DE102006033306A1 - Tirf microscope - Google Patents

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Abstract

Mikroskop zur TIRF-Mikroskopie mit einer Mehrfarben-Lichtquelle zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe mit einem Beleuchtungsstrahl, mit einer Wellenlängenselektionseinrichtung zur variablen Auswahl einer Hauptwellenlänge des Beleuchtungsstrahls und mit einer Ablenkeinrichtung zur variablen Beeinflussung des Beleuchtungsstrahls, wobei die Ablenkeinrichtung zur Veränderung des Einfallswinkels des Beleuchtungsstrahlengangs zur Probe vorgesehen ist.Microscope for TIRF microscopy with a multicolor light source for evanescent illumination of a sample with an illumination beam, with a wavelength selection device for variable selection of a main wavelength of the illumination beam and with a deflection device for variably influencing the illumination beam, wherein the deflection device for changing the angle of incidence of the illumination beam path to the sample is provided.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop und ein Verfahren zur Total-Internen-Reflexions(TIRF)-Mikroskopie mit einer Mehrfarbenlichtquelle, bei dem der TIRF-Einfallswinkel verändert wird.The The invention relates to a microscope and a method for total internal reflection (TIRF) microscopy with a multicolor light source where the TIRF angle of incidence changed becomes.

Eine bekannte Vorrichtung verwendet für jede unterschiedliche Wellenlänge eine eigene optische Achse.A known device used for each different wavelength a separate optical axis.

Nachteilig ist dem bekannten Stand der Technik, dass alle Einstellungen an allen Achsen einzeln getroffen werden müssen.adversely is the prior art that all settings All axes must be taken individually.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, den Stand der Technik weiter zu entwickeln. Es kann dabei wünschenswert sein, Sequenzen gleicher Eindringtiefe bei unterschiedlicher Wellenlänge des Anregungslichts, aber gleicher Eindringtiefe aufzunehmen.Of the The invention is therefore based on the object, the prior art to develop further. It may be desirable to have sequences same depth of penetration at different wavelengths of Excitation light, but absorb the same depth of penetration.

Diese Aufgabe wird durch das in Anspruch 1 bestimmte Mikroskop sowie durch die in den Ansprüchen 9 bis 12 bestimmten Verfahren gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den weiteren Unteransprüchen angegeben.These The object is achieved by the microscope defined in claim 1 and by those in the claims 9 to 12 solved certain procedures. Advantageous embodiments The invention are specified in the further subclaims.

Die Erfindung geht dabei von der Erkenntnis aus, dass sowohl die Veränderung der Wellenlänge als auch die Veränderung des Einfallswinkels die Eindringtiefe des evanescenten Feldes verändert.The Invention is based on the knowledge that both the change the wavelength as also the change of the angle of incidence changes the penetration depth of the evanescent field.

Erfindungsgemäß ist die oben genannte Aufgabe bei einem Mikroskop zur TIRF-Mikroskopie mit einer Mehrfarben-Lichtquelle zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe mit einem Beleuchtungsstrahl, mit einer Wellenlängenselektionseinrichtung zur variablen Auswahl einer Hauptwellenlänge des Beleuchtungsstrahls und mit einer Ablenkeinrichtung zur variablen Beeinflussung des Beleuchtungsstrahls dadurch gelöst, dass die Ablenkeinrichtung zur Veränderung des Einfallswinkels des Beleuchtungsstrahlengangs zur Probe vorgesehen ist.According to the invention above object in a microscope for TIRF microscopy with a Multi-color light source for evanescent illumination of a sample with an illumination beam, with a wavelength selection device for variable selection of a main wavelength of the illumination beam and with a deflection device for variably influencing the Lighting beam solved by that the deflection device for changing the angle of incidence of the illumination beam path to the sample is provided.

Die Mehrfarbenlichtquelle kann aus einer Anzahl von Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlänge, etwa unterschiedlicher Laser, UV, VIS (z.B. 405nm, 488nm, 532nm, 561nm, 635nm) oder IR oder aus Lasern mit unterschiedlichern Laserlinien bestehen. Ebenso können die Lichtquellen Leuchtdioden, Glühlampen (HG-Dampf, Metallhydrid) oder OPOs sein. Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlänge können üblicherweise über wellenselektive Elemente zu einem Strahl vereinigt werden. Daneben kann die Mehrfarbenlichtquelle auch aus einer Laser-Weißlichtquelle, etwa aus einer monochromatischen Lichtquelle wie einem Laser, und mit einer photonischen Faser gebildet sein.The Multicolor light source may be different from a number of light sources Wavelength, about different lasers, UV, VIS (e.g., 405nm, 488nm, 532nm, 561nm, 635nm) or IR or lasers with different laser lines consist. Likewise the light sources light emitting diodes, incandescent lamps (HG vapor, metal hydride) or OPOs. Light sources of different wavelengths can usually via wave-selective Elements are combined to a beam. In addition, the multi-color light source also from a laser white light source, from a monochromatic light source such as a laser, and be formed with a photonic fiber.

Die Wellenselektionseinrichtung können schaltbare Schutter (akustooptisch, mechanisch, elektrooptisch) vor den einzelnen Lichtquellen oder schaltbare Filter (Filterrad, akustooptische Elemente wie AOM oder AOTF) im vereinigten Strahl sein. Auch die Verwendung von akustooptischen Elementen zur gleichzeitigen Vereinigung und Auswahl ist denkbar.The Shaft selection device can switchable Schutter (acousto-optic, mechanical, electro-optical) in front of the individual Light sources or switchable filters (filter wheel, acousto-optic elements such as AOM or AOTF) in the unified beam. Also the use of acousto-optic elements for simultaneous union and selection is conceivable.

Die Ablenkeinrichtung kann durch einen Scanner (z.B. Kippspiegel) gebildet sein, der den selektierten Lichtstrahl vor oder nach der Wellenlängenselektionseinrichtung derart ablenkt, dass der Lichtstrahl unter verschiedenen Winkeln auf die Probe einfällt. Ebenso kann die Ablenkeinrichtung ein sein.The Deflector may be formed by a scanner (e.g., tilting mirror) be that the selected light beam before or after the wavelength selection device so distracts that the light beam at different angles to the sample. Likewise, the deflection can be a.

Der Beleuchtungsstrahlengang kann durch das Mikroskopobjektiv hindurch oder seitlich vom Linsensystem des Mikroskopobjektivs innerhalb oder außerhalb des Gehäuses des Mikroskopobjektivs geführt sein.Of the Illumination beam can pass through the microscope objective or laterally from the lens system of the microscope objective within or outside of the housing guided the microscope objective be.

Das Mikroskop zur TIRF-Mikroskopie kann zur wahlweisen oder gleichzeitigen Verwendung als epi-Fluoreszens-, Hell- oder Dunkellicht- oder zur konfokalen Scanning Mikroskopie ausgestaltet sein.The Microscope for TIRF microscopy may be optional or simultaneous Use as epi-fluorescence, light or dark-light or confocal Scanning microscopy be designed.

Vorzugsweise ist vorgesehen, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Wellenselektionseinrichtung und die Ablenkeinrichtung in gegenseitiger Abhängigkeit steuert.Preferably it is provided that the microscope comprises a control unit, the the shaft selector and the deflector in mutual dependence controls.

Zweckmäßigerweise ist vorgesehen, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert.Conveniently, it is provided that the microscope comprises a control unit, the the deflection in dependence from the main wavelength controls.

Mit besonderem Vorteil ist vorgesehen, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert zur konstanten Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in der Probe.With particular advantage is provided that the microscope is a control unit includes, which controls the deflection device in dependence on the main wavelength to the constant penetration depth of the evanescent field in the sample.

Vorteilhafterweise ist vorgesehen, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert zur Aufnahme eines Bildes mit konstanter Eindringtiefe von mindestens einem Teil der Probe.advantageously, it is provided that the microscope comprises a control unit, the the deflection in dependence from the main wavelength Controls to capture a constant depth image of at least part of the sample.

Nach einer Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert zur Aufnahme meherer Bilder von mindestens einem Teil der Probe mit unterschiedlicher, jeweils konstanter Eindringtiefe.To a development of the invention is provided that the microscope a control unit that controls the deflection device in dependence on the main wavelength controls to capture multiple images of at least a portion of the Sample with different, each constant depth of penetration.

Nach einer weiteren Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge automatisch steuert zur Aufnahme meherer Bilder mit unterschiedlicher, jeweils konstanter Eindringtiefe.According to a further development of the invention it is provided that the microscope comprises a control unit, the deflection in Ab Automatically adjusts the frequency of the main wavelength to capture several images with different, respectively constant penetration depths.

Nach einer weiteren Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass das Mikroskop nur eine einzige optische Achse für den Beleuchtungsstrahlengang aufweist.To A further development of the invention provides that the microscope only a single optical axis for the illumination beam path having.

Erfindungsgemäß ist des weiteren die ursprünglich genannte Aufgabe bei einem Verfahren zur TIRF-Mikroskopie mit den folgenden Verfahrensschritten gelöst:

  • – Auswahl einer ersten Beleuchtungswellenlänge
  • – Auswahl einer bestimmten Eindringtiefe des evaneszenten Feldes
  • – Automatisches Anpassen des Einfallswinkels des Beleuchtungslichtes in Abhängigkeit von der ersten Beleuchtungswellenlänge und der bestimmten Eindringtiefe
  • – Aufnehmen eines ersten Bildes von mindestens einem Ausschnitt einer Probe in der bestimmten Eindringtiefe mit der ersten Beleuchtungswellenlänge und dem automatisch angepassten Einfallswinkel
Furthermore, according to the invention, the initially stated object is achieved in a method for TIRF microscopy with the following method steps:
  • - Selection of a first illumination wavelength
  • - Selection of a specific penetration depth of the evanescent field
  • - Automatically adjusting the angle of incidence of the illumination light as a function of the first illumination wavelength and the determined penetration depth
  • - Taking a first image of at least a portion of a sample in the determined penetration depth with the first illumination wavelength and the automatically adjusted angle of incidence

Erfindungsgemäß ist des weiteren die ursprünglich genannte Aufgabe bei einem weiteren Verfahren zur TIRF-Mikroskopie mit den folgenden Verfahrensschritten gelöst:

  • – Auswahl einer ersten Beleuchtungswellenlänge
  • – Auswahl einer bestimmten Eindringtiefe des evaneszenten Feldes
  • – Automatisches Anpassen des Einfallswinkels des Beleuchtungslichtes in Abhängigkeit von der ersten Beleuchtungswellenlänge und der bestimmten Eindringtiefe
  • – Aufnehmen eines ersten Bildes von mindestens einem Ausschnitt einer Probe in der bestimmten Eindringtiefe mit der ersten Beleuchtungswellenlänge und dem automatisch angepassten Einfallswinkel
  • – Auswahl einer zweiten Beleuchtungswellenlänge
  • – Automatisches Anpassen des Einfallswinkels des Beleuchtungslichtes in Abhängigkeit von der zweiten Beleuchtungswellenlänge und der bestimmten Eindringtiefe
  • – Aufnehmen eines zweiten Bildes von mindestens einem Ausschnitt der Probe in der bestimmten Eindringtiefe mit der ersten Beleuchtungswellenlänge und dem automatisch angepassten Einfallswinkel
Furthermore, according to the invention, the initially stated object is achieved in a further method for TIRF microscopy with the following method steps:
  • - Selection of a first illumination wavelength
  • - Selection of a specific penetration depth of the evanescent field
  • - Automatically adjusting the angle of incidence of the illumination light as a function of the first illumination wavelength and the determined penetration depth
  • - Taking a first image of at least a portion of a sample in the determined penetration depth with the first illumination wavelength and the automatically adjusted angle of incidence
  • - Selection of a second illumination wavelength
  • - Automatically adjusting the angle of incidence of the illumination light as a function of the second illumination wavelength and the determined penetration depth
  • - Taking a second image of at least a portion of the sample in the determined penetration depth with the first illumination wavelength and the automatically adjusted angle of incidence

Erfindungsgemäß ist des weiteren die ursprünglich genannte Aufgabe bei einem weiteren Verfahren zur TIRF-Mikroskopie mit den folgenden Verfahrensschritten gelöst:

  • – Festlegen einer Beleuchtungswellenlänge
  • – Festlegen mehrerer Eindringtiefen des evaneszenten Feldes
  • – Automatisches Berechnen der zugeordneten Einfallswinkel des Beleuchtungslichtes für die verschiedenen Eindringtiefen in Abhängigkeit von der Beleuchtungswellenlänge und der Eindringtiefe
  • – Aufnehmen mehrerer Bilder von mindestens einem Ausschnitt einer Probe für die verschiedenen Eindringtiefen.
Furthermore, according to the invention, the initially stated object is achieved in a further method for TIRF microscopy with the following method steps:
  • - Set a lighting wavelength
  • - Setting several penetration depths of the evanescent field
  • Automatic calculation of the assigned angles of incidence of the illumination light for the different penetration depths as a function of the illumination wavelength and the penetration depth
  • - taking several pictures of at least one section of a sample for the different penetration depths.

Erfindungsgemäß ist des weiteren die ursprünglich genannte Aufgabe bei einem weiteren Verfahren zur TIRF-Mikroskopie mit den folgenden Verfahrensschritten gelöst:

  • – Festlegen mehrerer Beleuchtungswellenlängen
  • – Festlegen mehrerer Eindringtiefen des evaneszenten Feldes
  • – Automatisches Berechnen der zugeordneten Einfallswinkel des Beleuchtungslichtes für bestimmte Kombinationen aus Beleuchtungswellenlänge und Eindringtiefe in Abhängigkeit von der Beleuchtungswellenlänge und der Eindringtiefe
  • – Aufnehmen mehrerer Bilder von mindestens einem Ausschnitt einer Probe für die bestimmten Kombinationen aus Beleuchtungswellenlänge und Eindringtiefe.
Furthermore, according to the invention, the initially stated object is achieved in a further method for TIRF microscopy with the following method steps:
  • - Setting several illumination wavelengths
  • - Setting several penetration depths of the evanescent field
  • - Automatically calculating the associated incident angle of the illumination light for certain combinations of illumination wavelength and penetration depth depending on the illumination wavelength and the penetration depth
  • Taking a plurality of images of at least a portion of a sample for the particular combination of illumination wavelength and penetration depth.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand schematischer Darstellungen zu einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. Gleiche Bezugszeichen in den einzelnen Figuren beizeichnen dabei gleiche Elemente. Es zeigtin the The invention will be described below with reference to schematic illustrations to an embodiment explained in more detail. Same Reference numerals in the individual figures indicate the same elements. It shows

1 das erfindungsgemäße Mikroskop. 1 the microscope according to the invention.

Die 1 zeigt ein TIRF-Mikroskop. Vier Laser 1 senden Licht unterschiedlicher Wellenlängen (405nm, 488nm, 561nm, 635nm) an die Wellenlängenselektionseinrichtung 2. Diese ist hier mit Blenden für die einzelnen Laser derart ausgeführt, dass wahlweise die Wellenlänge eines Lasers in den Beleuchtungsstrahlengang freigegeben wird. Der Beleuchtungsstrahl wird über einen dichroitischen Spiegel in den Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt und über einen Scanner 5 und das Mikroskopobjektiv 6 im Einfallswinkel 7 über das Glasplättchen 8 auf die Probe 9 eingestrahlt. Der Einfallswinkel ist dabei stets so gewählt, dass Totalreflexion stattfindet. Das in einer bestimmten Eindringtiefe in die Probe eindringende evanszente Feld regt Teile der Probe zur Fluoreszenz an. Das Fluoreszenzlicht wird im Detektionsstrahlengang 10 durch das Objektiv 6, zurück über den Scanner 5 und durch den dichroitischen Spiegel 3 auf den Detektor 11 geführt. Der Detektor ist über eine Verbindung 23 mit einem Computer 13 verbunden. Der Computer 13 enthält eine Speichereinheit und eine Recheneinheit und empfängt das Signal des Detektors 11 und berechnet daraus eine bildhaft darstellbare Darstellung des Detektorsignals. Eine Steuereinheit 12 ist mit einer Verbindung 20 mit dem Scanner, mit einer Verbindung 21 mit der Wellenlängenselektionseinrichtung 2 und mit einer Verbindung 22 mit dem Computer 13 verbunden. Die Steuereinheit 12 steuert oder regelt dabei die Tätigkeit des Scanners 5 und der Wellenlängen selektionseinrichtung 2 nach Maßgabe des Computers 13. Die Steuereinheit 12 kann auch durch den Computer 13 ausgebildet sein. Die Darstellung des Detektorsignals im Computer 13 wird von diesem zur Darstellung auf dem Monitor 14 aufbereitet und auf dem Monitor 14 bildhaft dargestellt. Daneben speichert der Computer 13 die Darstellung zur späteren Darstellung auf dem Monitor 14 oder zur weiteren Verrechnung mit anderen Darstellungen. Dabei werden dreidimensionale und mehrfarbige Darstellungen der Probe 9 gespeichert und auf dem Monitor 14 dargestellt.The 1 shows a TIRF microscope. Four lasers 1 send light of different wavelengths (405nm, 488nm, 561nm, 635nm) to the wavelength selector 2 , This is designed here with apertures for the individual lasers such that either the wavelength of a laser is released into the illumination beam path. The illumination beam is coupled into the illumination beam path via a dichroic mirror and via a scanner 5 and the microscope objective 6 at the angle of incidence 7 over the glass plate 8th to the test 9 irradiated. The angle of incidence is always chosen so that total reflection takes place. The evanscent field entering the sample at a certain depth of penetration excites parts of the sample to fluoresce. The fluorescent light is in the detection beam path 10 through the lens 6 , back over the scanner 5 and through the dichroic mirror 3 on the detector 11 guided. The detector is connected 23 with a computer 13 connected. The computer 13 contains a memory unit and a computing unit and receives the signal of the detector 11 and calculates therefrom a pictorially representable representation of the detector signal. A control unit 12 is with a connection 20 With the scanner, with a connection 21 with the wavelength selection device 2 and with a connection 22 with the computer 13 connected. The control unit 12 controls or regulates the activity of the scanner 5 and the wavelength selector 2 according to the computer 13 , The control unit 12 can also through the computer 13 be educated. The representation of the detector signal in the computer 13 from this to the representation on the monitor 14 prepared and on the monitor 14 depicted pictorially. Next to it the computer saves 13 the presentation for later presentation on the monitor 14 or for further offsetting with other representations. This will be three-dimensional and multi-colored representations of the sample 9 saved and on the monitor 14 shown.

Dabei werden die beanspruchten Verfahren durchgeführt. Um die Eindringtiefe zu vergrößern, wird der Einfallswinkel 7 des Beleuchtungslichtstrahls 4 durch den Scanner 5 verkleinert. Dies geschieht etwa dadurch, dass der Beleuchtungsstahl 4 näher zum Zentrum des Objektivs 6 hin in dieses eingestrahlt wird.The claimed methods are carried out. To increase the penetration depth, the angle of incidence becomes 7 of the illumination light beam 4 through the scanner 5 reduced. This happens approximately by the fact that the lighting steel 4 closer to the center of the lens 6 is radiated into this.

Dies wird durchgeführt, um bei einem Wechsel zu einer höheren Wellenlänge durch die Wellenlängenselektionseinrichtung 2 die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes konstant zu halten, da sich bei einer Erhöhung der Wellenlänge die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes vergrößert. Auf diese Weise gelingt es, mit mehreren Wellenlängen die Probe bei einer konstanten Eindringtiefe anzuregen und so Bilder der Probe von unterschiedlichen Fluorophoren in der gleichen Ebene zu erhalten.This is done to switch to a higher wavelength through the wavelength selection means 2 To keep the penetration depth of the evanescent field constant, as the penetration depth of the evanescent field increases as the wavelength increases. In this way it is possible to excite the sample at several wavelengths at a constant penetration depth and thus to obtain images of the sample from different fluorophores in the same plane.

Die Erfindung kann sowohl mit Fluoreszenzanregung der Probe 9 als auch ohne Fluoreszenzanregung der Probe 9 betrieben werden.The invention can be used both with fluorescence excitation of the sample 9 as well as without fluorescence excitation of the sample 9 operate.

Die 1 zeigt lediglich den TIRF-Strahlengang. Selbstverständlich kann das Mikroskop auch noch weitere Strahlengänge, etwa zur normalen epi-Fluoreszenz oder zur konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, umfassen.The 1 only shows the TIRF beam path. Of course, the microscope may also include other beam paths, such as normal epi-fluorescence or confocal laser scanning microscopy.

Ein Vorteil der Erfindung ist, dass die Verfahren automatisiert und damit zeit- und kostensparend ausgeführt werden können. Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass die Anordnung bei einem Wechsel der Wellenlängen nicht erst neu justiert werden muss. Die Erfindung erlaubt die automatische Aufnahme von Bildsequenzen unterschiedlicher Farben und Eindringtiefen (Stacking).One Advantage of the invention is that the process is automated and so that time and running cost-saving can be. Another advantage of the invention is that the arrangement in a Change of wavelengths does not have to be readjusted. The invention allows the automatic Capture image sequences of different colors and indentation depths (Stacking).

11
Laserlaser
22
WellenlängenselektionseinrichtungWavelength selection means
33
Dichroitischer Spiegeldichroic mirror
44
BeleuchtungsstrahlengangIllumination beam path
55
Scannerscanner
66
Objektivlens
77
Einfallswinkelangle of incidence
88th
Glasplättchenglass flakes
99
Probesample
1010
DetektionsstrahlengangDetection beam path
1111
Detektordetector
1212
Steuereinheitcontrol unit
1313
Computercomputer
1414
Monitormonitor
2020
Verbindung Steuereinheit zu Scannerconnection Control unit to scanner
2121
Verbindung Steuereinheit zu Wellenlängenselektionseinrichtungconnection Control unit for wavelength selection device
2222
Verbindung Steuereinheit zu Computerconnection Control unit to computer
2323
Verbindung von Detektor zu Computerconnection from detector to computer
2424
Verbindung von Computer zu Monitorconnection from computer to monitor

Claims (12)

Mikroskop zur TIRF-Mikroskopie mit einer Mehrfarben-Lichtquelle zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe mit einem Beleuchtungsstrahl, mit einer Wellenlängenselektionseinrichtung zur variablen Auswahl einer Hauptwellenlänge des Beleuchtungsstrahls und mit einer Ablenkeinrichtung zur variablen Beeinflussung des Beleuchtungsstrahls, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinrichtung zur Veränderung des Einfallswinkels des Beleuchtungsstrahlengangs zur Probe vorgesehen ist.Microscope for TIRF microscopy with a multicolor light source for evanescent illumination of a sample with an illumination beam, with a wavelength selection device for variable selection of a main wavelength of the illumination beam and with a deflection device for variably influencing the illumination beam, characterized in that the deflection device for changing the angle of incidence of the Illumination beam path to the sample is provided. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Wellenselektionseinrichtung und die Ablenkeinrichtung in gegenseitiger Abhängigkeit steuert.Microscope according to claim 1, characterized in that in that the microscope comprises a control unit which controls the shaft selection device and controls the deflector in mutual dependence. Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert.Microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the microscope comprises a control unit which the deflection in dependence from the main wavelength controls. Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert zur konstanten Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in der Probe.Microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the microscope comprises a control unit which the deflection in dependence from the main wavelength controls the constant penetration depth of the evanescent field in the sample. Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert zur Aufnahme eines Bildes mit konstanter Eindringtiefe von mindestens einem Teil der Probe.Microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the microscope comprises a control unit which controls the deflection device in dependence on the main wavelength for taking a picture with a constant Penetration depth of at least part of the sample. Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert zur Aufnahme meherer Bilder von mindestens einem Teil der Probe mit unterschiedlicher, jeweils konstanter Eindringtiefe.Microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the microscope comprises a control unit which the deflection in dependence from the main wavelength controls to capture multiple images of at least a portion of the Sample with different, each constant depth of penetration. Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge automatisch steuert zur Aufnahme meherer Bilder mit unterschiedlicher, jeweils konstanter Eindringtiefe.Microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the microscope comprises a control unit which the deflection in dependence from the main wavelength automatically controls multiple images with different, each constant depth of penetration. Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop nur eine einzige optische Achse für den Beleuchtungsstrahlengang aufweist.Microscope according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the microscope only a single optical axis for the Has illumination beam path. Verfahren zur TIRF-Mikroskopie mit den folgenden Verfahrensschritten: – Auswahl einer ersten Beleuchtungswellenlänge – Auswahl einer bestimmten Eindringtiefe des evaneszenten Feldes – Automatisches Anpassen des Einfallswinkels des Beleuchtungslichtes in Abhängigkeit von der ersten Beleuchtungswellenlänge und der bestimmten Eindringtiefe – Aufnehmen eines ersten Bildes von mindestens einem Ausschnitt einer Probe in der bestimmten Eindringtiefe mit der ersten Beleuchtungswellenlänge und dem automatisch angepassten EinfallswinkelMethod of TIRF microscopy with the following Steps: - Selection a first illumination wavelength - Selection a certain penetration depth of the evanescent field - automatic Adjusting the angle of incidence of the illumination light in dependence from the first illumination wavelength and the determined penetration depth - Take up a first image of at least a portion of a sample in the determined penetration depth with the first illumination wavelength and the automatically adjusted angle of incidence Verfahren zur TIRF-Mikroskopie mit den folgenden Verfahrensschritten: – Auswahl einer ersten Beleuchtungswellenlänge – Auswahl einer bestimmten Eindringtiefe des evaneszenten Feldes – Automatisches Anpassen des Einfallswinkels des Beleuchtungslichtes in Abhängigkeit von der ersten Beleuchtungswellenlänge und der bestimmten Eindringtiefe – Aufnehmen eines ersten Bildes von mindestens einem Ausschnitt einer Probe in der bestimmten Eindringtiefe mit der ersten Beleuchtungswellenlänge und dem automatisch angepassten Einfallswinkel – Auswahl einer zweiten Beleuchtungswellenlänge – Automatisches Anpassen des Einfallswinkels des Beleuchtungslichtes in Abhängigkeit von der zweiten Beleuchtungswellenlänge und der bestimmten Eindringtiefe – Aufnehmen eines zweiten Bildes von mindestens einem Ausschnitt der Probe in der bestimmten Eindringtiefe mit der ersten Beleuchtungswellenlänge und dem automatisch angepassten EinfallswinkelMethod of TIRF microscopy with the following Steps: - Selection a first illumination wavelength - Selection a certain penetration depth of the evanescent field - Automatic Adjusting the angle of incidence of the illumination light in dependence from the first illumination wavelength and the determined penetration depth - Take up a first image of at least a portion of a sample in the determined penetration depth with the first illumination wavelength and the automatically adjusted angle of incidence - Selection of a second illumination wavelength - Automatic Adjusting the angle of incidence of the illumination light in dependence from the second illumination wavelength and the determined penetration depth - Take up a second image of at least a portion of the sample in the determined penetration depth with the first illumination wavelength and the automatically adjusted angle of incidence Verfahren zur TIRF-Mikroskopie mit den folgenden Verfahrensschritten: – Festlegen einer Beleuchtungswellenlänge – Festlegen mehrerer Eindringtiefen des evaneszenten Feldes – Automatisches Berechnen der zugeordneten Einfallswinkel des Beleuchtungslichtes für die verschiedenen Eindringtiefen in Abhängigkeit von der Beleuchtungswellenlänge und der Eindringtiefe – Aufnehmen mehrerer Bilder von mindestens einem Ausschnitt einer Probe für die verschiedenen Eindringtiefen.Method of TIRF microscopy with the following Steps: - Establish an illumination wavelength - Establish several penetration depths of the evanescent field - Automatic Calculating the associated angles of incidence of the illumination light for the different penetration depths depending on the illumination wavelength and the penetration depth - Take up multiple images of at least a portion of a sample for the different ones Penetration depths. Verfahren zur TIRF-Mikroskopie mit den folgenden Verfahrensschritten: – Festlegen mehrerer Beleuchtungswellenlängen – Festlegen mehrerer Eindringtiefen des evaneszenten Feldes – Automatisches Berechnen der zugeordneten Einfallswinkel des Beleuchtungslichtes für bestimmte Kombinationen aus Beleuchtungswellenlänge und Eindringtiefe in Abhängigkeit von der Beleuchtungswellenlänge und der Eindringtiefe – Aufnehmen mehrerer Bilder von mindestens einem Ausschnitt einer Probe für die bestimmten Kombinationen aus Beleuchtungswellenlänge und Eindringtiefe.Method of TIRF microscopy with the following Steps: - Establish several illumination wavelengths - Establish several penetration depths of the evanescent field - Automatic Calculating the associated angles of incidence of the illumination light for certain combinations from illumination wavelength and penetration depth depending from the illumination wavelength and the penetration depth - Take up multiple images of at least a portion of a sample for the particular one Combinations of illumination wavelength and penetration depth.
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