DE102006035580A1 - Determination of the biological activity of heparin in AT III-containing preparations - Google Patents

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist eine Methode zur quantitativen Bestimmung der Aktivität eines Reaktionsbeschleunigers, z. B. Heparin in einem Testsystem, bei der sich die zu testende Substanz in einer Matrix befindet, die bereits spontan reagierende Reaktionskomponenten enthält. Bei solchen Reaktionskomponenten kann es sich um Proteine oder Peptide, z. B. AT III, handeln, die durch spezifische Reaktionsbeschleuniger weitere im Testsystem befindliche Faktoren derart beeinflussen, dass sie zu einer Veränderung der Messergebnisse führen.The invention relates to a method for the quantitative determination of the activity of a reaction accelerator, for. As heparin in a test system in which the substance to be tested is in a matrix containing already spontaneously reacting reaction components. Such reaction components may be proteins or peptides, e.g. As AT III act, the influence of specific reaction accelerators further factors in the test system such that they lead to a change in the measurement results.

Description

Gegenstand der Erfindung ist eine Methode zur quantitativen Bestimmung der Aktivität eines Reaktionsbeschleunigers, z.B. Heparin in einem Testsystem, bei der sich die zu testende Substanz in einer Matrix befindet, die bereits spontan reagierende Reaktionskomponenten enthält. Bei solchen Reaktionskomponenten kann es sich um Proteine oder Peptide, z.B. AT III, handeln, die durch spezifische Reaktionsbeschleuniger weitere im Testsystem befindliche Faktoren derart beeinflussen, dass sie zu einer Veränderung der Messergebnisse führen.object The invention is a method for the quantitative determination of activity a reaction accelerator, e.g. Heparin in a test system, where the substance to be tested is in a matrix, contains the already spontaneously reacting reaction components. at such reaction components may be proteins or peptides, e.g. AT III, act by specific reaction accelerators influence other factors in the test system in such a way, that they change lead the measurement results.

Es ist üblich, Heparin über eine Reaktion mit AT III und Faktor Xa zu bestimmen. Heparin beschleunigt die durch AT III hervorgerufene Hemmung der Gerinnungsfaktoren Xa und Thrombin.It is common, Heparin over to determine a reaction with AT III and factor Xa. Heparin speeds up the AT III induced inhibition of coagulation factors Xa and Thrombin.

In der konventionellen Methode zur quantitativen Bestimmung der Heparinaktivität wird die Probelösung mit geringen Mengen an AT III und anschließend mit einem Überschuss an Faktor Xa oder Faktor IIa inkubiert. Die verbliebenen Menge an Faktor Xa bzw. Faktor IIa spaltet ein spezifisches chromogenes Substrat und der resultierende Farbstoff wird in einem kinetischen Test photometrisch vermessen. Das Ergebnis ist indirekt proportional zu dem Gehalt an Heparin in der Probe.In The conventional method for the quantitative determination of heparin activity is the sample solution with small amounts of AT III and then with an excess incubated on factor Xa or factor IIa. The remaining amount Factor Xa or Factor IIa cleaves a specific chromogenic substrate and the resulting dye becomes photometric in a kinetic assay measured. The result is indirectly proportional to the salary to heparin in the sample.

Es werden bereits kommerzielle Testkits für eine derartige Bestimmung von Heparin angeboten, die gebrauchsfertige Zubereitungen an Reagenzien enthalten, die durch den Tester ggf. nur noch rekonstituiert werden brauchen. Solche Testkits sind vom Hersteller hauptsächlich für die Bestimmung von Heparin im Human-Plasma entwickelt worden, wozu sie auch weltweit in entsprechenden Testlabors routinemäßig eingesetzt werden. Ein solcher Test ist sinnvoll und notwendig, um bei Patienten einerseits den Blutspiegel an Heparin zu testen und um auch die Heparin-Dosis in der Therapie bestimmter Krankheitsbilder einzustellen. Die Durchführung der Testungen erfolgt in den hierfür speziell entwickelten Geräten, womit durch die Automatisierung ein rascher und reproduzierbarer Durchsatz an Testproben erreicht wird. Eine Ausführungsform eines solchen Assays ist z.B. in dem US Patent Nr. 4,672,030 beschrieben.There are already commercial test kits available for such a determination of heparin containing ready-to-use preparations of reagents that may need to be reconstituted by the tester only. Such test kits have been developed by the manufacturer mainly for the determination of heparin in human plasma, for which they are routinely used in relevant test laboratories worldwide. Such a test is useful and necessary to test in patients on the one hand the blood level of heparin and to adjust the heparin dose in the therapy of certain clinical pictures. The tests are carried out in the specially developed devices, whereby the automation achieves a rapid and reproducible throughput of test samples. An embodiment of such an assay is in the U.S. Patent No. 4,672,030 described.

Zur therapeutischen Verwendung werden AT III Präparationen eingesetzt, die z.B. durch biochemische Prozessierung aus dem Human-Plasma gewonnen werden. Ihre Anwendbarkeit erstreckt sich von der Therapie verschiedener Krankheiten, wie z.B. bei Patienten mit angeborenem AT III-Mangel, über deren Einsatz als Reagenzien wie in den für die quantitative Heparin-Bestimmung produzierten Testkits. AT III Präparationen können ebenso auf dem Fachmann an sich bekannten gentechnischen Wegen hergestellt werden.to For therapeutic use, AT III preparations are used which e.g. obtained by biochemical processing from human plasma become. Their applicability extends from the therapy of various Diseases such as in patients with congenital AT III deficiency whose Use as reagents as in the for quantitative heparin determination produced test kits. AT III preparations can as well produced by genetic engineering known in the art become.

Derartige AT III Präparationen können je nach Herstellungsweg eine geringe Menge an Heparin, gegenüber einem deutlichen Überschuss an AT III enthalten. Erfahrungsgemäß enthalten diese Präparate Heparin, in einer Konzentration von höchstens 0,5 IE/mL, meistens höchstens 0,2 IE/mL. Demgegenüber stehen AT III Konzentrationen von mindestens 10 IU/ml, regelmäßig etwa 20 bis 100 IU/ml. Daraus folgt, dass sich in der Reaktionslösung eine viel zu hohe Menge an AT III befindet, da die Konzentration an AT III im Präparat um ein Vielfaches höher ist gegenüber derjenigen in der Reagenzlösung.such AT III preparations can depending on the preparation, a small amount of heparin, compared to one significant surplus included in AT III. Experience has shown that these preparations contain heparin, in a concentration of at most 0.5 IU / mL, usually at most 0.2 IU / mL. In contrast, AT III concentrations of at least 10 IU / ml, regularly about 20 to 100 IU / ml. It follows that in the reaction solution much too high amount of AT III is located, as the concentration of AT III in the preparation many times higher is opposite that in the reagent solution.

Jedes in der Testprobe enthaltene AT III führt im Test zu einer verstärkten Hemmung von Faktor Xa bzw. Faktor IIa, und damit zu falsch hohen Messergebnissen. Sofern ist es nicht möglich, eine Eichkurve mit einem Heparin-Standard mit deklarierter Aktivität und den Reagenzien aus dem Testkit zu erstellen und diese zur Berechnung der Heparin-Aktivität einer AT III-haltigen Testprobe zu verwenden. Eine Hemmung von AT III in der zu testenden Lösung erweist sich als äusserst schwierig und daher nicht praktikabel, da im Testsystem ja ein AT III-haltiges Reagenz zugesetzt wird, welches von der Hemmung ausgeschlossen sein muss.each AT III contained in the test sample leads to increased inhibition in the test of factor Xa or factor IIa, and thus to false high measurement results. If it is not possible a calibration curve with a heparin standard with declared activity and the Reagents from the test kit to create and this for calculation the heparin activity to use an AT III-containing test sample. An inhibition of AT III in the solution to be tested proves to be extreme difficult and therefore impractical, since in the test system yes an AT III-containing reagent is added, which excluded from the inhibition have to be.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand also darin, eine Methode zu finden mit Hilfe derer es möglich ist zuverlässig, quantitativ geringe Mengen Heparin in Gegenwart eines großen, nicht unbedingt konstanten Überschusses an AT III zu bestimmen.The The object underlying the present invention was therefore to find a way to make it possible reliable, quantitatively small amounts of heparin in the presence of a large, not necessarily constant surplus at AT III.

Im folgenden Testverfahren wird der Reaktionsbeschleuniger zuerst im gesamten Testsystem vermessen. Dann wird er spezifisch gehemmt und nochmals vermessen. Die resultierende Differenz aus beiden Messungen entspricht der Aktivität des Reaktionsbeschleunigers. Sein genauer Wert wird an einer mit der gleichen Matrix erstellten Eichkurve, der definierte Mengen an Standard (Reaktionsbeschleuniger) zugesetzt wurden, berechnet.in the following test procedure, the reaction accelerator is first used in measure the entire test system. Then he is specifically inhibited and measure again. The resulting difference from both measurements corresponds to the activity of the reaction accelerator. Its exact value is attached to a calibration curve, the defined quantities were added to standard (reaction accelerator).

Die Methode ist insbesondere für die Ermittlung von aktiven Komponenten in Präparaten geeignet, deren weitere Inhaltsstoffe das Ergebnis im entsprechenden Testsystem nachhaltig beeinflussen können.The Method is especially for the determination of active components in preparations suitable, whose further Ingredients sustain the result in the appropriate test system can influence.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht daher eine quantitative Bestimmung der biologischen Aktivität von Heparin in AT III-haltigen Präparaten. Vorteilhafterweise kann dabei auf kommerzielle Heparin-Testkits zurückgegriffen werden, wobei das in den herkömmlichen Testkits enthaltene AT III-Reagenz nicht verwendet wird. Es können auch einzeln angebotene oder selbst hergestellte Faktor Xa- bzw. Thrombin-Reagenzien sowie chromogene Substrate sein.The present invention enables therefore a quantitative determination of the biological activity of heparin in AT III-containing preparations. Advantageously, it can be applied to commercial heparin test kits resorted be that in the conventional Test kit contained AT III reagent is not used. It can too individually offered or self-made factor Xa or thrombin reagents and be chromogenic substrates.

Die erfindungsgemäße Methode bestimmt Heparin in AT III-haltigen Lösungen indirekt über einen Verbrauch an Faktor Xa. Die verbleibende Faxtor Xa Aktivität wird über die Spaltung eines Chromophors detektiert wird.The inventive method determines heparin in AT III-containing solutions indirectly via a Consumption of factor Xa. The remaining Faxtor Xa activity will be over the Cleavage of a chromophore is detected.

Erfindungsgemäß wird für die Erstellung der Eichkurve die AT III-haltige Testprobe (die AT III Präparation) eingesetzt. Es wird eine Verdünnungsreihe mit dieser Matrix vorbereitet, der Heparin-Standard in verschiedenen Konzentrationen (in einem Testpuffer) zugesetzt wird.According to the invention for the creation the calibration curve the AT III-containing test sample (the AT III preparation) used. It will be a dilution series prepared with this matrix, the heparin standard in different Concentrations (in a test buffer) is added.

Eine Referenzprobe erhält Testpuffer (ohne Heparin).A Reference sample receives Test buffer (without heparin).

Für jeden Testlauf wird für die Eichkurve, die Referenzprobe und die Testprobe das gleiche Volumen an Testprobe bzw. Testpuffer zugesetzt. Das Volumenverhältnis der Vermischung von Probenmatrix und Standard ist variabel, soll aber in einem Testlauf stets konstant sein. Das Verdünnungsverhältnis kann z.B. 1:4, vorzugsweise 1:2 betragen. Zu beachten ist, dass die Lösungen für die Messung der Eichkurve und die Testlösung die gleiche Matrix und somit die gleiche AT III-Konzentration enthalten.For each Test run is for the calibration curve, the reference sample and the test sample are the same volume Test sample or test buffer added. The volume ratio of Mixing of sample matrix and standard is variable, but should always be constant in a test run. The dilution ratio may be e.g. 1: 4, preferably 1: 2 amount. It should be noted that the solutions for the measurement of the calibration curve and the test solution the same matrix and thus contain the same AT III concentration.

Der Messbereich liegt vorzugsweise zwischen 0 und 2 IE/mL Heparin-Aktivität, besonders bevorzugterweise zwischen 0,01 und 1,00 IE/mL Heparin-Aktivität, am besten zwischen 0,05 und 0,30 IE/mL Heparin-Aktivität.Of the Measuring range is preferably between 0 and 2 IU / mL heparin activity, especially preferably between 0.01 and 1.00 IU / mL heparin activity, preferably between 0.05 and 0.30 IU / mL heparin activity.

In der Testprobe wird die Heparin-Aktivtät durch Zusatz eines Inhibitors. Dies erfolgt über eine organische Polykation-Verbindung wie z.B. Polybren, welches mit dem Heparin-Molekül einen 1:1-Komplex bildet und somit dessen Aktivität unterbindet.In The test sample becomes heparin activity by adding an inhibitor. This is done via an organic polycation compound such as e.g. Polybren, which with the heparin molecule forms a 1: 1 complex and thus inhibits its activity.

Möglich, allerdings weniger vorteilhaft, ist auch der Einsatz Heparin-spezifischer Enzyme, z.B. Heparinase I. Die Testprobe, aus der dann die Heparin-Aktivität gemessen wird, wird mit dem Testpuffer vermischt, dem bereits der Hemmstoff zugesetzt worden war. Das Verdünnungsverhältnis ist analog dem Verfahren bei der Vorbereitung der Proben für die Eichkurve, so dass hier auch mit der gleichen Matrix gearbeitet wird.Possible, though less advantageous is the use of heparin-specific enzymes, e.g. Heparinase I. The test sample, from which then measured the heparin activity is mixed with the test buffer, which is already the inhibitor had been added. The dilution ratio is analogous to the procedure for preparing the samples for the calibration curve, so that you work with the same matrix.

Die Proben (Eichkurve, Referenzprobe, Testprobe) werden in einem hierfür geeigneten Gerät vermessen. Gut eignet sich der Behring Coagulation Timer (BCT, Dade Behring, Marburg, Deutschland). Es können auch vergleichbare Geräte und diverse Photometer eingesetzt werden, sofern sie für die Quantifizierung des im Test eingesetzten Chromophors geeignet sind. Nach der Messung der Proben werden die Rohdaten (Messsignale) ermittelt.The Samples (calibration curve, reference sample, test sample) are in a suitable for this Measure the device. The Behring Coagulation Timer (BCT, Dade Behring, Marburg, Germany). It can too comparable devices and various photometers are used, provided they are for quantification of the chromophore used in the test are suitable. After the measurement The raw data (measuring signals) are determined for the samples.

Die Werte der Messsignale der einzelnen für die Bildung der Eichkurve erstellten Lösungen, die unterschiedliche Mengen an zugesetztem Heparin enthalten, werden vom Messwert der Referenzprobe abgezogen. Die resultierenden Werte entsprechen der Aktivität an zugesetztem Heparin und werden in Abhängigkeit von der Heparin-Konzentration zum Messsignal (Differenz vom Referenzwert) in einem Diagramm aufgetragen.The Values of the measuring signals of the individual for the formation of the calibration curve created solutions, containing varying amounts of added heparin deducted from the measured value of the reference sample. The resulting values correspond to the activity of added heparin and depending on the heparin concentration to Measuring signal (difference from the reference value) plotted in a diagram.

Ebenso wird der Wert von der mit dem Hemmstoff versetzten Testprobe vom Referenzwert abgezogen. Die Differenz dieser Messwerte (Testprobe minus Referenzwert) entspricht dem Signal für die in der Testlösung enthaltene Heparin-Aktivität, die, unter Berücksichtigung der Verdünnung mit der Hemmstofflösung, an der Eichkurve ausgewertet wird.As well the value of the test sample added with the inhibitor from Reference value deducted. The difference between these measurements (test sample minus reference value) corresponds to the signal for those contained in the test solution Heparin activity, which, considering the dilution with the inhibitor solution, is evaluated on the calibration curve.

Beispielexample

Die Aktivität von Heparin wird in einem AT III-haltigen Präparat bestimmt, z.B. in Kybernin® HS. Kybernin® HS enthält ca. 50 IE/mL AT III.The activity of heparin is determined in an AT III-containing preparation, eg in Kybernin ® HS. Cybernin ® HS contains approx. 50 IU / mL AT III.

Zur Erstellung der Eichkurve werden 0,5 mL Kybernin HS mit 0,5 mL Heparin-Standard in variabler Konzentration vermischt.to Preparation of the calibration curve is 0.5 mL cybernine HS with 0.5 mL heparin standard in variable concentration mixed.

Die Referenzprobe (ungehemmt) enthält eine 1:2-Mischung aus Kybernin HS und dem Testpuffer.The Reference sample (uninhibited) contains a 1: 2 mixture of cybernine HS and the assay buffer.

Die Testprobe (Kybernin HS; gehemmt) wird 1:2 mit einer Polybren-haltigen Lösung verdünnt. Die Messung der Proben für die Eichkurve sowie der Referenz- und Testprobe erfolgt an einem Behring Coagulation Timer (BCT, Dade Behring, Marburg, Deutschland).The Test sample (cybernine HS; inhibited) becomes 1: 2 with a polybrene-containing solution diluted. The measurement of the samples for the calibration curve and the reference and test sample are taken at one Behring Coagulation Timer (BCT, Dade Behring, Marburg, Germany).

Das Messsignal der Referenzprobe beträgt 646 mE/min (Referenzwert). Heparin [IE/mL] Messsignal [mE/min] (gemessen) Messsignal [mE/min] (nach Abzug vom Referenzwert) 0,05 607 38 0,07 590 56 0,10 570 75 0,20 498 147 0,30 438 208 The measurement signal of the reference sample is 646 mE / min (reference value). Heparin [IU / mL] Measuring signal [mE / min] (measured) Measuring signal [mE / min] (after subtraction from the reference value) 0.05 607 38 0.07 590 56 0.10 570 75 0.20 498 147 0.30 438 208

Die Messsignale der Testproben (mit Hemmstoff) werden vom Messsignal der Referenzprobe abgezogen und jeweils an der Eichkurve ausgewertet. Bei der Berechnung der Heparin-Aktivität in der Testprobe muss noch die 1:2-Verdünnung mit der Polybrenlösung mit berücksichtigt werden. Probe Nr. Messsignal [mE/min] Heparin in der Testprobe [IE/mL] 1 48 0,118 2 59 0,152 3 50 0,126 4 75 0,199 The measured signals of the test samples (with inhibitor) are subtracted from the measurement signal of the reference sample and evaluated on the calibration curve. When calculating the heparin activity in the test sample, the 1: 2 dilution with the polybrene solution must be taken into account. Sample No. Measuring signal [mE / min] Heparin in the test sample [IE / mL] 1 48 0.118 2 59 0,152 3 50 0.126 4 75 0,199

Claims (4)

Quantitativer Test zur spezifischen Bestimmung der biologischen Aktivität von Heparin in AT III-haltigen Matrices, dadurch gekennzeichnet, dass AT III in einem großen Überschuss vorliegt und eine Eichkurve zur Auswertung verwendet wird.Quantitative test for the specific determination of the biological activity of heparin in AT III-containing matrices, characterized in that AT III is in a large excess and a calibration curve is used for the evaluation. Test gemäß Anspruch 1, wobei die Eichkurve unter Verwendung der gleichen AT III-haltigen Matrix wie die Testprobe erstellt wird.Test according to claim 1, wherein the calibration curve using the same AT III-containing Matrix as the test sample is created. Test gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Heparinaktivität in der Testprobe durch den Einsatz eines Heparin-Hemmstoffs gehemmt wird.Test according to at least one of the claims 1 to 2, wherein the heparin activity in the test sample by the Use of a heparin inhibitor is inhibited. Test gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei neben der Eichkurve mindestens eine ungehemmte Referenzprobe und mindestens eine gehemmte Testprobe gemessen wird.Test according to at least one of the claims 1 to 3, wherein in addition to the calibration curve at least one uninhibited reference sample and at least one inhibited test sample is measured.
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