DE102006011911A1

DE102006011911A1 - Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen über Frizzled-9

Info

Publication number: DE102006011911A1
Application number: DE200610011911
Authority: DE
Inventors: Hans-Jörg Dr. Bühring
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date: 2006-03-08
Filing date: 2006-03-08
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2026-03-09
Also published as: DE102006011911B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und/oder Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen (MSC) aus einer biologischen Probe und die Verwendung eines Fängermoleküls zur Isolierung und/oder Identifizierung von MSC aus einer biologischen Probe.

Description

Stammzellen sind undifferenzierte Zellen, welche die Fähigkeit besitzen, sich selbst zu erneuern und in unterschiedliche Effektorzellen zu differenzieren. Aufgrund dieser Eigenschaften gehören sie zu den vielversprechendsten Forschungsobjekten der biomedizinischen Forschung und nähren die Hoffnung, in Zukunft im Rahmen der sogenannten Stammzelltherapie Gewebe bzw. ganze Organe regenerieren zu können.

Je nach Herkunft werden embryonale Stammzellen und adulte Stammzellen voneinander unterschieden.

Embryonale Stammzellen werden aus der inneren Zellmasse des Blastocysten-Stadiums eines Säugetier- oder eines menschlichen Embryos gewonnen. Sie können sich unbegrenzt teilen und sich theoretisch zu jedem Zelltyp der ca. 200 Gewebearten des Menschen entwickeln. Bei der Gewinnung embryonaler Stammzellen aus dem Blastocysten im Rahmen der Stammzellforschung kommt es häufig zu ethischen Konflikten, da der Tod des Embryos in Kauf genommen werden muss.

Hierzu im Gegensatz ist die Forschung an adulten Stammzellen ethisch völlig unbedenklich, da diese aus adulten Organismen gewonnen werden können. Adulte Stammzellen wurden bisher in mindestens 20 Geweben des Menschen entdeckt. Ihre Aufgabe ist es, für die entsprechenden Gewebe Ersatzzellen zu bilden. Im Vergleich zu embryonalen Stammzellen galten sie bisher als begrenzt teilungs- und entwicklungsfähig: Es wurde angenommen, dass adulte Stammzellen eines bestimmten Gewebes keine Zelltypen eines anderen Gewebes bilden können. In letzter Zeit häufen sich jedoch die Erkenntnisse, dass auch adulte Stammzellen über ein wesentlich höheres Entwicklungspotential verfügen, als bisher angenommen. So wird mittlerweile in Fachkreisen weitgehend die Auffassung vertreten, dass auch adulte Stammzellen verschiedenste Differenzierungswege einschlagen können.

Zu den adulten Stammzellen zählen auch die sogenannten mesenchymalen Stammzellen (MSC). MSC finden sich in einer Vielzahl von Geweben und Organen, wie der Leber, der Niere, der Placenta, im Fettgewebe, im Nabelschnurblut, sowie im Knochenmark. MSC stellen aufgrund ihres mesenchymalen Differenzierungspotentials und ihrer guten In-vitro-Expansionseigenschaften eine attraktive Zellpopulation für den Ersatz mesenchymaler Gewebe im Rahmen des sog. Tissue-Engineerings dar. MSC lassen sich in vitro in Knorpel, Knochen, Sehnen und Fettzellen differenzieren. Dreidimensional auf unterschiedlichen Trägersubstanzen kultiviert wurden MSC bereits in vielen Studien im Klein- und Großtiermodell erfolgreich zum Ersatz mesenchymaler Gewebe eingesetzt. Auch eine klinische Anwendung von MSC am Menschen wurde bereits in Pilotstudien erfolgreich erprobt.

Die Isolation humaner MSC aus einer biologischen Probe basiert bis heute auf dem Selektionsfaktor der Kunststoffadhärenz und auf charakteristischen Medienbedingungen; vgl. Pittenger et al. (1999), Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells, Science 284, Seiten 143–147, Reyes (2001), Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells, Blood 98, Seiten 2615–2625.

Die zur Isolation von MSC aus einer biologischen Probe bislang im Stand der Technik verwendeten Protokolle, die gegenüber denen, die derzeit zur Isolation von hämatopoetischen Stammzellen verwendet werden, wesentliche Unterschiede aufweisen, führen nachteiligerweise zu unterschiedlichen MSC-Populationen. Folglich zeigen derart gewonnene MSC-Zellen unterschiedliche Charakteristika, z.B. bezüglich ihrer Proliferation und Matrixsynthese und sind deshalb für das Tissue-Engineering nur wenig geeignet; vgl. Niemeyer et al. (2003), Vergleich zweier Isolationsverfahren zur Gewinnung humaner mesenchymaler Stammzellen aus Knochenmark, Z. Orthop. 141, Seite 129.

Protokolle zur Isolierung und Identifizierung von MSC, die vorstehend genannte Nachteile nicht aufweisen, fehlen insbesondere deshalb, da bis heute zuverlässige MSC-Marker fehlen. So wurde vor einigen Jahren STRO-1 als vielversprechendes Oberflächenantigen zur Identifizierung der MSC diskutiert, inzwischen jedoch wurde seine Bedeutung wieder relativiert; vgl. Dennis et al., The STRO-1+ marrow cell population is multipotential, Cells Tissues Organs 170, Seite 7–82. Auch das kürzlich als MSC-Marker beschriebene Antigen W8B2 von unbekannter Identität zeigt eine heterogene Expression auf MSC-Populationen; vgl. Vogel et al. (2003) Heterogenity among human bone marrowderived mesenchymal stem cells and neuroprogenitor cells, Haematologica 88, Seiten 126–133.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb ein zuverlässiges Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von MSC bereitzustellen, bei dem die vorstehenden Nachteile aus dem Stand der Technik behoben werden. Insbesondere soll ein solches Verfahren bereitgestellt werden, bei dem die Identifizierung und Isolierung über einen natürlichen und spezifischen MSC-Marker erfolgt.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Isolierung und/oder Identifizierung von MSC aus einer biologischen Probe gelöst, das folgende Schritte aufweist, nämlich: (a) Bereitstellen einer biologischen Probe, (b) Inkubation eines für einen MSC-Marker spezifischen Fängermoleküls mit der biologischen Probe, um einen Fängermolekül-MSC-Komplex zu bilden, (c) Isolierung und/oder Identifizierung eines Fängermolekül-MSC-Komplexes, wobei es sich bei dem MSC-Marker um den Wnt-Rezeptor Frizzled-9 (FZD-9) handelt.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.

Wie die Erfinder überraschend feststellen konnten, exprimieren MSC den Wnt-Rezeptor FZD-9. Diese Erkenntnisse wurden durch Arbeiten an MSC mit unreifem Phänotyp gewonnen, die aus Knochenmark sowie aus nicht-amniotischer Placenta gewonnen wurden. Ferner stellten die Erfinder fest, dass sich dieser neue MSC-Marker nicht nur zur Identifizierung von MSC sondern auch zur Isolierung von MSC aus einer biologischen Probe eignet. Dabei erfolgt die Isolierung über die Wechselwirkung eines FZD-9-spezifischen Fängermoleküls mit den von den MSC exprimierten FZD-9-Rezeptoren, wobei die MSC dann im Komplex mit den Fängermolekülen von der biologischen abgetrennt werden.

Die Eignung von FZD-9 zur Isolierung und/oder Identifizierung von MSC war deshalb so überraschend, da Frizzled-Proteine allgemein im Stand der Technik bislang in anderem Zusammenhang beschrieben werden.

Die Proteine der Frizzled (FZD) Familie gehören zu einer Gruppe von Rezeptoren, die sieben Transmembranabschnitte aufweisen. Die FZD-Proteine werden durch sogenannte Wnt-Faktoren aktiviert, die eine Familie von extrazellulär-sektretierten Signalmolekülen bilden. Die N-terminale extrazelluläre cysteinreiche Domäne von FZD wurde dabei als Wnt-Bindedomäne identifiziert.

Wnt/FZD-Proteine spielen eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung von Metazoen. Sie regulieren verschiedenste Entwicklungsprozesse, wie die Spezifizierung, Proliferation, Migration und Polarität der Zelle. Gepaart mit den „low-density lipoprotein like"-Rezeptoren 5 und 6 vermitteln FZD-Proteine zumindest drei Wnt/FZD-Signalwege. In einen dieser Signalwege ist das Protein β-Catenin involviert. Dieser sog. β-Catenin-Signalweg induziert die Regulation der Transkription verschiedener Zielgene, einschließlich c-Myc, Cyclin D1, Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), Immunglobulintranskriptionsfaktor 2 (ITF-2). Der die planare Zellpolarität regulierende Signalweg wird durch Wnt-Bindung via GTPase und Aktivierung der c-Junaminoterminalen Kinase (JNK) induziert, was zur Steuerung der morphogenetischen Zellbewegung führt. Der Ca²⁺-Signalweg aktiviert die Phospholipase Cβ und erhöht den intrazellulären Ca²⁺-Spiegel, was in der Aktivierung der Proteinkinase C, der Ca²⁺-calmodulinabhängigen Proteinkinase II und von Calcineurin resultiert, wodurch das zelluläre Schicksal und der Adhäsionsprozess beeinflusst wird. Eine Übersicht über die Wnt/FZD-Signalwege findet sich in Huang und Klein (2004), The Frizzled family: receptors for multiple signal transduction pathways, Genome Biol. 5, Seiten 234–241.

Das humane FZD-9-Gen, ursprünglich als FZD-3 bezeichnet, liegt in der genetisch definierten 1,4 Mb-Region auf dem Chromosom 7g11.23. Das humane FZD-9-Protein besteht aus 591 Aminosäuren.

Kürzlich veröffentlichte Experimente, in denen Mäuse mit einer FZD-9-Knock-Out-Mutation hergestellt wurden, deuten auf eine Rolle von FZD-9 im blutbildenden System hin; vgl. Ranheim et al. (2005), Frizzled 9 knock-out mice have abnormal B-cell development, Blood 105, Seiten 2487–2494.

Wang et al. (1997) beschreiben in "A novel human homologue of the Drosophila frizzled wnt receptor gene binds wingless protein and is in the Williams syndrome deletion at 7g11.23", Hum. Mol. Genet. 6, Seiten 465–472, hingegen, dass FZD-9 in einer Vielzahl von verschiedensten humanen Geweben exprimiert wird, wie beispielsweise im Gehirn, aber auch im Skelettmuskel, in den Nieren, den Augen und den Hoden.

Ferner beschreiben Zhao und Pleasure (2004), Frizzled-9 promoter drives expression of transgenes in the medial wall of the cortex and its chief derivative the hippocampus, Genesis 40, Seiten 32–39, die weit über das Gehirn verbreitete Expression von FZD-9, bspw. in der medialen Wand des Cortex, dem Telencephalon, dem Hippocampus und weiteren Bereichen des Mausgehirns.

In der nicht-veröffentlichten deutschen Patentanmeldung DE 10 204 059 620 werden Daten präsentiert, nach denen FZD-9 in verschiedensten unterschiedlichen Zelltypen exprimiert wird, wie bspw. in Leukämiezellen, Retinoblastomzellen oder embryonalen Karzinomzellen.

In der weiteren nicht veröffentlichten Patentanmeldung DE 2005 023 740 werden Experimente beschrieben, nach denen FZD-9 in Astrozytomzellen exprimiert wird.

Es wurde deshalb bislang angenommen, dass es sich bei FZD-9 um ein ubiquitäres Protein handelt, das als Marker zur Identifizierung und/oder Isolierung von MSC gänzlich ungeeignet ist.

Der erfindungsgemäße MSC-Marker ist, wie erwähnt, FZD-9. Hierunter fällt sowohl das FZD-9-Protein als auch ein Teilprotein von FZD-9, wie beispielsweise die extrazelluläre Domäne von FZD-9, aber auch ein anderes sich von dem FZD-9-Protein ableitendes Protein oder Peptid, solange dies von dem Fängermolekül spezifisch gebunden wird.

Die 591 Aminosäuren umfassende Proteinsequenz der humanen Variante von FZD-9 ist im Stand der Technik bekannt und beispielsweise unter der Zugriffsnummer NM 003499 oder AH26333 der NCBI-Datenbank entnehmbar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov./). Diese Sequenzinformationen sind durch Inbezuqnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Erfindungsgemäß wird unter einem Fängermolekül ein Stoff verstanden, der selektiv und spezifisch mit FZD-9 wechselwirken kann. Dies kann durch direktes Kontaktieren von FZD-9 erfolgen. Die spezifische und selektive Wechselwirkung kann aber auch indirekt mit FZD-9 erfolgen, beispielsweise über Kontaktieren von mit FZD-9 wechselwirkenden Faktoren, wie dem Wnt-Protein.

Unter eine solches Fängermolekül fallen im Sinne der Erfindung deshalb bspw. Bindeproteine, wie monoklonale oder polyklonale Antikörper, die gegen FZD-9 gerichtet sind. Alternativ können als Fängermoleküle auch Abschnitte derartiger Antikörper verwendet werden, die für die Wechselwirkung mit FZD-9 verantwortlich sind. Hierunter fallen sog. Fab-Fragmente und sog. scFv- Fragmente. Ein Fab-Fragment enthält die variable Domäne der schweren und leichten Kette und die angrenzenden konstanten Domänen C_H1 und C_L, verbunden durch eine Disulfidbrücke, die natürlicherweise diese beiden Ketten zusammenhält. Ein scFv-Fragment besteht aus dem Fv-Fragment, d.h. der kleinsten Antikörperdomäne, die für die Affinität des gesamten Antikörpers für das Antigen (mit-)verantwortlich ist, und einem stabilisierenden Linker-Polypeptid. Die Spezifitäten und Selektivitäten von solchen Fab- und scFv-Fragmenten sind identische mit jenen des gesamten Antikörpers. Allerdings können Antikörperfragmente wesentlich einfacher und damit kostengünstiger, bspw. in mikrobiellen Expressionssystemen hergestellt werden.

Ein geeignetes Fängermolekül stellt auch ein sogenanntes Aptamer dar, das im vorstehenden Sinne in der Lage ist, spezifisch und selektiv an FZD-9 zu binden. Bei einem Aptamer handelt es sich um eine über eine im Stand der Technik bekannte in-vitro-Evolution gewonnene Nukleinsäuremolekülart, die in ihren Bindeeigenschaften mit hochselektiven monoklonalen Antikörpern vergleichbar ist.

Je nach Herkunft der biologischen Probe kommt als Fängermolekül vorzugsweise ein solches in Frage, das gegen FZD-9 gerichtet ist, das den gleichen Ursprung hat, wie die biologische Probe. D.h. sollen MSC aus einer biologischen Probe humanen Ursprungs isoliert bzw. identifiziert werden, wird als Fängermolekül vorzugsweise ein solches eingesetzt, das selektiv und spezifisch die humane Variante von FZD-9 bindet. Entsprechendes gilt für MSC tierischen Ursprungs, wobei dann ein Fängermolekül eingesetzt wird, das selektiv und spezifisch die jeweilige tierische Variante von FZD-9 bindet.

Erfindungsgemäß umfasst eine biologische Probe jedes beliebige biologische Material tierischen oder humanen Ursprungs, das auf das Vorhandensein von MSC untersucht werden soll bzw. aus dem MSC isoliert werden sollen. Dabei kann es sich um ein Gewebeverband, eine Zellsuspension oder aber auch um Organe, Organteile oder um Organismen handeln. Beispiele für biologische Proben umfassen Knochenmarkgewebe und Knochenmarkzellen, Knorpelzellen und Knochenzellen, Fettgewebe und Fettzellen, Lebergewebe und Leberzellen, Placentagewebe und Placentazellen, peripheres und Nabelschnurblut etc.

Die Inkubation des Fängermoleküls mit der biologischen Probe kann in jedem dem Fachmann bekannten System bzw. Medium erfolgen, das die Bildung eines Komplexes aus Fängermolekül und MSC ermöglicht. Beispiele hierfür sind Puffersysteme, die dem Fachmann bekannt sind und routinemäßig beispielsweise bei Immunassays verwendet werden, z.B. bei dem Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), der Durchflusszytometrie (FACS), etc.

Unter Identifizierung von MSC wird erfindungsgemäß die Feststellung verstanden, dass sich ein Komplex aus Fängermolekül und MSC gebildet hat. Dies erfolgt mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren von immunologischer, histologischer, bildgebender oder mikroskopischer Art.

Unter Isolierung von MSC wird erfindungsgemäß verstanden, dass ein Komplex aus Fängermolekül und MSC von der biologischen Probe getrennt wird. Wenn gewünscht, kann anschließend auch der Komplex in MSC und Fängermolekül getrennt werden Dies erfolgt mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren. Das Fängermolekül kann bspw. an ein Trägermaterial gekoppelt sein, was die Handhabung des Fängermoleküls erleichtert und eine Zentrifugation des Letzteren ggf. mit daran gebundenen MSC und die Trennung des Komplexes aus Fängermolekül und MCS von der biologischen Probe ermöglicht.

Nach einer bevorzugten Weiterbildung erfolgt nach dem Schritt (b) der weitere Schritt (b1), in dem der gebildete Fängermolekül-MSC-Komplex von ungebundenen Bestandteilen der biologischen Probe und ungebundenen Fängermolekülen separiert wird.

Durch diese Maßnahme wird auf bevorzugte Art und Weise die Isolierung des Komplexes realisiert und Kontaminanten, wie ungebundene Fängermoleküle, ungebundenen weitere Bestandteile der biologischen Probe und ggf. ungebundene MSC von den gewünschten MSC abgetrennt.

Dabei ist es bevorzugt, wenn es sich bei den MSC um solche mit unreifem Phänotyp handelt.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass MSC in einem sehr frühen Differenzierungsstadium isoliert und/oder identifiziert werden. Erfindungsgemäß sind MSC mit unreifem Phänotyp dadurch charakterisiert, dass sie neben FZD-9 auch embryonale Stammzellmarker wie SSEA-4, Oct-4 und nanog exprimieren. Solche MSC zeichnen sich durch ihr besonders hohes Entwicklungspotential aus und können verschiedenste Differenzierungswege einschlagen. Unreife MSC stellen damit ein Repertoire für unterschiedliche Gewebetypen dar. Wie die Erfinder feststellen konnten, lassen sich nämlich diese unreifen MSC bspw. in funktionelle Adipocyten, osteoblasten-ähnliche Zellen, Glucagon-exprimierende pankreati sche inselähnliche Zellen, sowie in neural-ähnliche Zellen differenzieren.

Dabei ist es bevorzugt, wenn das Fängermolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Antikörper, Antikörperfragment, Aptamer, natürlicher Ligand (Wnt) sowie einem Fragment hiervon.

Wie weiter oben erwähnt, handelt es sich bei diesen Substanzen um besonders geeignete Fängermoleküle, die bei der Verwendung im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zu besonders guten Ergebnissen führen. Ein geeigneter polyklonaler Antikörper, der als Fängermolekül verwendet werden kann, ist bspw. der polyklonale α-FZD-9-Antikörper der Firma Acris Antibodies GmbH, Hiddenhausen, Deutschland (Katalog Nr. SP4135P).

Vorzugsweise wird als Fängermolekül der monoklonale Antikörper verwendet, der von der nach dem Budapester Vertrag am 15. Juli 2004 bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Deutschland, unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegten Hybridomzelle W3C4E11 produziert wird.

Dieser Antikörper hat sich als besonders selektiv für die humane Variante von FZD-9 herausgestellt und ist deshalb ein erfindungsgemäß besonders geeignetes Fängermolekül.

Vorzugsweise ist das Fängermolekül an eine Trägersubstanz gekoppelt, bei der es sich vorzugsweise um Agarose oder Sepharose handeln kann.

Derartige Materialien haben sich zur Immobilisierung von Fängermolekülen als besonders geeignet erwiesen. Die Kopplung erfolgt vorzugsweise über ein zwischengeschaltetes bakterielles Protein, wie beispielsweise Protein A, Protein G oder Protein L, die einerseits die konstanten Regionen (Fc) von Antikörpern binden, und andererseits sich leicht an die Trägersubstanz Agarose bzw. Sepharose koppeln lassen. Eine derartige Kopplung von Antikörpern an eine Trägersubstanz ist beispielsweise beschrieben in Ed Harlow und David Lane (1988), Antibodies: A laboratory manual; der Inhalt dieser Publikation ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Dabei ist es bevorzugt, wenn das Fängermolekül mit einem detektierbaren Marker gekoppelt ist.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Identifizierung des Komplexes aus Fängermolekül und MSC erleichtert wird. Erfindungsgemäß wird unter einem Marker jede Verbindung verstanden, mittels derer eine Lokalisierung und Identifizierung des Komplexes in vitro, in vivo oder in situ möglich ist. Hierzu zählen Farbindikatoren, wie Farbstoffe, mit fluoreszierenden, phosphoreszierenden oder chemilumineszierenden Eigenschaften, AMPPD, CSPD, radioaktive Indikatoren, wie ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴C, ³H, nicht radioaktive Indikatoren, wie Biotin oder Dioxigenin, alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, etc. Der Nachweis solch markierter Fängermoleküle erfolgt dann über im Stand der Technik bekannte bildgebende Verfahren, wie Autoradiographie, Blotting-, Hybridisierungs- oder Mikroskopietechnike.

Der Fängermolekül-MSC-Komplex wird bevorzugt mittels immunologischer Verfahren, wie dem ELISA identifiziert.

Dieses Verfahren hat sich als besonders effektives und einfach durchführbares Trennverfahren von Antigen-Antikörper-Komplexen aus einem Inkubationsmedium etabliert. Bei diesem Verfahren ist entweder der Antikörper oder aber das Antigen mit einem Enzym markiert, das einen colorimetrischen Nachweis erlaubt, üblicherweise mittels alkalischer Phosphatase oder Peroxidase.

Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zur Identifizierung des Fängermolekül-MSC-Komplexes ist die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung bzw. Durchflusscytometrie (FACS).

Bei der FACS-Sortierung werden die FZD-9 tragenden MSC mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers erkannt, der gegen FZD-9 gerichtet ist und seinerseits mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert ist. Die biologische Probe bzw. Zellsuspension wird durch eine dünne Kanüle geführt, deren Strahl am Ende durch Vibration in einzelne Tropfen aufgelöst wird. Wenn ein Tropfen eine MSC enthält, die den markierten Antikörper gebunden hat, wird der Marker durch einen Laserstrahl zur Fluoreszenz angeregt. Diese Fluoreszenz kann mit einem Lichtdetektor gemessen und zur Auftrennung der Zellen benutzt werden. Dazu werden die Zellen mittels eines elektrischen Impulses je nach Fluoreszenzintensität aufgeladen und beim Passieren eines elektrischen Feldes entsprechend gelenkt und sortiert.

Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zur Identifizierung des Fängermolekül-MSC-Komplexes ist der CFU-F-Assay.

Bei diesem Verfahren werden die an das Fängermolekül gebundenen Zellen in Kulturgefäße ausgesät und anschließend die Kolonien wachsender MSC gezählt. Dazu wird vorzugsweise der Komplex aus Fängermolekül und Zelle bzw. MSC aufgelöst, d.h. die Zellen werden von dem Fängermolekül befreit.

Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Fängermoleküls, das an einen Marker für MSC bindet, zur Isolierung und/oder Identifizierung von MSC aus einer biologischen Probe, wobei es sich bei dem Marker um FZD-9 handelt.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Nachfolgend werden bevorzugte Ausführungsbeispiele beschrieben, die den alleinigen Zweck der Illustrierung der Erfindungsgegenstände haben und die Tragweite der Erfindung keinesfalls einschränken. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Abbildungen. Diese zeigen Folgendes:

1 Vektorkonstruktion und Transfektion von HEK-293-Zellen mit plRES2-EGFP-Si-F-FZD-9/FZD-10. (A) Vektorkonstrukte, die für die Expression von FZD-9- und FZD-10-Rezeptoren in HEK-293-Zellen verwendet wurden, basieren auf plRES-EGFP (Clontech). Das Konstrukt enthält sowohl eine N-terminale Signalsequenz für die Membraninsertion als auch einen FLAG-Tag. HEK-293-Zellen wurden entweder mit plRES2-EGFP-Si-F-FZD-9 oder mit plRES2-EGFP-Si-F-FZD-10 transfiziert. (B) FACS-Analyse der transfizierten Zellen. Die Zellen wurden entweder mit einem Anti-FLAG- oder einem Anti-FZD-Antikörper markiert und mit einem sekundären PE-konjugierten Anti-Maus-Antikörper gefärbt. Nach dem Waschen wurden die Zellen auf einem FACSCalibur-Durchflusscytometer unter Verwendung der Cellquest-Software analysiert. Festzustellen ist eine spezifische Reaktion des gegen FZD-9 gerichteten monoklonalen Antikörpers (W3C4) und des gegen FZD-10-gerichteten monoklonalen Antikörpers mit den jeweils transfizierten Zelllinien. (C) Die exogene Frizzled-Rezeptor-Expression in HEK-293-huFZD-9- und HEK-293-huFZD-10-Zellen wurde durch einen Immunoblot der mittels SDS-PAGE-separierten Lysate dieser Zellen (transfiziert mit 1 μg, 2 μg und 4μg von FZD-9 und FZD-10 enthaltenden Plasmide) mit kommerziell erhältlichen Anti-FZD-Antiseren und Anti-FLAG-Antikörpern bestätigt. Die Figur zeigt eine detektierbare Expression von FZD-9 oder FZD-10 nur in transfizierten, nicht aber in parentalen Zellen. (D) RT-PCR-Analyse von FZD-9 und FZD-10 in parentalen und transfizierten HEK-293-Zellen. Die tranfizierten Zellen zeigen einen Anstieg der mRNA-Expression von FZD-9 bzw. FZD-10.

2 Charakterisierung von Placentagewebe durch Immunhistochemie. (A) Immunhistologische Färbung von CD318 an acetonfixierten Cryostatschnitten. Positive Zellen wurden hauptsächlich im Parenchym von kleinen Placenta-Villi angefärbt; Stern: Blutgefäß; Maßstabsbalken: 100 μm. (B) Höhere Vergrößerung von Teilabbildung (A). Die Pfeile zeigen auf CD318 positive Zellen; Maßstabsbalken: 25 μm. (C) Immunhistologische Färbung von FZD-10 auf einem Parafinschnitt, V: Villi; IS: Zwischenvillusraum; SV: Stammvillus; Maßstabsbalken: 100 μm. (D) Höhere Vergrößerung von Teilabbildung (C); die Pfeile zeigen auf FZD-10 positive Syncytiotrophoblasten; Stern: Blutgefäß; Maßstabsbalken 25 μm. (E) Kombinierte Immunfärbung von FZD-9 und Glattmuskel-Actin an acetonfixierten Cryostatschnitten. Die Pfeile zeigen auf gefärbte Bereiche, die ein großes Blutgefäß umgeben; Maßstabsbalken 200 μm. (F) Höhere Vergrößerung von Teilabbildung (E); starke Färbung des mittleren Bereichs eines Blutgefäßes und der das Gefäß umgebenden Zellen (Pfeil); die Pfeilspitze markiert die für den glatten Muskel positive Blutgefäßmitte; Maßstabsbalken: 100 μm. (G) Hohe Vergrößerung der FZD-9 gefärbten Zellen (Pfeil) in dem Parenchym eines kleinen Villus; Stern: Blutgefäß; Maßstabsbalken: 25 μm. (H) Immunhistologische Färbung von SSEA-4 auf acetonfixierten Cryostatschnitten. Festzustellen ist die positive Färbung des Syncytiotrophoblast (Pfeil); Stern: Blutgefäß; Maßstabsbalken: 50 μm. (I) Höhere Vergrößerung der Teilabbildung (H). Starke Färbung des Syncytiotrophoblast und einzelnen Zellen im Parenchym des Villus (Pfeilspitze); Stern: Blutgefäß; Maßstabsbalken: 25 μm. (J) Hohe Vergrößerung des SSEA-4 positiven Syncytiotrophoblasten in dem kleinen Villus; Stern: Blutgefäß; Maßstabsbalken: 25 μm.

3: Morphologie von MC- und Plazenta-abgeleiteten MSC, EBS und CAPC. (A) Aus Knochenmark (BM) oder aus Placenta gewonnene MSC wurden auf Gelatine-beschichteten Schalen in Gegenwart von 5 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (b-FGF) für 7 Tage (Placenta) oder für 14 Tage (BM) kultiviert. Man beachte die halb-konfluente Schicht von fibroblastoiden, spindelförmigen Zellen. (B) Embryoidkörper-ähnliche Strukturen (EBS), die aus MSC gewonnen wurden, wurden für 4 Tage in Gegenwart von embryonalen Stamm(ES)-Zellmedium auf Platten mit extrem niedriger Adhärenz kultiviert. Die Zellen bildeten große Aggregate mit ähnlicher Struktur, wie diese für Embryoidkörper beschrieben wurden. (C) CAPC, die aus EBS gewonnen wurden, wurden für sechs Tage in Gegenwart von serumfreiem, IST-Zusatz enthaltendem ES-Cult-Medium kultiviert. Man beachte die mesenchymale Morphologie der Zellen, die sich von den EBS ausbreiten.

4 Expression der Oberflächenmarker auf MSC, EBS und CAPC. Die Zellen wurden mit den angegebenen Antikörpern markiert und mit einem Sekundär-PE-konjugiertem Anti-Maus-Antikörper gefärbt. Nach dem Waschen wurden die Zellen auf einem FACSCalibur Durchflusscytometer unter Verwendung der Cellquest Software analysiert. (A) MSC; (B) EBS; (C) CAPC.

5 Immuncytochemische Analyse von Oct-4- und FZD-9-Proteinexpression in MSC. Zur Färbung von MSC, die sich von BM (Teilabbildung A-D) und von Placenta (Teilabbildung E-H) ableiten, wurden die Zellen über Nacht mit Antikörpern inkubiert, die spezifisch waren für Oct-4 und FZD-9. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit einem TRITC-konjugierten Schwein-Anti- Kaninchen-Sekundär-Antikörper gefärbt und auf einem Zeiss Axiovert 200-Mikroskop unter Verwendung der Axiovision Software visualisiert. Die Teilabbildungen (B), (D), (F) und (H) zeigen eine höhere Vergrößerung (Maßstabsbalken: 25 μm) der Teilabbildungen (A), (C), (E) bzw. (G) (Maßstabsbalken: 50 μm).

6 RT-PCR-Analyse der mRNA-Expression in MSC, EBS und CAPC. (A) Primersequenzen für Oct-4, Nestin und Nanog sind beschrieben in Miki et al. (2005), Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells, stem cells 23, S. 1549–1559; die Primersequenzen von FZD-10 sind beschrieben in Etheridge et al. (2004), Expression profiling and functional analysis of wnt signalling mechanisms in mesenchymal stem cells, Stem Cells 22, Seiten 849–860. FZD-9- und GAPDH-Primer wurden aus den Genbanksequenzen ID NM_003508 bzw. NM 003499 sowie BT006893 abgeleitet. (B) Primäre BM- und Placentazellen oder kultivierte Zellen (MSC, EBS und CAPC) wurden auf die mRNA-Expression von FZD-9, FZD-10, Oct-4, Nanog und Nestin analysiert. Die Expression von GAPDH wurde durchgeführt, um das identische Laden von cDNA zu demonstrieren. Die rechten Spuren stellen Wasserkontrollen dar. Die Produkte wurde über ein 1%-iges Agarosegel separiert und die resultierenden DNA-Banden wurden auf einem Vilber Lourmat UV-Transilluminator (Vilber Lourmat) visualisiert.

7 Differenzierung von CAPC in Zellen verschiedener Keimbahnen. (A) Für die osteogene Differenzierung wurden CAPC für 10 Tage in OsteoDiff^TM-Medium kultiviert. Die resultierenden osteoblasten-ähnlichen Zellen wurden durch ihre markante Färbung der Phosphatase-Aktivitäten mit dem BCIP/NBT-Substrat identifiziert. (B) Zur adipogenen Differenzierung wurden die CAPC für 18 Tage in Gegenwart von AdipoDiff^TM-Medium kultiviert. Funktionelle Adipocyten zeigen die Aufnahme von Oil-Red-O-Farbstoff (siehe Teilabbildung). (C, D) Die Bildung von neuronenähnlichen und astrocytenähnlichen Zellen wurde durch das Kultivieren CAPC in Gegenwart von NeuroCult^®-Medium für die neuronale Proliferation und Differenzierung analysiert. (C) Offenbart Zellen mit Astrocytenmorphologie, die positiv sind für das glial-fibrilläre-acidische-Protein (GFAP); Maßstabsbalken: 25 μm. (D) Zeigt die Färbung von Zellen mit einem Antikörper gegen neuronales β-Tubulin-III; Maßstabsbalken: 25 μm. (E, H) Zur pankreatischen Differenzierung wurden CAPC zuerst in einem Medium zur pankreatischen Proliferation, das bFGF enthielt, und dann in einem Medium zur pankreatischen Differenzierung, das Nikotinamid enthielt, kultiviert. (E) Zeigt das Ausbreiten von adhärenten Zellen nach der Kultivierung in Medium zur pankreatischen Proliferation. (F) Zeigt die Bildung von inselähnlichen pankreatischen Strukturen. (G) Zeigt die Färbung von Zellen mit Glucagon-spezifischen Antikörpern. (H) ist die höhere Vergrößerung (Maßstabsbalken: 25 μm) von (G) (Maßstabsbalken: 50 μm).

Bevorzugte Ausführungsbeispiele
I. Material und Methoden
1. Isolierung von Primärzellen
1.1 Placenta
Placentagewebe wurde nach Genehmigung durch das Ethikkomitee der Universität Tübingen aus der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie von solchen Frauen erhalten, bei denen ein Kaiserschnitt durchgeführt wurde. Unmittelbar nach dem Eingriff wurden die Chorionplatte mit dem amniotischen Epithel und den Stammvilli einschließlich der großen Blutgefäße von der Placenta entfernt. Das verbleibende Placentagewebe wurde in kleine Stücke geschnitten und intensiv dreimal mit Hanks's-balanced Salzlösung (PAA, Pasching, Österreich) enthaltend 1 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (HBSS-Pen/Strep, PAA) gewaschen. Im nächsten Schritt wurde das Gewebe mit einer Kombination von Kollagenase (750 U/ml; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) und Dispase II (200 μg/ml; Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) in HBSS bei 37°C für eine Stunde in einem Schüttelwasserbad verdaut. Das verbleibende Gewebe wurde durch Filtrierung durch ein Sieb mit einer Porengröße von 100 μm filtriert. Im letzten Schritt wurden Erythrocyten durch Histopac (Sigma-Aldrich)-Dichtegradientenfraktionierung bei 750 g für 20 min bei Raumtemperatur entfernt, und die Interphasezellen wurden mit Ammoniumchloridlösung (0,8 % NH₄Cl und 0,1 mM EDTA, Cell Systems) für 10 Min. bei 4°C gewaschen.
1.2 Knochenmark
Knochenmark (BM) wurde über das Berufsgenossenschaftliche Krankenhaus aus dem Schaft des Oberschenkelknochens von Patienten gewonnen, die einer Hüftoperation unterzogen wurden. Dies wurde vom Ethikkomitee der Universität Tübingen genehmigt. Ungefähr 25 ml BM-Zellen wurden gesammelt und mit 5000 U Heparin (Sigma-Aldrich) gemischt. Mononukleare Zellen wurden durch Ficoll-Histopac-Dichtegradientenfraktionierung (750 g für 20 min bei Raumtemperatur) zurückgewonnen.
2. Kultivierung von Primärzellen
2.1 Herstellung von mesenchymalen Stammzellen (MSC)
2 × 10⁷ Ficoll separierte Zellen aus BM oder 1 × 10⁷ Zellen aus Placenta wurden auf Gelatine-beschichtete 27 cm² Zellkulturlatten transferiert und bei 37°C und 5 % CO₂ in 20 ml „knock-out Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium" (KO-DMEM; Invitrogen; Karlsruhe, Deutschland) enthaltend 20 % KO-Serumersatz, 1 mM L-Glutamin, 0,1 mM β-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich), 1 % nicht-essentielle Aminosäuren und 5 ng/ml humanem basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) wachsen gelassen; vgl. Itskovitz-Eldor et al. (2000), Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers, Mol. Med. 6, Seiten 88–95. An jedem zweiten Kultivierungstag wurden 2 ml von KO-DMEM zugegeben. Die adhärenten Zellen waren nach 14 Tagen (BM-Zellen) oder 7 Tagen (Placenta) der Kultivierung zu ca. 90 % konfluent.
2.2 Herstellung von Embryoidkörper-ähnlichen Strukturen.
Embryoidkörper-ähnliche Strukturen (EBS) wurden durch Kultivierung von trypsinierten MSC für 4 Tage in ES-Cult^® Schalen mit niedriger Adhärenz (CellSystems) in ES-Differenzierungsmedium enthaltend 15 ES-Cult^®-FBS, 1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin (Cell-Systems), 1 mM Mono-Thioglycerol (MTG; Sigma) gelöst in DMEM „high glucose" (1 g/l; Invitrogen) und Penicillin/Streptomycin. Nach 2 Kultivierungstagen wurden schwerkraftsedimentierte EBS von einzelnen Zellen in einem Falconröhrchen durch vorsichtige Entfernung des Überstandes separiert, und das Medium wurde durch frisches ES-Cult^®-Medium ersetzt. Vor der Durchführung weiterer Analysen wurden die EBS durch Pipettieren und sorgfältigem Schütteln mit einem Vortexer disaggregiert.
2.3 Anreicherung von sog. „common adherent progenitor cells" (CAPC)
Um CAPC anzureichern, wurden sedimentierte EBS in 6-Well-Platten transferiert und für 6 Tage in 3 ml serumfreiem ES-Cult^®-Basalmedium (Cell Systems) mit ITS-Zusätzen (0,5 μg/ml rh-Insulin, 5 μl/ml rh-Transferrin, 0,52 μg/ml Natriumselenit in PBS; Cell Systems) kultiviert. Das Medium wurde alle zwei Tage ersetzt.
2.4 Pankreatische Differenzierung von CAPC
Für die Differenzierung von CAPC in Insulin-sekretierende pankreatische inselähnliche Cluster wurden die Zellen zu erst in pankreatischem Proliferationsmedium expandiert und anschließend in pankreatischem Differenzierungsmedium kultiviert. Im ersten Schritt wurden die Zellen in pankreatischem ES-Cult^®-Basalmedium enthaltend N2-A- und B27-Zusätzen und 25 ng/ml rh-bFGF (pankreatisches Proliferationsmedium; Cell Systems) suspendiert und für 6 Tage auf Poly-D-Lysine beschichteten Glaskammerobjektträgern (BD Biosciences) kultiviert. Im nächsten Schritt wurden die Zellen nach dem Austausch des Mediums für weitere 6 Tage in pankreatischem Differenzierungsmedium (pankreatisches Poliferationsmedium enthalten 10 mM Nicotinamid; Cell Systems) kultiviert.
2.5 Neuronale Differenzierung von CAPC
Für die Differenzierung von CAPC in die neuronale Linie wurden die Zellen für 6 Tage auf Poly-D-Lysin-beschichteten Glaskammerobjektträgern in Gegenwart von neuronalem Proliferationsmedium (NeuroCult^® NS-A-Basalmedium enthalten NeuroCult^® NS-A Proliferationszusätze; Cell Systems) kultiviert. Das Medium wurde alle zwei Tage ersetzt. Nach 6 Kultivierungstagen wurde das neuronale Proliferationsmedium durch „vollständiges" NeuroCult^®-NS-A Differenzierungsmedium (NS-A Basalmedium mit NS-A Differenzierungszusätzen; Cell Systems) ersetzt. Das Medium wurde alle 2 Tage gegen frisches neuronales Differenzierungsmedium ausgetauscht. Nach 7 Kultivierungstagen wurden die Zellen für die Immunfluoreszenzfärbung verwendet.
2.6 Mesodermale Differenzierung von CAPC
Zur Differenzierung von CAPC in Adipocyten und Osteoblasten wurden die Zellen in Gegenwart von NH-AdipoDiff-Medium bzw. NH-OsteoDiff-Medium (jeweils von Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) gemäß der Anweisungen des Herstellers kultiviert. Kurz gesagt, CAPC wurden bei 5 × 10⁴/ml (Adipogenese) oder 3 × 10⁴/ml (Osteogenese) in dem jeweiligen Medium resuspendiert und in Gewebekultur behandelte 6-Well-Platten transferiert. Das Medium wurde alle 3 Tage ausgetauscht. Die Bildung von Adipocyten wurde am 18. Tag der Kultivierung evaluiert, indem die Zelle mit Methanol für 5 min bei –20°C fixiert und anschließend hinsichtlich intrazellulärer neutraler Lipide mit Oil Red O-Farbstoff (Sigma; 20 Min, Raumtemperatur) angefärbt wurden. Die Bildung von osteogenen Zellen wurde am 10. Kultivierungstag analysiert, indem die Aktivität der alkalischen Phosphatase von Methanol-fixierten Zellen (–20°C, 5 Min.) mit 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat/Nitro-Blau-Tetrazolium (Sigma FAST^TM BCIP/NBT-Substrat; Sigma) für 10 min bei Raumtemperatur angefärbt wurde.
3. Transfektion von HEK-293-Zellen
Die transiente Transfektion von HEK-293-Zellen (bezogen von der DSMZ, Braunschweig, Deutschland) mit Plasmiden enthaltend die cDNA der humanen Frizzled-Rezeptoren 9 oder 10 (1A) wurde gemäß der Anweisungen des Herstellers unter Verwendung des FuGene-Transfektionsreagenz (Roche Diagnostics) durchgeführt. 200.000 Zellen wurden in einer Flacon 6-Well-Schale ausplattiert und in 5 ml RPMI-1640 mit 10 % FBS kultiviert, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht wurde. Die Transfektion wurde durch Verwendung von 200 μl einer Mischung von variierenden Konzentrationen von FuGene (3 μl, 6 μl, 12 μl) und leeren Vektoren bzw. Vektoren enthaltend die Frizzled-Rezeptor cDNA (1 μg, 2 μg, 4 μg) durchgeführt.
4. Konstruktion von Frizzled(FZD)-Gen enthaltenden Plasmiden
Ein synthetisches DNA-Fragment, das für die Signalsequenz der V-J2-C-Region der Maus-Ig-kappa-Kette gefolgt von einem FLAG-Tag codiert, wurde in den plRES2-EGFP-Vektor (Contech, Mountain View, CA, Vereinigte Staaten von Amerika) eingebracht. 5'-phosphorylierte Oligonukleotide Nhe-SiFXho 5'(5'-CTAGCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGC TCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGATTATAAGGATGACGATGACAAGC-3') und NheSiFXho 3' (5'-TCGAGCTTGTCATCGTCATCCTTATAATCGTCACC-AGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCC-ATG-3') wurden hybridisiert und in Ndel- und Xholverdauten plRES2-EGFP ligiert. Die multiple Klonierungsstelle (MCS) wurde mit einer neuen MCS ersetzt, die ein neues Set von Restriktionsstellen enthält, indem ein zweites Paar von hybridisierten Oligonucleotiden, die als XhoMCSBam- 5' (5'-TCGAGGGATCCGAARTTCGACGTCCCCGGGTCTAGAGAG-CTCGGTACCACTAGTA-3') bezeichnet werden und XhoMCSBam-3' (5'-GATCTACTAGTGGTACCGAGCTCTCTAGACCCGGGGACGTCGAATTCGGAT-CCC-3') in die Xhol- und BamHI-Stellen ligiert werden. Der resultierende Expressionsvektor, der als plRES2-Si-F-EGFP bezeichnet wird, wurde auf der Basis von Restriktionsverdauanalysen und Nukleotidsequenzierungen verifiziert.
Der Expressionsvektor pGEX2aHis-FZD-9 enthaltend die FZD-9 cDNA wurde von Cytomyx (Cambridge, Vereinigtes Königreich) bezogen. Die FZD-9-cDNA, beginnend an Position Leu23, wurde durch Restriktionsverdau des Vektors mit EcoRI und XbaI erhalten. Die DNA-Fragmente wurden in den analog verdauten plRES2-Si-F-EGFP-Vektor ligiert, um das Plasmid plRES2-EGFP-Si-F-FZD-9 (1A) zu erhalten. Positive Klone wurden durch Nukleotidsequenzierung verifiziert.
Die cDNA von FZD-10 wurde von Origene (Rockville, MD, Vereinigte Staaten von Amerika) bezogen. Die Codierungssequenz von FZD-10 wurde PCR amplifiziert, wobei die Primerpaare FZD-10BamH1 5' (5'-CGGGATCCATCAGCTCCATGGACATGGAGCGC-3')/FZD-10Spel 3' (5'-GGACTAGTCACGCAGGTGGGCGACTGGG-3') verwendet wurden. Das amplifizierte Produkt beginnend bei Position Ile21, wurde mit BamHI und SpeI verdaut und in die entsprechenden Stellen von plRES2-Si-F-EGFP kloniert. Der resultierende Expressionsvektor plRES32-EGFP-Si-F-FZD-10 (1A) wurde durch Nukleotidsequenzierung verifiziert.
5. Generierung von monoklonalen Antikörpern (mAb) gegen humanes FZD-9 und FZD-10
Der humane FZD-9-reaktive mAb W3C4E11 wurde durch Immunisierung einer 6 Wochen alten weiblichen Balb/c-Maus (Charles River WIGA, Sulzfeld, Deutschland) mit der Retinoblastoma-Zelllinie WERI-RB-1 (DMSZ) gewonnen. Der FZD-10 spezifische mAb wurde erhalten, indem mit HEK-293-Zellen immunisiert wurde, die mit einem Plasmid transfiziert wurden, der die gesamte Codierungssequenz von humanem FZD-10 trug. Die Spezifitäten der monoklonalen Antikörper gegen humanes FZD-9 (W3C4E11) und gegen humanes FZD-10 wurden durch deren selektive Erkennung von humanen embryonalen Nierenzellen (HEK-293) verifiziert, die mit Plasmiden transfiziert wurden, die die gesamten Codierungssequenzen der entsprechenden humanen FZD-Gene trugen. Die Isotypen des Anti-FZD-9-Antikörpers (W3C4E11) (IgM) und des Anti-FZD-10 monoklonalen Antikörpers wurden über ELISA (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) bestimmt.
6. Zelloberflächenfärbung und FACS-Analyse
Aus BM-, Placenta- oder Zelllinien gewonnene Zellen wurden markiert, wie in Vogel et al. (2003), Heterogeneity among human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and neural progenitor cells, Haematologica 88, Seiten 126–133, beschrieben, und auf einem FACSCalibur-Durchflusscytometer (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) analysiert. Antikörper gegen die Zelloberflächenantigene CD318 (CDCP1; Klon CUB2) [Scherl-Mostageer et al. (2001), Identification of a novel gene, CDCP1, overexpressed in human colorectal cancer Oncogene 20, Seiten 4402–4408], CD133 (Klon W6B3C1) [Ernst und Christie (2005), The putative neural stem cell marker, nestin, is expressed in heterogeneous cell types in the adult rat neocortex", Neuroscience], CD34 (Klon 43A1) [Zhou et al. (2005), An experimental study on astrocytes promoting production of neural stem cells derived from mouse embryonic stem cells, Chin. Med. J. 118, S. 1194–1999], CD105 (Klon 1G2C2) [Vogel et al. a.a.O.], CD13 (46A11) [Vogel et al. a.a.O.], w8B2-Antigen (Klon W8B2B10) [Vogel et al. a.a.O.], CD164 (Klon 67D2) [Vogel et al. a.a.O.], FZD-9 (Klon W3C4E11) und FZD-10 wurden in den eigenen Laboren hergestellt. Der Antikörper gegen SSEA-4 (Klon MC-813-70) wurde von Chemicon (Hampshire, Vereinigtes Königreich) bezogen.
7. RT-PCT Analyse
Die kultivierten oder Primärzellen wurden durch Reverse-Transcriptase(RT)-PCR bzgl. der mRNA-Expression der folgenden Moleküle analysiert: FZD-9, FZD-10, Oct-4, Nanog und Nestin. Um die exogene Expression von FZD-9 und FZD-10 zu analysieren, wurden HEK-293-Zellen mit der gesamten Codierungssequenz von FZD-9 und FZD-10 transfiziert. Die mittels RNeasy-Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) extrahierte RNA wurde als Template in der RT-PCR (Promega, Mannheim, Deutschland) bei 0,1 μg pro Reaktion verwendet. Die Primersequenzen für die untersuchten Gene sind in 6A dargestellt. Wegen des hohen GC-Gehaltes des Templates wurden 3 % DMSO zu den FZD-9- und FZD-10-PCRs zusammen mit Taq-DNA-Polymerase (Applied Biosystems) und einem Mix aus dNTP (Promega) hinzugegeben. Die PCR-Produkte wurden über einem 1 %-igen Aqarosegel (Peglab, Erlangen, Deutschland) mit Ethidiumbromid (Roth, Karlsruhe, Deutschland) aufgetrennt und die DNA-Banden wurden auf einem Vilber Lourmat UV-Transluminator (Vilber Lourmat, Marne La Vallee, Frankreich) visualisiert.
8. Westernblot-Analyse
HEK-293-Zellen, die transient mit plRES2-EGFP-Si-F-FZD-9 oder plRES2-EGFP-Si-F-FZD-10 transfiziert wurden, wurden dazu verwendet, um die exogene Proteinexpression zu analysieren. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen durch Ultraschallbehandlung in SDS-Proteinladepuffer (125 mM Tris-Cl, pH 6,8, 4 % w/v SDS, 0,005 % Bromphenolblau (w/v), 20 % v/v Glycerol) enthalten 200 mM dithiothreitol (DTT) (Sigma), 2 mM PMSF (Santa Cruz, Biotechnologies) und Protease-Inhibitorcocktail (1:100, Santa Cruz) lysiert. Die Proteinlysate wurden durch 10 %-ige SDS-PAGE separiert und dann auf eine Nitrocellulosemembran (Biorad, München, Deutschland) transferiert. Um die nicht-spezifische Bindung zu blockieren, wurden die Membranen mit Blockierungspuffer enthalten 5 % fettfreie Trockenmilch (Naturaflor, Dietmannsried, Deutschland) in 2 × TBS und 0,05 % Tween 20 inkubiert und anschließend entweder mit einem 1:1500 verdünnten Anti-FLAG-Antikörper (Sigma, Klon M2) oder einem 1:1000 verdünnten FZD-9- oder FZD-10-reaktiven Antiserum (Acris, Hiddenhausen, Deutschland) inkubiert. Die gebundenen Antikörper wurden mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern (Dako) und dem ECL-Westernblotsubstrat (Pierce, Bonn, Deutschland) gemäß der Anweisungen der Hersteller inkubiert.
9. Doppelfärbung von Placentagewebe durch Immunhistochemie
Paraformaldehyd fixiertes (4 % in PBS) und Paraffin eingebettetes placentales Gewebe wurde in 5 μm dicke Scheiben geschnitten. Nach der Rehydrierung wurden die Schnitt für 10 min in Citratpuffer (2.1 g Natriumcitrat/l, pH 6,0) in einem Mikrowellengerät gekocht. Die endogene Peroxidasereaktion wurde mit 3 % H₂O₂ in TBS für 15 Min. blockiert. Nach der Blockierung der nicht-spezifischen Immunglobulinbindung mit 10 %-igem normalem Schweineserum in TBS enthaltend 0,1 % BSA und 0,3 % Triton X-100 für 30 min, wur den die Schnitte mit Primärantikörpern verdünnt in TBS (0,1 % BSA, 0,3 % Triton X-100) über Nacht bei 4°C inkubiert. Es wurden primäre monoklonale Antikörper mit den folgenden Spezifitäten verwendet: SSEA-4 (Chemicon, Verdünnung 1:100), als auch die unverdünnten Überstände der intern hergestellten Antikörper gegen CD318 (CUB2), gegen FZD-9 (W3C4E11) und gegen FZD-10. Nach drei Waschzyklen in TBS-Puffer wurden die Schnitte mit biotinyliertem Sekundärantikörpern für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert (1:400, Schwein-Anti-Maus-IgG; Dako Cytomations, Glostrup, Dänemark). Nach drei Waschschritten mit TBS-Puffer erfolgte die Färbung der Zellen mit 3-3'-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB, Sigma-Aldrich) unter Verwendung des ABC-Färbesystems gemäß der Empfehlungen des Herstellers (Dako). Für die Doppelfärbungsexperimente wurden die Scheiben dann mit einem Glattmuskelzellactin-reaktiven Antikörper (Kaninchen-Anti-Human IgG, Dako, Verdünnung 1:100) inkubiert. Nach drei Waschzyklen mit TBS-Puffer wurden die Zellen für 30 min mit einem ABC-Komplex, der mit alkalischer Phosphatase konjugiert (Dako) und 1:400 in TBS (0,1 % BSA) verdünnt war, gefärbt. Die Zellen wurden durch Zugabe von Fast-Blue-BB-Salz-Chromogen-Substratlösung (Sigma-Aldrich) visualisiert. Die Schnitte wurden dann getrocknet und mit Kaiser's Glycerolgelatine (Merck, Darmstadt, Deutschland) getrocknet. Für die Immunohistochemie auf Cryostatschnitten wurde gefrorenes Placentagewebe in 12 μm dicke Scheiben auf einem Gefriermikrotom geschnitten. Nach der Fixierung in eiskaltem Aceton und Blockierung mit Schweineserum wurde die Färbung durchgeführt, wie oben beschrieben.
10. Immuncytochemie
Zellen in den angegebenen Differenzierungsstadien wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich) für 15 min bei Raumtemperatur fixiert. Im nächsten Schritt wurden die Zellen durch Inkubation mit 70 % Ethanol für 5 min bei Raumtemperatur permeabilisiert. Die nicht-spezifische Bindung wurde durch Inkubation für eine Stunde mit 10 % Schweineserum in PBS blockiert. Um die neuronale Differenzierung zu analysieren, wurden die Zellen mit Astrocyten-spezifischen und Neuron-spezifischen Antikörpern markiert, indem die Zelle mit einem 1:100 verdünnten Kaninchen-Anti-Human-Glialem-Fibrillärem-Azidischen-Protein(GFAP)-Antikörper, und einem 1:100 verdünnten Maus-Anti-Human-Neuronal-Klasse-III-β-Tubulin-Antikörper (beide Antikörper stammen von Cell Systems) über Nacht in 1 %-igem Schweineserum inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen für eine Stunde mit einem CY3-konjugierten Schwein-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Jackson Immuno Research, Cambridge, Vereinigtes Königreich) und mit einem Alexa488-konjugiertem Ziege-Anti-Maus-Sekundärantikörper (Molecular Probes, Karlsruhe, Deutschland) inkubiert. Nach dem Färben wurden die Zellen fünfmal mit PBS gewaschen. Um die Kernstrukturen zu visualisieren, wurden die Zellen mit DAPI für 10 Min. gegengefärbt.
Um die Pankreas-ähnlichen Inseln zu färben, wurden die Zellen für eine Stunde mit einem 1:100 verdünnten Kaninchen-Anti-human-Glucagon-Antikörper (Dako Cytomations) markiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen, wie oben be schrieben, gefärbt. Die Färbung der Glucagon-spezifischen Antikörper erfolgte unter Verwendung eines CY3-konjugierten Schwein-Anti-Kaninchen-Antikörpers. Das gleiche Protokoll wurde ebenfalls zur Färbung von MSC, EBS und CAPC mit Antikörpern verwendet, die spezifisch waren für Oct-4 (Kaninchen, Polyclonal, Santa Cruz) und FZD-9 (Kaninchen, Polyclonal, Acris). Ein TRITC-konjugierter Schwein-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Dako Cytomations) wurde verwendet, um die gefärbten Zellen unter einem Zeiss Axiovert 200 Mikroskop unter Verwendung der Axiovision Software zu visualisieren.
11. Identifizierung und/oder Isolierung von MSC aus einer biologischen Probe
Eine biologische Probe, von der angenommen wird, dass diese MSC enthält, beispielsweise eine Suspension von humanem Knochenmarksgewebe oder von potentiellen MSC-Primärzellen, wird in einem geeigneten Puffersystem bereitgestellt. Die Identifizierung bzw. Isolierung von MSC kann auf verschiedenen Wegen erfolgen, von denen nachfolgend einige beschrieben werden.
(a) Mittels Fängermoleküle, die gegen FZD-9 gerichtet und an Protein-A-Agarose gekoppelt sind.
Es werden Fängermoleküle, die gegen den humanen FZD-9-Rezeptor gerichtet sind, an Trägermaterial gekoppelt. Bei den Fängermolekülen kann es sich um monoklonale Antikörper handeln. Bei dem Trägermaterial kann es sich beispielsweise um Protein-A-beschichtete Agarose handeln.
Die gekoppelten Fängermoleküle werden zu der biologischen Probe hinzugegeben. Diese Mischung wird für eine bestimmte Zeit und unter solchen Bedingungen inkubiert, bei denen das Fängermolekül an MSC binden kann. Im Speziellen bindet das Fängermolekül an einen Teil des FZD-9-Rezeptor, der auf der Zelloberfläche der MSC exprimiert wird, sofern diese in der Probe vorhanden sind.
Anschließend wird die Mischung aus biologischer Probe mit gegebenenfalls sich darin gebildeten Fängermolekül-MSC-Komplexen zentrifugiert. Im Überstand befinden sich Nicht-MSC-Bestandteile der biologischen Probe sowie gegebenenfalls ungebundene MSC und gegebenenfalls ungebundene Fängermoleküle. Im Pellet befindet sich das Trägermaterial mit gebundenem Fängermolekül, daran ggf. gebundenen MSC. Der Überstand wird abgenommen und ggf. verworfen. Das sedimentierte Trägermaterial wird mit Waschpuffer gründlich gewaschen und daraufhin analysiert, ob MSC gebunden haben.
(b) Mittels FACS-Sortierung
Fängermoleküle, die gegen den humanen FZD-9-Rezeptor gerichtet sind, werden an einen fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt, z.B. an Cy3. Bei den Fängermolekülen kann es sich um monoklonale Antikörper handeln.
Die biologische Probe wird mit dem fluoreszenzmarkierten Fängermolekül inkubiert. Anschließend wird das Gemisch aus fluoreszenzgekoppelten Fängermolekülen und biologischer Probe einer FACS-Sortierung unterzogen, wobei an den Anti körper gebundene Zellen separiert werden. Die separierten Zellen werden dann auf ihre MSC-Kapazität untersucht.
(c) Identifizierung von MSC
Die Identifizierung von MSC kann mittels des sogenannten CFU-F-Assays erfolgen. Hier wird eine definierte Zahl vereinzelter und ggf. vom Fängermolekül getrennter Zellen in Kulturgefäße ausgesät und anschließend die Kolonien wachsender MSC gezählt. Der Fachmann kennt weitere bekannte Techniken, die sich zur Identifizierung von MSC eignen.
Die MSC stehen anschließend für weitere Anwendungen, z.B. im Tissue-Engineering, zur Verfügung.
II. Ergebnisse
1. Charakterisierung der monoklonalen Antikörper gegen FZD-9 und FZD-10
Um die FZD-Zelloberflächenexpression zu analysieren, wurden monoklonale Antikörper gegen membrangebundenes FZD-9 generiert, wie dies in den Methoden beschrieben ist. 1B zeigt, dass der monoklonale Antikörper W3C4E11 (IqM) und der monoklonale Antikörper gegen humanes Frizzled-10 selektiv FLAG-positive HEK-293/huFZD-9- bzw. HEK-293/huFZD-10-Zellen (a-Flag), nicht aber HEK-293-Zellen, die mit leeren Vektoren transfiziert wurden (Kontr.), erkennen. Die Spezifität der monoklonalen Antikörper wurde ferner durch deren Nicht-Reaktivität mit transfizierten Zellen verifiziert, die nicht-verwandte FZD-Proteine exprimierten (nicht gezeigt).
Die exogene Frizzled-Rezeptor-Expression in HEK-293/ huFZD-9- und HEK-293/huFZD-10-Zellen wurde ebenfalls durch Immunoblotting von SDS-PAGE-separierten Lysaten dieser Zellen mit kommerziell verfügbaren Anti-Frizzled-Antiseren bestätigt. 1C zeigt, dass nur transfizierte, nicht aber parentale Zellen, eine detektierbare Expression von FZD-9- bzw. FZD-10-Protein zeigen. Hiermit in Übereinstimmung wurde eine erhöhte exogene mRNA-Expression von FZD-9 und FZD-10 (die Primer sind in 6A gezeigt) in den transfizierten Zellen im Vergleich zu den parentalen Zellen beobachtet (1D).
2. Expression von Stammzellmarkern auf bestimmten Zelltypen der Placenta
Placentagewebeschnitte wurden durch Immunhistochemie auf die Expression des embryonalen Stammzellantigens SSEA-4 sowie des hämatopoetischen/neuralen/mesenchymalen Stammzellmarkers CD318 und der potentiellen Stammzellmarker FZD-9 und FZD-10 untersucht. CD318 wurde hauptsächlich in Zellen von kleinen placentalen Villi exprimiert (2A, B). Eine positive Färbung auf FZD-10 wurde in dem Syncytiotrophoblasten von Stamm-Villi als auch von kleinem placentalen Villi beobachtet (2C, D). Im Gegensatz zu FZD-10 zeigte FZD-9 eine starke Expression in den parenchymatischen Zellen, die die großen Blutgefäße umgeben, und in der Gefäßmitte, die doppelt mit einem Antikörper gegen Glattmuskelactin (2E-G) gefärbt wurde. Die Im munhistochemie für den embryonalen Stammzellmarker SSEAj-4 zeigte eine starke Färbung des Syncytiotrophoblasten als auch für einzelne Zellen in dem Parenchym des Villus (2H-J).
3. Generierung von MSC
Es wurde ein Dreischrittverfahren ausgewählt, um BM- und neonatale Plazentazellen in CAPC zur weiteren Differenzierung in reife Zellen zu differenzieren. Diese drei Schritte beinhalten die Generierung von MSC aus Primärzellen, gefolgt von der Formierung von Embryoidkörper-ähnlichen Strukturen (EBS), und die Differenzierung in CAPC. Um MSC zu generieren, wurden Zellen aus BM oder Plazenta auf Gelatine beschichteten Schalen in Gegenwart von 5 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (b-FGF) kultiviert. Nach sieben Tagen (Placenta) oder vierzehn Tagen (BM) der Kultivierung wurde eine konfluente Schicht von fibroblastoiden Zellen festgestellt (3A).
Die Analyse der Oberflächenmarkerexpression zeigte, dass diese Zellen nicht nur die bekannten MSC-Marker CD13, CD105, CD164 und CD318 exprimieren, sondern auch FZD-9, d.h. einen Marker, der bislang nicht in primären Knochenmarkszellen gefunden wurde (4A). Ferner exprimierten kultivierte Zellen aus beiden Quellen den embryonalen Stammzellmarker SSEA-4, was belegt, dass in der Tat MSC generiert wurden, die den natürlichen MSC entsprechen. Interessanterweise zeigte das W8D2-Antigen eine deutliche Expression auf den meisten MSC, die aus Knochenmark gewon nen wurden, W8D2 konnte jedoch nur schwach auf den plazentalen Gegenstücken detektiert werden.
MSC aus beiden Quellen waren negativ für CD34 und FZD-10. Die Expression der embryonalen Stammzellmarker wurde bestätigt durch Immuncytochemie für FZD-9 und Oct-4 (4A-H) und durch RT-PCR für Oct-4, Nanog, FZD-9, FZD-10 und Nestin (6B).
Um EBS zu generieren, wurden MSC für vier Tage in Gegenwart von embryonalen Stamm(ES)-Zellmedium auf Schalen mit extrem niedriger Adhärenz ausplattiert und kultiviert. 3B zeigt, dass die Zellen große Aggregate von runden Zellen mit entsprechender Struktur bildeten, wie diese für ES-zellabgeleitete Embryoid-Körper (EBs) beschrieben werden. Diese Zellen exprimierten Nanog- und Oct-4-mRNA (6B). In der Placenta war die Nestin-Expression in MSC sehr stark, jedoch nahezu abwesend in EBS, aber wiederum verstärkt in CAPC. In BM war die Nestin-Expression stark in MSC, mit einer starken Abnahme nach der Differenzierung in EBS und abwesend bei weiterer Kultivierung in CAPC. Ein vergleichbares Expressionsmuster wurde für FZD-9 beobachtet, während die FZD-10-mRNA sehr schwach während sämtlicher Stadien exprimiert wurde. Durchflusscytometrische Analysen ergaben ferner, dass diese Zellen CD318, FZD-9, CD105, CD13, CD164 und SSEA-4, nicht aber CD34 auf der Oberfläche exprimierten (4B). Trotz der Tatsache, dass auf mRNA-Ebene FZD-10 exprimiert wurde, konnte keine FZD-10-Proteinexpression auf der Zelloberfläche detektiert werden.
Zur Generierung von CAPC wurden EBS für sechs Tage in Gegenwart von serumfreiem, IST-Zusatz-enthaltendem ES-Cult^®-Medium kultiviert. 3C zeigt Zellen mit mesenchymaler Morphologie, die sich von den EBS ausbreiten. Entsprechend zu den EBS exprimieren diese Zellen Oct-4- und Nanog-mRNA (6B), und die Oberflächenmarkeranalyse ergab eine reduzierte Expression von SSEA-4 und FZD-9 auf CAPC (4C).
4. Differenzierung von CAPC in mesodermale, endodermale und ectodermale Zellen
Das oben beschriebene Dreischritt-Verfahren zur Bildung von CAPC aus primärem BM- und Placentazellen bildete die Basis für die mesodermalen, endodermalen und ectodermalen Differenzierungslinien. Um die mesodermale Differenzierungskapazität zu demonstrieren, wurden CAPC dazu induziert, um Zellen der Adipocytenlinie und osteoblastenähnliche Zellen hervorzubringen. 7A zeigt, dass die Kultivierung von CAPC für zehn Tage in OsteoDiff^TM-Medium in der Formierung von osteoblastenähnlichen Zellen mit deutlicher Färbung der Phosphataseaktivität mit BCIP/NBT-Substrat resultiert. Hierzu im Gegensatz brachten CAPC, die für achtzehn Tage in Gegenwart von AdipoDiff^TM-Medium kultiviert wurden, funktionelle Adiopocyten hervor, wie sich dies aus deren Kapazität zur Aufnahme von Oil-Red-O-Farbstoff ergab (7B).
Um die ectodermale Differenzierungskapazität zu studieren, wurden CAPC in neurale Linien getrieben. Die Formierung von Zellen, die die neuronen- und astrocytenspezifischen Marker exprimieren, wurden nach der Kultivierung von CAPC in Gegenwart von NeuroCult^®-neuronalem Proliferations- und Differenzierungsmedium analysiert. 7C zeigt, dass die meisten der Zellen positiv für den Astrocytenmarker Gliales Fibrilläres Azidisches Protein (GFAP) waren, während wenige Zellen mit dem neuronalen Klasse-III-β-Tubulin gefärbt wurden (7D).
Die endodermale Differenzierung wurde untersucht, indem die CAPC zur Reifung in pankrea-ähnliche Inseln induziert wurden. Um dies zu erreichen, wurde CAPC zuerst in einem bFGF-enthaltenden pankreatischen Proliferationsmedium und dann in einem Nicotinamid-enthaltenden pankreatischen Differenzierungsmedium kultiviert. 7E zeigt das Ausbreiten von adhärenten Zellen nach der Behandlung mit pankreatischem Proliferationsmedium. Nach der weiteren Differenzierung mit pankreatischem Differenzierungsmedium wurde die Formierung von pankreatischen inselähnlichen Strukturen beobachtet (7F). Die Färbung von pankreaähnlichen Inseln mit glucagonspezifischen Antikörpern ergab die Expression von Glucagon in diesen Zellen (7G-H). Zusammengefasst, konnte demonstriert werden, dass MSC in einem frühen Differenzierungsstadium, die aus Placenta und BM-gewonnen wurden, über die Stufe der CAPC Zelllinien einer jeden Keimbahnlinie hervorbringen können.

Claims

Verfahren zur Isolierung und/oder Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen (MSC) aus einer biologischen Probe, das folgende Schritte aufweist, nämlich: (a) Bereitstellen einer biologischen Probe, (b) Inkubation eines für einen MSC-Marker spezifischen Fängermoleküls mit der biologischen Probe, um einen Fängermolekül-MSC-Komplex zu bilden, (c) Isolierung und/oder Identifizierung eines Fängermolekül-MSC-Komplexes, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem MSC-Marker um den Wnt-Rezeptor Frizzled-9 (FZD-9) handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt (b) der weitere Schritt (b1) erfolgt: (b1) Separieren des Fängermolekül-MSC-Komplexes von ungebundenen Bestandteilen der biologischen Probe und von ggf. ungebundenen Fängermolekülen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den MSC um solche mit unreifem Phänotyp handelt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fängermolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Antikörper, Antikörperfragment, Aptamer, natürlicher Ligand (Wnt) sowie Fragment hiervon.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Antikörper der Antikörper verwendet wird, der von der nach dem Budapester Vertrag am 15. Juli 2004 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegten Hybridomzelle W3C4E11 produziert wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fängermolekül an eine Trägersubstanz gekoppelt ist, die vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Agarose, Sepharose.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägersubstanz mit einem Protein beschichtet ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Protein A, Protein G, Protein L.
Verfahren nach einem dem vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fängermolekül mit einem detektierbaren Marker gekoppelt ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Fängermolekül-MSC-Komplex mittels immunologischer Verfahren, vorzugsweise mittels des enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) identifiziert wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Fängermolekül-MSC-Komplex mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) identifiziert wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Fängermolekül-MSC-Komplex mittels CFU-F-Assays identifiziert wird.
Verwendung eines Fängermoleküls, das an einen Marker für mesenchymale Stammzellen (MSC) bindet, zur Isolierung und/oder Identifizierung von MSC aus einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Marker um den Wnt-Rezeptor Frizzled-9 (FZD-9) handelt.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den MSC um solche mit unreifem Phänotyp handelt.
Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Fängermolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Antikörper, Antikörperfragment, Aptamer, natürlicher Ligand (Wnt) sowie Fragment hiervon.
Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass als Antikörper der Antikörper verwendet wird, der von der nach dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegten Hybridomzelle W3C4E11 produziert wird.