einen KD-Wert von 11 ± 5 μM für das Tyrosinkonjugat der einfachtrunkierten Neu5Ac und einen KD-Wert von 185 ± 54 μM für das Tyrosinkonjugat der zweifachtrunkierten Neu5Ac. 10 : Comparison of the SPR results of the 8 species and the 7 species of the amino acid Neu5Ac derivatives with the tyrosine Neu5Ac derivatives SV-14 and SV-18. Concentrations of 1.52 μM to 500 μM were measured. Fit on the one site binding model yielded a KD value of 11 ± 5 μM for the tyrosine conjugate of the single truncated Neu5Ac and a KD value of 185 ± 54 μM for the tyrosine conjugate of the doubly truncated Neu5Ac.

Die für die Aminosäure-trunkierte Neu5Ac-Derivate erhaltenen Sensorgramme wurden hinsichtlich der Kinetik der Bindung dieser Substanzen an das MAG analysiert. Die SPR-Analyse des Phenylalaninderivates SV-8 zeigte als einzige negative Bindungskurven (11). Zur kinetischen Auswertung dieser Sensorgramme mussten die Werte daher gespiegelt werden und kon und koff einzeln berechnet werden.The sensorgrams obtained for the amino acid truncated Neu5Ac derivatives were analyzed for the kinetics of binding of these substances to the MAG. The SPR analysis of the phenylalanine derivative SV-8 was the only negative binding curve ( 11 ). For the kinetic evaluation of these sensorgrams the values had to be mirrored and k on and k off individually calculated.

11: Die Sensorgramme der SPR-Analyse des Phenylalaninderivates SV-8. SV-8 zeigte als einziges Derivat negative Sensorgramme in der SPR-Analyse. 11 : The sensorgrams of the SPR analysis of the phenylalanine derivative SV-8. SV-8 was the only derivative to show negative sensorgrams in the SPR analysis.

In 12, 13 und 14 sind die Sensorgramme der SPR-Analysen der anderen drei analysierten Aminosäure-trunkierte Neu5Ac-Derivate mit den darüber gelegten Fitkurven zu sehen. Die dazugehörigen Werte für kon und koff sind in Tabelle aufgeführt. Während für die Auswertung hinsichtlich der Bindungskinetik bei Ligand SV-10 die vier hohen Konzentrationen verwendet wurden, wurde bei den Verbindungen SV-14 und SV-18 jeweils nur eine Konzentration ausgewertet.In 12 . 13 and 14 For example, the sensorgrams of the SPR analyzes of the other three analyzed amino acid truncated Neu5Ac derivatives with the fit curves superimposed on them can be seen. The corresponding values for k on and k off are listed in the table. While the four high concentrations were used to evaluate the binding kinetics of ligand SV-10, only one concentration was evaluated for compounds SV-14 and SV-18.

12: Die Sensorgramme der SPR-Analyse des Tryptophanderivates SV-10 mit Fit nach dem 1:1-Binding-Modell. Es wurden die erhaltenen Sensorgramme für die Konzentrationen 25 μM, 100 μM, 250 μM und 500 μM gefittet. 12 : The sensorgrams of the SPR analysis of the Tryptophile SV-10 with Fit according to the 1: 1 binding model. The resulting sensorgrams for the concentrations 25 μM, 100 μM, 250 μM and 500 μM were fitted.

13: Das Sensorgramm des Tyrosinkonjugates der einfachtrunkierten Neu5Ac SV-14 bei einer Konzentration von 1.52 μM mit Fit nach dem 1:1-Binding-Modell. 13 : The sensorgram of the tyrosine conjugate of the single truncated Neu5Ac SV-14 at a concentration of 1.52 μM with Fit according to the 1: 1 binding model.

14: Das Sensorgramm des Tyrosinkonjugates der zweifachtrunkierten Neu5Ac SV-18 bei einer Konzentration von 10 μM mit Fit nach dem 1:1-Binding-Modell. 14 : The titer of the tyrosine conjugate of the doubly truncated Neu5Ac SV-18 at a concentration of 10 μM with Fit according to the 1: 1 binding model.

Die mittels Kinetikanalyse ermittelten KD-Werte der Aminosäure-trunkierte Neu5Ac-Derivate stimmen in guter Näherung mit den KD-Werten aus der Affinitätsanalyse mittels SPR überein. Nur bei dem Tyrosinkonjugat der zweifachtrunkierten Neu5Ac SV-18 ist die Bindungskonstante laut Kinetikanalyse niedriger und somit besser als die durch die Affinitätsanalyse bestimmte Bindungskonstante. Zur Bestimmung der Assoziations- und der Dissoziationsrate des Phenylalaninliganden SV-8 wurde der KD-Wert aus den Affinitätsanalysen verwendet. Somit war eine Berechnung des KD-Wertes zum Vergleich nicht möglich. Tabelle 1: Die Ergebnisse der Kinetikanalyse der Bindung der Aminosäure-Neu5Ac-Derivate erhalten mittels SPR. Ligand kon [M–1 s–1] koff [s–1] KD[μM] Kinetikanalyse KD[μM] Affinitätsanalyse Chi2 Kinetikanalyse SV-8 2.5·102 0.4·10–3 - 14 ± 2 - SV-10 5.9·102 6.4·10–3 100 77 ± 7 0.68 SV-14 2.0·104 2.4·10–3 1 11 ± 5 0.16 SV-18 5.7·103 4.2·10–3 7 185 ± 54 0.52 The K D values of the amino acid truncated Neu5Ac derivatives determined by kinetic analysis are in good agreement with the K D values from the affinity analysis by SPR. Only in the case of the tyrosine conjugate of the doubly truncated Neu5Ac SV-18 is the binding constant lower, and thus better than the binding constant determined by the affinity analysis, according to kinetics analysis. The K D value from the affinity analyzes was used to determine the association and dissociation rate of the phenylalanine ligand SV-8. Thus, a calculation of the K D value was not possible for comparison. Table 1: The results of the kinetic analysis of the binding of amino acid Neu5Ac derivatives obtained by SPR. ligand k on [M -1 s -1 ] k off [s -1 ] K D [μM] kinetic analysis K D [μM] affinity analysis Chi 2 kinetic analysis SV-8 2.5 · 10 2 0.4 · 10 -3 - 14 ± 2 - SV-10 5.9 · 10 2 6.4 · 10 -3 100 77 ± 7 0.68 SV-14 2.0 · 10 4 2.4 · 10 -3 1 11 ± 5 12:16 SV-18 5.7 · 10 3 4.2 · 10 -3 7 185 ± 54 12:52

Die mittels zwei verschiedener Auswertungsverfahren ermittelten Dissoziationskonstanten zeigten ähnliche Tendenzen in den Bindungsaffinitäten der Liganden zum MAG. Die höchste Affinität zeigte in beiden Verfahren das Tyrosin-Konjugat der einfachtrunkierten Neu5Ac, das gleichzeitig auch die schnellste Assoziationsrate aufwies. Im direkten Vergleich zeigte das Tyrosin-Konjugat der zweifachtrunkierten Neu5Ac eine wesentlich schwächere Bindungsaffinität zum MAG. Dies ist vermutlich mit einer ungünstigeren Position der Verbindung in der Bindungstasche des Proteins aufgrund der verkürzten Molekülstruktur sowie dem Fehlen der Hydroxylgruppe an der 7-Position zu begründen.The dissociation constants determined by two different evaluation methods showed similar tendencies in binding affinities the ligands to the MAG. The highest affinity showed in both methods the tyrosine conjugate of the single truncated Neu5Ac, which also had the fastest association rate. In direct comparison, the tyrosine conjugate showed the doubly truncated Neu5Ac a much weaker binding affinity to MAG. This is probably a less favorable position the compound in the binding pocket of the protein due to the shortened Molecular structure and the absence of the hydroxyl group to justify the 7-position.

Diese Ergebnisse führten zu der Schlussfolgerung, dass die Aminosäure-Konjugate der einfachtrunkierten Neu5Ac die optimalen Eigenschaften als Bindungspartner für MAG aufwiesen.These Results led to the conclusion that the amino acid conjugates the singly truncated Neu5Ac the optimal properties as a binding partner for MAG.

Untersuchung der Bindungskonstanten der Aminosäurekonjugate der trunkierten Neuraminsäure mittels STD NMR-SpektroskopieInvestigation of the binding constants the amino acid conjugates of truncated neuraminic acid by STD NMR spectroscopy

Um eine genauere Analyse der Bindungsspezifitäten der Aminosäurekonjugate der trunkierten Neu5Ac zu erhalten, wurden diese mittels STD NMR-Spektroskopie untersucht. Für alle Verbindungen der einfachtrunkierten Neu5Ac wurden STD-Titrationen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Titrationen sind in 15 gezeigt. Der Phenylalanin-Ligand SV-8 zeigte in der STD-Titration eine Bindungskonstante von 8 ± 3 μM. Diese zeigt eine gute Übereinstimmung mit der Bindungskonstante von 14 ± 2 μM, die die SPR-Analyse für diese Verbindung ergab. Für das Tryptophan-Derivat SV-10 wurde hier ein KD-Wert von 15 ± 6 μM erhalten. Dieser liegt deutlich unter dem KD-Wert von 77 μM, den diese Verbindung in der SPR-Analyse gezeigt hat. Allerdings ist auch hier die Tendenz zur geringeren Bindungsaffinität im Vergleich zu den Phenylalanin- und Tyrosin-Liganden zu erkennen. Der Tyrosin-Ligand SV-14 zeigte auch in diesem Analyseverfahren die höchste Bindungaffinität mit einem KD-Wert von 4 ± 5 μM. Die Bindungskonstanten der SPR-Analyse werden durch die Ergebnisse der STD-Titrationen gestützt. Hier wurden die gleichen Abhängigkeiten der Bindungsaffinität gefunden.To obtain a more detailed analysis of the binding specificities of the amino acid conjugates of truncated Neu5Ac, these were analyzed by STD NMR spectroscopy. For all compounds of the singly truncated Neu5Ac, STD titrations were performed. The results of these titrations are in 15 shown. The phenylalanine ligand SV-8 showed a binding constant of 8 ± 3 μM in the STD titration. This shows good agreement with the binding constant of 14 ± 2 μM, which gave the SPR analysis for this compound. For the tryptophan derivative SV-10, a K D value of 15 ± 6 μM was obtained here. This is well below the K D value of 77 μM, which this compound has shown in the SPR analysis. However, the tendency to lower binding affinity compared to the phenylalanine and tyrosine ligands can be seen here as well. The tyrosine ligand SV-14 also showed the highest binding affinity in this analysis method with a K D value of 4 ± 5 μM. The binding constants of SPR analysis are supported by the results of STD titrations. Here, the same dependencies of binding affinity were found.

15: Auftragung der STD-Amplifikationsfaktoren gegen die Konzentrationen in μM: Ergebnisse der KD-Titrationen mittels STD NMR für die Aminosäurekonjugate der einfachtrunkierten Neu5Ac. Der Fit mit Hilfe des one site binding-Modells ergab für den Phenylalaninliganden SV-8 einen KD-Wert von 8 ± 3 μM, für den Tryptophanliganden SV-10 einen KD-Wert von 15 ± 6 μM und für den Tyrosinliganden SV-14 einen KD-Wert von 4 ± 5 μM. [SV-8: (c(FcMAGd1-3) = 13.9 μM, c(SV-8) = 13.9 bis 166.8 μM, 700 MHz, T = 285 K, shaped pulse sp1 = 45 dB, Sättigungsdauer = 2.04 s, Einstrahlfrequenz an resonance-Spektrum = –0.5 ppm)]. [SV-10: (c(FcMAGd1-3) = 11.1 μM, c(SV-10) = 11.2 bis 166.8 μM, 700 MHz, T = 285 K, shaped pulse sp1 = 45 dB, Sättigungsdauer = 2.04 s, Einstrahlfrequenz an resonance-Spektrum = –0.5 ppm)]. [SV-14: (c(FcMAGd1-3) 11.1 μM, c(SV-14) = 11.1 bis 166.8 μM, 700 MHz, T = 285 K, shaped pulse sp1 = 45 dB, Sättigungsdauer = 2.04 s, Einstrahlfrequenz an resonance-Spektrum = –1.0 ppm)]. 15 : Plot of STD amplification factors versus concentrations in μM: Results of KD titrations by STD NMR for the amino acid conjugates of the single truncated Neu5Ac. The fit using the one site binding model yielded a KD value of 8 ± 3 μM for the phenylalanine ligand SV-8, a KD value of 15 ± 6 μM for the tryptophan ligand SV-10 and a KD value for the tyrosine ligand SV-14 KD value of 4 ± 5 μM. [SV-8: (c (FcMAGd1-3) = 13.9 μM, c (SV-8) = 13.9 to 166.8 μM, 700 MHz, T = 285 K, shaped pulse sp1 = 45 dB, saturation time = 2.04 s, irradiation frequency resonance spectrum = -0.5 ppm)]. [SV-10: (c (FcMAGd1-3) = 11.1 μM, c (SV-10) = 11.2 to 166.8 μM, 700 MHz, T = 285 K, shaped pulse sp1 = 45 dB, saturation duration = 2.04 s, irradiation frequency resonance spectrum = -0.5 ppm)]. [SV-14: (c (FcMAGd1-3) 11.1 μM, c (SV-14) = 11.1 to 166.8 μM, 700 MHz, T = 285 K, shaped pulse sp1 = 45 dB, saturation duration = 2.04 s, irradiation frequency an Spectrum = -1.0 ppm)].

Zum Vergleich mit dem Differenzspektrum, das für die Referenzsubstanz SH-81 erhalten wurde, ist in 16 das entsprechende Differenzspektrum der Phenylalanin- Verbindung SV-8 beispielhaft gezeigt. Auch hier sind die Differenzsignale der aromatischen Protonen deutlich zu erkennen. Außerdem zeigt auch bei dieser Verbindung die N-Acetylgruppe der Neu5Ac einen hohen STD-Effekt und somit einen hohen Beitrag zur Bindung an das MAG.For comparison with the difference spectrum obtained for the reference substance SH-81, see 16 the corresponding difference spectrum of the phenylalanine compound SV-8 is shown by way of example. Again, the difference signals of the aromatic protons can be clearly seen. In addition, the N-acetyl group of the Neu5Ac also shows a high STD effect in this compound and thus a high contribution to the binding to the MAG.

16: Das off resonance-Spektrum und das Differenzspektrum des Liganden SV-8 (das off resonance-Spektrum ist um den Faktor 100 verkleinert dargestellt). Im Differenzspektrum sind die Signale der bindenden Protonen des Liganden zu erkennen. Besonders starke STD-Effekte zeigen die aromatischen Protonen. (c(FcMAGd1-3) = 13.9 μM, c(SV-8) = 166.8 μM, 700 MHz, T = 285 K, shaped pulse sp1 = 45 dB, Sättigungsdauer = 2.04 s, Einstrahlfrequenz an resonance-Spektrum = –0.5 ppm). 16 : The off-resonance spectrum and the difference spectrum of ligand SV-8 (the off-resonance spectrum is reduced by a factor of 100). In the difference spectrum, the signals of the binding protons of the ligand can be recognized. Particularly strong STD effects show the aromatic protons. (c (FcMAGd1-3) = 13.9 μM, c (SV-8) = 166.8 μM, 700 MHz, T = 285 K, shaped pulse sp1 = 45 dB, saturation time = 2.04 s, irradiation frequency an-spectrum = -0.5 ppm ).

Vergleich der ermittelten Dissoziationskonstanten Kp sowie der Assoziationskonstanten und Dissoziationskonstanten für die Aminosäure-trunkierteComparison of the determined Dissociation constants Kp and the association constants and Dissociation constants for the amino acid truncated

Neu5Ac-DerivateNeu5Ac derivatives

Die höchste Bindungsaffinität zum MAG zeigte das Tyrosin-Konjugat der einfachtrunkierten Neu5Ac SV-14 mit einem KD = 11 ± 5 μM in der SPR-Affinitätsanalyse bzw. einem KD = 1 μM (Chi2 = 0.16) in der SPR-Kinetikanalyse sowie einem KD = 4 ± 5 μM in der STD NMR Analyse. Das Phenylalanin-Konjugat der einfachtrunkierten Neu5Ac SV-8 zeigte mit einem KD = 14 ± 2 μM in der SPR-Affinitätsanalyse und einem KD = 8 ± 3 μM in der STD NMR Analyse eine nur geringfügig schwächere Bindungsaffinität zum MAG. Eine Bestimmung der Dissoziationskonstante mittels SPR-Kinetikanalyse war für SV-8 nicht möglich, da dieser Ligand als einziger negative Sensorgramme in der SPR-Analyse zeigte (11). Das Tryptophan-Konjugat der einfachtrunkierten Neu5Ac SV-10 zeigte dagegen weniger gute Bindungsaffinitäten zum MAG als die anderen beiden Konjugate. In der SPR-Affinitätsanalyse wurde ein KD = 77 ± 7 μM erhalten und mittels SPR-Kinetikanalyse ein KD = 100 μM (Chi2 = 0.68). Die STD NMR Analyse zeigte einem KD = 15 ± 6 μM, der zwar niedriger liegt als die mittels SPR bestimten Dissoziationskonstanten, aber immer noch um der Faktor 3.8 bzw. 2 schlechter ist als die mittels STD NMR bestimmten Dissoziationskonstanten für die anderen Konjugate.The highest binding affinity to MAG was found in the tyrosine conjugate of the single truncated Neu5Ac SV-14 with a K D = 11 ± 5 μM in the SPR affinity analysis and a K D = 1 μM (Chi 2 = 0.16) in SPR kinetics analysis, respectively a K D = 4 ± 5 μM in the STD NMR analysis. The phenylalanine conjugate of the single truncated Neu5Ac SV-8 showed only a slightly weaker binding affinity for MAG with a K D = 14 ± 2 μM in the SPR affinity analysis and a K D = 8 ± 3 μM in the STD NMR analysis. A determination of the dissociation constant by means of SPR kinetic analysis was not possible for SV-8, since this ligand was the only negative sensorgram in the SPR analysis ( 11 ). In contrast, the tryptophan conjugate of the single truncated Neu5Ac SV-10 showed less good binding affinities for MAG than the other two conjugates. A K D = 77 ± 7 μM was obtained in the SPR affinity analysis and a K D = 100 μM (Chi 2 = 0.68) by SPR kinetic analysis. The STD NMR analysis showed a K D = 15 ± 6 μM, which is lower than the SPR-determined dissociation constants, but is still worse by a factor of 3.8 or 2 than the dissociation constants determined by STD NMR for the other conjugates.

Das Tyrosin-Konjugat der zweifachtrunkierten Neu5Ac SV-18 zeigte in der SPR-Affinitätsanalyse einen KD = 185 ± 54 μM sowie in der SPR-Kinetikanalyse einen KD = 7 μM (Chi2 = 0.52). Aufgrund der schwächeren Bindungsaffinität ist keine STD NMR Analyse durchgeführt worden. Der Vergleich mit der Dissoziationskonstante des Tyrosin-Konjugats der einfachtrunkierten Neu5Ac zeigte eine um den Faktor 17 bzw. 7 schwächere Bindungsaffinität zu MAG. Die zweifache Verkürzung der Neu5Ac führt vermutlich durch das Fehlen der Hydroxylgruppe an der 7-Position und durch eine ungünstigere Lage in der Bindungstasche zu einer geringeren Bindungsaffinität zum MAG. Unter Einbezug der unterschiedlichen Bedingungen dieser zwei Analysemethoden stimmen die für die einzelnen Liganden erhaltenen KD-Werte in guter Näherung überein. Die SPR-Kinetikanalyse zeigt für alle vier Liganden ähnliche Dissoziationsraten koff. Die Konjugate SV-14 und SV-8 mit der höheren Bindungsaffinität zeigten eine etwas schnellere Dissoziationsrate mit koff = 2.4·10–3 s–1 für SV-14 und koff = 0.4·10–3 s–1 für SV-8 im Vergleich zu den Konjugaten SV-10 und SV-18 mit koff = 6.4·10–3 s–1 für SV-10 und koff = 4.2·10–3 s–1 für SV-18 (Tabelle 1). Die schnellste Assoziationsrate zeigte das Tyrosin-Konjugat der einfachtrunkierten Neu5Ac SV-14 mit einer kon = 2.0·104 M–1 s–1, welches auch die höchste Bindungsaffinität zum MAG zeigte. Das Tyrosin-Konjugat der zweifachtrunkierten Neu5Ac SV-18 zeigte mit kon = 5.7·10–3 M–1 s–1 ebenfalls eine schnellere Assoziation als die Konjugate der anderen Aminosäuren. Das Phenylalanin-Konjugat SV-8 und das Tryptophan-Konjugat SV-10 zeigten mit kon = 2.5·102 M–1 s–1 für SV-8 und kon = 5.9·102 M–1 s–1 für SV-10 langsamere Assoziationen.The tyrosine conjugate of the doubly truncated Neu5Ac SV-18 showed a K D = 185 ± 54 μM in the SPR affinity analysis and a K D = 7 μM (Chi 2 = 0.52) in the SPR kinetic analysis. Due to the weaker binding affinity no STD NMR analysis has been performed. The comparison with the dissociation constant of the tyrosine conjugate of the single truncated Neu5Ac showed a factor of 17 or 7 weaker binding affinity to MAG. The twofold shortening of the Neu5Ac presumably leads to a lower binding affinity for the MAG due to the absence of the hydroxyl group at the 7-position and a less favorable position in the binding pocket. Taking into account the different conditions of these two analytical methods, the K D values obtained for the individual ligands are in good agreement. The SPR kinetic analysis shows similar dissociation rates k off for all four ligands. The conjugates SV-14 and SV-8 with the higher binding affinity showed a slightly faster dissociation rate with k off = 2.4 · 10 -3 s -1 for SV-14 and k off = 0.4 · 10 -3 s -1 for SV-8 compared to the conjugates SV-10 and SV-18 with k off = 6.4 · 10 -3 s -1 for SV-10 and k off = 4.2 · 10 -3 s -1 for SV-18 (Table 1). The fastest association rate was shown by the tyrosine conjugate of the single truncated Neu5Ac SV-14 with a k on = 2.0 · 10 4 M -1 s -1 , which also showed the highest binding affinity to MAG. The tyrosine conjugate of the doubly truncated Neu5Ac SV-18 with k on = 5.7 · 10 -3 M -1 s -1 also showed a faster association than the conjugates of the other amino acids. The phenylalanine conjugate SV-8 and the tryptophan conjugate SV-10 showed with k on = 2.5 · 10 2 M -1 s -1 for SV-8 and k on = 5.9 · 10 2 M -1 s -1 for SV -10 slower associations.

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Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

  • - DeBellard et al. [0006] - DeBellard et al. [0006]
  • - Strenge et al. [0008] - Strenge et al. [0008]
  • - Kelm et al. [0015] Kelm et al. [0015]

Claims (8)

Inhibitoren des Myelin Assoziiertes Glycoprotein (MAG) bestehend aus Konjugaten von Aminosäuren mit trunkierten NeuraminsäurenInhibitors of Myelin Associated Glycoprotein (MAG) consisting of conjugates of amino acids with truncated neuraminic Inhibitoren des Myelin Assoziiertes Glycoprotein (MAG) bestehend aus Konjugaten von Peptiden mit trunkierten NeuraminsäurenInhibitors of Myelin Associated Glycoprotein (MAG) consisting of conjugates of peptides with truncated neuraminic acids Inhibitoren, in denen die Aminosäuren einen hydrophoben Rest besitzen.Inhibitors in which the amino acids one have hydrophobic radical. Ein Prozess zur Herstellung der Konjugate aus Aminosäuren und trunkierten NeuraminsäurenA process for the preparation of the conjugates of amino acids and truncated neuraminic acids Der Einsatz der unter Anspruch 1, 2 und 3 beschriebenen Substanzen zur Behandlung von Verletzungen des zentralen Nervensystems mit dem Ziel, das Wiederzusammenwachsen der Nerven zu ermöglichen.The use of the described in claim 1, 2 and 3 Substances used to treat central nervous system injuries with the aim to enable the reunification of the nerves. Der Einsatz der unter Anspruch 1, 2 und 3 beschriebenen Substanzen zur Behandlung von Verletzungen des zentralen Nervensystems mit dem Ziel, die Folgen der Verletzung zu lindern.The use of the described in claim 1, 2 and 3 Substances used to treat central nervous system injuries with the aim of alleviating the consequences of the injury. Der Einsatz der unter Anspruch 1, 2 und 3 beschriebenen Substanzen mit dem Ziel, das Neuritenwachstum zu stimulieren.The use of the described in claim 1, 2 and 3 Substances designed to stimulate neurite outgrowth. Entwicklung eines Oberflächenplasmonenresonanzsystems zur Bestimmung der Bindung an Myelin Assoziiertes Glycoprotein (MAG)Development of a surface plasmon resonance system for Determining Binding to Myelin Associated Glycoprotein (MAG)
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