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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und/oder
Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen (MSC) aus einer biologischen
Probe und die Verwendung eines Fängermoleküls zur Isolierung
und/oder Identifizierung von MSC aus einer biologischen Probe.
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Stammzellen
sind undifferenzierte Zellen, welche die Fähigkeit besitzen, sich selbst
zu erneuern und in unterschiedliche Effektorzellen zu differenzieren.
Aufgrund dieser Eigenschaften gehören sie zu den vielversprechendsten
Forschungsobjekten der biomedizinischen Forschung und nähren die Hoffnung,
in Zukunft im Rahmen der sogenannten Stammzelltherapie Gewebe bzw.
ganze Organe regenerieren zu können.
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Je
nach Herkunft werden embryonale Stammzellen und adulte Stammzellen
voneinander unterschieden.
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Embryonale
Stammzellen werden aus der inneren Zellmasse des Blastocysten-Stadiums
eines Säugetier-
oder eines menschlichen Embryos gewonnen. Sie können sich unbegrenzt teilen
und sich theoretisch zu jedem Zelltyp der ca. 200 Gewebearten des
Menschen entwickeln. Bei der Gewinnung embryonaler Stammzellen aus
dem Blastocysten im Rahmen der Stammzellforschung kommt es häufig zu
ethischen Konflikten, da der Tod des Embryos in Kauf genommen werden
muss.
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Hierzu
im Gegensatz ist die Forschung an adulten Stammzellen ethisch völlig unbedenklich,
da diese aus adulten Organismen gewonnen werden können. Adulte
Stammzellen wurden bisher in mindestens 20 Geweben des Menschen
entdeckt. Ihre Aufgabe ist es, für
die entsprechenden Gewebe Ersatzzellen zu bilden. Im Vergleich zu
embryonalen Stammzellen galten sie bisher als begrenzt teilungs- und
entwicklungsfähig:
Es wurde angenommen, dass adulte Stammzellen eines bestimmten Gewebes
keine Zelltypen eines anderen Gewebes bilden können. In letzter Zeit häufen sich
jedoch die Erkenntnisse, dass auch adulte Stammzellen über ein wesentlich
höheres
Entwicklungspotential verfügen, als
bisher angenommen. So wird mittlerweile in Fachkreisen weitgehend
die Auffassung vertreten, dass auch adulte Stammzellen verschiedenste
Differenzierungswege einschlagen können.
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Zu
den adulten Stammzellen zählen
auch die sogenannten mesenchymalen Stammzellen (MSC). MSC finden
sich in einer Vielzahl von Geweben und Organen, wie der Leber, der
Niere, der Placenta, im Fettgewebe, im Nabelschnurblut, sowie im
Knochenmark. MSC stellen aufgrund ihres mesenchymalen Differenzierungspotentials
und ihrer guten In-vitro-Expansionseigenschaften eine attraktive
Zellpopulation für
den Ersatz mesenchymaler Gewebe im Rahmen des sog. Tissue-Engineerings
dar. MSC lassen sich in vitro in Knorpel, Knochen, Sehnen und Fettzellen
differenzieren. Dreidimensional auf unterschiedlichen Trägersubstanzen
kultiviert wurden MSC bereits in vielen Studien im Klein- und Großtiermodell
erfolgreich zum Ersatz mesenchymaler Gewebe eingesetzt. Auch eine
klinische Anwendung von MSC am Menschen wurde bereits in Pilotstudien erfolgreich
erprobt.
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Die
Isolation humaner MSC aus einer biologischen Probe basiert bis heute
auf dem Selektionsfaktor der Kunststoffadhärenz und auf charakteristischen
Medienbedingungen; vgl. Pittenger et al. (1999), Multilineage potential
of adult human mesenchymal stem cells, Science 284, Seiten 143–147, Reyes
(2001), Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow
mesodermal progenitor cells, Blood 98, Seiten 2615–2625.
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Die
zur Isolation von MSC aus einer biologischen Probe bislang im Stand
der Technik verwendeten Protokolle, die gegenüber denen, die derzeit zur Isolation
von hämatopoetischen
Stammzellen verwendet werden, wesentliche Unterschiede aufweisen,
führen
nachteiligerweise zu unterschiedlichen MSC-Populationen. Folglich
zeigen derart gewonnene MSC-Zellen unterschiedliche Charakteristika,
z.B. bezüglich
ihrer Proliferation und Matrixsynthese und sind deshalb für das Tissue-Engineering
nur wenig geeignet; vgl. Niemeyer et al. (2003), Vergleich zweier
Isolationsverfahren zur Gewinnung humaner mesenchymaler Stammzellen
aus Knochenmark, Z. Orthop. 141, Seite 129.
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Protokolle
zur Isolierung und Identifizierung von MSC, die vorstehend genannte
Nachteile nicht aufweisen, fehlen insbesondere deshalb, da bis heute
zuverlässige
MSC-Marker fehlen. So wurde vor einigen Jahren STRO-1 als vielversprechendes
Oberflächenantigen
zur Identifizierung der MSC diskutiert, inzwischen jedoch wurde
seine Bedeutung wieder relativiert; vgl. Dennis et al., The STRO-1+
marrow cell population is multipotential, Cells Tissues Organs 170,
Seite 7–82.
Auch das kürzlich
als MSC-Marker beschriebene Antigen W8B2 von unbekannter Identität zeigt
eine heterogene Expression auf MSC-Populationen; vgl. Vogel et al.
(2003) Heterogenity among human bone marrowderived mesenchymal stem cells
and neuroprogenitor cells, Haematologica 88, Seiten 126–133.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es deshalb ein zuverlässiges Verfahren
zur Isolierung und Identifizierung von MSC bereitzustellen, bei
dem die vorstehenden Nachteile aus dem Stand der Technik behoben
werden. Insbesondere soll ein solches Verfahren bereitgestellt werden,
bei dem die Identifizierung und Isolierung über einen natürlichen
und spezifischen MSC-Marker
erfolgt.
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Diese
Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Isolierung und/oder Identifizierung
von MSC aus einer biologischen Probe gelöst, das folgende Schritte aufweist,
nämlich:
(a) Bereitstellen einer biologischen Probe, (b) Inkubation eines
für einen
MSC-Marker spezifischen
Fängermoleküls mit der
biologischen Probe, um einen Fängermolekül-MSC-Komplex
zu bilden, (c) Isolierung und/oder Identifizierung eines Fängermolekül-MSC-Komplexes,
wobei es sich bei dem MSC-Marker um den Wnt-Rezeptor Frizzled-9 (FZD-9)
handelt.
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Die
der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird hiermit vollkommen
gelöst.
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Wie
die Erfinder überraschend
feststellen konnten, exprimieren MSC den Wnt-Rezeptor FZD-9. Diese
Erkenntnisse wurden durch Arbeiten an MSC mit unreifem Phänotyp gewonnen,
die aus Knochenmark sowie aus nicht-amniotischer Placenta gewonnen
wurden. Ferner stellten die Erfinder fest, dass sich dieser neue
MSC-Marker nicht
nur zur Identifizierung von MSC sondern auch zur Isolierung von
MSC aus einer biologischen Probe eignet. Dabei erfolgt die Isolierung über die
Wechselwirkung eines FZD-9-spezifischen
Fängermoleküls mit den
von den MSC exprimierten FZD-9-Rezeptoren, wobei die MSC dann im
Komplex mit den Fängermolekülen von der
biologischen abgetrennt werden.
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Die
Eignung von FZD-9 zur Isolierung und/oder Identifizierung von MSC
war deshalb so überraschend,
da Frizzled-Proteine allgemein im Stand der Technik bislang in anderem
Zusammenhang beschrieben werden.
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Die
Proteine der Frizzled (FZD) Familie gehören zu einer Gruppe von Rezeptoren,
die sieben Transmembranabschnitte aufweisen. Die FZD-Proteine werden
durch sogenannte Wnt-Faktoren aktiviert, die eine Familie von extrazellulär-sektretierten
Signalmolekülen
bilden. Die N-terminale extrazelluläre cysteinreiche Domäne von FZD
wurde dabei als Wnt-Bindedomäne
identifiziert.
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Wnt/FZD-Proteine
spielen eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung von Metazoen.
Sie regulieren verschiedenste Entwicklungsprozesse, wie die Spezifizierung,
Proliferation, Migration und Polarität der Zelle. Gepaart mit den „low-density
lipoprotein like"-Rezeptoren
5 und 6 vermitteln FZD-Proteine zumindest drei Wnt/FZD-Signalwege.
In einen dieser Signalwege ist das Protein β-Catenin involviert. Dieser
sog. β-Catenin-Signalweg induziert
die Regulation der Transkription verschiedener Zielgene, einschließlich c-Myc,
Cyclin D1, Matrix-Metalloproteinase-7
(MMP-7), Immunglobulintranskriptionsfaktor 2 (ITF-2). Der die planare
Zellpolarität
regulierende Signalweg wird durch Wnt-Bindung via GTPase und Aktivierung
der c-Junaminoterminalen Kinase (JNK) induziert, was zur Steuerung
der morphogenetischen Zellbewegung führt. Der Ca2+-Signalweg
aktiviert die Phospholipase Cβ und
erhöht
den intrazellulären Ca2+-Spiegel,
was in der Aktivierung der Proteinkinase C, der Ca2+-calmodulinabhängigen Proteinkinase II
und von Calcineurin resultiert, wodurch das zelluläre Schicksal
und der Adhäsionsprozess
beeinflusst wird. Eine Übersicht über die
Wnt/FZD-Signalwege findet
sich in Huang und Klein (2004), The Frizzled family: receptors for
multiple signal transduction pathways, Genome Biol. 5, Seiten 234–241.
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Das
humane FZD-9-Gen, ursprünglich
als FZD-3 bezeichnet, liegt in der genetisch definierten 1,4 Mb-Region
auf dem Chromosom 7g11.23. Das humane FZD-9-Protein besteht aus
591 Aminosäuren.
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Kürzlich veröffentlichte
Experimente, in denen Mäuse
mit einer FZD-9-Knock-Out-Mutation hergestellt wurden, deuten auf
eine Rolle von FZD-9 im blutbildenden System hin; vgl. Ranheim et al.
(2005), Frizzled 9 knock-out mice have abnormal B-cell development,
Blood 105, Seiten 2487–2494.
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Wang
et al. (1997) beschreiben in "A
novel human homologue of the Drosophila frizzled wnt receptor gene
binds wingless protein and is in the Williams syndrome deletion
at 7g11.23", Hum.
Mol. Genet. 6, Seiten 465–472,
hingegen, dass FZD-9 in einer Vielzahl von verschiedensten humanen
Geweben exprimiert wird, wie beispielsweise im Gehirn, aber auch
im Skelettmuskel, in den Nieren, den Augen und den Hoden.
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Ferner
beschreiben Zhao und Pleasure (2004), Frizzled-9 promoter drives
expression of transgenes in the medial wall of the cortex and its chief
derivative the hippocampus, Genesis 40, Seiten 32–39, die
weit über
das Gehirn verbreitete Expression von FZD-9, bspw. in der medialen
Wand des Cortex, dem Telencephalon, dem Hippocampus und weiteren
Bereichen des Mausgehirns.
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In
der nicht-veröffentlichten
deutschen Patentanmeldung
DE
10 204 059 620 werden Daten präsentiert, nach denen FZD-9
in verschiedensten unterschiedlichen Zelltypen exprimiert wird,
wie bspw. in Leukämiezellen,
Retinoblastomzellen oder embryonalen Karzinomzellen.
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In
der weiteren nicht veröffentlichten
Patentanmeldung
DE 2005 023
740 werden Experimente beschrieben, nach denen FZD-9 in
Astrozytomzellen exprimiert wird.
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Es
wurde deshalb bislang angenommen, dass es sich bei FZD-9 um ein
ubiquitäres
Protein handelt, das als Marker zur Identifizierung und/oder Isolierung
von MSC gänzlich
ungeeignet ist.
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Der
erfindungsgemäße MSC-Marker
ist, wie erwähnt,
FZD-9. Hierunter fällt
sowohl das FZD-9-Protein als auch ein Teilprotein von FZD-9, wie
beispielsweise die extrazelluläre
Domäne
von FZD-9, aber auch ein anderes sich von dem FZD-9-Protein ableitendes
Protein oder Peptid, solange dies von dem Fängermolekül spezifisch gebunden wird.
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Die
591 Aminosäuren
umfassende Proteinsequenz der humanen Variante von FZD-9 ist im Stand
der Technik bekannt und beispielsweise unter der Zugriffsnummer
NM 003499 oder AH26333 der NCBI-Datenbank
entnehmbar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov./). Diese Sequenzinformationen
sind durch Inbezuqnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
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Erfindungsgemäß wird unter
einem Fängermolekül ein Stoff
verstanden, der selektiv und spezifisch mit FZD-9 wechselwirken
kann. Dies kann durch direktes Kontaktieren von FZD-9 erfolgen.
Die spezifische und selektive Wechselwirkung kann aber auch indirekt
mit FZD-9 erfolgen, beispielsweise über Kontaktieren von mit FZD-9
wechselwirkenden Faktoren, wie dem Wnt-Protein.
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Unter
eine solches Fängermolekül fallen
im Sinne der Erfindung deshalb bspw. Bindeproteine, wie monoklonale
oder polyklonale Antikörper,
die gegen FZD-9 gerichtet sind. Alternativ können als Fängermoleküle auch Abschnitte derartiger
Antikörper verwendet
werden, die für
die Wechselwirkung mit FZD-9 verantwortlich sind. Hierunter fallen
sog. Fab-Fragmente und sog. scFv- Fragmente.
Ein Fab-Fragment enthält
die variable Domäne
der schweren und leichten Kette und die angrenzenden konstanten
Domänen
CH1 und CL, verbunden
durch eine Disulfidbrücke,
die natürlicherweise
diese beiden Ketten zusammenhält.
Ein scFv-Fragment
besteht aus dem Fv-Fragment, d.h. der kleinsten Antikörperdomäne, die
für die
Affinität
des gesamten Antikörpers
für das
Antigen (mit-)verantwortlich ist, und einem stabilisierenden Linker-Polypeptid.
Die Spezifitäten
und Selektivitäten
von solchen Fab- und scFv-Fragmenten sind identische mit jenen des
gesamten Antikörpers.
Allerdings können
Antikörperfragmente
wesentlich einfacher und damit kostengünstiger, bspw. in mikrobiellen
Expressionssystemen hergestellt werden.
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Ein
geeignetes Fängermolekül stellt
auch ein sogenanntes Aptamer dar, das im vorstehenden Sinne in der
Lage ist, spezifisch und selektiv an FZD-9 zu binden. Bei einem
Aptamer handelt es sich um eine über
eine im Stand der Technik bekannte in-vitro-Evolution gewonnene Nukleinsäuremolekülart, die in
ihren Bindeeigenschaften mit hochselektiven monoklonalen Antikörpern vergleichbar
ist.
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Je
nach Herkunft der biologischen Probe kommt als Fängermolekül vorzugsweise ein solches in
Frage, das gegen FZD-9 gerichtet ist, das den gleichen Ursprung
hat, wie die biologische Probe. D.h. sollen MSC aus einer biologischen
Probe humanen Ursprungs isoliert bzw. identifiziert werden, wird
als Fängermolekül vorzugsweise
ein solches eingesetzt, das selektiv und spezifisch die humane Variante
von FZD-9 bindet. Entsprechendes gilt für MSC tierischen Ursprungs,
wobei dann ein Fängermolekül eingesetzt
wird, das selektiv und spezifisch die jeweilige tierische Variante
von FZD-9 bindet.
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Erfindungsgemäß umfasst
eine biologische Probe jedes beliebige biologische Material tierischen oder
humanen Ursprungs, das auf das Vorhandensein von MSC untersucht
werden soll bzw. aus dem MSC isoliert werden sollen. Dabei kann
es sich um ein Gewebeverband, eine Zellsuspension oder aber auch
um Organe, Organteile oder um Organismen handeln. Beispiele für biologische
Proben umfassen Knochenmarkgewebe und Knochenmarkzellen, Knorpelzellen
und Knochenzellen, Fettgewebe und Fettzellen, Lebergewebe und Leberzellen,
Placentagewebe und Placentazellen, peripheres und Nabelschnurblut
etc.
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Die
Inkubation des Fängermoleküls mit der biologischen
Probe kann in jedem dem Fachmann bekannten System bzw. Medium erfolgen,
das die Bildung eines Komplexes aus Fängermolekül und MSC ermöglicht.
Beispiele hierfür
sind Puffersysteme, die dem Fachmann bekannt sind und routinemäßig beispielsweise
bei Immunassays verwendet werden, z.B. bei dem Enzyme Linked Immunosorbent Assay
(ELISA), der Durchflusszytometrie (FACS), etc.
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Unter
Identifizierung von MSC wird erfindungsgemäß die Feststellung verstanden,
dass sich ein Komplex aus Fängermolekül und MSC
gebildet hat. Dies erfolgt mittels im Stand der Technik bekannter
Verfahren von immunologischer, histologischer, bildgebender oder
mikroskopischer Art.
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Unter
Isolierung von MSC wird erfindungsgemäß verstanden, dass ein Komplex
aus Fängermolekül und MSC
von der biologischen Probe getrennt wird. Wenn gewünscht, kann
anschließend
auch der Komplex in MSC und Fängermolekül getrennt
werden Dies erfolgt mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren.
Das Fängermolekül kann bspw.
an ein Trägermaterial
gekoppelt sein, was die Handhabung des Fängermoleküls erleichtert und eine Zentrifugation
des Letzteren ggf. mit daran gebundenen MSC und die Trennung des
Komplexes aus Fängermolekül und MCS
von der biologischen Probe ermöglicht.
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Nach
einer bevorzugten Weiterbildung erfolgt nach dem Schritt (b) der
weitere Schritt (b1), in dem der gebildete Fängermolekül-MSC-Komplex von ungebundenen
Bestandteilen der biologischen Probe und ungebundenen Fängermolekülen separiert
wird.
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Durch
diese Maßnahme
wird auf bevorzugte Art und Weise die Isolierung des Komplexes realisiert und
Kontaminanten, wie ungebundene Fängermoleküle, ungebundenen
weitere Bestandteile der biologischen Probe und ggf. ungebundene
MSC von den gewünschten
MSC abgetrennt.
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Dabei
ist es bevorzugt, wenn es sich bei den MSC um solche mit unreifem
Phänotyp
handelt.
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Diese
Maßnahme
hat den Vorteil, dass MSC in einem sehr frühen Differenzierungsstadium
isoliert und/oder identifiziert werden. Erfindungsgemäß sind MSC
mit unreifem Phänotyp
dadurch charakterisiert, dass sie neben FZD-9 auch embryonale Stammzellmarker
wie SSEA-4, Oct-4 und nanog exprimieren. Solche MSC zeichnen sich
durch ihr besonders hohes Entwicklungspotential aus und können verschiedenste
Differenzierungswege einschlagen. Unreife MSC stellen damit ein
Repertoire für
unterschiedliche Gewebetypen dar. Wie die Erfinder feststellen konnten,
lassen sich nämlich
diese unreifen MSC bspw. in funktionelle Adipocyten, osteoblasten-ähnliche
Zellen, Glucagon-exprimierende pankreati sche inselähnliche
Zellen, sowie in neural-ähnliche
Zellen differenzieren.
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Dabei
ist es bevorzugt, wenn das Fängermolekül ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus: Antikörper, Antikörperfragment, Aptamer, natürlicher Ligand
(Wnt) sowie einem Fragment hiervon.
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Wie
weiter oben erwähnt,
handelt es sich bei diesen Substanzen um besonders geeignete Fängermoleküle, die
bei der Verwendung im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zu besonders
guten Ergebnissen führen.
Ein geeigneter polyklonaler Antikörper, der als Fängermolekül verwendet
werden kann, ist bspw. der polyklonale α-FZD-9-Antikörper der Firma Acris Antibodies
GmbH, Hiddenhausen, Deutschland (Katalog Nr. SP4135P).
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Vorzugsweise
wird als Fängermolekül der monoklonale
Antikörper
verwendet, der von der nach dem Budapester Vertrag am 15. Juli 2004
bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
(DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Deutschland, unter
der Nummer DSM ACC2668 hinterlegten Hybridomzelle W3C4E11 produziert
wird.
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Dieser
Antikörper
hat sich als besonders selektiv für die humane Variante von FZD-9
herausgestellt und ist deshalb ein erfindungsgemäß besonders geeignetes Fängermolekül.
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Vorzugsweise
ist das Fängermolekül an eine Trägersubstanz
gekoppelt, bei der es sich vorzugsweise um Agarose oder Sepharose
handeln kann.
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Derartige
Materialien haben sich zur Immobilisierung von Fängermolekülen als besonders geeignet
erwiesen. Die Kopplung erfolgt vorzugsweise über ein zwischengeschaltetes
bakterielles Protein, wie beispielsweise Protein A, Protein G oder
Protein L, die einerseits die konstanten Regionen (Fc) von Antikörpern binden,
und andererseits sich leicht an die Trägersubstanz Agarose bzw. Sepharose
koppeln lassen. Eine derartige Kopplung von Antikörpern an
eine Trägersubstanz
ist beispielsweise beschrieben in Ed Harlow und David Lane (1988),
Antibodies: A laboratory manual; der Inhalt dieser Publikation ist durch
Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
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Dabei
ist es bevorzugt, wenn das Fängermolekül mit einem
detektierbaren Marker gekoppelt ist.
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Diese
Maßnahme
hat den Vorteil, dass die Identifizierung des Komplexes aus Fängermolekül und MSC
erleichtert wird. Erfindungsgemäß wird unter
einem Marker jede Verbindung verstanden, mittels derer eine Lokalisierung
und Identifizierung des Komplexes in vitro, in vivo oder in situ
möglich
ist. Hierzu zählen
Farbindikatoren, wie Farbstoffe, mit fluoreszierenden, phosphoreszierenden
oder chemilumineszierenden Eigenschaften, AMPPD, CSPD, radioaktive
Indikatoren, wie 32P, 35S, 125I, 131I, 14C, 3H, nicht radioaktive
Indikatoren, wie Biotin oder Dioxigenin, alkalische Phosphatase,
Meerrettich-Peroxidase, etc. Der Nachweis solch markierter Fängermoleküle erfolgt
dann über
im Stand der Technik bekannte bildgebende Verfahren, wie Autoradiographie,
Blotting-, Hybridisierungs- oder Mikroskopietechnike.
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Der
Fängermolekül-MSC-Komplex
wird bevorzugt mittels immunologischer Verfahren, wie dem ELISA
identifiziert.
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Dieses
Verfahren hat sich als besonders effektives und einfach durchführbares
Trennverfahren von Antigen-Antikörper-Komplexen
aus einem Inkubationsmedium etabliert. Bei diesem Verfahren ist entweder
der Antikörper
oder aber das Antigen mit einem Enzym markiert, das einen colorimetrischen Nachweis
erlaubt, üblicherweise
mittels alkalischer Phosphatase oder Peroxidase.
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Ein
weiteres bevorzugtes Verfahren zur Identifizierung des Fängermolekül-MSC-Komplexes ist
die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung bzw. Durchflusscytometrie
(FACS).
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Bei
der FACS-Sortierung werden die FZD-9 tragenden MSC mit Hilfe eines
monoklonalen Antikörpers
erkannt, der gegen FZD-9 gerichtet ist und seinerseits mit einem
fluoreszierenden Farbstoff markiert ist. Die biologische Probe bzw.
Zellsuspension wird durch eine dünne
Kanüle
geführt,
deren Strahl am Ende durch Vibration in einzelne Tropfen aufgelöst wird.
Wenn ein Tropfen eine MSC enthält,
die den markierten Antikörper
gebunden hat, wird der Marker durch einen Laserstrahl zur Fluoreszenz
angeregt. Diese Fluoreszenz kann mit einem Lichtdetektor gemessen
und zur Auftrennung der Zellen benutzt werden. Dazu werden die Zellen
mittels eines elektrischen Impulses je nach Fluoreszenzintensität aufgeladen
und beim Passieren eines elektrischen Feldes entsprechend gelenkt
und sortiert.
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Ein
weiteres bevorzugtes Verfahren zur Identifizierung des Fängermolekül-MSC-Komplexes ist
der CFU-F-Assay.
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Bei
diesem Verfahren werden die an das Fängermolekül gebundenen Zellen in Kulturgefäße ausgesät und anschließend die
Kolonien wachsender MSC gezählt.
Dazu wird vorzugsweise der Komplex aus Fängermolekül und Zelle bzw. MSC aufgelöst, d.h.
die Zellen werden von dem Fängermolekül befreit.
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Vor
diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung die Verwendung eines Fängermoleküls, das
an einen Marker für MSC
bindet, zur Isolierung und/oder Identifizierung von MSC aus einer
biologischen Probe, wobei es sich bei dem Marker um FZD-9 handelt.
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Es
versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend
noch zu erläuternden Merkmale
nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in
anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne
den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Nachfolgend
werden bevorzugte Ausführungsbeispiele
beschrieben, die den alleinigen Zweck der Illustrierung der Erfindungsgegenstände haben
und die Tragweite der Erfindung keinesfalls einschränken. Dabei
wird Bezug genommen auf die beigefügten Abbildungen. Diese zeigen
Folgendes:
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1 Vektorkonstruktion
und Transfektion von HEK-293-Zellen
mit plRES2-EGFP-Si-F-FZD-9/FZD-10. (A) Vektorkonstrukte, die für die Expression
von FZD-9- und FZD-10-Rezeptoren in HEK-293-Zellen verwendet wurden,
basieren auf plRES-EGFP (Clontech). Das Konstrukt enthält sowohl
eine N-terminale Signalsequenz für
die Membraninsertion als auch einen FLAG-Tag. HEK-293-Zellen wurden entweder
mit plRES2-EGFP-Si-F-FZD-9 oder mit plRES2-EGFP-Si-F-FZD-10 transfiziert.
(B) FACS-Analyse der transfizierten Zellen. Die Zellen wurden entweder
mit einem Anti-FLAG- oder einem Anti-FZD-Antikörper markiert und mit einem
sekundären
PE-konjugierten
Anti-Maus-Antikörper
gefärbt. Nach
dem Waschen wurden die Zellen auf einem FACSCalibur-Durchflusscytometer
unter Verwendung der Cellquest-Software
analysiert. Festzustellen ist eine spezifische Reaktion des gegen
FZD-9 gerichteten monoklonalen Antikörpers (W3C4) und des gegen
FZD-10-gerichteten
monoklonalen Antikörpers
mit den jeweils transfizierten Zelllinien. (C) Die exogene Frizzled-Rezeptor-Expression
in HEK-293-huFZD-9- und HEK-293-huFZD-10-Zellen wurde
durch einen Immunoblot der mittels SDS-PAGE-separierten Lysate dieser
Zellen (transfiziert mit 1 μg,
2 μg und
4μg von
FZD-9 und FZD-10 enthaltenden Plasmide) mit kommerziell erhältlichen
Anti-FZD-Antiseren und Anti-FLAG-Antikörpern bestätigt. Die Figur zeigt eine
detektierbare Expression von FZD-9 oder FZD-10 nur in transfizierten,
nicht aber in parentalen Zellen. (D) RT-PCR-Analyse von FZD-9 und
FZD-10 in parentalen und transfizierten HEK-293-Zellen. Die tranfizierten
Zellen zeigen einen Anstieg der mRNA-Expression von FZD-9 bzw. FZD-10.
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2 Charakterisierung
von Placentagewebe durch Immunhistochemie. (A) Immunhistologische
Färbung
von CD318 an acetonfixierten Cryostatschnitten. Positive Zellen
wurden hauptsächlich
im Parenchym von kleinen Placenta-Villi angefärbt; Stern: Blutgefäß; Maßstabsbalken:
100 μm.
(B) Höhere
Vergrößerung von
Teilabbildung (A). Die Pfeile zeigen auf CD318 positive Zellen;
Maßstabsbalken: 25 μm. (C) Immunhistologische
Färbung von
FZD-10 auf einem Parafinschnitt, V: Villi; IS: Zwischenvillusraum;
SV: Stammvillus; Maßstabsbalken:
100 μm. (D)
Höhere
Vergrößerung von
Teilabbildung (C); die Pfeile zeigen auf FZD-10 positive Syncytiotrophoblasten;
Stern: Blutgefäß; Maßstabsbalken
25 μm. (E)
Kombinierte Immunfärbung
von FZD-9 und Glattmuskel-Actin an acetonfixierten Cryostatschnitten. Die
Pfeile zeigen auf gefärbte
Bereiche, die ein großes
Blutgefäß umgeben;
Maßstabsbalken
200 μm. (F)
Höhere
Vergrößerung von
Teilabbildung (E); starke Färbung
des mittleren Bereichs eines Blutgefäßes und der das Gefäß umgebenden
Zellen (Pfeil); die Pfeilspitze markiert die für den glatten Muskel positive
Blutgefäßmitte;
Maßstabsbalken:
100 μm.
(G) Hohe Vergrößerung der
FZD-9 gefärbten
Zellen (Pfeil) in dem Parenchym eines kleinen Villus; Stern: Blutgefäß; Maßstabsbalken:
25 μm. (H)
Immunhistologische Färbung
von SSEA-4 auf acetonfixierten Cryostatschnitten. Festzustellen
ist die positive Färbung
des Syncytiotrophoblast (Pfeil); Stern: Blutgefäß; Maßstabsbalken: 50 μm. (I) Höhere Vergrößerung der
Teilabbildung (H). Starke Färbung
des Syncytiotrophoblast und einzelnen Zellen im Parenchym des Villus
(Pfeilspitze); Stern: Blutgefäß; Maßstabsbalken:
25 μm. (J)
Hohe Vergrößerung des
SSEA-4 positiven Syncytiotrophoblasten in dem kleinen Villus; Stern:
Blutgefäß; Maßstabsbalken:
25 μm.
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3:
Morphologie von MC- und Plazenta-abgeleiteten MSC, EBS und CAPC.
(A) Aus Knochenmark (BM) oder aus Placenta gewonnene MSC wurden
auf Gelatine-beschichteten Schalen in Gegenwart von 5 ng/ml basischem
Fibroblasten-Wachstumsfaktor (b-FGF) für 7 Tage (Placenta) oder für 14 Tage
(BM) kultiviert. Man beachte die halb-konfluente Schicht von fibroblastoiden,
spindelförmigen
Zellen. (B) Embryoidkörper-ähnliche
Strukturen (EBS), die aus MSC gewonnen wurden, wurden für 4 Tage
in Gegenwart von embryonalen Stamm(ES)-Zellmedium auf Platten mit extrem niedriger
Adhärenz
kultiviert. Die Zellen bildeten große Aggregate mit ähnlicher
Struktur, wie diese für
Embryoidkörper
beschrieben wurden. (C) CAPC, die aus EBS gewonnen wurden, wurden
für sechs
Tage in Gegenwart von serumfreiem, IST-Zusatz enthaltendem ES-Cult-Medium kultiviert.
Man beachte die mesenchymale Morphologie der Zellen, die sich von
den EBS ausbreiten.
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4 Expression
der Oberflächenmarker auf
MSC, EBS und CAPC. Die Zellen wurden mit den angegebenen Antikörpern markiert
und mit einem Sekundär-PE-konjugiertem
Anti-Maus-Antikörper gefärbt. Nach
dem Waschen wurden die Zellen auf einem FACSCalibur Durchflusscytometer
unter Verwendung der Cellquest Software analysiert. (A) MSC; (B)
EBS; (C) CAPC.
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5 Immuncytochemische
Analyse von Oct-4- und FZD-9-Proteinexpression
in MSC. Zur Färbung
von MSC, die sich von BM (Teilabbildung A-D) und von Placenta (Teilabbildung
E-H) ableiten, wurden die Zellen über Nacht mit Antikörpern inkubiert,
die spezifisch waren für
Oct-4 und FZD-9. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit einem TRITC-konjugierten
Schwein-Anti- Kaninchen-Sekundär-Antikörper gefärbt und
auf einem Zeiss Axiovert 200-Mikroskop unter Verwendung der Axiovision Software
visualisiert. Die Teilabbildungen (B), (D), (F) und (H) zeigen eine
höhere
Vergrößerung (Maßstabsbalken:
25 μm) der
Teilabbildungen (A), (C), (E) bzw. (G) (Maßstabsbalken: 50 μm).
-
6 RT-PCR-Analyse
der mRNA-Expression in MSC, EBS und CAPC. (A) Primersequenzen für Oct-4,
Nestin und Nanog sind beschrieben in Miki et al. (2005), Stem cell
characteristics of amniotic epithelial cells, stem cells 23, S.
1549–1559;
die Primersequenzen von FZD-10
sind beschrieben in Etheridge et al. (2004), Expression profiling
and functional analysis of wnt signalling mechanisms in mesenchymal
stem cells, Stem Cells 22, Seiten 849–860. FZD-9- und GAPDH-Primer
wurden aus den Genbanksequenzen ID NM_003508 bzw. NM 003499 sowie
BT006893 abgeleitet. (B) Primäre
BM- und Placentazellen
oder kultivierte Zellen (MSC, EBS und CAPC) wurden auf die mRNA-Expression
von FZD-9, FZD-10, Oct-4, Nanog und Nestin analysiert. Die Expression
von GAPDH wurde durchgeführt,
um das identische Laden von cDNA zu demonstrieren. Die rechten Spuren
stellen Wasserkontrollen dar. Die Produkte wurde über ein
1%-iges Agarosegel separiert und die resultierenden DNA-Banden wurden
auf einem Vilber Lourmat UV-Transilluminator (Vilber Lourmat) visualisiert.
-
7 Differenzierung
von CAPC in Zellen verschiedener Keimbahnen. (A) Für die osteogene Differenzierung wurden
CAPC für
10 Tage in OsteoDiffTM-Medium kultiviert.
Die resultierenden osteoblasten-ähnlichen
Zellen wurden durch ihre markante Färbung der Phosphatase-Aktivitäten mit
dem BCIP/NBT-Substrat identifiziert. (B) Zur adipogenen Differenzierung
wurden die CAPC für
18 Tage in Gegenwart von AdipoDiffTM-Medium
kultiviert. Funktionelle Adipocyten zeigen die Aufnahme von Oil-Red-O-Farbstoff
(siehe Teilabbildung). (C, D) Die Bildung von neuronenähnlichen
und astrocytenähnlichen
Zellen wurde durch das Kultivieren CAPC in Gegenwart von NeuroCult®-Medium
für die
neuronale Proliferation und Differenzierung analysiert. (C) Offenbart
Zellen mit Astrocytenmorphologie, die positiv sind für das glial-fibrilläre-acidische-Protein
(GFAP); Maßstabsbalken:
25 μm. (D)
Zeigt die Färbung
von Zellen mit einem Antikörper
gegen neuronales β-Tubulin-III;
Maßstabsbalken:
25 μm. (E,
H) Zur pankreatischen Differenzierung wurden CAPC zuerst in einem
Medium zur pankreatischen Proliferation, das bFGF enthielt, und
dann in einem Medium zur pankreatischen Differenzierung, das Nikotinamid
enthielt, kultiviert. (E) Zeigt das Ausbreiten von adhärenten Zellen
nach der Kultivierung in Medium zur pankreatischen Proliferation.
(F) Zeigt die Bildung von inselähnlichen
pankreatischen Strukturen. (G) Zeigt die Färbung von Zellen mit Glucagon-spezifischen
Antikörpern.
(H) ist die höhere
Vergrößerung (Maßstabsbalken:
25 μm) von
(G) (Maßstabsbalken:
50 μm).
-
Bevorzugte Ausführungsbeispiele
-
I. Material und Methoden
-
1. Isolierung von Primärzellen
-
1.1 Placenta
-
Placentagewebe
wurde nach Genehmigung durch das Ethikkomitee der Universität Tübingen aus der
Abteilung für
Geburtshilfe und Gynäkologie
von solchen Frauen erhalten, bei denen ein Kaiserschnitt durchgeführt wurde.
Unmittelbar nach dem Eingriff wurden die Chorionplatte mit dem amniotischen
Epithel und den Stammvilli einschließlich der großen Blutgefäße von der
Placenta entfernt. Das verbleibende Placentagewebe wurde in kleine
Stücke
geschnitten und intensiv dreimal mit Hanks's-balanced Salzlösung (PAA, Pasching, Österreich)
enthaltend 1 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (HBSS-Pen/Strep,
PAA) gewaschen. Im nächsten Schritt
wurde das Gewebe mit einer Kombination von Kollagenase (750 U/ml;
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) und Dispase II (200 μg/ml; Roche
Diagnostics, Mannheim, Deutschland) in HBSS bei 37°C für eine Stunde
in einem Schüttelwasserbad
verdaut. Das verbleibende Gewebe wurde durch Filtrierung durch ein
Sieb mit einer Porengröße von 100 μm filtriert.
Im letzten Schritt wurden Erythrocyten durch Histopac (Sigma-Aldrich)-Dichtegradientenfraktionierung
bei 750 g für
20 min bei Raumtemperatur entfernt, und die Interphasezellen wurden
mit Ammoniumchloridlösung
(0,8 % NH4Cl und 0,1 mM EDTA, Cell Systems)
für 10
Min. bei 4°C
gewaschen.
-
1.2 Knochenmark
-
Knochenmark
(BM) wurde über
das Berufsgenossenschaftliche Krankenhaus aus dem Schaft des Oberschenkelknochens
von Patienten gewonnen, die einer Hüftoperation unterzogen wurden. Dies
wurde vom Ethikkomitee der Universität Tübingen genehmigt. Ungefähr 25 ml
BM-Zellen wurden gesammelt und mit 5000 U Heparin (Sigma-Aldrich) gemischt.
Mononukleare Zellen wurden durch Ficoll-Histopac-Dichtegradientenfraktionierung (750
g für 20
min bei Raumtemperatur) zurückgewonnen.
-
2. Kultivierung
von Primärzellen
-
2.1 Herstellung von mesenchymalen
Stammzellen (MSC)
-
2 × 107 Ficoll separierte Zellen aus BM oder 1 × 107 Zellen aus Placenta wurden auf Gelatine-beschichtete
27 cm2 Zellkulturlatten transferiert und
bei 37°C
und 5 % CO2 in 20 ml „knock-out Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium" (KO-DMEM; Invitrogen;
Karlsruhe, Deutschland) enthaltend 20 % KO-Serumersatz, 1 mM L-Glutamin,
0,1 mM β-Mercaptoethanol
(Sigma-Aldrich), 1 % nicht-essentielle Aminosäuren und 5 ng/ml humanem basischem
Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) wachsen gelassen; vgl. Itskovitz-Eldor
et al. (2000), Differentiation of human embryonic stem cells into
embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers, Mol. Med.
6, Seiten 88–95.
An jedem zweiten Kultivierungstag wurden 2 ml von KO-DMEM zugegeben. Die
adhärenten
Zellen waren nach 14 Tagen (BM-Zellen) oder 7 Tagen (Placenta) der
Kultivierung zu ca. 90 % konfluent.
-
2.2 Herstellung von Embryoidkörper-ähnlichen
Strukturen.
-
Embryoidkörper-ähnliche
Strukturen (EBS) wurden durch Kultivierung von trypsinierten MSC
für 4 Tage
in ES-Cult® Schalen
mit niedriger Adhärenz (CellSystems)
in ES-Differenzierungsmedium
enthaltend 15 ES-Cult®-FBS, 1 mM nicht-essentielle
Aminosäuren,
2 mM L-Glutamin (Cell-Systems),
1 mM Mono-Thioglycerol (MTG; Sigma) gelöst in DMEM „high glucose" (1 g/l; Invitrogen)
und Penicillin/Streptomycin. Nach 2 Kultivierungstagen wurden schwerkraftsedimentierte
EBS von einzelnen Zellen in einem Falconröhrchen durch vorsichtige Entfernung des Überstandes
separiert, und das Medium wurde durch frisches ES-Cult®-Medium ersetzt. Vor
der Durchführung
weiterer Analysen wurden die EBS durch Pipettieren und sorgfältigem Schütteln mit
einem Vortexer disaggregiert.
-
2.3 Anreicherung von sog. „common
adherent progenitor cells" (CAPC)
-
Um
CAPC anzureichern, wurden sedimentierte EBS in 6-Well-Platten transferiert
und für
6 Tage in 3 ml serumfreiem ES-Cult®-Basalmedium (Cell
Systems) mit ITS-Zusätzen
(0,5 μg/ml
rh-Insulin, 5 μl/ml
rh-Transferrin, 0,52 μg/ml
Natriumselenit in PBS; Cell Systems) kultiviert. Das Medium wurde
alle zwei Tage ersetzt.
-
2.4 Pankreatische Differenzierung
von CAPC
-
Für die Differenzierung
von CAPC in Insulin-sekretierende pankreatische inselähnliche
Cluster wurden die Zellen zu erst in pankreatischem Proliferationsmedium
expandiert und anschließend
in pankreatischem Differenzierungsmedium kultiviert. Im ersten Schritt
wurden die Zellen in pankreatischem ES-Cult®-Basalmedium
enthaltend N2-A- und B27-Zusätzen und
25 ng/ml rh-bFGF (pankreatisches Proliferationsmedium; Cell Systems)
suspendiert und für
6 Tage auf Poly-D-Lysine beschichteten Glaskammerobjektträgern (BD
Biosciences) kultiviert. Im nächsten
Schritt wurden die Zellen nach dem Austausch des Mediums für weitere
6 Tage in pankreatischem Differenzierungsmedium (pankreatisches
Poliferationsmedium enthalten 10 mM Nicotinamid; Cell Systems) kultiviert.
-
2.5 Neuronale Differenzierung
von CAPC
-
Für die Differenzierung
von CAPC in die neuronale Linie wurden die Zellen für 6 Tage
auf Poly-D-Lysin-beschichteten
Glaskammerobjektträgern in
Gegenwart von neuronalem Proliferationsmedium (NeuroCult® NS-A-Basalmedium enthalten
NeuroCult® NS-A
Proliferationszusätze;
Cell Systems) kultiviert. Das Medium wurde alle zwei Tage ersetzt. Nach
6 Kultivierungstagen wurde das neuronale Proliferationsmedium durch „vollständiges" NeuroCult®-NS-A Differenzierungsmedium
(NS-A Basalmedium mit NS-A Differenzierungszusätzen; Cell Systems) ersetzt.
Das Medium wurde alle 2 Tage gegen frisches neuronales Differenzierungsmedium ausgetauscht.
Nach 7 Kultivierungstagen wurden die Zellen für die Immunfluoreszenzfärbung verwendet.
-
2.6 Mesodermale Differenzierung
von CAPC
-
Zur
Differenzierung von CAPC in Adipocyten und Osteoblasten wurden die
Zellen in Gegenwart von NH-AdipoDiff-Medium bzw. NH-OsteoDiff-Medium (jeweils
von Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) gemäß der Anweisungen
des Herstellers kultiviert. Kurz gesagt, CAPC wurden bei 5 × 104/ml (Adipogenese) oder 3 × 104/ml (Osteogenese) in dem jeweiligen Medium
resuspendiert und in Gewebekultur behandelte 6-Well-Platten transferiert. Das
Medium wurde alle 3 Tage ausgetauscht. Die Bildung von Adipocyten
wurde am 18. Tag der Kultivierung evaluiert, indem die Zelle mit
Methanol für
5 min bei –20°C fixiert
und anschließend
hinsichtlich intrazellulärer
neutraler Lipide mit Oil Red O-Farbstoff (Sigma; 20 Min, Raumtemperatur)
angefärbt
wurden. Die Bildung von osteogenen Zellen wurde am 10. Kultivierungstag
analysiert, indem die Aktivität
der alkalischen Phosphatase von Methanol-fixierten Zellen (–20°C, 5 Min.)
mit 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat/Nitro-Blau-Tetrazolium (Sigma
FASTTM BCIP/NBT-Substrat; Sigma) für 10 min
bei Raumtemperatur angefärbt
wurde.
-
3. Transfektion von HEK-293-Zellen
-
Die
transiente Transfektion von HEK-293-Zellen (bezogen von der DSMZ,
Braunschweig, Deutschland) mit Plasmiden enthaltend die cDNA der
humanen Frizzled-Rezeptoren 9 oder 10 (1A)
wurde gemäß der Anweisungen
des Herstellers unter Verwendung des FuGene-Transfektionsreagenz
(Roche Diagnostics) durchgeführt. 200.000
Zellen wurden in einer Flacon 6-Well-Schale ausplattiert und in
5 ml RPMI-1640 mit 10 % FBS kultiviert, bis eine Konfluenz von 80
% erreicht wurde. Die Transfektion wurde durch Verwendung von 200 μl einer Mischung
von variierenden Konzentrationen von FuGene (3 μl, 6 μl, 12 μl) und leeren Vektoren bzw.
Vektoren enthaltend die Frizzled-Rezeptor cDNA (1 μg, 2 μg, 4 μg) durchgeführt.
-
4. Konstruktion von Frizzled(FZD)-Gen
enthaltenden Plasmiden
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Ein
synthetisches DNA-Fragment, das für die Signalsequenz der V-J2-C-Region
der Maus-Ig-kappa-Kette gefolgt von einem FLAG-Tag codiert, wurde
in den plRES2-EGFP-Vektor (Contech, Mountain View, CA, Vereinigte
Staaten von Amerika) eingebracht. 5'-phosphorylierte Oligonukleotide Nhe-SiFXho 5'(5'-CTAGCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGC
TCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGATTATAAGGATGACGATGACAAGC-3') und NheSiFXho 3' (5'-TCGAGCTTGTCATCGTCATCCTTATAATCGTCACC-AGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCC-ATG-3') wurden hybridisiert
und in Ndel- und Xholverdauten plRES2-EGFP ligiert. Die multiple
Klonierungsstelle (MCS) wurde mit einer neuen MCS ersetzt, die ein neues
Set von Restriktionsstellen enthält,
indem ein zweites Paar von hybridisierten Oligonucleotiden, die als
XhoMCSBam- 5' (5'-TCGAGGGATCCGAARTTCGACGTCCCCGGGTCTAGAGAG-CTCGGTACCACTAGTA-3') bezeichnet werden
und XhoMCSBam-3' (5'-GATCTACTAGTGGTACCGAGCTCTCTAGACCCGGGGACGTCGAATTCGGAT-CCC-3') in die Xhol- und
BamHI-Stellen ligiert werden. Der resultierende Expressionsvektor,
der als plRES2-Si-F-EGFP bezeichnet wird, wurde auf der Basis von
Restriktionsverdauanalysen und Nukleotidsequenzierungen verifiziert.
-
Der
Expressionsvektor pGEX2aHis-FZD-9 enthaltend die FZD-9 cDNA wurde
von Cytomyx (Cambridge, Vereinigtes Königreich) bezogen. Die FZD-9-cDNA,
beginnend an Position Leu23, wurde durch Restriktionsverdau des
Vektors mit EcoRI und XbaI erhalten. Die DNA-Fragmente wurden in
den analog verdauten plRES2-Si-F-EGFP-Vektor ligiert, um das Plasmid
plRES2-EGFP-Si-F-FZD-9
(1A) zu erhalten. Positive Klone wurden
durch Nukleotidsequenzierung verifiziert.
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Die
cDNA von FZD-10 wurde von Origene (Rockville, MD, Vereinigte Staaten
von Amerika) bezogen. Die Codierungssequenz von FZD-10 wurde PCR
amplifiziert, wobei die Primerpaare FZD-10BamH1 5' (5'-CGGGATCCATCAGCTCCATGGACATGGAGCGC-3')/FZD-10Spel 3' (5'-GGACTAGTCACGCAGGTGGGCGACTGGG-3') verwendet wurden.
Das amplifizierte Produkt beginnend bei Position Ile21, wurde mit
BamHI und SpeI verdaut und in die entsprechenden Stellen von plRES2-Si-F-EGFP
kloniert. Der resultierende Expressionsvektor plRES32-EGFP-Si-F-FZD-10 (1A)
wurde durch Nukleotidsequenzierung verifiziert.
-
5. Generierung von monoklonalen
Antikörpern
(mAb) gegen humanes FZD-9 und FZD-10
-
Der
humane FZD-9-reaktive mAb W3C4E11 wurde durch Immunisierung einer
6 Wochen alten weiblichen Balb/c-Maus (Charles River WIGA, Sulzfeld,
Deutschland) mit der Retinoblastoma-Zelllinie WERI-RB-1 (DMSZ) gewonnen.
Der FZD-10 spezifische mAb wurde erhalten, indem mit HEK-293-Zellen immunisiert
wurde, die mit einem Plasmid transfiziert wurden, der die gesamte
Codierungssequenz von humanem FZD-10 trug. Die Spezifitäten der
monoklonalen Antikörper
gegen humanes FZD-9 (W3C4E11) und gegen humanes FZD-10 wurden durch
deren selektive Erkennung von humanen embryonalen Nierenzellen (HEK-293)
verifiziert, die mit Plasmiden transfiziert wurden, die die gesamten
Codierungssequenzen der entsprechenden humanen FZD-Gene trugen.
Die Isotypen des Anti-FZD-9-Antikörpers (W3C4E11) (IgM) und des
Anti-FZD-10 monoklonalen
Antikörpers
wurden über
ELISA (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) bestimmt.
-
6. Zelloberflächenfärbung und
FACS-Analyse
-
Aus
BM-, Placenta- oder Zelllinien gewonnene Zellen wurden markiert,
wie in Vogel et al. (2003), Heterogeneity among human bone marrow-derived mesenchymal
stem cells and neural progenitor cells, Haematologica 88, Seiten
126–133,
beschrieben, und auf einem FACSCalibur-Durchflusscytometer (Becton
Dickinson, Heidelberg, Deutschland) analysiert. Antikörper gegen
die Zelloberflächenantigene CD318
(CDCP1; Klon CUB2) [Scherl-Mostageer et al. (2001), Identification
of a novel gene, CDCP1, overexpressed in human colorectal cancer
Oncogene 20, Seiten 4402–4408],
CD133 (Klon W6B3C1) [Ernst und Christie (2005), The putative neural
stem cell marker, nestin, is expressed in heterogeneous cell types
in the adult rat neocortex",
Neuroscience], CD34 (Klon 43A1) [Zhou et al. (2005), An experimental
study on astrocytes promoting production of neural stem cells derived
from mouse embryonic stem cells, Chin. Med. J. 118, S. 1194–1999],
CD105 (Klon 1G2C2) [Vogel et al. a.a.O.], CD13 (46A11) [Vogel et al.
a.a.O.], w8B2-Antigen (Klon W8B2B10) [Vogel et al. a.a.O.], CD164
(Klon 67D2) [Vogel et al. a.a.O.], FZD-9 (Klon W3C4E11) und FZD-10
wurden in den eigenen Laboren hergestellt. Der Antikörper gegen SSEA-4 (Klon
MC-813-70) wurde von Chemicon (Hampshire, Vereinigtes Königreich)
bezogen.
-
7. RT-PCT
Analyse
-
Die
kultivierten oder Primärzellen
wurden durch Reverse-Transcriptase(RT)-PCR
bzgl. der mRNA-Expression der folgenden Moleküle analysiert: FZD-9, FZD-10,
Oct-4, Nanog und Nestin. Um die exogene Expression von FZD-9 und
FZD-10 zu analysieren, wurden HEK-293-Zellen mit der gesamten Codierungssequenz
von FZD-9 und FZD-10 transfiziert. Die mittels RNeasy-Mini Kit (Qiagen,
Hilden, Deutschland) extrahierte RNA wurde als Template in der RT-PCR
(Promega, Mannheim, Deutschland) bei 0,1 μg pro Reaktion verwendet. Die
Primersequenzen für
die untersuchten Gene sind in 6A dargestellt.
Wegen des hohen GC-Gehaltes des Templates wurden 3 % DMSO zu den
FZD-9- und FZD-10-PCRs zusammen mit Taq-DNA-Polymerase (Applied
Biosystems) und einem Mix aus dNTP (Promega) hinzugegeben. Die PCR-Produkte wurden über einem
1 %-igen Aqarosegel (Peglab, Erlangen, Deutschland) mit Ethidiumbromid
(Roth, Karlsruhe, Deutschland) aufgetrennt und die DNA-Banden wurden
auf einem Vilber Lourmat UV-Transluminator (Vilber Lourmat, Marne
La Vallee, Frankreich) visualisiert.
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8. Westernblot-Analyse
-
HEK-293-Zellen,
die transient mit plRES2-EGFP-Si-F-FZD-9 oder plRES2-EGFP-Si-F-FZD-10
transfiziert wurden, wurden dazu verwendet, um die exogene Proteinexpression
zu analysieren. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen durch
Ultraschallbehandlung in SDS-Proteinladepuffer (125 mM Tris-Cl,
pH 6,8, 4 % w/v SDS, 0,005 % Bromphenolblau (w/v), 20 % v/v Glycerol)
enthalten 200 mM dithiothreitol (DTT) (Sigma), 2 mM PMSF (Santa
Cruz, Biotechnologies) und Protease-Inhibitorcocktail (1:100, Santa
Cruz) lysiert. Die Proteinlysate wurden durch 10 %-ige SDS-PAGE separiert
und dann auf eine Nitrocellulosemembran (Biorad, München, Deutschland)
transferiert. Um die nicht-spezifische Bindung zu blockieren, wurden
die Membranen mit Blockierungspuffer enthalten 5 % fettfreie Trockenmilch
(Naturaflor, Dietmannsried, Deutschland) in 2 × TBS und 0,05 % Tween 20 inkubiert
und anschließend
entweder mit einem 1:1500 verdünnten
Anti-FLAG-Antikörper
(Sigma, Klon M2) oder einem 1:1000 verdünnten FZD-9- oder FZD-10-reaktiven
Antiserum (Acris, Hiddenhausen, Deutschland) inkubiert. Die gebundenen
Antikörper wurden
mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern (Dako)
und dem ECL-Westernblotsubstrat (Pierce, Bonn, Deutschland) gemäß der Anweisungen
der Hersteller inkubiert.
-
9. Doppelfärbung von
Placentagewebe durch Immunhistochemie
-
Paraformaldehyd
fixiertes (4 % in PBS) und Paraffin eingebettetes placentales Gewebe
wurde in 5 μm
dicke Scheiben geschnitten. Nach der Rehydrierung wurden die Schnitt
für 10
min in Citratpuffer (2.1 g Natriumcitrat/l, pH 6,0) in einem Mikrowellengerät gekocht.
Die endogene Peroxidasereaktion wurde mit 3 % H2O2 in TBS für 15 Min. blockiert. Nach der
Blockierung der nicht-spezifischen Immunglobulinbindung mit 10 %-igem
normalem Schweineserum in TBS enthaltend 0,1 % BSA und 0,3 % Triton
X-100 für
30 min, wur den die Schnitte mit Primärantikörpern verdünnt in TBS (0,1 % BSA, 0,3
% Triton X-100) über
Nacht bei 4°C
inkubiert. Es wurden primäre
monoklonale Antikörper
mit den folgenden Spezifitäten verwendet:
SSEA-4 (Chemicon, Verdünnung
1:100), als auch die unverdünnten Überstände der
intern hergestellten Antikörper
gegen CD318 (CUB2), gegen FZD-9 (W3C4E11) und gegen FZD-10. Nach
drei Waschzyklen in TBS-Puffer wurden die Schnitte mit biotinyliertem
Sekundärantikörpern für 30 min
bei Raumtemperatur inkubiert (1:400, Schwein-Anti-Maus-IgG; Dako
Cytomations, Glostrup, Dänemark).
Nach drei Waschschritten mit TBS-Puffer erfolgte die Färbung der
Zellen mit 3-3'-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid
(DAB, Sigma-Aldrich) unter Verwendung des ABC-Färbesystems gemäß der Empfehlungen
des Herstellers (Dako). Für
die Doppelfärbungsexperimente
wurden die Scheiben dann mit einem Glattmuskelzellactin-reaktiven
Antikörper (Kaninchen-Anti-Human
IgG, Dako, Verdünnung 1:100)
inkubiert. Nach drei Waschzyklen mit TBS-Puffer wurden die Zellen
für 30
min mit einem ABC-Komplex, der mit alkalischer Phosphatase konjugiert
(Dako) und 1:400 in TBS (0,1 % BSA) verdünnt war, gefärbt. Die
Zellen wurden durch Zugabe von Fast-Blue-BB-Salz-Chromogen-Substratlösung (Sigma-Aldrich)
visualisiert. Die Schnitte wurden dann getrocknet und mit Kaiser's Glycerolgelatine (Merck,
Darmstadt, Deutschland) getrocknet. Für die Immunohistochemie auf
Cryostatschnitten wurde gefrorenes Placentagewebe in 12 μm dicke Scheiben auf
einem Gefriermikrotom geschnitten. Nach der Fixierung in eiskaltem
Aceton und Blockierung mit Schweineserum wurde die Färbung durchgeführt, wie
oben beschrieben.
-
10. Immuncytochemie
-
Zellen
in den angegebenen Differenzierungsstadien wurden zweimal mit PBS
gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich) für 15 min
bei Raumtemperatur fixiert. Im nächsten
Schritt wurden die Zellen durch Inkubation mit 70 % Ethanol für 5 min
bei Raumtemperatur permeabilisiert. Die nicht-spezifische Bindung
wurde durch Inkubation für eine
Stunde mit 10 % Schweineserum in PBS blockiert. Um die neuronale
Differenzierung zu analysieren, wurden die Zellen mit Astrocyten-spezifischen und
Neuron-spezifischen Antikörpern
markiert, indem die Zelle mit einem 1:100 verdünnten Kaninchen-Anti-Human-Glialem-Fibrillärem-Azidischen-Protein(GFAP)-Antikörper, und
einem 1:100 verdünnten
Maus-Anti-Human-Neuronal-Klasse-III-β-Tubulin-Antikörper (beide Antikörper stammen
von Cell Systems) über
Nacht in 1 %-igem Schweineserum inkubiert. Nach viermaligem Waschen
mit PBS wurden die Zellen für
eine Stunde mit einem CY3-konjugierten Schwein-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Jackson
Immuno Research, Cambridge, Vereinigtes Königreich) und mit einem Alexa488-konjugiertem Ziege-Anti-Maus-Sekundärantikörper (Molecular
Probes, Karlsruhe, Deutschland) inkubiert. Nach dem Färben wurden die
Zellen fünfmal
mit PBS gewaschen. Um die Kernstrukturen zu visualisieren, wurden
die Zellen mit DAPI für
10 Min. gegengefärbt.
-
Um
die Pankreas-ähnlichen
Inseln zu färben, wurden
die Zellen für
eine Stunde mit einem 1:100 verdünnten
Kaninchen-Anti-human-Glucagon-Antikörper (Dako Cytomations) markiert.
Nach dem Waschen wurden die Zellen, wie oben be schrieben, gefärbt. Die
Färbung
der Glucagon-spezifischen Antikörper
erfolgte unter Verwendung eines CY3-konjugierten Schwein-Anti-Kaninchen-Antikörpers. Das gleiche
Protokoll wurde ebenfalls zur Färbung
von MSC, EBS und CAPC mit Antikörpern
verwendet, die spezifisch waren für Oct-4 (Kaninchen, Polyclonal, Santa
Cruz) und FZD-9 (Kaninchen, Polyclonal, Acris). Ein TRITC-konjugierter
Schwein-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Dako
Cytomations) wurde verwendet, um die gefärbten Zellen unter einem Zeiss
Axiovert 200 Mikroskop unter Verwendung der Axiovision Software
zu visualisieren.
-
11. Identifizierung und/oder
Isolierung von MSC aus einer biologischen Probe
-
Eine
biologische Probe, von der angenommen wird, dass diese MSC enthält, beispielsweise eine
Suspension von humanem Knochenmarksgewebe oder von potentiellen
MSC-Primärzellen,
wird in einem geeigneten Puffersystem bereitgestellt. Die Identifizierung
bzw. Isolierung von MSC kann auf verschiedenen Wegen erfolgen, von
denen nachfolgend einige beschrieben werden.
-
(a) Mittels Fängermoleküle, die
gegen FZD-9 gerichtet und an Protein-A-Agarose gekoppelt sind.
-
Es
werden Fängermoleküle, die
gegen den humanen FZD-9-Rezeptor
gerichtet sind, an Trägermaterial
gekoppelt. Bei den Fängermolekülen kann es
sich um monoklonale Antikörper
handeln. Bei dem Trägermaterial
kann es sich beispielsweise um Protein-A-beschichtete Agarose handeln.
-
Die
gekoppelten Fängermoleküle werden
zu der biologischen Probe hinzugegeben. Diese Mischung wird für eine bestimmte
Zeit und unter solchen Bedingungen inkubiert, bei denen das Fängermolekül an MSC
binden kann. Im Speziellen bindet das Fängermolekül an einen Teil des FZD-9-Rezeptor,
der auf der Zelloberfläche
der MSC exprimiert wird, sofern diese in der Probe vorhanden sind.
-
Anschließend wird
die Mischung aus biologischer Probe mit gegebenenfalls sich darin
gebildeten Fängermolekül-MSC-Komplexen zentrifugiert.
Im Überstand
befinden sich Nicht-MSC-Bestandteile
der biologischen Probe sowie gegebenenfalls ungebundene MSC und
gegebenenfalls ungebundene Fängermoleküle. Im Pellet
befindet sich das Trägermaterial
mit gebundenem Fängermolekül, daran
ggf. gebundenen MSC. Der Überstand
wird abgenommen und ggf. verworfen. Das sedimentierte Trägermaterial
wird mit Waschpuffer gründlich
gewaschen und daraufhin analysiert, ob MSC gebunden haben.
-
(b) Mittels FACS-Sortierung
-
Fängermoleküle, die
gegen den humanen FZD-9-Rezeptor gerichtet sind, werden an einen
fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt, z.B. an Cy3. Bei den Fängermolekülen kann
es sich um monoklonale Antikörper
handeln.
-
Die
biologische Probe wird mit dem fluoreszenzmarkierten Fängermolekül inkubiert.
Anschließend
wird das Gemisch aus fluoreszenzgekoppelten Fängermolekülen und biologischer Probe
einer FACS-Sortierung unterzogen, wobei an den Anti körper gebundene
Zellen separiert werden. Die separierten Zellen werden dann auf
ihre MSC-Kapazität untersucht.
-
(c) Identifizierung von
MSC
-
Die
Identifizierung von MSC kann mittels des sogenannten CFU-F-Assays
erfolgen. Hier wird eine definierte Zahl vereinzelter und ggf. vom
Fängermolekül getrennter
Zellen in Kulturgefäße ausgesät und anschließend die
Kolonien wachsender MSC gezählt.
Der Fachmann kennt weitere bekannte Techniken, die sich zur Identifizierung
von MSC eignen.
-
Die
MSC stehen anschließend
für weitere Anwendungen,
z.B. im Tissue-Engineering, zur Verfügung.
-
II. Ergebnisse
-
1. Charakterisierung der
monoklonalen Antikörper gegen
FZD-9 und FZD-10
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Um
die FZD-Zelloberflächenexpression
zu analysieren, wurden monoklonale Antikörper gegen membrangebundenes
FZD-9 generiert, wie dies in den Methoden beschrieben ist. 1B zeigt, dass der monoklonale Antikörper W3C4E11
(IqM) und der monoklonale Antikörper
gegen humanes Frizzled-10 selektiv FLAG-positive HEK-293/huFZD-9-
bzw. HEK-293/huFZD-10-Zellen
(a-Flag), nicht aber HEK-293-Zellen, die mit leeren Vektoren transfiziert wurden
(Kontr.), erkennen. Die Spezifität
der monoklonalen Antikörper
wurde ferner durch deren Nicht-Reaktivität mit transfizierten Zellen
verifiziert, die nicht-verwandte FZD-Proteine exprimierten (nicht gezeigt).
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Die
exogene Frizzled-Rezeptor-Expression in HEK-293/ huFZD-9- und HEK-293/huFZD-10-Zellen
wurde ebenfalls durch Immunoblotting von SDS-PAGE-separierten Lysaten
dieser Zellen mit kommerziell verfügbaren Anti-Frizzled-Antiseren
bestätigt. 1C zeigt, dass nur transfizierte, nicht
aber parentale Zellen, eine detektierbare Expression von FZD-9-
bzw. FZD-10-Protein zeigen. Hiermit in Übereinstimmung wurde eine erhöhte exogene mRNA-Expression
von FZD-9 und FZD-10 (die Primer sind in 6A gezeigt)
in den transfizierten Zellen im Vergleich zu den parentalen Zellen
beobachtet (1D).
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2. Expression
von Stammzellmarkern auf bestimmten Zelltypen der Placenta
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Placentagewebeschnitte
wurden durch Immunhistochemie auf die Expression des embryonalen
Stammzellantigens SSEA-4 sowie des hämatopoetischen/neuralen/mesenchymalen
Stammzellmarkers CD318 und der potentiellen Stammzellmarker FZD-9
und FZD-10 untersucht. CD318 wurde hauptsächlich in Zellen von kleinen
placentalen Villi exprimiert (2A,
B). Eine positive Färbung
auf FZD-10 wurde in dem Syncytiotrophoblasten von Stamm-Villi als
auch von kleinem placentalen Villi beobachtet (2C,
D). Im Gegensatz zu FZD-10 zeigte FZD-9 eine starke Expression in
den parenchymatischen Zellen, die die großen Blutgefäße umgeben, und in der Gefäßmitte,
die doppelt mit einem Antikörper
gegen Glattmuskelactin (2E-G) gefärbt wurde.
Die Im munhistochemie für
den embryonalen Stammzellmarker SSEAj-4 zeigte eine starke Färbung des
Syncytiotrophoblasten als auch für
einzelne Zellen in dem Parenchym des Villus (2H-J).
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3. Generierung
von MSC
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Es
wurde ein Dreischrittverfahren ausgewählt, um BM- und neonatale Plazentazellen
in CAPC zur weiteren Differenzierung in reife Zellen zu differenzieren.
Diese drei Schritte beinhalten die Generierung von MSC aus Primärzellen,
gefolgt von der Formierung von Embryoidkörper-ähnlichen Strukturen (EBS),
und die Differenzierung in CAPC. Um MSC zu generieren, wurden Zellen
aus BM oder Plazenta auf Gelatine beschichteten Schalen in Gegenwart
von 5 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (b-FGF) kultiviert.
Nach sieben Tagen (Placenta) oder vierzehn Tagen (BM) der Kultivierung wurde
eine konfluente Schicht von fibroblastoiden Zellen festgestellt
(3A).
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Die
Analyse der Oberflächenmarkerexpression
zeigte, dass diese Zellen nicht nur die bekannten MSC-Marker CD13,
CD105, CD164 und CD318 exprimieren, sondern auch FZD-9, d.h. einen
Marker, der bislang nicht in primären Knochenmarkszellen gefunden
wurde (4A). Ferner exprimierten kultivierte
Zellen aus beiden Quellen den embryonalen Stammzellmarker SSEA-4,
was belegt, dass in der Tat MSC generiert wurden, die den natürlichen
MSC entsprechen. Interessanterweise zeigte das W8D2-Antigen eine
deutliche Expression auf den meisten MSC, die aus Knochenmark gewon nen
wurden, W8D2 konnte jedoch nur schwach auf den plazentalen Gegenstücken detektiert
werden.
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MSC
aus beiden Quellen waren negativ für CD34 und FZD-10. Die Expression
der embryonalen Stammzellmarker wurde bestätigt durch Immuncytochemie
für FZD-9
und Oct-4 (4A-H) und durch RT-PCR
für Oct-4,
Nanog, FZD-9, FZD-10 und Nestin (6B).
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Um
EBS zu generieren, wurden MSC für
vier Tage in Gegenwart von embryonalen Stamm(ES)-Zellmedium auf
Schalen mit extrem niedriger Adhärenz
ausplattiert und kultiviert. 3B zeigt,
dass die Zellen große
Aggregate von runden Zellen mit entsprechender Struktur bildeten,
wie diese für
ES-zellabgeleitete Embryoid-Körper
(EBs) beschrieben werden. Diese Zellen exprimierten Nanog- und Oct-4-mRNA
(6B). In der Placenta war die Nestin-Expression
in MSC sehr stark, jedoch nahezu abwesend in EBS, aber wiederum
verstärkt
in CAPC. In BM war die Nestin-Expression stark in MSC, mit einer
starken Abnahme nach der Differenzierung in EBS und abwesend bei
weiterer Kultivierung in CAPC. Ein vergleichbares Expressionsmuster
wurde für
FZD-9 beobachtet, während
die FZD-10-mRNA sehr schwach während
sämtlicher
Stadien exprimiert wurde. Durchflusscytometrische Analysen ergaben ferner,
dass diese Zellen CD318, FZD-9, CD105, CD13, CD164 und SSEA-4, nicht
aber CD34 auf der Oberfläche
exprimierten (4B). Trotz der Tatsache,
dass auf mRNA-Ebene FZD-10 exprimiert wurde, konnte keine FZD-10-Proteinexpression
auf der Zelloberfläche
detektiert werden.
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Zur
Generierung von CAPC wurden EBS für sechs Tage in Gegenwart von
serumfreiem, IST-Zusatz-enthaltendem ES-Cult®-Medium
kultiviert. 3C zeigt Zellen mit mesenchymaler
Morphologie, die sich von den EBS ausbreiten. Entsprechend zu den
EBS exprimieren diese Zellen Oct-4- und Nanog-mRNA (6B),
und die Oberflächenmarkeranalyse
ergab eine reduzierte Expression von SSEA-4 und FZD-9 auf CAPC (4C).
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4. Differenzierung von
CAPC in mesodermale, endodermale und ectodermale Zellen
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Das
oben beschriebene Dreischritt-Verfahren zur Bildung von CAPC aus
primärem
BM- und Placentazellen bildete die Basis für die mesodermalen, endodermalen
und ectodermalen Differenzierungslinien. Um die mesodermale Differenzierungskapazität zu demonstrieren,
wurden CAPC dazu induziert, um Zellen der Adipocytenlinie und osteoblastenähnliche
Zellen hervorzubringen. 7A zeigt, dass
die Kultivierung von CAPC für
zehn Tage in OsteoDiffTM-Medium in der Formierung
von osteoblastenähnlichen
Zellen mit deutlicher Färbung
der Phosphataseaktivität
mit BCIP/NBT-Substrat
resultiert. Hierzu im Gegensatz brachten CAPC, die für achtzehn
Tage in Gegenwart von AdipoDiffTM-Medium kultiviert
wurden, funktionelle Adiopocyten hervor, wie sich dies aus deren
Kapazität
zur Aufnahme von Oil-Red-O-Farbstoff
ergab (7B).
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Um
die ectodermale Differenzierungskapazität zu studieren, wurden CAPC
in neurale Linien getrieben. Die Formierung von Zellen, die die
neuronen- und astrocytenspezifischen Marker exprimieren, wurden
nach der Kultivierung von CAPC in Gegenwart von NeuroCult®-neuronalem
Proliferations- und Differenzierungsmedium analysiert. 7C zeigt, dass die meisten der Zellen
positiv für
den Astrocytenmarker Gliales Fibrilläres Azidisches Protein (GFAP)
waren, während
wenige Zellen mit dem neuronalen Klasse-III-β-Tubulin gefärbt wurden (7D).
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Die
endodermale Differenzierung wurde untersucht, indem die CAPC zur
Reifung in pankrea-ähnliche
Inseln induziert wurden. Um dies zu erreichen, wurde CAPC zuerst
in einem bFGF-enthaltenden pankreatischen Proliferationsmedium und dann
in einem Nicotinamid-enthaltenden pankreatischen Differenzierungsmedium
kultiviert. 7E zeigt das Ausbreiten
von adhärenten
Zellen nach der Behandlung mit pankreatischem Proliferationsmedium.
Nach der weiteren Differenzierung mit pankreatischem Differenzierungsmedium
wurde die Formierung von pankreatischen inselähnlichen Strukturen beobachtet
(7F). Die Färbung von pankreaähnlichen
Inseln mit glucagonspezifischen Antikörpern ergab die Expression
von Glucagon in diesen Zellen (7G-H).
Zusammengefasst, konnte demonstriert werden, dass MSC in einem frühen Differenzierungsstadium,
die aus Placenta und BM-gewonnen wurden, über die Stufe der CAPC Zelllinien
einer jeden Keimbahnlinie hervorbringen können.