DE102006039976A1

DE102006039976A1 - Beleuchtungsoptik für ein optisches Beobachtungsgerät

Info

Publication number: DE102006039976A1
Application number: DE102006039976A
Authority: DE
Inventors: Michael Brehm; Werner Kleinschmidt; Jan Thirase
Original assignee: Carl Zeiss MicroImaging GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2006-08-25
Filing date: 2006-08-25
Publication date: 2008-02-28
Also published as: US20080049313A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Beleuchtungsoptik für ein optisches Gerät zur Beobachtung einer Probe (7), insbesondere zur TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescene Microscopy), wobei die Probe (7) auf der der Beleuchtungsoptik abgewandten Seite eines Trägerglases (6) positioniert ist und das aus der Beleuchtungsoptik austretende Beleuchtungslicht zu einem Beleuchtungsstrahlenbündel (5) geformt ist, das mit der Normalen auf die Oberfläche des Trägerglases (6) einen Winkel ungleich 90° einschließt. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Beleuchtungsoptik der eingangs beschriebenen Art mindestens zwei optisch wirksame Elemente umfaßt, welche die Form und Richtung des Beleuchtungsstrahlenbündels (5) beeinflussen, und die außerhalb eines Detektionsstrahlenganges (9) angeordnet sind, welcher das von der Probe (7) kommende Licht einem Detektor zuführt. Bevorzugt sind die optisch wirksamen Elemente als ringförmige Linsen (1, 2, 3, 4) ausgebildet und konzentrisch um den Detektionsstrahlengang (9) angeordnet.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Beleuchtungsoptik für ein optisches Gerät zur Beobachtung einer Probe, insbesondere zur TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy), wobei die Probe auf der der Beleuchtungsoptik abgewandten Seite eines Trägerglases positioniert ist und das aus der Beleuchtungsoptik austretende Beleuchtungslicht zu einem Beleuchtungsstrahlenbündel geformt ist, das mit der Normalen auf die Oberfläche des Trägerglases einen Winkel ungleich 90° einschließt.
Das Prinzip der TIRF-Mikroskopie ist aus dem Stand der Technik an und für sich bekannt. Dabei wird durch das Trägerglas hindurch kommendes Licht an der Grenzfläche zwischen dem Trägerglas und der Probe totalreflektiert.
Bedingung dafür ist, dass der Brechungsindex des Probenmaterials kleiner ist als der Brechungsindex des Glases, aus dem das Trägerglas besteht. Von der Zone der Totalreflexion ausgehend erstreckt sich ein Beleuchtungsfeld in das Probenmaterial hinein, das mit zunehmender Tiefe in der Probe exponentiell abklingt und als evaneszentes Beleuchtungsfeld bezeichnet wird.
Mit dieser Art der Beleuchtung ist es möglich, eine in der Tiefe der Probe gut abgegrenzte Beleuchtung zu schaffen, was vorteilhaft dazu nutzbar ist, nur die Fluoreszenzfarbstoffe anzuregen, die sich in unmittelbarer Nähe des Trägerglases innerhalb der Probe befinden.
Die Tiefe, bis zu der das evaneszente Beleuchtungsfeld in die Probe eindringt, hängt von dem vorgegebenen Winkel β ab, unter der Voraussetzung, dass der Winkel β den Bedingungen der Totalreflexion genügt.
Als Winkel β soll im Rahmen der nachfolgend beschriebenen Erfindung der Winkel verstanden werden, den das auf die Grenzschicht zwischen Trägerglas und Probe einfallende Beleuchtungsstrahlenbündel mit der Normalen auf das Trägerglas – und damit beispielsweise mit der optischen Achse eines Mikroskopobjektivs – einschließt. Die Richtung, in der sich die optische Achse erstreckt, gilt in der Regel auch als Z-Richtung eines Koordinatensystems X, Y, Z, wobei dann das Trägerglas in einer von den Koordinaten X, Y aufgespannten Ebene liegt.
Durch Variation des Winkels β läßt sich die Tiefe verändern, mit der das Beleuchtungsfeld in die Probe eindringt.
Es sind Anordnungen für Mikroskop-Auflichtdunkelfeldbeleuchtungen bekannt, bei denen ein ähnlicher Beleuchtungskanal zur Dunkelfeldbeleuchtung benutzt wird. TIRF-Mikroskopie ist bei dieser Anordnung nicht möglich, weil das Beleuchtungsbündel mit so großen Aberrationen behaftet ist, dass nicht für alle Strahlen Totalreflexion auftritt. Ein Beispiel hierfür ist der Epiplan-Neofuar 100x/1,3 Öl HD 442483-0000-000 des Unternehmens Carl Zeiss, Deutschland. Nachteiligerweise ist bei diesen Anordnungen außerdem die Beleuchtung und damit Beobachtung von Probenfeldern mit nur verhältnismäßig geringer Größe möglich. Desweiteren sind die Aberrationen des Beleuchtungssystems so groß, dass man von einem Winkel β gar nicht sprechen kann, weil ein ganzer Winkelbereich auftritt.
In der DE 196 30 322 A1 wird ein optisches Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem beschrieben, mit dem Anregungslicht auf der Probe abgebildet werden kann. Auch hierbei bestehen die vorgenannten Nachteile.
Von diesem Stand der Technik ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Beleuchtungsoptik der eingangs beschriebenen Art zu schaffen, mit der es möglich ist, größere Felder in der Probe zu beobachten sowie auch den verfügbaren Variationsbereich des Winkels β zu erweitern.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Beleuchtungsoptik der eingangs beschriebenen Art mindestens zwei optisch wirksame Elemente umfaßt, welche die Form und Richtung des Strahlenbündels beeinflussen, und die außerhalb des Detektionsstrahlenganges angeordnet sind, der von der Probe kommendes Licht einem Detektor zuführt. Bevorzugt sind diese optisch wirksamen Elemente ringförmig ausgebildet und konzentrisch um den Detektionsstrahlengang angeordnet.
Beispielsweise können die optisch wirksamen Elemente als ringförmige Linsen ausgebildet sein, die konzentrisch um den Detektionsstrahlengang angeordnete sphärisch oder asphärisch gewölbte Lichtein- und Lichtaustrittsflächen aufweisen.
Zwischen der Lichtaustrittsfläche der (in Richtung des Beleuchtungsstrahlengangs gesehen) letzten Linse, im Rahmen dieser Erfindung auch als Frontlinse bezeichnet, und dem Trägerglas ist eine Immersionsflüssigkeit vorgesehen. Dabei sollte das Glas, aus dem die Frontlinse besteht, einen Brechungsindex n_e aufweisen, der vom Brechungsindex n_e der Immersionsflüssigkeit um nicht mehr als 0,05 abweicht, und dessen Dispersion ν_e um maximal 20 von der Dispersion ν_e der Immersionsflüssigkeit abweicht.
Besonders vorteilhaft umfaßt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Beleuchtungsoptik vier ringförmige Linsen.
Alternativ dazu ist es denkbar und liegt auch im Rahmen der Erfindung, wenn die optisch wirksamen Elemente als ringförmige Spiegel ausgebildet sind mit konzentrisch um den Detektionsstrahlengang angeordneten, sphärisch oder asphärisch gewölbten Spiegelflächen.
Dabei kann mindestens einer der Spiegel als Rückflächenspiegel ausgebildet sein, bei dem das zu reflektierende Licht zunächst eine Trägerschicht durchdringt, an einer auf der Rückseite der Trägerschicht aufgebrachten Spiegelschicht reflektiert wird und in der reflektierten Richtung durch das Trägermaterial hindurch wieder austritt.
Bei einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Beleuchtungsoptik mit konzentrisch um den Detektionsstrahlengang angeordneten Spiegeln kann beispielsweise der (in Richtung des Beleuchtungsstrahlenganges gesehen) letzte Spiegel als Rückflächenspiegel ausgebildet ist.
Denkbar und im Rahmen der Erfindung liegen auch Beleuchtungsoptiken, in deren Beleuchtungsstrahlengang neben ringförmigen Linsen auch ringförmige Spiegel als optisch wirksame Elemente vorhanden sind.
Besonders vorteilhaft sind die optisch wirksamen Elemente in der erfindungsgemäßen Beleuchtungsoptik für Gesamtbrennweiten im Bereich von 1 mm bis 50 mm ausgelegt.
Des weiteren sollten die optisch wirksamen Elemente so ausgeführt sein, dass der Beleuchtungsstrahlengang als paralleles Lichtbündel aus der Frontlinse austritt, und sämtliche Strahlungsanteile des parallelen Lichtbündels unter demselben Winkel β auf die Grenzfläche zwischen Trägerglas und Probe treffen, das schließt sowohl die Vermeidung von Nichtparallelität von Strahlungsanteilen ein, die sich hinsichtlich der Wellenlänge unterscheiden, als auch die Vermeidung von Nichtparallelität von Strahlungsanteilen aufgrund von Aberrationen.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der beschriebenen Beleuchtungsoptik in Mikroskopen mit Auflichtbeleuchtungssystem sowie in Mikroskopen mit Durchlichtbeleuchtungssystem.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert werden.
Dazu zeigt 1 eine erfindungsgemäße Beleuchtungsoptik, welche vier ringförmige Linsen 1 bis 4 umfaßt, wobei die Linse 4 die Frontlinse bildet, aus welcher das Beleuchtungsstrahlenbündel 5 austritt und unter einem Winkel β, welcher der Bedingung der Totalreflexion genügt, auf die Grenzfläche zwischen einem Trägerglas 6 und der Probe 7 fällt. Zwischen der Frontlinse 4 und dem Trägerglas 6 befindet sich eine Immersionsflüssigkeit 8.
Im ausgesparten Zentrum der ringförmigen Linsen 1 bis 4 verläuft in einem Detektionsstrahlengang 9 das von der Probe 7 kommende Licht und gelangt zu einer nicht dargestellten Detektionseinrichtung.

Die Linsen 1 bis 4 weisen die in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Radien r, Dicken d und Abstände a in mm, Brechzahlen n_e bei der Wellenlänge 546 nm, Abbezahlen ν_e, und freien Durchmesser Frd auf. Entgegen den sonst nur möglichen und üblichen positiven Abständen zwischen den Linsen sind hier auch negative Abstände oder der Abstand 0 mm möglich. Dies lässt sich leicht verstehen: Ergänzt man die durchbohrte Linse wieder zu einer normalen würden sich die Linsen durchdringen, weil eben dieser negative Abstand der Linsenscheitel vorliegt.

Linse	Fläche	Radien r	Dicken d	Abstand a	Brechzahl n_e	Abbezahl ν_e	Frd
1	2 3	–25.0000 –28.1068	5.28456		1.52458	59.22	28
				12.4776
2	4 5	22.7704 –3033.99	8.12534		1.48914	70.23	30
				0.0000
3	6 7	10.4645 12.9410	8.0000		1.48914	70.23	20.6 15.0
				–5.0000
4	8 9	6.6167 Plan		10.5253	1.52458	59.22	13.2334

Als Glasarten kommen NK5 und NFK5 in Betracht. Das Trägerglas 6 ist plan ausgeführt und hat eine Dicke von 0.17 mm.
Als Immersionsflüssigkeit 8 dient vorteilhafterweise normales Immersionsöl mit einem Brechungsindex n_e = 1.518 und einer Dispersion ν_e = 47.37.
Der Winkel β wird variiert, indem man den Abstand des Fokuspunktes zur optischen Achse variiert. Beispielsweise ergibt ein Abstand von 12.5 mm zwischen Fokuspunkt und optischer Achse einen Winkel β von 82.5°, ein Abstand von 12.17 mm ergibt einen Winkel β von 74.1° usw.
In 2 ist der in 1 markierte Bereich A vergrößert dargestellt. Hier ist zu erkennen, dass der Beleuchtungsstrahlengang 5 als paralleles Lichtbündel aus der Frontlinse 4 austritt und durch die Immersionsflüssigkeit 8 und das Trägerglas 6 hindurch auf die Grenzfläche gerichtet ist, die zwischen der der Frontlinse 4 abgewandten Seite des Trägerglases 6 und der Probe 7 ausgebildet ist.
Mit dieser Ausführung der erfindungsgemäßen Beleuchtungsoptik können auf der Probe Felder mit einem Durchmesser von etwa 580 μm beobachtet werden. Daraus ergibt sich ein bedeutender Vorteil gegenüber dem Stand der Technik, da bisher nur Felder in der Größe von ca. 110 μm Durchmesser beobachtet werden konnten.
Dieser Vorteil wird im wesentlichen erzielt, weil eine separate Beleuchtungsoptik verwendet wird, die eine andere Brennweite als die Detektionsoptik aufweisen kann.
Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit der Verringerung der Eindringtiefe, weil mit der erfindungsgemäßen Beleuchtungsoptik Winkel β bis zu 81,2° realisiert werden können, was bei einer Immersionsölbrechzahl von 1.518 einer numerischen Apertur von 1,50 entspricht. Die Variation des Beleuchtungswinkels bzw. des Winkels β ist wegen der erzielbaren langen Brennweite, mit dem die Lichtquelle in die Probe abgebildet wird, wesentlich genauer möglich als in den Fällen des Standes der Technik, bei denen die Beleuchtung der Probe durch ein Mikroskopobjektiv hindurch erfolgt.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil besteht darin, dass die Eigenfluoreszenz des Materials, aus dem die optischen Elemente des Mikroskopobjektivs beim Stand der Technik bestehen, unberücksichtigt bleiben kann, da diese Elemente vom Beleuchtungslicht (das in der Fluoreszenzmikroskopie dem Anregungslicht entspricht) nicht mehr durchstrahlt werden.
Das gesamte optische System dieser Beleuchtungsoptik kann somit speziell auf die kürzeren Wellenlängen einer Fluoreszenzanregungsstrahlung optimiert werden, und es ist lediglich nur noch erforderlich, den Pupillenaußenbereich für ein Lichtbündel mit kleinem Durchmesser zu korrigieren, wodurch es möglich ist, das optische System unkompliziert auszugestalten.

1, 2, 3: Linsen
4: Frontlinse
5: Beleuchtungsstrahlenbündel
6: Trägerglas
7: Probe
8: Immersionsflüssigkeit
9: Detektionsstrahlengang
β: Winkel

Claims

Beleuchtungsoptik für ein optisches Gerät zur Beobachtung einer Probe (7), insbesondere zur TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy), wobei – die Probe (7) auf der der Beleuchtungsoptik abgewandten Seite eines Trägerglases (6) angeordnet ist, und – das aus der Beleuchtungsoptik austretende Beleuchtungslicht zu einem Beleuchtungsstrahlenbündel (5) geformt ist, das mit der Normalen auf die Oberfläche des Trägerglases (6) einen Winkel ungleich 90° einschließt, umfassend: – mindestens zwei optisch wirksame Elemente, welche die Form und Richtung des Beleuchtungsstrahlenbündels (5) beeinflussen, und – die außerhalb des Detektionsstrahlengangs (9) angeordnet sind, welcher von der Probe (7) kommendes Licht einem Detektor zuführt.
Beleuchtungsoptik nach Anspruch 1, bei welcher die optischen Elemente ringförmig ausgebildet und konzentrisch um den Detektionsstrahlengang (9) angeordnet sind.
Beleuchtungsoptik nach Anspruch 1 oder 2, bei der die optisch wirksamen Elemente als ringförmige Linsen (1, 2, 3, 4) ausgebildet sind, mit konzentrisch um den Detektionsstrahlengang (9) angeordneten Lichtein- und Lichtaustrittsflächen.
Beleuchtungsoptik nach Anspruch 3, bei welcher zwischen der Lichtaustrittsfläche der in Richtung des Beleuch tungsstrahlengangs (5) letzten Linse, d.h. der Frontlinse (4), und dem Trägerglas (6) eine Immersionsflüssigkeit (8) vorgesehen ist.
Beleuchtungsoptik nach Anspruch 4, bei welcher das Glas, aus dem die Frontlinse (4) besteht, einen Brechungsindex n_e aufweist, der vom Brechungsindex n_e der Immersionsflüssigkeit (8) um nicht mehr als 0,05 abweicht, und dessen Dispersion ν_e um maximal 20 von der Dispersion ν_e der Immersionsflüssigkeit (8) abweicht.
Beleuchtungsoptik nach Anspruch 5, bestehend aus vier Linsen mit in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Radien r, Dicken d und Abständen a in mm, Brechzahlen n_e bei der Wellenlänge 546 nm, Abbezahlen ν_e, und freien Durchmessern Frd: Linse Fläche Radien r Dicken d Abstand a Brechzahl n_e Abbezahl ν_e Frd 1 2 3 –25.0000 –28.1068 5.28456 1.52458 59.22 28 12.4776 2 4 5 22.7704 –3033.99 8.12534 1.48914 70.23 30 0.0000 3 6 7 10.4645 12.9410 8.0000 1.48914 70.23 20.6 15.0 –5.0000 4 8 9 6.6167 Plan 10.5253 1.52458 59.22 13.2334
Beleuchtungsoptik nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei welcher der Beleuchtungsstrahlengang (5) als paralleles Lichtbündel aus der Frontlinse (4) aus tritt, wobei sämtliche Strahlungsanteile des parallelen Lichtbündels, die sich hinsichtlich der Wellenlänge unterscheiden, unter demselben Reflexionswinkel β auf die Grenzfläche zwischen Trägerglas (6) und Probe (7) treffen.
Beleuchtungsoptik nach Anspruch 1 oder 2, bei der die optischen Elemente als ringförmige Spiegel ausgebildet sind mit konzentrisch um den Detektionsstrahlengang (9) angeordneten Spiegelflächen.
Beleuchtungsoptik nach Anspruch 8, bei der mindestens einer der Spiegel als Rückflächenspiegel ausgebildet ist.
Beleuchtungsoptik nach Anspruch 8 oder 9, bei welcher der in Richtung des Beleuchtungsstrahlengangs (5) letzte Spiegel vor dem Trägerglas (6), d.h. der Frontspiegel, als Rückflächenspiegel ausgebildet ist und zwischen dem Frontspiegel und dem Trägerglas (6) eine Immersionflüssigkeit (8) vorgesehen ist.
Beleuchtungsoptik nach Anspruch 1 oder 2 bei der sowohl als ringförmige Linsen als auch als ringförmige Spiegel ausgebildete optische Elemente vorgesehen sind.
Beleuchtungsoptik nach einem der vorgenannten Ansprüche, mit einer Brennweite im Bereich von 1 mm bis 50 mm.
Beleuchtungsoptik nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei welcher der Winkel β bis zu 81,2° betragen kann, was bei Immersionsmedien mit der Brechzahl n_e = 1.518 einer numerischen Apertur von 1,50 entspricht.
Verwendung einer Beleuchtungsoptik nach einem der Ansprüche 1 bis 13 in einem Mikroskop mit Auflichtbeleuchtungssystem.
Verwendung einer Beleuchtungsoptik nach einem der Ansprüche 1 bis 13 in einem Mikroskop mit Durchlichtbeleuchtungssystem.