DE102006041388A1 - Nutrient medium for culturing protozoa comprises yeast extract, phosphate, hemin and glucose - Google Patents

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Abstract

Nutrient medium for culturing protozoa comprises yeast extract, phosphate, hemin and glucose. An independent claim is also included for for culturing protozoa in a medium as above at 22-34[deg] C.

Description

Die Erfindung betrifft ein Nährmedium und Verfahren zur Kultivierung eines Protozoan zu hohen Zelldichten mit hohen spezifischen Wachstumsraten, insbesondere für die Produktion humaner rekombinanter Proteine mittels eukaryotischer Expressionssysteme.The Invention relates to a nutrient medium and methods of cultivating a protozoan to high cell densities with high specific growth rates, especially for production human recombinant proteins by eukaryotic expression systems.

Der Eukaryot Leishmania gehört in das Reich der Protozoen und zu der Ordnung der Kinetoplasten. Diese Organismengruppe zeichnet sich durch ein zusätzliches Zellorganell mit DNA aus. Die Spezies Leishmania ist ein Parasit für den Menschen, aber auch für Hunde, Nagetiere, Eidechsen und andere Säugetiere. Die human-pathogenen Stämme sind Auslöser für die Krankheiten Leishmaniasis, Kalar-Azar und Orientbeule, welche in tropischen und subtropischen Gebieten der Erde auftreten.Of the Eukaryot Leishmania belongs into the kingdom of the protozoa and to the order of the kinetoplasts. This group of organisms is characterized by an additional Cell organelle with DNA out. The species Leishmania is a parasite for the People, but also for Dogs, rodents, lizards and other mammals. The human pathogenic strains are trigger for the Diseases Leishmaniasis, Kalar-Azar and Orientbane, which in tropical and subtropical areas of the earth occur.

Die Leishmania Spezies ist gekennzeichnet durch einen Lebenszyklus mit verschiedenen Stadien. In der Sandfliege (Gattung Phlebotominae) kommt Leishmania als promastigote Form vor, wobei die Zellen einfach begeißelt sind, beweglich, spindelförmig und eine starke Zellteilung aufweisen. Durch einen Stich der infizierten Sandmücke wird Leishmania auf den Wirt übertragen. In der Blutbahn werden die Zellen durch Makrophagen phagozytiert und es kommt zur Umwandlung in die amastigote Form. Die Zellen sind nun rund, unbegeißelt und weisen einen veränderten Stoffwechsel auf. Die Zellen teilen sich in den Makrophagen bis es zu einem Aufplatzen des Makrophagen kommt. Durch die freigesetzten Amastigoten wird der gesamte Organismus infiziert. Nach einem Stich einer Sandmücke kann diese wieder als Vektor agieren und die aufgenommenen Amastigoten wandeln sich in Promastigoten um.The Leishmania species is characterized by a life cycle with different stages. In the sand fly (genus Phlebotominae) comes Leishmania as a promastigote form, with the cells simply flagellated, movable, spindle-shaped and have a strong cell division. By a sting of the infected sandfly Leishmania is transferred to the host. In the bloodstream, the cells are phagocytosed by macrophages and it comes to the transformation into the amastigote form. The cells are now round, unsullied and have a changed one Metabolism. The cells divide up in the macrophages it comes to a bursting of macrophages. By the released Amastigotes infect the entire organism. After a stitch a sandfly This can act as a vector again and the recorded Amastigoten transform into promastigotes.

Die Spezies Leishmania tarentolae ist ein Parasit für die Eidechse Tarentolae annularis und wird als promastigote Form unter S1 Bedingungen kultiviert. Leishmania tarentolae ist ein gentechnisch veränderter Stamm zur Expression von Proteinen [siehe WO 01/32896 ]. Aus der Publikation Breitling et al. [Breitling, R.; Klingner, S.; Callewaert, N.; Pietrucha, R.; Geyer, A. Ehrlich, G.; Hartung, R.; Müller, A.; Contreras, R.; Beverley, S.; Alexandrov, K.: Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for Protein research and production; Protein Expression and Purification; Vol 25; pages 209–218; 2002.] ist bekannt, dass die Spezies Leishmania tarentolae rekombinante Proteine glykosilieren kann. Die N-Glykosilierungsstrukturen sind dabei vom Säugertyp, was am humanen Erythropoietin gezeigt wurde. Leishmania tarentolae ist eine alternative Möglichkeit gegenüber Zellkulturen zur Produktion von humanen Proteinen [siehe Sodoyer, R.: Expression systems for the production of recombinant pharmaceuticals; Technology Review; Biodrugs; Vol. 18; Issue 1; pages 51–62; 2004. ].The species Leishmania tarentolae is a parasite for the lizard Tarentolae annularis and is cultivated as a promastigote form under S1 conditions. Leishmania tarentolae is a genetically engineered strain for the expression of proteins [see WO 01/32896 ]. From the Publication Breitling et al. [Breitling, R .; Klingner, S .; Callewaert, N .; Pietrucha, R .; Geyer, A. Ehrlich, G .; Hartung, R .; Müller, A .; Contreras, R .; Beverley, S .; Alexandrov, K .: Non-pathogenic trypanosomatide protozoa as a platform for protein research and production; Protein expression and purification; Vol 25; pages 209-218; 2002.] It is known that the species Leishmania tarentolae can glycosylate recombinant proteins. The N-glycosylation structures are of the mammalian type, which has been shown on human erythropoietin. Leishmania tarentolae is an alternative to cell cultures for the production of human proteins [see Sodoyer, R .: Expression systems for the production of recombinant pharmaceuticals; Technology Review; Biodrugs; Vol. 18; Issue 1; pages 51-62; Of 2004. ].

Die Kultivierung in einem serumfreien Medium und Medium ohne tierische Zusätze ist vorteilhaft, so auch beschrieben in WO 9426899 A1 ; und DE 69434424D D1 , wenn Proteine für die Therapie oder Diagnose GMP-gerecht produziert werden müssen. Zum einem verringern sich die Kosten für den Produktionsprozess, da auf teure Nährmedienzusätze verzichtet wird, andererseits verringert sich der Umfang des downstream processing und der begleitenden Analytik, da Viren und Prionen aus tierischen Bestandteilen nicht abgetrennt und die Abtrennungen nachgewiesen werden müssen. Um einen wirtschaftlichen Prozess zu ermöglichen, sind hohe Zelldichten bei der Kultivierung zu erreichen, um dadurch hohe Proteinausbeuten zu erzielen. Die Zellen sind als Suspensionskultur mit einer definierten spezifischen Wachstumsrate zu kultivieren, um eine Kontrolle des gesamten Prozesses zu ermöglichen.Culturing in a serum-free medium and medium without animal additives is advantageous, as also described in US Pat WO 9426899 A1 ; and DE 69434424D D1 if proteins need to be produced GMP-compliant for therapy or diagnosis. On the one hand, the costs for the production process are reduced because expensive nutrient media supplements are dispensed with; on the other hand, the scope of the downstream processing and the accompanying analysis is reduced, since viruses and prions from animal components do not have to be separated and the separations have to be detected. In order to enable an economic process, high cell densities are to be achieved during cultivation in order to achieve high protein yields. The cells are to be cultured as a suspension culture with a defined specific growth rate to allow control of the entire process.

Gegenwärtig werden Leishmania Spezies in der promastigoten Form vorwiegend in flüssigen Nährmedien mit Zusatz an tierischem Serum oder in Nährmedien aus tierischen Quellen kultiviert [ Jensen, J. B.: In vitro cultivation of protozoan parasites, CRC Press, Inc., 1983. ].At present, Leishmania species in the promastigote form are predominantly cultivated in liquid nutrient media supplemented with animal serum or in nutrient media from animal sources [ Jensen, JB: In vitro cultivation of protozoan parasites, CRC Press, Inc., 1983. ].

Ein Basismedium ist Brain Heart Infusion Medium (BHI), welches aus pulverisierten Rinderherz und Rinderhirn hergestellt und Hemin oder Serum zugegeben wird. In diesem BHI-Medium mit Hemin können bei Leishmania Spezies Zelldichten bis zu 2·108 Z/mL für L. tarentolae erreicht werden [ Meehan, H. A.; Lundberg, R. A.: A trypanosomatid Protein specifically interacts with a mammalian iron-responsive element, Parasitol Res, Vol 86, pages 109–114, 2000 ].A basic medium is Brain Heart Infusion Medium (BHI), which is prepared from powdered bovine heart and bovine brain and added to hemin or serum. In this BHI medium with hemin, cell densities of up to 2 · 10 8 Z / mL can be achieved for L. tarentolae in Leishmania species [ Meehan, HA; Lundberg, RA: A trypanosomatide protein specifically interacts with a mammalian iron-responsive element, Parasitol Res, Vol. 86, pages 109-114, 2000 ].

Ein weiteres Medium ist AJM-1 [ Atif Ali, S.; Iqbal, J.; Ahmad, B.; Masoom, M.: A semisynthetic fetal calf serum-free liquid medium for in vitro cultivation of Leishmania promastigotes, Am. J. Trop. Med. Hyg., Vol. 59 (1), pages 163–165, 1998 ], welches 3 g/L Pepton, 1 g/L Kasein Hydrolysat, 3,5 g/L Rinderextrakt, 0,5 g/L Hefeextrakt, Salze, Glukose und L-Proline enthält. Diesem Medium werden keine Zusätze an Serum zugefügt und maximale Zelldichten von 2,4·107 Z/mL für L. major Promastigoten erreicht.Another medium is AJM-1 [ Atif Ali, S .; Iqbal, J .; Ahmad, B .; Masoom, M .: A semisynthetic fetal calf serum-free liquid medium for in vitro cultivation of Leishmania promastigotes, Am. J. Trop. Med. Hyg., Vol. 59 (1), pages 163-165, 1998 ] containing 3 g / L peptone, 1 g / L casein hydrolyzate, 3.5 g / L bovine extract, 0.5 g / L yeast extract, salts, glucose and L-proline. No serum additions are made to this medium and maximum cell densities of 2.4 x 10 7 Z / mL are achieved for L. major promastigotes.

Ein anderes undefiniertes Medium ist Peptone-yeast-autolysate basal Medium, welches aus Peptone (10 g/L), Hefe-Autolysat (2,5 g/L), Salzen und 10% Fötalem Kälberserum besteht [ Palomino, J. C.: Peptone-yeast autolysate-fetal bovine serum 10, a simple, inexpensive liquid medium for the cultivation of Leishmania spp., Journal of Clinical Microbiology, Vol 15 (5), pages 949–950, 1982 ]. In diesem Medium werden Zelldichten bis maximal 4·10 Zellen/mL für L. brasiliensis nach 7 Tagen erreicht, was einer spezifischen Wachstumsrate von 0,024 h-1 entspricht. Limoncu et al. [Limoncu, M. E.; Balcioğlu, I. C.; Yereli, K., Ozbel, Y.; Ozbilgin, A.: A new experimental in vitro culture medium for cultivation od Leishmania species, Journal of Clinical Microbiology, Vol 35 (9), pages 2430–2431, 1997] erreichten in diesem Medium maximale Zelldichten von 2,2·107 Z/mL nach 8 Tagen Kultivierungszeit für L. infantum bzw. 1,8·107 Z/mL für L. tropica. Dieses entspricht einer spezifischen Wachstumsrate von 0,022h-1.Another undefined medium is Peptone-yeast autolysate basal medium which consists of peptone (10 g / L), yeast autolysate (2.5 g / L), salts and 10% fetal calf serum [ Palomino, JC: Peptone-yeast autolysate-fetal bovine serum 10, a simple, liquid medium for the cultivation of Leishmania spp., Journal of Clinical Microbiology, Vol 15 (5), pages 949-950, 1982 ]. In this medium, cell densities up to a maximum of 4 · 10 cells / mL for L. brasiliensis after 7 days, which corresponds to a specific growth rate of 0.024 h-1. Limoncu et al. [Limoncu, ME; Balcioğlu, IC; Yereli, K., Ozbel, Y .; Ozbilgin, A .: A new experimental in vitro culture medium for cultivation or Leishmania species, Journal of Clinical Microbiology, Vol 35 (9), pages 2430-2431, 1997] reached maximum cell densities of 2.2 × 10 7 Z / ml in this medium after 8 days culturing time for L. infantum or 1.8 × 10 7 Z / mL for L. tropica. This corresponds to a specific growth rate of 0.022 h -1 .

Ein weiteres Nährmedium für die Leishmania Kultivierung ist aus RU 2086644 C1 bekannt und beinhaltet Pepton, Futterhefeextrakt, Hemin, Folsäure, Maltose und Salze in unterschiedlichen Zusammensetzungen. In diesem Nährmedium werden maximale Zelldichten von 1,6 106 Z/mL für L. major, 1,1 106 Z/mL für L. donovani und 0,8 106 Z/mL für L. infantum erreicht.Another nutrient for Leishmania cultivation is off RU 2086644 C1 and includes peptone, feed yeast extract, hemin, folic acid, maltose and salts in various compositions. In this nutrient medium maximum cell densities of 1.6 10 6 Z / mL for L. major, 1.1 10 6 Z / mL for L. donovani and 0.8 10 6 Z / mL for L. infantum are achieved.

Außerdem wird auch die Kultivierung in semidefinierten Medien versucht.In addition, will also attempts to cultivate in semi-defined media.

Dazu werden Zellkulturmedien wie M 199 oder RPMI 1640 mit bis zu 15 % Fötalem Kälberserum versetzt. Limoncu et al [Limoncu, M. E.; Balcioğlu, I. C.; Yereli, K., Ozbel, Y.; Ozbilgin, A.: A new experimental in vitro culture medium for cultivation od Leishmania species, Journal of Clinical Microbiology, Vol 35 (9), pages 2430–2431, 1997] erreichten z.B. mit RPMI 1640 + 10 % Fötalem Kälberserum 2,2·107 Z/mL für L. infantum. Ali et al. [1998] erreichten mit M 199 + 10 % Fötalem Kälberserum + 2 % menschlichem Urin 2,2·107 Z/mL für L. major.Cell culture media such as M 199 or RPMI 1640 are supplemented with up to 15% fetal calf serum. Limoncu et al [Limoncu, ME; Balcioğlu, IC; Yereli, K., Ozbel, Y .; Ozbilgin, A .: A new experimental in vitro culture medium for cultivation or Leishmania species, Journal of Clinical Microbiology, Vol 35 (9), pages 2430-2431, 1997] achieved with RPMI 1640 + 10% fetal calf serum 2.2 · 10 7 Z / mL for L. infantum. Ali et al. [1998] achieved with M 199 + 10% fetal calf serum + 2% human urine 2.2 · 10 7 Z / mL for L. major.

Eine Kultivierung in synthetischen Nährmedien wird für verschiedene Leishmania Spezies beschrieben [siehe bspw. Schuster, F. L.; Sullivan, J. J.: Cultivation of clinically significant hemoflagellates, Clinical Microbiology Reviews, Vol. 15 (3), pages 374–389, 2002 und Jensen, J. B.: In vitro cultivation of protozoan parasites, CRC Press, Inc., 1983 ].Cultivation in synthetic nutrient media is described for various Leishmania species [see, eg. Schuster, FL; Sullivan, JJ: Cultivation of clinically significant hemoflagellates, Clinical Microbiology Reviews, Vol. 15 (3), pages 374-389, 2002 and Jensen, JB: In vitro cultivation of protozoan parasites, CRC Press, Inc., 1983 ].

In den synthetischen Medien von Melo [ Melo, N. M.; Peixoto de Azevedo, H.; Roitman, I.; Mayrink, W.: A new defined medium for cultivating Leishmania promastigotes; Acta Tropica, Vol 42, pages 137–141, 1985 ] und O'Daly [ O'Daly, J. A.; Rodriguez, M. B.: Differential growth requirements of several Leishmania spp. in chemically defined media; Acta Tropica, Vol 45, pages 109–126, 1988 ] können maximale Zelldichten von 4–6·107 Z/mL für verschiedene Leishmania Spezies erreicht werden.In the synthetic media of Melo [ Melo, NM; Peixoto de Azevedo, H .; Roitman, I .; Mayrink, W .: A new defined medium for cultivating Leishmania promastigotes; Acta Tropica, Vol. 42, pages 137-141, 1985 ] and O'Daly [ O'Daly, YES; Rodriguez, MB: Differential growth requirements of several Leishmania spp. in chemically defined media; Acta Tropica, Vol 45, pages 109-126, 1988 ] maximum cell densities of 4-6 x 10 7 Z / mL can be achieved for different Leishmania species.

McCarthy-Burke et. al. [McCarthy-Burke, C.; Bates, P. A.; Dwyer, D. M.: Leishmania donovani: Use of two different, commercially available chemically defined media for the continuous in vitro cultivation of promastigotes, Experimental Parasitology, Vol 73, pages 385–387, 1991] erzielten mit dem synthetischen und chemisch definierten Medium M199+ maximale Zelldichten von 4·10 Z/mL für L. donovani bei einer spezifischen Wachstumsrate von 0,078 h-1. Das synthetische Medium REIII [ Steiger, R. F.; Black, C. D. V.: Simplified defined media for cultivating Leishmania donovani promastigotes; Acta Tropica, Vol 37, pages 195–198, 1980 ] ermöglicht das Wachstum von L. donovani und L. brasiliensis zu einer Zelldichte von 5·10 Z/mL innerhalb von 5 Tagen, was einer spezifischen Wachstumsrate von 0,04 h-1 entspricht. McCarthy-Burke et. al. [McCarthy-Burke, C .; Bates, PA; Dwyer, DM: Leishmania donovani: Use of two different, commercially available chemically defined media for the continuous in vitro cultivation of promastigotes, Experimental Parasitology, Vol 73, pages 385-387, 1991] obtained with the synthetic and chemically defined medium M199 + maximum cell densities of 4 x 10 Z / mL for L. donovani at a specific growth rate of 0.078 h -1 . The synthetic medium REIII [ Steiger, RF; Black, CDV: Simplified defined media for cultivating Leishmania donovani promastigotes; Acta Tropica, Vol 37, pages 195-198, 1980 ] allows the growth of L. donovani and L. brasiliensis to a cell density of 5 × 10 2 Z / ml within 5 days, which corresponds to a specific growth rate of 0.04 h -1 .

In dem Medium C nach Trager [ Trager, W.: Nutrition of a hemoflagellate (Leishmania tarentolae) having an interchangeable requirement for cholin or pyridoxal; J. Protozoology, Vol 4, pages 269–276, 1957 ] wurden maximale Zelldichten von 7·107 Z/mL für L. tarentolae erzielt.In medium C after carrier [ Trager, W .: Nutrition of a hemoflagellate (Leishmania tarentolae) having an interchangeable requirement for choline or pyridoxal; J. Protozoology, Vol 4, pages 269-276, 1957 ] maximum cell densities of 7 · 10 7 Z / mL were achieved for L. tarentolae.

Der Nachteil aller bekannten Nährmedien und Kultivierungsverfahren ist, dass diese nicht ermöglichen, Leishmania Promastigoten in Nährmedien zu kultivieren, die frei von tierischen Zusätzen wie Rinderextrakt oder Kasein und auch gleichzeitig frei von Serum- oder Blutzusätzen sind und die gleichzeitig Zelldichten > 1·109 Z/mL von Leishmania Promastigoten unterstützen.The disadvantage of all known culture media and culture methods is that they do not allow Leishmania to cultivate promastigotes in nutrient media which are free from animal additives such as bovine extract or casein and at the same time free from serum or blood additives and at the same time have cell densities> 1 × 10 9 Z / mL of Leishmania Promastigotes support.

Aufgabe der Erfindung ist es ein, Nährmedium und ein Verfahren zur Kultivierung eines Protozoan zu hohen Zelldichten mit hohen spezifischen Wachstumsraten anzugeben, die eine Kultivierung frei von tierischen Zusätzen, wie Rinderextrakt oder Kasein, und auch gleichzeitig frei von Serum- oder Blutzusätzen ermöglichen und die gleichzeitig Zelldichten > 1·109 Z/mL von Leishmania Promastigoten realisieren.The object of the invention is to provide a nutrient medium and a method for cultivating a protozoan at high cell densities with high specific growth rates, which allow cultivation free of animal additives such as bovine extract or casein, and also free of serum or blood additives simultaneously Cell densities> 1 · 10 9 Z / mL of Leishmania Promastigotes realize.

Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass vermittels des erfindungsgemäßen Nährmediums und des erfindungsgemäßen Verfahrens hohe Zelldichten für Leishmania Promastigoten erzielt werden, wobei als Nährmedium Hefeextrakt mit einem Phosphatpuffer eingesetzt wird. Das Medium ist frei von tierischen Bestandteilen und Serumzusätzen. Gemäß der Erfindung wird dem Medium nach dem Autoklavieren Glukose als Kohlenstoffquelle und Hemin als Eisenquelle zugesetzt, wobei diese besonders vorteilhaft im sterilen Zustand zugesetzt werden, bevor das erfindungsgemäße Verfahren betrieben wird.The Essence of the invention is that by means of the nutrient medium according to the invention and the method of the invention high cell densities for Leishmania promastigotes are obtained using as nutrient medium Yeast extract is used with a phosphate buffer. The medium is free from animal ingredients and serum additives. According to the invention After autoclaving, glucose becomes the source of carbon in the medium after autoclaving and Hemin added as an iron source, these being particularly advantageous be added in the sterile state before the inventive method is operated.

Hemin wird dem Medium in einer Konzentration von 1 bis 50 μM zugesetzt.hemin is added to the medium at a concentration of 1 to 50 μM.

Das erfindungsgemäße Nährmedium besteht somit aus ausgewogenen Konzentrationen von Hefeextrakt, Phosphat, Hemin und Glukose (YE+P+HG-Nährmedium).The nutrient medium according to the invention thus consists of balanced concentrations of yeast extract, Phosphate, hemin and glucose (YE + P + HG nutrient medium).

Durch Zilberstein und Shapira [ Zilberstein, D.; Shapira, M.: The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites, Annu. Rev. Microbiol., Vol. 48, pages 449–470, 1994 ] ist die Temperaturtoleranz von 22–28 °C für Leishmania Promastigoten bekannt.By Zilberstein and Shapira [ Zilberstein, D .; Shapira, M .: The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites, Annu. Rev. Microbiol., Vol. 48, pages 449-470, 1994 ], the temperature tolerance of 22-28 ° C for Leishmania promastigotes is known.

Durch eigene Untersuchungen wurde überraschender weise gefunden, dass eine Kultivierung von L. tarentolae bis 34 °C möglich ist, ohne dadurch eine Umwandlung in die amastigote Form zu induzieren. Die Kultivierung während des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt bei einer Temperatur von 22 bis 34 °C.By own investigations became more surprising found that a cultivation of L. tarentolae is possible up to 34 ° C, without thereby inducing a transformation into the amastigote form. The cultivation during the method according to the invention takes place at a temperature of 22 to 34 ° C.

Zur Beimpfung des Bioreaktors werden exponentiell wachsende Vorkulturen verwendet, welche in dem YE+P+HG-Nährmedium bei 22 bis 34 °C, insbesondere bei 26 °C, kultiviert werden. Die Vorkulturführung kann eine oder zwei Stufen umfassen. Zur Beimpfung der Vorkultur dient eine exponentiell wachsende Standkultur, welche in einem beliebigen komplexen Nährmedium kultiviert wird.to Inoculation of the bioreactor becomes exponentially growing precultures used in the YE + P + HG nutrient medium at 22 to 34 ° C, in particular at 26 ° C, be cultivated. The preculture guidance can be one or two stages include. For the inoculation of preculture serves an exponentially growing Stand culture, which in any complex nutrient medium is cultivated.

Überraschenderweise ist keine vorherige Nährmedienadaption der Leishmania Zellen an das YE+P+HG-Nährmedium notwendig.Surprisingly is not a previous culture media adaptation Leishmania cells to the YE + P + HG nutrient medium necessary.

Die Kultivierung erfolgt im Bioreaktor oder Fermenter, der eine ausreichende Durchmischung der Kulturlösung und Sauerstoffversorgung garantiert und über verschiedene unabhängige Zudosagetechniken verfügt.The Cultivation takes place in the bioreactor or fermenter, which has a sufficient Mixing of the culture solution and oxygen supply guaranteed and via various independent Zudosagetechniken features.

Die Kultivierung wird als Fed-Batch-Prozess geführt, wobei folgende Zudosagen unabhängig voneinander in den Bioreaktor gegeben werden:

  • • Glukose wird zyklisch aus einer Stammlösung zugegeben, um eine Limitierung oder Inhibierung zu verhindern. Die Glukosekonzentration wird zwischen 0,5 und 5 g/L im Fermenter gehalten, vorwiegend zwischen 1 und 3 g/L.
  • • Konzentriertes YE+P-Nährmedium wird zyklisch zugegeben, um Limitierungen im Nährmedium entgegen zu wirken. Die Zugabe erfolgt aus einer Stammlösung von YE+P-Nährmedium, welches aus 24 g/L–150 g/L Hefeextrakt, vorwiegend 96 g/L und 150 g/L und Puffersalzen besteht. Die Zugabe erfolgt zu einer Endkonzentration von 30 g/L bis 34 g/L Hefeextrakt im Fermenter, bevor eine Limitierung des Nährmediums eintritt.
  • • Heminkonzentrat wird zyklisch in den Bioreaktor zu einer Endkonzentration von 8 μM gegeben, bevor eine Limitation des Hemins eintritt.
The cultivation is conducted as a fed-batch process, whereby the following doses are added independently of one another into the bioreactor:
  • • Glucose is added cyclically from a stock solution to prevent limitation or inhibition. The glucose concentration is maintained between 0.5 and 5 g / L in the fermenter, predominantly between 1 and 3 g / L.
  • • Concentrated YE + P nutrient medium is added cyclically to counteract limitations in the nutrient medium. The addition is made from a stock solution of YE + P nutrient medium which consists of 24 g / L-150 g / L yeast extract, predominantly 96 g / L and 150 g / L and buffer salts. The addition takes place to a final concentration of 30 g / L to 34 g / L yeast extract in the fermenter, before a limitation of the nutrient medium occurs.
  • • Hemink concentrate is added cyclically to the bioreactor to a final concentration of 8 μM before any limitation of hemine occurs.

Der pH-Wert des Kultivierungsmediums wird zu einen pH von 6,8 bis 8,0, hauptsächlich im Bereich von 7,2 bis 7,4, konstant gehalten durch die Zudosage von Säure und Base.Of the pH of the culture medium becomes a pH of 6.8 to 8.0, mainly in the range of 7.2 to 7.4, kept constant by the Zudosage of acid and base.

Die Begasung des Bioreaktors erfolgt mit Luft, wobei 0,5–5 VVM (Volumen/Volumen/Minute) zu realisieren sind.The Gasification of the bioreactor is done with air, adding 0.5-5 VVM (volume / volume / minute) are realizing.

Bei dieser erfindungsgemäßen Verfahrensführung können Leishmania Promastigoten mit einer definierten spezifischen Wachstumsrate kultiviert werden. Gleichzeitig erreicht man in dem beschriebenen YE+P+HG-Nährmedium eine maximale Zelldichte von > 1·109 Zellen/mL.In this process according to the invention Leishmania promastigotes can be cultivated with a defined specific growth rate. At the same time, a maximum cell density of> 1 × 10 9 cells / mL is achieved in the described YE + P + HG nutrient medium.

So können wesentlich höhere Zelldichten als bei bisherigen Verfahren und in bisherigen Nährmedien erreicht werden.So can much higher Cell densities than in previous methods and in previous culture media be achieved.

Als primäre Kohlenstoffquelle wird D-Glukose während des gesamten Prozesses verstoffwechselt, was für die Prozesskontrolle von Vorteil ist und die hohe spezifische Wachstumsrate von 0,05–0,13 h-1 ermöglicht.As the primary carbon source, D-glucose is metabolized throughout the process, which is beneficial for process control and allows for the high specific growth rate of 0.05-0.13 h -1 .

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht den Einsatz von Leishmania Promastigoten für die Produktion von rekombinanten Proteinen zur diagnostischen und therapeutischen Anwendung am Menschen.The inventive method allows the use of Leishmania promastigotes for the production of recombinant Proteins for diagnostic and therapeutic use in humans.

Mit dem Verfahren können hohe Zelldichten in relativ kurzer Zeit erreicht werden. Durch die Möglichkeit der N-Glykosilierung von humanen Proteinen kann Leishmania, insbesondere Leishmania tarentolae, als alternatives Expressionssystem zu Zellkultursystemen wie BHK oder CHO-Zellen eingesetzt werden. Gegenüber Zellkulturen hat Leishmania den Vorteil einer viel höheren spezifischen Wachstumsrate und der Kultivierung in kostengünstigen Nährmedien.With the method can high cell densities can be achieved in a relatively short time. By the possibility N-glycosylation of human proteins can be Leishmania, in particular Leishmania tarentolae, as an alternative expression system to cell culture systems how BHK or CHO cells are used. Leishmania has compared to cell cultures the advantage of a much higher one specific growth rate and cultivation in cost-effective Culture media.

Ausführungsbeispielembodiment

Als Basismedium wird YE+P+HG-Nährmedium verwendet. Zur Herstellung des Mediums werden 24 g Bacto Yeast Extract in 900 mL A. dest gelöst und bei 121 °C für 20 min autoklaviert. In einem zweiten Ansatz werden 12,541 g K2HPO4 und 2,319 g KH2PO4 in 100 mL A. dest gelöst und bei 121 °C für 20 min autoklaviert. Nach dem getrennten Autoklavieren beider Lösungen werden sie vereinigt und es erfolgt die Zugabe von 5 mg/L Hemin und 3 g/L Glukose.The basic medium used is YE + P + HG nutrient medium. To prepare the medium, 24 g of Bacto Yeast Extract are dissolved in 900 ml of A. dest. And autoclaved at 121 ° C. for 20 min. In a second batch, 12.541 g of K 2 HPO 4 and 2.319 g of KH 2 PO 4 are dissolved in 100 ml of A. dest. And autoclaved at 121 ° C. for 20 min. After separately autoclaving both solutions, they are combined and added 5 mg / L hemin and 3 g / L glucose.

Für die zyklische Prozessführung wird 4fach und 6,25fach konzentriertes YE+P-Nährmedium verwendet. Für das 4xYE+P-Nährmedienkonzentrat werden 96 g/L Bacto Yeast Extract eingewogen und bei 121 °C für 20 min autoklaviert. Die Puffersalze werden in der gleichen Konzentration wie bei dem YE+P+HG-Nährmedium nach dem Autoklavieren steril zugegeben. Für das 6,25xYE+P-Nährmedienkonzentrat werden 150 g/L Bacto Yeast Extract eingewogen und bei 121 °C für 20 min autoklaviert. Die Puffersalze werden in der gleichen Konzentration wie bei dem YE+P+HG-Nährmedium nach dem Autoklavieren steril zugegeben.For cyclical process control, 4-fold and 6.25-fold concentrated YE + P nutrient medium is used. 96 g / L Bacto Yeast Extract is weighed out for the 4xYE + P nutrient medium concentrate and autoclaved at 121 ° C for 20 min. The buffer salts are added sterile in the same concentration as in the YE + P + HG nutrient medium after autoclaving. For the 6.25xYE + P media concentrate, add 150 g / L Bacto Yeast Extract weighed and autoclaved at 121 ° C for 20 min. The buffer salts are added sterile in the same concentration as in the YE + P + HG nutrient medium after autoclaving.

Zur Erzeugung von ausreichend Startbiomasse im Fermenter werden 2 Stufen an Vorkulturen benötigt. Die Beimpfung der Vorkultur 1 erfolgt aus einer exponentiell wachsenden Standkultur von Leishmania tarentolae p 10 Wildtyp in YE+P+HG-Nährmedium zu einer Biomasse von mindestens 1,4·107 Zellen/mL. Dabei werden 50 mL YE+P+HG-Nährmedium in einem Schüttelkolben mit 250 mL Arbeitsvolumen mit Schikane kultiviert. Nach einer Kultivierungszeit von ca. 24 h erfolgt die Beimpfung der Vorkultur 2 aus der Vorkultur 1. Die Vorkultur 2 besteht aus 3 Schüttelkolben, welche jeweils 100 mL YE+P+HG-Nährmedium enthalten und zu einer Anfangsbiomasse von mindestens 1,4·107 Zellen/mL inokuliert werden. Nach wiederum ca. 24 h Kultivierungszeit erfolgt die Beimpfung des Fermenters mit der Vorkultur 2 zu einer Biomassekonzentration von 5,51·107 Zellen/mL. Die Zellen wachsen im YE+P+HG-Nährmedium mit einer spezifischen Wachstumsrate von 0,05–0,13 h-1.To produce enough start biomass in the fermenter, 2 stages of precultures are needed. The inoculation of the preculture 1 takes place from an exponentially growing culture of Leishmania tarentolae p 10 wild type in YE + P + HG nutrient medium to a biomass of at least 1.4 × 10 7 cells / mL. 50 mL of YE + P + HG nutrient medium are cultured in a shaking flask of 250 mL working volume with chicane. After a cultivation time of about 24 hours, the inoculation of the preculture 2 from the preculture 1 takes place. The preculture 2 consists of 3 shake flasks, each containing 100 ml of YE + P + HG nutrient medium and having an initial biomass of at least 1.4.10 7 cells / mL are inoculated. After again about 24 h cultivation time, the inoculation of the fermenter is carried out with the preculture 2 to a biomass concentration of 5.51 · 10 7 cells / mL. The cells grow in the YE + P + HG nutrient medium with a specific growth rate of 0.05-0.13 h -1 .

Als Fermenter wird bspw. ein Rührreaktor mit parallel angeordneten Blattrührern verwendet. Der Fermenter hat in diesem Beispiel ein Bruttovolumen von 2 L und wird mit einem Arbeitsvolumen von 1 bis 1,6 L im gesamten Prozess betrieben. Der Bioreaktor ist mit einer pH-Messeinrichtung, einer pO2-Messeinrichtung, einer Probennahme-Vorrichtung, einem Abluftkühler, Anschlüssen für die Basen-Zudosage und Glukosezugabe und einem Anschluss mit Septum ausgestattet. Das Kulturgefäß wird mit 24 g/L Bacto Yeast Extract gefüllt und bei 121 °C für 20 min autoklaviert. Danach erfolgt die Zugabe von 12,541 g/L K2HPO4 und 2,319 g/L KH2PO4, welche getrennt autoklaviert werden. Weiterhin wird 5 mg/L Hemin und 3 g/L Glukose in das Nährmedium gegeben. Es liegt nun YE+P+HG-Nährmedium mit einem Anfangsvolumen von 0,9 L im Fermenter vor.As a fermenter, for example, a stirred reactor is used with parallel Blattrührern. The fermenter in this example has a gross volume of 2 L and is operated with a working volume of 1 to 1.6 L throughout the process. The bioreactor is equipped with a pH measuring device, a pO 2 measuring device, a sampling device, an exhaust air cooler, connections for base dosing and glucose addition and a connection with septum. The culture vessel is filled with 24 g / L Bacto Yeast Extract and autoclaved at 121 ° C for 20 min. This is followed by the addition of 12.541 g / LK 2 HPO 4 and 2.319 g / L KH 2 PO 4 , which are autoclaved separately. Furthermore, 5 mg / L hemin and 3 g / L glucose are added to the nutrient medium. There is now YE + P + HG nutrient medium with an initial volume of 0.9 L in the fermenter.

Die Temperierung des Mediums zu 26 °C erfolgt über einen Doppelmantel und der automatischen Temperaturregelung. Die Drehzahl wird zu Beginn auf 100 rpm konstant geregelt und wird dann entsprechend der pO2-Regelung bis auf 500 Umdrehungen/min erhöht. Der pO2-Wert des Medium wird nach dem Absinken auf 20 % über die Steigerung der Rührerdrehzahl konstant gehalten. Die Kalibrierung der Sonde zu 100 % erfolgt an unbeimpften, begasten Nährmedium. Der pH-Wert des Mediums wird über die Zugabe von 0,5 M Kaliumhydroxid- Lösung auf einen Wert von 7,3 konstant geregelt. Die Begasung des Fermenters erfolgt mit Luft zu 1 VVM.The temperature of the medium to 26 ° C via a double jacket and the automatic temperature control. The speed is initially controlled to 100 rpm and then increased according to the pO 2 control up to 500 revolutions / min. The pO 2 value of the medium is kept constant after the drop to 20% on the increase of the stirrer speed. The calibration of the probe to 100% takes place on uninoculated, gassed nutrient medium. The pH of the medium is controlled to a value of 7.3 by the addition of 0.5 M potassium hydroxide solution. The fermentation of the fermenter takes place with air to 1 VVM.

Der Konzentrationsgehalt an Kohlendioxid und Sauerstoff in der Prozessabluft wird durch eine Abgasanalyse erfasst. Die Zugabe von YE+P-Nährmedienkonzentrat im Fermentationsprozess erfolgt manuell und zyklisch über eine Schlauchpumpe, welche über eine Sterilkupplung an den Fermenter angeschlossen ist. Die Entnahme von Zellsuspension während der Kultivierung erfolgt über ein Ernterohr mit angeschlossener Schlauchpumpe. Das Wachstum der Zellen wird off-line über die Messung der Zellzahl dokumentiert, der Verbrauch an Glukose durch die Messung der Glukosekonzentration. Die Glukosekonzentration wird im gesamten Fermentationsverlauf zwischen ca. 1 g/L und 3 g/L gehalten durch eine manuelle zyklische Zugabe von Glukosekonzentrat (500 g/L Stammlösung), siehe 1.The concentration of carbon dioxide and oxygen in the process exhaust air is detected by an exhaust gas analysis. The addition of YE + P-Nährmedienkonzentrat in the fermentation process is carried out manually and cyclically via a peristaltic pump, which is connected via a sterile coupling to the fermenter. The removal of cell suspension during the cultivation takes place via a harvesting tube with a connected peristaltic pump. The growth of the cells is documented off-line by measuring the cell count, the consumption of glucose by measuring the glucose concentration. The glucose concentration is maintained throughout the fermentation process between about 1 g / L and 3 g / L by a manual cyclic addition of glucose concentrate (500 g / L stock solution), see 1 ,

Die Zugabe von Hemin-Stammlösung (2,5 g/L Hemin in 50%igen Triacetylamin) während des Prozesses erfolgt manuell und zyklisch über ein Septum und eine sterile Spritze.The Addition of hemin stock solution (2.5 g / L hemin in 50% triacetylamine) takes place during the process manually and cyclically over a septum and a sterile syringe.

Die Zugabe des Antischaummittels Silikon M30 (1:5 verdünnt mit A.dest und autoklaviert) während des Prozesses erfolgt manuell und zyklisch über ein Septum und eine sterile Spritze.The Add antifoam silicone M30 (diluted 1: 5 with A.dest and autoclaved) during The process is done manually and cyclically via a septum and a sterile one Syringe.

Nach der Beimpfung des Fermenters erfolgt die Kultivierung bis zu einer Biomasse von ca. 2,8·108 Zellen/mL, siehe 2. Danach werden 500 mL 4xYE+P-Nährmedienkonzentrat in dem Fermenter gegeben. Die Biomasse verdünnt sich auf 2,0·108 Zellen/mL. Bei einer Zellzahl von 3,1·108 Zellen/mL wird 3,2 mL Hemin-Stammlösung und 0,8 mL Antischaummittel steril in den Fermenter gegeben. Die Kultivierung wird fortgesetzt bis zum Erreichen einer Zellzahl von 4,8·108 Zellen/mL. Dann wird 500 mL Zellsuspension über ein Ernterohr mit angeschlossener Schlauchpumpe aus dem Fermenter entnommen und anschließend 500 mL 4xYE+P-Nährmedienkonzentrat in den Fermenter gegeben. Die Zellzahl im Fermenter beträgt nun 3,3·108 Zellen/mL und es wird bis zu einer Zellzahl von 5,5·108 Zellen/mL kultiviert. Es werden nun 800 mL Zellsuspension aus dem Fermenter über das Ernterohr mit Hilfe einer Schlauchpumpe entnommen und 200 mL 6,25xYE+P-Nährmedienkonzentrat in den Fermenter gegeben. Gleichzeitig werden 2 mL Hemin-Stammlösung und 0,5 mL Antischaummittel zugegeben.After inoculation of the fermenter, cultivation is carried out up to a biomass of about 2.8 × 10 8 cells / ml, see 2 , Thereafter, 500 mL of 4xYE + P nutrient medium concentrate are added to the fermenter. The biomass is diluted to 2.0 x 10 8 cells / mL. At a cell count of 3.1 × 10 8 cells / mL, 3.2 mL of hemin stock solution and 0.8 mL of antifoam agent are added to the fermenter in a sterile condition. The cultivation is continued until a cell count of 4.8 × 10 8 cells / ml. 500 mL of cell suspension are then removed from the fermenter via a harvest tube with a connected peristaltic pump and 500 mL 4xYE + P nutrient medium concentrate are then added to the fermenter. The cell count in the fermenter is now 3.3 × 10 8 cells / mL and it is cultured to a cell count of 5.5 × 10 8 cells / mL. Using a peristaltic pump, 800 ml of cell suspension are removed from the fermenter via the harvest tube and 200 ml of 6.25xYE + P nutrient medium concentrate are added to the fermenter. At the same time, 2 mL of Hemin stock solution and 0.5 mL of antifoam agent are added.

Die Zellzahl verdünnt sich durch die Zugabe auf 3,0·108 Zellen/mL und wird bis zum Erreichen einer Zellzahl von 9,7·108 Zellen/mL kultiviert. Danach erfolgt die Zugabe von 250 mL 6,25xYE+P-Nährmedienkonzentrat, wodurch sich die Zellzahl auf 7,9·108 Zellen/mL verdünnt. Bei Erreichen einer Zellzahl von 8,9·108 Zellen/mL werden 2,5 mL Hemin zugegeben. Bei einer Zellzahl von 1,08·109 Zellen/mL wird 312 mL 6,25xYE+P-Nährmedienkonzentrat und 0,6 mL Antischaummittel zugegeben. Die Zellzahl verdünnt sich dadurch auf 8,72·108 Zellen/mL.The number of cells diluted by the addition to 3.0 × 10 8 cells / mL and is cultured until reaching a cell count of 9.7 · 10 8 cells / mL. This is followed by the addition of 250 mL 6.25 x YE + P nutrient medium concentrate, whereby the cell count is diluted to 7.9 x 10 8 cells / mL. When a cell count of 8.9 × 10 8 cells / mL is reached, 2.5 mL of hemin are added. At a cell count of 1.08 x 10 9 cells / mL, add 312 mL of 6.25x YE + P medium concentrate and 0.6 mL of antifoam agent. As a result, the cell count dilutes to 8.72 × 10 8 cells / mL.

Bei einer Zellzahl von 1,08·109 Zellen/mL wird 2,8 mL Hemin-Stammlösung und 0,5 mL Antischaummittel zugegeben. Bei Erreichen einer Zellzahl von 1,41·109 Zellen/mL wird 2,7 mL Hemin-Stammlösung zugegeben. Bei einer Zellzahl von 1,67·109 Zellen/mL wird 2,8 mL Hemin-Stammlösung zugegeben. Die Fermentation wird bei einer konstanten Zellzahl von 1,75·109 Zellen/mL beendet.For a cell count of 1.08 x 10 9 cells / mL, add 2.8 mL of Hemin stock solution and 0.5 mL of antifoam agent. When a cell count of 1.41 · 10 9 cells / mL is reached, 2.7 mL of Hemin stock solution is added. At a cell count of 1.67 × 10 9 cells / mL, 2.8 mL of Hemin stock solution is added. The fermentation is stopped at a constant cell count of 1.75 x 10 9 cells / mL.

Claims (18)

Nährmedium zur Kultivierung eines Protozoan zu hohen Zelldichten mit hohen spezifischen Wachstumsraten umfassend Hefeextrakt, Phosphat, Hemin und Glukose.broth for cultivating a protozoan to high cell densities with high specific growth rates, including yeast extract, phosphate, hemin and Glucose. Nährmedium gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefeextrakt-Konzentration 24 g/L–150 g/L beträgt.broth according to claim 1, characterized in that the yeast extract concentration 24 g / L-150 g / L is. Nährmedium gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Phosphat K2HPO4 und KH2PO4 oder Na2HPO4 und NaH2PO4 ist.Nutrient medium according to claim 1, characterized in that the phosphate K 2 HPO 4 and KH 2 PO 4 or Na 2 HPO 4 and NaH 2 PO 4 is. Nährmedium gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass 12,541 g/L K2HPO4 und 2,319 g/L KH2PO4 enthalten sind.Nursing medium according to claim 3, characterized in that 12.541 g / LK 2 HPO 4 and 2.319 g / L KH 2 PO 4 are included. Nährmedium gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hemin-Konzentration 1 bis 50 μM beträgt.broth according to claim 1, characterized in that the hemin concentration is 1 to 50 μM. Nährmedium gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Glukose-Konzentration 0,5 und 5 g/L beträgt.broth according to claim 1, characterized in that the glucose concentration is 0.5 and 5 g / L. Verfahren zur Kultivierung eines Protozoan zu hohen Zelldichten mit hohen spezifischen Wachstumsraten bei dem man einen Protozoan in einem Nährmedium gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche bei einer Temperatur von 22 bis 34 °C kultiviert.Method for culturing a protozoan too high Cell densities with high specific growth rates in which one Protozoan in a nutrient medium according to one or more of the preceding claims at a temperature of 22 to 34 ° C cultured. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Protozoa in einem Fed-Batch Prozess in einem Bioreaktor kultiviert wird.Method according to claim 7, characterized in that the protozoa in a fed-batch process is cultivated in a bioreactor. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium mit einer Endkonzentration von 30 g/L bis 34 g/L pro Zyklus zugegeben wird.Method according to claim 8, characterized in that the nutrient medium with a final concentration from 30 g / L to 34 g / L per cycle. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Hemin zyklisch in den Bioreaktor gegeben wird.Method according to claim 8, characterized in that the hemin cyclically in the bioreactor is given. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Hemin-Endkonzentration pro Zyklus 8 μM beträgt.Method according to claim 10, characterized in that the hemin final concentration per cycle 8 μM. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert 6,8 bis 8,0 beträgt.Method according to claim 7, characterized in that the pH is 6.8 to 8.0. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert konstant gehalten wird.Method according to claim 12, characterized in that the pH is kept constant. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Bioreaktor mit bis zu 5 VVM begast wird.Method according to claim 7, characterized in that the bioreactor gassed with up to 5 VVM becomes. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Protozoa ein Leishmania Promastigot ist.Method according to one or more of the preceding claims, characterized that the protozoa is a Leishmania promastigote. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die promastigote Form einer Leishmania Spezies kultiviert wird.Method according to claim 15, characterized in that the promastigote form of a Leishmania Species is cultivated. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die als Leishmania Spezies Leishmania tarentolae kultiviert wird.Method according to claim 16, characterized in that as Leishmania species Leishmania tarentolae is cultivated. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Leishmania Promastigot als Wirt für rekombinante Produkte verwendet wird.Method according to claim 15, characterized in that the Leishmania promastigote as a host for recombinant Products is used.
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