DE102007045099A1

DE102007045099A1 - Determining the activity of an analyte in a sample comprises treating an analyte-binder complex with ultrasound before or during activity determination

Info

Publication number: DE102007045099A1
Application number: DE200710045099
Authority: DE
Inventors: Frank Dr. Vitzthum
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Priority date: 2007-09-20
Filing date: 2007-09-20
Publication date: 2008-10-30

Abstract

Determining the activity of an analyte in a sample by incubating the sample with an analyte binder immobilized on a solid phase, washing off unbound components and determining the activity of the analyte comprises treating the analyte-binder complex with ultrasound before or during activity determination. An independent claim is also included for extracting an analyte from a sample by incubating the sample with an analyte binder immobilized on a solid phase, washing off unbound components and eluting the analyte from the solid phase, comprising treating the analyte-binder complex with ultrasound before or during elution.

Description

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Analytik bzw. der in vitro-Diagnostik und betrifft ein Verfahren zur Extraktion eines Analyten aus einer Probe, wobei die Probe mit Ultraschall behandelt wird. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, wobei der Testansatz mit Ultraschall behandelt wird.The Invention is in the field of analysis or in vitro diagnostics and relates to a method for extracting an analyte from a Sample, wherein the sample is treated with ultrasound. Especially the invention relates to a method for determining an analyte, wherein the test batch is treated with ultrasound.

In Verfahren zur Reinigung oder Isolierung von Substanzen (Analyten) aus einem Substanzgemisch (Probe) sowie in Verfahren zur quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines Analyten in einer Probe ist es häufig notwendig, den Analyten zunächst anzureichern und von anderen Probenbestandteilen weitestgehend abzutrennen. Fraktionierungs- bzw. Trennverfahren, bei denen eine Substanz durch Wechselwirkung mit einem Bindungspartner, wie z. B. mit einem chromatographischen Material oder mit spezifischen Antikörpern, angereichert wird, sind hinreichend bekannt. Der Bindungspartner kann hierbei mit einem Trägermaterial, einer Festphase, assoziiert sein, beispielweise mit Partikeln, wie magnetischen Kügelchen, oder mit Oberflächen, wie der Innenseite von Mikrotitrationsplatten oder anderen Reaktionsgefäßen.In Process for the purification or isolation of substances (analytes) from a substance mixture (sample) as well as in quantitative or qualitative determination of an analyte in a sample is common necessary to enrich the analyte first and others Separate sample components as far as possible. fractioning or separation processes in which a substance by interaction with a binding partner, such. B. with a chromatographic material or enriched with specific antibodies well known. The binding partner can in this case with a Carrier material, a solid phase, be associated, for example with particles, such as magnetic beads, or with surfaces, like the inside of microtitration plates or other reaction vessels.

In Verfahren zur quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines Analyten wird im Anschluss an den Anreicherungsschritt üblicherweise eine Nachweisreaktion zur quantitativen oder qualitativen Bestimmung des angereicherten Analyten durchgeführt. Häufig wird die Nachweisreaktion durchgeführt, ohne dass der Analyt zuvor von dem Bindungspartner abgelöst wird. Gelegentlich, im Falle bestimmter Analyten oder bei Verwendung bestimmter Bindungspartner, besteht jedoch das Problem, dass der an den Bindungspartner gebundene Analyt nicht mehr ausreichend nachzuweisen ist. Erst nach Ablösung des Analyten von dem Bindungspartner ist eine Bestimmung des Analyten möglich. Gewöhnlicherweise wird der Analyt eluiert, indem die Wechselwirkung zwischen Analyt und Bindungspartner z. B. durch eine Änderung des pH-Werts oder der ionischen Stärke oder durch Zugabe von Lösungsmitteln, wie z. B. von chaotropen Reagenzien geschwächt wird. Doch auch die Elution kann nachteilige Folgen für die Nachweisbarkeit eines Analyten haben. Die Wechselwirkung zwischen Analyt und Bindungspartner kann beispielsweise so stabil sein, dass eine ausreichende Ablösung des Analyten nur unter extremen Elutionsbedingungen erfolgt. Extreme Elutionsbedingungen, wie z. B. ein pH-Wert des Lösungsmittels nahe des isoelektrischen Punktes eines zu eluierenden Proteins, können z. B. die unerwünschte Denaturierung, Aktivierung oder Inaktivierung des Analyten zur Folge haben.In Method for the quantitative or qualitative determination of an analyte becomes common following the enrichment step a detection reaction for quantitative or qualitative determination of the enriched analyte. Often the detection reaction is performed without the analyte previously detached from the binding partner. Occasionally, in the case of certain analytes or when using certain binding partners, However, there is the problem that the bound to the binding partner Analyte is no longer sufficient evidence. Only after replacement of the analyte from the binding partner is a determination of the analyte possible. Usually, the analyte is eluted, by the interaction between analyte and binding partner z. B. by a change in the pH or the ionic Starch or by adding solvents, such as z. B. is weakened by chaotropic reagents. But also The elution can have adverse consequences for traceability have an analyte. The interaction between analyte and binding partner For example, it can be so stable that there is sufficient detachment of the analyte only under extreme elution conditions. extreme Elution conditions, such. B. a pH of the solvent near the isoelectric point of a protein to be eluted, can z. As the unwanted denaturation, activation or inactivation of the analyte.

Der vorliegenden Erfindung lag demnach die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereit zu stellen, das es ermöglicht, einen Analyten, der über die Wechselwirkung mit einem Bindungspartner an eine Festphase gebunden ist, von der Festphase abzulösen. Der Erfindung lag weiterhin die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereit zu stellen, das es ermöglicht, die Nachweisbarkeit eines Analyten zu verbessern, welcher zur Anreicherung an einen Festphasen-assoziierten Bindungspartner gebunden wird. Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass der Komplex aus Bindungspartner und Analyt mit Ultraschall behandelt wird.Of the The present invention was therefore based on the object, a method to provide an analyte that is capable of over bound the interaction with a binding partner to a solid phase is to replace the solid phase. The invention was still the task is to provide a method that allows the Detectability of an analyte to improve, which for enrichment is bound to a solid phase-associated binding partner. The object is achieved in that the complex of binding partner and analyte is sonicated.

Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines Analyten in einer Probe, wobei

a) die Probe mit einem mit einer Festphase assoziierten Bindungspartner mit Affinität für den Analyten inkubiert wird, und
b) nicht gebundene Bestandteile der Probe durch Waschen der Festphase entfernt werden, und anschließend
c) die Aktivität des Analyten bestimmt wird,

und wobei vor oder während der Aktivitätsbestimmung des Analyten in Schritt c) der mit der Festphase assoziierte Komplex aus Festphase-assoziiertem Bindungspartner und Analyt mit Ultraschall behandelt wird.A first aspect of the invention relates to a method for determining the activity of an analyte in a sample, wherein

a) the sample is incubated with a binding partner associated with a solid phase with affinity for the analyte, and
b) unbound constituents of the sample are removed by washing the solid phase, and subsequently
c) the activity of the analyte is determined,

and wherein, before or during the activity determination of the analyte in step c), the solid phase-associated complex of solid-phase-associated binding partner and analyte is treated with ultrasound.

Unter dem Begriff „Aktivität eines Analyten" ist im Sinne dieses ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung jegliche strukturelle oder funktionelle Eigenschaft eines Analyten zu verstehen, die geeignet ist, den quantitativen oder qualitativen Nachweis des Analyten zu ermöglichen. Ein Beispiel für eine strukturelle Eigenschaft eines Analyten ist z. B. seine Affinität für bestimmte Bindungspartner. Ein Beispiel für eine funktionelle Eigenschaft eines Analyten ist beispielweise die katalytische Aktivität eines Enzyms.Under the term "activity of an analyte" is in the Meaning of this first aspect of the present invention any to understand the structural or functional property of an analyte, which is suitable, the quantitative or qualitative detection of the analyte to enable. An example of a structural Property of an analyte is z. B. his affinity for certain binding partners. An example of a functional Property of an analyte is, for example, the catalytic activity an enzyme.

Erfindungsgemäß wird der Testansatz mit dem darin befindlichen Komplex aus Festphase-assoziiertem Bindungspartner und Analyt mit Ultraschall behandelt. Als Ultraschall werden Schallwellen mit Frequenzen über 15 kHz, insbesondere zwischen 15 kHz und 10 MHz bezeichnet. Da die Hörbarkeitsgrenze des Menschen etwa bei 20 kHz liegt, werden vorzugsweise Frequenzen verwendet, die darüber liegen. Die Erzeugung dieser Frequenzen kann auf mechanischem Wege erfolgen oder mit Hilfe von elektroakustischen Wandlern, Transducern, die magnetostriktive oder piezoelektrische Effekte ausnutzen. Bei magnetostriktiven Effekten erfahren ferromagnetische Materialien in einem elektromagnetischen Feld bei Resonanz eine Längenänderung. Dies wird bei piezoelektrischen Materialien durch das direkte Anlegen einer Spannung erzielt. Neben Ultraschall-Immersionshörnern, Sonotroden, sind beispielsweise Ultraschallbäder gebräuchliche Geräte, um Ultraschall zu erzeugen oder in ein Gefäß einzutragen. Entscheidend für die Wirkung des Ultraschalls ist die Schallleistung. Diese wird durch die elektrische Leistung und den Wirkungsgrad bestimmt. Der Wirkungsgrad ergibt sich aus dem Quotienten der eingebrachten elektrischen Leistung und der erzeugten Ultraschallleistung, wobei der Wirkungsgrad von weiteren Faktoren, beispielsweise der Geometrie des Ultraschallresonators, des Ultraschallbades und des Reaktionsgefäßes sowie deren Positionierung relativ zueinander, abhängig sein kann. Die Beschallungsdauer, um in einem bestimmten Reaktionsansatz eine bestimmte Wirkung des Ultraschalls zu erzielen, ist sehr stark von der Schallleistung abhängig. Beispielsweise kann bei einem Reaktionsansatz zur Desintegration von Mikroorganismen in einem Ultraschallbad mit niedriger Schallleistung das Erreichen eines festgelegten Ausmaßes der Desintegration, beispielsweise 50% Desintegration, Stunden dauern, wohingegen die entsprechende Desintegration in einem Becherresonator mit hoher Schallleistung und Fokussierung des Ultraschalles exakt auf den Reaktionsraum im Reaktionsgefäß in Minuten oder gar Sekunden erfolgen kann. Die optimale bzw. maximale Beschallungsdauer sowie weitere Parameter, wie beispielsweise die Behandlungstemperatur, der Druck, die Ultraschallfrequenz, Verwendung einer kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Beschallung, die Art, Zusammensetzung und Volumina des zu verwendenden Mediums, das den Ultraschall überträgt und/oder das im Reaktionsgefäß verwendet wird, Oberflächeneigenschaften, beispielsweise die Rauhigkeit im Innern des Reaktionsgefäßes sowie weitere Eigenschaften des Reaktionsgefäßes, beispielsweise die Geometrie, dessen Material oder Wandstärke, etc. sind daher im Allgemeinen für den jeweiligen Reaktionsansatz und die zu erreichenden Ziele empirisch zu ermitteln. Für das erfindungsgemäße Verfahren bedeutet dies, dass die Verfahrensparameter Beschallungsdauer und Schallleistung in Abhängigkeit von einem gewählten Reaktionsaufbau (u. a. bestehend aus Reaktionsgefäß, Ultraschallfrequenz, Geometrie der Ultraschallquelle) empirisch ermittelt werden müssen. Um die Verfahrensparameter festzulegen, ist es gegebenenfalls hilfreich auf multiparametrische, statistische Verfahren wie „Taguchi", vollfaktorielle Verfahren für die Planung und Auswertung entsprechender Experimente zurückzugreifen. Da die Schallleistung und die Beschallungsdauer wichtige Parameter sind, kann es beispielsweise sinnvoll sein, zunächst bei maximaler Schallleistung verschiedene Beschallungsdauern im Bereich von Sekunden, Minuten und Stunden zu untersuchen, d. h. beispielsweise 5, 10 und 30 Sekunden, sowie 1, 5, 10, 20, 30 und 50 Minuten, sowie 1, 2 und 5 Stunden. Diese Untersuchungen sind im Vergleich zu entsprechenden Kontrollen, beispielsweise einer Kontrolle ohne Beschallung, Kontrollen mit und ohne Bindungspartner sowie Analyt oder Kontrollen mit definierter Analytmenge durchzuführen.According to the invention, the test batch is treated with the complex of solid-phase-associated binding partner and analyte therein with ultrasound. As ultrasonic sound waves are called frequencies above 15 kHz, in particular between 15 kHz and 10 MHz. Since the human audibility limit is around 20 kHz, it is preferable to use frequencies above it. These frequencies can be generated mechanically or by using electroacoustic transducers that utilize magnetostrictive or piezoelectric effects. In magnetostrictive effects ferromagnetic materials undergo a change in length in an electromagnetic field at resonance. This is achieved with piezoelectric materials by the direct application of a voltage. In addition to ultrasonic immersion horns, sonotrodes, for example, ultrasonic baths are common devices, to generate ultrasound or enter it into a vessel. Decisive for the effect of the ultrasound is the sound power. This is determined by the electrical power and the efficiency. The efficiency results from the quotient of the introduced electrical power and the ultrasonic power generated, wherein the efficiency of other factors, such as the geometry of the ultrasonic resonator, the ultrasonic bath and the reaction vessel and their positioning relative to each other, may be dependent. The sonication time in order to achieve a specific effect of the ultrasound in a particular reaction batch depends very much on the sound power. For example, in a reaction approach for disintegrating microorganisms in a low acoustic power ultrasonic bath, achieving a fixed degree of disintegration, for example 50% disintegration, may take hours, whereas the corresponding disintegration in a high sonic capacity bucket resonator and focusing the ultrasound exactly on the reaction space in the Reaction vessel can be done in minutes or even seconds. The optimum or maximum sonication time and other parameters, such as the treatment temperature, the pressure, the ultrasonic frequency, use of continuous or discontinuous sonication, the type, composition and volumes of the medium to be used, which transmits the ultrasound and / or used in the reaction vessel is surface properties, such as the roughness inside the reaction vessel and other properties of the reaction vessel, such as geometry, its material or wall thickness, etc. are therefore generally to determine empirically for each reaction and the objectives to be achieved. For the method according to the invention, this means that the process parameters sonication time and sound power as a function of a selected reaction structure (including consisting of reaction vessel, ultrasonic frequency, geometry of the ultrasound source) must be determined empirically. In order to determine the process parameters, it may be helpful to use multiparametric statistical methods such as "Taguchi", full factorial methods for the planning and evaluation of appropriate experiments.Since the sound power and the duration of sound are important parameters, it may be useful, for example, at maximum sound power To investigate different sonication durations in the range of seconds, minutes and hours, eg 5, 10 and 30 seconds, as well as 1, 5, 10, 20, 30 and 50 minutes, as well as 1, 2 and 5 hours appropriate controls, such as a control without sonication, to perform controls with and without binding partner as well as analyte or controls with a defined amount of analyte.

Bevorzugterweise wird der Testansatz, der den Komplex aus Bindungspartner und Analyt enthält, mit Ultraschall einer Frequenz von mindestens 15 kHz bis 10 MHz behandelt, besonders bevorzugt mit Ultraschall einer Frequenz von 20 bis 40 kHz.preferably, becomes the test batch containing the complex of binding partner and analyte contains, with ultrasound a frequency of at least 15 kHz to 10 MHz, particularly preferably with ultrasound Frequency from 20 to 40 kHz.

Der Ultraschall kann über eine Sonotrode direkt in das Reaktionsgefäß, das ein Medium enthält, das den an die Festphase assoziierten Komplex aus Festphaseassoziiertem Bindungspartner und Analyt umgibt, eingebracht werden. Alternativ kann der Ultraschall auch von außen auf das Reaktionsgefäß aufgebracht werden, so dass der Ultraschall auf den an die Festphase assoziierten Komplex aus Festphase-assoziiertem Bindungspartner und Analyt übertragen wird. Dazu kann das Reaktionsgefäß, das den an die Festphase assoziierten Komplex aus Festphase-assoziiertem Bindungspartner und Analyt enthält, beispielsweise in ein Medium, wie z. B. Wasser, eine wässrige Lösung oder ein Gel, überführt werden, und der Ultraschall in das das Reaktionsgefäß umgebende, Medium eingebracht werden. Dies ist beispielsweise bei der Verwendung eines Ultraschallbades der Fall. Das Reaktionsgefäß, wie z. B. eine Mikrotiterplatte, ein Reagenzglas, etc. wird im Ultraschallbad möglichst so positioniert, dass die Auswirkungen des Ultraschalls auf das Verfahren optimal sind. Eine Mikrotiterplatte kann beispielsweise so im Ultraschallbad positioniert werden, dass die Platte auf der Oberfläche des Mediums flottiert. Ein Reagenzglas wird bevorzugterweise lösungsmitteldicht verschlossen und kann beispielsweise mittels einer Stativhalterung an einer bestimmten Stelle im Ultraschallbad positioniert werden.Of the Ultrasound can be transmitted via a sonotrode directly into the reaction vessel, containing a medium associated with the solid phase Complex of solid phase-associated binding partner and analyte surrounds, be introduced. Alternatively, the ultrasound can also be from the outside be applied to the reaction vessel, so that the ultrasound on the complex associated to the solid phase transferred from solid-phase-associated binding partner and analyte becomes. For this purpose, the reaction vessel, the to the Solid phase associated complex of solid phase-associated binding partner and analyte, for example, in a medium such. As water, an aqueous solution or a gel transferred and the ultrasound in the surrounding the reaction vessel, Medium are introduced. This is for example when using an ultrasonic bath the case. The reaction vessel, such as As a microtiter plate, a test tube, etc. is in the ultrasonic bath ideally positioned so that the effects of ultrasound are optimal on the process. For example, a microtiter plate So be positioned in the ultrasonic bath that the plate is on the surface of the medium floats. A test tube is preferably solvent-tight closed and can for example by means of a tripod mount be positioned at a certain point in the ultrasonic bath.

Erfindungsgemäß kann die Aktivität des Analyten während oder nach der Ultraschallbehandlung bestimmt werden. In einer Ausführungsform wird nach dem Waschen der Festphase der an die Festphase assoziierte Komplex aus Festphase-assoziiertem Bindungspartner und Analyt mit mindestens einem Reagenz inkubiert, das eine Aktivitätsbestimmung des Analyten erlaubt, und während der Aktivitätsbestimmung erfolgt die Ultraschallbehandlung. In einer anderen Ausführungsform wird nach dem Waschen der Festphase der an die Festphase assoziierte Komplex aus Festphase-assoziiertem Bindungspartner und Analyt mit Ultraschall behandelt, und der Analyt-haltige Überstand wird anschließend von der Festphase abgetrennt. Die Aktivitätsbestimmung des Analyten erfolgt dann in dem abgetrennten Überstand.According to the invention the activity of the analyte during or after the Ultrasonic treatment can be determined. In one embodiment after washing the solid phase associated with the solid phase Complex of solid-phase-associated binding partner and analyte with incubated at least one reagent, which is an activity determination of the analyte, and during activity determination the ultrasound treatment takes place. In another embodiment is after washing the solid phase associated with the solid phase Complex of solid-phase-associated binding partner and analyte with Sonicated, and the analyte-containing supernatant is then separated from the solid phase. The activity determination of the analyte then takes place in the separated supernatant.

Unter einem Reagenz, das eine Aktivitätsbestimmung des Analyten erlaubt, ist jegliche Zubereitung zu verstehen, die es ermöglicht ein messbares, quantifizierbares Signal zu erzeugen, dass mit der Aktivität des Analyten korreliert. Beispiele für derartige Zubereitungen sind beispielweise Lösungen chromogener, fluorogener oder andersartig markierter Peptidsubstrate, die von dem Analyten umgesetzt werden, oder auch gelabelte, z. B. Peroxidase-gekoppelte, Antikörper, die den Analyten spezifisch binden und dann anhand des Labels bzw. anhand eines Substrats für das Label quantifiziert werden können. Bevorzugterweise ist die Zubereitung so beschaffen, dass sie eine Ablösung des Analyten von dem Bindungspartner begünstigt, z. B. durch einen geeigneten pH-Wert, eine spezifische Ionenstärke oder dadurch dass sie chaotrope Agenzien, ein Detergenz oder ein organisches Lösungsmittel enthält.A reagent that allows analyte activity to be determined means any preparation that produces a measurable, quantifiable signal that correlates with the activity of the analyte. Examples of such preparations are, for example, solutions of chromogenic, fluorogenic or otherwise labeled Peptide substrates that are reacted by the analyte, or even labeled, z. As peroxidase-coupled, antibodies that bind the analyte specifically and can then be quantified using the label or on the basis of a substrate for the label. Preferably, the preparation is such that it promotes detachment of the analyte from the binding partner, e.g. By a suitable pH, ionic strength or by containing chaotropic agents, a detergent or an organic solvent.

Der Bindungspartner mit Affinität für den Analyten, der zur Anreicherung des Analyten aus der Probe verwendet wird, ist mit einer Festphase assoziiert. Der Begriff „assoziiert" ist breit zu verstehen und umfasst beispielsweise eine kovalente und eine nicht-kovalente Bindung, eine direkte und eine indirekte Bindung, die Adsorption an eine Oberfläche und den Einschluss in eine Vertiefung. Bei einer kovalenten Bindung ist der Bindungspartner über eine chemische Bindung an die Festphase gebunden. Ein Beispiel für eine nicht-kovalente Bindung ist die Oberflächenadsorption. Neben einer direkten Bindung an die Festphase kann der Bindungspartner auch indirekt über spezifische Wechselwirkung mit anderen spezifischen Bindungspartnern an die Festphase gebunden sein, z. B. über spezifische Wechselwirkung mit einem Antikörper.Of the Binding partner with affinity for the analyte, used to enrich the analyte from the sample, is associated with a solid phase. The term "associated" is broad and includes, for example, a covalent and a non-covalent bond, a direct and an indirect Bonding, adsorption to a surface and inclusion into a depression. In a covalent bond of the binding partner is about bound a chemical bond to the solid phase. An example for a non-covalent bond is surface adsorption. In addition to a direct bond to the solid phase, the binding partner can also indirectly via specific interaction with other specifics Bonding partners to be bound to the solid phase, z. B. over specific interaction with an antibody.

Der Begriff „Festphase" im Sinne dieses ersten Aspekts der Erfindung beinhaltet einen Gegenstand, der aus porösem und/oder nicht porösem, wasserunlöslichem Material besteht und die unterschiedlichsten Formen aufweisen kann, wie z. B. Gefäß, Röhrchen, Mikrotitrationsplatte (ELISA-Platte), Kugel, Mikropartikel, Stäbchen, Streifen, Filter- oder Chromatographiepapier, etc. In der Regel ist die Oberfläche der Festphase hydrophil oder kann hydrophil gemacht werden. Die Festphase kann aus den unterschiedlichsten Materialien bestehen wie z. B. aus anorganischen und/oder aus organischen Materialien, aus synthetischen, aus natürlich vorkommenden und/oder aus modifizierten natürlich vorkommenden Materialien. Beispiele für Festphasenmaterialien sind Polymere wie z. B. Cellulose, Nitrocellulose, Zelluloseacetat, Polyvinylchlorid, Polyacrylamid, vernetzte Dextranmoleküle, Agarose, Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polymethacrylat oder Nylon; Latex; Keramik; Glas; Metalle, insbesondere Edelmetalle wie Gold und Silber; Magnetit; Mischungen oder Kombinationen derselben.Of the Term "solid phase" in the sense of this first aspect of the Invention includes an article made of porous and / or non-porous, water-insoluble material exists and may have a variety of forms, such. B. vessel, tube, microtiter plate (ELISA plate), sphere, microparticles, sticks, strips, Filter or chromatography paper, etc. As a rule, the surface is the solid phase is hydrophilic or can be rendered hydrophilic. The Solid phase can consist of a wide variety of materials such as As inorganic and / or organic materials, made of synthetic, naturally occurring and / or from modified naturally occurring materials. Examples for solid phase materials, polymers such as e.g. Cellulose, Nitrocellulose, cellulose acetate, polyvinyl chloride, polyacrylamide, crosslinked dextran molecules, agarose, polystyrene, polyethylene, Polypropylene, polymethacrylate or nylon; Latex; ceramics; Glass; Metals, in particular precious metals such as gold and silver; magnetite; Mixtures or combinations thereof.

Die Festphase kann einen Überzug aus einer oder mehreren Schichten aufweisen, z. B. aus Proteinen, Kohlenhydraten, lipophilen Substanzen, Biopolymeren, organischen Polymeren oder Mischungen hiervon, um beispielsweise die unspezifische Bindung von Probenbestandteilen an die Festphase zu unterdrücken oder zu verhindern, oder um beispielsweise Verbesserungen zu erreichen hinsichtlich der Suspensionsstabilität von partikulären Festphasen, der Lagerstabilität, der formgebenden Stabilität oder der Resistenz gegen UV-Licht, Mikroben oder sonstige zerstörend wirkender Agenzien.The Solid phase can be a coating of one or more layers have, for. From proteins, carbohydrates, lipophilic substances, Biopolymers, organic polymers or mixtures thereof For example, the non-specific binding of sample components to suppress or prevent the solid phase, or for example, to achieve improvements in suspension stability of particulate solid phases, storage stability, the shaping stability or the resistance to UV light, Microbes or other destructive agents.

Bevorzugte Bindungspartner mit Affinität für den Analyten, insbesondere wenn es sich bei dem Analyten um ein Peptid oder Protein handelt, sind monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Fragmente derartiger Antikörper. Weitere Beispiele für geeignete Bindungspartner mit Affinität für jeweils eine bestimmte Gruppe von Analyten sind Protein A (mit Affinität für Antikörper), Benzamidin (mit Affinität für Serinproteasen), Calmodulin (mit Affinität für Kinasen), Heparin (mit Affinität für Lipoproteine).preferred Binding partner with affinity for the analyte, in particular when the analyte is a peptide or protein are monoclonal or polyclonal antibodies or Fragments of such antibodies. Further examples of suitable binding partner with affinity for each a specific group of analytes are protein A (with affinity for antibodies), benzamidine (with affinity for serine proteases), calmodulin (with affinity for kinases), heparin (with affinity for Lipoproteins).

Unter einer „Probe" ist im Sinne dieses ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung das Material zu verstehen, das den nachzuweisenden Analyten vermutlich enthält, und umfasst beispielsweise biologische Flüssigkeiten oder Gewebe insbesondere von Menschen und Tieren wie Blut, Plasma, Serum, Sputum, Exudat, bronchoalveoläre Lavage, Lymphflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Vaginalschleim, Feces, Urin, Liquor, Haare, Haut, Gewebeproben oder -schnitte. Ferner werden umfasst Zellkulturproben, pflanzliche Flüssigkeiten oder Gewebe, forensische Proben, Wasser- und Abwasserproben, Nahrungsmittel, Arzneimittel. Gegebenenfalls müssen die Proben vorbehandelt werden, um den Analyten für das Nachweisverfahren zugänglich zu machen oder um störende Probenbestandteile zu entfernen. Solche Vorbehandlung von Proben mag die Abtrennung und/oder Lyse von Zellen beinhalten, das Präzipitieren, die Hydrolyse oder die Denaturierung von Probenbestandteilen wie z. B. Proteinen, die Zentrifugation von Proben, das Behandeln der Probe mit organischen Lösungsmitteln wie z. B. Alkohole, insbesondere Methanol; das Behandeln der Probe mit Detergenzien. Häufig wird die Probe in ein anderes, meistens wässriges, Medium überführt welches mit dem Nachweisverfahren möglichst nicht interferieren soll.Under a "sample" is within the meaning of this first aspect of the present invention Invention to understand the material that presumably the analyte to be detected contains, and includes, for example, biological fluids or tissue, in particular of humans and animals such as blood, plasma, Serum, sputum, exudate, bronchoalveolar lavage, lymphatic fluid, Synovial fluid, seminal fluid, vaginal mucus, Feces, urine, cerebrospinal fluid, hair, skin, tissue samples or sections. Further will include cell culture samples, vegetable fluids or tissue, forensic samples, water and wastewater samples, food, Drug. If necessary, the samples must be pretreated be accessible to the analyte for the detection method or to remove interfering sample components. Such pretreatment of samples may be separation and / or lysis of cells, precipitation, hydrolysis or the denaturation of sample components such. B. Proteins that Centrifugation of samples, treating the sample with organic Solvents such. For example, alcohols, especially methanol; treating the sample with detergents. Often the Sample transferred to another, usually aqueous, medium which as far as possible do not interfere with the detection method should.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Aktivität eines Analyten betrifft die Bestimmung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease (FSAP) ( EP 1 182 258 A1 ).A preferred embodiment of the method according to the invention for determining the activity of an analyte relates to the determination of the blood coagulation factor VII-activating protease (FSAP) (US Pat. EP 1 182 258 A1 ).

Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion eines Analyten aus einer Probe, wobei

i) die Probe mit einem mit einer Festphase assoziierten Bindungspartner mit Affinität für den Analyten inkubiert wird, und
ii) nicht gebundene Bestandteile der Probe durch Waschen der Festphase entfernt werden, und anschließend
iii) der Analyt von der Festphase abgewaschen wird,

und wobei vor oder während des Abwaschens des Analyten in Schritt iii) der an die Festphase assoziierte Komplex aus Festphase-assoziiertem Bindungspartner und Analyt mit Ultraschall behandelt wird.A second aspect of the invention relates to a method for extracting an analyte from a sample, wherein

i) the sample is incubated with a binding partner associated with a solid phase with affinity for the analyte, and
ii) unbound constituents of the sample are removed by washing the solid phase, and subsequently
iii) the analyte is washed off the solid phase,

and wherein before or during the washing off of the analyte in step iii) the solid phase-associated complex of solid-phase-associated binding partner and analyte is treated with ultrasound.

Erfindungsgemäß wird der Komplex aus Festphase-assoziiertem Bindungspartner und Analyt mit Ultraschall einer Frequenz von mindestens 15 kHz bis 10 MHz behandelt, besonders bevorzugt mit Ultraschall einer Frequenz von 20 bis 40 kHz.According to the invention the complex of solid phase-associated binding partner and analyte with Treated ultrasound at a frequency of at least 15 kHz to 10 MHz, particularly preferably with ultrasound of a frequency of 20 to 40 kHz.

Die Erzeugung dieser Frequenzen kann wie bereits oben beschrieben erfolgen. Neben Ultraschall-Immersionshörnern, Sonotroden, sind beispielsweise Ultraschallbäder gebräuchliche Geräte, um Ultraschall zu erzeugen oder in ein Gefäß einzutragen. Die optimale bzw. maximale Beschallungsdauer sowie weitere Parameter, wie beispielsweise die Behandlungstemperatur, der Druck, die Ultraschallfrequenz, Verwendung einer kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Beschallung, die Art, Zusammensetzung und Volumina des zu verwendenden Mediums, das den Ultraschall überträgt und/oder das im Reaktionsgefäß verwendet wird, sowie der Aspekt ob Lösungsmittel im Durchfluss eingesetzt wird, Oberflächeneigenschaften, beispielsweise die Rauhigkeit im Innern des Reaktionsgefäßes sowie weitere Eigenschaften des Reaktionsgefäßes, beispielsweise die Geometrie, dessen Material oder Wandstärke, etc. sind im Allgemeinen für den jeweiligen Reaktionsansatz und die zu erreichenden Ziele empirisch zu ermitteln. Für das erfindungsgemäße Verfahren bedeutet dies, dass die Verfahrensparameter Beschallungsdauer und Schallleistung in Abhängigkeit von einem gewählten Reaktionsaufbau (u. a. bestehend aus Reaktionsgefäß, Ultraschallfrequenz, Geometrie der Ultraschallquelle) empirisch ermittelt werden müssen. Um die Verfahrensparameter festzulegen, kann die bereits oben beschriebene Vorgehensweise angewandt werden.The Generation of these frequencies can be done as already described above. In addition to ultrasonic immersion horns, sonotrodes, for example Ultrasonic baths common equipment to To generate ultrasound or to enter it in a vessel. The optimal or maximum sonication time as well as further parameters, such as the treatment temperature, the pressure, the ultrasonic frequency, Use of a continuous or discontinuous sound, the type, composition and volumes of the medium to be used, which transmits the ultrasound and / or in the Reaction vessel is used, as well as the aspect whether solvent is used in the flow, surface properties, for example, the roughness in the interior of the reaction vessel as well as other properties of the reaction vessel, for example the geometry whose material or wall thickness, etc. are in general for the respective reaction mixture and the to be achieved empirically. For the inventive method this means that the process parameters sonication duration and Sound power depending on a selected Reaction structure (inter alia consisting of reaction vessel, Ultrasonic frequency, geometry of the ultrasound source) empirically determined Need to become. To set the process parameters, the procedure described above can be used.

Der Ultraschall kann über eine Sonotrode direkt in das Reaktionsgefäß, das ein Medium enthält, das den an die Festphase assoziierten Komplex aus Festphaseassoziiertem Bindungspartner und Analyt umgibt, eingebracht werden. Alternativ kann der Ultraschall auch von außen auf das Reaktionsgefäß aufgebracht werden, so dass der Ultraschall auf den an die Festphase assoziierten Komplex aus Festphase-assoziiertem Bindungspartner und Analyt übertragen wird. Dazu kann das Reaktionsgefäß, das den an die Festphase assoziierten Komplex aus Festphase-assoziiertem Bindungspartner und Analyt enthält, beispielsweise in ein Medium, wie z. B. Wasser, eine wässrige Lösung oder ein Gel, überführt werden, und der Ultraschall in das das Reaktionsgefäß umgebende, Medium eingebracht werden. Dies ist beispielsweise bei der Verwendung eines Ultraschallbades der Fall. Das Reaktionsgefäß, wie z. B. eine Mikrotiterplatte, ein Reagenzglas, eine Chromatographiesäule, etc. wird im Ultraschallbad möglichst so positioniert, dass die Auswirkungen des Ultraschalls auf das Verfahren optimal sind. Eine Mikrotiterplatte kann beispielsweise so im Ultraschallbad positioniert werden, dass die Platte auf der Oberfläche des Mediums flottiert. Ein Reagenzglas wird bevorzugterweise lösungsmitteldicht verschlossen und kann beispielsweise mittels einer Stativhalterung an einer bestimmten Stelle im Ultraschallbad positioniert werden. Eine vergleichsweise große chromatographische Säule kann beispielsweise waagerecht mittels einer Stativhalterung in das Ultraschallbad gelegt werden. Eine vergleichsweise kleine chromatographische Säule kann mittels einer Stativhalterung senkrecht im Ultraschallbad positioniert werden.Of the Ultrasound can be transmitted via a sonotrode directly into the reaction vessel, containing a medium associated with the solid phase Complex of solid phase-associated binding partner and analyte surrounds, be introduced. Alternatively, the ultrasound can also be from the outside be applied to the reaction vessel, so that the ultrasound on the complex associated to the solid phase transferred from solid-phase-associated binding partner and analyte becomes. For this purpose, the reaction vessel, the to the Solid phase associated complex of solid phase-associated binding partner and analyte, for example, in a medium such. As water, an aqueous solution or a gel transferred and the ultrasound in the surrounding the reaction vessel, Medium are introduced. This is for example when using an ultrasonic bath the case. The reaction vessel, such as A microtiter plate, a test tube, a chromatography column, etc. is positioned as possible in the ultrasonic bath that the effects of ultrasound on the procedure are optimal are. For example, a microtiter plate can be used in an ultrasonic bath be positioned that the plate on the surface of the medium floats. A test tube is preferably solvent-tight closed and can for example by means of a tripod mount be positioned at a certain point in the ultrasonic bath. A comparatively large chromatographic column can For example, horizontally by means of a tripod mount in the ultrasonic bath be placed. A comparatively small chromatographic column can positioned vertically in the ultrasonic bath by means of a tripod mount become.

Erfindungsgemäß kann das Abwaschen, die Elution, des Analyten von der Festphase während oder nach der Ultraschallbehandlung durchgeführt werden. In einer Ausführungsform wird nach dem Abwaschen nicht-gebundener Probenbestandteile von der Festphase der an die Festphase assoziierte Komplex aus Festphase-assoziiertem Bindungspartner und Analyt mit einem Medium inkubiert, das eine Elution des Analyten erlaubt, und während der Elution erfolgt die Ultraschallbehandlung. In einer anderen Ausführungsform wird nach dem Abwaschen nicht-gebundener Probenbestandteile von der Festphase der an die Festphase assoziierte Komplex aus Festphase-assoziiertem Bindungspartner und Analyt mit Ultraschall behandelt, und die Elution des Analyten wird anschließend durchgeführt.According to the invention the washing, the elution, the analyte from the solid phase during or be carried out after the ultrasound treatment. In a Embodiment becomes unbound after washing Sample components from the solid phase of the complex associated with the solid phase from solid-phase-associated binding partner and analyte with a Medium incubated, which allows elution of the analyte, and during the elution is followed by ultrasound treatment. In another Embodiment becomes unbound after washing Sample components from the solid phase of the solid phase associated Complex of solid-phase-associated binding partner and analyte with Ultrasound is treated, and the elution of the analyte is subsequently carried out.

Der Begriff „Festphase" im Sinne dieses zweiten Aspekts der Erfindung beinhaltet einen Gegenstand, der aus porösem und/oder nicht porösem, wasserunlöslichem Material besteht und die unterschiedlichsten Formen aufweisen kann, wie z. B. Gefäß, Röhrchen, Mikrotitrationsplatte (ELISA-Platte), Kugel, Mikropartikel, Stäbchen, Streifen, Filter- oder Chromatographiepapier, etc. In der Regel ist die Oberfläche der Festphase hydrophil oder kann hydrophil gemacht werden. Die Festphase kann aus den unterschiedlichsten Materialien bestehen wie z. B. aus anorganischen und/oder aus organischen Materialien, aus synthetischen, aus natürlich vorkommenden und/oder aus modifizierten natürlich vorkommenden Materialien. Beispiele für Festphasenmaterialien sind Harze, Polymere wie z. B. Cellulose, Nitrocellulose, Zelluloseacetat, Silica, Polyacrylamid, vernetzte Dextranmoleküle, Agarose (Sepharose^TM).The term "solid phase" in the sense of this second aspect of the invention includes an article which consists of porous and / or non-porous, water-insoluble material and which can have a great variety of shapes, such as vessel, tube, microtitration plate (ELISA plate). . Sphere, microparticles, rods, strips, filter or chromatography paper, etc. Typically, the surface of the solid phase is hydrophilic or can be rendered hydrophilic. The solid phase may consist of a variety of materials such. As inorganic and / or organic materials, synthetic, naturally occurring and / or modified naturally occurring materials. Examples of solid phase materials are resins, polymers such as. Cellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, silica, polyacrylamide, crosslinked dextran molecules, agarose (Sepharose ^™ ).

Unter einer „Probe" ist im Sinne dieses zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung das Material zu verstehen, das den zu extrahierenden Analyten enthält, und umfasst beispielsweise biologische Flüssigkeiten oder Gewebe insbesondere von Menschen und Tieren wie Blut, Plasma, Serum, Sputum, Exudat, bronchoalveoläre Lavage, Lymphflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Vaginalschleim, Feces, Urin, Liquor, Haare, Haut oder Gewebeproben. Ferner werden umfasst Zellkulturproben, pflanzliche Flüssigkeiten oder Gewebe, forensische Proben, Wasser- und Abwasserproben, Nahrungsmittel, Arzneimittel. Gegebenenfalls müssen die Proben vorbehandelt werden, um den Analyten für das Extraktionsverfahren zugänglich zu machen oder um störende Probenbestandteile zu entfernen. Solche Vorbehandlung von Proben mag die Abtrennung und/oder Lyse von Zellen beinhalten, das Präzipitieren, die Hydrolyse oder die Denaturierung von Probenbestandteilen wie z. B. Proteinen, die Zentrifugation von Proben, das Behandeln der Probe mit organischen Lösungsmitteln wie z. B. Alkohole, insbesondere Methanol; das Behandeln der Probe mit Detergenzien. Häufig wird die Probe in ein anderes, meistens wässriges, Medium überführt welches mit dem Extraktionsverfahren möglichst nicht interferieren soll.Under a "sample" is within the meaning of this second aspect of the present invention Invention to understand the material containing the analyte to be extracted, and includes, for example, biological fluids or Tissues, in particular of humans and animals such as blood, plasma, serum, Sputum, exudate, bronchoalveolar lavage, lymphatic fluid, Synovial fluid, seminal fluid, vaginal mucus, feces, Urine, cerebrospinal fluid, hair, skin or tissue samples. Further included Cell culture samples, plant fluids or tissues, forensic samples, water and sewage samples, food, medicines. If necessary, the samples must be pretreated to accessible to the analyte for the extraction process or to remove interfering sample components. Such pretreatment of samples may be separation and / or lysis of cells, precipitation, hydrolysis or the denaturation of sample components such. Proteins, centrifugation of samples, treating the sample with organic Solvents such. For example, alcohols, especially methanol; treating the sample with detergents. Often the Sample transferred to another, usually aqueous, medium which should not interfere with the extraction process if possible.

Figurenbeschreibungfigure description

1 Enzymaktivität der FSAP in Abhängigkeit von der Beschallungsdauer. Die mittlere Volumenaktivität einer Plasmaprobe (nach Dreifachbestimmung) steigt signifikant je länger der Testansatz beschallt wird (gefüllte Rechtecke). Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Die Volumenaktivität eines Testansatzes, der nicht mit Ultraschall behandelt wurde, d. h. eine Beschallungsdauer von 0 Sekunden wurde der Übersichtlichkeit halber gleich Null gesetzt. Um auszuschließen, dass durch den Ultraschall artifizielle unspezifische Aktivitäten hervorgerufen werden, wurde die Volumenaktivität von Waschpuffer als Probe (ohne FSAP) bestimmt (gefüllte Kreise). Bei diesen Negativkontrolle wurde mit zunehmender Beschallungsdauer keine Steigerung der Volumenaktivität erzielt. 1 Enzyme activity of FSAP as a function of the duration of sonication. The mean volume activity of a plasma sample (after triple determination) increases significantly the longer the test batch is sonicated (filled rectangles). The error bars indicate the standard deviation. The volume activity of a test batch which was not sonicated, ie a sonication time of 0 seconds has been set to zero for clarity. In order to exclude that artificial non-specific activities are induced by the ultrasound, the volume activity of wash buffer was determined as a sample (without FSAP) (filled circles). In this negative control, no increase in volume activity was achieved with increasing sonication time.

Das im Folgenden beschriebene Beispiel dient der exemplarischen Beleuchtung einzelner Aspekte der Erfindung und ist nicht als Einschränkung zu verstehen:The The example described below serves as an example of illumination individual aspects of the invention and is not intended to be limiting understand:

BeispieleExamples

Beispiel 1: Bestimmung der Prourokinase-aktivierenden Aktivität der den Blutgerinnungsfaktor VII-aktivierenden Protease (FSAP)Example 1 Determination of prourokinase-activating Activity of the blood coagulation factor VII-activating Protease (FSAP)

Mikrotiterplatten (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland) wurden mit einem monoklonalen anti-FSAP-Antikörper beschichtet. In jedes Näpfchen wurden 100 μL FSAP-haltiges Citrat-Plasma gegeben, und es wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Citrat-Plasma abgenommen, und die Näpfchen wurden dreimal mit jeweils 100 μL Puffer 1 (20-fach Konzentrat: 70 mM di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat, 23,6 mM Kaliumhydrogenphosphat, 1,6 mM Natriumchlorid, 1,9% Tween^® 20, 10 mM Phenol) gewaschen. Anschließend wurde jedes Näpfchen mit 100 μL Puffer 2 (42 mM NaCl, 38,4 mM Trizma^®, 0,004 mM Tween^® 20) befüllt, und die Ansätze wurden 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Mikrotiterplatte mit einer selbstklebenden Folie abgedeckt und in ein Ultraschallwasserbad (Sonicator 3000, Misonix, Inc., Farmingdale, NY, USA) überführt, so dass die Mikrotiterplatte auf der Wasseroberfläche flottierte. Es erfolgte dann entweder keine Beschallung (0 Sekunden) oder eine kontinuierliche Beschallung für 120, 240 bzw. 600 Sekunden mit Ultraschall einer Frequenz von 20 kHz und mit einer Leistung von 200 Watt.Microtiter plates (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany) were coated with an anti-FSAP monoclonal antibody. Into each well, 100 μL of FSAP-containing citrate plasma was added and incubated at 37 ° C for 30 minutes. After incubation, the citrated plasma was removed and the wells were washed three times with 100 μL each of Buffer 1 (20-fold concentrate: 70 mM di-sodium hydrogen phosphate dihydrate, 23.6 mM potassium hydrogen phosphate, 1.6 mM sodium chloride, 1.9 % Tween ^® 20, washed 10 mM phenol). Subsequently, each well was charged with 100 .mu.l of buffer 2 (42 mM NaCl, 38.4 mM Trizma ^®, 0.004 mM Tween ^® 20) filled, and the mixtures were incubated at 37 ° C for 30 minutes. Subsequently, the microtiter plate was covered with a self-adhesive foil and transferred to an ultrasonic water bath (Sonicator 3000, Misonix, Inc., Farmingdale, NY, USA) so that the microtiter plate floated on the water surface. There was then either no sound (0 seconds) or a continuous sound for 120, 240 or 600 seconds with ultrasound of a frequency of 20 kHz and with a power of 200 watts.

Es wurden folgende Kontrollexperimente durchgeführt:

1. Um auszuschließen, dass durch den Ultraschall artifizielle unspezifische Aktivitäten hervorgerufen werden, wurde anstelle von FSAP-haltigem Citrat-Plasma FSAP-freier Waschpuffer als Probe verwendet.
2. Zum Vergleich mit einem Verfahren aus dem Stand der Technik, bei welchem Zitronensäure zur Ablösung eines Analyten von einem Bindungspartner verwendet wird, wurden die Näpfchen nach Inkubation mit FSAP-haltigem Citrat-Plasma und dreimaligem Waschen mit Waschpuffer anschließend mit 100 μL 20 mM Zitronensäurelösung (pH 2,49) befüllt und 30 Minuten bei 37°C inkubiert, ohne dass eine Ultraschallbehandlung erfolgte.

The following control experiments were carried out:

1. In order to exclude that artificial non-specific activities are caused by the ultrasound, FSAP-free wash buffer was used instead of FSAP-containing citrated plasma as a sample.
2. For comparison with a prior art method in which citric acid is used to detach an analyte from a binding partner, the wells were incubated with FSAP-containing citrated plasma and washed three times with washing buffer finally filled with 100 .mu.l 20 mM citric acid solution (pH 2.49) and incubated for 30 minutes at 37 ° C, without any ultrasonic treatment.

Nach der jeweiligen Inkubation der verschiedenen Testansätze, mit und ohne Ultraschallbehandlung, wurden die Überstände aus den Näpfchen der Mikrotiterplatte entnommen und in Näpfchen einer neuen, unbeschichteten Mikrotiterplatte überführt. Die Bestimmung der Prourokinase-aktivierenden Aktivität der FSAP in den Überständen erfolgte durch Zugabe des FSAP-Substrats Prourokinase und eines chromogenen Prourokinase-Substrats (S-2444, Chromogenix Instrumentation Laborstory S. p. A., Milano, Italien) (siehe auch Beispiel 1 in EP 1 801 233 A1 zur Bestimmung der Prourokinase-aktivierenden Aktivität der FSAP).After each incubation of the various test mixtures, with and without ultrasound treatment, the supernatants were removed from the wells of the microtiter plate and transferred into wells of a new, uncoated microtiter plate. The determination of the prourokinase-activating activity of FSAP in the supernatants was carried out by adding the FSAP substrate prourokinase and a chromogenic prourokinase substrate (S-2444, Chromogenix Instrumentation Laboratory S.p.A., Milano, Italy) (see also Example 1) in EP 1 801 233 A1 for determining the prourokinase-activating activity of the FSAP).

Die Absorptionsänderung (CD) der Reaktionsansätze wurde bei einer Wellenlänge von 405 nm über einen Zeitraum von 4 Stunden bei 37°C verfolgt. Die Bestimmung der katalytischen Aktivität der FSAP erfolgte in Form der Volumenaktivität in Units (μmol Substratumsatz pro Minute) pro Liter (U/L) nach folgender Formel:

The absorbance change (CD) of the reactions was monitored at a wavelength of 405 nm over a period of 4 hours at 37 ° C. The catalytic activity of FSAP was determined in terms of volume activity in units (μmol substrate turnover per minute) per liter (U / L) according to the following formula:

Hierbei ist δc/δt die Konzentrationsänderung, d. h. Substratumsatz pro Zeiteinheit, δA/δt die Änderung der Absorption pro Zeiteinheit, ε der molare dekadische Absorptionskoeffizient von 9600 M^–1·cm^–1, d die Schichtdicke von 0,3362 cm und VF der Verdünnungsfaktor der zu untersuchenden Probe bezogen auf den Testansatz.Here δc / δt is the change in concentration, ie substrate conversion per unit time, δA / δt the change in absorption per unit time, ε the molar decadic absorption coefficient of 9600 M ^-1 · cm ^-1 , d the layer thickness of 0.3362 cm and VF the dilution factor the sample to be tested based on the test batch.

Die Volumenaktivität der FSAP in den Kontrollansätzen, die nicht mit Ultraschall behandelt worden waren, war nach Inkubation mit 20 mM Zitronensäure im Vergleich zur Inkubation mit Waschpuffer deutlich niedriger. Beim Ansatz mit Zitronensäure betrug die Volumenaktivität 0,76 ± 0,91 U/L (n = 3), beim Ansatz mit Waschpuffer waren es 2,25 ± 1,83 U/L (n = 3).The Volume activity of FSAP in control approaches, that had not been sonicated was after incubation with 20 mM citric acid compared to incubation with Wash buffer significantly lower. When mixed with citric acid the volume activity was 0.76 ± 0.91 U / L (n = 3), 2.25 ± 1.83 with the wash buffer U / L (n = 3).

Im Gegensatz hierzu nahm die Volumenaktivität der FSAP in den Ansätzen, die mit Waschpuffer inkubiert und erfindungsgemäß mit Ultraschall behandelt worden waren im Vergleich zu den Kontrollansätzen, die nicht mit Ultraschall behandelt worden waren, signifikant zu (1). Die Aktivität stieg mit zunehmender Beschallungsdauer. Mit der Ultraschallbehandlung nimmt die Volumenaktivität der FSAP signifikant zu, wodurch der FSAP-Nachweis verbessert wird.In contrast, the volume activity of FSAP in the batches incubated with wash buffer and sonicated according to the present invention increased significantly as compared to controls which had not been sonicated. 1 ). Activity increased with increasing sonication time. With ultrasound treatment, the volume activity of FSAP increases significantly, improving FSAP detection.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

EP 1182258 A1 [0017]
EP 1801233 A1 [0031]

Claims

A method for determining the activity of an analyte in a sample, wherein a) the sample is incubated with a binding partner associated with a solid phase having affinity for the analyte, and b) unbound portions of the sample are removed by washing the solid phase, and then c) the activity of the analyte is determined, characterized in that before or during the activity determination of the analyte in step c) the complex of solid phase-associated binding partner and analyte associated with the solid phase is treated with ultrasound.

Method according to claim 1, characterized in that that after washing the solid phase in step b) of the solid phase associated complex of solid phase-associated binding partner and analyte is incubated with at least one reagent, which is an activity determination of the analyte, and sonication during the activity determination in step c) takes place.

Method according to claim 1, characterized in that in that after washing the solid phase in step b) and before determining the activity in step c) the solid phase associated complex of the solid phase Binding partner and analyte is treated with ultrasound, the analyte-containing supernatant is separated from the solid phase and the activity determination of the analyte in the separated supernatant.

Method according to one of the previous Claims, characterized in that the to the solid phase associated complex of solid phase-associated binding partner and Analyte with ultrasound of a frequency of 15 kHz to 10 MHz, preferably a frequency of 20 to 40 kHz is treated.

Method according to one of the previous Claims, characterized in that the binding partner with affinity for the analyte a monoclonal or polyconic antibody or a fragment thereof.

Method for extracting an analyte from a Sample, wherein i) the sample with one associated with a solid phase Binding partner with affinity for the analyte is incubated, and ii) unbound constituents of the sample be removed by washing the solid phase, and then iii) the analyte is washed off the solid phase, characterized, that before or during the washing off of the analyte in step iii) the solid-phase-associated complex associated with the solid phase Binding partner and analyte is treated with ultrasound.

Method according to one of the previous Claims wherein the analyte is the blood coagulation factor VII activating protease.