DE102007009659B4 - Use of a diode-pumped solid-state laser and laser scanning microscope with a UV illumination beam path - Google Patents
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Abstract
Verwendung eines diodengepumpten Festkörperlasers mit Frequenzvervielfachung im cw Betrieb zur Erzeugung von UV Strahlung und Einkopplung in den Scankopf eines Laser-Scanning-Mikroskopes über eine Monomode-Lichtleitfaser und einen vor der Monomode-Lichtleitfaser angeordneten angesteuerten AOM oder AOTF zur Regulierung der optischen Leistung oder zum Scannen eines interessierenden Bereichs durch definierte schnelle Anschaltung und Abschaltung.Use of a diode-pumped solid-state laser with frequency multiplication in cw operation to generate UV radiation and couple it into the scan head of a laser scanning microscope via a single-mode optical fiber and a controlled AOM or AOTF arranged in front of the single-mode optical fiber to regulate the optical power or to scan an area of interest by defined rapid switching on and off.
Description
Stand der TechnikState of the art
In einem Laser-Scanning-System werden Laser unterschiedlicher Leistungsklassen verwendet. Weiterhin ist ein Laser-Scanning-System durch eine große Anzahl von variablen Modulen gekennzeichnet, die als Detektor oder zur Beleuchtung dienen.Lasers of different power classes are used in a laser scanning system. A laser scanning system is also characterized by a large number of variable modules that serve as detectors or for illumination.
Ein konfokales Scanmikroskop enthält ein Lasermodul, das bevorzugt aus mehreren Laserstrahlquellen besteht, die Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen erzeugen. Eine Scaneinrichtung, in die das Beleuchtungslicht als Beleuchtungsstrahl eingekoppelt wird, weist einen Hauptfarbteiler, einen x-y-Scanner und ein Scanobjektiv auf, um den Beleuchtungsstrahl durch Strahlablenkung über eine Probe zu führen, die sich auf einem Mikroskoptisch einer Mikroskopeinheit befindet. Ein dadurch erzeugter von der Probe kommender Messlichtstrahl wird über einen Hauptfarbteiler und eine Abbildungsoptik auf mindestens eine konfokale Detektionsblende (Detektionspinhole) eines Detektionskanals gerichtet.A confocal scanning microscope contains a laser module, which preferably consists of several laser beam sources that generate illumination light of different wavelengths. A scanning device, into which the illumination light is coupled as an illumination beam, has a main color splitter, an x-y scanner and a scanning lens in order to guide the illumination beam by beam deflection over a sample that is located on a microscope stage of a microscope unit. A measuring light beam generated in this way and coming from the sample is directed via a main color splitter and an imaging optics onto at least one confocal detection aperture (detection pinhole) of a detection channel.
In
Zur spezifischen Anregung der verschiedenen Farbstoffe in einem Präparat werden in einem LSM Laser mit verschiedenen Wellenlängen eingesetzt. Die Wahl der Anregungswellenlänge richtet sich nach den Absorptionseigenschaften der zu untersuchenden Farbstoffe. Der Anregungsstrahlung wird im Lichtquellenmodul erzeugt. Zum Einsatz kommen hierbei verschiedene Laser (u.a. Argon, Argon Krypton, TiSa-Laser). Weiterhin erfolgt im Lichtquellenmodul die Selektion der Wellenlängen und die Einstellung der Intensität der benötigten Anregungswellenlänge, z.B. durch den Einsatz eines akusto-optischen Kristalls. Anschließend gelangt die Laserstrahlung über eine Faser oder eine geeignete Spiegelanordnung in das Scanmodul.Lasers with different wavelengths are used in an LSM to specifically excite the various dyes in a preparation. The choice of excitation wavelength depends on the absorption properties of the dyes to be examined. The excitation radiation is generated in the light source module. Various lasers are used here (including argon, argon krypton, TiSa laser). The wavelengths are also selected in the light source module and the intensity of the required excitation wavelength is set, e.g. by using an acousto-optical crystal. The laser radiation then reaches the scanning module via a fiber or a suitable mirror arrangement.
Die in der Lichtquelle erzeugte Laserstrahlung wird mit Hilfe des Objektivs beugungsbegrenzt über die Scanner, die Scanoptik und die Tubuslinse in das Präparat fokussiert. Der Fokus rastert punktförmig die Probe in x-y-Richtung ab. Die Pixelverweilzeiten beim Scannen über die Probe liegen meist im Bereich von weniger als einer Mikrosekunde bis zu einigen 100 Mikrosekunden.The laser radiation generated in the light source is focused into the specimen with the help of the objective in a diffraction-limited manner via the scanner, the scanning optics and the tube lens. The focus scans the sample in a point-like manner in the x-y direction. The pixel dwell times when scanning the sample are usually in the range of less than one microsecond to several hundred microseconds.
Bei einer konfokalen Detektion (descanned Detection) des Fluoreszenzlichtes, gelangt das Licht das aus der Fokusebene (Specimen) und aus den darüber- und darunterliegenden Ebenen emittiert wird, über die Scanner auf einen dichroitischen Strahlteiler (MD). Dieser trennt das Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht. Anschließend wird das Fluoreszenzlicht auf eine Blende (konfokale Blende / Pinhole) fokussiert, die sich genau in einer zur Fokusebene konjugierten Ebene befindet. Dadurch werden Fluoreszenzlichtanteile außerhalb des Fokus unterdrückt. Durch Variieren der Blendengröße kann die optische Auflösung des Mikroskops eingestellt werden. Hinter der Blende befindet sich ein weiterer dirchroitischer Blockfilter (EF) der nochmals die Anregungsstrahlung unterdrückt. Nach Passieren des Blockfilters wird das Fluoreszenzlicht mittels eines Punktdetektors (PMT) gemessen.In confocal detection (descanned detection) of the fluorescent light, the light emitted from the focal plane (specimen) and from the planes above and below passes through the scanner to a dichroic beam splitter (MD). This separates the fluorescent light from the excitation light. The fluorescent light is then focused on an aperture (confocal aperture / pinhole) that is located exactly in a plane conjugated to the focal plane. This suppresses fluorescent light components outside the focus. The optical resolution of the microscope can be adjusted by varying the aperture size. Behind the aperture there is another dichroic block filter (EF) that again suppresses the excitation radiation. After passing through the block filter, the fluorescent light is measured using a point detector (PMT).
Bei Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption erfolgt die Anregung der Farbstofffluoreszenz in einem kleinen Volumen an dem die Anregungsintensität besonders hoch ist. Dieser Bereich ist nur unwesentlich größer als der detektierte Bereich bei Verwendung einer konfokalen Anordnung. Der Einsatz einer konfokalen Blende kann somit entfallen und die Detektion kann direkt nach dem Objektiv erfolgen (non descannte Detektion).When using multiphoton absorption, the dye fluorescence is excited in a small volume where the excitation intensity is particularly high. This area is only slightly larger than the area detected when using a confocal arrangement. This eliminates the need for a confocal aperture and detection can take place directly after the lens (non-descanned detection).
In einer weiteren Anordnung zur Detektion einer durch Mehrphotonenabsorption angeregten Farbstofffluoreszenz erfolgt weiterhin eine descannte Detektion, jedoch wird diesmal die Pupille des Objektives in die Detektionseinheit abgebildet (nichtkonfokal descannte Detektion).In another arrangement for detecting dye fluorescence excited by multiphoton absorption, descanned detection is still carried out, but this time the pupil of the objective is imaged into the detection unit (non-confocal descanned detection).
Von einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild wird durch beide Detektionsanordnungen in Verbindung mit der entsprechenden Einphotonen bzw. Mehrphotonen-Absorption nur die Ebene (optischer Schnitt) wiedergegeben, die sich in der Fokusebene des Objektivs befindet. Durch die Aufzeichnung mehrerer optische Schnitte in der x-y Ebene in verschiedenen Tiefen z der Probe kann anschließend rechnergestützt ein dreidimensionales Bild der Probe generiert werden. Das LSM ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Die Anregungswellenlängen werden durch den verwendeten Farbstoff mit seinen spezifischen Absorptionseigenschaften bestimmt. Auf die Emissionseigenschaften 2 des Farbstoffes abgestimmte dichroitische Filter stellen sicher, dass nur das vom jeweiligen Farbstoff ausgesendete Fluoreszenzlicht vom Punktdetektor gemessen wird.From a three-dimensionally illuminated image, both detection arrangements in conjunction with the corresponding single-photon or multi-photon absorption only reproduce the plane (optical section) that is in the focal plane of the objective. By recording several optical sections in the x-y plane at different depths z of the sample, a three-dimensional image of the sample can then be generated using computer support. The LSM is therefore suitable for examining thick specimens. The excitation wavelengths are determined by the dye used with its specific absorption properties. Dichroic filters matched to the emission properties 2 of the dye ensure that only the fluorescent light emitted by the respective dye is measured by the point detector.
In biomedizinischen Applikationen werden zur Zeit mehrere verschiedene Zellregionen mit verschiedenen Farbstoffen gleichzeitig markiert (Multifluoreszenz). Die einzelnen Farbstoffe können mit dem Stand der Technik entweder aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften oder Emissionseigenschaften (Spektren) getrennt nachgewiesen werden. Dazu erfolgt eine zusätzliche Aufspaltung des Fluoreszenzlichts von mehreren Farbstoffen mit den Nebenstrahlteilern (DBS) und eine getrennte Detektion der einzelnen Farbstoffemissionen in getrennten Punktdetektoren (PMT).In biomedical applications, several different cell regions are currently labelled with different dyes simultaneously (multifluorescence). The individual dyes can be labelled with the current technology either on the basis of different absorption properties or emission properties (spectra) can be detected separately. This involves an additional splitting of the fluorescent light from several dyes using the secondary beam splitters (DBS) and a separate detection of the individual dye emissions in separate point detectors (PMT).
Das LSM LIVE der Carl Zeiss Microlmaging GmbH realisiert einen sehr schnellen Linienscanner mit einer Bilderzeugung um 120 Bildern pro Sekunde (LSM 5 LIVE and LSM 5 LIVE DuoScan Laser Scanning Microscope; Carl Zeiss Microlmaging GmbH, veröffentlicht 11/2006).The LSM LIVE from Carl Zeiss Microlmaging GmbH is a very fast line scanner with an image generation rate of around 120 frames per second (LSM 5 LIVE and LSM 5 LIVE DuoScan Laser Scanning Microscope; Carl Zeiss Microlmaging GmbH, published 11/2006).
Die Verbindung der Lichtquellenmodule mit dem Scanmodul erfolgt in der Regel über Lichtleitfasern.The light source modules are usually connected to the scanning module via optical fibers.
Das Einkoppeln mehrerer unabhängiger Laser in eine Faser zur Übertragung zum Scankopf wurde beispielsweise in
Auch aus der
Laserstrahlung einer Frequenz kann beispielsweise durch einen im kontinuierlichen Betrieb (cw-Betrieb; continous wave) betriebenen diodengepumpten Festkörperlaser der Firma Oxxius (siehe Abschnitt Darstellung der Erfindung und ihrer Wirkung und Vorteile) bereitgestellt werden. Dabei kann eine interne Frequenzverdreifachung durchgeführt werden.Laser radiation of a frequency can be provided, for example, by a diode-pumped solid-state laser from Oxxius (see section Description of the invention and its effect and advantages) operated in continuous wave mode. Internal frequency tripling can be carried out in this case.
Ein monolithischer Laser zur Erzeugung und Bereitstellung eines Laserstrahls einer einzigen Wellenlänge ist beispielsweise aus der
In der konfokalen Laserscanmikroskopie werden immer häufiger Experimente mit UV-Laserlicht im Bereich von ca. 350-365 nm durchgeführt.In confocal laser scanning microscopy, experiments with UV laser light in the range of approximately 350-365 nm are increasingly being carried out.
Zur Erzeugung dieser Laserstrahlung wurde bisher meistens ein spezieller Ar-Laser verwendet, der groß und teuer ist. Da er zudem einen extrem kleinen Wirkungsgrad aufweist, ist eine aufwändige Luft- oder manchmal sogar Wasserkühlung erforderlich. Eine zweite, bekannte Methode besteht darin, einen gepulsten, modengekoppelten (üblicherweise, aber nicht zwingend diodengepumpten) Nd:YAG-Laser mit einer Laseremission bei 1064 nm als primäre Laserquelle zu verwenden. Die Ausgangspulse werden dann in einer geeigneten Anordnung, beispielsweise in einem nachgeordneten nichtlinearen optischen Element, in ihrer optischen Frequenz verdreifacht (third harmonic generation, THG), d.h. die Wellenlänge wird gedrittelt. Es ergeben sich Ausgangspulse mit einer Wellenlänge von 355 nm. Es ist auch möglich, das THG-Element direkt in die Laserkavität einzubauen, um letztlich denselben Effekt zu erzielen.To date, a special Ar laser has been used to generate this laser radiation, which is large and expensive. Since it also has an extremely low efficiency, complex air or sometimes even water cooling is required. A second, known method is to use a pulsed, mode-locked (usually, but not necessarily diode-pumped) Nd:YAG laser with a laser emission at 1064 nm as the primary laser source. The output pulses are then tripled in their optical frequency (third harmonic generation, THG) in a suitable arrangement, for example in a downstream nonlinear optical element, i.e. the wavelength is divided into three. This results in output pulses with a wavelength of 355 nm. It is also possible to install the THG element directly in the laser cavity to ultimately achieve the same effect.
Der Nachteil dieser Methode ist, dass man durch die gepulste UV-Ausgangsstrahlung sehr hohe Pulsspitzenleistungen benötigt, um eine für seine Anwendungen genügend hohe Durchschnittsleistung zu erhalten.The disadvantage of this method is that the pulsed UV output radiation requires very high pulse peak powers in order to achieve an average power high enough for the application.
Durch die hohe Pulsspitzenleistung wird jedoch die Oberfläche der Glasfaser, in die die Laserstrahlung eingekoppelt und zum Scankopf hin geleitet wird, sehr schnell zerstört .However, due to the high peak pulse power, the surface of the glass fiber into which the laser radiation is coupled and guided to the scan head is destroyed very quickly.
Dies wird in seiner Wirkung noch dadurch verstärkt, dass man für ein LSM normalerweise eine polarisationserhaltende (polarization maintaining, PM), einmodige (single mode, SM) Glasfaser verwendet.This effect is further enhanced by the fact that a polarization maintaining (PM), single mode (SM) fiber optic cable is normally used for an LSM.
In PM-SM-Glasfasern existieren durch den inneren Aufbau üblicherweise hohe mechanische Spannungen, die gerade für die PM-Eigenschaften sorgen.Due to the internal structure, PM-SM glass fibers typically contain high mechanical stresses, which are precisely what determine the PM properties.
Durch diese inneren Spannungen wird nun die Zerstörschwelle der Fasern weiter herabgesetzt, so dass ein Degradieren der Faser bei noch kleineren Leistungen einsetzt. Dadurch sind diese gepulsten UV-Laser für ein fasergekoppeltes LSM so nicht oder nur bei für viele Anwendungen zu geringen Leistungen verwendbar.These internal stresses further reduce the damage threshold of the fibers, so that degradation of the fiber begins at even lower power levels. As a result, these pulsed UV lasers cannot be used for a fiber-coupled LSM or can only be used at power levels that are too low for many applications.
Darstellung der Erfindung und ihrer Wirkungen und VorteileDescription of the invention and its effects and advantages
Erfindungsgemäß wurde erkannt, dass sich die oben genannten Probleme durch die Verwendung eines diodengepumpten Festkörperlasers (diode pumped solid state DPSS), der zur Erzeugung von UV Strahlung frequenzverdreifacht wird und im cw-Betrieb läuft, lösen lassen.According to the invention, it was recognized that the above-mentioned problems can be solved by using a diode pumped solid state laser (DPSS), which is frequency tripled to generate UV radiation and runs in cw mode.
Solche Laser werden derzeit beispielsweise von der Firma Oxxius S. A. beschrieben (
Der mögliche Aufbau des LSM mit dem Laser ist in
Der Laser L wird über eine Einkoppeloptik KO in eine Monomodefaser F eingekoppelt und wie oben beschrieben in den LSM Strahlengang MI eingekoppelt.The laser L is coupled into a single-mode fiber F via a coupling optics KO and coupled into the LSM beam path MI as described above.
Einzelheiten zum cw-DPSS-THG-Laser kann man der Veröffentlichung von Oxxius entnehmen:
Durch den cw-Betrieb entstehen keine hohen Pulsspitzenleistungen, und die Stirnseite der Glasfaser wird weniger stark als im Pulsbetrieb beansprucht. Dadurch ist die Verwendung höhere Durchschnittsleistungen als bei gepulsten Systemen für die Experimente am LSM möglich. Durchschnittsleistungen (aus einem cw-Laser) von deutlich mehr als 50 mW werden heutzutage vom Anwender benötigt und in handelsüblichen LSMs, beispielsweise ·dem LSM 510 von Carl Zeiss, eingesetzt.CW operation does not result in high peak pulse powers, and the front side of the fiber optic is less stressed than in pulsed operation. This makes it possible to use higher average powers than with pulsed systems for experiments at the LSM. Average powers (from a cw laser) of significantly more than 50 mW are required by users today and are used in commercially available LSMs, for example the LSM 510 from Carl Zeiss.
Im Pulsbetrieb arbeitende UV-Laser zerstören die Stirnseite der Glasfaser jedoch innerhalb weniger Stunden.However, UV lasers operating in pulsed mode destroy the front side of the glass fiber within a few hours.
Der Laserstrahl wird vor der Einkopplung in die Glasfaser noch durch einen AOM (oder AOTF) geleitet, siehe Skizze in
In diesem Fall lässt sich die optische Leistung regulieren oder beim Scannen eine „region of interest (ROI)“ durch definierte schnelle An- und Abschaltung definieren (
Weiterhin kann auch ein Shutter zwischen Laser und AOM bzw. Glasfaser sitzen könnte, um die Belastung der Faser während der Zeiten, zu denen keine Bildaufnahme stattfindet, zu verringern.
- • Prinzipiell können auch andere Laser als Nd:YAG als Ausgangslaser verwendet werden, sofern deren Wellenlänge (bei Verwendung von THG) im Bereich um 1064 nm liegt.
- • Auch frequenzverdoppelte Festkörper cw-Laser (sofern es welche mit Wellenlänge im Bereich 710 nm gibt) können verwendet werden.
- • In principle, lasers other than Nd:YAG can be used as output lasers, provided their wavelength (when using THG) is in the range of 1064 nm.
- • Frequency-doubled solid-state cw lasers (if there are any with a wavelength in the 710 nm range) can also be used.
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