DE102006036652A1 - Invention relating to cell line from carcass epithelial cells of pregnant cattle and their use - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung umfasst eine Zelllinie aus dem maternalen Anteil der Rinderplazenta trächtiger Tiere, die dauerhaft kultiviert (BCEC Bovine Caruncular Epithelial Cells Zelllinie) und in verschiedenen In-vitro-Assays unter anderem zum Nachweis auf die Wirksamkeit von Stoffen auf die epitheliale Barriere zwischen maternalem und fetalem Anteil verwendet wird. Die Zelllinie ist negativ für das BVD-Virus und wird auch als In-vitro-Assay für Infektionsstudien mit BVD eingesetzt.The present invention comprises a cell line from the maternal portion of the bovine placenta of pregnant animals that is permanently cultured (BCEC Bovine Caruncular Epithelial Cell Cell Line) and in various in vitro assays, inter alia, to demonstrate the efficacy of substances on the epithelial barrier between maternal and maternal fetal portion is used. The cell line is negative for the BVD virus and is also used as an in vitro assay for infection studies with BVD.
Description
Die Reproduktion beim Rind spielt eine zentrale Rolle in der heutigen Tierhaltung. Gute Fertilität und normal verlaufende Trächtigkeiten sind von entscheidender wirtschaftlicher Bedeutung. Daher ist es wichtig die Physiologie und Pathologie der Trächtigkeit zu erforschen um Mittel und Wege zu finden, eventuelle Störungen zu erkennen, vorzubeugen und ggf. zu behandeln. Studien am Tiermodell selbst sind zeit- und kostenaufwendig und daher ist es wichtig, Zellkulturen zu etablieren und in vitro Modelle zu entwickeln, die das Erforschen trächtigkeitsrelevanter und invasiver Prozesse erleichtern.The Cattle reproduction plays a key role in today Livestock farming. Good fertility and normal pregnancies are of crucial economic importance. That's why it's important to explore the physiology and pathology of gestation To find ways and means to detect and prevent possible disruptions and to treat if necessary. Studies on the animal model itself are timely and Costly and therefore it is important to establish cell cultures and to develop in vitro models that involve researching pregnancy relevant and facilitate invasive processes.
Mehr und mehr werden Zellkulturen als Tumormodelle und zur Erforschung neuer Wirkstoffe eingesetzt. Hier bieten das Rind und damit aus dem Rind etablierte Zelllinien erhebliche Vorteile gegenüber den Nagern (Maus und Ratte) als Modelltiere. Während Nager einen Plazentationstyp mit einem hochinvasiven Trophoblasten besitzen, weist das Rind nur eingeschränkt invasive Trophoblastriesenzellen (TGC) auf, die auf das maternale Epithel zu migrieren und mit jeweils einer Epithelzelle fusionieren. Da die Migration an der maternalen Basalmembran endet, ist die überwundene Distanz sehr kurz und damit überschaubarer, als beim hochinvasiven Trophoblasten von Nagern und dem Menschen. Diese überschau baren Verhältnisse eignen sich besonders für Kulturmodelle, weil das Verhalten einzelner Zellen nachvollzogen und gegebenenfalls stimuliert bzw. gehemmt werden kann.More and more will be cell cultures as tumor models and for research new active ingredients used. Here offer the cattle and thus Cattle established cell lines have significant advantages over the Rodents (mouse and rat) as model animals. During rodents a Plazentationstyp with a highly invasive trophoblast, the bovine only shows limited invasive trophoblastic cells (TGCs) on the maternal To migrate epithelium and merge with each epithelial cell. There The migration to the maternal basement membrane ends, is the overcome Distance very short and thus manageable, as in the highly invasive trophoblast of rodents and humans. These are overlooked conditions are particularly suitable for cultural models, because the behavior of individual cells retraced and if necessary can be stimulated or inhibited.
Der
Stand der Technik kennt aus dem Rind Primärzellkulturen von endometrialen
Epithelzellen. Diese sind z.B. beschrieben in
Allerdings wurde die Mehrheit der Primärzellkulturen wie auch die BEND Zelllinie aus nicht-trächtigen Rinderuteri isoliert, wobei größtenteils nicht zwischen den karunkulären Anlagen und der interkarunkulären Region unterschieden wurde. Dazu muss man wissen, dass in der Plazenta des Rindes ca. 80-120 so genannte Plazentome in das Uteruslumen hineinragen. Diese bestehen aus einem fetalen Anteil (Kotyledone) der mit dem mütterlichen Anteil (Karunkel) interdigitiert was einerseits zu einer festen Verankerung fetaler und maternaler Kompartimente führt, andererseits ist dies eine Region intensiver feto-maternaler Kommunikation.Indeed became the majority of primary cell cultures as well as the BEND cell line isolated from non-pregnant bovine uteri, for the most part not between the caruncular Plants and the interkaruncular Region was differentiated. You have to know that in the placenta of bovine approx. 80-120 so-called placentomes protrude into the uterine lumen. These consist of a fetal portion (Kotyledone) with the maternal Share (caruncle) interdigitates on the one hand to a solid anchorage fetal and maternal compartments, on the other hand this is a region of intense feto-maternal communication.
Studien zeigen, dass es zwischen den Epithelzellen der interkarunkulären (zwischen den Plazentomen) und der karunkulären Region Unterschiede in der Protein- und Genexpression gibt. Daher ist es wichtig diese Regionen differenziert zu betrachten.studies show that it is between the epithelial cells of the intercaruncular (between the placental) and the caruncular region differences in protein and gene expression. That's why it's important Differentiated regions.
Für die Entwicklung von in-vitro-Assays zur Diagnose und Therapie von Störungen in den trächtigkeitsrelevanten und invasiven Prozessen ist es daher besonders wichtig Zelllinien aus trächtigen Rinderuteri zu etablieren und dabei sorgfältig zwischen Zellkulturen mit einerseits maternalem und anderseits Zellkulturen mit fetalem Gewebe zu unterscheiden.For the development of in vitro assays for the diagnosis and treatment of disorders in the pregnancy relevant Therefore, it is particularly important cell lines for invasive processes from pregnant To establish bovine udder while taking care between cell cultures on the one hand maternal and on the other hand cell cultures with fetal Distinguish tissue.
Zellkulturen aus trächtigen Rinderuteri und Verfahren zu ihrer Anwendung in in-vitro-Assays sind derzeit nicht bekannt.cell cultures from pregnant Cattle uteri and methods for their use in in vitro assays are currently not known.
Sämtliche Untersuchungen von Störungen in den trächtigkeitsrelevanten Prozessen finden nur in vivo statt, ausschließlich über die Lokalisation von Markerproteinen auf Protein- und mRNA Ebene. Als Material werden Proben (größtenteils post mortem) verwendet, die sowohl maternale aber auch fetale Anteile enthalten, da es bei der Präparation aufgrund der intensiven mechanischen Verankerung beider Gewebe nicht möglich ist, fetales von maternalem Gewebe zu trennen.All Investigations of disorders in the pregnancy-relevant Processes only take place in vivo, exclusively via the localization of marker proteins at the protein and mRNA level. As a material, samples (mostly post mortem), which used both maternal and fetal parts included as it is at the preparation not due to the intense mechanical anchoring of both tissues possible is to separate fetal from maternal tissue.
Beide Gewebe können nämlich auf zellulärer Ebene nur histologisch, nicht aber funktionell differenziert werden. Aufgrund der Größe der Tierart Rind und deren langer Trächtigkeitsdauer (9 Monate) wurden funktionelle Studien zu Störungen bislang nur im geringen Umfang durchgeführt, weil der Zeitaufwand und die dadurch bedingten Kosten sehr hoch sind.Both Tissue can namely at the cellular level only histologically, but not functionally differentiated. by virtue of the size of the animal species Beef and its long gestation period (9 months) functional studies on disorders have so far only been minor Scope performed, because the time required and the associated costs are very high are.
Es besteht daher ein Bedarf an etablierten maternalen Zelllinien und fetalen Zelllinien aus trächtigen Rinderuteri zur Verwendung in in-vitro-Assays zur Diagnose und Therapie von Störungen in den trächtigkeitsrelevanten und invasiven Prozessen sowie der Tumorforschung, Untersuchung der Endokrinologie, Zell-Zell Interaktionen, Passage von toxischen Substanzen und Medikamenten und diaplazentaren Übertragung von Krankheitserregern.It There is therefore a need for established maternal cell lines and pregnant fetal cell lines Bovine uteri for use in in vitro assays for diagnosis and therapy of disorders in the pregnancy-relevant and invasive processes as well as tumor research, investigation of Endocrinology, cell-cell interactions, passage of toxic substances and drugs and diaplacental transmission of pathogens.
Endokrinologische
Störungen
haben einen großen
Einfluss auf den Verlauf der Trächtigkeit.
Neben Östrogen-
und Oxytocin-Wirkungen ist im Besonderen auch die Wirkung von Glukokortikoiden bzw.
Substanzen, die dieselben Rezeptoren binden von Bedeutung. Dies
ist beispielsweise beschrieben in
Es ist bekannt, dass unter anderem der Glukokortikoidrezeptor im Karunkelepithel vorkommt. Die Gabe von Glukokortikoiden während der Trächtigkeit führt unter anderem zum Abort. Es ist daher von Bedeutung, die Wirkung dieser Hormone, die auf die Steroidsynthese Einfluss haben in-vitro in einer geeigneten Zellkultur zu untersuchen.It It is known that, among other things, the glucocorticoid receptor in the carcinoid epithelium occurs. The administration of glucocorticoids during pregnancy leads under other abortion. It is therefore important to the effect of this Hormones that affect steroid synthesis in vitro to examine a suitable cell culture.
Aufgabetask
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es eine, auf längerfristige Weiterzüchtung angelegte maternale Zelllinie aus einem trächtigen Rinderuterus bereit zustellen, ein Verfahren zu ihrer Langzeit-Kultivierung und einen in-vitro-Assay zum Einsatz der Zelllinie in der Diagnostik von Störungen der Trächtigkeit des Rindes.task In the present invention, it is one designed for long-term on-breeding maternal cell line from a pregnant Provide bovine uterus, a procedure for their long-term cultivation and an in vitro assay for use of the cell line in diagnostics of disorders the pregnancy of the bovine.
Lösungsolution
Die vorliegende Aufgabe wird durch eine Zelllinie gemäß Anspruch 1, durch ein Verfahren gemäß der Ansprüche 11 bis 13 gelöst, indem Epithelzellen aus dem maternalen Anteil der Rinderplazenta trächtiger Tiere dauerhaft kultiviert (BCEC Bovine Caruncular Epithelial Cells Zelllinie) werden, bei gleichzeitig erhaltenen epithelialen und plazentaspezifischen Eigenschaften und durch in-vitro-Assays zur Therapie und Diagnostik trächtigkeitsrelevanter und invasiver Prozesse gemäß der Ansprüche 14 bis 24.The This object is achieved by a cell line according to claim 1, by a method according to claims 11 to 13 solved, by making epithelial cells from the maternal part of the bovine placenta more pregnant Animals cultured permanently (BCEC Bovine Caruncular Epithelial Cells Cell line), with simultaneous epithelial and placental-specific properties and by in vitro assays Therapy and diagnostics relevant to pregnancy and Invasive processes according to claims 14 to 24.
Die Vorteile dieser erfindungsgemäßen Zelllinie bestehen darin, dass sie maternale Zellen aus dem Uterus trächtiger Tiere darstellen, eine auf längerfristige Weiterzüchtung angelegte dauerhafte Kultivierung (long-term culture) möglich ist und die Zellen negativ auf BVD-Virus getestet sind.The Advantages of this cell line according to the invention are that they maternal cells from the uterus pregnant Represent animals, one on longer term Next breeding established permanent cultivation (long-term culture) is possible and the cells are tested negative for BVD virus.
Die Problematik der BVD Infektion besteht in der Tatsache, dass das Virus diaplazentar von der Mutter auf den Fetus übertragen wird und im späteren zur Erkrankung des Kalbes an der tödlich verlaufenden Form, der „Mucosal disease" führt.The Problem of BVD infection consists in the fact that the Virus diaplazentar is transmitted from the mother to the fetus and later in the Disease of the calf at the deadly running form, the "Mucosal disease "leads.
Da die erfindungsgemäße BCEC-Zelllinie an sich BVD-Virus negativ ist, jedoch mit dem BVD-Virus infizierbar ist, eignet sie sich als Testsystem zur Erforschung der Pathogenese dieser Erkrankung und als Testsystem für die Wirksamkeit von Medikamenten und anderen Stoffen, die zu Diagnostik und Therapie dieser Erkrankung eingesetzt werden. Bislang wird die BVD-Forschung in vitro entweder an nicht-Rinder Zelllinien durchgeführt oder aber an einer aus der Rinderniere (Marbin Darby Bovine Kidney – MDBK Zelllinie) gewonnenen Zelllinie. Dieses Organ spielt aber bei der Pathogenese der Erkrankung keine Rolle, denn das Virus muss die Plazentabarriere, bestehend aus dem mütterlichen Karunkelepithel, überwinden. Somit stellt die erfindungsgemäße BCEC-Zelllinie eine wertvolle Basis für die Erforschung des Infektionswegs durch BDV dar und wird vielseitig als Testsystem verwendet.There the BCEC cell line according to the invention in itself BVD virus is negative, but infectable with the BVD virus is suitable as a test system for the investigation of pathogenesis This disease and as a test system for the effectiveness of drugs and other substances leading to diagnosis and therapy of this disease be used. So far, BVD research is either in vitro performed on non-cattle cell lines or on an off bovine kidney (Marbin Darby Bovine Kidney - MDBK cell line) Cell line. However, this organ plays in the pathogenesis of the disease not matter, because the virus must be the placental barrier, consisting from the maternal Carbuncle epithelium, overcome. Thus, the inventive BCEC cell line a valuable base for the exploration of the path of infection by BDV and is versatile used as a test system.
Beschreibungdescription
Das Verfahren zur Herstellung der BCEC-Zelllinie umfasst die Isolierung von Karunkelepithelzellen aus dem Uterus trächtiger Rinder, die Erstellung einer Pimärkultur, deren Wachstum und Passagen bis zur Überführung in eine Dauerkultur (long term culture) mit Stabilität bis zu 32 Passagen.The Method of making the BCEC cell line involves isolation of carcinoepithelial cells from the uterus of pregnant cattle, the creation a pimply culture, their growth and passages until their transformation into a permanent crop (long term culture) with stability up to 32 passages.
Bereits die Primärkultur, aus der dauerhaft wachsende Zellen generiert werden, entsprechen in ihrer Morphologie und Proteinexpression den Ursprungszellen. Einzige Ausnahme bildet die Expression eines nicht epithelialen Strukturproteins, das Vimentin, ein Phänomen welches in vielen epithelialen Zelllinien gleicher Herkunft anderer Tierarten bzw. anderer Herkunft gleicher oder anderer Tierarten auftritt und in der Literatur toleriert wird.Already the primary culture, from which permanently growing cells are generated in their morphology and protein expression, the cells of origin. The only exception is the expression of a non-epithelial Structural protein, vimentin, a phenomenon common in many epithelial cell lines of the same origin of other animal species or of another source of the same or other animal species and is tolerated in the literature.
Die Primärkultur sowie die dauerhaft wachsenden Zellen der Zellkultur sind negativ für das bovine Virusdiarrhoe Virus (BVDV), lassen sich mit diesem Virus jedoch infizieren. Das Wachstum der Zellen erfolgt unter relativ einfach zu handhabenden Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, in Zellkulturflaschen oder auch Wells. Bevorzugt wachsen sie auf einer Membran innerhalb eines Inserts (Well im Well), welches den separaten Zugang entweder zum apikalen oder basalen Kompartiment der Epithelzellen (oder auch der epithelialen Barriere) ermöglicht. Besonders bevorzugt erfolgt das Wachstum der Zellen auf einem Untergrund, der mit Proteinen der extrazellulären Matrix (v.a. Fibronectin, aber auch Collagen A) beschichtet ist, welches das Wachstum des Zellen erheblich beschleunigt.The primary culture as well as the permanently growing cells of cell culture are negative for the Bovine virus diarrhea virus (BVDV), can be treated with this virus however, infect. The growth of the cells takes place under relative easy-to-use conditions known to those skilled in the art, in cell culture bottles or wells. Preferably they grow up a membrane within an insert (well in the well) containing the separate access to either the apical or basal compartment the epithelial cells (or even the epithelial barrier) allows. Particularly preferably, the growth of the cells takes place on a substrate, with extracellular matrix proteins (especially fibronectin, but also collagen A) is coated, which is the growth of Cells significantly accelerated.
Vorteilhafterweise weisen die erfindungsgemäß dauerhaft wachsenden Zellen der BCEC-Zelllinie eine intakte epitheliale Barriere auf, was mittels Messung des transepithelialen Widerstandes verifiziert wurde. Dieses Charakteristikum ist Voraussetzung für die Verwendung der Zellen in Transportstudien mit trächtigkeitsrelevanten Substanzen (Medikamenten, Hormonen und anderen Stoffen), Toxinen oder auch Infektionserregern (Viren wie z.B. BVDV, Bakterien u.a. Mikroorganismen). Für Studien zur genaueren Untersuchung des Zellstoffwechsels werden vor allem die auf Membranen kultivierten dauerhaft wachsenden Zellen der BCEC-Zelllinie verwendet.advantageously, have the invention permanently growing cells of the BCEC cell line an intact epithelial barrier which was verified by measuring transepithelial resistance has been. This characteristic is a prerequisite for use of the cells in transport studies with pregnancy-relevant substances (Medicines, hormones and other substances), toxins or too Infectious agents (viruses such as BVDV, bacteria and other microorganisms). For studies for a closer examination of the cell metabolism will be mainly used on membranes cultured permanently growing cells of the BCEC cell line.
Ausführungsbeispiel 1embodiment 1
Erstellung einer PrimärkulturCreation of a primary culture
In der vorliegenden Erfindung werden Zellen bis zur 2. Passage noch als Primärkultur bezeichnet, da erst ab diesen Zeitpunkt ausreichend epitheliale Zellen vorhanden sind. Die Primärkultur wird erstellt:
- i) Isolierung der maternalen Karunkel
- ii) Isolation und Aussaat der Zellen
- iii) Pflege und Aufreinigung der Primärkultur
- i) Isolation of the maternal caruncles
- ii) Isolation and seeding of the cells
- iii) care and purification of the primary culture
i) Isolierung der maternalen Karunkeli) Isolation of the maternal caruncles
Ausgangsmaterial ist Uterus mind. eines trächtigen Rindes, wobei die Plazentome steril entnommen werden. Es erfolgt die Abtrennung des karunkulären Anteils, z.B. indem das Plazentom manuell durch sanften Zug in fetale Kotyledone und maternalen Karunkel separiert wird. Die maternale Karunkel wird anschließend in ein Gefäß (vorzugsweise sterilisiert, pyrogenfrei, RNA-/DNA-frei, RNase-/DNase-frei) mit vorzugsweise steriler Enzymlösung mit Collagenase I (z.B. von Biochrom AG seromed, Berlin) mit einer Endkonzentration von vorzugsweise 200 U/ml in vorzugsweise 1 ml Puffer (z.B. Hank's Salt Solution mit Ca2+ & Mg2+ bsp. von Biochrom AG seromed, Berlin) und 9 ml Medium (z.B. DMEM/HAM's F12 mit Glutamin und NaHCO3-Fertiglösung z.B. PAA Laboratories GmbH, Cölbe) mit 10% fetalem Kälberserum (z.B. Biochrom AG seromed, Berlin) und 1% Penicillin/Streptomycin (10.000 IE/10.000 μg/ml) (Biochrom AG seromed, Berlin) überführt, vorzugsweise so, dass der Teil der Karunkel der mit der Kotyledone verankert war (= Chorionplattennahe Fläche) nach unten in die Lösung taucht, so dass sich Zellen lösen. Das Gefäß wird nun mindestens 60 min bei 37°C inkubiert.The starting material is uterus at least one pregnant cow, the placentomes are removed sterile. The separation of the caruncular part is effected, for example by the placentomoma being separated manually by gentle pulling into fetal cotyledons and maternal caruncles. The maternal caruncle is subsequently placed in a vessel (preferably sterilized, pyrogen-free, RNA / DNA-free, RNase / DNase-free) with preferably sterile enzyme solution with collagenase I (eg from Biochrom AG seromed, Berlin) with a final concentration of preferably 200 U / ml in preferably 1 ml of buffer (eg Hank's Salt Solution with Ca 2+ & Mg 2+ from biochrom AG seromed, Berlin) and 9 ml of medium (eg DMEM / HAM's F12 with glutamine and NaHCO 3 final solution eg PAA Laboratories GmbH, Cölbe) with 10% fetal calf serum (eg, Biochrom AG seromed, Berlin) and 1% penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 μg / ml) (Biochrom AG seromed, Berlin), preferably so that the part of the caruncle of the was anchored with the cotyledons (= Chorionplattennahe surface) down into the solution so that cells dissolve. The vessel is then incubated at 37 ° C for at least 60 min.
ii) Isolation und Aussaat der Zellenii) Isolation and seeding of the cells
Danach wird das Karunkelstück entfernt und die Lösung mit den Zellen zentrifugiert, z.B. 5 min bei 160 × g und der Überstand verworfen. Die Zellen im Pellet werden mit Medium (z.B. DMEM/HAM's F12 mit Glutamin und NaHCO3-Fertiglösung (PAA Laboratories GmbH, Cölbe) mit 10% fetalem Kälberserum (Biochrom AG seromed, Berlin) und 1% Penicillin/Streptomycin (10.000 IE/10.000 μg/ml) (Biochrom AG seromed, Berlin) resuspendiert und in Zellkulturflaschen (vorzugs weise sterilisiert, pyrogenfrei, RNA-/DNA-frei, RNase-/DNase-frei) mit Medium überführt. Die Inkubation erfolgt bei 5% CO2 und 37°C.Thereafter, the piece of caruncle is removed and the solution is centrifuged with the cells, eg 5 min at 160 × g and the supernatant discarded. The cells in the pellet are treated with medium (eg DMEM / HAM's F12 with glutamine and NaHCO 3 finishing solution (PAA Laboratories GmbH, Cölbe) with 10% fetal calf serum (Biochrom AG seromed, Berlin) and 1% penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 g / ml) (Biochrom AG seromed, Berlin) and transferred into culture flasks (preferably sterilized, pyrogen-free, RNA / DNA-free, RNase / DNase-free) with medium, incubation is carried out at 5% CO 2 and 37 ° C.
iii) Pflege und Aufreinigung der Primärkulturiii) care and purification of the primary culture
Die maternalen Epithelzellen werden aufgereinigt, indem die Zellen mehrere Tage vorzugsweise 5-7 Tage inkubiert werden.The Maternal epithelial cells are purified by adding multiple cells Days are preferably incubated for 5-7 days.
Anschließend wird das Medium nach der dem Fachmann bekannten Weise gewechselt und weitere Tage, vorzugsweise 2-3 Tage inkubiert. In einer mikroskopischen Überprüfung werden charakteristische Zellpopulationen erkennbar. Fibroblastoide Zellen, die der stromalen Fraktion des karunkulären Gewebes entsprechen und andererseits Kolonien epitheloider Zellen. Dabei heften sich die Epithelzellen stärker an den Zellkulturflaschenboden an, als die übrigen Zellen. Zur Durchführung der 1. Passage vorzugsweise 10-14 Tage nach der Isolation wird Medium entfernt, die Zellen mehrmals mit Puffer (z.B. Hank's Salt Solution ohne Ca2+ & Mg2+ bsp. von Biochrom AG seromed, Berlin) gewaschen und mit Trypsin (0,5% Trypsin/0,2% EDTA-Stammlösung (10×) z.B. von Biochrom AG seromed, Berlin) inkubiert.Subsequently, the medium is changed according to the manner known to those skilled in the art and incubated for a further days, preferably 2-3 days. Microscopic examination reveals characteristic cell populations. Fibroblastoid cells that correspond to the stromal fraction of the caruncular tissue and colonies of epithelioid cells. The epithelial cells attach more strongly to the cell culture bottle bottom than the remaining cells. For carrying out the first passage, preferably 10-14 days after isolation, medium is removed, the cells are washed several times with buffer (eg Hank's Salt Solution without Ca 2+ & Mg 2+, for example, from Biochrom AG, seromed, Berlin) and treated with trypsin ( 0.5% trypsin / 0.2% EDTA stock solution (10 ×), for example, from Biochrom AG seromed, Berlin).
Die fibroblastoiden Zellen lösen sich und können entfernt werden, während die epitheloiden Zellen unverändert bleiben und erst durch weiteres Trypsin gelöst und in neues Medium überführt werden.The Dissolve fibroblastoid cells yourself and can be removed while the epitheloid cells unchanged remain and only be solved by further trypsin and transferred into new medium.
5-7 Tage nach der 1. Passage sind bereits neue Zellkolonien am Flaschenboden erkennbar und die 2. Passage erfolgt. Da die Zellen nicht so stark anhaften wie bei der 1. Passage, wird die Inkubationszeiten im Trypsin verkürzt.5-7 Days after the first passage are already new cell colonies on the bottom of the bottle recognizable and the second passage takes place. Because the cells do not adhere so strongly as in the first passage, the incubation times in trypsin are shortened.
Diese Zellen sind das Rohmaterial für Untersuchungen an der Primärkultur und werden je nach Versuchsansatz in die entsprechenden Gefäße (Zellkulturflaschen, 6-Wells, etc.) ausgesät. Für die Erstellungen der Zelllinie erfolgt die Aussaat vorzugsweise Zellkulturflaschen.These Cells are the raw material for Investigations on the primary culture and depending on the experimental batch in the appropriate vessels (cell culture bottles, 6-wells, etc.) seeded. For the Creation of the cell line is done by sowing preferably cell culture bottles.
Konfluenz wird nach 5-7 Tagen (max. 10 Tagen) erreicht.confluence is reached after 5-7 days (max 10 days).
Fibronectin wird als Lösung von bovinem Plasma, 1 mg/ml (z.B. von SIGMA-Alderich Chemie) eingesetzt, Collagen A als Lösung 1 mg/ml (z.B. von Biochrom AG seromed, Berlin) fibronectin is considered a solution of bovine plasma, 1 mg / ml (e.g., from SIGMA-Alderich Chemie), collagen A as a solution 1 mg / ml (for example from Biochrom AG seromed, Berlin)
Ausführungsbeispiel 2embodiment 2
Erstellung der BCEC-1 ZelllinieCreation of the BCEC-1 cell line
Die Zelllinie entsteht durch weitere Kultivierung der Primärkultur aus Schritt i) bis iii) über einen möglichst langen Zeitraum hinweg bei Erhaltung der spezifischen Eigenschaften der Zellen.The Cell line is formed by further cultivation of the primary culture from step i) to iii) one possible long period of time while preserving the specific properties the cells.
Dabei werden die Kulturen in neue Zellkulturflaschen passagiert sobald diese konfluent sind (= Verdoppelung der Kultur nach jeder Passage).there The cultures are passaged into new cell culture bottles as soon as possible these are confluent (= duplication of culture after each passage).
Die Passagen erfolgen nach folgendem Muster, wobei die erfindungsgemäßen BCEC-1 Zelllinie selbst nach Passage 32 die beschriebenen epithelspezifischen Eigenschaften aufweisen:
- • 3 × Spülen der Zellen mit Puffer I
- • Inkubation in Trypsin für mind. 2-3 min
- • Verwerfen des alten und Zugabe neuen Trypsins
- • Inkubation für mind. 1-2 min
- • Lösen der restlichen Zellen mittels Klopfen und Zellkulturschaber
- • Zugabe von frischem Medium
- • mehrmalige Resuspension
- • Aussaat der Zellsuspension in neue mit Medium befüllte Zellkulturflaschen (aus 1 werden 2)
- • Kultivierung im Brutschrank
- • Mediumwechsel erfolgt nach 2-3 Tagen
- Rinse the cells 3 × with buffer I
- • Incubation in trypsin for at least 2-3 min
- Discard the old and add new trypsin
- • incubation for at least 1-2 min
- • Loosen the remaining cells by tapping and cell culture scraper
- • Addition of fresh medium
- • repeated resuspension
- • Sow the cell suspension in new cell culture bottles filled with medium (from 1 to 2)
- • Cultivation in the incubator
- • Medium change occurs after 2-3 days
Besonders vorteilhaft erfolgen Proliferation und Wachstum der erfindungsgemäßen BCEC-1 Zelllinie in Zellkulturflaschen, die eine Beschichtung des Bodens mit Proteinen aufweisen. Diese Proteine sind ausgewählt aus der Gruppe der extrazellulären Matrix, Fibronectin im besonderen aber auch Collagen A. Die Zellen sind vitaler und bilden eine funktionelle und deutlich messbare epitheliale Barriere aus. Sie gelangen schneller zur Konfluenz. Diese vorteilhafte Wirkung zeigt sich auch bei Verwendung von Well-Platten und Inserts mit Beschichtung durch diese Proteine.Especially Advantageously, proliferation and growth of the BCEC-1 cell line according to the invention take place in cell culture bottles that cover the soil with proteins exhibit. These proteins are selected from the group of extracellular matrix, Fibronectin in particular but also collagen A. The cells are more vital and form a functional and clearly measurable epithelial Barrier off. They reach confluence faster. This advantageous Effect is also evident when using well plates and inserts coated with these proteins.
Die Beschichtung einer Zellkulturflasche mit Proteinen beispielsweise Fibronectin erfolgt, indem eine in Puffer (z.B. Hank's Salt Solution ohne Ca und Mg) verdünnte z.B. 1%ige Fibronectin Lösung (10 μg/ml) hergestellt und z.B. 150 μl davon pro cm2 Fläche aufgetragen werden. Daran schließt sich eine Inkubation für mind. 30 min bei Raumtemperatur (20-30°C) an. Überschüssige Lösung wird entfernt und Medium bzw. Zellsuspension eingefüllt.The coating of a cell culture flask with proteins, for example fibronectin, is carried out by preparing a 1% fibronectin solution (10 μg / ml) diluted in buffer (eg Hank's Salt Solution without Ca and Mg) and, for example, 150 μl thereof per cm 2 of surface area. This is followed by incubation for at least 30 min at room temperature (20-30 ° C). Excess solution is removed and filled medium or cell suspension.
Die Beschichtung einer Zellkulturflasche mit Proteinen beispielsweise Collagen A erfolgt, indem eine in Puffer (z.B. Hank's Salt Solution ohne Ca2+ und Mg2 +) verdünnte z.B. 2%ige Collagen A Lösung (20 μg/ml) hergestellt und z.B. 150 μl davon pro cm2 Fläche aufgetragen werden.Is carried out, for example, Collagen A coating a cell culture bottle with proteins by an in buffer (such as Hank's Salt Solution without Ca 2+ and Mg 2+) diluted eg 2% collagen prepared and A solution (20 ug / ml), for example per 150 .mu.l thereof cm 2 area can be applied.
Ausführungsbeispiel 3embodiment 3
Kryokonservierung der BCEC-1 ZelllinieCryopreservation of the BCEC-1 cell line
Die Voraussetzung für die Etablierung der BCEC-1 Zelllinie ist die Kryokonservierung für eine längere Lagerung. Späteres Auftauen erlaubt den Einsatz der BCEC-1 Zelllinie zu einem beliebigen Zeitpunkt.
- a) Ernte der Zellen Zellen der BCEC-1 Zelllinie einer Passage werden in Trypsin gelöst und in Medium (z.B. DMEM/HAM's F12 mit Glutamin und NaHCO3-Fertiglösung (z.B. PAA Laboratories GmbH, Cölbe) mit 10% fetalem Kälberserum (z.B. Biochrom AG seromed, Berlin) und 1% Penicillin/Streptomycin (10.000 IE/10.000 μg/ml) (z.B. Biochrom AG seromed, Berlin)) resuspendiert und in ein neues Gefäß überführt. Kurze Zentrifugation, um Überstand und Pellet zu trennen z.B. 5 min bei 160 × g (1000 U/min). Der Überstand wird entfernt, das Pellet in Medium resuspendiert und erneut zentrifugiert. Insgesamt erfolgen drei Zentrifugationsschritte.
- b) Das Zellpellet wird in Kryolösung resuspendiert und in ein zum Einfrieren geeignetes Gefäß überführt.
- a) Harvesting of Cells Cells of the BCEC-1 cell line of one passage are dissolved in trypsin and in medium (eg DMEM / HAM's F12 with glutamine and NaHCO 3 final solution (eg PAA Laboratories GmbH, Cölbe) with 10% fetal calf serum (eg Biochrom AG seromed, Berlin) and 1% penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 μg / ml) (eg Biochrom AG seromed, Berlin)) and transferred to a new vessel. Short centrifugation to separate supernatant and pellet eg 5 min at 160 xg (1000 rpm). The supernatant is removed, the pellet resuspended in medium and recentrifuged. In total, there are three centrifugation steps.
- b) The cell pellet is resuspended in cryosolution and transferred to a suitable freezing vessel.
Die Kryolösung besteht aus:
- • 1 Teil: Dimethylsulphoxide (DMSO), steril filtriert, auf Endotoxine getestet, auf Hybridoma getestet (z.B. von SIGMA-Alderich Chemie)
- • 3 Teile: Fetales Kälber Serum (BVD-Virus frei) (z.B. von Biochrom AG seromed, Berlin)
- • 6 Teile: Medium (z.B. DMEM/HAM's F12 mit Glutamin und NaHCO3-Fertiglösung (z.B. PAA Laboratories GmbH, Cölbe))
- • 1 part: dimethylsulphoxide (DMSO), sterile filtered, tested for endotoxins, tested for hybridomas (eg from SIGMA-Alderich Chemie)
- • 3 parts: fetal calf serum (BVD virus free) (eg from Biochrom AG seromed, Berlin)
- 6 parts: medium (eg DMEM / HAM's F12 with glutamine and NaHCO 3 final solution (eg PAA Laboratories GmbH, Cölbe))
Kurzfristig ist eine Lagerung der Zellen der BCEC-1 Zelllinie bei -20°C möglich, die Haltbarkeit erhöht sich bei Lagerung bei -80°C, sodass die Zellen bis zu 12 Monaten ohne Funktionsverlust lagerbar sind. Die Haltbarkeit wird weiter verlängert bei Lagerung in -180°C (z.B. Stickstoff)Short term it is possible to store the cells of the BCEC-1 cell line at -20 ° C, the Increased durability when stored at -80 ° C, so that the cells can be stored for up to 12 months without loss of function. The durability is further extended when stored in -180 ° C (e.g., nitrogen)
Das Auftauen der Zellen der BCEC-1 Zelllinie aus der Kryokonservierung erfolgt langsam bis auf Raumtemperatur, wobei die Zellen in Medium gelöst und in ein geeignetes Gefäß überführt werden. Vorzugsweise erfolgen drei Zentrifugationsschritte wie bei der „Ernte der Zellen" beschrieben. Sie werden in alternativ in Zellkulturflaschen, Wells oder Platten mit Inserts ausgesät.The Thawing the cells of the BCEC-1 cell line from cryopreservation Slowly bring to room temperature, taking the cells in medium solved and transferred to a suitable vessel. Preferably take three centrifugation steps as in the "harvest of the cells ". They are alternatively used in cell culture bottles, wells or plates seeded with inserts.
Ausführungsbeispiel 4embodiment 4
Verfahren zur Erstellung einer Insert-Zellkultur mit Zellen der BCEC-1 Zelllinie zur Verwendung im in-vitro AssayMethod of creating an insert cell culture with cells of the BCEC-1 cell line for use in the in vitro assay
Mit diesem Verfahren ist es möglich mit den Zellen der BCEC-1 Zelllinie eine Insert-Zellkultur herzustellen, die eine funktionelle epitheliale Barriere in vitro darstellt und als in-vitro-Assay vielfältige Verwendung findet. Diese epitheliale Barriere entspricht der Hauptfunktion der Zellen der BCEC-1 Zelllinie in vivo. Das Wachstum der Zellen der BCEC-1 Zelllinie in den Inserts ermöglicht einen separaten Zugang entweder zur apikalen oder basalen Seite der Barriere. Beispielhaft wird das Transwell® Insert Modell von Corning verwendet. Das Transwell® Insert System erlaubt die Beurteilung der Zellen im Lichtmikroskop, des weiteren ist es immunzytologischen Methoden sehr einfach zugänglich. Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopie sind leicht anzuwenden.With this method, it is possible to use the cells of the BCEC-1 cell line to produce an insert cell culture which is a functional epithelial barrier in vitro and has many uses as an in vitro assay. This epithelial barrier corresponds to the major function of the cells of the BCEC-1 cell line in vivo. The growth of the cells of the BCEC-1 cell line in the inserts allows separate access to either the apical or basal side of the barrier. By way of example, the Transwell ® insert model of Corning is used. The Transwell ® Insert System allows the evaluation of cells by light microscopy, furthermore, it is very easy to access immunocytological methods. Transmission and Scanning Electron Microscopy are easy to use.
Die Funktionalität der epithelialen Barriere wird mittels Transepithelialer Resistenz (TEER) nachgewiesen. Dabei wird beispielsweise das „Epithelial Voltohmmeter" (EVOMTM, World Precision Instruments) verwendet. Damit wird auch der Einfluss verschiedenster Wirkstoffe (Hormone, Arzneimittel, Placebos, Nahrungsergänzungsmittel, Arzneimittel, Umweltgifte, Infektionserreger u.a.) auf die Integrität der epithelialen Barriere der BCEC-1 Zelllinie gemessen.The functionality of the epithelial barrier is demonstrated by means of transepithelial resistance (TEER). For example, the "Epithelial Volumetric Meter" (EVOM ™ , World Precision Instruments) is used to assess the influence of various drugs (hormones, drugs, placebos, nutritional supplements, drugs, environmental toxins, infectious agents, etc.) on the integrity of the BCEC epithelial barrier. 1 cell line measured.
Die
Insert-Zellkultur wird wie folgt nach Herstellerangaben erstellt:
Die
Zellen der erfindungsgemäßen BCEC-1
Zelllinie werden in den Transwell® Inserts
ausgesät,
wobei Zellen verwendet werden, die konfluent in Zellkulturfla schen
gewachsen sind oder kryokonserviert waren. Nach der Passage bzw.
dem Auftauen werden die Zellen der BCEC-1 Zelllinie in Medium (z.B. DMEM/HAM's F12 mit Glutamin
und NaHCO3-Fertiglösung (z.B. PAA Laboratories
GmbH, Cölbe)
mit 10% fetalem Kälberserum
(z.B. Biochrom AG seromed, Berlin) und 1% Penicillin/Streptomycin
(10.000 IE/10.000 μg/ml)
(z.B. Biochrom AG seromed, Berlin)) gelöst.The insert cell culture is prepared according to the manufacturer's instructions as follows:
The cells of the invention BCEC-1 cell line are seeded in the Transwell ® inserts, using cells which are grown in confluent Zellkulturfla rule or were cryopreserved. After passage or thawing, the cells of the BCEC-1 cell line in medium (eg DMEM / HAM's F12 with glutamine and NaHCO 3 final solution (eg PAA Laboratories GmbH, Cölbe) with 10% fetal calf serum (eg Biochrom AG seromed, Berlin ) and 1% penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 μg / ml) (eg Biochrom AG seromed, Berlin)).
Beispielsweise erfolgt eine Aussaat in 12-Well Platten mit Inserts, die zuvor mit Medium befüllt werden. Die Inserts werden mit Zellen der BCEC-1 Zelllinie befüllt. Nach Inkubation Brutschrank und Medienwechsel wird die Konfluenz nach 5-7 Tagen erreicht.For example Sowing takes place in 12-well plates with inserts, previously with Medium filled become. The inserts are filled with cells of the BCEC-1 cell line. To Incubation incubator and media change will be confluent after 5-7 Days reached.
Mit dieser Insert-Kultur sind nach Zugabe von Stoffen, wie Arzneimitteln und anderen Wirkstoffen u.a. Nachweise von Veränderung des Cytoskeletts, der morphologischen Strukturen und/oder dem genetischen Material der Zelllinie möglich, wie die weiteren Ausführungsbeispiele zeigen.With this insert culture are after addition of substances such as drugs and other agents u.a. Evidence of alteration of the cytoskeleton, the morphological structures and / or the genetic material of the Cell line possible, like the other embodiments demonstrate.
Ausführungsbeispiel 5embodiment 5
Messung des transepithelialen Widerstandes (TEER) der BCEC-1 ZelllinieMeasurement of transepithelial resistance (TEER) of the BCEC-1 cell line
Es ist bekannt das verschiedene Umweltgifte (z.B. Dioxin, PCB) Zellschäden hervorrufen können. Ähnliches gilt für Arzneimittel, die konzentrationsabhängig auch zur Zellschädigung führen können. Mit Zellkulturen wird die Zytotoxizität von Stoffen in unterschiedlichen Konzentrationen der zu untersuchenden Substanzen in vitro getestet und die Konzentration mit dem „zytopathogener" Effekt (Absterben der Zellen) ermittelt. Dieser Effekt tritt am Ende der Kaskade des Zellsterbens auf. Die Zytotoxizität von Stoffen geht oft mit einer Störung der Trächtigkeit einher, auch die Schädigung der epithelialen Barriere allein hat negative Folgen für den Organismus. Diese Schädigung der epithelialen Barriere wird durch Messung des transepithelialen Widerstandes (TEER Messung) bestimmt und dargestellt.It It is known that various environmental toxins (e.g., dioxin, PCB) cause cell damage can. something similar applies to Medicines that can also lead to cell damage depending on the concentration. With cell cultures will the cytotoxicity of substances in different concentrations to be examined Substances tested in vitro and the concentration with the "cytopathogenic" effect (death the cells). This effect occurs at the end of the cascade of Cell dying on. The cytotoxicity of substances is often present a fault the pregnancy along with the damage the epithelial barrier alone has negative consequences for the organism. This injury The epithelial barrier is determined by measuring the transepithelial Resistance (TEER measurement) determined and displayed.
Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit eine Schädigung der epithelialen Barriere und damit verbunden auch der Zellen zu einem wesentlich früheren Zeitpunkt zu beobachten bevor ein zytopathogener Effekt deutlich ist. Andererseits ist es auch möglich, dass eine Schädigung der epithelialen Barriere durch die applizierten Stoffe auftritt ohne zytopathogenen Effekt (die einzelne Zelle bleibt intakt). Diese Differenzierung der Wirkung von Stoffen ist vorzugsweise mit der TEER Messung möglich. Die Messung des transepithelialen Widerstandes (TEER) erfolgt mittels des „Epithelial Voltohmmeters"-EVOMTM (WPI, Berlin) nach den Angaben des Herstellers im Transwell-Insert System.This method offers the possibility to observe a damage of the epithelial barrier and thus of the cells at a much earlier time before a cytopathogenic effect is clear. On the other hand, it is also possible that damage to the epithelial barrier by the applied substances occurs without cytopathogenic effect (the individual cell remains intact). This differentiation of the effect of substances is preferably possible with the TEER measurement. The transepithelial resistance (TEER) is measured by means of the "Epithelial Voltohmmeter" -EVOM ™ (WPI, Berlin) according to the manufacturer's instructions in the Transwell-Insert System.
Das Erreichen der Konfluenz geht mit dem Aufbau einer intakten epithelialen Barriere einher und wird als Kontrollwert des transepithelialen Widerstandes im TEER festgehalten. Die Zugabe von verschiedenen Stoffen und pharmazeutischen Präparaten, aber auch die Zugabe von Krankheitserregern kann den transepithelialen Widerstand verändern. Mit den erfindungsgemäßen Zellen der BCEC-1 Zelllinie, ist diese Schädigung der Barriere durch Noxen (z.B. pharmakologische Produkte, Erreger) erstmals in einem in vitro Assay messbar.The Achieving confluence involves building an intact epithelial Barrier associated with and is considered as a control value of the transepithelial Resistance recorded in the TEER. The addition of different Substances and pharmaceutical preparations, but The addition of pathogens can also affect the transepithelial Change resistance. With the cells according to the invention of the BCEC-1 cell line, this is damage to the barrier by noxae (e.g., pharmacological products, agents) first in vitro Assay measurable.
TEER Messungen zum Aufbau einer intakten epithelialen Barriere zeigen bei Konfluenz einen Widerstand von mindestens 200 ohm/cm2. Werte zwischen 600 und 1600 ohm/cm2 gelten als Indiz für eine intakte Barriere. Ein Absinken der Messwerte bis unter 200 ohm/cm2 nach Zugabe von Noxen ist als schädlich anzusehen.TEER measurements to establish an intact epithelial barrier show a resistance of at least 200 ohm / cm 2 at confluency. Values between 600 and 1600 ohm / cm 2 are an indication of an intact barrier. A decrease in the measured values to below 200 ohm / cm 2 after addition of Noxen is to be regarded as harmful.
Nach Konfluenz und Verifizierung eines TEER von < 200 ohm/cm2 werden den Zellen unterschiedliche Konzentrationen des zu untersuchenden Stoffes zugeführt. In definierten Zeitabständen, die zuvor aus kleinen Vorversuchen ermittelt werden, erfolgt eine TEER Messung. Kommt es zum Abfall des TEER ist die epitheliale Barriere geschädigt. Korrelationen mit den Verhältnissen in vivo mit bekannten Wirkstoffen werden auf neue zu prüfende Stoffe übertragen.After confluence and verification of a TEER of <200 ohm / cm 2 , the cells are given different concentrations of the substance to be investigated. At defined time intervals, which are determined beforehand from small preliminary tests, a TEER measurement is carried out. If the TEER declines, the epithelial barrier is damaged. Correlations with the ratios in vivo with known active substances are transferred to new substances to be tested.
Ausführungsbeispiel 6embodiment 6
Nachweis von Cytoskelett-Strukturen in den Zellen der BCEC-1 ZelllinieDetection of cytoskeletal structures in the cells of the BCEC-1 cell line
Die Zellen der BCEC-1 Zelllinie werden in der Insert-Zellkultur mit immunzytologischen Methoden (Standardverfahren, wie z.B. Immunfluoreszenz, Immunhistologie, In-situ Hybridisierung etc.) charakterisiert, wobei epitheliales Zytokeratin, Zonula-occludens-1 Protein der tight junctions und Vimentin nachgewiesen wird. Nicht exprimiert wird in den Zellen der BCEC-1 Zelllinie smooth muscle Actin, Desmin, Connexin 43 und Connexin 32.The cells of the BCEC-1 cell line are characterized in the insert cell culture by immunocytological methods (standard methods, such as immunofluorescence, immunohistology, in situ hybridization, etc.), whereby epithelial cytokeratin, zonula-occludens-1 protein of tight junctions and vimentin detected becomes. Not expressed in the cell of the BCEC-1 cell line smooth muscle actin, desmin, connexin 43 and connexin 32.
Weiterhin erfolgt mit immunzytologischen Methoden in den Zellen der BCEC-1 Zelllinie der Nachweis von Virusprotein des Bovinen Virus Diarrhöe (BVD) Virus. Mit diesem Nachweis werden Veränderungen der Cytoskelett-Strukturen ausgelöst z.B. durch Zugabe von Noxen, deutlich gemacht.Farther is carried out using immunocytological methods in the cells of BCEC-1 Cell Line Detection of Bovine Virus Diarrhea Virus Protein (BVD) Virus. With this evidence, changes in the cytoskeleton structures triggered e.g. by adding Noxen, made it clear.
Ausführungsbeispiel 7embodiment 7
Nachweis von morphologischen Strukturen in den Zellen der BCEC-1 ZelllinieDetection of morphological structures in the cells of the BCEC-1 cell line
Die morphologischen Strukturen z.B. Tight junctions, Adherens junctions, Gap junctions, Transportvesikel, apikaler Mikrovillisaum, uvm. der Zellen der BCEC-1 Zelllinie werden mit Transmissions-(TEM) und Rasterelektronenmikroskopie (REM) erfasst. Hersteller des Transwell Inserts Systems bieten diverse Arbeitsprotokolle für diese Anwendungen an.The morphological structures e.g. Tight junctions, Adherens junctions, Gap junctions, transport vesicles, apical microvilla space, and much more. of the Cells of the BCEC-1 cell line are analyzed by transmission (TEM) and scanning electron microscopy (REM) recorded. Manufacturers of the Transwell Inserts system offer various Working logs for these applications.
Mit diesem Nachweis werden Veränderungen der morphologischen Strukturen, die z.B. durch die Zugabe von Noxen ausgelöst werden, deutlich gemacht.With this proof will be changes morphological structures, e.g. by the addition of Noxen triggered be made clear.
Ausführungsbeispiel 8embodiment 8th
Nachweis von genetischem Material in den Zellen der BCEC-1 ZelllinieProof of genetic material in the Cells of the BCEC-1 cell line
Die Isolierung von DNA, RNA und Proteinen ist die Grundvoraussetzung für weitere Nachweismethoden (z.B. PCR, Western Blot, Sequenzierungen, etc.) der Zellen der BCEC-1 Zelllinie. Die Isolierung von DNA, RNA und Protein aus den Zellen der BCEC-1 Zelllinie erfolgt nach gängigen Standardprotokollen verschiedener Hersteller von Isolations-Kits. Vorzugsweise wird der peqGOLD TrifastTM (PEQ-LAB Biotechologie GmbH, Erlangen) zur Isolierung von RNA und Protein verwendet. Zum Nachweis von spezifischer Genexpression wird vorzugsweise RT-PCR und zum Nachweis spezifischer Proteine Western Blots mit anschließender Immundetektion verwendet.The isolation of DNA, RNA and proteins is the basic prerequisite for further detection methods (eg PCR, Western Blot, sequencing, etc.) of the cells of the BCEC-1 cell line. The isolation of DNA, RNA and protein from the cells of the BCEC-1 cell line is carried out according to common standard protocols of different manufacturers of isolation kits. The peqGOLD Trifast ™ (PEQ-LAB Biotechologie GmbH, Erlangen, Germany) is preferably used for the isolation of RNA and protein. For the detection of specific gene expression, preferably RT-PCR and for the detection of specific proteins Western Blots with subsequent immunodetection is used.
Mit diesem Nachweis werden Veränderungen der genetischen Information, die z.B. durch die Zugabe von Noxen ausgelöst werden, deutlich gemacht.With this proof will be changes genetic information, e.g. by the addition of Noxen triggered be made clear.
Ausführungsbeispiel 9embodiment 9
In vitro Assay zum Nachweis der Wirksamkeit von Stoffen auf die epitheliale BarriereIn vitro assay to demonstrate efficacy of substances on the epithelial barrier
Die erfindungsgemäßen Zellen der BCEC-1 Zelllinie werden bevorzugt in der Insert-Zellkultur eingesetzt, da diese eine funktionelle epitheliale Barriere in vitro simuliert und einen separaten Zugang zum apikalen (dem Fetus zugewandten Sei te) und zum basalen (der Mutter zugewandten Seite) Kompartiment der Barriere darstellt.The cells of the invention the BCEC-1 cell line are preferably used in the insert cell culture, as this simulates a functional epithelial barrier in vitro and a separate access to the apical (fetus-facing side) and to the basal (the mother facing side) compartment of the Represents barrier.
Dieser Assay macht es erstmals möglich, die Auswirkungen verschiedenster Stoffe (Arzneimittel, Hormone, Umweltgifte, Infektionserreger, u.a.) auf die Barriere in vitro als Routinemesssystem zu erfassen und vergleichende Messungen unter Standardbedingungen durchzuführen. So erfolgt die Messung der Funktionalität der Barriere z.B. mittels TEER, die Messung der Permeabilität d.h. die Durchlässigkeit der Barriere für verschiedene Stoffe z.B. mittels Zugabe eines Stoffes auf einer Seite der Barriere und Konzentrationsmessung der Substanz im gegenüberliegenden Kompartiment. Bei Stoffen, die eine Barrieren-Passage zeigen, wird weiterhin untersucht, über welchen Weg der Stoff auf die andere Seite gelangt, z.B. transzellulär oder interzellulär und welche Rezeptoren, Transportmechanismen dies vermitteln.This Assay makes it possible for the first time the effects of various substances (medicines, hormones, Environmental toxins, infectious agents, etc.) on the barrier in vitro as a routine measuring system and comparative measurements under Standard conditions. Thus, the measurement of the functionality of the barrier occurs e.g. by means of TEER, the measurement of permeability i. the permeability of Barrier for various substances e.g. by adding a substance on one Side of the barrier and concentration measurement of the substance in the opposite Compartment. For fabrics that show a barrier passage is continues to be studied over which way the substance gets to the other side, e.g. transcellular or intercellular and which receptors, Transport mechanisms convey this.
Weiterhin erfolgt die Konzentrationsbestimmung von Stoffwechselprodukten vor und nach Zugabe von Stoffen von denen bekannt ist, dass sie eine Auswirkung auf den Gesamtorganismus haben (z.B. Hormone, Prostaglandine). Des Weiteren werden Invasionsstudien mit invadierenden Zelltypen (z.B. TGC und Tumorzellen) durchgeführt und ihre Wirkung auf die epitheliale Barriere gemessen.Farther the determination of the concentration of metabolites takes place and after addition of substances known to be a Affect the whole organism (e.g., hormones, prostaglandins). Furthermore invasion studies with invading cell types (e.g. TGC and tumor cells) and measured their effect on the epithelial barrier.
Ausführungsbeispiel 10embodiment 10
In vitro Assay zur Diagnose und Therapie von Störungen in den trächtigkeitsrelevanten ProzessenIn vitro assay for diagnosis and therapy of disorders in the pregnancy-relevant processes
Im Vordergrund der Therapie von Störungen in den trächtigkeitsrelevanten oder invasiven Prozessen steht die Erhaltung einer normal verlaufenden Trächtigkeit. Dabei spielt der Prostaglandin-Syntheseweg eine entscheidende Rolle.in the Foreground of the therapy of disorders in the pregnancy relevant or invasive processes is the maintenance of normal gestation. The prostaglandin synthesis pathway plays a crucial role here.
Ein entscheidender Faktor während der Trächtigkeit ist das Hormon Progesteron (= Trächtigkeitserhaltendes Hormon) dessen Anwesenheit in relativ hohen Konzentrationen die Trächtigkeit aufrechterhält. Dieses Hormon wird hauptsächlich im Corpus luteum des Ovars gebildet. Prostaglandine (PG), PGF2α im Besonderen, stimulieren die Luteolyse was die Senkung des Progesteronspiegels nach sich zieht und in der Folge zum Abort führt. (Dieser Regelkreis wird übrigens in der Veterinärmedizin zum Trächtigkeitsabbruch eingesetzt). Es ist bekannt, dass Oxyto cin und Östrogene die PGF2α Synthese in den endometrialen Epithelzellen stimulieren können. In den erfindungsgemäßen Zellen der BCEC-1 Zelllinie ist der Östrogenrezeptor nachweisbar. Experimente dazu haben gezeigt, das Phytoöstrogenhaltige Futtermittel Auswirkungen auf die Fertilität haben, was auf eine Beeinflussung des PGF2α Synthesewegs zurückgeführt wird.A key factor during pregnancy is the hormone progesterone (= pregnancy-sustaining hormone), whose presence at relatively high levels maintains pregnancy. This hormone is mainly produced in the corpus luteum of the ovary. Prostaglandins (PG), PGF2α in particular, stimulate luteolysis, which causes the lowering of progesterone levels and subsequently leads to abortion. (Incidentally, this control loop is used in pregnancy for the purpose of pregnancy termination). It is known that oxytocin and estrogens can stimulate PGF2α synthesis in the endometrial epithelial cells. In the cells according to the invention of the BCEC-1 cell line, the estrogen receptor is detectable. Experiments have shown, the phytoestrogenhalti feeds have an effect on fertility, which is attributed to an influence on the PGF2α synthesis pathway.
Daher ist von besonderem Interesse welche Stoffe (z.B. Arzneimittel, Nahrungsergänzungsmittel) eine Oxytocin bzw. Östrogen-ähnliche Wirkung besitzen und/oder die PGF2α Synthese erhöhen was zu Störungen in den trächtigkeitsrelevanten Prozessen und zum Abort führen kann.Therefore is of particular interest which substances (e.g., drugs, dietary supplements) Oxytocin or estrogen-like Possessing effect and / or increase the PGF2α synthesis what to disturbances in the pregnancy-relevant Processes and miscarriages can.
Neben der Untersuchung von Stoffen die zu Störungen in den trächtigkeitsrelevanten Prozessen und zum Abort führen, wird die Wirkung von Stoffen, die als Blocker oder Antagonisten wirken, und z.B. den östrogenergen Effekt hemmen, untersucht und in ihrer Wirkung auf die Insert-Zellkultur mit Zellen der BCEC-1 Zelllinie gemessen. Zu diesen Blockern und/oder Antagonisten zählen z.B. Östrogenrezeptor-Antagonist (z.B. ICI), Translationsantagonisten (z.B. Actinomycin D), Proteinkinase A Inhibitoren (z.B. Staurosporin) und Phosphorylase C Inhibitoren (z.B. U73122).Next the investigation of substances that cause disturbances in the pregnancy-relevant Lead to processes and miscarriages, The effect of substances acting as blockers or antagonists act, and e.g. the estrogenic gene Inhibit effect, studied and their effect on the insert cell culture measured with cells of the BCEC-1 cell line. To these blockers and / or Counting antagonists e.g. Estrogen receptor antagonist (e.g., ICI), translation antagonists (e.g., actinomycin D), protein kinase A inhibitors (e.g., staurosporine) and phosphorylase C inhibitors (e.g. U73122).
Der in vitro-Assay ist einfach und kostengünstig durchzuführen. Nach Konfluenz der erfindungsgemäßen Zellen der BCEC-1 Zelllinie werden die zu untersuchenden Stoffe (z.B. Arzneimittel etc.) dem basalen Kompartiment in definierten Mengen zugefügt. Nach Inkubationszeit wird das Medium des apikalen und des basalen Kompartiments gewonnen und auf die Anwesenheit von PGF2α hin untersucht. Sofern eine Erhöhung des PGF2α-Wertes im Vergleich zu Kontrollproben nachgewiesen wird, hat der Stoff PGF2α stimulierende Wirkungen, was auf eine negative Wirkung der Trächtigkeit deutet.Of the In vitro assay is easy and inexpensive to perform. To Confluence of the cells of the invention In the BCEC-1 cell line, the substances to be tested (e.g., drugs etc.) are added to the basal compartment in defined amounts. To Incubation time becomes the medium of the apical and the basal compartment and tested for the presence of PGF2α. If one increase of the PGF2α value compared to control samples, the substance has PGF2α stimulatory Effects, indicating a negative effect of pregnancy.
Diese Wirkung wird durch zusätzliche Gabe eines Blockers und/oder Antagonisten z.B. Östrogenrezeptor-Antagonist (z.B. ICI), Translationsantagonisten (z.B. Actinomycin D), Proteinkinase A Inhibitoren (z.B. Staurosporin) und Phosphorylase C Inhibitoren (z.B. U73122) gehemmt, so dass es zu keiner Erhöhung von PGF2α kommt. Die Trächtigkeit wird damit positiv unterstützt.These Effect is by additional Administration of a blocker and / or antagonist e.g. Estrogen receptor antagonist (e.g., ICI), translation antagonists (e.g., actinomycin D), protein kinase A inhibitors (e.g., staurosporine) and phosphorylase C inhibitors (e.g., U73122), so that there is no increase in PGF2α. The pregnancy is thus positively supported.
Der erfindungsgemäße in vitro Assay mit Zellen der BCEC-1 Zelllinie wird zur Diagnose von endokrinologischen Störungen, die einen großen Einfluss auf den Verlauf der Trächtigkeit eingesetzt. Dies sind neben den bereits beschriebenen Östrogen- und Oxytocin-Wirkungen im Besonderen auch Glukokortikoide bzw. alle Substanzen, die den Glukokortikoid-Rezeptor binden. Es ist bekannt, dass der Glukokortikoid-Rezeptor im Karunkelepithel vorkommt. Die Gabe von Glukokortikoiden während der Trächtigkeit führt unter anderem zum Abort. Mit dem erfindungsgemäßen in vitro Assay mit Zellen der BCEC-1 Zelllinie ist es dem Fachmann möglich sämtliche Stoffe, die auf die Steroidsynthese Einfluss haben und entsprechende Antagonisten, auf Ihre Wirkung hinsichtlich trächtigkeitsrelevanter Prozesse zu untersuchen.Of the in vitro according to the invention Assay with cells of the BCEC-1 cell line is used for the diagnosis of endocrinological disorders, the one big Influence on the course of pregnancy used. These are in addition to the already described estrogen and oxytocin effects in particular also glucocorticoids or all Substances that bind the glucocorticoid receptor. It is known, that the glucocorticoid receptor occurs in the carcinoid epithelium. The gift of glucocorticoids during the pregnancy ends other abortion. With the in vitro assay according to the invention with cells the BCEC-1 cell line, it is possible for the expert all substances that are based on the Steroidsynthese have influence and appropriate antagonists, on Their effect in terms of pregnancy-relevant To investigate processes.
Im erfindungsgemäßen in vitro Assay werden auch toxische Substanzen und Medikamente eingesetzt, die die epitheliale Barriere passieren und somit zum Fetus zu gelangen was zu z.B. gestörter Embryonalentwicklung, Missbildungen, Aborten oder Frühgeburten führen kann.in the according to the invention in vitro Assay also uses toxic substances and drugs, which pass through the epithelial barrier and thus reach the fetus what to e.g. impaired embryonic development, Malformations, abortions or premature births to lead can.
Ausführungsbeispiel 11embodiment 11
In vitro Assay zur Diagnose und Therapie von invasiven ProzessenIn vitro assay for diagnosis and therapy of invasive processes
Tumore und Trophoblasten stellen invasive Prozesse dar, die einen Einfluss auf die Trächtigkeit haben. Der in-vitro-Assay mit Zellen der BCEC-1 Zelllinie wird in Verbindung mit Tumorzellen oder Trophoblastriesenzellen als „Confrontation invasion assay" oder „Coculture invasion assay" eingesetzt und die Reaktion der Zellen auf entsprechende Therapeutika gemessen. Invasionsvorgänge können erstmals in vitro hinsichtlich beteiligter Faktoren sowie deren Rezeptoren und Regelkreise untersucht und potentielle Targets für die Tumortherapie gemessen werden.tumors and trophoblasts represent invasive processes that have an impact to have the pregnancy. The in vitro assay with cells of the BCEC-1 cell line is associated with tumor cells or trophoblastic cells as a "confrontation invasion assay "or" coculture invasion assay " and measured the response of the cells to appropriate therapeutics. invasion processes can for the first time in vitro with regard to factors involved and their Receptors and regulatory circuits investigated and potential targets for tumor therapy be measured.
Beispiele für Stoffe, die in diesem in vitro Assay mit Zellen der BCEC-1 Zelllinie eingesetzt werden sind Steroide, Stoffe des Integrinsystems, Stoffe des Insulin-like growth factor Systems und Moleküle der Rho-Familie der GTPasen sowie deren Derivate. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass mit der vorliegenden technischen Lehre auch andere Stoffe ohne weitere erfinderische Tätigkeit untersucht und in ihrer Wirkung auf die Zellen dargestellt werden können.Examples for fabrics, used in this in vitro assay with cells of the BCEC-1 cell line Steroids, substances of the integrin system, substances of insulin-like growth factor Systems and molecules of the Rho family of GTPases and their derivatives. It will be apparent to those skilled in the art that with the present technical teaching also other substances without further inventive activity be examined and presented in their effect on the cells can.
Beispielhaft ist die Wirkung des Wachstumsfaktors aus der Familie der Cytokine, im Besonderen des „Vascular Endothelial Growth Factors" (VEGF) gezeigt.exemplary is the effect of the growth factor from the family of cytokines, in particular of the "Vascular Endothelial Growth Factors "(VEGF).
In der Pathogenese von Tumoren spielen Cytokine, Wachstumsfaktoren im Besonderen, eine bedeutende Rolle. VEGF zum Beispiel ist ein angiogener Faktor welcher eine Rolle in soliden Tumoren, aber auch Tumoren des hämatopoetischen Systems spielt. VEGF ist beteiligt an der Aktivierung, Proliferation und Migration von Tumorzellen. Beim Rind konnte die Expression von VEGF und seinem Rezeptor im Karunkelepithel und den TGC trächtiger Tiere nachgewiesen werden, welches auf eine mögliche Beteiligung von VEGF an TGC Aktivierung, Migration und Invasion hindeutet.In The pathogenesis of tumors play cytokines, growth factors in particular, a significant role. VEGF, for example, is one angiogenic factor which plays a role in solid tumors, as well Tumors of the hematopoietic Systems plays. VEGF is involved in activation, proliferation and migration of tumor cells. In bovine expression of VEGF and its receptor in the carcinoid epithelium and the TGC pregnant Animals are detected, indicating a possible involvement of VEGF suggesting TGC activation, migration and invasion.
Weitere wichtige Cytokine in der Tumorforschung sind z.B. Fibroblast growth factor (FGF), Interleukin-6 (IL-6), Insulin-like Growth Faktor I (IGF-I) und Tumor Necrosis Factor α (TNF-α) und werden ebenfalls im in vitro Assay mit Zellen der BCEC-1 Zelllinie eingesetzt.Other important cytokines in tumor research include fibroblast growth factor (FGF), interleukin-6 (IL-6), insulin-like growth factor I (IGF-I), and tumor necrosis factor α (TNF-α) also used in the in vitro assay with cells of the BCEC-1 cell line.
Der in vitro-Assay zur Diagnose und Therapie von invasiven Prozessen ist einfach und kostengünstig durchzuführen.Of the in vitro assay for the diagnosis and treatment of invasive processes is easy and inexpensive perform.
Ausgangsmaterial ist eine Insert-Zellkultur mit Zellen der BCEC-1 Zelllinie. Diese wird als konfluenter BCEC Monolayer angelegt und nach Standardmethode mit z.B. isolierten primären TGC, Tumorzellen oder Tumorzellspheroiden beimpft. Zunächst wird die Migration, Proliferation und Invasion der Zellen morphologisch untersucht. Weiterhin wird die Expression von Cytokinen z.B. VEGF und deren Rezeptoren gemessen. Durch die Zugabe von Therapeutika z.B. exogenem VEGF, VEGF-Blockern (z. B. neutralisierende Antikörper) oder VEGF-Rezeptor-Blockern (z.B. VEGF-Rezeptor tyrosin kinase Inhibitor PTK787/ZK222584 oder VEGF-Rezeptor pan-Inhibitor GW654652) wird deren Einfluss auf das Verhalten der Zellen untersucht und ihre Wirkung bei Förderung oder Hemmung der Invasion dargestellt.starting material is an insert cell culture with cells of the BCEC-1 cell line. These is designed as a confluent BCEC monolayer and by standard method with e.g. isolated primary Inoculated TGC, tumor cells or tumor cell spheroids. First, the Migration, proliferation and invasion of cells morphologically examined. Furthermore, the expression of cytokines is e.g. VEGF and theirs Measured receptors. By the addition of therapeutics, e.g. exogenous VEGF, VEGF blockers (eg, neutralizing antibodies) or VEGF receptor blockers (e.g., VEGF receptor tyrosine kinase inhibitor PTK787 / ZK222584 or VEGF receptor pan-inhibitor GW654652) will determine its influence on the behavior of the Cells are studied and their effect in promoting or inhibiting invasion shown.
Neue Arzneimittel deren Targets innerhalb z.B. des VEGF-Regelkreises liegen, werden so auf ihre Wirksamkeit hin in vitro überprüft.New Drugs whose targets are within e.g. of the VEGF control loop are checked for their effectiveness in vitro.
Die TEER-Messung dokumentiert dabei alternativ die Auswirkungen der z.B. TGC oder Tumorzellen auf die Funktionalität der epithelialen Barriere.The TEER measurement alternatively documents the effects of e.g. TGC or tumor cells on the functionality of the epithelial barrier.
Ausführungsbeispiel 12embodiment 12
In vitro Assay zur Messung der Zell-Zell InteraktionenIn vitro assay for measuring cell-cell interactions
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird der In vitro Assay mit Zellen der BCEC-1 Zelllinie auch zur Messung der Zell-Zell Interaktion zwischen invadierenden Zellen und BCEC-Zellen aber auch zur Messung der Interaktion von BCEC-Zellen untereinander verwendet. Dieses ist im Rahmen der Entwicklung einer Prophylaxe bzw. Therapie der Nachgeburtsverhaltung von Bedeutung, da zur regulären Ablösung der fetalen Kotyledonen erstens Reifungsvorgänge des Karunkelepithels und zweitens die Auflösung von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakten gehören. Die in vivo Reifung der Karunkelepithelzellen kann durch Applikation hormonell aktiver Substanzen, von Wachstumsfaktoren und deren Hemmern sowie Anti-Integrinen experimentell beeinflusst werden.In Another aspect of the present invention is the in vitro Assay with cells of BCEC-1 cell line also for measurement of cell-cell Interaction between invading cells and BCEC cells as well used to measure the interaction of BCEC cells with each other. This is in the context of the development of a prophylaxis or therapy the Nachgeburtsverhaltung of importance, since the regular replacement of the fetal cotyledons, first, maturation processes of the carpal epithelium and second, the resolution cell-cell and cell-matrix contacts belong. The in vivo maturation of the carious epithelial cells can be hormonally by application active substances, growth factors and their inhibitors as well as Anti-integrins are experimentally influenced.
Ausführungsbeispiel 13embodiment 13
In vitro Assay zur Passage von Stoffen von der mütterlichen epithelialen Barriere auf das fetale ChorionepithelIn vitro assay for the passage of substances from the maternal epithelial barrier to fetal choriocarcinoma
Die epitheliale Barriere hat ähnlich wie die Blut-Hirn Schranke in vivo eine wichtige Funktion, sie schützt den Fetus vor toxischen Substanzen und Infektionserregern aus dem mütterlichen Organismus. Es ist bekannt, dass Arzneimittel, Hormone, Umweltgifte und an andere Stoffe die Trächtigkeit beeinträchtigen können.The epithelial barrier is similar as the blood-brain barrier in vivo has an important function, it protects the Fetus from toxic substances and infectious agents from the maternal Organism. It is known that medicines, hormones, environmental toxins and to other substances the gestation impair can.
Es gibt Arzneimittel, die während der Trächtigkeit nicht eingesetzt werden können, da sie ein Risiko für den Fetus darstellen (z.B. Abort, Missbildungen, Frühgeburt). Bei der Zulassung von Medikamenten wird diese potentielle Eigenschaft stets untersucht. Die Ursachen sind mannigfaltig, eine davon ist das Gelangen der pharmakologischen Substanz in den fetalen Kreislauf. Dies ist nur über die Passage der mütterlichen epithelialen Barriere und des fetalen Chorionepithels möglich. Die Passage kann passiv über Diffusionsprozesse, aber auch aktiv über zelleigene Transportmechanismen erfolgen. Die erfindungsgemäße BCEC-Zelllinie in der Insert-Zellkultur wird als in vitro-Assay verwendet, um die Wirkung dieser Substanzen auf den Fetus abzuschätzen. Dazu gehört, dass im Assay bestimmt wird, ob eine Substanz den Fetus erreichen kann oder nicht. Dies reduziert die Zahl der in vivo Tierversuche erheblich. Ist keine Passage möglich, kann angenommen werden, dass der Fetus wahrscheinlich geschützt ist.It gives medicines during the pregnancy can not be used because they are at risk fetus (e.g., abortion, malformations, premature birth). When drug approval becomes this potential property always examined. The causes are manifold, one of them is the achievement of the pharmacological substance in the fetal circulation. This is just over the passage of the maternal epithelial barrier and fetal chorionic epithelium possible. The Passage can be passive over Diffusion processes, but also actively via cell-own transport mechanisms respectively. The BCEC cell line according to the invention in the insert cell culture is used as an in vitro assay to the Estimate the effect of these substances on the fetus. This includes that the assay determines whether a substance can reach the fetus or not. This significantly reduces the number of in vivo animal experiments. is no passage possible It can be assumed that the fetus is probably protected.
Der in vitro-Assay zur Passage von Stoffen von der mütterlichen epithelialen Barriere auf das fetale Chorionepithel ist einfach und kostengünstig durchzuführen.Of the in vitro assay for passage of substances from the maternal epithelial barrier on the fetal chorionic epithelium is easy and inexpensive to perform.
Ausgangsmaterial ist eine Insert-Zellkultur mit Zellen der BCEC-1 Zelllinie. Diese wird nach Konfluenz und Bestätigung der Funktionalität der epithelialen Barriere (z.B. mittels TEER) definierten Mengen der zu untersuchenden Substanz z.B. ins basale Kompartiment ausgesetzt. Nach definierten Zeitpunkten werden Proben aus dem apikalen Kompartiment gewonnen und auf die Menge an der zu untersuchenden Substanz hin überprüft. Diverse Methoden der Substanzdetektion und -konzentrationsbestimmung sind dem Fachmann bekannt.starting material is an insert cell culture with cells of the BCEC-1 cell line. These will after confluence and confirmation the functionality the epithelial barrier (e.g., by TEER) the substance to be examined, e.g. exposed to the basal compartment. At defined times samples are taken from the apical compartment and checked for the amount of substance to be examined. Various Methods of substance detection and concentration determination are known to the skilled person.
Ausführungsbeispiel 14embodiment 14
In-vitro-Assay zur Ermittlung der diaplazentaren Übertragung von KrankheitserregernIn vitro assay to determine diaplacental transmission of pathogens
Es gibt zahlreiche Erreger, die diaplazentar Krankheiten übertragen. Dies sind z.B. intrauterine, den Fetus infizierende Erreger, die Schäden während der Trächtigkeit (z.B. Abort, Missbildungen, Frühgeburt) verursachen können.It There are numerous pathogens that transmit diaplazentar diseases. These are e.g. intrauterine, the fetus infecting pathogens, the damage during the pregnancy (e.g., abortion, malformations, premature birth) can cause.
Auch diese Erreger z.B. das bovine Virus Diarrhoe Virus (BVD-Virus) aber auch bakterielle Erreger wie z.B. Brucella abortus, Bacillus licheniformis sowie Parasiten wie z.B. Neospora caninum müssen die plazentare Barriere passieren um zum Fetus zu gelangen.These pathogens such as the bovine virus diarrhea virus (BVD virus) but also bacterial pathogens such as Brucella abortus, Bacillus licheniformis and parasites such as Neospora caninum need Pass the placental barrier to reach the fetus.
Da die erfindungsgemäßen Zellen der BCEC-Zelllinie frei von BVD-Virus sind, ist eine experimentelle Infektion leicht möglich. Die ist von besonderer Bedeutung, da es bisher keine geeignete Zelllinie für diese Anwendung gibt. Die einzige bekannte endometriale Zelllinie aus nicht-trächtigen Kühen (BEND) ist BVD-Virus positiv.There the cells of the invention the BCEC cell line are free from BVD virus is an experimental Infection easily possible. This is of particular importance, as it has not been a suitable cell line for this Application gives. The only known endometrial cell line out non-pregnant Cows (BEND) BVD virus is positive.
Am Beispiel des BVD-Virus wird eine konkrete Anwendung beschrieben.At the Example of the BVD virus is described a concrete application.
Der in vitro-Assay zur Ermittlung der diaplazentaren Übertragung von Krankheitserregern ist einfach und kostengünstig durchzuführen.Of the in vitro assay to determine diaplacental transmission of pathogens is easy and inexpensive to perform.
Nach Konfluenz und Bestätigung der Funktionalität der epithelialen Barriere (z.B. mittels TEER) werden definierte Mengen an BVD-Virus z.B. dem basalen Kompartiment zugefügt. Nach definierten Zeitpunkten werden Proben aus dem apikalen Kompartiment gewonnen und nach Standardmethoden der Virustiter bestimmt.To Confluence and confirmation the functionality of the epithelial barrier (e.g., by means of TEER) are defined Levels of BVD virus e.g. added to the basal compartment. To Defined times become samples from the apical compartment and determined by standard methods of virus titers.
Es werden zusätzlich Stoffe, die die Virusreplikation stören oder hemmen hinzugefügt und deren Einfluss auf den Virustiter gemessen.It be additional Substances that interfere with or inhibit virus replication are added and their influence measured on the virus titer.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft die Ausgestaltung der genannten in-virto-Assays, einen Kit beispielsweise als Kit zur Diagnose und Therapie von Störungen in den trächtigkeitsrelevanten oder invasiven Prozessen, der mindestens Zellen der erfindungsgemäßen BCEC-1 Zelllinie umfasst.A embodiment The invention relates to the design of said in-vitro assays, a Kit, for example, as a kit for the diagnosis and treatment of disorders in the pregnancy relevant or invasive processes, the at least cells of the BCEC-1 invention Cell line comprises.
Auf Grund der Lehre der vorliegenden Erfindung sowie auf Grund des allgemeinen Fachwissens in diesem technischen Gebiet ist dem Hersteller der erfindungsgemäßen Kits bekannt, wie er die einzelnen Komponenten des Kits, z.B. die Puffer steril herstellt, formuliert und lagert.On Reason of the teaching of the present invention as well as on the basis of the general Expertise in this technical field is the manufacturer of the kits according to the invention It is known to know the individual components of the kit, e.g. the buffers produced sterile, formulated and stored.
Der Kit enthält, falls es für die Kundenfreundlichkeit gewünscht wird, auch weitere Materialien zur Durchführung, wie. z.B. Medium und Kontrollproben.Of the Kit contains, if it is for the customer-friendliness desired will also carry out other materials, such as. e.g. Medium and Control samples.
Claims (24)
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Applications Claiming Priority (1)
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DE200610036652 DE102006036652A1 (en) | 2006-08-03 | 2006-08-03 | Invention relating to cell line from carcass epithelial cells of pregnant cattle and their use |
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Family Applications (1)
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DE200610036652 Withdrawn DE102006036652A1 (en) | 2006-08-03 | 2006-08-03 | Invention relating to cell line from carcass epithelial cells of pregnant cattle and their use |
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2006
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2007
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Non-Patent Citations (4)
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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