DE102007044379A1 - Procedure for the conversion of substrates e.g. organic sulfides, ketones and amino acids, to products by a combined electrochemical and catalytic process in a reaction medium containing ionic liquid` - Google Patents
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Abstract
Description
Alle in der vorliegenden Anmeldung zitierten Dokumente sind durch Verweis in die vorliegende Offenbarung einbezogen (= incorporated by reference).All Documents cited in the present application are by reference included in the present disclosure (= incorporated by reference).
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umsetzung von Substraten zu Produkten durch einen kombinierten elektrochemischen und katalytischen Prozeß in Reaktionsmedien enthaltend ionische Flüssigkeiten.The The present invention relates to a process for reacting substrates to products through a combined electrochemical and catalytic Process in reaction media containing ionic liquids.
Stand der Technik/Hintergrund der Erfindung:Background Art / Background of the Invention:
Da alle biologischen Systeme chiral und somit auch optisch aktiv sind, muss man beim Einsatz von chiralen Verbindungen in der Pharmazie, Lebensmittelchemie oder Umweltchemie die oft unterschiedlichen pharmakologischen und toxikologischen Wirkungsweisen berücksichtigen. Seit bekannt wurde, wie wichtig die Chiralität für die Erfüllung exakter biologischer und physiologischer Aufgaben ist, hat die Zahl an selektiven Syntheseverfahren stetig zugenommen. Der Einsatz von Enzymen als Katalysatoren spielt dabei eine sehr wichtige Rolle, da diese sehr wirkungs- oder substratspezifisch sein können, d. h. je nach Enzym wird meist nur eine typische Reaktion katalysiert oder es wird nur eine bestimmte Art von Verbindung umgesetzt. Als Maß für die Enantioselektivität des Katalysators wird der sogenannte Enantiomerenüberschuss (ee) berechnet. Je höher der Enantiomerenüberschuss, desto höher ist der Anteil eines Enantiomers im entstehenden Produkt.There all biological systems are chiral and thus optically active, one must be aware of the use of chiral compounds in pharmacy, Food chemistry or environmental chemistry often have different pharmacological and toxicological effects. since It became known how important chirality is for the fulfillment of exact biological and physiological Tasks is, the number of selective synthesis methods has been steady increased. The use of enzymes as catalysts plays thereby a very important role as these are very specific or substrate specific can be, d. H. depending on the enzyme is usually only a typical Reaction catalyses or it becomes only a certain kind of connection implemented. As a measure of enantioselectivity the catalyst becomes the so-called enantiomeric excess (ee) calculated. The higher the enantiomeric excess, the higher the proportion of one enantiomer in the resulting Product.
Darüber hinaus arbeiten Enzyme unter milden Reaktionsbedingungen, wie z. B. physiologischem pH-Wert, Temperatur und Druck, was zur Senkung von Prozesskosten, geringeren sicherheitstechnischen Anforderungen und höherer Umweltverträglichkeit beitragen kann.About that In addition, enzymes work under mild reaction conditions, such as. As physiological pH, temperature and pressure, resulting in reduction of process costs, lower safety requirements and higher environmental impact.
Oxidoreduktasen sind interessante Katalysatoren für die Synthese chiraler Substanzen, da sie selektiv oxidieren bzw. reduzieren können. Dazu benötigen sie jedoch eine Elektronenquelle oder -senke, die die bei der Reaktion benötigten Elektronen zu- oder abführt. In der Natur wird diese Aufgabe meist von den Cofaktoren übernommen. Da Cofaktoren jedoch sehr teuer sind, ist es unwirtschaftlich, sie in stöchiometrischen Mengen in die Reaktion einzusetzen. Man muss die Cofaktoren im Reaktionssystem regenerieren. Zu diesem Zweck gibt es chemische, photochemische, elektrochemische und enzymatische Methoden.oxidoreductases are interesting catalysts for the synthesis of chiral ones Substances because they can selectively oxidise or reduce. For this, however, they need an electron source or sink, which add or require the electrons required in the reaction dissipates. In nature, this task is mostly done by the Cofactors taken over. However, cofactors are very expensive are, it is uneconomical, they are in stoichiometric Use amounts in the reaction. You have to cofactors in the reaction system regenerate. For this purpose, there are chemical, photochemical, electrochemical and enzymatic methods.
Sehr weit verbreitet ist die Regenerierung über eine zweite enzymatische Reaktion, bei der die verbrauchte Form des Cofaktors als Elektronenträger benötigt wird. Dazu kann man ein und dasselbe Enzym verwenden (substratgekoppelte Regenerierung) oder eine weiteres Enzym zur Regenerierung einsetzen (enzymgekoppelte Regenerierung).Very The regeneration is widespread over a second enzymatic reaction, in which the spent form of the cofactor is required as an electron carrier. This can to use one and the same enzyme (substrate-coupled regeneration) or use another enzyme for regeneration (enzyme-linked Regeneration).
Zur enzymgekoppelten Cofaktorregenerierung werden in vielen Fällen die Enzyme Formiatdehydrogenase (FDH), Glukosedehydrogenase (GDH) oder Glukose-6-phosphat-dehydrogenase (GPD) als Regenerierungsenzyme eingesetzt.to Enzyme-linked cofactor regeneration will in many cases the enzymes formate dehydrogenase (FDH), glucose dehydrogenase (GDH) or glucose-6-phosphate dehydrogenase (GPD) as regeneration enzymes used.
Bei der FDH-gekoppelten Regenerierung wird gleichzeitig mit der Hauptreaktion vom Regenerierungsenzym FDH Formiat zu CO2 umgewandelt. Da das Enzym bei dieser Reaktion Elektronen aufnehmen muss, braucht es einen Reaktionspartner, der diese Elektronen übernimmt. Der reduzierte Cofaktor NAD(P)+ kann die überschüssigen Elektronen aufnehmen und wird so wieder in die für die Hauptreaktion benötigte Form NADH überführt. Für diese Regenerierungsmethode sprechen die niedrigen Anschaffungskosten für das Substrat und das Enzym, sowie, dessen gute Aktivität und Stabilität. Darüber hinaus lässt sich das Coprodukt verhältnismäßig leicht abtrennen und beeinflusst somit die Lage des thermodynamischen Gleichgewichts positiv. Nachteilig ist, dass sich der pH-Wert der Reaktionslösung während der Synthese verschiebt und diesem Effekt entgegengewirkt werden muss, um Beeinflussungen der Enzymleistungen zu verhindern. Ein weiteres Problem liegt in der Cofaktorpräferenz der FDH; in den meisten Fällen bevorzugt das Enzym den Cofaktor NAD+ und zeigt nur eine sehr geringe Aktivität mit NADP+.In the FDH-coupled regeneration, formate is converted to CO 2 simultaneously with the main reaction by the regeneration enzyme FDH. Since the enzyme must absorb electrons in this reaction, it needs a reaction partner, which takes over these electrons. The reduced cofactor NAD (P) + can absorb the excess electrons and is thus converted back into the NADH form required for the main reaction. This regeneration method is supported by the low acquisition costs for the substrate and the enzyme, as well as its good activity and stability. In addition, the coproduct is relatively easy to separate and thus influences the position of the thermodynamic equilibrium positively. The disadvantage is that the pH of the reaction solution shifts during the synthesis and this effect must be counteracted to prevent interference with the enzyme performance. Another problem lies in the cofactor preference of the FDH; in most cases the enzyme prefers the cofactor NAD + and shows only a very low activity with NADP + .
Bei der Regenerierung mit Hilfe von GDH bzw. GPD wird Glukose bzw. Glukose-6-Posphat oxidiert. Die benötigten Enzyme sind relativ preiswert, aktiv und stabil. Allerdings ist das Substrat Glukose-6-Phosphat verhältnismäßig teuer. Außerdem schränkt die Cofaktorpräferenz der GPD für NADP+ die Einsatzmöglichkeiten dieser Methode ein.Regeneration with the aid of GDH or GPD oxidizes glucose or glucose-6-phosphate. The required enzymes are relatively inexpensive, active and stable. However, the glucose-6-phosphate substrate is relatively expensive. In addition, the cofactor preference of the GPD for NADP + limits the potential for use this method.
Bei der enzymgekoppelten Regenerierung ist es generell nachteilig, dass man die Reaktionsbedingungen an die Bedürfnisse der beiden Enzyme anpassen muss, da dies allermeist einen Kompromiss für die jeweiligen Aktivitäten und Stabilitäten erfordert. Durch die Verwendung von zwei unterschiedlichen Enzymen wird ggf. die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches erschwert.at the enzyme-coupled regeneration, it is generally disadvantageous that the reaction conditions to the needs of the two Enzyme must adapt as this is most often a compromise for which requires respective activities and stabilities. By using two different enzymes, if necessary, the workup of the reaction mixture difficult.
Die substratgekoppelte Cofaktorregenerierung wird hauptsächlich für Alkoholdehydrogenase (ADH) katalysierte Reaktionen genutzt; wobei in den meisten Fällen 2-Propanol als Cosubstrat fungiert und durch die ADH zu Aceton umgesetzt wird. Da bei dieser Methode zwei verschiedene Substrate vom gleichen Enzym zu zwei verschiedene Produkten umgesetzt werden müssen, ist dieses System stark von der zugehörigen thermodynamischen Gleichgewichtslage abhängig. Außerdem fungiert das Aceton meistens auch als Enzyminhibitor oder desaktiviert die Enzyme. Darüber hinaus kann ebenfalls das 2-Propanol das Enzym inhibieren oder desaktivieren. Um die Prozesse wirtschaftlich zu machen sind eine geeignete Methode der integrierten Coproduktabtrennung und eine angepasste Cosubstratdosierung nötig.The substrate-coupled cofactor regeneration becomes major for alcohol dehydrogenase (ADH) catalyzed reactions used; where in most cases 2-propanol as cosubstrate and is converted by the ADH to acetone. As with this Method Two different substrates from the same enzyme to two different ones Products must be implemented, this system is strong from the associated thermodynamic equilibrium position dependent. In addition, the acetone usually works also as an enzyme inhibitor or deactivates the enzymes. About that In addition, 2-propanol may also inhibit or inactivate the enzyme. To make the processes economical are a suitable method the integrated coproduct separation and an adapted co-substrate dosage necessary.
Allgemeine Probleme der beiden enzymatischen Cofaktorregenerierungsmethoden sind Inhibierungen des Enzyms der Hauptreaktion durch das eingesetzte Cosubstrat oder des entstehenden Coprodukts. Des Weiteren sind die Reaktionsgemische meist viel komplexer und somit kann die Produktaufarbeitung oder die Katalysatorrückgewinnung erschwert sein.General Problems of the two enzymatic cofactor regeneration methods are inhibitions of the enzyme of the main reaction by the used Cosubstrate or the resulting coproduct. Furthermore, the Reaction mixtures usually much more complex and thus can the product processing or the catalyst recovery be difficult.
Eine Methode, die versucht diese Schwierigkeiten zu umgehen ist die elektrochemische Cofaktorregenerierung. Dabei werden die in der Reaktion involvierten Elektronen nicht durch eine weitere Reaktion transportiert, sondern von Elektroden aufgenommen bzw. bereitgestellt. Vorteile dieser Methode sind z. B. die im Verhältnis viel niedrigeren Kosten. Außerdem wird nicht zwingend ein weiterer Reaktand benötigt, der die spätere Aufarbeitung verkompliziert. Darüber hinaus kann die Reaktion durch den anliegenden Strom gesteuert werden. Ein großes Problem dieses Regenerierungskonzepts ist jedoch, das die normalerweise verwendeten Reaktionsmedien für die Enzymkatalyse nur geringe Leitfähigkeiten aufweisen und somit auch nur geringe Produktivitäten erzielt werden. Nach dem Stand der Technik ist die niedrige Produktivität bisher der entscheidende Faktor, der die Wirtschaftlichkeit der Prozesse limitiert. Die Zugabe von gewöhnlichen Salzen zur Leitfähigkeitserhöhung kann zu geringeren Aktivitäten und Stabilitäten bis hin zum Ausfällen des Enzyms führen. Darüber hinaus ist diese Methode auf wasserlösliche Substrate angewiesen, da die Zugabe von organischen Cosolventien neben der Herabsetzung der Enzymaktivität und -stabilität die Leitfähigkeit zusätzlich negativ beeinflussen würde.A Method that tries to circumvent these difficulties is the electrochemical Cofactor regeneration. They are involved in the reaction Electrons are not transported by another reaction, but instead taken or provided by electrodes. Advantages of this Method are z. B. the relatively much lower cost. In addition, another reactant is not necessarily needed, which complicates the later workup. About that In addition, the reaction can be controlled by the applied current. However, a big problem with this regeneration concept is the normally used reaction media for the Enzyme catalysis have low conductivities and thus only low productivity can be achieved. In the prior art, the low productivity So far, the decisive factor affecting the profitability of Processes limited. The addition of ordinary salts to conductivity increase can be less Activities and stabilities to failure of the enzyme. In addition, this method is reliant on water-soluble substrates as the addition of organic cosolvents in addition to lowering enzyme activity and stability the conductivity in addition would adversely affect.
Die Kombination von elektrochemischer Cofaktorregenerierung oder Cosubstratgenerierung mit einer enzymkatalysierten Synthese nennt man elektroenzymatische Synthese. Die Anwendbarkeit elektroenzymatischer Synthesen wurde schon in den verschiedensten Konstellationen untersucht. Bei vielen Untersuchungen lag der Schwerpunkt hauptsächlich auf der generellen Durchführbarkeit und nicht auf der Optimierung der Synthesen. Bei den wenigen Optimierungsversuchen wurde insbesondere versucht das Reaktordesign zu verbessern.The Combination of electrochemical cofactor regeneration or cosubstrate generation with an enzyme-catalyzed synthesis is called elektroenzymatische Synthesis. The applicability of electro-enzymatic syntheses has been already examined in various constellations. In many Investigations focused mainly on the general feasibility and not on optimization the syntheses. In particular, the few optimization attempts became trying to improve the reactor design.
Die
Kopplung von enzymatischer Reduktion und Regenerierung von NAD(P)H
wurde bislang am häufigsten verwendet. Vor allem für
die elektroenzymatische Synthese chiraler Alkohole sind einige Beispiele
bekannt. Die aktuellsten Forschungsarbeiten beschäftigen
sich mit Anwendbarkeit von 2-Phasensystemen für die Elektroenzymatik
um Probleme der Substratlöslichkeit und/oder Produkt-inhibierungen
zu umgehen. In einem Beispiel ist die Alkoholdehydrogenase-katalysierte
Synthese von (1S,3S)-3-Methylcyclohexanol beschrieben. Unter Verwendung
von Oktanol als zweite Phase konnte eine Produktivität
von 27 mol/Id (= 3,12 g/Id) erreicht werden (
In
einem anderen Ansatz wurde MTBE als zweite Phase verwendet. Im Vergleich
zu den Synthesen ohne zweite Phase konnte die Zyklenzahl (= n(Produkt)/n(Katalysator))
für den Cofaktor und den Mediator verdoppelt werden, die
Produktivität betrug jedoch nur ~20% des ursprünglich
erreichten Wertes. Durch eine Überdosierung an Enzym kann
die Zyklenzahl für die Alkoholdehydrogenase nicht eindeutig
bestimmt werden. Es ist jedoch erkennbar, dass die Zyklenzahl in
Gegenwart der organischen Phase deutlich reduziert wird (nur ~7%
des Vergleichswertes) (
Nicht alle Oxidoreduktasen sind NAD(P)(H) abhängig; Flavinadenindinukleotid FAD ist ein weiterer wichtiger Cofaktor den ein großer Teil aller Oxidoreduktasen benötigt. Im Gegensatz zu NAD(P)(H) liegt der Cofaktor nicht frei in der Lösung vor, sondern ist kovalent an das Enzym gebunden. In den Oxidationsreaktionen die diese Enzyme katalysieren kann das FAD über molekularen Sauerstoff regeneriert werden. Allerdings entsteht dabei immer H2O2 als Nebenprodukt, durch das das Enzym schon in geringen Dosen inaktiviert und/oder destabilisiert wird. Durch Zugabe von Catalase kann das entstandene Wasserstoffperoxid wieder zerstört werden. Um die Entstehung von H2O2 komplett zu vermeiden kann das FAD auch aerob, elektrochemisch regeneriert werden. Meist wird dazu ein Ferrocenderivat als Mediator (Elektronüberträger zwischen Elektrode und Cofaktor) verwendet.Not all oxidoreductases are dependent on NAD (P) (H); Flavin adenine dinucleotide FAD is another important cofactor that requires a large portion of all oxidoreductases. In contrast to NAD (P) (H), the cofactor is not freely present in the solution but is covalently bound to the enzyme. In the oxidation reaction which can catalyze these enzymes, the FAD can be regenerated via molecular oxygen. However, it always produces H 2 O 2 as a by-product, through which the enzyme is inactivated and / or destabilized even at low doses. By adding catalase, the resulting hydrogen peroxide can be destroyed again. In order to completely avoid the formation of H 2 O 2 , the FAD can also be regenerated aerobically, electrochemically. Usually a ferrocene derivative is used as mediator (electron transfer between electrode and cofactor).
Diese
Methode wurde z. B. schon zur Regenerierung von Cresolmethylhydroxylase
(PCMH) während der Synthese von p-Hydroxybenzaldehyde genutzt.
Als Reaktionsmedium wurde 50 mM TRIS/HCl-Puffer mit Zugabe von KCl
verwendet. Der verwendete Ferrocen-Mediator war polymervergrößert
um eine spätere Abtrennung mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran
zu ermöglichen. Unter den gewählten Reaktionsbedingungen konnte
jedoch lediglich eine Produktivität von ~21,9 mmolL–1d–1 erreicht
werden (
Ein
Beispiel bei dem eine elektrochemische Cosubstratgenerierung erfolgreich
eingesetzt wurde ist die Chloroperoxidase-katalysierte Synthese
chiraler Sulfoxide. Für das Substrat Thioanisol wurden
Synthesen in einem Satzreaktor durchgeführt. Zur Erhöhung
der Löslichkeit des Substrates wurden dem Reaktionsmedium
30 Vol.-% tert-Butanol zugegeben. Unter den gewählten Reaktionsbedingungen
konnte eine Produktivität von 30 g/Id und eine Zyklenzahl
von 95000 für die Chloroperoxidase erreicht werden. Durch
die Nutzung einer 3-dimensionalen-Elektrode als Reaktionsgefäß und
einer Zugabe von 10 Vol.-% tert-Butanol zum Reaktionsmedium konnte
die Produktivität auf 104 g/Id und eine Zyklenzahl von
145000 für das Enzym gesteigert werden. In beiden Fällen
mussten dem Reaktionspuffer noch 50 mM Na2SO4 zur Leitfähigkeitserhöhung
beigemischt werden. Durch das organische Cosolvents traten drei
wesentlichen Probleme auf: Durch die Zugabe von tert-Butanol zur
Pufferlösung wurde die Leitfähigkeit deutlich
verringert. Bei einer Zugabe von 30 Vol.-% sinkt die Leitfähigkeit
von zuvor 13,4 mScm–1 auf 4 mScm–1. Zusätzlich sinkt die
Enzymaktivität von 1800 Umg–1 auf
600 Umg–1. Darüber hinaus
wird die Enzymstabilität drastisch beeinflusst; nach drei
Stunden weist das Enzym nur noch 10% seiner Anfangsaktivität
auf (
Bei elektroenzymatischen Synthesen zeigt sich als Hauptproblem die geringe Produktivität. Generell ist die Leitfähigkeit der Reaktionsmedien oft zu niedrig. Versuche zur Erhöhung der Substratlöslichkeit durch ein Cosolvents führten zusätzlich zu einer Reduzierung der Leitfähigkeit.at Electroenzymatic syntheses are the main problem Productivity. Generally, the conductivity is Of the reaction media often too low. Attempts to increase the substrate solubility led by a cosolvent in addition to a reduction in conductivity.
Im
Jahr 2000 wurde erstmalig der Einsatz eines isolierten Enzyms in
ionischen Flüssigkeiten beschrieben; im Rahmen dieser Arbeit
wurde die Thermolysinkatalysierte Umsetzung von L-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid
und Carbobenzoxy-L-aspartat zu Z-Aspartam in 1-Butyl-3-Methylimidazolium
Hexafluorophosphat BMIM PF6 untersucht.
Dabei zeigte sich, dass das Enzym in der ionischen Flüssigkeit
im Vergleich zu dem sonst verwendeten organischen Lösemittel
(Ethylacetat) höhere Stabilitäten aufweist (
Seit dieser Zeit hat das Interesse an ionischen Flüssigkeiten für die Biokatalyse stetig zugenommen. Ein wichtiger Grund für den Einsatz von ionischen Flüssigkeiten in der Biokatalyse sind deren gute Löslichkeiten für verschiedenste Substanzen. Mit dem Einsatz von Pufferlösungen war man bislang meist auf wasserlösliche Substrate beschränkt. Organische Lösemittel haben sich in vielen Fällen als nicht enzymfreundlich erwiesen.since this time has an interest in ionic liquids For biocatalysis steadily increased. An important reason for the use of ionic liquids in of biocatalysis are their good solubilities for various substances. With the use of buffer solutions So far, it has mostly been limited to water-soluble substrates. Organic solvents have in many cases proved to be non-enzyme friendly.
Gegenstand der Forschung sind zum größten Teil Lipasen (Enzyme der Klasse der Hydrolasen, die die heterolytische Spaltung von Bindungen katalysieren), eine Enzymklasse, die dafür bekannt ist, nicht natürliche Reaktionsbedingungen in überdurchschnittlichem Maß zu tolerieren.object The research is mostly Lipases (enzymes the class of hydrolases involving the heterolytic cleavage of bonds catalyze), an enzyme class known for not natural reaction conditions in above average To tolerate measure.
Bei den Untersuchungen zur Enzymperformance in Gegenwart der verschiedensten ionischen Flüssigkeiten zeigten sich sehr unterschiedliche Ergebnisse. In manchen ionischen Flüssigkeiten wurden gesteigerte Aktivitäten, Stabilitäten oder Selektivitäten der Biokatalysatoren gefunden, in den meisten ionischen Flüssigkeiten waren die Ergebnisse allerdings deutlich schlechter.at the investigations of the enzyme performance in the presence of the most diverse ionic liquids were very different Results. In some ionic liquids were increased Activities, stabilities or selectivities of biocatalysts found in most ionic liquids However, the results were significantly worse.
Die ionische Flüssigkeit BMIM BF4 wurde als Lösungsvermittler in der Meerretichperoxidase katalysierten Umsetzung schwer wasserlöslicher Phenole eingesetzt. Bei den Aktivitätsuntersuchungen zeigte sich, dass das Enzym in Gegenwart der ionischen Flüssigkeiten drastisch an Aktivität verloren hatte; in Gegenwart von ca. 25 Vol.-% ist im Vergleich zum reinem Puffer keine Aktivität mehr vorhanden.The ionic liquid BMIM BF 4 was used as a solubilizer in the horseradish peroxidase catalyzed reaction of poorly water-soluble phenols. The activity studies showed that the enzyme had drastically lost activity in the presence of the ionic liquids; in the presence of about 25% by volume, no activity is present in comparison with the pure buffer.
Das Enzym 3-alpha-Hydrosteroiddehydrogenase wurde auf seine Aktivität in Gegenwart von 10 Vol.-% verschiedener ILs untersucht. In BMIM Lactat konnte die Aktivität um 60% gesteigert werden, während in EMIM CF3SO3 nur noch 80% und in BMIM CF3SO3 und BMIM BF4 sogar nur noch 20% Restaktivität gefunden werden konnten. Angaben zu den Stabilitäten in den unterschiedlichen ionischen Flüssigkeiten wurden nicht gemacht.The enzyme 3-alpha-hydrosteroid dehydrogenase was assayed for activity in the presence of 10% by volume of various ILs. In BMIM lactate the activity could be increased by 60%, while in EMIM CF 3 SO 3 only 80% and in BMIM CF 3 SO 3 and BMIM BF 4 even only 20% residual activity could be found. Information on the stabilities in the different ionic liquids were not made.
Die enantioselektive Sulfoxidation von Thioanisol mit Hilfe des Enzyms Chloroperoxidase mit einfacher Zudosierung des Cosubstrats H2O2 wurde schon in verschiedenen ionischen Flüssigkeiten untersucht. Bei den Versuchen konnten jedoch lediglich drei ionische Flüssigkeiten (N1112OH Citr, MMIM Me2PO4, N1112OH OAc) identifiziert werden, in deren Gegenwart das Enzym generell noch aktiv ist. Einflüsse auf die Enzymstabilität wurden nicht untersucht.The enantioselective sulfoxidation of thioanisole using the enzyme chloroperoxidase with simple addition of the cosubstrate H 2 O 2 has been studied in various ionic liquids. In the experiments, however, only three ionic liquids (N 1112 OH Citr, MMIM Me 2 PO 4 , N 1112 OH OAc) could be identified, in the presence of which the enzyme is still generally active. Influences on enzyme stability have not been studied.
Immobilisierte Aminosäureoxidase ist in den wassermischbaren ionischen Flüssigkeiten BMIM BF4, MMIM Me2PO4 und BMIM OcSO4 aktiv und weist im Vergleich der drei ILs in MMIM Me2PO4 die größte Stabilität auf (Referenzwerte in reiner Pufferlösung sind nicht angegeben). Mit dem Enzymimmobilisat wurden Biotransformationen mit Zugabe von Catalase zur Vermeidung zu hoher H2O2-Konzentrationen durchgeführt. Für das freie Enzym sind nur Aktivitätswerte in BMIM BF4 und MMIM Me2PO4 angegeben; in 20% MMIM Me2PO4 wurde eine Aktivitätssteigerung von 45% ermittelt. Die Stabilität des Enzyms in den jeweiligen ionischen Flüssigkeiten ist nicht bekannt.Immobilized amino acid oxidase is active in the water-miscible ionic liquids BMIM BF 4 , MMIM Me 2 PO 4 and BMIM OcSO 4 and has the greatest stability in comparison of the three ILs in MMIM Me 2 PO 4 (reference values in pure buffer solution are not indicated). Biotransformations with the addition of catalase were carried out with the enzyme immobilizate to avoid too high H 2 O 2 concentrations. For the free enzyme only activity values are given in BMIM BF 4 and MMIM Me 2 PO 4 ; in 20% MMIM Me 2 PO 4 an increase in activity of 45% was determined. The stability of the enzyme in the respective ionic liquids is not known.
Für
die Enzyme der Klasse der Alkoholdehydrogenasen waren lange keine
ionischen Flüssigkeiten bekannt, in denen die Enzyme noch
aktiv waren. In der
Es
ist bekannt, enzymatische Umsetzungen in ionischen Flüssigkeiten
durchzuführen; z. B:
Aus
dem Stand der Technik ist es bekannt, die Cofaktoren von Enzymen
auf elektrochemischem Weg zu regenerieren; z. B: aus
Aufgabe:Task:
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren zur Umsetzung von Substraten zu Produkten zur Verfügung zu stellen, daß einfach durchführbar ist. Das Verfahren soll ökonomisch und ökologisch vorteilhaft sein und auf viele Substrate anwendbar sein. Weiterhin soll das Verfahren kontinuierlich durchführbar sein.task The present invention is a method for the implementation of Providing substrates to products that easy is feasible. The process should be economical and be ecologically beneficial and on many substrates be applicable. Furthermore, the method should be continuously practicable be.
Insbesondere soll es zur Herstellung chiraler Verbindungen geeignet sein. Das Verfahren soll dabei die genannten Nachteile des Standes der Technik vermeiden.Especially it should be suitable for the preparation of chiral compounds. The Process should thereby the mentioned disadvantages of the prior art avoid.
Insbesondere im Hinblick auf die oben genannten Probleme der elektroenzymatischen Synthesen, ist eine Aufgabe der Erfindung, Methoden zur Produktivitätssteigerung durch Erhöhung der Leitfähigkeit des Reaktionsmediums zu finden, die nicht gleichzeitig die Enzymaktivität und -stabilität negativ beeinflussen und darüber hinaus noch positive Einflüsse auf die Substratlöslichkeit haben können.Especially in view of the above-mentioned problems of the electroenzymatic Synthesis, is an object of the invention, methods for increasing productivity by increasing the conductivity of the reaction medium to find that does not simultaneously affect the enzyme activity and stability, and beyond still positive influences on the substrate solubility can have.
Lösung:Solution:
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Umsetzung von Substraten zu Produkten durch einen kombinierten elektrochemischen und katalytischen Prozess in Reaktionsmedien enthaltend ionische Flüssigkeiten gelöst.The The object is achieved by a process for the conversion of substrates Products through a combined electrochemical and catalytic Process dissolved in reaction media containing ionic liquids.
Begriffsdefinitionen:Definition of terms:
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind alle Mengenangaben, sofern nicht anders angegeben, als Gewichtsangaben zu verstehen.in the The scope of the present invention are all amounts, if not stated otherwise, to be understood as weight data.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Raum- bzw. Zimmertemperatur" eine Temperatur von 20°C. Temperaturangaben sind, soweit nicht anders angegeben, in Grad Celsius (°C).in the For the purposes of the present invention, the term "space or room temperature ", a temperature of 20 ° C are, unless stated otherwise, in degrees Celsius (° C).
Sofern nichts anderes angegeben wird, werden die angeführten Reaktionen bzw. Verfahrensschritte bei Normaldruck (Atmosphärendruck) durchgeführt.Provided unless otherwise stated, the reactions cited or process steps at normal pressure (atmospheric pressure) carried out.
Unter Substrat wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Ausgangsverbindung, also das Edukt, verstanden, welches im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens umgesetzt wird.Under Substrate is in the context of the present invention, the starting compound, ie the educt, understood, which in the context of the invention Procedure is implemented.
Unter dem Begriff „ionische Flüssigkeit" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Ausschließlich aus Kationen und Anionen bestehende Flüssigkeiten verstanden. Diese weisen niedrige Schmelzpunkte von unter 100°C auf. Insbesondere werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter ionischen Flüssigkeiten verstanden, die bei Temperaturen zwischen –10 und 80°C, insbesondere bei Raumtemperatur, flüssig sind. Der Begriff „ionische Flüssigkeit" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung gelegentlich durch „IL" abgekürzt.Under The term "ionic liquid" is used in the context of the present invention exclusively of cations and anions existing liquids understood. These have low melting points below 100 ° C. Especially in the context of the present invention are understood as meaning ionic liquids, at temperatures between -10 and 80 ° C, in particular at room temperature, are liquid. The term "ionic Liquid "is within the scope of the present invention occasionally abbreviated by "IL".
Mediatoren (Redoxmediatoren) im Sinne der vorliegenden Erfindung dienen dazu, die elektrochemische Cofaktor-Regenerierung „indirekt" durchzuführen.mediators (Redox mediators) within the meaning of the present invention serve the electrochemical cofactor regeneration "indirectly" perform.
Der Cofaktor reagiert dann nicht selber an der Elektrode, sondern zunächst der Mediator, der dann mit dem Cofaktor reagiert; der Mediator überträgt die Redoxäquivalente auf den Cofaktor. Der Mediator ist demgemäß im Rahmen der vorliegende Erfindung ein „Ladungstransporter".Of the Cofactor then does not react to the electrode itself, but first the mediator, who then reacts with the cofactor; the mediator transmits the redox equivalents on the cofactor. The mediator is Accordingly, in the context of the present invention, a "charge transporter".
Als wassermischbar werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung ILs angesehen, die bei Raumtemperatur mit Wasser in beliebigen Volumen-Anteilen gemischt homogene, einphasige Systeme ergeben.When water-miscible ILs are considered in the context of the present invention, at room temperature with water in any volume proportions mixed homogeneous, single-phase systems result.
In einer Variante werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter wassermischbaren ILs solche verstanden, die in einer Menge bis 55 Vol.-% mit Wasser in einer Menge von mindestens 45 Vol.-% gemischt homogene, einphasige Systeme ergeben.In a variant are in the context of the present invention under water-miscible ILs are understood to be those in an amount up to 55 Vol .-% mixed with water in an amount of at least 45 vol .-% homogeneous, single-phase systems.
Detaillierte Beschreibung:Detailed description:
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umsetzung von Substraten zu Produkten durch einen kombinierten elektrochemischen und katalytischen Prozeß in Reaktionsmedien enthaltend ionische Flüssigkeiten.The The present invention relates to a process for reacting substrates to products through a combined electrochemical and catalytic Process in reaction media containing ionic liquids.
Die vorliegende Erfindung betrifft also ein elektrochemisches Verfahren, bei dem eine elektrochemische Reaktion mit einer Reaktion, die unter Verwendung eines Katalysators abläuft.The The present invention thus relates to an electrochemical process. in which an electrochemical reaction with a reaction under Use of a catalyst expires.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung chiraler Verbindungen durch Oxidoreduktasen mit elektrochemischer Regenerierung bzw. Generierung der benötigten Redoxäquivalente bzw. Cofaktoren unter Verwendung von Reaktionsmedien enthaltend ionische Flüssigkeiten.In In one embodiment, the invention relates to methods for the preparation of chiral compounds by oxidoreductases with electrochemical regeneration or generation of the required Redox equivalents or cofactors using reaction media containing ionic liquids.
Im Hinblick auf den bekannten Stand der Technik war es überraschend, daß eine enzymatische Umsetzung bei elektrochemischer Cofaktor-Regenerierung in Reaktionsmedien möglich war, die einen nur geringen Anteil an IL aufweisen.in the In view of the known state of the art, it was surprising that an enzymatic conversion in electrochemical cofactor regeneration in reaction media was possible, the only minor Share of IL.
Die Verwendung der ionischen Flüssigkeiten führt zu einer Leitfähigkeitserhöhung und einer gleichzeitigen Erhöhung der Substratlöslichkeit. Dies erfolgt unter Erhalt oder sogar Erhöhung der Stabilität des Enzyms.The use of the ionic liquids leads to an increase in conductivity and a simultaneous increase in substrate solubility. This is done while preserving or even increasing the stability of the ene zyms.
Überraschenderweise zeigt sich hierbei, dass in einer aufgrund des Standes der Technik nicht zu erwartenden Breite, wassermischbare ionische Flüssigkeiten als Lösungsvermittler und Leitsalz in elektroenzymatischen Synthesen verwendet werden können. Hierbei findet man unerwartet eine Reihe von Kombinationen, bei denen die verwendeten Oxidoreduktasen nicht signifikant an Aktivität einbüßen, bzw. bei denen sogar die Stabilität des Enzyms erhöht ist. Darüber hinaus werden die Leitfähigkeiten schon bei Verwendung geringer Mengen an ionischer Flüssigkeit drastisch erhöht und hierdurch die Produktivität der Prozesse signifikant erhöht. Positiv wirkt sich auch aus, dass die Löslichkeit der organischen Substrate gegenüber rein wässrigen Puffergemischen in vielen Fällen erhöht werden kann.Surprisingly shows here that in one due to the state of the art unpredictable breadth, water-miscible ionic liquids as a solubilizer and conductive salt in electroenzymatic Syntheses can be used. Here you will find unexpected a number of combinations in which the oxidoreductases used not significantly lose activity, or in which even increases the stability of the enzyme is. In addition, the conductivities even when using small amounts of ionic liquid dramatically increased and thereby productivity the processes increased significantly. Positive also affects from that the solubility of the organic substrates opposite purely aqueous buffer mixtures in many cases can be increased.
In einer Ausführungsform kann die Umsetzungen in einem homogenen, einphasigen System erfolgen.In In one embodiment, the reactions may be carried out in a homogeneous, single-phase system.
Erfindungsgemäß können als katalytisches System Biokatalysatoren Enzymen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oxidoreduktasen, Alkoholhydrogenasen, Oxidasen; Peroxidasen und Gemischen derselben oder E. C. 1. X. eingesetzt werden.According to the invention as a catalytic system biocatalysts enzymes, selected from the group consisting of oxidoreductases, alcohol hydrogenases, oxidases; Peroxidases and mixtures thereof or E. C. 1. X. used become.
Erfindungsgemäß wird in dem katalytischen Prozeß mindestens ein, bevorzugt ein, Enzym und gegebenenfalls zusätzlich noch mindestens ein, bevorzugt ein, Cofaktor und/oder mindestens ein, bevorzugt ein, Mediator und/oder mindestens ein, bevorzugt eine prosthetische Gruppe, eingesetzt werden.According to the invention in the catalytic process at least one, preferably one, Enzyme and optionally additionally at least one, preferably one, cofactor and / or at least one, preferably one, mediator and / or at least one, preferably a prosthetic group used become.
Bei den erfindungsgemäß verwendbaren Katalysatoren handelt es sich in einer Ausführungsform um eine Oxidoreduktase (Enzymklasse 1) mit Rhodium- und/oder Ferrocenkomplexe handelt.at the catalysts usable according to the invention In one embodiment, it is an oxidoreductase (Enzyme class 1) with rhodium and / or ferrocene complexes.
Die Oxidoreduktase kann dabei ein Enzym mikrobiellen Ursprungs sein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dehydrogenasen, Oxidasen, Peroxidasen, Monooxygenasen und Hydrogenasen.The Oxidoreductase may be an enzyme of microbial origin, selected from the group consisting of dehydrogenases, Oxidases, peroxidases, monooxygenases and hydrogenases.
Einsetzbare Oxidoreduktasen können Dehydrogenasen, Peroxidasen, oder Oxidasen sein, Beispiele dafür sind:
- – Alkoholdehydrogenase, insbesondere eine Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis,
- – Aminosäureoxidase, insbesondere eine Aminosäureoxidase aus Trigonopsis variabilis oder
- – Chloroperoxidase, insbesondere eine Chloroperoxidase aus Caldariomyces fumago.
- Alcohol dehydrogenase, in particular an alcohol dehydrogenase from Lactobacillus brevis,
- Amino acid oxidase, in particular an amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis or
- - Chloroperoxidase, in particular a chloroperoxidase from Caldariomyces fumago.
Die Oxidoreduktasen können beispielsweise abhängig sein von Cofaktor NAD(P)(H) oder Cofaktor FAD.The Oxidoreductases may be dependent, for example its from cofactor NAD (P) (H) or cofactor FAD.
Durch die biokatalytische Redoxreaktion (z. B: Enzym oxidiert Substrat Aminosäure zum Produkt Ketosäure oder Enzym reduziert Substrat Keton zum Produkt Alkohol) werden die Cofaktoren ihrerseits reduziert bzw. oxidiert und liegen somit nicht mehr im richtigen Redoxzustand für einen erneuten Katalyse-Zyklus vor. Durch eine elektrochemische Reaktion werden die Cofaktoren, z. B., indirekt über einen Übergansgmetallkomplex als Mediator, wieder in den ursprünglichen Redoxzustand überführt (regeneriert; Cofaktor-Regenerierung) und stehen erneut für die Reduktion bzw. Oxidation des Substrates zur Verfügung.By the biocatalytic redox reaction (eg: enzyme oxidizes substrate Amino acid to the product keto acid or enzyme reduced Substrate ketone to the product alcohol) become the cofactors themselves reduced or oxidized and are therefore no longer in the right Redox state for a new catalytic cycle before. By an electrochemical reaction, the cofactors, z. B., indirectly via a transition metal complex as a mediator, again in the transferred to the original redox state (regenerates, cofactor regeneration) and stand again for the reduction or oxidation of the substrate available.
Cofaktoren bzw. prosthetische Gruppen in Peroxidasen werden in einer Ausführungsform ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Metallen deren Ionen, Mangan und Vanadate, sein.cofactors or prosthetic groups in peroxidases are in one embodiment selected from the group consisting of metals whose Ions, manganese and vanadate.
Bei der Chlororperoxidase ist der Cofaktor bzw. die prosthetische Gruppe bevorzugt das Häm (Hämoglobin, ein Eisen-Porphyrin-Komplex).at Chlororperoxidase is the cofactor or prosthetic group prefers the heme (hemoglobin, an iron porphyrin complex).
Es ist erfindungsgemäß auch möglich, die prosthetische Gruppe im Enzym durch Cosubstrate wieder in den richtigen Redoxzustand zu bringen, damit das Enzym wieder mit einem Substrat reagieren kann.It is also possible according to the invention, the prosthetic group in the enzyme by cosubstrates back into the right one Redox state to bring the enzyme back to a substrate can react.
Eine Variante ist Wasserstoffperoxid (H2O2) als Cosubstrat bzw. Redoxäquivalent.One variant is hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) as cosubstrate or redox equivalent.
Die Zusammenhänge von Enzym/Coenzym/Cosubstrat/Cofaktor/prosthetische Gruppe ist dem Fachmann hinreichend bekannt und braucht nicht näher ausgeführt zu werden.The Interactions of Enzyme / Coenzyme / Cosubstrate / Cofactor / Prosthetic Group is well known to the skilled person and needs no closer to be executed.
Ergänzend
wird auf die entsprechenden Fachbücher der Biochemie verwiesen,
z. B.
Erfindungsgemäß einsetzbare Substrate sind organische Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sulfiden, Aminen, Aminosäuren, Ketonen, Thioanisol, Methionin, Acetophenon und Gemische derselben.Usable according to the invention Substrates are organic compounds selected from the Group consisting of sulphides, amines, amino acids, ketones, Thioanisole, methionine, acetophenone and mixtures thereof.
Ionische
Flüssigkeiten, sowie deren Herstellung sind aus dem Stand
der Technik bekannt. Es wird z. B. auf den in der
Als ionische Flüssigkeiten können solche eingesetzt werden, deren Kationen aus der Gruppe bestehend aus Imidazol-, Pyridin-, Pyrrolidinium-, Ammonium-, Phosphonium-, und Sulfonium-basierten Kationen ausgewählt werden.When ionic liquids can be used whose cations are selected from the group consisting of imidazole, pyridine, Pyrrolidinium, ammonium, phosphonium, and sulfonium based Cations are selected.
Gleichfalls können die die Anionen der verwendeten ionischen Flüssigkeiten aus der Gruppe bestehend aus Organosulfaten, Organophosphaten, Halogenen und Bortetrafluorid ausgewählt werden.Likewise may be the anions of the ionic liquids used from the group consisting of organosulfates, organophosphates, halogens and boron tetrafluoride.
Dabei können die Kationen und Anionen beliebig miteinander kombiniert werden.there The cations and anions can be combined with each other in any way become.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geht man vorzugsweise so vor, daß man wäßrige Puffermedien verwendet, die durch Zugabe entsprechender Mengen an Puffersalzen zu destilliertem Wasser und Einstellung des pH-Wertes erhalten werden, und diese dann mit der entsprechenden Menge ionischer Flüssigkeit mischt.at the process according to the invention is preferably used so before that one aqueous buffer media used by adding appropriate amounts of buffer salts to obtain distilled water and adjust the pH, and then mix with the appropriate amount of ionic liquid.
Erfindungsgemäß könne die üblichen, dem Fachmann bekannten Pufferlösungen eingesetzt werde.According to the invention the usual, known in the art buffer solutions used.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung weisen einsetzbare Pufferlösungen einen pH-Bereich von 2 bis 10, bevorzugt 4 bis 9 und besonders bevorzugt von 5 bis 8 auf.In A variant of the present invention have usable buffer solutions a pH range of 2 to 10, preferably 4 to 9, and more preferably from 5 to 8 on.
Zum Einsatz können dabei insbesondere Natriumacetat und Phosphatpuffer kommen, die auf den gewünschten pH-Wert eingestellt werden.To the In particular sodium acetate and phosphate buffer can be used here come, which are adjusted to the desired pH.
Die Einstellung des pH-Wertes erfolgt in einer Variante durch Mischen von Lösungen der komplementären Verbindungen, z. B. Natriumacetat und Essigsäure oder Kaliumhydrogenphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat, in den gewünschten Konzentrationen.The The pH is adjusted in a variant by mixing of solutions of complementary compounds, z. For example, sodium acetate and acetic acid or potassium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate, in the desired concentrations.
In einer Variante kann auch die Lösung nur einer Verbindung durch starke Säuren oder Basen (Hcl, NaOH o. ä.) auf den richtigen pH-Wert eingestellt werden.In A variant can also be the solution of only one connection by strong acids or bases (Hcl, NaOH or similar) be adjusted to the correct pH.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bei Temperaturen durchgeführt, die für die verwendeten Katalysatoren, bevorzugt Biokatalysatoren, insbesondere Enzyme, vorteilhaft sind. Die Umsetzungen können im Rahmen der vorliegenden Erfindung zwischen 5 und 80°C, bevorzugt zwischen 10 und 60°C, besonders bevorzugt zwischen 20 und 40°C, durchgeführt werden.The inventive method is at temperatures carried out for the catalysts used, preferably biocatalysts, in particular enzymes, are advantageous. The reactions may be within the scope of the present invention between 5 and 80 ° C, preferably between 10 and 60 ° C, more preferably between 20 and 40 ° C performed become.
Es sind in Prinzip alle aus dem Stand der Technik für die Verwendung in elektroenzymatischen Verfahren bekannten elektrochemischen Apparturen und Elektroden geeignet.It are in principle all of the prior art for the Use in electroenzymatic processes known electrochemical Apartments and electrodes suitable.
Bezüglich
einer erfindungsgemäß bevorzugt einsetzbaren elektrochemischen
Zelle wird auf
Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbare Elektrodenmaterial kann aus Kohlefilz, Platin, Graphit, insbesondere Graphitvlies, bestehen.The usable in the method according to the invention Electrode material may be carbon felt, platinum, graphite, in particular Graphite fleece, exist.
Durch den Einsatz von Mediatoren (Redoxmediatoren) kann die Umsetzung beschleunigt bzw. erleichtert werden.By the use of mediators (redox mediators) can be the implementation be accelerated or facilitated.
Als Mediatoren können im Rahmen der vorliegenden Erfindung Übergansmetallkomplexe eingesetzt werden.When Mediators in the context of the present invention may be transition metal complexes be used.
Bevorzugt werden Ferrocencarbonsäure, insbesondere für die Regenerirung von FAD/FADH2 in Oxidasen oder Rhodium-Komplexe, hier bevorzugt cp·Rh(bpy)Cl, insbesondere für die Regenerierung von NAD(P)(NAD(P)H z. B. für Alkoholdehydrogenasen oder Monooxygenasen.Prefers be ferrocene carboxylic acid, in particular for the Regeneration of FAD / FADH2 in oxidases or rhodium complexes, here preferably cp · Rh (bpy) Cl, especially for regeneration of NAD (P) (NAD (P) H for example for alcohol dehydrogenases or Monooxygenases.
Weitere geeignete Übergangsmetallkomplexe sind den Fachmann geläufig und können von diesem je nach Bedarf ausgewählt werden.Further Suitable transition metal complexes are familiar to the person skilled in the art and can be selected from this as needed become.
Dabei ist es möglich, diese Mediatoren mit Polymeren zu modifizieren, diese also an Polymeren zu immobilisieren. Durch die Modifizierung wird zum einen deren Abtrennung erleichtert und zum anderen ist über die Modifizierung deren Löslichkeit in dem Reaktionsmedium steuerbar.there is it possible to modify these mediators with polymers, to immobilize them on polymers. By the modification on the one hand facilitates their separation and on the other hand is about the Modify their solubility in the reaction medium controllable.
Die Mediatoren können im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere mit Polyalkylenglykolen, bevorzugt Poylethylenglykolen, Polyvinylpyrrolidonen, Polyvinylacetalen und Polyurethanen modifiziert sein.The Mediators can be used in the context of the present invention in particular with polyalkylene glycols, preferably polyethylene glycols, Polyvinylpyrrolidones, polyvinyl acetals and polyurethanes modified be.
Dies kann z. B. durch Copolymerisation mit den jeweiligen Monomeren oder durch Pfropfung auf die jeweiligen Polymere nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden erfolgen.This can z. B. by copolymerization with the respective monomers or by grafting to the respective polymers according to the person skilled in general done with known methods.
Das Reaktionsmedium der vorliegenden Erfindung kann insbesondere neben der ionischen Flüssigkeit noch Wasser und gegebenenfalls weiter organische Lösungsmittel enthalten.The Reaction medium of the present invention can be particularly adjacent the ionic liquid still water and optionally further contain organic solvents.
Die zusätzlichen einsetzbaren organischen Lösungsmittel sind wassermischbar. Beispiele sind Aceton, Glykol, Glyzerin, Methanol, Ethanol, die verschiedenen Propanole, die verschiedenen Butanole.The additional usable organic solvent are water miscible. Examples are acetone, glycol, glycerine, methanol, Ethanol, the different propanols, the different butanols.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Ils Wasserlöslich bzw. wassermischbar.In an embodiment of the present invention are the Ils Water-soluble or water-miscible.
Erfindungsgemäß ist es dabei bevorzugt, wenn das Reaktionsmedium aus
- a) 0,3 bis 55, bevorzugt 0,5 bis 20, insbesondere 2 bis 10 Vol.-% ionischer Flüssigkeit,
- b) 0 bis 99,7, bevorzugt 0,5 bis 20, insbesondere bevorzugt 2 bis 10 Vol.-% Wasser,
- c) 0 bis 99,7, bevorzugt 0,5 bis 20, insbesondere bevorzugt 2 bis 10 Vol.-% organischem Lösungsmittel,
- d) 0 bis 99,7, bevorzugt 0,5 bis 20, insbesondere bevorzugt 2 bis 10 Vol.-% Pufferlösung, und
- e) 0 bis 99,7, bevorzugt 0,5 bis 20, insbesondere bevorzugt 2 bis 10 Vol.-% weiteren üblichen Additiven
- a) from 0.3 to 55, preferably from 0.5 to 20, in particular from 2 to 10,% by volume of ionic liquid,
- b) 0 to 99.7, preferably 0.5 to 20, particularly preferably 2 to 10,% by volume of water,
- c) 0 to 99.7, preferably 0.5 to 20, particularly preferably 2 to 10, vol.% of organic solvent,
- d) 0 to 99.7, preferably 0.5 to 20, particularly preferably 2 to 10 vol .-% buffer solution, and
- e) 0 to 99.7, preferably 0.5 to 20, particularly preferably 2 to 10,% by volume of further customary additives
Als Additive können die üblichen, dem Fachmann bekannten Additive eingesetzt werden. Beispiele für einsetzbare Additive sind Stoffe ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Salzen, die nicht unter die Definition der ionischen Flüssigkeiten fallen, Mediatoren, Hilfsmittel zur Enzymstabilisierung z. B. Harze, Ionentauscher zur Immbilisierung, und Mischungen dieser Stoffe.When Additives can be the customary ones known to the person skilled in the art Additives are used. Examples of usable additives are substances selected from the group consisting of salts, the not under the definition of ionic liquids fall, mediators, enzyme stabilization aids, for. Resins, Ion exchanger for imbibition, and mixtures of these substances.
In einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Variante besteht das Reaktionsmedium aus 2 bis 10 Vol.-% ionischer Flüssigkeit und 90 bis 98 Vol.-% Wasser inklusive Puffersubstanz.In a particularly preferred variant according to the invention If the reaction medium consists of 2 to 10 vol .-% of ionic liquid and 90 to 98% by volume of water including buffer substance.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung werden die IL's in einer Menge ausgewählt aus der Gruppe von 2, 4, 6, 8, 10 Vol.-% eingesetzt.In In a variant of the present invention, the ILs are in one Quantity selected from the group of 2, 4, 6, 8, 10 vol.% used.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren durchgeführt bei Leitfähigkeiten von Mischungen aus Puffer und IL ausgesucht aus der Gruppe der Intervalle bestehend aus 16 bis 23 mS/cm, 17 bis 27 mS/cm, 18 bis 32 mS/cm, 19 bis 37 mS/cm, 20 bis 40 mS/cm.In In a variant of the present invention, the method is carried out at conductivities of mixtures of buffer and IL from the group of intervals consisting of 16 to 23 mS / cm, 17 to 27 mS / cm, 18 to 32 mS / cm, 19 to 37 mS / cm, 20 to 40 mS / cm.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren durchgeführt bei Leitfähigkeiten von beliebigen Mischungen aus Puffer, Enzym, Substrat, Mediator und IL, mit der Maßgabe, daß Puffer und IL immer zugegen sind, ausgesucht aus der Gruppe der Intervalle bestehend aus 10 bis 23 mS/cm, 10 bis 27 mS/cm, 10 bis 32 mS/cm, 10 bis 37 mS/cm, 10 bis 40 mS/cm.In In a variant of the present invention, the method is carried out at conductivities of any mixtures of buffers, Enzyme, substrate, mediator and IL, with the proviso that buffer and IL are always present, chosen from the group of intervals consisting of 10 to 23 mS / cm, 10 to 27 mS / cm, 10 to 32 mS / cm, 10 to 37 mS / cm, 10 to 40 mS / cm.
Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung kann kontinuierlich durchgeführt werden, d. h. Substrat wird immer weiter nachdosiert und das entstehende Produkt aus dem Reaktionsgefäß entfernt.The Process according to the invention can be continuous be carried out, d. H. Substrate is dosed further and further and the resulting product removed from the reaction vessel.
Vorteil der kontinuierlichen Verfahrensführung ist es, daß die Verweilzeit des Substrates präzise gesteuert werden kann, wodurch es möglich ist, gezielt auf Zwischenprodukte der enzymatischen Reaktion zuzugreifen. Es ist damit möglich, gezielt langsamere Konkurrenz-Reaktionen zu unterdrücken, oder zu verstärken, je nachdem welches Produkt gewünscht ist.advantage The continuous process is that the Residence time of the substrate can be controlled precisely which makes it possible to target intermediates of the to access enzymatic reaction. It is thus possible specifically to suppress slower competition reactions, or to reinforce, depending on which product desired is.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt die in der folgenden Tabelle 1 angeführten ionischen Flüssigkeiten eingesetzt.in the Within the scope of the present invention, the following are preferred Table 1 listed ionic liquids used.
Erfindungsgemäß sind Ausführungsformen die ionischen Flüssigkeiten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MMIM MeSO4, MMIM Me2PO4, BMIM MwSO4, EMIM EtSO4, EMIM MDEGSO4, EMPY EtSO4, BMIM MDEGSO4, BMIM BF4, EMIM Et2PO4, OMIM Br, HMIM Br und Gemischen davon.According to the invention, embodiments of the ionic liquids are selected from the group consisting of MMIM MeSO 4 , MMIM Me 2 PO 4 , BMIM MwSO 4 , EMIM EtSO 4 , EMIM MDEGSO 4 , EMPY EtSO 4 , BMIM MDEGSO 4 , BMIM BF 4 , EMIM Et 2 PO 4 , OMIM Br, HMIM Br and mixtures thereof.
Weitere
erfindungsgemäße Ausführungsformen sind
dabei die folgenden:
Der Einsatz von Oxidoreduktasen mit Sulfiden,
Ketonen oder Aminosäuren als Substrat und unter Verwendung eines
Reaktionsmediums enthaltend 0,5 bis 20 Vol.-% einer wassermischbaren
ionischen Flüssigkeit.
Der Einsatz von Chloroperoxidase
(CPO) mit Thioanisol als Substrat und unter Verwendung eines Reaktionsmediums
enthaltend 2 Vol.-% EMIM EtSO4.
Der
Einsatz von Aminosäureoxidase mit Methionin als Substrat
und unter Verwendung eines Reaktionsmediums enthaltend 2 bis 10
Vol.-% MMIM Me2PO4.
Die
Verwendung eines Rhodium-Komplexes in einem Reaktionsmedium enthaltend
0,5 bis 10 Vol.-% EMPy EtSO4.Further embodiments according to the invention are the following:
The use of oxidoreductases with sulfides, ketones or amino acids as substrate and using a reaction medium containing 0.5 to 20 vol .-% of a water-miscible ionic liquid.
The use of chloroperoxidase (CPO) with thioanisole as substrate and using a reaction medium containing 2% by volume of EMIM EtSO 4 .
The use of amino acid oxidase with methionine as a substrate and using a Reaktionsmedi containing from 2 to 10% by volume of MMIM Me 2 PO 4 .
The use of a rhodium complex in a reaction medium containing 0.5 to 10% by volume of EMPy EtSO 4 .
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschend gefunden, daß es möglich ist, durch Zusatz geringer Mengen an ionischen Flüssigkeiten, insbesondere 2 bis 10 Vol.-%, zu einem wäßrigen Medium die Leitfähigkeit des resultierenden Gemisches erheblich zu steigern, wobei aber in diesem Bereich die Aktivität der Enzyme gleichzeitig nicht oder nur geringfügig herab gesetzt wird.in the Within the scope of the present invention, it has surprisingly been found that it is possible by adding small amounts of ionic liquids, in particular 2 to 10% by volume, to an aqueous medium, the conductivity considerably increase the resulting mixture, but in At the same time the activity of the enzymes does not affect this area or only slightly lowered.
Die verschiedenen Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung, z. B. diejenigen der verschiedenen abhängigen Ansprüche, können dabei in beliebiger Art und Weise miteinander kombiniert werden.The various embodiments of the present invention, for. B. those of the various dependent claims, can be combined with each other in any way become.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden nicht-limitierenden Beispiele erläutert.The Invention will now be described with reference to the following non-limiting examples explained.
Beispiele:Examples:
Exemplarisch für die vorliegende Erfindung wurden drei verschiedene Prozesse untersucht:exemplary for the present invention were three different Investigated processes:
1. Chloroperoxidase katalysierte Oxidation von Sulfiden1. Chloroperoxidase catalyzed oxidation of sulphides
Das Enzym Chloroperoxidase ist in der Lage verschiedenste organische Sulfide enantioselektiv zu oxidieren. Dabei benötigt es Peroxide als Oxidationsmittel. Da bekannt ist, dass das Oxidationsmittel das Enzym gleichzeitig inhibiert, müssen zu hohe Peroxidkonzentrationen vermieden werden. Deshalb wurde hier die elektrochemische Umsetzung von Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid zur in situ Generierung des Oxidationsmittels gewählt. Als Substrat wurde Thioanisol verwendet.The Enzyme Chloroperoxidase is capable of diverse organic Oxidize sulfides enantioselectively. It needs it Peroxides as oxidizing agent. Since it is known that the oxidizing agent The enzyme inhibits the same time, too high peroxide concentrations be avoided. Therefore, here was the electrochemical reaction from oxygen to hydrogen peroxide for in situ generation of the Oxidizing agent selected. The substrate was thioanisole used.
2. Aminosäureoxidase katalysierte Spaltung von Aminosäureracematen2. Catalyzed amino acid oxidase Cleavage of amino acid residues
Ein Aminosäureracemat kann durch eine D- oder L-selektive Aminosäureoxidase gespalten werden. Dabei oxidiert das Enzym selektiv die D- oder die L-Form der Aminosäure, während die andere Form in Lösung verbleibt. Während der Reaktion wird der am Enzym gebundene Cofaktor FAD verbraucht und muss regeneriert werden. In unseren Reaktionen erfolgte die Regenerierung elektrochemisch über Ferrocencarbonsäure. Als Substrat wurde DL-Methionin verwendet.One Amino acid racemate can be produced by a D- or L-selective amino acid oxidase be split. The enzyme selectively oxidizes the D- or the L-form of the amino acid while the other Form remains in solution. During the reaction the enzyme-bound cofactor FAD is consumed and needs to be regenerated become. In our reactions, the regeneration was carried out electrochemically over Ferrocene. The substrate used was DL-methionine.
3. Alkohldehydrogenase katalysierte Synthese chiraler Alkohole3. Alkohydrogenase catalyzed synthesis chiral alcohols
Alkoholdehydrogenasen katalysieren die reduktive Synthese chiraler Alkohole ausgehend von prochiralen Ketonen. Dazu benötigen sie den Cofaktor NAD(P)H. Da dieser Cofaktor sehr teuer ist, muss er während der Reaktion regeneriert werden. In unseren Reaktionen erfolgte die Regenerierung elektrochemisch über (2,2'-Bipyridin)(pentamethylcyclopentadienyl)rhodium(III)-Komplexe (Rhbpy). Als Substrat wurde Acetophenon verwendet.alcohol dehydrogenases catalyze the reductive synthesis of chiral alcohols of prochiral ketones. For this they need the cofactor NAD (P) H. Since this cofactor is very expensive, it must be during the Reaction be regenerated. In our reactions, the Regeneration electrochemically via (2,2'-bipyridine) (pentamethylcyclopentadienyl) rhodium (III) complexes (Rhbpy). The substrate used was acetophenone.
Für die einzelnen Reaktionssysteme wurden zunächst Einflüsse auf die Enzymaktivität und -stabilität, sowie Substratlöslichkeit und Leitfähigkeit studiert. Für erste Versuche wurden jeweils 12 verschiedene ionischen Flüssigkeiten getestet (siehe Tabelle 1). Abschließend wurden Synthesen in einem Satzreaktor durchgeführt und zu Vergleichszwecken die wichtigsten Prozesskennzahlen ermittelt.For The individual reaction systems were initially influences on enzyme activity and stability, as well Substrate solubility and conductivity studied. For first experiments each 12 different ionic Liquids tested (see Table 1). Finally syntheses were carried out in a batch reactor and For comparison purposes, the most important process key figures are determined.
Anschließend wurden Synthesen in einem Satzreaktor durchgeführt. Das verwendete Reaktionsgefäß setzte sich aus folgenden Teilen zusammen:
- • Temperierbares Glasgefäß mit Doppelwand
- • Temperiereinheit (Wasserbad)
- • Potentiosat
- • Magnetrührer
- • Zylindrisches Stahlgestell mit Kohlefilz als Arbeitselektrode
- • Platingegenelektrode
- • Referenzelektrode
- • Probenahmevorrichtung
- • Begasungsvorrichtung (je nach Bedarf O2 oder Ar)
- • Temperable glass vessel with double wall
- • tempering unit (water bath)
- • Potentiosate
- • magnetic stirrer
- • Cylindrical steel frame with carbon felt as working electrode
- • Platinum counter electrode
- • Reference electrode
- • Sampling device
- Fumigation device (as required O 2 or Ar)
1. Chloroperoxidase katalysierte Oxidation von Sulfiden1. Chloroperoxidase catalyzed oxidation of sulphides
Aktivitätactivity
Die Aktivität in reiner Pufferlösung betrug ~4,21 kUml–1 Enzymlösung. Als Aktivitätsassay wurde die Oxidation von Thionanisol zu (R)-Phenylmethylsulfoxid photometrisch untersucht. Die Enzymaktivität wurde durch die Aufnahme der Absorption bei einer Wellenlänge von 284 nm über einen Reaktionszeitraum von einer Minute ermittelt. Ein 100 mM Natriumacetatpuffer pH 5 wurde verwendet. Vor der Messung werden die Thioanisollösung (2 mmol/l, 980 μl) und eine H2O2-Lösung (200 mmol/l, 10 μl) gemischt und anschließend für fünf Minuten bei 25°C inkubiert. Mit Zugabe der Enzymlösung (10 μl) wurde die Reaktion gestartet.The activity in pure buffer solution was ~ 4.21 kUml- 1 enzyme solution. As an activity assay, the oxidation of thionanisole to (R) -phenylmethylsulfoxide was investigated photometrically. The enzyme activity was determined by recording the absorbance at a wavelength of 284 nm over a reaction period of one minute. A 100 mM sodium acetate buffer pH 5 was used. Before the measurement, the thioanisole solution (2 mmol / l, 980 μl) and a H 2 O 2 solution (200 mmol / l, 10 μl) are mixed and then incubated for five minutes at 25 ° C. With the addition of the enzyme solution (10 ul), the reaction was started.
Es
zeigt:
Das
Enzym war in der Gegenwart geringer Mengen (bis 10 Vol.-%) einer
sehr großen Breite an verschiedensten ionischen Flüssigkeiten – überraschenderweise
auch in MMIM MeSO4, einer ionischen Flüssigkeit
in der laut
Stabilitätstability
Die Halbwertszeit in reiner Pufferlösung betrug 44,9 Tage. Zur Bestimmung der Stabilität wurde das Enzym in den IL-Puffermischungen bei 25°C gelagert und anschließend mit dem Aktivitätsassay (siehe oben Aktivität) vermessen.The Half life in pure buffer solution was 44.9 days. To determine stability, the enzyme was in the IL buffer mixtures stored at 25 ° C and then with the activity assay (see activity above).
Es
zeigt:
Es zeigte sich für alle untersuchten ionischen Flüssigkeiten – bis auf IL 5 (EMIM Et2PO4) – eine Zunahme der Halbwertszeit mit steigendem Anteil an IL. Für IL 5 ergab sich eine drastische Steigerung der Stabilität in Gegenwart geringer Mengen ionischer Flüssigkeit; für 2 Vol.-% wurde eine Halbwertszeit > 200 Stunden ermittelt.For all investigated ionic liquids - with the exception of IL 5 (EMIM Et 2 PO 4 ) - an increase in the half-life with an increasing proportion of IL was found. For IL 5, there was a dramatic increase in stability in the presence of small amounts of ionic liquid; for 2% by volume, a half-life of> 200 hours was determined.
Unerwarteterweise scheinen bei richtiger Dosierung alle untersuchten ionischen Flüssigkeiten einen positiven Einfluss auf die Stabilität des Enzyms zu haben.unexpectedly with proper dosing, all the ionic liquids studied appear to be a positive influence on the stability of the enzyme to have.
Substratlöslichkeitsubstrate solubility
Für diese Untersuchung wurden bis zu 50 Vol.-% untersucht, um die Lösungsvermittlung deutlicher zu sehen. Unter den gewählten Reaktionsbedingungen wurde in Puffer eine Maximallöslichkeit von 3,8 mmol pro Liter ermittelt. Zur Ermittlung der maximalen Löslichkeiten wurde Thioanisol zu den IL-Puffermischungen zugegeben und diese für 24 Stunden bei 25°C gelagert. Überschüssiges Thioanisol wurde abgetrennt und die wässrige IL- Phase gaschromatographisch analysiert.For this study was studied up to 50 vol% to solubilize to see more clearly. Under the selected reaction conditions was in buffer a maximum solubility of 3.8 mmol per liter determined. To determine the maximum solubilities was Thioanisole added to the IL buffer mixtures and this for Stored for 24 hours at 25 ° C. excess Thioanisole was separated and the aqueous IL phase gas chromatographed analyzed.
Es
zeigt:
In allen getesteten ionischen Flüssigkeiten nahm die Substratlöslichkeit deutlich zu. Allein die Zugabe von 5 Vol.-% der verschieden ILs erhöhte die Löslichkeit um mindestens 40% (IL 7; MMIM Me2PO4). Mit 5 Vol.-% IL 1 (BMIM MeSO4) konnte die Löslichkeit sogar verfünffacht werden.In all tested ionic liquids the substrate solubility increased significantly. Only the addition of 5% by volume of the different ILs increased the solubility by at least 40% (IL 7, MMIM Me 2 PO 4 ). With 5% by volume of IL 1 (BMIM MeSO 4 ) the solubility could even be quintupled.
Leitfähigkeitconductivity
Reiner Puffer weist eine Leitfähigkeit von 5,0 mScm–1 auf. Zur Ermittlung der Leitfähigkeit wurden die IL-Pufferlösungen mit den bei den Aktivitätsassays angegebenen Puffern hergestellt und mit einem Leitfähigkeitsmessgerät bei 25°C vermessen.Pure buffer has a conductivity of 5.0 mScm -1 . To determine the conductivity, the IL buffer solutions were prepared with the buffers indicated in the activity assays and measured with a conductivity meter at 25 ° C.
Es
zeigt:
Für alle ionischen Flüssigkeiten konnte eine Erhöhung der Leitfähigkeit festgestellt werden. Darüber hinaus verbesserten sich die Leitfähigkeiten selbst bei geringen Zusätzen an ionischer Flüssigkeit drastisch. Allein die Zugabe von 2 Vol.-% der verschieden ILs erhöhte die Leitfähigkeit um mindestens 50%.For All ionic liquids could increase the conductivity can be determined. Furthermore the conductivities improved even at low Additions of ionic liquid drastically. Alone the addition of 2% by volume of the different ILs increased the Conductivity by at least 50%.
Synthesensyntheses
Da der Einfluss der verschiedenen ionischen Flüssigkeiten auf die Leitfähigkeit des Reaktionsmediums schon bei sehr geringen Volumenanteilen an IL sehr ausgeprägt war, wurden Synthesen mit 2 Vol.-% IL durchgeführt und anschließend mit den Ergebnissen der Synthese in reinem Puffer verglichen.There the influence of different ionic liquids on the conductivity of the reaction medium already at very small volumes of IL were very pronounced Syntheses carried out with 2 vol .-% IL and then compared with the results of synthesis in pure buffer.
Als Reaktionsmedium wurden 300 ml 100 mM Natriumacetatpuffer pH 5 verwendet. Das Reaktionsmedium wurde auf 25°C temperiert und mit Sauerstoff begast. Da durch die Begasung das leicht flüchtige Substrat Thioanisol aus dem Reaktionsgemisch ausgetragen wurde, wurde alle 30 Minuten mit 6 mmol Thioanisol nachdosiert. Zum Starten der Reaktion wurde ein Potential von –650 mV vs Ag|AgCl angelegt. Nach bestimmten Zeitabständen wurden Proben entnommen und diese gaschromatographisch analysiert.When Reaction medium was used 300 ml of 100 mM sodium acetate buffer pH 5. The reaction medium was heated to 25 ° C and with oxygen fumigated. As a result of fumigation the volatile substrate Thioanisole was discharged from the reaction mixture was all Post-dosed with 6 mmol of thioanisole for 30 minutes. To start the reaction a potential of -650 mV vs Ag | AgCl was applied. To at specific intervals samples were taken and these analyzed by gas chromatography.
Es
zeigt:
Mit der elektroenzymatischen Synthese in reiner Pufferlösung konnte eine Produktivität von 17,9 g/Id mit einem ee von 97% und einer ttn von 3300 erreicht werden.
- (ttn = total turnover number = molProdukt/molKatalysator; gebildete Stoffmenge Produkt pro verbrauchter Stoffmenge Katalysator)
- (ttn = total turnover number = mol of product / mol of catalyst , amount of product produced per amount of catalyst consumed)
Als Reaktionsmedium wurden 294 ml 100 mM Natriumacetatpuffer pH 5 und 6 ml EMIM EtSO4 verwendet. Das Reaktionsmedium wurde auf 25°C temperiert und mit Sauerstoff begast. Da durch die Begasung das leicht flüchtige Substrat Thioanisol aus dem Reaktionsgemisch ausgetragen wurde, wurde alle 30 Minuten mit 6 mmol Thioanisol nachdosiert. Zum Starten der Reaktion wurde ein Potential von –650 mV vs Ag|AgCl angelegt. Nach bestimmten Zeitabständen wurden Proben entnommen und diese gaschromatographisch analysiert.The reaction medium used was 294 ml of 100 mM sodium acetate buffer pH 5 and 6 ml of EMIM EtSO 4 . The reaction medium was heated to 25 ° C and gassed with oxygen. Since the fumigant substrate thioanisole was discharged from the reaction mixture by the fumigation, was metered in every 30 minutes with 6 mmol of thioanisole. To start the reaction, a potential of -650 mV vs Ag | AgCl was applied. After certain time intervals, samples were taken and analyzed by gas chromatography.
Es
zeigt:
Durch die Zugabe von 2 Vol.-% EMIM EtSO4 konnte die Produktivität der Synthese auf 75,4 g/Id (ee 97%) gesteigert werden. Durch die verbesserten Reaktionsbedingungen konnte auch der Biokatalysator besser genutzt werden; für diese Reaktion konnte eine ttn von 123000 erreicht werden.The addition of 2% by volume of EMIM EtSO 4 increased the productivity of the synthesis to 75.4 g / l (ee 97%). The improved reaction conditions also made it possible to make better use of the biocatalyst; a ttn of 123000 could be achieved for this reaction.
In
der nachfolgenden Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Synthesen mit
den unterschiedlichen ionischen Flüssigkeiten dargestellt:
Es ist deutlich zu erkennen, dass mit Zugabe aller ionischen Flüssigkeiten bessere Ergebnisse für die Produktivitäten erzielt werden konnten.It It can be clearly seen that with the addition of all ionic liquids achieved better results for the productivities could become.
2. Aminosäureoxidase katalysierte Spaltung von Aminosäureracematen Aktivität2nd amino acid oxidase catalyzed cleavage of amino acid residues activity
Die Aktivität in reiner Pufferlösung betrug ~2,5 U pro mg Enzym. Als Aktivitätsassay wurde die Umsetzung von D-Alanin gekoppelt mit einem Peroxidaseassay untersucht. Während der aminosäurekatalysierten Reaktion wurde H2O2 gebildet, welches in einem zweiten Schritt zur Meerrettichperoxidase katalysierten Oxidation von o-Dianisidin verwendet wurde. Dabei färbte sich die Reaktionslösung rotbraun. Die Aminosäureoxidaseaktivität wurde durch Ermittlung der Absorption bei 436 nm während einer Reaktionszeit von einer Minute ermittelt. Als Puffer wurde 100 mM Phosphatpuffer pH 8 verwendet. Die benötigten Alanin und o-Dianisidinlösungen wurden vor dem Messen für 30 Minuten mit Sauerstoff begast und anschließend für fünf Minuten bei 25°C inkubiert. In einem 1 ml-Küvettenvolumen befanden sich 10 mmol/l DL-Alanin, 0.2 mg/ml o-Dianisidin·2HCl, Meerrettichperoxidase in ausreichendem Maße (die Meerrettichperoxidaseaktivität war immer um ein vielfaches höher als die der D-Aminosäureoxidase) und D-Aminosäureoxidase.The activity in pure buffer solution was ~ 2.5 U per mg enzyme. The activity assay investigated the reaction of D-alanine coupled with a peroxidase assay. During the amino acid-catalyzed reaction, H 2 O 2 was formed, which was used in a second step for the horseradish peroxidase-catalyzed oxidation of o-dianisidine. The reaction solution turned reddish brown. The amino acid oxidase activity was determined by measuring absorbance at 436 nm for one minute reaction time. The buffer used was 100 mM phosphate buffer pH 8. The required alanine and o-dianisidine solutions were gassed with oxygen for 30 minutes prior to measurement and then incubated for five minutes at 25 ° C. In a 1 ml cuvette volume were 10 mmol / l DL-alanine, 0.2 mg / ml o-dianisidine · 2HCl, horseradish peroxidase sufficiently (the horseradish peroxidase activity was always many times higher than that of D-amino acid oxidase) and D-amino acid oxidase ,
Es
zeigt:
Mit steigendem Anteil an IL nahm die Aktivität des Enzyms je nach IL unterschiedlich stark ab.With increasing level of IL decreased the activity of the enzyme ever different degrees according to IL.
Stabilitätstability
Die Halbwertszeit in reiner Pufferlösung betrug 44,4 Stunden. Zur Bestimmung der Stabilität wurde das Enzym in den IL-Puffermischungen bei 25°C gelagert und anschließend mit dem Aktivitätsassay (siehe oben zur Aktivität) vermessen.The Half life in pure buffer solution was 44.4 hours. To determine stability, the enzyme was in the IL buffer mixtures stored at 25 ° C and then with the activity assay (see above for activity).
Es
zeigt:
Das Enzym wurde in Gegenwart der ionischen Flüssigkeiten 1, 2 und 6 (EMIM Et2PO4, MMIM Me2PO4 und MMIM MeSO4) und mit steigendem Volumenanteil an IL stabiler. Bei einem Volumenanteil von 10% war die Halbwertszeit mehr als verdoppelt (für EMIM Et2PO4 ~260%; für MMIM Me2PO4 und für MMIM MwSO4 ~230%). In den ILs 3, 4 und 5 (BMIM MDEGSO4, EMIM MDEGSO4 und BMIM MeSO4) zeigte sich ein gegenläufiger Effekt; mit zunehmendem Anteil an IL wurde die Halbwertszeit reduziert.The enzyme became more stable in the presence of ionic liquids 1, 2 and 6 (EMIM Et 2 PO 4 , MMIM Me 2 PO 4 and MMIM MeSO 4 ) and with increasing volume fraction of IL. With a volume fraction of 10%, the half-life was more than doubled (for EMIM Et 2 PO 4 ~ 260%, for MMIM Me 2 PO 4 and for MMIM MwSO 4 ~ 230%). ILs 3, 4 and 5 (BMIM MDEGSO 4 , EMIM MDEGSO 4 and BMIM MeSO 4 ) showed an opposite effect; as the proportion of IL increased, the half-life was reduced.
Unter Berücksichtigung der Untersuchungen zur Enzymaktivität sind die ionischen Flüssigkeiten EMIM Et2PO4 und MMIM Me2PO4 für die Aminosäureoxidase von besonderem Interesse.Taking into account the enzyme activity studies, the ionic liquids EMIM Et 2 PO 4 and MMIM Me 2 PO 4 are of particular interest for the amino acid oxidase.
Substratlöslichkeitsubstrate solubility
Unter den gewählten Reaktionsbedingungen liegt die Löslichkeit für Methionin bei ~280 mmol/l und ist somit nicht limitierend.Under the chosen reaction conditions is the solubility for methionine at ~ 280 mmol / l and is therefore not limiting.
Leitfähigkeitconductivity
Reiner Puffer weist eine Leitfähigkeit von 16,2 mScm–1 auf. Zur Ermittlung der Leitfähigkeit wurden die IL-Pufferlösungen mit den bei den Aktivitäsassays angegebenen Puffern hergestellt und mit einem Leitfähigkeitsmessgerät bei 25°C vermessen.Pure buffer has a conductivity of 16.2 mScm -1 . To determine the conductivity, the IL buffer solutions were prepared with the buffers indicated in the activity assays and measured with a conductivity meter at 25 ° C.
Es
zeigt:
Für alle ionischen Flüssigkeiten konnte eine Erhöhung der Leitfähigkeit festgestellt werden. Darüber hinaus verbesserten sich die Leitfähigkeiten selbst bei geringen Zusätzen an ionischer Flüssigkeit.For All ionic liquids could increase the conductivity can be determined. Furthermore the conductivities improved even at low Additions of ionic liquid.
Synthesensyntheses
Unter Berücksichtigung der Voruntersuchungen, wurde die ionische Flüssigkeit MMIM Me2PO4 als vielversprechender Zusatz zum Reaktionsmedium identifiziert; die Aktivität des Biokatalysators war nur in verhältnismäßig geringem Maße beeinträchtigt, während die Stabilität und die Leitfähigkeit deutlich zunahm. Für dieses Reaktionssystem wurden Synthesen mit 2, 5 und 10 Vol.-% der ionischen Flüssigkeit durchgeführt und mit dem für reine Pufferlösung erzielten Ergebnis verglichen.Taking into account the preliminary investigations, the ionic liquid MMIM Me 2 PO 4 was identified as a promising addition to the reaction medium; the activity of the biocatalyst was affected only to a relatively small extent, while the stability and conductivity increased significantly. For this reaction system syntheses were carried out with 2, 5 and 10 vol .-% of the ionic liquid and with compared to the result obtained for pure buffer solution.
Als Reaktionsmedium wurden 300 ml 100 mM Phosphatpuffer pH 8 verwendet. Das Reaktionsmedium wurde mit Argon entgast und auf 25°C temperiert. Es lagen immer 0.5 mmol/l des Mediators Ferrocencarbonsäure und 0,5 Uml–1 an D-Aminosäureoxidase vor. Durch Anlegen eines Potential von 350 mV vs. Ag|AgCl wurde die Reaktion gestartet. Nach bestimmten Zeitabständen wurden Proben entnommen und diese mittels HPLC vermessen.The reaction medium used was 300 ml of 100 mM phosphate buffer pH 8. The reaction medium was degassed with argon and heated to 25 ° C. There was always 0.5 mmol / l of the mediator ferrocene carboxylic acid and 0.5 uml -1 of D-amino acid oxidase. By applying a potential of 350 mV vs. Ag | AgCl was started the reaction. After certain time intervals, samples were taken and these were measured by HPLC.
Es
zeigt:
In Puffer wurde eine Produktivität von 17,6 g/Id (ee 99,9) erreicht.In Buffer was a productivity of 17.6 g / Id (ee 99.9) reached.
Als Reaktionsmedium wurden 270 ml 100 mM Phosphatpuffer pH 8 und 30 ml MMIM Me2PO4 verwendet. Das Reaktionsmedium wurde mit Argon entgast und auf 25°C temperiert. Es lagen immer 0.5 mmol/l–1 des Mediators Ferrocencarbonsäure und 0,5 Uml–1 an D-Aminosäureoxidase vor. Durch Anlegen eines Potential von 350 mV vs. Ag|AgCl wurde die Reaktion gestartet. Nach bestimmten Zeitabständen wurden Proben entnommen und diese mittels HPLC vermessen.The reaction medium used was 270 ml of 100 mM phosphate buffer pH 8 and 30 ml of MMIM Me 2 PO 4 . The reaction medium was degassed with argon and heated to 25 ° C. There were still 0.5 mmol / l -1 of the mediator ferrocenecarboxylic acid and 0.5 Uml -1 to D-amino acid oxidase before. By applying a potential of 350 mV vs. Ag | AgCl was started the reaction. After certain time intervals, samples were taken and these were measured by HPLC.
Es
zeigt:
Durch die Zugabe von 10 Vol.-% MMIM Me2PO4 konnte die Produktivität der Synthese auf 27,1 g/Id (ee 99,9%) gesteigert werden.The addition of 10% by volume of MMIM Me 2 PO 4 increased the productivity of the synthesis to 27.1 g / d (ee 99.9%).
In
der nachfolgenden Tabelle 3 sind die Ergebnisse der Synthesen mit
den unterschiedlichen Volumenanteilen an MMIM Me2PO4 dargestellt:
Durch die Zudosierung an ionischer Flüssigkeit konnte die Produktivität deutlich gesteigert werden; in Gegenwart von 10 Vol.-% ionischer Flüssigkeit war eine Steigerung der Produktivität um mehr als 50% möglich.By the addition of ionic liquid could increase productivity be increased significantly; in the presence of 10% by volume of ionic Liquid was an increase in productivity more than 50% possible.
3. Alkoholdehydrogenase-katalysierte Synthese chiraler Alkohole3. Alcohol dehydrogenase-catalyzed synthesis chiral alcohols
Aktivitätactivity
Die Aktivität in reiner Pufferlösung betrug ~6,93 U pro mg Enzym. Als Aktivitätsassay wurde die Reduktion von Acetophenon zu 1-Phenylethanol untersucht. Die Enzymaktivität wurde durch Messung der Absorption bei 340 nm während einer Messzeit von einer Minute ermittelt. Es wurde ein 50 mM Phosphatpuffer pH 7 verwendet. In der Küvette wurden Acetophenonlösung (11 mmol/l–1, 970 μl) und NADPH-Lösung (10 mmol/l–1, 20 μl) gemischt und für fünf Minuten bei 25°C inkubiert. Durch die Zugabe von 10 μl Enzymlösung wurde die Reaktion gestartet.The activity in pure buffer solution was ~ 6.93 U per mg enzyme. The activity assay investigated the reduction of acetophenone to 1-phenylethanol. The enzyme activity was determined by measuring absorbance at 340 nm for a one-minute measurement time. A 50 mM phosphate buffer pH 7 was used. In the cuvette, acetophenone solution (11 mmol / l -1 , 970 μl) and NADPH solution (10 mmol / l -1 , 20 μl) were mixed and incubated for five minutes at 25 ° C. The reaction was started by adding 10 μl of enzyme solution.
Es
zeigt:
Das Enzym war in der Gegenwart geringer Mengen (bis 10 Vol.-%) verschiedenster ionischen Flüssigkeiten aktiv. Mit steigendem Anteil an IL nahm die Aktivität des Enzyms je nach IL unterschiedlich stark ab. Für die ILs 1 bis 3 (EMIM EtSO4; MMIM Me2PO4 und EMPy EtSO4) konnte bei geringer Zugabe (2 Vol.-%) eine leichte Aktivierung des Enzyms festgestellt werden.The enzyme was active in the presence of small amounts (up to 10% by volume) of a wide variety of ionic liquids. As the proportion of IL increased, the activity of the enzyme decreased with varying degrees depending on the IL. For ILs 1 to 3 (EMIM EtSO 4 , MMIM Me 2 PO 4 and EMPy EtSO 4 ) slight activation (2% v / v) revealed slight activation of the enzyme.
Stabilitätstability
Die Halbwertszeit in reiner Pufferlösung betrug 40,1 Stunden. Zur Bestimmung der Stabilität wurde das Enzym in den IL-Puffermischungen bei 25°C gelagert und anschließend mit dem Aktivitätsassay (siehe oben zur Aktivität) vermessen.The Half life in pure buffer solution was 40.1 hours. To determine stability, the enzyme was in the IL buffer mixtures stored at 25 ° C and then with the activity assay (see above for activity).
Es
zeigt:
Auch dieses Enzym konnte durch richtige IL-Zugabe stabilisiert werden. Lediglich 2 ILs (IL2 und IL 6) führten zu einer Herabsetzung der Halbwertszeit. In Gegenwart der ILs 4 und 5 nahm die Stabilität mit steigendem Volumenanteil an IL ab; dabei war die Halbwertszeit des Enzyms bei 10 Vol.-% von IL 4 jedoch immer noch doppelt so hoch wie die Halbwertszeit in reinem Puffer. Für IL 1 und IL 9 zeigte sich für alle Messungen ungefähr eine Verdopplung der Halbwertszeit und in den ILs 3, 7 und 8 nahm die Halbwertszeit mit wachsendem Anteil an IL stetig zu. Für 10 Vol.-% IL 3 oder IL 8 konnte eine Zunahme der Halbwertszeit auf > 350% festgestellt werden.This enzyme could also be stabilized by correct addition of IL. Only 2 ILs (IL2 and IL6) led to a reduction in the half-life. In the presence of ILs 4 and 5, stability decreased with increasing volume fraction of IL; however, the half-life of the enzyme at 10% by volume of IL 4 was still twice as high as the half-life in pure buffer. For IL 1 and IL 9 showed up for all measurements approximately doubling the half-life and in ILs 3, 7 and 8, the half-life increased steadily as the proportion of IL increased. For 10% by volume of IL 3 or IL 8, an increase in the half-life to> 350% was found.
Substratlöslichkeitsubstrate solubility
Die Löslichkeit in reiner Pufferlösung betrug ~25 mmol pro Liter. Zur Ermittlung der maximalen Löslichkeiten wurde Acetophenon zu den IL-Puffermischungen zugegeben und diese für 24 Stunden bei 25°C gelagert. Überschüssiges Acetophenon wurde abgetrennt und die wässrige IL-Phase gaschromatographisch analysiert.The Solubility in pure buffer solution was ~ 25 mmol per liter. To determine the maximum solubilities acetophenone was added to the IL buffer mixes and these stored for 24 hours at 25 ° C. excess Acetophenone was separated and the aqueous IL phase analyzed by gas chromatography.
Es
zeigt:
Alle untersuchten ionischen Flüssigkeiten trugen zur Erhöhung der Substratlöslichkeit bei. Selbst die geringen Volumenanteile von < 8 Vol.-% erhöhten die Löslichkeit schon merklich; z. B. war durch die Zugabe von 8 Vol.-% der ionischen Flüssigkeit 3 (EMPy EtSO4) eine Steigerung der Löslichkeit um fast 90% möglich.All of the ionic liquids studied contributed to increasing substrate solubility. Even the small volume fractions of <8% by volume increased the solubility noticeably; z. For example, by adding 8% by volume of the ionic liquid 3 (EMPy EtSO 4 ), an increase in solubility of almost 90% was possible.
Leitfähigkeitconductivity
Reiner Puffer weist eine Leitfähigkeit von 7,3 mScm–1 auf. Zur Ermittlung der Leitfähigkeit wurden die IL-Pufferlösungen mit den bei den Aktivitäsassays angegebenen Puffern hergestellt und mit einem Leitfähigkeitsmessgerät bei 25°C vermessen.Pure buffer has a conductivity of 7.3 mScm -1 . To determine the conductivity, the IL buffer solutions were prepared with the buffers indicated in the activity assays and measured with a conductivity meter at 25 ° C.
Es
zeigt:
Für alle ionischen Flüssigkeiten konnte eine Erhöhung der Leitfähigkeit festgestellt werden. Darüber hinaus verbesserten sich die Leitfähigkeiten selbst bei geringen Zusätzen an ionischer Flüssigkeit drastisch. Allein die Zugabe von 2 Vol.-% der verschieden ILs erhöhte die Leitfähigkeit um mindestens 20%.For All ionic liquids could increase the conductivity can be determined. Furthermore the conductivities improved even at low Additions of ionic liquid drastically. Alone the addition of 2% by volume of the different ILs increased the Conductivity by at least 20%.
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