DE102006045130A1 - Laserscanningmikroskopie zur Analyse des Bleichverhaltens einer Probe - Google Patents

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    • G02B21/008Details of detection or image processing, including general computer control

Abstract

Es wird beschrieben ein Laserscanningmikroskopie-Verfahren zur Analyse des Bleichverhaltens einer fluoreszierenden Probe (2), bei dem auf die Probe (2) in einem Probenbereich (27) durch Einstrahlung von Beleuchtungsstrahlung (17) bestimmter Intensität eingewirkt wird und durch Abtasten eines des Probenbereiches (27) beinhaltenden Probengebietes (28) die Reaktion der Probe auf diese Einwirkung erfasst wird, wobei die Probe (2) entlang einer Kurve (28) abgetastet wird, die innerhalb eines den Probenbereich (27) umgebenden Ringes oder Torus liegt.

Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Laserscanning-Mikroskopie-Verfahren zur Analyse des Bleichverhaltens einer fluoreszierenden Probe, bei dem auf die Probe in einem Probenbereich durch Einstrahlung von Beleuchtungsstrahlung bestimmter Intensität eingewirkt wird und durch Abtasten eines des Probenbereiches beinhaltenden Probengebietes die Reaktion der Probe auf diese Einwirkung erfaßt wird. Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Laserscanning-Mikroskop sowie ein Computerprogrammprodukt für ein computergesteuertes Laserscanning-Mikroskop zur Ausführung des genannten Verfahrens.
  • Laserscanning-Mikroskope sind im Stand der Technik bekannt. Hierzu wird beispielsweise auf die DE 19702753 A1 oder die DE 10257237 A1 verwiesen, die beide ein als Laserscanning-Mikroskop ausgebildetes Lichtrastermikroskop beschreiben. In diesem Zusammenhang sei angemerkt, daß hier unter dem Begriff „Licht" der gesamte, den optischen Gesetzen gehorchende Bereich der elektromagnetischen Strahlung verstanden wird.
  • Lichtrastermikroskope bzw. Laserscanning-Mikroskope gewinnen ein Objektbild üblicherweise durch Abrastern des Objektes mit einer Spot- oder Multispotanordnung. Die in den Spot- oder Multispotbereichen aufgenommene Strahlung wird mit möglichst hoher Tiefenauflösung so detektiert, daß keine Struktur des Spots oder des Multispots aufgelöst wird, beispielsweise durch eine sogenannte konfokale Detektion. Ein Verschieben des Spot- oder Multispotbereiches über das Objekt liefert dann das Bild. Am Detektor liegt somit immer nur Strahlungsinformation zum jeweiligen Spot- bzw. Multispotbereich vor, und ein elektronisches Zusammenfügen dieser Bildinformation zu den einzelnen Punkten des Bildes (entsprechend den Spot/Multispotbereichen) unter Berücksichtigung der Verschiebung der Spot- oder Multispotbereiche führt zum gewünschten Bild. Konfokale Detektion ist dabei eine übliche Möglichkeit, eine sehr hohe Tiefenauflösung zu erreichen. Die Signalauswertung ist dann im wesentlichen auf die Fokalebene eingeschränkt, da außerhalb der Fokalebene liegende Bereiche keine wesentliche Signalinformation bei der konfokalen Detektion liefern; sie werden vor oder hinter die konfokale Blende abgebildet.
  • Zur Aufnahme des Bildes ist es bei einem Laserscanning-Mikroskop also bedeutsam, den auf einen Punkt (Spot) oder Punktgruppe (Multispot) fokussierten Lichtstrahl über das Objekt abzulenken. Es ist bekannt, dazu eine Scaneinrichtung zu verwenden, die den Strahl zweiachsig ablenkt. Gebräuchlich sind Scaneinrichtungen, die zwei Scanelemente haben, welche den Strahl jeweils einachsig einstellbar ablenken. Beispiele für Scanelemente, die bei Lichtrastermikroskopen verwendet werden, sind Galvanometerspiegel oder akustisch optische Modulatoren. Die Ablenkung mit den beiden Scanelementen erfolgt günstigerweise um orthogonal zueinander liegende Achsen. Bezogen auf das aufgenommene Bild spricht man deshalb davon, daß ein Scanelement die Ablenkung in Zeilenrichtung, das andere Element in der senkrecht dazu liegenden Bild-Richtung (denkbar wäre auch die Bezeichnung „Spaltenrichtung") bewirkt.
  • Laserscanning-Mikroskope eignen sich besonders zur Analyse der Fluoreszenzeigenschaften von Proben, insbesondere biologischer Proben. Hierbei ist die Erfassung dynamischer Prozesse von besonderem Interesse.
  • Ein bekanntes Verfahren zur Analyse dynamischer Vorgänge in einer Probe, beispielsweise einem biologischen Material, ist das sogenannte FLIR-Verfahren (bitte Bezeichnung überprüfen). Dabei wird eine Probe in einem üblicherweise möglichst punktförmigen Probenbereich derart mit Anregungsstrahlung beleuchtet, daß die Fluoreszenzeigenschaften im beleuchteten Bereich abnehmen. Man spricht von Bleichen der Probe bzw. des Fluorophors, die bzw. der aufgrund der hohen Anregungsstrahlungsintensität seine Fluoreszenzeigenschaften zumindest teilweise verliert oder ändert. Unter Bleichen wird im Sinne der Erfindung also verstanden, daß eine Probe ihre Fluoreszenzeigenschaften derart ändert, daß bestimmte Fluoreszenzstrahlung nur noch vermindert eingestrahlt wird. „Bleichen" kann also dadurch auftreten, daß die Probe insgesamt am gebleichten Probenbereich weniger fluoresziert oder die Fluoreszenzeigenschaften gegenüber dem Ausgangszustand spektral verändert sind, so daß in bestimmten Spektralbereichen die Fluoreszenzintensität durch das Bleichen vermindert ist.
  • Beim genannten FLIR-Verfahren möchte man verfolgen, wie sich das Bleichen an einem Bereich oder Punkt der Probe auf die restliche Probe auswirkt, beispielsweise durch Diffusion der in ihren Fluoreszenzeigenschaften geänderten Probenbestandteile, z.B. Fluorophore. Man setzt dazu beispielsweise Fluorophore ein, die an bestimmten biologischen Strukturen ankoppeln, so daß man aus der Diffusion der Fluorophore einen Rückschluß auf die Bewegung der biologischen Strukturen, an denen die Fluorophore angekoppelt sind, erhält.
  • Das FLIR-Verfahren ist exemplarisch für eine solche Analyse dynamischer Prozesse, bei der auf die Probe in einem kleinen Bereich besonders eingewirkt wird, und die Reaktion der Probe auf diese Einwirkung in einem größeren, den kleinen Bereich umgebenden Gebiet erfaßt werden soll. Die Geschwindigkeit, mit der dieses Gebiet abgebildet werden kann, erweist sich als maßgeblich für die erreichbare Zeitauflösung der Analyse der dynamischen Prozesse. Man ist deshalb im Stand der Technik bemüht, die Geschwindigkeit der Bildaufnahme möglichst zu steigern, um auch hochdynamische Prozesse erfassen zu können. Entsprechend steigen die Anforderungen an die Ablenkgeschwindigkeit, mit der in einem Laserscanning-Mikroskop das Scannen erfolgen kann, sowie an die Nachweisempfindlichkeit der Detektoren, die die Meßzeit für den einzelnen Bildpunktes bestimmt.
  • Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Laserscanning-Mikroskopie-Verfahren bzw. ein Laserscanning-Mikroskop bzw. ein Computerprogrammprodukt für ein computergeschütztes Laserscanning-Mikroskop der eingangs genannten Art derart auszugestalten, daß hochdynamische Prozesse mit möglichst geringem Aufwand verfolgt werden können.
  • Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zur Erfassung der Reaktion der Probe auf die Einwirkung (z.B. Bleichen) die Probe entlang einer Kurve abgetastet wird, die innerhalb eines den Probenbereich umgebenden Ringes oder Torus liegt.
  • Abkehrend vom Stand der Technik wird also nicht mehr danach getrachtet, durch Steigerung der Arbeitsgeschwindigkeit des Laserscanning-Mikroskopes ein bestimmtes Gebiet vollständig in noch kürzerer Zeit zu erfassen, sondern die Erfassung erfolgt lediglich in einem den Probenbereich, in dem eingewirkt wurde, umgebenden Ring oder Torus. Die für die Datenaufnahme eines derart gestalteten Gebietes erforderliche Zeit ist nun durch die verminderte Fläche/das verminderte Volumen drastisch reduziert, ohne daß die apparativen Anforderungen steigen. Dennoch ist ein dynamischer Vorgang in allen Richtungen vom Zentrum, in dem der Vorgang durch das Einwirken ausgelöst wurde, her darstellbar.
  • Eine besonders gute Erfassung des dynamischen Prozesses erhält man, wenn die Kurve innerhalb des Ringes oder Torus geschlossen ist. Die Datenaufnahme bzw. das Abtasten erfolgt somit auf einer geschlossenen, den Probenbereich, in dem die Reaktion ausgelöst wurde, umgebenden oder umschreibenden (nicht notwendigerweise direkt umgrenzenden) Gebiet. Die Wahl des Abstandes zwischen der inneren Gebietsgrenze und dem Probenbereich ist applikativ abhängig von der jeweiligen Anwendung für den Fachmann einfach zu wählen. Sie ist vorteilhafter Weise so einzustellen, daß ein Umlauf um den Probenbereich eine Zeitspanne in Anspruch nimmt, die kurz gegen die Geschwindigkeit der zu erwartenden dynamischen Prozesse ist.
  • Der Ring oder Torus muß nicht zwingend rotationssymmetrisch sein. Prinzipiell genügt für die Erfindung jede geschlossene zwei- oder dreidimensionale Figur, die im mathematischen Sinne ein wegzusammenhängender aber nicht einfach zusammenhängender Raum, und in deren Loch sich der Probenbereich, in dem die Reaktion ausgelöst wurde, befindet.
  • Unter dem Gesichtspunkt der maximalen Scangeschwindigkeit ist es natürlich zu bevorzugen, wenn bei der Ansteuerung der für das Scannen bekanntermaßen verwendeten Ablenkeinrichtung möglichst geringe Frequenzen auftreten. Verwendet man als geschlossene Kurve eine Kreisbahn, ist bezüglich der Frequenzen das Optimum erreicht, da dann idealerweise die Ablenkeinrichtung in zwei orthogonalen Raumrichtungen jeweils nur eine Frequenz realisieren muß. Gleiches gilt natürlich im Falle einer Ellipse, bei der ebenfalls in zwei orthogonalen Richtungen nur eine Frequenz zur Erzeugung in der Ablenkeinrichtung anfällt; abweichend zur Kreisbahn sind die Frequenzen dann verschieden. Durch einen solchen Ansatz ergibt sich eine weitere Beschleunigung beim Abtasten, da hohe Frequenzen mit sich bringende Umkehrpunkte, wie sie beim üblichen zeilen- und bildweisen Rastern eines Probengebietes erforderlich sind, nicht mehr berücksichtigt werden müssen. Die Ablenkeinrichtung kann also beim erfindungsgemäßen Vorgehen schneller arbeiten, wenn Kreis-, Ellipsen- oder diesen nahekommende Bahnen (z.B. oval) verwendet werden.
  • Der erfindungsgemäße Ansatz ermöglicht eine sehr große Freiheit bei der Wahl der Kurven. Neben geschlossenen Kurven sind natürlich auch „fast" geschlossene Kurven denkbar, beispielsweise Spiralen o.ä. Hier muß lediglich darauf geachtet werden, daß der räumliche Abstand in zwei aufeinanderfolgenden Umläufen abtastete Bahnen gering gegen die Geschwindigkeit der zu untersuchenden Prozesse ist. Tastet man beispielsweise innerhalb des Ringes oder Torus mit einer Spirale ab, sollte der Abstand benachbarter Spiralwindungen geringer sein, als das Produkt aus erwarteter Diffusionsgeschwindigkeit und Umlaufzeit der Abtastung.
  • Eine weitere Analysenvertiefung erhält man, wenn man innerhalb des Ringes oder Torus auf Kreis- oder Ellipsenbahnen mit unterschiedlichen Parametern abtastet, also mehrere konzentrische Kurven verwendet.
  • Das erfindungsgemäße Laserscanning-Mikroskop unterscheidet sich von herkömmlichen Geräten im wesentlichen hinsichtlich der Realisierung des Steuergerätes, das nun die eingangs erwähnten Abtastparameter beim Betrieb des Mikroskops vorgibt. Analoges gilt hinsichtlich des erfindungsgemäßen Computerprogrammproduktes, das in Form einer Diskette, eines Festspeichers, einer über Netze übertragbaren Steuerdatei o.ä. vorliegen kann und bei einem computergesteuerten Laserscanning-Mikroskop, wie es heutzutage üblich ist, den entsprechenden Betrieb realisiert bzw. den Anwender bei der Einstellung der entsprechenden Betriebsparameter unterstützt.
  • Die Abtastung entlang der Kurve im Ring oder Torus erfolgt vorteilhafterweise konfokal. Die Beleuchtung kann ebenfalls konfokal in den Probenbereich eingestrahlt werden. Eine konfokale Arbeitsweise ist vorteilhaft, aber nicht zwingend. So kann die Abtastung entlang der Kurve auch ohne konfokale Filterung erfolgen, wenn z.B. nur geringe Ortsauflösungsanforderungen bestehen. Analoges gilt für die Beleuchtung des Probenbereiches.
  • Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung beispielshalber noch näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:
  • 1 eine schematische Darstellung eines Laserscanning-Mikroskops,
  • 2 eine schematische Darstellung der Bahnkurve beim Abtasten eines Laserscanning-Mikroskops und
  • 3 eine Abtastung mit dem Laserscanning-Mikroskop der 1 gemäß einem Verfahren nach dem Stand der Technik.
  • 1 zeigt schematisch ein als Laserscanning-Mikroskop (LSM) 1 ausgebildetes Lichtraster-Mikroskop. Mit dem LSM 1 wird ein Objekt 2 (nachfolgend auch als Probe bezeichnet) auf noch zu erläuternde Art vermessen. Das LSM 1 ist im wesentlichen in ein Mikroskopmodul 3, ein Detektionsmodul 4 sowie ein Beleuchtungs- oder Anregungsmodul 5 unterteilt. Das Anregungsmodul stellt Anregungsstrahlung bereit und speist diese in das Mikroskopmodul 3 ein, so daß sie als spotförmige Beleuchtung auf das Objekt 2 gerichtet wird. Die spotförmige Beleuchtung wird vom Mikroskopmodul 3 rasternd über das Objekt 2 geführt. Der am Objekt dabei mit Beleuchtungsstrahlung aus dem Beleuchtungsmodul 5 beleuchtete Spotbereich wird über das Mikroskopmodul 3 vom Detektionsmodul 4 konfokal detektiert. Gestaltet man die Beleuchtung als Anregungsstrahlung aus, kann dabei ein Bild der Fluoreszenzeigenschaften des Objektes 2 gewonnen werden.
  • Das Beleuchtungs- oder Anregungsmodul 5 weist zur Beleuchtung Lichtquellen 6 und 7 auf, die beispielsweise als Laser ausgebildet sein können. Die Strahlung aus den Lichtquellen 6 und 7 wird über einen Umlenkspiegel 8 bzw. einen Strahlteiler 9 sowie eine Beleuchtungsoptik 10 zu einem als Hauptfarbteiler bezeichneten Strahlteiler 11 geleitet, wo sie in das Mikroskopmodul 3 eingekoppelt ist. Die konkrete Ausgestaltung der Einkopplung der Strahlung, im vorliegenden Ausführungsbeispiel durch Umlenkspiegel 8, Strahlteiler 9 und Beleuchtungsoptik 10 realisiert, ist für die nachfolgende Erfindung ohne weitere Bedeutung. Es sind auch andere Bauweisen möglich, beispielsweise mittels Faseroptiken und geeigneten Faseroptikkopplern. Auch kann abweichend von den in 1 gezeigten zwei Lichtquellen natürlich nur eine einzige Lichtquelle oder eine größere Anzahl an Lichtquellen zum Einsatz kommen. Wesentlich für die Erfindung ist hier nur, daß am Hauptfarbteiler 11 ein Beleuchtungsstrahl 17 eingekoppelt wird.
  • Der Hauptfarbteiler 11 kann beispielsweise wie in der bereits genannten DE 19702753 A1 aufgebaut sein. Anstelle des dort beschriebenen dichroitischen Hauptfarbteilers kann auch ein farbneutraler Teiler verwendet werden, wie er z.B. in der DE 10257237 A1 geschildert ist.
  • Die vom Beleuchtungs- oder Anregungsmodul 5 am Hauptfarbteiler 11 ankommende Strahlung in Form des Beleuchtungsstrahles 17 wird dann mittels einer Scaneinrichtung 12 sowie einer Scanoptik 13 durch eine Tubuslinse 15 und ein Objektiv 16 auf oder in das Objekt 2 fokussiert. Die Fokussierung erfolgt dabei im Ausführungsbeispiel in einen beugungsbegrenzten Fokus, dessen Lage im Objekt 2 längs der optischen Achse durch einen verstellbaren Probentisch 18 eingestellt werden kann. Die Scaneinrichtung 12 lenkt den vom Hauptfarbteiler 11 kommenden Beleuchtungsstrahl 17 zweiachsig ab, so daß dieser als unterschiedlich ausgelenkter Strahl 19 durch die Tubuslinse 14 und das Objektiv 16 auf bzw. in das Objekt 2 fällt, mithin im Objekt 2 an unterschiedliche Stellen quer zur optischen Achse fokussiert ist.
  • Zur Beobachtung des Objektes 2 für einen Mikroskopbenutzer ist zwischen der Scanoptik 13 sowie der Tubuslinse 15 noch optional ein als Strahlteiler ausgebildeter Umlenkspiegel 14 vorgesehen, der eine visuelle Inspektion ermöglicht.
  • Mittels der Scaneinrichtung 12, die wie der Probentisch 18 auch von einem Steuergerät 26 über nicht näher bezeichnete bzw. nicht dargestellte Leitungen angesteuert wird, wird der Fokus des abgelenkten Beleuchtungsstrahls 19 durch das Objektiv 16 an unterschiedliche Stellen im Objekt plaziert. Insgesamt erfolgt eine dreidimensionale Positionierung. Die Ablenkung durch die Scaneinrichtung 12 bewirkt dabei die Aufnahme eines zweidimensionalen Bildes, dessen Tiefenlage im Objekt 2 als dritte Dimension durch die Einstellung des Probentisches 18, d.h. die Lage der Fokalebene im Objekt 2 bestimmt ist. Alternativ ist auch eine Fokusverstellung durch Einstellung des Objektives 16 möglich.
  • Die im Objekt 2 durch die Beleuchtung erzeugte Strahlung, z.B. Fluoreszenzstrahlung, wird durch Abbildung des Fokusses im Objekt 2 mittels des Objektivs 16 und der Tubuslinse 15 sowie der Scanoptik 13 in das Detektionsmodul 4 für jeden Punkt des aufzunehmenden Bildes detektiert. Der Hauptfarbteiler 11 leitet dazu den nach Durchlauf durch die Scaneinrichtung 12 in Abbildungsrichtung wieder ruhenden Strahl 21 zum Detektionsmodul 4, das konfokale Detektorelemente aufweist. Über einen Auskoppler 22 und eine Pinholeoptik 23 erfolgt an einem Pinhole 24 eine konfokale Filterung der Strahlung aus dem Fokus im Objekt 2. Die Ebene der konfokalen Blende 24 ist konjugiert zur Fokusebene im Objekt 2. Ein Detektor 25 nimmt die konfokal gefilterte Strahlung auf. Auch er ist mit dem Steuergerät 26 verbunden. Das Steuergerät 26 erzeugt so zu jeder Lage des Fokus im Objekt 2 einen entsprechenden Bildpunkt, der durch die Intensitätsinformation vom Detektor 25 sowie seine Lage im Bild durch die Stellung der Scaneinrichtung 12 charakterisiert ist. Das Detektionsmodul 4 kann dabei je nach Ausführungsform mehrere spektrale Kanäle aufweisen. Es sind dann die entsprechenden Elemente 22 bis 25 mehrfach vorhanden. In 1 ist dies schematisch durch einen zweiten Detektionskanal symbolisiert, dessen Bezugszeichen mit einem Apostroph versehen sind. Eine strichpunktierte Linie deutet an, daß noch weitere Detektionskanäle möglich sind. Die Auskoppler 22 bzw. 22' fungieren somit als sogenannte Nebenfarbteiler. Ihre spektrale Charakteristik bestimmt, welcher Spektralbereich die vom zugeordneten Detektor nachgewiesene Strahlung hat. Der Aufbau des Detektionsmoduls 4 ist für die hier beschriebene Erfindung nicht weiter von Interesse, insbesondere ist es nicht ausschlaggebend, ob bzw. wie eine konfokale Filterung erfolgt. Wesentlich für die Erfindung ist hier lediglich, daß nach der Scaneinrichtung 12 ein ruhender Strahl 21 vorliegt, der in der Literatur auch als de-scannter Strahl bezeichnet wird.
  • Die Scaneinrichtung 12 sorgt dafür, daß der Strahl zweiachsig zum ausgelenkten Strahl 19 abgelenkt wird, wodurch der Fokus der Beleuchtungsstrahlung im Objekt 2 ein senkrecht zur Einfallsrichtung der Beleuchtungsstrahlung bzw. zur Abbildungsrichtung liegendes Feld überstreicht. Dies wird als Scannen bezeichnet. In umgekehrter (Abbildungs-)Richtung sorgt die Scaneinrichtung dafür, daß zweidimensional verteilte Bildpunkte auf einen nichtortsauflösenden Detektor zeitsequentiell abgebildet werden. Dies wird als de-scannen bezeichnet.
  • Mit dem LSM 1 sollen dynamische Vorgänge z.B. als Reaktion auf das Bleichen des Objektes 2 untersucht werden. Ein Beispiel für solche Vorgänge sind die bereits erwähnten Diffusionsprozesse. Dazu wird in einem Beispiel das Objekt 2, beispielsweise eine biologische Probe, in einem bestimmten Probenbereich mit Anregungsstrahlung 17 derart beleuchtet, daß die Fluoreszenzeigenschaften geändert werden, was, wie eingangs eben bereits erwähnt, hier als Bleichen bezeichnet wird. 2 zeigt einen entsprechenden schematischen Blick auf die Oberfläche des Objektes 2 bzw. die biologische Probe. Nach dem Einwirken auf den Probenbereich 27 wird die Probe mit dem LSM 1 auf einer Kurve 28 abgetastet, die im Ausführungsbeispiel als geschlossener Kreis den Probenbereich 27 umgibt. Während einer kontinuierlichen Datenaufnahme wird der Kreis auf der Kurve 28 mehrmals durchlaufen. Die zeitliche Aufnahme der entsprechenden Intensitätsinformation erlaubt es dann die dynamische Reaktion der Probe auf das Einwirken im Probenbereich 27 hin in allen Richtungen von dem Probenbereich 27 aus darzustellen.
  • Die Datenaufnahme kann damit sehr viel schneller erfolgen, als dies im Stand der Technik möglich war, der exemplarisch in 3 verdeutlicht ist. Dort erfolgt nach dem Bleichen im Probenbereich 27 ein Abrastern eines Probenfeldes 29. Das Abrastern ist durch die Kreuz-Schraffierung des Feldes 9 symbolisiert. Es ist leicht einsehbar, daß das Abrastern des Feldes 29 sehr viel länger dauert, als das Umlaufen um die Kurve 28. Auch ist leicht zu erkennen, daß an den Umkehrpunkten zwischen den einzelnen Zeilen, mit denen das Feld 29 abgetastet wird, sehr viel höhere Verstellgeschwindigkeiten (und damit Frequenzen) erforderlich sind, als während des normalen Vorschubes entlang der Zeilen. Die maximale Bewegungsgeschwindigkeit der Scaneinrichtung 12 ist somit beim Vorgehen gemäß dem Stand der Technik analog 3 nicht für den eigentlichen Vorschub entlang der Zeilen verwendbar. Bei der geschlossenen Kurve 28 der 2 ist dies anders. Hier kann, da eine Synthetisierung der Kreisbahn aus zwei orthogonalen Bewegungen durch die Scanspiegel der Scaneinrichtung 12 lediglich eine einzige Frequenz erfordert, mit sehr viel höherer Geschwindigkeit die Kurve 28 abgefahren werden.
  • Die beschriebene Ausführungsform kann dahingehend abgewandelt werden, daß die Kurve 28 nicht als geschlossener Kreisring, sondern als Spirale oder Lissajou-Figur aufgebaut wird. Auch kann zusätzlich zum Strahlengang des in 1 gezeigten LSM 1 noch ein eigenständiger Strahlengang zur Einstrahlung der Beleuchtungsstrahlung unabhängig vom Abbilden des Gebietes verwendet werden. Dazu ist regelmäßig eine zweite Scaneinrichtung 12 vorgesehen. Dann kann das Leuchten zum Bleichen unabhängig von der Datenerfassung ausgeführt werden, so daß die Datenaufnahme simultan zum Bleichen möglich ist.

Claims (7)

  1. Laserscanningmikroskopie-Verfahren zur Analyse des Bleichverhaltens einer fluoreszierenden Probe (2), bei dem auf die Probe (2) in einem Probenbereich (27) durch Einstrahlung von Beleuchtungsstrahlung (17) bestimmter Intensität eingewirkt wird und durch Abtasten eines des Probenbereiches (27) beinhaltenden Probengebietes (28) die Reaktion der Probe auf diese Einwirkung erfaßt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe (2) entlang einer Kurve (28) abgetastet wird, die innerhalb eines den Probenbereich (27) umgebendes Ringes oder Torus liegt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kurve (28) geschlossen ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Ring ein Kreisring ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß nacheinander entlang mehrerer Kreisringe mit unterschiedlichem Radius abgetastet wird.
  5. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Einwirkung ein Bleichen der Probe (2) hinsichtlich der Abgabe von Fluoreszenzstrahlung ist.
  6. Laserscanning-Mikroskop mit einem Steuergerät (26), das das Mikroskop (1) gemäß dem Verfahren nach einem der obigen Ansprüche 1 bis 5 ansteuert.
  7. Computerprogrammprodukt für ein computergesteuertes Laserscanning-Mikroskop (1), mit Programmitteln zum Steuern des Mikroskops (1) gemäß dem Verfahren nach einem der obigen Ansprüche 1 bis 5.
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