GEBIET DER ERFINDUNGFIELD OF THE INVENTION
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen einer
Biosensoranordnung für
die amperometrische und/oder potentiometrische pharmakologische
Wirkort- und/oder Wirkstofftestung. Die vorliegende Erfindung betrifft
ferner eine Biosensoranordnung für
die amperometrische und/oder potentiometrische pharmakologische
Wirkort- und/oder Wirkstofftestung selbst sowie eine Vorrichtung
zum Herstellen einer Biosensoranordnung für die amperometrische und/oder
potentiometrische pharmakologische Wirkort- und/oder Wirkstofftestung.The
The present invention relates to a method for producing a
Biosensor arrangement for
the amperometric and / or potentiometric pharmacological
Site and / or drug testing. The present invention relates
a biosensor arrangement for
the amperometric and / or potentiometric pharmacological
Wirkort- and / or drug testing itself and a device
for producing a biosensor arrangement for the amperometric and / or
potentiometric pharmacological Wirkort- and / or drug testing.
HINTERGRUND DER ERFINDUNGBACKGROUND OF THE INVENTION
Bei
vielen Biosensoranordnungen, die auf dem Prinzip der kapazitiven
Kopplung beruhen, wird die kapazitive Kopplung zwischen einer Elektrode
eines Sekundärträgers an
zu untersuchende Primärträger dadurch
bewerkstelligt, dass die Primärträger in mechanischen
Kontakt gebracht werden mit dem Sekundärträger, und zwar in der Hoffnung,
dass sich dabei durch einen wie auch immer gearteten Anlagerungsprozess
im Sinne z. B. einer Adsorption ausreichend viele Primärträger ausreichend
innig und fest, also stabil elektrisch kapazitiv an die Elektrode
ankoppeln, so dass auch nach Beendigung des Anlagerungsprozesses
ausreichend viele Primärträger in diesem
Zustand verbleiben und sich somit, vermittelt durch die kapazitive
Kopplung, im Rahmen eines elektrischen Nachweises ausreichend starke
Signalamplituden im Sinne eines günstigen Signal-zu-Rauschverhältnisses
einstellen.at
many biosensor arrangements based on the principle of capacitive
Coupling, the capacitive coupling between an electrode
of a secondary carrier
thereby to be examined primary carrier
accomplished that the primary carrier in mechanical
Be contacted with the secondary carrier, in the hope
that thereby by a kind of appendage process
in the sense z. As adsorption sufficient primary carrier sufficient
intimately and firmly, so stable electrically capacitive to the electrode
dock, so even after completion of the attachment process
enough primary carrier in this
Condition remain and thus, mediated by the capacitive
Coupling, in the context of electrical detection sufficiently strong
Signal amplitudes in the sense of a favorable signal-to-noise ratio
to adjust.
In
der Praxis zeigt sich jedoch, dass das Signal-zu-Rauschverhältnis häufig ungünstig ist,
so dass für
eine quantitative Analyse eine Vielzahl Signale mit hohem Aufwand
unter gleichen Bedingungen aufgenommen und gemittelt werden müssen, so dass
einer analytischen Untersuchung dann das gemittelte Signal mit einem
künstlich
verbesserten Signal-zu-Rauschverhältnis zugeführt wird.In
In practice, however, the signal-to-noise ratio is often unfavorable.
so for
a quantitative analysis a large number of signals at great expense
must be recorded and averaged under the same conditions, so that
an analytical examination then the averaged signal with a
artificially
improved signal-to-noise ratio is supplied.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGSUMMARY OF THE INVENTION
Der
Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zum Herstellen
einer Biosensoranordnung und eine Biosensoranordnung selbst zu schaffen,
so dass sich im Endergebnis ein gegenüber dem herkömmlichen
Vorgehen verbessertes Signal-zu-Rauschverhältnis im Verwendungsfall der
Biosensoranordnung einstellt, ohne dass der präparative Aufwand beim Herstellen
oder die strukturelle Komplexität
der Biosensoranordnung selbst gesteigert werden.Of the
The invention is based on the object, a method for manufacturing
to create a biosensor arrangement and a biosensor arrangement itself,
so that in the end result one over the conventional one
Procedure improved signal-to-noise ratio in the case of use of
Biosensoranordnung adjusts, without the preparative effort in manufacturing
or the structural complexity
the biosensor arrangement itself be increased.
Die
der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe wird bei einem Verfahren
zum Herstellen einer Biosensoranordnung erfindungsgemäß mit den
Merkmalen des unabhängigen
Patentanspruchs 1 gelöst. Ferner
wird die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe auch bei einer
Biosensoranordnung mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche 48 und
49 und bei einer Vorrichtung zum Herstellen einer Biosensoranordnung
mit den Merkmalen des unabhängigen
Patentanspruchs 51 gelöst.The
The object underlying the invention is in a method
for producing a biosensor arrangement according to the invention with the
Characteristics of the independent
Patent claim 1 solved. Further
The object of the invention is based also in a
Biosensor arrangement with the features of independent claims 48 and
49 and in a device for producing a biosensor arrangement
with the characteristics of the independent
Claim 51 solved.
Die
vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zum Herstellen einer
Biosensoranordnung für
die amperometrische und/oder potentiometrische pharmakologische
Wirkort- und/oder Wirkstofftestung, bei welchem eine Mehrzahl zu
einer elektrischen Aktion aktivierbarer biologischer Einheiten aufweisende
Primärträger in elektrisch
kapazitive Kopplung zu einer elektrisch leitfähigen Elektrode eines Sekundärträgers gebracht
werden, wobei ein Isolationsbereich ausgebildet wird, durch welchen
die Elektrode elektrisch isoliert wird von den Primärträgern und/oder
im Betrieb von einem Messmedium, bei welchem die elektrisch kapazitive
Kopplung ausgebildet wird, indem in einem Schritt (A) zumindest
ein Oberflächenbereich
des Sekundärträgers mit
einer Primärträger aufweisenden
Lösung
oder Suspension in mechanischen Kontakt gebracht wird und bei welchem
in einem Schritt (B) zumindest der Sekundärträger für eine bestimmte Inkubationszeitspanne
einer bestimmten Kraft ausgesetzt wird, die mindestens eine Komponente
senkrecht zu einem Teil des Oberflächenbereichs des Sekundärträgers besitzt.The
The present invention provides a method for manufacturing a
Biosensor arrangement for
the amperometric and / or potentiometric pharmacological
Wirkort- and / or drug testing, in which a plurality of
having an electrical action of activatable biological units
Primary carrier in electrical
capacitive coupling brought to an electrically conductive electrode of a secondary carrier
be formed, wherein an isolation region is formed, through which
the electrode is electrically isolated from the primary carriers and / or
in the operation of a measuring medium, wherein the electrically capacitive
Coupling is formed by at least in a step (A)
a surface area
of the secondary carrier with
a primary carrier having
solution
or suspension is brought into mechanical contact and in which
in a step (B) at least the secondary carrier for a certain incubation period
a certain force is exposed to at least one component
perpendicular to a part of the surface area of the secondary carrier has.
Die
erfindungsgemäße Biosensoranordnung für die amperometrische
und/oder potentiometrische pharmakologische Wirkort- und/oder Wirkstofftestung
weist eine Mehrzahl zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische
Einheiten aufweisende Primärträger in elektrisch
kapazitiver Kopplung zu einer elektrisch leitfähigen Elektrode eines Sekundärträgers auf
und ist gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
zum Herstellen der Biosensoranordnung ausgebildet.The
Biosensor arrangement according to the invention for the amperometric
and / or potentiometric pharmacological Wirkort- and / or drug testing
has a plurality of bioactivatable to an electrical action
Units having primary carriers in electrical
capacitive coupling to an electrically conductive electrode of a secondary carrier
and is according to the method of the invention
designed for producing the biosensor arrangement.
Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
zum Herstellen einer Biosensoranordnung für die amperometrische und/oder
potentiometrische pharmakologische Wirkort- und/oder Wirkstofftestung ist ausgebildet
und weist Einrichtungen auf zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
zum Herstellen einer Biosen soranordnung für die amperometrische und/oder
potentiometrische pharmakologische Wirkort- und/oder Wirkstofftestung.The
inventive device
for producing a biosensor arrangement for the amperometric and / or
potentiometric pharmacological Wirkort- and / or drug testing is formed
and has means for carrying out the method according to the invention
for producing a Biosen soranordnung for the amperometric and / or
potentiometric pharmacological Wirkort- and / or drug testing.
Diese
und weitere Aspekte werden auf der Grundlage der beigefügten schematischen
Zeichnungen erläutert.These
and further aspects are based on the attached schematic
Drawings explained.
KURZBERSCHREIBUNG DER FIGURENBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
1A, 1B sind
schematische und geschnittene Seitenansichten, die Detailaspekte
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zum Herstellen einer Biosensoranordnung und einer Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
zum Durchführen des
erfindungsgemäßen Verfahrens
in schematischer und geschnittener Seitenansicht zeigen. 1A . 1B are schematic and sectional side views showing detailed aspects of the inventive method for producing a biosensor assembly and an embodiment of the inventive device for carrying out the method according to the invention in a schematic and sectional side view.
2A–2C zeigen
in Form einer Balkengraphik bzw. in Form von Tabellen einen Vergleich
von Messergebnissen aus einer elektrophysiologischen Untersuchung
unter Zugrundelegung herkömmlicher
und erfindungsgemäß hergestellter
Biosensoranordnungen. 2A - 2C show in the form of a bar graph or in the form of tables a comparison of measurement results from an electrophysiological examination on the basis of conventional and inventively prepared biosensor arrangements.
3 zeigt
in schematischer und geschnittener Seitenansicht eine Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Biosensoranordnung. 3 shows a schematic and sectional side view of an embodiment of the biosensor arrangement according to the invention.
4 zeigt
eine schematische und teilweise geschnittene Seitenansicht eines
anderen Ausführungsbeispiels
der erfindungsgemäßen Biosensoranordnung
mit einem Vesikel als Primärträger sowie
deren Verwendung in einer Messvorrichtung. 4 shows a schematic and partially sectioned side view of another embodiment of the biosensor assembly according to the invention with a vesicle as a primary carrier and their use in a measuring device.
5 zeigt
eine weitere Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Biosensoranordnung
mit einem Membranfragment als Primärträger. 5 shows a further embodiment of the biosensor arrangement according to the invention with a membrane fragment as the primary carrier.
6A–9C zeigen
Fotos zu optischen Fluoreszenzmessungen an der Oberfläche erfindungsgemäßer Biosensoranordnungen,
die gemäß einem
erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt wurden. 6A - 9C show photos of optical fluorescence measurements on the surface of inventive biosensor assemblies, which were prepared according to a method of the invention.
10A–10C zeigen Fotos zu optischen Fluoreszenzmessungen
an der Oberfläche
einer herkömmlichen
Biosensoranordnung. 10A - 10C show photos of optical fluorescence measurements on the surface of a conventional biosensor array.
11A–11C zeigen Fotos zu optischen Fluoreszenzmessungen
an der Oberfläche
einer Biosensoranordnung ohne Primärträger. 11A - 11C show photos on optical fluorescence measurements on the surface of a biosensor arrangement without a primary carrier.
12–14 zeigen
in Form von Graphen exemplarisch elektrische Einzelmessungen an
Biosensoranordnungen vergleichbarer Präparationen unter Verwendung
von rOCT2 als oder in Primärträgern 10. 12 - 14 show in the form of graphs by way of example individual electrical measurements on biosensor arrangements of comparable preparations using rOCT2 as or in primary carriers 10 ,
DETAILBESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMENDETAILED DESCRIPTION OF THE EMBODIMENTS
Nachfolgend
werden Ausführungsformen der
vorliegenden Erfindung beschreiben. Sämtliche Ausführungsformen
der Erfindung und auch ihre technischen Merkmale und Eigenschaften
können einzeln
isoliert oder wahlfrei zusammengestellt miteinander beliebig und
ohne Einschränkung
kombiniert werden.following
Become embodiments of the
Describe the present invention. All embodiments
the invention and also their technical features and properties
can be individually
isolated or randomly assembled with each other arbitrarily and
without restriction
be combined.
Strukturell
und/oder funktionell gleiche, ähnliche
oder gleich wirkende Merkmale oder Elemente werden nachfolgend im
Zusammenhang mit den Figuren mit denselben Bezugszeichen bezeichnet. Nicht
in jedem Fall wird eine detaillierte Beschreibung dieser Merkmale
oder Elemente wiederholt.Structurally
and / or functionally similar, similar
or equivalent features or elements will be described below
Connection with the figures denoted by the same reference numerals. Not
In any case, a detailed description of these features
or elements repeated.
Zunächst wird
auf die Zeichnungen im Allgemeinen Bezug genommen.First, will
generally referred to the drawings.
Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht ganz allgemein darin,
auf eine Anordnung 1, aus welcher die Biosensoranordnung 1 in
erfindungsgemäßer Art
und Weise ausgebildet werden soll, oder auf die Biosensoranordnung
selbst eine Kraft wirken zu lassen, derart, dass zumindest eine
Komponente dieser Kraft senkrecht steht zu einem Teil des Oberflächenbereichs 20a des
Sekundärträgers 20 und
insbesondere senkrecht zu einem Teil der Oberfläche 20a der Elektrode 26 des
Sekundärträgers 20.
Dadurch wird insgesamt eine bessere kapazitive Kopplung der Primärträger 10 an
den Sekundärträger 20 und
insbesondere an die Elektrode 26 des Sekundärträgers 20 erreicht.
Die Wirkmechanismen der Kraft und damit die Mechanismen der Verbesserung
der kapazitiven Kopplung bieten unterschiedliche Ansatzpunkte. Zum
einen ist es denkbar, dass durch die Einwirkende Kraft F die Struktur
des Sekundärträgers 20 derart
geändert
wird, dass sich eine verbesserte kapazitive Kopplung z. B. über eine Verringerung
des Abstandes zu den Primärträgern 10 oder über eine
innigere Ankopplung im Sinne einer Adsorption des Primärträgers 10 and
den Sekundärträger 20 ergibt.
Auch kann daran gedacht werden, dass der Anlagerungsprozess der
Primärträger 10 an
den Sekundärträger 20 und
die Elektrode 26 begünstigt
wird, und zwar auch ohne dass dabei die Struktur des Sekundärträgers 20 verändert wird.One aspect of the present invention is generally that of an assembly 1 from which the biosensor arrangement 1 is to be formed in accordance with the invention, or to let act on the biosensor itself a force such that at least one component of this force is perpendicular to a portion of the surface area 20a of the secondary carrier 20 and in particular perpendicular to a part of the surface 20a the electrode 26 of the secondary carrier 20 , This will result in a better overall capacitive coupling of the primary carriers 10 to the secondary carrier 20 and in particular to the electrode 26 of the secondary carrier 20 reached. The mechanisms of action of the force and thus the mechanisms for improving the capacitive coupling offer different starting points. On the one hand, it is conceivable that the force F acts on the structure of the secondary carrier 20 is changed so that an improved capacitive coupling z. B. on a reduction of the distance to the primary carriers 10 or via a more intimate coupling in the sense of adsorption of the primary carrier 10 and the secondary carrier 20 results. It can also be thought that the addition process of the primary carrier 10 to the secondary carrier 20 and the electrode 26 favored, even without the structure of the secondary carrier 20 is changed.
Gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird Verfahren geschaffen zum Herstellen
einer Biosensoranordnung 1 für die amperometrische und/oder
potentiometrische pharmakologische Wirkort- und/oder Wirkstofftestung,
bei welchem eine Mehrzahl zu einer elektrischen Aktion aktivierbarer
biologischer Einheiten 12 aufweisende Primärträger 10 in
elektrisch kapazitive Kopplung zu einer elektrisch leitfähigen Elektrode 26 eines
Sekundärträgers 20 gebracht
werden, wobei ein Isolationsbereich 24 ausgebildet wird,
durch welchen die Elektrode 26 elektrisch isoliert wird
von den Primärträgern 10 und/oder
im Betrieb von einem Messmedium 30, bei welchem die elektrisch
kapazitive Kopplung ausgebildet wird, indem in einem Schritt A zumindest
ein Oberflächenbereich 20a des
Sekundärträgers 20 mit einer
Primärträger 10 aufweisenden
Lösung
L oder Suspension in mechanischen Kontakt gebracht wird und bei
welchem in einem Schritt B zumindest der Sekundärträger 20 für eine bestimmte
Inkubationszeitspanne T einer bestimmten Kraft F ausgesetzt wird,
die mindestens eine Komponente senkrecht zu einem Teil des Oberflächenbereichs 20a des
Sekundärträgers 20 besitzt.In accordance with an embodiment of the present invention, there is provided methods of making a biosensor assembly 1 for the amperometric and / or potentiometric pharmacological Wirkort- and / or drug testing, in which a plurality of activatable for an electrical action biological units 12 having primary carriers 10 in electrically capacitive coupling to an electrically conductive electrode 26 a secondary carrier 20 be brought, with an isolation area 24 is formed, through which the electrode 26 is electrically isolated from the primary carriers 10 and / or during operation of a measuring medium 30 in which the electrically capacitive coupling is formed by at least one surface area in a step A. 20a of the secondary carrier 20 with a primary carrier 10 solution L or suspension is brought into mechanical contact and in which in a step B at least the secondary carrier 20 for a given incubation period T of a given force F is exposed, the at least one component perpendicular to a part of the surface area 20a of the secondary carrier 20 has.
Diese
Kraft F ist im Sinne einer zusätzlichen Kraft
zu verstehen, die zusätzlich
zu der gegebenenfalls ebenfalls wirksamen Erdschwere wirkt.These
Force F is in the sense of an additional force
to understand that in addition
to the possibly also effective earth gravity acts.
Der
Schritt B kann zumindest zum Teil oder vollständig gemeinsam mit oder nach
dem Schritt A durchgeführt
werden.Of the
Step B may be at least partially or completely shared with or after
the step A performed
become.
Alternativ
kann der Schritt B vor dem Schritt A durchgeführt werden.alternative
Step B may be performed prior to step A.
Im
Schritt B kann als Kraft F eine elektromagnetische Kraft, insbesondere
eine elektrostatische Kraft, eine mechanische Kraft, eine Kraft
aufgrund eines hydrostatischen Drucks oder eine Kraft aufgrund eines
hydrodynamischen Drucks oder Staudrucks verwendet werden.in the
Step B can as force F an electromagnetic force, in particular
an electrostatic force, a mechanical force, a force
due to a hydrostatic pressure or a force due to a
hydrodynamic pressure or dynamic pressure can be used.
Es
kann aber im Schritt B als Kraft F zusätzlich oder alternativ auch
eine Trägheitskraft,
insbesondere eine Zentrifugalkraft verwendet werden.It
but in step B as a force F additionally or alternatively also
an inertial force,
in particular a centrifugal force can be used.
Im
Schritt A kann der Sekundärträger 20 in eine
die Primärträger 10 aufweisende
Lösung
L oder Suspension enthaltendes Inkubationsgefäß G eingebracht und dort inkubiert
werden.In step A, the secondary carrier 20 in one of the primary carriers 10 containing solution L or suspension incubation vessel G are introduced and incubated there.
Es
kann im Schritt B die Anordnung aus Sekundärträger 20 und Primärträger 10 aufweisender Lösung L oder
Suspension zentrifugiert werden, indem insbesondere das Inkubationsgefäß G zentrifugiert
wird.It may in step B, the arrangement of secondary carrier 20 and primary carrier 10 centrifuging solution L or suspension, in particular by centrifuging the incubation vessel G.
Zum
Zentrifugieren kann eine Zentrifuge Z und/oder als Inkubationsgefäß G kann
ein Ausschwingrotor R der Zentrifuge Z verwendet werden.To the
Centrifugation can be a centrifuge Z and / or as incubation G can
a swing-bucket rotor R of the centrifuge Z are used.
Die
Inkubationsspanne T kann im Bereich von etwa 300 s liegen.The
Incubation margin T can be in the range of about 300 s.
Es
kann eine Trägheitskraft
F verwendet werden, der eine Beschleunigung im Bereich von etwa
700 g entspricht, wobei g die Erdbeschleunigung bezeichnet.It
can be an inertial force
F used, which has an acceleration in the range of about
700 g, where g denotes the gravitational acceleration.
Ein
Sekundärträger 20 mit
den kapazitiv gekoppelten Primärträgern 10 darauf
kann nach der Präparation
gespült
wird, z. B. indem der Oberflächenbereich 20a des
Sekundärträgers 20 mit
den gekoppelten Primärträgern 10 darauf
mit einer Spüllösung oder
Spülsuspension
angeströmt
wird. Dadurch kann z. B. erreicht werden, dass adsorbierte oder
gekoppelte geschlossene Primärträger 10 aufgerissen werden
und so genannte Inside-out-Strukturen entstehen, bei denen also
Strukturen frei zugängig
sind, die nativ oder aufgrund der üblichen Präparation im Inneren des Primärträgers, z.
B. einer Zelle oder dergleichen liegen.A secondary carrier 20 with the capacitively coupled primary carriers 10 it can be rinsed after the preparation, z. B. by the surface area 20a of the secondary carrier 20 with the coupled primary carriers 10 it is then flushed with a rinsing solution or rinsing suspension. As a result, z. B. be achieved that adsorbed or coupled closed primary carrier 10 be torn open and so-called inside-out structures arise, so that structures are freely accessible, the native or due to the usual preparation inside the primary carrier, z. B. a cell or the like.
Als
Primärträger 10 können eine
oder mehrere eukariontische Zellen, prokariontische Zellen, Oozyten,
bakterielle Einheiten oder Bakterien, virale Einheiten oder Viren
und/oder deren Bestandteile, Organellen, Fragmente, Membranfragmente
oder Verbände
in nativer Form, in abgewandelter Form, in gereinigter Form, in
mikrobiologisch geänderter
Form oder in molekularbiologisch geänderter Form vorgesehen und
verwendet werden.As primary carrier 10 For example, one or more eukaryotic cells, prokaryotic cells, oocytes, bacterial units or bacteria, viral units or viruses and / or components thereof, organelles, fragments, membrane fragments or dressings in native form, in modified form, in purified form, in microbiologically altered form or be provided in molecular biologically modified form and used.
Alternativ
oder zusätzlich
können
als Primärträger 10 ein
oder mehrere Vesikel, Liposomen, mizelläre Strukturen und/oder deren
Bestandteile, Fragmente, Membranfragmente oder Verbände in nativer
Form, in abgewandelter Form, in gereinigter Form, in mikrobiologisch
geänderter
Form oder in molekularbiologisch geänderter Form vorgesehen und
verwendet werden.Alternatively or additionally, as the primary carrier 10 one or more vesicles, liposomes, micellar structures and / or their components, fragments, membrane fragments or dressings can be provided and used in native form, in modified form, in purified form, in microbiologically altered form or in a molecular biologically modified form.
Es
können
also z. B. Primärträger 10 mit
einer zunächst
geschlossenen Membran 11 verwendet werden. Nach dem Ausbilden
der kapazitiven Kopplung können
dann auf die gekoppelten Primärträger 10 Scherkräfte ausgeübt werden,
insbesondere durch Spülen
mit einer Flüssigkeit,
so dass deren geschlossene Membran 11 zumindest aufreist
und in eine geöffnete
Membran 11' mit
Inside-out-Eigenschaft übergeht.It can therefore z. B. primary carrier 10 with an initially closed membrane 11 be used. After forming the capacitive coupling can then on the coupled primary carrier 10 Shear forces are exercised, in particular by rinsing with a liquid, so that the closed membrane 11 at least it's exciting and in an open membrane 11 ' merges with inside-out property.
Der
Primärträger 10 weist
also jeweils mindestens eine Membran 11 mit einer Außenseite 11a und
mit einer Innenseite 11b auf.The primary carrier 10 Thus, each has at least one membrane 11 with an outside 11a and with an inside 11b on.
Als
biologische Einheit 12 können jeweils ein oder mehrere
zu einem zumindest teilweise elektrogenem Ladungsträgertransport
und/oder zu einer zumindest teilweise elektrogenen Ladungsträgerbewegung
aktivierbare biologische, chemische und/oder biochemische Einheiten 12,
Transporteinheiten und/oder ein oder mehrere Bestandteile, Fragmente und/oder
Verbände
davon vorgesehen und verwendet werden.As a biological entity 12 For example, one or more biological, chemical and / or biochemical units which can be activated at least partially by electrogenic charge carrier transport and / or at least partially by electrogenic charge carrier movement can be activated 12 , Transport units and / or one or more components, fragments and / or dressings thereof may be provided and used.
Die
Primärträger 10 können – z. B.
durch die Adsorption – in
unmittelbarer räumlicher
Nachbarschaft der Elektrode 26 vorgesehen werden.The primary carriers 10 can -. B. by the adsorption - in the immediate vicinity of the electrode 26 be provided.
Die
Elektrode 26 des jeweiligen Sekundärträgers 20 kann – zur Realisierung
der kapazitiven Kopplung – gegenüber den
Primärträgern 10 elektrisch
isoliert ausgebildet werden.The electrode 26 of the respective secondary carrier 20 can - for the realization of the capacitive coupling - compared to the primary carriers 10 be formed electrically insulated.
Die
Elektrode 26 kann festkörperartig und/oder
festkörperunterstützt ausgebildet
werden.The electrode 26 can be formed like a solid and / or solid support.
Es
kann ein festkörperartiger
Träger 22 mit einer
Oberfläche 22a vorgesehen
und die Elektrode 26 als zusammenhängende Materialschicht auf
der Oberfläche 22a des
Trägers 22 ausgebildet
werden.It can be a solid-like carrier 22 with a surface 22a provided and the electrode 26 as a coherent layer of material on the surface 22a of the carrier 22 be formed.
Es
kann der Träger 22 mit
oder aus einem elektrisch isolierenden und/oder chemisch inerten Material
ausgebildet werden, insbesondere mit oder aus einem Glas, Kunststoff
oder Polymer.It can be the carrier 22 be formed with or from an electrically insulating and / or chemically inert material, in particular with or from a glass, plastic or polymer.
Die
Elektrode 26 kann als auf der Oberfläche 22a des Trägers 22 abgeschiedene,
insbesondere aufgedampfte oder gesputterte Materialschicht, ausgebildet
werden, vorzugsweise mit einer Schichtstärke von 10 bis 200 nm.The electrode 26 can be considered on the surface 22a of the carrier 22 deposited, in particular vapor-deposited or sputtered material layer, are formed, preferably with a layer thickness of 10 to 200 nm.
Der
Isolationsbereich 24 kann zumindest teilweise schichtartig,
insbesondere mehrschichtig ausgebildet werden.The isolation area 24 can be formed at least partially layered, in particular multi-layered.
Es
kann der Isolationsbereich 24 zumindest teilweise als Monoschicht
oder Monolage oder als Abfolge von Monoschichten oder Monolagen
ausgebildet werden, insbesondere jeweils als spontan selbstorganisierende
Schicht oder als Self-Assembling-Schicht.It may be the isolation area 24 at least partially formed as a monolayer or monolayer or as a sequence of monolayers or monolayers, in particular in each case as a spontaneously self-organizing layer or as a self-assembling layer.
Es
kann die Elektrode 26 mit oder aus mindestens einem metallischen
Material ausgebildet werden, insbesondere mit oder aus einem Edelmetall,
vorzugsweise Gold, Silber oder Platin.It can be the electrode 26 be formed with or from at least one metallic material, in particular with or from a precious metal, preferably gold, silver or platinum.
Als
Unterschicht 24b oder als unterster und der Elektrode 26 zugewandter
Bereich 24b des Isolationsbereichs 24 können eine
Schicht einer organischen Thioverbindung vorgesehen und ausgebildet werden,
vorzugsweise eines langkettigen Alkanthiols, insbesondere Oktadekanthiol.As a lower class 24b or as the bottom and the electrode 26 facing area 24b of the isolation area 24 For example, a layer of an organic thio compound may be provided and formed, preferably a long-chain alkanethiol, in particular octadecanethiol.
Als
Oberschicht 24a oder als oberster und von der Elektrode 26 abgewandter
oder Oberflächenbereich 24a des
Isolationsbereichs 24 können
eine Schicht einer amphiphilen organischen Verbindung vorgesehen
und ausgebildet werden, insbesondere eines Lipids.As upper class 24a or as the top and the electrode 26 remote or surface area 24a of the isolation area 24 For example, a layer of an amphiphilic organic compound may be provided and formed, in particular a lipid.
Der
Isolationsbereich 24, insbesondere die Unterschicht 24b davon,
können
mit oder aus einer Schicht aus Teflon, einem Kunststoff oder einem
Polymer ausgebildet werden, insbesondere mit einer Schichtdicke
von weniger als 5 μm.The isolation area 24 , especially the lower class 24b thereof, can be formed with or from a layer of Teflon, a plastic or a polymer, in particular with a layer thickness of less than 5 microns.
Es
kann ein Elektrodensubstrat für
die Elektrode 26 mit einer Oberfläche 26a ausgebildet
werden, wobei das Elektrodensubstrat der Elektrode 26 mit
oder aus einem Kunststoffmaterial oder einem Polymermaterial ausgebildet
wird und das Kunststoffmaterial oder das Polymermaterial elektrisch
leitfähig ausgebildet
wird.It may be an electrode substrate for the electrode 26 with a surface 26a be formed, wherein the electrode substrate of the electrode 26 is formed with or from a plastic material or a polymer material and the plastic material or the polymer material is formed electrically conductive.
Der
Isolationsbereich 24 kann mit oder aus mindestens einem
Biomaterialbereich ausgebildet werden, welcher in und/oder auf der
Oberfläche 26a des
Elektrodensubstrats der Elektrode 26 vorgesehen wird.The isolation area 24 can be formed with or from at least one biomaterial area, which in and / or on the surface 26a of the electrode substrate of the electrode 26 is provided.
Das
Kunststoffmaterial oder das Polymermaterial können mit oder aus einem oder
mehreren organischen Materialien ausgebildet werden.The
Plastic material or the polymer material can be with or from one or
several organic materials are formed.
Die
elektrische Leitfähigkeit
des Kunststoffmaterials oder des Polymermaterials kann durch das Vorsehen
mindestens eines ersten Zuschlagsstoffes im Kunststoffmaterial oder
Polymermaterial ausgebildet werden.The
electric conductivity
of the plastic material or polymer material may be provided by the provision
at least one first aggregate in the plastic material or
Polymer material can be formed.
Es
kann als mindestens ein erster Zuschlagsstoff ein metallisches Material
vorgesehen werden.It
can as at least a first aggregate a metallic material
be provided.
Es
kann als mindestens ein erster Zuschlagsstoff auch eine Form von
Kohlenstoff vorgesehen werden.It
may also be a form of at least one first aggregate
Be provided carbon.
Als
mindestens ein erster Zuschlagsstoff kann ein Material aus oder
mit Nanopartikeln und/oder mit Nanotubes vorgesehen werden.When
At least one first aggregate may or may not be a material
be provided with nanoparticles and / or with nanotubes.
Als
mindestens ein erster Zuschlagsstoff ein Material oder eine Kombination
von Materialien aus der Gruppe vorgesehen werden, die besteht aus: Kohlenstoff
in Form von Ruß,
Kohlenstoff in Form von Graphit, Kohlenstoff in Form von Nanopartikeln,
Kohlenstoff in Form von Buckminsterfullerenen oder deren – insbesondere
gecageten – Derivaten,
Kohlenstoff in Form von Nanotubes und Derivaten dieser Materialien.When
at least one first aggregate is a material or a combination
be provided by materials from the group, which consists of: carbon
in the form of soot,
Carbon in the form of graphite, carbon in the form of nanoparticles,
Carbon in the form of buckminsterfullerenes or their - in particular
caged - derivatives,
Carbon in the form of nanotubes and derivatives of these materials.
Der
Biomaterialbereich kann elektrisch isolierend ausgebildet werden,
so dass durch den Biomaterialbereich das Elektrodensubstrat der
Elektrode 26 elektrisch isoliert ausgebildet wird.The biomaterial region can be designed to be electrically insulating, such that the electrode substrate of the electrode is formed by the biomaterial region 26 is formed electrically insulated.
Der
Biomaterialbereich kann schichtartig ausgebildet werden.Of the
Biomaterial area can be formed layered.
Der
Biomaterialbereich kann mit einer oder aus einer Abfolge von Monoschichten 24a, 24b gebildet
werden.The biomaterial domain may be one or a series of monolayers 24a . 24b be formed.
Die
Monoschichten 24a, 24b können als spontan selbstorganisierende
Schichten ausgebildet werden.The monolayers 24a . 24b can be formed as spontaneously self-organizing layers.
Der
Biomaterialbereich oder eine oder mehrere Schichten 24b, 24a des
Biomaterialbereichs können
als chemisch und/oder physikalisch modifizierter oder umgewandelter
Bereich der Oberfläche 26a des
Elektrodensubstrats der Elektrode 26 ausgebildet werden.The biomaterial area or one or more layers 24b . 24a of the biomaterial region may be used as a chemically and / or physically modified or transformed area of the surface 26a of the electrode substrate of the electrode 26 be formed.
Der
Biomaterialbereich oder eine oder mehrere Schichten 24b, 24a des
Biomaterialbereichs könne
auch über
einen zweiten Zuschlagsstoff im Material des Elektrodensubstrats
der Elektrode 26 ausgebildet werden.The biomaterial area or one or more layers 24b . 24a of the biomaterial can also be a second aggregate in the material of the electrode substrate of the electrode 26 be formed.
Der
Biomaterialbereich oder eine oder mehrere Schichten 24b, 24a des
Biomaterialbereichs können
auch über
eine inhärente
Oberflächenstruktur
im Material des Elektrodensubstrats der Elektrode 26 ausgebildet
werden.The biomaterial area or one or more layers 24b . 24a of the biomaterial region may also have an inherent surface structure in the material of the electrode substrate of the electrode 26 be formed.
Der
Biomaterialbereich oder eine oder mehrere Schichten 24b, 24a des
Biomaterialbereichs können
ferner über
ein zusätzlich
auf die Oberfläche 26a des
Elektrodensubstrats der Elektrode 26 aufgebrachtes Oberflächenmaterial
ausgebildet werden.The biomaterial area or one or more layers 24b . 24a of the biomaterial area may also have an additional surface area 26a of the electrode substrate of the electrode 26 applied surface material can be formed.
Auch
kann der Biomaterialbereich als Schicht oder mit einer obersten
und vom Elektrodensubstrat der Elektrode 26 abgewandten
Schicht 24, 24b mit oder aus einer amphiphilen
organischen Verbindung oder einem Lipid ausgebildet werden.Also, the biomaterial region may be in the form of a layer or an uppermost and of the electrode substrate of the electrode 26 remote layer 24 . 24b be formed with or from an amphiphilic organic compound or a lipid.
Dabei
kann der Bereich, welcher durch den die Elektrode 26 isolierenden
und/oder abdeckenden Bereich des Isolationsbereichs 24 definiert
wird, mit einer Membranstruktur SSM ausgebildet werden, die zumindest
teilweise eine spezifische elektrische Leitfähigkeit von etwa Gm ≈ 1–100 nS/cm2, eine spezifische Kapazität von etwa
Cm ≈ 10–1000 nF/cm2 und/oder eine Fläche von etwa A ≈ 0,1–50 mm2 aufweist.In this case, the area through which the electrode 26 insulating and / or covering area of the isolation area 24 is defined, are formed with a membrane structure SSM, at least partially a specific electrical conductivity of about G m ≈ 1-100 nS / cm 2 , a specific capacity of about C m ≈ 10-1000 nF / cm 2 and / or an area of about A ≈ 0.1-50 mm 2 .
Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird auch eine Biosensoranordnung 1 für die amperometrische
und/oder potentiometrische pharmakologische Wirkort- und/oder Wirkstofftestung
geschaffen, bei welcher eine Mehrzahl zu einer elektrischen Aktion
aktivierbarer biologischer Einheiten 12 aufweisende Primärträger 10 in
elektrisch kapazitive Kopplung zu einer elektrisch leitfähigen Elektrode 26 eines
Sekundärträgers 20 gebracht
ist.In accordance with the present invention, a biosensor assembly is also disclosed 1 for the amperometric and / or potentiometric pharmacological Wirkort- and / or drug testing created in which a plurality of activatable for an electrical action biological units 12 having primary carriers 10 in electrically capacitive coupling to an electrically conductive electrode 26 a secondary carrier 20 brought is.
Die
Oberfläche 26a des
Sekundärträgers 20 oder
ein Teil davon kann mit Membranen 11 als Primärträger 10 bedeckt
ausgebildet sein.The surface 26a of the secondary carrier 20 or part of it can be with membranes 11 as a primary carrier 10 be formed covered.
Zusätzlich oder
alternativ können
die Primärträger 10 auf
der Oberfläche 20a des
Sekundärträgers 20 zumindest
zum Teil in Form von Strukturen in Zellgröße, insbesondere im Bereich
von etwa 5 μm bis
etwa 50 μm,
angeordnet sein.Additionally or alternatively, the primary carriers 10 on the surface 20a of the secondary carrier 20 at least in part in the form of structures in cell size, in particular in the range of about 5 microns to about 50 microns, be arranged.
Weiter
Zusätzlich
oder alternativ kann die Biosensoranordnung 1 gemäß einem
erfindungsgemäßen Verfahren
zum Herstellen einer Biosensoranordnung 1 für die amperometrische
und/oder potentiometrische pharmakologische Wirkort- und/oder Wirkstofftestung
ausgebildet sein.Further additionally or alternatively, the biosensor arrangement 1 according to a method according to the invention for producing a biosensor arrangement 1 be designed for the amperometric and / or potentiometric pharmacological Wirkort- and / or drug testing.
Ferner
schafft die vorliegende Erfindung auch eine Vorrichtung zum Herstellen
einer Biosensoranordnung 1 für die amperometrische und/oder potentiometrische
pharmakologische Wirkort- und/oder Wirkstofftestung, welche ausgebildet
ist und Einrichtungen aufweist zum Ausführen eines erfindungsgemäßen Verfahrens
zum Herstellen einer Biosensoranordnung 1.Furthermore, the present invention also provides an apparatus for manufacturing a biosensor assembly 1 for the amperometric and / or potentiometric pharmacological Wirkort- and / or drug testing, which is formed and having means for carrying out a method according to the invention for producing a biosensor assembly 1 ,
Die
Vorrichtung kann mit einem Gefäß G zum
Aufnehmen und Haltern einer Biosensoranordnung 1 und ihrer
Vorform 1 und zum Aufnehmen einer Primärträger 10 aufweisenden
Lösung
oder Suspension in einem gemeinsamen Gefäßbereich derart ausgebildet
sein, dass zumindest ein Oberflächenbereich 20a des
Sekundärträgers 20 mit
der Lösung
L oder Suspension in mechanischen Kontakt steht oder gebracht werden
kann.The device may include a vessel G for receiving and holding a biosensor assembly 1 and their preform 1 and for receiving a primary carrier 10 having solution or suspension in a common vessel area be formed such that at least one surface area 20a of the secondary carrier 20 with the solution L or suspension is in mechanical contact or can be brought.
Das
Gefäß G kann
als Ausschwingrotor R oder als Auslenkrotor R oder als Teil davon
ausgebildet sein.The
Vessel G can
as a swing-bucket rotor R or as a deflection rotor R or as part thereof
be educated.
Es
kann ein Zentrifugationsmechanismus Z vorgesehen sein, durch welchen
das Gefäß G derart in
Rotation versetzbar ist, dass die Anordnung aus Sekundärträger 20 und
Primärträger 10 aufweisender
Lösung
L oder Suspension für
eine bestimmte Inkubationszeitspanne T einer bestimmten Trägheitskraft
F ausgesetzt wird oder aussetzbar ist.There may be provided a centrifuging mechanism Z, by means of which the vessel G is set in rotation in such a way that the arrangement of secondary carrier 20 and primary carrier 10 solution L or suspension for a given incubation period T of a given inertial force F is exposed or is suspendable.
Es
kann ein Adapter A vorgesehen sein, durch welchen der Sekundärträger 20 im
Gefäß G derart
halterbar ist, das die ausgeübte
Trägheitskraft F
mit mindestens einer Komponente senkrecht zu einem Teil des Oberflächenbereichs 20a des
Sekundärträgers 20 wirkt.There may be provided an adapter A through which the secondary carrier 20 in the vessel G is holdable such that the applied inertial force F with at least one component perpendicular to a part of the surface area 20a of the secondary carrier 20 acts.
Nun
wird im Detail auf die Zeichnungen Bezug genommen.Now
is referred in detail to the drawings.
Die 1A und 1B zeigen
in schematischer und geschnittener Seitenansicht Detailaspekte einer
Ausführungsform
eines Verfahrens zum Herstellen einer Biosensoranordnung 1 unter
Zugrundelegung einer Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung 100 zum
Herstellen einer erfindungsgemäßen Biosensoranordnung 1.The 1A and 1B show in schematic and sectional side view detail aspects of an embodiment of a method for producing a biosensor assembly 1 based on an embodiment of the device according to the invention 100 for producing a biosensor arrangement according to the invention 1 ,
Die
in den 1A und 1B beispielhaft gezeigte
erfindungsgemäße Vorrichtung 100 zum Herstellen
einer Biosensoranordnung 1 wird im Wesentlichen von einer
Zentrifuge Z gebildet. Um eine Drehachse X, die z. B. von einer
Drehwelle 101 oder einer Rotationswelle 101 gebildet
wird, ist ein um einen Schwenkpunkt P schwenkbarer Ausschwingrotor
R oder Auslenkrotor R angeordnet. Der Schwenkrotor R besteht hier
aus einem Paar Schwenkarme R1 und R2, die sich in Bezug auf die
Rotationsachse X punkt- oder achsensymmetrisch gegenüberstehen und
an deren Ende und von der Drehachse X abgewandt sich identische
Gefäße G1 und
G2 als Inkubationsgefäße G befinden.
Die vom Drehpunkt P und von der Drehachse X abgewandten Enden der
Gefäße G1 und
G2 zeigen im Gefäßinneren
einen Adapter A, der als Haltevorrichtung zur Aufnahme einer Vorform 1' für die Biosensoranordnung 1 und
für die
Fertiggestellte Biosensoranordnung 1 selbst dient. In einer
Ausnehmung des Adapters A kann die Vorform 1' der Biosensoranordnung 1 – hier dargestellt
in Form eines Plättchens,
welches den Primärträger 20 bildet – aufgenommen
werden. Gleichzeitig befindet sich im Inneren der Gefäße G1, G2
in Richtung auf den Schwenkpunkt P und die Drehachse X hin die Lösung oder
Suspension zur Inkubation des Sekundärträgers 20. In den in
den 1A und 1B dargestellte
Ausführungsform
enthält
die Suspension L bereits die Primärträger 10; dies ist jedoch
nicht zwingend, da die Inkubation mit den Primärträgern 10 auch der Beaufschlagung
mit der Kraft F nachgeschaltet sein kann.The in the 1A and 1B Exemplary inventive device shown 100 for producing a biosensor arrangement 1 is essentially formed by a centrifuge Z. To a rotation axis X, the z. B. from a rotary shaft 101 or a rotary shaft 101 is formed, a pivotable about a pivot point P swing-bucket rotor R or Auslenkrotor R is arranged. The swivel rotor R here consists of a pair of pivot arms R1 and R2, which are point or axis-symmetrical with respect to the axis of rotation X. and at the end thereof and away from the rotation axis X, identical vessels G1 and G2 are located as incubation vessels G. The ends of the vessels G1 and G2 facing away from the pivot point P and from the axis of rotation X show an adapter A in the interior of the vessel, which serves as a holding device for receiving a preform 1' for the biosensor arrangement 1 and for the finished biosensor assembly 1 itself serves. In a recess of the adapter A, the preform 1' the biosensor arrangement 1 - Shown here in the form of a small plate, which is the primary carrier 20 forms - to be recorded. At the same time, the solution or suspension for incubating the secondary carrier is located in the interior of the vessels G1, G2 in the direction of the pivot point P and the axis of rotation X out 20 , In the in the 1A and 1B illustrated embodiment, the suspension L already contains the primary carrier 10 ; However, this is not mandatory, as the incubation with the primary carriers 10 also the application of the force F can be connected downstream.
In
der 1A stehen die Zentrifuge Z und der Rotor R still,
das heißt
für die
Winkelgeschwindigkeit gilt: ω =
0. Folglich wirkt außer
der normalen Schwerkraft keine weitere Kraft auf die Oberfläche 20a des
Primärträgers 20.In the 1A If the centrifuge Z and the rotor R are stationary, that is to say for the angular velocity: ω = 0. Consequently, apart from the normal gravity, no further force acts on the surface 20a of the primary carrier 20 ,
In
dem in 1B dargestellten Zustand ist die
Zentrifuge Z in Betrieb gesetzt, der Rotor R rotiert mit der Winkelgeschwindigkeit ω = ω0 um die Rotations- oder Drehachse X derart,
dass an der Drehwelle 101 um den Schwenkpunkt P herum die
Rotorarme R1 und R2 des Rotors R ausschwenken. Die sich einstellende
Zentrifugalkraft F wirkt in diesem Fall als eine Kraft senkrecht
auf der Oberfläche 20a des
Sekundärträgers 20.
Wie oben bereits beschrieben wurde, führt die Kraftwirkung zu einer
Verbesserung der kapazitiven Kopplung der Primärträger 10 auf dem Sekundärträger 20 und
mit hin zur Elektrode 26 hin.In the in 1B shown state, the centrifuge Z is set in operation, the rotor R rotates at the angular velocity ω = ω 0 about the rotation or rotation axis X such that on the rotary shaft 101 swing the rotor arms R1 and R2 of the rotor R around the pivot point P around. The resulting centrifugal force F acts in this case as a force perpendicular to the surface 20a of the secondary carrier 20 , As already described above, the force effect leads to an improvement of the capacitive coupling of the primary carriers 10 on the secondary carrier 20 and with it to the electrode 26 out.
Diese
verbesserte kapazitive Kopplung mach sich bei der Aufnahme und Auswertung
durch Aktivierung der in den Primärträgern 10 enthaltenen biologischen
Einheiten 12 erzeugter elektrischer Signale in einer gesteigerten
Signalamplitude und mithin in einem verbesserten Signal-zu-Rauschverhältnis bemerkbar.This improved capacitive coupling takes place in the acquisition and evaluation by activation of the primary carriers 10 contained biological units 12 generated electrical signals in an increased signal amplitude and thus in an improved signal-to-noise ratio noticeable.
In
den 2A bis 2C sind
Vergleiche zwischen herkömmlich
hergestellten Biosensoranordnungen 1 und erfindungsgemäß hergestellten
Biosensoranordnun gen 1 im Hinblick auf dieses verbesserte
Signal-zu-Rauschverhältnis
in Bezug auf die maximalen Signalamplituden Imax bei einer Strommessung
dargestellt.In the 2A to 2C are comparisons between conventionally produced biosensor assemblies 1 and Biosensoranordnun produced according to the invention 1 in view of this improved signal-to-noise ratio with respect to the maximum signal amplitudes Imax shown in a current measurement.
In
dem Balkendiagramm der 2A sind 20 Einzelexperimente
dargestellt, jeweils zehn für
herkömmlich
hergestellte Biosensoranordnungen und jeweils zehn für erfindungsgemäß hergestellte
Biosensoranordnungen 1. Die Herstellungsverfahren für sämtliche
Biosensoranordnungen sind identisch, außer, dass bei der erfindungsgemäßen Herstellung der
Biosensoranordnungen 1 gemäß der vorliegenden Erfindung
währen
des Inkubations- und Anlagerungsvorgangs der Primärträger 10 an
den Sekundärträger 20 eine
Zentrifugation mit einer Zentrifugalbeschleunigung von 700 g für fünf Minuten
durchgeführt
wurde. Auf der Abszisse der Grafik aus 1A sind
vier Gruppen A bis E mit jeweils vier experimentellen Ergebnissen
gezeigt, wobei jeweils die beiden linken Balken in jeder Gruppe
A bis E die Messergebnisse zu den herkömmlichen Biosensoranordnungen bezeichnen
und die beiden rechten Balken aus Experimenten mit erfindungsgemäß hergestellten
Biosensoranordnungen 1 stammen. Die Ordinate gibt die maximalen
Stromamplituden aus den Einzelexperimenten an. Die Primärträger in sämtlichen
Experimenten waren Lipidvesikel mit dort in der Lipidmembran enthaltenen
organischen Kationentransportern rOCT2. Deutlich sichtbar ist, dass
gegenüber
den herkömmlichen
Biosensoranordnungen sich in den maximalen Signalamplituden bei
den erfindungsgemäß hergestellten
Biosensoranordnungen eine deutliche Steigerung ergibt. Die 2B zeigt
die Einzelexperimente in numerisch tabellarischer Form.In the bar chart of the 2A 20 individual experiments are shown, in each case ten for conventionally produced biosensor arrangements and ten each for biosensor arrangements produced according to the invention 1 , The production methods for all biosensor arrangements are identical, except that in the production according to the invention of the biosensor arrangements 1 according to the present invention during the incubation and annealing process, the primary carriers 10 to the secondary carrier 20 centrifugation was performed with a centrifugal acceleration of 700 g for five minutes. On the abscissa of the graph 1A four groups A to E are shown, each with four experimental results, with the two left bars in each group A to E indicating the measurement results for the conventional biosensor arrangements and the two right bars from experiments with biosensor arrangements produced according to the invention 1 come. The ordinate indicates the maximum current amplitudes from the individual experiments. The primary carriers in all experiments were lipid vesicles with organic cation transporters rOCT2 contained in the lipid membrane. It is clearly visible that compared to the conventional biosensor arrangements, a significant increase results in the maximum signal amplitudes in the biosensor arrangements produced according to the invention. The 2 B shows the individual experiments in numerical tabular form.
Die 2C zeigt
die statistische Analyse der in den 2A und 2B gezeigten
Einzelexperimente. Es ergibt sich in etwa eine Verfünffachung
der maximalen Amplitude bei den erfindungsgemäß hergestellten Biosensoranordnungen 1 im
Vergleich zu herkömmlich
hergestellten Biosensoranordnungen.The 2C shows the statistical analysis of the in the 2A and 2 B shown individual experiments. This results in a quintupling of the maximum amplitude in the biosensor arrangements produced according to the invention 1 compared to conventionally produced biosensor arrangements.
Die 12, 13 und 14 zeigen
exemplarisch dazu noch elektrische Einzelmessungen an Biosensoranordnungen
vergleichbarer Präparationen
unter Verwendung von rOCT2 als oder in Primärträgern 10.The 12 . 13 and 14 exemplarily show individual electrical measurements on biosensor arrangements of comparable preparations using rOCT2 as or in primary carriers 10 ,
12 zeigt
den zeitlichen Verlaufs des elektrischen Stroms einer herkömmlichen
Biosensoranordnung, die also nicht zentrifugiert wurde. Die maximale
Stromamplitude Imax beträgt
hier 445 pA bei einem Messfehler von 42 pA. 13 zeigt
eine Vergleichmessung mit einer erfindungsgemäßen Biosensoranordnung 1,
bei der die Primärträger 10 erst nach
der Zentrifugation an der Oberfläche 20a des Sekundärträgers 20 angelagert
wurden. Die maximale Stromamplitude Imax ist hier verdoppelt und
beträgt
hier 901 pA bei einem Messfehler von 280 pA. Bei 14 wurde
erfolgte die Anlagerung der Primärträger 10 während der
Zentrifugation. Hier liegt nochmals eine Steigerung der maximalen
Stromamplitude Imax vor und beträgt
hier 1016 pA bei einem Messfehler von 176 pA. 12 shows the time course of the electric current of a conventional biosensor assembly, which was therefore not centrifuged. The maximum current amplitude Imax is 445 pA at a measurement error of 42 pA. 13 shows a comparison measurement with a biosensor arrangement according to the invention 1 in which the primary carriers 10 only after centrifugation on the surface 20a of the secondary carrier 20 were attached. The maximum current amplitude Imax is doubled here and amounts to 901 pA with a measurement error of 280 pA. at 14 the addition of the primary carriers took place 10 during centrifugation. Here again there is an increase in the maximum current amplitude Imax and here is 1016 pA with a measurement error of 176 pA.
3 zeigt
in schematischer und geschnittener Seitenansicht eine erste Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Biosensoranordnung 1. 3 shows a schematic and sectional side view of a first embodiment of he inventive biosensor arrangement 1 ,
Diese
erste Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Biosensoranordnung 1 weist
einen Trägersubstratbereich 22 oder
ein Trägersubstrat 22 mit
einem Oberseitenoberflächenbereich 22a auf,
auf welchem der vermittelnde Zwischensubstratbereich 26 oder
der Vermittlungssubstratbereich 26 in Form einer geschichteten
Metallstruktur vorgesehen ist, und zwar mit einem Primärmetallbereich 26-1,
hier z. B. aus Kupfer, einer Hilfsschicht 26-2, hier z.
B. aus Nickel, die als Diffusionsbarriere und als Legierungsbildungsbarriere
dient, sowie einer eigentlichen Elektrodenschicht 26-3,
hier aus Gold.This first embodiment of the biosensor arrangement according to the invention 1 has a carrier substrate area 22 or a carrier substrate 22 with a top surface area 22a on which the mediating intermediate substrate area 26 or the switch substrate area 26 is provided in the form of a layered metal structure, with a primary metal region 26-1 , here z. B. of copper, an auxiliary layer 26-2 , here z. B. of nickel, which serves as a diffusion barrier and as an alloying barrier, and an actual electrode layer 26-3 here in gold.
Durch
eine spezifische chemische Wechselwirkung mit der eigentlichen Elektrodenschicht 26-3 sind
eine Biomaterialschicht 24 oder ein Biomaterialbereich 24 auf
dem Oberseitenoberflächenbereich 26a des
Vermittlungssubstratbereichs 26 immobilisiert. Diese Biomaterialschicht 24 dient
als Isolationsbereich 24 für die erfindungsgemäße Sensorelektrodenanordnung 1 und
besteht aus einer geschichteten Abfolge selbstorganisierender Monoschichten 24a und 24b,
und zwar aus einer zuunterst angeordneten Unterschicht in Form einer
Alkanthiolmonoschicht 24b, welche über die spezifische Thiol-Gold-
oder SH-Au-Wechselwirkung angekoppelt ist, und einer zuoberst vorgesehenen
Lipidmonoschicht 24a. Durch diese Anordnung wird eine Membranbiosensorelektrodeneinrichtung
M oder 20 mit einer festkörperunterstützten Membran
SSM gebildet.Through a specific chemical interaction with the actual electrode layer 26-3 are a biomaterial layer 24 or a biomaterial area 24 on the top surface area 26a of the switch substrate area 26 immobilized. This biomaterial layer 24 serves as isolation area 24 for the sensor electrode arrangement according to the invention 1 and consists of a layered sequence of self-assembling monolayers 24a and 24b , namely from a lower layer arranged in the form of a Alkanthiolmonoschicht 24b which is coupled via the specific thiol-gold or SH-Au interaction and a top lipid monolayer 24a , By this arrangement, a membrane biosensor electrode device M or 20 is formed with a solid state assisted membrane SSM.
Sämtliche
Eigenschaften, welche die mesoskopische oder mikroskopische Struktur
der Oberfläche
der Membranbiosensorelektrodenbereiche M. der Sekundärträger 20 und
insbesondere der jeweiligen zugeordneten Elektroden 26 betreffen,
ergeben sich auch aus der Darstellung der nachfolgenden 4 und 5.
Sämtliche
dort geschilderten Eigenschaften sind in beliebiger Kombination
auf die zuvor im Zusammenhang mit den 1 bis 3 beschriebenen
Strukturen anwendbar.All properties showing the mesoscopic or microscopic structure of the surface of the membrane biosensor electrode regions M. of the secondary carriers 20 and in particular the respective associated electrodes 26 also arise from the presentation of the following 4 and 5 , All there described properties are in any combination on the previously in connection with the 1 to 3 described structures applicable.
4 zeigt
in einer schematischen und teilweise geschnittenen Seitenansicht
eine weitere Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Sensoranordnung 1 und
einer entsprechenden Vorrichtung zur amperometrischen und/oder potentiometrischen pharmakologischen
Wirkstofftestung. 4 shows a schematic and partially sectioned side view of a further embodiment of the sensor arrangement according to the invention 1 and a corresponding device for amperometric and / or potentiometric pharmacological drug testing.
Ein
Messraum 50 in Form eines im Wesentlichen geschlossenen
Gefäßes bildet
zusammen mit einer Austausch-/Mischeinrichtung 60, zum
Beispiel in Form eines Perfusorsystems oder einer Pumpenanlage,
einen geschlossenen Flüssigkeitskreislauf. Die
Kommunikation der als Messmedium 30 dienenden Flüssigkeit
erfolgt über
entsprechende Zuführ- und
Abführeinrichtungen 51 bzw. 52.
Das Messmedium 30 kann dabei eine wässrigere Elektrolytlösung sein,
die bestimmte Ionenanteile, eine gegebene Temperatur, einen bestimmten
pH-Wert usw. aufweist. Des Weiteren sind im Messmedium 30 gegebenenfalls
bestimmte Substratstoffe S und/oder bestimmte Wirkstoffe W enthalten,
oder sie werden in späteren
Verfahrensschritten durch die Austausch-/Mischeinrichtung 60 hinzugefügt.A measuring room 50 in the form of a substantially closed vessel forms together with an exchange / mixing device 60 For example, in the form of a perfusor system or a pump system, a closed fluid circuit. The communication of the as measuring medium 30 Serving liquid via appropriate supply and discharge devices 51 respectively. 52 , The measuring medium 30 may be a more aqueous electrolyte solution having certain ionic proportions, a given temperature, a certain pH, etc. Furthermore, in the measuring medium 30 optionally contain certain substrate substances S and / or certain active ingredients W, or they are in later steps by the exchange / mixing device 60 added.
Im
Messbereich 50 ist eine erfindungsgemäße Sensoranordnung 1 vorgesehen.
Die Sensoranordnung 1 besteht aus Primärträgern 10, welche am Oberflächenbereich 24a der
als Sekundärträger dienenden
Sensorelektrodeneinrichtung 20 angelagert sind.In the measuring range 50 is a sensor arrangement according to the invention 1 intended. The sensor arrangement 1 consists of primary carriers 10 , which at the surface area 24a the serving as a secondary carrier sensor electrode device 20 are attached.
In
dem in 4 in schematischer und nicht maßstabsgetreuer
Form gezeigten Ausführungsbeispiel
ist nur ein einziger Primärträger 10 gezeigt.
Dieser besteht aus einem Lipidvesikel oder Liposom in Form einer
im Wesentlichen hohlkugelförmig
und geschlossen ausgebildeten Lipiddoppelschicht oder Lipidmembran 11.
In diese Lipiddoppelschicht 11 des als Primärträger 10 dienenden
Vesikels ist als im Wesentlichen biologische Einheit 12 ein
Membranprotein membrandurchgreifend eingelagert.In the in 4 shown in schematic and not to scale embodiment is only a single primary carrier 10 shown. This consists of a lipid vesicle or liposome in the form of a substantially hollow spherical and closed lipid bilayer or lipid membrane 11 , In this lipid bilayer 11 as the primary carrier 10 serving vesicle is considered to be essentially a biological entity 12 embedded a membrane protein across the membrane.
Durch
Umsetzung eines im Messmedium 30 vorhandenen Substrats
S zu einem umgesetzten Substrat S' werden im Membranprotein 12 bestimmte Prozesse
initiiert, die in dem in 1 gezeigten
Fall zu einem Stofftransport einer Spezies Q von der extravesikulären Seite
oder Außenseite 10a des
Vesikels 10 zur intravesikulären Seite oder Innenseite 10b des
Vesikels 10 führt.
Ist die Spezies Q mit einer elektrischen Ladung behaftet, so führt der
Transport dieser Spezies Q von der Seite 10a zur Seite 10b zu einem
Nettoladungstransport, welcher mit einem elektrischen Strom von
der Außenseite 10a des
Vesikels 10 zur Innenseite 10b des Vesikels 10 korrespondiert.By converting one in the measuring medium 30 existing substrate S to a converted substrate S 'are in the membrane protein 12 certain processes initiated in the in 1 to a mass transport of a species Q from the extravesicular side or outside 10a of the vesicle 10 to the intravesicular side or inside 10b of the vesicle 10 leads. If the species Q has an electric charge, the transport of this species Q will be off the side 10a to the side 10b to a net charge transport, which with an electric current from the outside 10a of the vesicle 10 to the inside 10b of the vesicle 10 corresponds.
Zum
einen sind in jedem Vesikel 10 in der Regel eine Vielzahl
hier identischer Membranproteinmoleküle 12 hier in gleicher
Orientierung in der Membran 11 des Vesikels 10 eingebaut.
Werden diese im Wesentlichen simultan aktiviert – z. B. durch einen durch Mischen
initiierten Konzentrationssprung in der Konzentration des Substrats
S von einem nicht aktivierenden Messmedium N, 30 ohne Substrat S
zu einem aktivierenden Messmedium A, 30 mit Substrat S – so führt das
zu einem messbaren elektrischen Strom.For one thing, in every vesicle 10 usually a multitude of identical membrane protein molecules 12 here in the same orientation in the membrane 11 of the vesicle 10 built-in. Are these activated substantially simultaneously - z. B. by an initiated by mixing concentration jump in the concentration of the substrate S from a non-activating measuring medium N, 30 without substrate S to an activating measuring medium A, 30 with substrate S - so this leads to a measurable electric current.
Dieser
Ladungsträgertransport
ist deshalb messbar, weil eine Vielzahl von Primärträgern 10 oder Vesikeln
an der Oberfläche 24a der
Sensorelektrodeneinrichtung 20 angelagert sind, so dass
sich bei Aktivierung einer Vielzahl von Proteinmolekülen 12 in
einer Vielzahl von Vesikeln vor der Oberfläche 24a der Sensorelektrodeneinrichtung 20 eine
Raumladung bestimmter Polarität
ausbildet. Diese Raumladung wirkt dann auf die Elektrode 26,
die in dem in 1 gezeigten Fall auf
einem Träger 22 aus
Glas in Form einer Goldschicht aufgedampft ist und durch eine als
Isolationsbereich 24 dienende Doppelschicht aus einer unteren
Schicht 24b und einer als Oberfläche dienenden Oberschicht 24a abgedeckt
und gegenüber
dem Messmedium 30 elektrisch isoliert wird.This charge carrier transport is measurable because a large number of primary carriers 10 or vesicles on the surface 24a the sensor electrode device 20 are attached, so when activating a variety of protein molecules 12 in a variety of vesicles in front of the surface 24a the sensor electrode device 20 a room charge of a certain polarity. This space charge then acts on the electrode 26 in the in 1 shown case on a support 22 made of glass vapor-deposited in the form of a gold layer and by an insulating region 24 serving double layer of a lower layer 24b and a surface upper layer 24a covered and opposite the measuring medium 30 is electrically isolated.
Die
Oberfläche
oder obere Schicht 24a des Isolationsbereichs 24 ist
zum Beispiel ein zur Lipiddoppelschicht 11 des Vesikels 10 kompatible
Lipidmonoschicht, die mittels eines Self-Assembling-Vorgangs auf
einer die untere Schicht 24b bildenden Alkanthiolmonoschicht
ausgebildet ist, so dass die Abfolge der Schichten 24b und 24a,
nämlich
die Abfolge aus einer Alkanthiolmonoschicht und einer Lipidmonoschicht
auf einem festkörperartig
ausgebildeten Goldsubstrat als Elektrode 26 eine Membranstruktur SSM
bildet, die auch als festkörperunterstützte Membran
bezeichnet wird (SSM: Solid Supported Membrane).The surface or upper layer 24a of the isolation area 24 is for example a lipid bilayer 11 of the vesicle 10 Compatible lipid monolayer, which by means of a self-assembling process on a lower layer 24b forming alkanethiol monolayer is formed, so that the sequence of layers 24b and 24a namely, the sequence of an alkanethiol monolayer and a lipid monolayer on a solid-like gold substrate as an electrode 26 forms a membrane structure SSM, which is also referred to as a solid-supported membrane (SSM: Solid Supported Membrane).
Über eine
Anschlussleitung 48i ist die Sensoranordnung 1 und
insbesondere die Sensorelektrodeneinrichtung 20 mit einer
Datenerfassungs-/Steuereinrichtung 40 verbunden. Diese
weist einen Messeinrichtung 44 auf, in welchem in zeitlicher
Abhängigkeit
ein elektrischer Strom I(t) oder eine elektrische Spannung U(t)
gemessen werden kann. Des Weiteren ist eine Verstärkereinrichtung 42 vorgesehen,
in welcher die Messsignale gefiltert und/oder verstärkt werden. Über eine
Steuerleitung 48s wird die Wirkstofftestung durch Steuerung
der Austausch/Mischeinrichtung 60 geregelt. Über eine weitere
Leitung 48o wird der elektrische Stromkreis mittels einer
Gegenelektrode 46, zum Beispiel in Form einer Pt/Pt-Elektrode oder mittels
einer Ag/AgCl-Elektrode geschlossen. Isolationen 28, 27 und 47 verhindern
Kurzschlüsse
der SSM bzw. der Gegenelektrode 46 gegenüber dem
Messmedium 30.Via a connecting cable 48i is the sensor arrangement 1 and in particular, the sensor electrode device 20 with a data acquisition / control device 40 connected. This has a measuring device 44 in which an electrical current I (t) or an electrical voltage U (t) can be measured in time dependence. Furthermore, an amplifier device 42 provided in which the measurement signals are filtered and / or amplified. Via a control line 48s The drug testing is done by controlling the exchange / mixing device 60 regulated. About another line 48o the electric circuit is by means of a counter electrode 46 , closed for example in the form of a Pt / Pt electrode or by means of an Ag / AgCl electrode. isolations 28 . 27 and 47 prevent short circuits of the SSM or the counter electrode 46 opposite the measuring medium 30 ,
5 zeigt
in schematischer und teilweise geschnittener Seitenansicht eine
Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Biosensoranordnung 1,
bei welcher als Primärträger 10 anstelle
eines Vesikels oder Liposoms ein Membranfragment 10 vorgesehen ist,
in welches in orientierter Art und Weise ein als biologische Einheit 12 dienendes
Membranprotein eingelagert ist. Auch in Bezug auf die Ausführungs form der 5 ist
festzuhalten, dass die Darstellung nicht maßstabsgetreu ist, und zum anderen
in der Regel eine große
Mehrzahl von Membranfragmenten gleichzeitig auf der SSM oder der
Oberfläche 24a der als
Sekundärträger dienenden
Sensorelektrodeneinrichtung 20 angelagert oder adsorbiert
sind. 5 shows a schematic and partially sectioned side view of an embodiment of the biosensor arrangement according to the invention 1 , in which as a primary carrier 10 instead of a vesicle or liposome a membrane fragment 10 is provided, in which in an oriented manner as a biological entity 12 serving membrane protein is incorporated. Also in relation to the execution form of 5 It should be noted that the representation is not to scale, and, on the other hand, typically a large number of membrane fragments simultaneously on the SSM or surface 24a the serving as a secondary carrier sensor electrode device 20 attached or adsorbed.
Auch
hier ist wieder gezeigt, dass durch Umsetzung des im Messmedium 30 vorgesehenen
Substrats S zu einem umgesetzten Substrat S' ein Stofftransport der Spezies Q von
einer Seite 10a des Membranfragments 10 zur gegenüberliegenden
Seite 10b erfolgt, welcher über den entsprechenden Nettoladungstransport
und den damit verbundenen Verschiebungsstrom in zeitlich abhängiger Form
nachgewiesen werden kann.Again, it is shown again that by implementing the in the measuring medium 30 provided substrate S to a converted substrate S 'a mass transfer of the species Q from one side 10a of the membrane fragment 10 to the opposite side 10b which can be detected via the corresponding net charge transport and the associated displacement current in a time-dependent form.
Die 6A bis 11C zeigen Foto zu optischen Fluoreszenzmessungen
an erfindungsgemäßen Biosensoranordnungen
sowie zum vergleich an herkömmlichen
oder mit Primärträgern unbeladenen Biosensoren.
Dabei ist das jeweils mit A bezeichnete Foto in einem optischen
Wellenlängenbereich
aufgenommen, welcher einer für
die Membranen 11 der Primärträger 10 relevanten
Fluoreszenz entspricht und das jeweils mit B bezeichnete Foto in
einem optischen Wellenlängenbereich,
welcher einer für
die Zellorganellen oder Zellkerne der Primärträger 10 relevanten
Fluoreszenz entspricht. Das jeweils mit C bezeichnete Foto ist dann
ein Kompositbild aus den jeweiligen mit A und B bezeichneten Fotos.The 6A to 11C show photo to optical fluorescence measurements on biosensor assemblies according to the invention and for comparison to conventional or unloaded with primary carriers biosensors. In this case, each photo designated A is recorded in an optical wavelength range, which one for the membranes 11 the primary carrier 10 corresponds to relevant fluorescence and each designated B in a photoelectric wavelength range, which one for the cell organelles or cell nuclei of the primary carrier 10 corresponds to relevant fluorescence. Each photo labeled C is then a composite image of the respective photos labeled A and B.
Die 6A bis 6C zeigen
Fotos von optischen Fluoreszenzmessungen an der Oberfläche eines
erfindungsgemäßen Biosensors 1,
der gemäß einem
erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt wurde.The 6A to 6C show photos of optical fluorescence measurements on the surface of a biosensor according to the invention 1 prepared according to a method of the invention.
Dabei
wurden an den Sekundärträger 20 Zellen
als Primärträger 1 angelagert.
Die Membranen 11 dieser Zellen enthalten integriert ein
zur Fluoreszenz anregbares Membranprotein, damit sind über die Messung
und den Nachweis der Fluoreszenzstrahlung – z. B. über ein Foto – diese
Zellmembranen 11 nachweisbar. Ferner sind die Zellkerne
mit einem Fluoreszenzfarbstoff angefärbt und somit analog nachweisbar,
wobei sich die Fluoreszenzstrahlung von Kernfarbstoff und Membranprotein
in ihrer Wellenlänge
unterscheiden.It was to the secondary carrier 20 Cells as primary carrier 1 attached. The membranes 11 These cells contain an integrally stimulable to the fluorescence membrane protein, so are on the measurement and detection of fluorescence radiation -. For example via a photograph - these cell membranes 11 detectable. Furthermore, the cell nuclei are stained with a fluorescent dye and thus detectable analogously, with the fluorescence radiation of nuclear dye and membrane protein differ in their wavelength.
Die
Membran 11 enthält
hier gebundenes YFP als fluoreszierendes Protein, das in der Fluoreszenz
grün erscheint.
Eine Sensoranordnung 1 ohne Membranen erschiene im Bild
schwarz.The membrane 11 contains bound YFP as a fluorescent protein that appears green in fluorescence. A sensor arrangement 1 without membranes, the picture appears black.
Die
Zellkerne sind hier durch Inkubation mit DAPI oder 4',6 Dimainido-2-phenylindol blau
angefärbt.
Dazu werden die Zellen mit Formaldehyd fixiert, gewaschen, 5 min
1 μg/ml
DAPI inkubiert und nochmals gewaschen.The
Nuclei are blue here by incubation with DAPI or 4 ', 6 dimainido-2-phenylindole
stained.
For this, the cells are fixed with formaldehyde, washed, 5 min
1 μg / ml
DAPI incubated and washed again.
6A zeigt
die Membranen 11 Zellen als Primärträger 10, welche auf
einer Biosensoranordnung 1 angelagert sind, wobei die Anlagerung
unter Zentrifugation für
300 s bei 800 g erfolgte. Man kann aus 6C erkennen,
dass die Zellkerne von den Zellmembranen 11 umschlossen
sind. 6B zeigt nur die Zellkerne bzw.
Organellen. 6A shows the membranes 11 Cells as primary carrier 10 which are on a biosensor assembly 1 annealed with centrifugation for 300 seconds at 800 g. You can go out 6C recognize that the cell nuclei of the cell membranes 11 are enclosed. 6B shows only the cell nuclei or organelles.
Die
Abfolge der 7A bis 7C zeigt
dieselbe Biosensoranordnung 1 nach einem Spülvorgang.
Es ist kaum noch eine Blaufärbung
zu Erkennen, die meisten Zellkerne sind also entfernt. Dagegen ist
die grüne
Fluoreszenz der Zellmembranen noch sichtbar. Daraus kann man ableiten,
dass durch den Spülschritt
die an die Oberfläche 20a des
Sekundärträgers 20 gekoppelten
Zellen zunächst
aufgerissen wurden. Dabei wurden dann auch die Zellkerne und das
weitere Zellinnere entfernt. Einzig die an die Oberfläche 20a des
Sekundärträgers 20 gekoppelten Membranen 11 der
Zellen verblieben als Primärträger 10 von
den anderen Zellbestandteilen getrennt und können nun isoliert untersucht
werden, hier als Insideout-Struktur.The sequence of 7A to 7C show the same biosensor arrangement 1 after a rinse. There is hardly any blue color to recognize, so most cell nuclei are removed. In contrast, the green fluorescence of the cell membranes is still visible. From this one can deduce that by the rinsing step to the surface 20a of the secondary carrier 20 coupled cells were first torn open. In this case, the cell nuclei and the further cell interior were removed. Only the surface 20a of the secondary carrier 20 coupled membranes 11 the cells remained as the primary carrier 10 separated from the other cell components and can now be examined in isolation, here as an insideout structure.
Die
Abfolge der 8A bis 8C zeigt eine
andere erfindungsgemäße Biosensoranordnung 1 nach
einem Spülvorgang,
wobei jedoch eine Epifluoreszenztechnik verwendet wurde. Hier sind
die an der Oberfläche 20a des
Sekundärträgers 20 angelagerten
oder anhaftenden Zellmembranen 11 der aufgerissenen Zellen
besonders gut zu erkennen.The sequence of 8A to 8C shows another biosensor arrangement according to the invention 1 after a rinse, but an epifluorescence technique was used. Here are the ones on the surface 20a of the secondary carrier 20 attached or adherent cell membranes 11 the torn cells particularly well to recognize.
Die
Abfolge der 9A bis 9C zeigt eine
erfindungsgemäße Biosensoranordnung 1 nach einem
Spülvorgang,
wobei jedoch Membranfragmente als Primärträger 10 vorgesehen
sind. Auch hier erkennt man eine sehr gute Bedeckung der Oberfläche 20a des
Sekundärträgers 20,
die sich nicht einstellt, wenn der Schritt des Zentrifugierens entfällt.The sequence of 9A to 9C shows a biosensor arrangement according to the invention 1 after a rinse, but with membrane fragments as the primary carrier 10 are provided. Again, you can see a very good coverage of the surface 20a of the secondary carrier 20 which does not occur when the centrifuging step is omitted.
Dies
wird auch aus der Abfolge der 10A bis 10C deutlich. Durch das Fehlen des Zentrifugationsschritts – es handelt
sich also um eine konventionelle oder konventionell hergestellte
Biosensoranordnung – findet
sich nach dem Spülvorgang
eine höchstens
geringe Bedeckung mit Primärträgern 10 auf
der Oberfläche 20a des
Sekundärträgers 20.This is also from the sequence of 10A to 10C clear. Due to the absence of the centrifugation step - that is to say a conventional or conventionally produced biosensor arrangement - there is at most a small amount of coverage with primary carriers after the rinsing process 10 on the surface 20a of the secondary carrier 20 ,
Zum
Vergleich zeigt die Abfolge der 11A bis 11C die Messung einer leeren Biosensoranordnung,
bei welcher keine Primärträger 10 eingesetzt
wurden.For comparison, the sequence of the 11A to 11C the measurement of an empty biosensor arrangement, in which no primary carrier 10 were used.
Diese
und weitere Aspekte werden nun der Grundlage der nachfolgend Bemerkungen
weiter erläutert:
Ein
herkömmliches
Verfahren zum Herstellen von Sensoren und Biosensoranordnungen umfasst
einen Anlagerungsschritt, bei welchem eine Vorform eines Sensors – z. B.
mit Thiol- und Lipidschicht – mit
einer Lösung
inkubiert wird, die Membranfragmente, Vesikel oder ähnliche
Primärträger enthält. Die
Anlagerung oder auch Bindung der Primärträger an die Sensoroberfläche wird
wegen Proteinstabilität
z. B. bei 4°C
durchgeführt
und benötigt
je nach Protein 1 Stunde bis 24 Stunden. In dieser Zeit lagern sich
die Primärträger an die
Oberfläche
des Sensors an. Dadurch wird eine elektrische Kopplung ausgebildet. Semifusion
oder Adsorption über
Chemisorption oder Physiosorption sind als mögliche Mechanismen denkbar,
welche die Anlagerung und die Kopplung definieren. Nach Ende des
Inkubationsschrittes, welcher für
jede Proteinpräparation/jedes
Protein bzw. jede Membranart neu festgelegt werden muss, können die
dann fertigen Sensoren oder Sensoranordnungen elektrophysiologisch
untersucht werden.These and other aspects are now further explained on the basis of the following remarks:
A conventional method for producing sensors and biosensor arrangements comprises an attachment step in which a preform of a sensor - e.g. B. with thiol and lipid layer - is incubated with a solution containing membrane fragments, vesicles or similar primary carrier. The addition or binding of the primary carrier to the sensor surface is due to protein stability z. B. carried out at 4 ° C and requires depending on the protein 1 hour to 24 hours. During this time, the primary carriers are attached to the surface of the sensor. As a result, an electrical coupling is formed. Semifusion or adsorption via chemisorption or physiosorption are conceivable as possible mechanisms that define the attachment and the coupling. After the end of the incubation step, which must be redefined for each protein preparation / protein or each type of membrane, the then finished sensors or sensor arrays can be electrophysiologically examined.
Dabei
fällt auf,
dass durch kleine Variationen bei der Anlagerung, auch bei einem
weitgehend automatisierten Prozess, eine große relative Schwankung der
maximalen Signalamplituden beobachtet wird.there
you notice
that by small variations in the attachment, even at a
largely automated process, a large relative fluctuation of
maximum signal amplitudes is observed.
Ziel
der Erfindung ist unter anderem auch, ein Herstellungsverfahren
mit einer Anlagerungsmethode zu entwickeln, das schnell, für verschiedene Membrantypen
oder andere Primärträger, verschiedene
Proteine und auch für
ganze Zellen eine gute und reproduzierbare Sensorpräparation
ermöglicht, so
dass Nachteile herkömmlicher
Verfahren reduziert oder gar vermieden werden. Diese Nachteile sind
z. B. unter anderem:
- • die begrenzte Reproduzierbarkeit
der Sensorqualität,
- • das
Vorliegen vergleichsweise geringer Signalamplituden oder geringer
Signal-zu-Rauschverhältnisse,
- • Schwierigkeiten
bei oder Anlagerung von ganzen Zellen an die Sensoranordnung.
The aim of the invention is, inter alia, also to develop a production method with an addition method which allows a good and reproducible sensor preparation quickly, for various types of membranes or other primary carriers, different proteins and also for whole cells, so that disadvantages of conventional methods are reduced or even avoided , These disadvantages are z. For example: - • the limited reproducibility of the sensor quality,
- The presence of comparatively small signal amplitudes or low signal-to-noise ratios,
- Difficulty in or attachment of whole cells to the sensor array.
Dazu
werden u. a. auch folgende Maßnahmen
vorgeschlagen, die einzeln verwendet oder beliebig kombiniert werden
können:
- • Die
Sensoren werden nach Zugabe der Primärträger einer Zentrifugation z.
B. bei 700 g, z. B. für 5
Minuten unterzogen.
- • Bei
der Verwendung von Zellen können
die Sensoren vor der Verwendung in einer Messung einem Spülschritt
unterzogen werden. Der Spülvorgang
kann mit der Entfernung der intrazellulären Komponenten der angelagerten
Zellen korelliert werden, wie dies im Zusammenhang mit den 6A und 6B beschrieben
und gezeigt ist. Die mikroskopische Untersuchung der Sensoren vor
und nach dem Spülschritt
zeigt, dass die vor dem Spülen
optisch erkennbaren Zellkerne und ggf. auch andere Organellen nach
dem Spülprozess
nicht mehr gefunden werden. Die Tatsache, dass proteinspezifische
elektrische Signale mittels der Sensoren nach dem Spülen gemessen werden
können
zeigt neben der optischen Fluoreszenzkontrolle gemäß 6a, 6B,
dass die unterste Zellmembranen so fest auf dem Sensor haften, dass
durch das Spülen
die Zelle aufgerissen wird und nur die Zellmembran auf dem Sensor
verbleibt, insbesondere in einer Inside-out-Struktur.
- • Die
Verwendung ganzer Zellen als Proteinquelle oder als zu untersuchende
Objekte, ohne vorher eine Membranpräparation durchführen zu
müssen,
ist hiermit erstmals möglich.
Ein derartig neues Vorgehen ist mit frisch aus einer Kultur entnommenen
Zellen genauso möglich
wie mit aufgetauten.
- • Durch
die erfindungsgemäße Präparation
der messbaren Membran auf dem Sensor wird der Zeitbedarf für die Präparation
von z. B. ca. 4,5 Stunden auf wenige Sekunden pro Sensor reduziert.
- • Die
minimal nötige
Zellmenge oder Proteinmenge wird durch den Bedarf für einen
Sensor bestimmt und nicht durch die minimal für den Aufschluss nötige Menge.
Dadurch können
Zellmengen oder Proteinmengen von unter 1 mg gegenüber 250
mg bei einer miniaturisierten Membranpräparation eingesetzt werden.
- • Die
Ausbeute an Membranen pro eingesetzter Zelle ist deutlich niedriger
als bei einer Membranpräparation.
Dadurch werden die Kosten gesenkt.
- • Neue
Applikationen sind denkbar: Regulation von elektrisch aktiven Membranproteinen
durch intrazelluläre
Mechanismen, Botenstoffe oder Medikamente.
- • Durch
die erhöhte
Geschwindigkeit bei der Präparation
wird ein Vergleich verschiedener Mutanten oder Proteinvarianten
innerhalb weniger Tage nach Verfügbarkeit
der genetischen Information möglich.
- • Die
Sensoren, die durch Zentrifugation bei Anlagerung von Membranpräparationen
erzeugt werden zeigen eine geringere relative Schwankung in der
Signalgröße.
- • Es
ergibt sich bei den erfindungsgemäß erzeugten Sensoren oder Biosensoranordnungen
eine Signalsteigerung oder eine Steigerung des Signal-zu-Rauschverhältnisses
um einen Faktor von 2 bis 20 im Vergleich zu entsprechend herkömmlich hergestellten
Biosensoranordnungen.
Among other things, the following measures are proposed, which can be used individually or combined as desired: - • After the addition of the primary carrier, the sensors are subjected to centrifugation z. B. at 700 g, z. B. for 5 minutes.
- • When cells are used, the sensors may be rinsed before use in one measurement. The rinsing process can be correlated with the removal of the intracellular components of the attached cells, as described in connection with FIGS 6A and 6B described and shown. The microscopic examination of the sensors before and after the rinsing step shows that the cell nuclei optically recognizable prior to rinsing and possibly also other organelles are no longer found after the rinsing process. The fact that protein-specific electrical signals can be measured by means of the sensors after rinsing, in addition to the optical fluorescence control according to FIG 6a . 6B in that the lowermost cell membranes adhere so firmly to the sensor that rinsing ruptures the cell and only the cell membrane remains on the sensor, in particular in an inside-out structure.
- • The use of whole cells as a protein source or as objects to be examined, without any prior To carry out a membrane preparation is hereby possible for the first time. Such a new approach is just as possible with cells freshly removed from a culture as with thawed ones.
- The inventive preparation of the measurable membrane on the sensor, the time required for the preparation of z. B. about 4.5 hours to a few seconds per sensor reduced.
- • The minimum required amount of cells or protein is determined by the need for a sensor and not by the minimum amount required for digestion. As a result, amounts of cells or protein amounts of less than 1 mg compared to 250 mg in a miniaturized membrane preparation can be used.
- The yield of membranes per cell used is significantly lower than with a membrane preparation. This will reduce costs.
- • New applications are conceivable: Regulation of electrically active membrane proteins by intracellular mechanisms, messengers or drugs.
- • Due to the increased preparation speed, a comparison of different mutants or protein variants becomes possible within a few days of the availability of the genetic information.
- • The sensors generated by centrifugation on attachment of membrane preparations show less relative variation in signal size.
- In the case of the sensors or biosensor arrangements produced according to the invention, a signal increase or an increase in the signal-to-noise ratio results by a factor of 2 to 20 in comparison with biosensor arrangements produced in accordance with conventional methods.
Im
Hinblick auf die Anlagerung von ganzen Zellen und/oder von Membranfragmenten
durch das erfindungsgemäße Vorgehen
bei Durchführung
einer Zentrifugation sind unter anderem auch folgende Proteine als
zu untersuchende Spezies denkbar:
- • Organische
Kationentransporter (rOCT2),
- • Chloridkanäle,
- • Bacteriorhodopsin
(BR),
- • Di-Peptid-Transporter
(hPepT1) und
- • GABA
Transporter (GATT).
With regard to the addition of whole cells and / or membrane fragments by the procedure according to the invention when carrying out a centrifugation, the following proteins are also conceivable as species to be investigated: - • organic cation transporters (rOCT2),
- • chloride channels,
- Bacteriorhodopsin (BR),
- • Di-peptide transporter (hPepT1) and
- • GABA Transporter (GATT).
Diese
Proteine stammen aus unterschiedlichen Proteinfamilien.These
Proteins are from different protein families.
Dazu
wurde folgendes gezeigt:
Die Messergebnisse sind dabei bei
herkömmlichen und
erfindungsgemäß gefertigten
Sensoren bei Membranfragmenten und Zellen sind in ihren Eigenschaften
identisch bezüglich
der Signalform:
Ferner sind die Messergebnisse dabei bei herkömmlichen
und erfindungsgemäß gefertigten
Sensoren bei Membranfragmenten identisch bezüglich der Pharmakologie und
der Inhibitionstests.The following was shown:
The measurement results are in conventional and inventively manufactured sensors for membrane fragments and cells are identical in their properties with respect to the waveform:
Furthermore, the measurement results in the case of conventional and inventively manufactured sensors for membrane fragments are identical with regard to pharmacology and inhibition tests.
Die 2A bis 2C zeigen
die Auswertung von Einzelsignalmessungen bei fünf Personen (A bis E), die
jeweils vier mit OCT beladenen Membranfragmenten bestückte Sensoren
herstellten und einer elektrophysiologischen Messung unterwarfen. Jeweils
zwei dieser Sensoren wurden zentrifugiert, also erfindungsgemäß hergestellten;
die beiden anderen Sensoren wurden jeweils normal, also herkömmliche
und ohne Zentrifugation hergestellt. Alle Sensoren – insgesamt
also 20 Stück – wurden
dabei über
Nacht bei 4°C
inkubiert und am nächsten
Tag gemessen. Die maximalen Signalamplituden der nicht zentrifugierten
Sensoren betrugen bei Strommes sungen im Mittel 261 pA mit einem
CV von 40%. Die maximalen Signalamplituden der zentrifugierten Sensoren
betrugen bei Strommessungen im Mittel 1210 pA mit einem CV von 13%.The 2A to 2C show the evaluation of single signal measurements in five persons (A to E), each of which produced four sensors equipped with OCT-loaded membrane fragments and subjected them to an electrophysiological measurement. In each case two of these sensors were centrifuged, thus produced according to the invention; the other two sensors were each made normal, ie conventional and without centrifugation. All sensors - 20 in total - were incubated overnight at 4 ° C and measured the next day. The maximum signal amplitudes of the non-centrifuged sensors were on average 261 pA with a CV of 40%. The maximum signal amplitudes of the centrifuged sensors during current measurements averaged 1210 pA with a CV of 13%.
-
11
-
erfindungsgemäße Sensorelektrodenanordnung
oder SensoranordnungSensor electrode arrangement according to the invention
or sensor arrangement
-
1010
-
Primärträger, Vesikel,
MembranfragmentPrimary carrier, vesicles,
membrane fragment
-
10a10a
-
Oberfläche, Außenseite,
extravesikuläre SeiteSurface, outside,
extravesicular side
-
10b10b
-
Innenseite,
intravesikuläre
SeiteInside,
intravesical
page
-
1111
-
Membran
des Primärträgers 10 Membrane of the primary carrier 10
-
1212
-
biologische
Einheit, Membranproteinbiological
Unit, membrane protein
-
1313
-
Innenmediuminternal medium
-
2020
-
Sekundärträger, Sensorelektrodeneinrichtung,
MembranbiosensorelektrodenbereichSecondary carrier, sensor electrode device,
Membranbiosensorelektrodenbereich
-
20a20a
-
erste
oder obere Oberflächefirst
or upper surface
-
20c20c
-
zweite
oder untere Oberflächesecond
or lower surface
-
2121
-
Elektrodenbereichelectrode area
-
2222
-
Träger, TrägersubstratbereichCarrier, carrier substrate area
-
22a22a
-
Oberflächenbereich,
OberseitenoberflächenbereichSurface area,
Top surface area
-
2424
-
Isolationsbereich,
BiomaterialbereichQuarantine,
biomaterial
-
24a24a
-
Oberschicht,
Oberflächenbereich,
LipidmonoschichtUpper Class,
Surface area,
Lipid monolayer
-
24b24b
-
Unterschicht,
Thiol-/MercaptanmonoschichtUnderlayer
Thiol / Mercaptanmonoschicht
-
2626
-
Elektrodeelectrode
-
26a26a
-
OberseitenoberflächenbereichTop surface area
-
26-126-1
-
Primärmetallbereich,
insbesondere aus/mit KupferPrimary metals sector,
especially from / with copper
-
26-226-2
-
Hilfsschicht,
z. B. Diffusions-/Legierungsbildungsbarriere, insbesondere mit/aus
NickelAuxiliary layer,
z. B. diffusion / alloying barrier, in particular with / out
nickel
-
26-326-3
-
eigentliche
Elektrodenschicht, insbesondere mit/aus Goldreal
Electrode layer, in particular with / of gold
-
2727
-
Isolationisolation
-
2828
-
Isolationisolation
-
2929
-
Anschlussconnection
-
3030
-
Messmediummeasuring medium
-
4040
-
Datenerfassungs-/SteuereinrichtungData acquisition / control device
-
4242
-
Verstärkereinrichtungamplifier means
-
4444
-
Messeinrichtungmeasuring device
-
4646
-
Gegenelektrodecounter electrode
-
48i,o48i, o
-
Anschlussleitungenconnecting cables
-
48s48s
-
Steuerleitungcontrol line
-
5050
-
Messbereich,
Gefäß, KüvetteMeasuring range,
Vessel, cuvette
-
50a50a
-
erste
oder obere Oberflächefirst
or upper surface
-
50c50c
-
zweite
oder untere Oberflächesecond
or lower surface
-
5151
-
Zuführeinrichtungfeeding
-
51a51a
-
Auslassöffnung,
Austrittsöffnungoutlet,
outlet opening
-
5252
-
Abführeinrichtungremoval device
-
52e52e
-
Einlassöffnung,
EintrittsöffnungInlet port,
inlet opening
-
5353
-
VorratsgefäßStorage jar
-
5454
-
VorratsgefäßStorage jar
-
5555
-
VorratsgefäßStorage jar
-
6060
-
Austausch-/MischeinrichtungExchange / mixing device
-
100100
-
Messvorrichtungmeasuring device
-
AA
-
aktivierendes
Messmediumactivating
measuring medium
-
A
+ WA
+ W
-
aktivierendes
Messmedium mit Wirkstoff Wactivating
Measuring medium with active substance W
-
Cm C m
-
spezifische
Kapazitätspecific
capacity
-
Ee
-
Entsorgungdisposal
-
Gm G m
-
spezifische
Leitfähigkeitspecific
conductivity
-
MM
-
MembranbiosensorelektrodenbereichMembranbiosensorelektrodenbereich
-
NN
-
nicht
aktivierendes MessmediumNot
activating measuring medium
-
I(t)I (t)
-
Stromsignalcurrent signal
-
QQ
-
Ladungsträgercharge carrier
-
SS
-
Substratsubstratum
-
S'S '
-
umgesetztes
Substratunconverted
substratum
-
SSMSSM
-
Membranstruktur,
festkörperunterstützte MembranMembrane structure,
solid state supported membrane
-
U(t)U (t)
-
Spannungssignalvoltage signal
-
vv
-
Fließgeschwindigkeit,
StrömungsgeschwindigkeitFlow rate,
flow rate
-
WW
-
Wirkstoffactive substance
-
XX
-
Wirkstoffactive substance