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Die
Erfindung betrifft ein Laser-Scanning-Mikroskop sowie ein Laser-Scanning-Mikroskopierverfahren,
die insbesondere zur Detektion von Fluoreszenzstrahlung geeignet
sind.
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Für die fluoreszenzmikroskopische
Vermessung sind verschiedene Detektionsprinzipien bekannt. So kann
beispielsweise ein Laserstrahl punktförmig auf die Probe fokussiert
und das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht durch eine Pinhole-Blende örtlich gefiltert
und mit einem nachgeordneten, nicht ortsauflösenden Detektor registriert
werden. Nachteilig ist hierbei jedoch, daß zum einen viele bewegliche
Teile (zwei Scanner zur Ablenkung des fokussierten Laserstrahls über die
gesamte Probe) verwendet werden müssen, was die Standzeit begrenzt.
Ferner wird die Farbstoffanregung durch die sehr hohe Spitzenintensitäten im Fokus
leicht gesättigt,
so daß dies
eine obere Grenze der maximalen Geschwindigkeit zur Erfassung eines örtlich aufgelösten Fluoreszenzbildes
der Probe setzt. Des weiteren tritt auch die Schwierigkeit auf,
daß eine
starke Ausbleichung der Farbstoffe auftritt.
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Die
Probe kann mit einer linienförmig
fokussierten Laserstrahlung beleuchtet werden, wobei diese Beleuchtungslinie
dann über
die Probe gescannt wird, um ein Bild der gesamten Probe zu erhalten. Die
Detektion erfolgt beispielsweise mit einem CCD- oder CMOS-Zeilendetektor.
Licht aus anderen Ebenen wird bei diesem Verfahren bevorzugt konfokal unterdrückt. Wenn
man jedoch mehrere Farbstoffe in der Probe hat, die mit verschiedenen
Laserwellenlängen
angeregt werden müssen,
so muß die
Probe entweder mehrfach mit jeweils einer der Anregungswellenlängen vermessen
werden, oder man regt die Fluoreszenz gleichzeitig mit allen Anregungslaserlinien an
und detektiert das von allen Linien angeregte Licht spektral. Bei
der ersten Alternative führt
dies zu einer höheren
Meßzeit.
Bei der zweiten Alternative kann man nicht unterscheiden, welche
Fluoreszenzstrahlung von welcher Laserstrahlung erzeugt wurde.
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Es
ist auch möglich,
die Probe flächig
zu beleuchten und mit einem ortsauflösenden Detektor zu vermessen.
Spektrale Informationen können
aber nur seriell gewonnen werden. Um eine konfokale Unterdrückung zu
erreichen, müssen
weitere aufwendige Maßnahmen
ergriffen werden, so daß dieses
Verfahren insgesamt nur für
Proben mit wenigen Farbstoffen geeignet ist.
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Ausgehend
hiervon ist es Aufgabe der Erfindung, ein Laser-Scanning-Mikroskop
sowie ein Laser-Scanning-Mikroskopierverfahren bereitzustellen,
das einen möglichst
einfachen Aufbau aufweist und hohe Meßgeschwindigkeiten ermöglicht.
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Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe gelöst durch
ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Beleuchtungsmodul, das einen
ersten linienförmigen und
einen davon beabstandeten zweiten linienförmigen Abschnitte einer zu
untersuchenden Probe mit Laserstrahlung unterschiedlicher Wellenlängen beleuchtet,
wobei in jedem Abschnitt aufgrund einer Wechselwirkung der Laserstrahlung
mit der Probe Probenstrahlung erzeugt wird, mit einem Scanmodul, das
eine Relativbewegung zwischen der Laserstrahlung zur Beleuchtung
der Abschnitte und der Probe quer zu den linienförmigen Abschnitten bewirkt,
und mit einem Detektionsmodul, das eine erste Detektionseinheit
sowie einen ortsauflösenden
Detektor umfaßt,
wobei die erste Detektionseinheit die linienförmigen Abschnitte derart örtlich getrennt
konfokal erfaßt,
daß für jeden
Abschnitt ein linienförmiges
Probenstrahlenbündel
erzeugt wird, das jeweils mittels des Detektors örtlich aufgelöst detektiert
wird.
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Da
das Laser-Scanning-Mikroskop (bevorzugt gleichzeitig) zwei linienförmige Abschnitte
beleuchtet und diese (bevorzugt gleichzeitig) örtlich getrennt konfokal erfassen
kann, ist es möglich,
die Probenstrahlung sowohl nach Emissionswellenlängen als auch nach Anregungswellenlängen (bevorzugt gleichzeitig)
getrennt zu detektieren. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn
Fluoreszenzstrahlung von mehreren Farbstoffen, die in die Probe
eingebracht sind, detektiert werden sollen. So ist es insbesondere möglich, zwei
bis acht verschiedene Farbstoffe in der Probe zu separieren und
deren Mengenverhältnisse zu
bestimmen. Es müssen
nur die entsprechende Anzahl von linienförmigen Abschnitten, die voneinander
beabstandet sind, mit Laserstrahlung unterschiedlicher Wellenlänge beleuchtet
und entsprechend konfokal detektiert werden.
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Um
ein örtlich
aufgelöstes
Bild der detektierten Probenstrahlung zu erhalten, kann mittels
des Scanmoduls lediglich die Probe relativ zu der Laserstrahlung
bewegt werden. Dies kann beispielsweise mit einem herkömmlichen
x-y-Probentisch eines Mikroskops realisiert werden. Es muß also nur
ein bewegliches Teil vorgesehen werden, um das gewünschte Bild
zu erhalten. Dies vereinfacht den Aufbau, senkt die Herstellungskosten
und führt
zu hohen Standzeiten.
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Die
Probenstrahlung der linienförmigen
Abschnitte kann mittels des Detektors gleichzeitig detektiert werden,
so daß die
Detektionsgeschwindigkeit erhöht
werden kann.
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Das
Detektionsmodul kann eine zweite Detektionseinheit aufweisen, die
die von der ersten Detektionseinheit kommenden Probenstrahlenbündel jeweils
quer zur linienförmigen
Ausdehnung spektral aufspaltet, wobei der Detektor bei der Detektion
der Probenstrahlenbündel
jeweils zumindest eine spektral aufgespaltene Wellenlänge örtlich ausgelöst detektiert.
Damit kann man eine sehr hohe spektrale Auflösung bei der Detektion erreichen.
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Das
Beleuchtungsmodul kann mehr als zwei voneinander beabstandete, linienförmige Abschnitte mit
Laserstrahlung unterschiedlicher Wellenlängen befeuchtet. Insbesondere
können
beispielsweise drei bis zehn Abschnitte gleichzeitig beleuchtet
und auch detektiert werden.
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Die
erste Detektionseinheit kann zur örtlich getrennten konfokalen
Erfassung eine Spaltblende aufweisen, die für jeden Abschnitt einen linienförmigen Spalt
enthält.
Mit einer solchen Spaltblende kann man in einfacher Art und Weise
die gewünschte
konfokale Detektion realisieren.
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Das
Beleuchtungsmodul kann zur Beleuchtung jedes Abschnitts die jeweilige
Laserstrahlung linienförmig
auf oder in die Probe fokussieren. Bevorzugt liegt quer zur Erstreckungsrichtung
eine beugungsbegrenzte Fokussierung vor, um eine möglichst
gute konfokale Detektion zu erzielen.
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Das
Beleuchtungsmodul kann insbesondere noch so ausgebildet sein, daß die Fokustiefe
in der Probe veränderbar
ist. Dadurch ist es möglich,
verschiedene optische Schnitte in unterschiedlichen Probentiefen
durchzuführen.
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Die
linienförmigen
Abschnitte verlaufen bevorzugt parallel zueinander. Dies erleichtert
den Aufbau des Beleuchtungs- sowie des Detektionsmoduls.
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Das
Detektionsmodul kann als Probenstrahlung insbesondere die durch
die Laserstrahlung angeregte Fluoreszenzstrahlung detektieren.
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Das
Scanmodul kann mindestens einen Scanner-Spiegel (z.B. drehbarer
Ablenkspiegel) aufweisen, der die Laserstrahlung für die Abschnitte
simultan über
die Probe lenkt. Mittels des bzw. der Scanner-Spiegel wird die Relativbewegung
teilweise oder vollständig
bewirkt. Wenn die Laserstrahlung linienförmig fokussiert wird, erfolgt
die Ablenkung bevorzugt quer (insbesondere senkrecht) zur linienförmigen Ausdehnung
der linienförmig
fokussierten Laserstrahlung.
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Das
Detektionsmodul kann einen Filter enthalten, der aus der Probenstrahlung
(also vor der konfokalen Erfassung) und/oder aus den Probenstrahlenbündeln (also
nach der konfokalen Erfassung) die Wellenlängen der Laserstrahlung herausfiltert.
Damit können
z.B. bei der Detektion von Fluoreszenzstrahlung als Probenstrahlung
die häufig
unerwünschten
Anregungswellenlängen
herausgefiltert werden.
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Der
ortsauflösende
Detektor ist insbesondere ein flächiger,
ortsauflösender
Detektor. Er kann beispielsweise als CMOS- oder als CCD-Detektor ausgebildet
sein.
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Ferner
kann der Detektor als linienförmiger, ortsauflösender Detektor
ausgebildet sein, wobei in diesem Fall die zweite Detektionseinheit
bevorzugt eine dem Detektor vorgeschaltete Ablenkeinheit enthält, die
den gewünschten
Teil des spektral aufgespaltenen Probenstrahlenbündels auf den Detektor lenkt.
Die Ablenkeinheit kann beispielsweise ein drehbar gelagerter Ablenkspiegel
sein.
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Zur
spektralen Aufspaltung der Probenstrahlenbündel kann die zweite Detektionseinheit
beispielsweise ein Ablenkprisma, ein Gitter oder auch ein sonstiges
optisches bzw. dispersives Element enthalten, das die gewünschte spektrale
Aufspaltung durchführt.
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Das
Beleuchtungsmodul kann eine Laserquelle zur Erzeugung der Laserstrahlung
mit den unterschiedlichen Wellenlängen enthalten.
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Ferner
kann das Beleuchtungsmodul eine Abbildungseinheit umfassen, die
die Abschnitte mit linienförmig
fokussierten Laserstrahlenbündel
beleuchtet. Die Abbildungseinheit ist insbesondere so ausgebildet,
daß die
Fokustiefe in der Probe verstellbar und einstellbar ist.
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Ferner
kann das Beleuchtungsmodul zur Erzeugung der Laserstrahlenbündel die
Laserstrahlung durch eine Spaltblende transmittieren, die für jeden zu
beleuchtenden Abschnitt einen transmissiven Spalt aufweist, wobei
die einzelnen Spalte voneinander beabstandet sind.
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Das
Mikroskop kann ferner noch eine Steuereinheit umfassen, die zur
Steuerung des Mikroskops dient. Die Steuereinheit ist insbesondere
so ausgebildet, daß die
beschriebenen Funktionen des Laser-Scanning-Mikroskops realisiert
werden können.
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Ferner
kann das Mikroskop noch ein Auswertemodul umfassen, dem die Daten
des Detektors zugeführt
sind. Das Auswertemodul erzeugt aus diesen Daten dann die gewünschten
(bevorzugt ortsaufgelösten)
Bilder der Probenstrahlung.
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Das
Scanmodul kann bewirken, daß die
Probe in einem Flüssigkeitsstrom
so geführt
wird, daß sie
zumindest einen Beitrag zur Relativbewegung liefert. Ein weiterer
Beitrag zur Relativbewegung kann beispielsweise mittels eines bewegbaren
Probentisches oder eines Ablenkspiegels in dem Scanmodul erfolgen.
Natürlich
kann die Relativbewegung auch vollständig mittels des Flüssigkeitsstroms
erzielt werden.
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Das
Laser-Scanning-Mikroskop kann somit als bildgebendes Zytometer bzw.
bildgebendes Flow-Zytometer weitergebildet werden.
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Wenn
die Laserstrahlung linienförmig
fokussiert wird, kann das Scanmodul so ausgebildet werden, daß der Flüssigkeitsstrom
in einer Objektebene des Mikroskops senkrecht zur linienförmigen Ausdehnung
der linienförmig
fokussierten Laserstrahlung fließt.
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Die
Aufgabe wird ferner gelöst
durch ein Laser-Scanning-Mikroskopierverfahren, bei dem ein erster
linienförmiger
und ein davon beabstandeter zweiter linienförmiger Abschnitt einer zu untersuchenden
Probe (bevorzugt gleichzeitig) mit Laserstrahlung unterschiedlicher
Wellenlänge
beleuchtet wird, wobei in jedem Abschnitt aufgrund einer Wechselwirkung
der Laserstrahlung mit der Probe Probenstrahlung erzeugt wird, und
bei dem die linienförmigen
Abschnitte (bevorzugt gleichzeitig) derart örtlich getrennt konfokal erfaßt werden,
daß für jeden
Abschnitt ein linienförmiges
Probenstrahlenbündel
erzeugt wird, das jeweils in linienförmiger Ausdehnung örtlich aufgelöst detektiert
wird.
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Mit
diesem Verfahren ist es möglich,
die Probenstrahlung spektral selektiv und selektiv nach Anregungswellenlängen zu
detektieren.
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Bei
dem Verfahren können
die Probenstrahlenbündel
vor der Detektion jeweils quer zur linienförmigen Ausdehnung spektral
aufgespalten werden und kann jeweils zumindest eine spektral augespaltene
Wellenlänge örtlich aufgelöst detektiert
werden.
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Insbesondere
bei der Detektion von Fluoreszenzstrahlung führt dies zu dem Vorteil, daß mehrere Farbstoffe
spektral aufgelöst
sowie spektral selektiv nach Anregungswellenlänge gleichzeitig detektiert werden
können.
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Bei
dem Verfahren kann zur Beleuchtung jedes Abschnitts die jeweilige
Laserstrahlung linienförmig
auf oder in die Probe fokussiert werden. Dies führt zu einer besseren konfokalen
Unterdrückung.
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Insbesondere
werden zueinander parallel verlaufende linienförmige Abschnitte beleuchtet. Dies
erleichtert die Detektion der Probenstrahlung.
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Insbesondere
wird als Probenstrahlung durch die Laserstrahlung angeregte Fluoreszenzstrahlung
detektiert.
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Die örtlich aufgelöste Detektion
kann linienförmig
oder auch flächig
durchgeführt
werden. Wenn sie linienförmig
durchgeführt
wird, kann insbesondere ein linienförmiger, ortsauflösender Detektor
vorgesehen werden, dem eine Ablenkeinheit vorgeschaltet ist, die
den gewünschten
Teil des spektral aufgespaltenen Probenstrahlenbündels auf den Detektor lenkt.
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Für örtlich getrennte
konfokale Erfassung kann insbesondere eine Spaltblende eingesetzt
werden, die für
jeden Abschnitte einen linienförmigen Spalt
enthält.
Dies führt
zu einer ausgezeichneten konfokalen Unterdrückung der Probenstrahlung.
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Ferner
kann auch zur Beleuchtung der Abschnitte eine Spaltblende eingesetzt
werden, die für jeden
zu beleuchtenden Abschnitt einen transmissiven Spalt aufweist, wobei
die einzelnen Spalte voneinander örtlich beabstandet sind.
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Bei
dem Verfahren kann eine Relativbewegung zwischen der Laserstrahlung
zur Beleuchtung der Abschnitte und der Probe quer zur Erstreckungsrichtung
der linienförmigen
Abschnitte durchgeführt werden.
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Die
Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung beispielhalber
noch näher erläutert. Es
zeigen:
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1 eine
schematische Ansicht einer ersten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops;
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2 eine
Draufsicht der Spaltblende 17 von 1;
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3 eine
Draufsicht der beleuchteten Probe 26 von 1;
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4 eine
Draufsicht der Spaltblende 30 von 1;
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5 eine
Draufsicht des Detektors 38 von 1;
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6 eine
schematische Darstellung der Intensitätsverteilung der ersten Zeile 39 des
Detektors 38 von 5;
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7 eine
zweite Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops,
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8 eine
schematische Ansicht einer zweiten Ausführungsform der Laserquelle 1,
und
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9 eine
dritte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops.
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Bei
der in 1 gezeigten Ausführungsform umfaßt das Laser-Scanning-Mikroskop
eine Laserquelle 1, die vier Laser 2, 3, 4, 5 sowie
für jeden
Laser 2–5 eine
Lichtleitfaser 6, 7, 8, 9 enthält. Die
Laser 2–5 erzeugen
Laserstrahlung mit unterschiedlichen Wellenlängen, hier Laserstrahlung im
UV-Bereich sowie blaue, grüne
und rote Laserstrahlung, die in die Lichtleitfasern 6–9 eingekoppelt
wird und an den den Lasern 1–4 abgewandten Enden
als Laserstrahlenbündel 10, 11, 12, 13 mit
im wesentlichen rundem Strahlquerschnitt und gaußförmiger Intensitätsverteilung abgegeben
wird.
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Den
Lichtleitfasern 6–9 ist
eine Linse 15, ein diffraktiv-optisches Element 16 sowie
eine Spaltblende 17 nachgeordnet. Die Linse 15 bildet
die aus den Fasern 6–9 austretenden
Laserstrahlenbündel
auf die Blende 17 ab. Das diffraktiv-optische Element 16 übernimmt
dabei die Funktion einer Powell-Linse bzw. Powell-Spiegels, so daß die einzelnen
Laserstrahlenbündel 10–13 in
der Ebene der Blende 17 jeweils einen linienförmigen Querschnitt
aufweisen, der sich hier jeweils senkrecht zur Zeichenebene erstreckt.
Gleichzeitig bewirkt das diffraktiv-optische Element 16,
daß die
Laserstrahlenbündel 10–13 in der
Ebene der Blende 17 ein annähernd homogenes Intensitätsprofil
aufweisen.
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Die
Blende 17 weist, wie in der Draufsicht von 2 schematisch
dargestellt ist, vier transmissive Bereiche 18, 19, 20 und 21 auf,
auf die die linienförmigen
Laserstrahlenbündel 10–13 treffen
und somit durch die Blende 17 hindurchtreten können. Die
Bereiche 18–21 sind
bevorzugt jeweils als Spalt bzw. Schlitz ausgebildet und die restlichen
Bereiche der Blende sind für
die Laserstrahlung absorbierend und/oder reflektiv. Am Ort der Blende 17 liegen
somit örtlich
beabstandete, linienförmige
Laserstrahlenbündel
mit unterschiedlicher Wellenlänge
vor, nämlich
eine UV-Beleuchtungslinie (Spalt 18), eine blaue Beleuchtungslinie
(Spalt 19), eine grüne
Beleuchtungslinie (Spalt 20) sowie eine rote Beleuchtungslinie
(Spalt 21).
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Um
eine konvergente Kugelwelle (hier die aus den Fasern 6–9 austretenden
Laserstrahlenbündel 10–13)
auf einen Spalt (hier Spalte 18–21 der Blende 17)
mit einem diffraktiv-optischen Element abzubilden, wird herkömmlicher
Weise ein spezielles eindimensionales diffraktives Profil verwendet.
Da die Wirkung des diffraktiv-optischen Elements jedoch von der
Wellenlänge
der Strahlung abhängt,
weist das hier verwendete diffraktiv-optische Element 16 in der
zweiten Dimension ein sich kontinuierlich veränderndes und an die Wellenlänge angepaßtes Profil auf,
so daß es
für die
Laserstrahlenbündel 10–13 mit den
unterschiedlichen Wellenlängen,
die nebeneinander auf das diffraktiv-optische Element 16 treffen, optimal
geeignet ist. Man kann beispielsweise in der zweiten Dimension ein
lineare Skalierung des Profils des diffraktiv-optischen Elements
vorsehen.
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Die
durch die Blende 17 transmittierten Laserstrahlenbündel 10–13 werden
mittels einer der Blende 17 nachgeordneten ersten Tubuslinse 22 nach
unendlich abgebildet, durchlaufen einen Anregungsfilter 23 (z.B.
einen Plasmafilter), der zur Herausfilterung unerwünschter
Nebenmoden der Laser 1–4 dient,
und werden dann über
einen Teilerwürfel 24 und
ein Objektiv 25 auf die zu untersuchende Probe 26 fokussiert,
die auf einem Probentisch 27 liegt. Zur Vereinfachung der
Darstellung ist nach der Blende 17 nur noch die Ausbreitungsrichtung
der Laserstrahlenbündel 10–13 sowie
der nachher noch beschriebenen Probenstrahlung eingezeichnet. Somit wird
die Probe 26 mit vier linienförmig fokussierten Laserstrahlenbündel 10–13 beleuchtet,
wobei die linienförmig
fokussierten Laserstrahlenbündel 10–13 parallel
zueinander ausgerichtet und voneinander beabstandet sind. Es werden
somit auf bzw. in der Probe 26, je nach Fokussierung mittels
des Objektivs 25, linienförmige und voneinander beabstandete
Abschnitte A1, A2, A3, A4 der Probe 26 beleuchtet, wie dies
in der schematischen Draufsicht auf die Probe in 3 gezeigt
ist.
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Der
Probentisch 27 ist, wie durch den Doppelpfeil P in 1 und 3 angedeutet
ist, in einer Richtung quer zur Erstreckungsrichtung der linienförmig auf
oder in die Probe fokussierten Laserstrahlenbündel 10–13 bewegbar,
so daß die
Probe 26 relativ zum Beleuchtungsmuster M, das durch die
vier auf oder in der Probe 26 linienförmig fokussierten Laserstrahlenbündel 10–13 gebildet
ist, bewegt werden kann. Die Laserstrahlenbündel 10–13 werden
somit mit einem Beleuchtungsmodul BM, das hier die Laser 1–4,
die Lichtleitfasern 6–9,
die Linse 15, das diffraktiv-optische Element 16,
die Blende 17, die erste Tubuslinse 22, den Filter 22,
den Teilerwürfel 24 sowie das
Objektiv 25 enthält,
auf oder in die Probe 26 fokussiert und dienen in dem hier
beschriebenen Ausführungsbeispiel
dazu, in der Probe Fluoreszenzlicht (Probenlicht) anzuregen.
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Das
so erzeugte Fluoreszenzlicht wird mittels des Objektivs 25 nach
unendlich abgebildet und durchläuft
den Teilerwürfel 24 sowie
einen dem Teilerwürfel 24 nachgeordneten
Detektionsfilter 28 (z.B. einen Notch-Filter), der die
Anregungswellenlängen eliminieren
soll. Das Probenlicht durchläuft
dann eine zweite Tubuslinse 29, die es auf eine zweite
Spaltblende 30 abbildet, die gleich ausgebildet ist wie
die Spaltblende 17 und schematisch in Draufsicht in 4 gezeigt
ist.
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Somit
trifft das vom UV-Laserstrahlenbündel 10 angeregte
Fluoreszenzlicht auf den ersten Spalt 31. Das vom blauen
Laserstrahlenbündel 11 angeregte
Fluoreszenzlicht trifft auf den zweiten Spalt 32, das vom
grünen
Laserstrahlenbündel 12 angeregte Fluoreszenzlicht
trifft auf den dritten Spalt 33 und das vom roten Laserstrahlenbündel 13 angeregte
Fluoreszenzlicht trifft auf den vierten Spalt 34. In dieser Weise
wird das Fluoreszenzlicht der einzelnen beleuchteten Abschnitte
A1–A4 örtlich getrennt
derart konfokal erfaßt,
daß für jeden
Abschnitt A1–A4
ein linienförmiges
Probenstrahlbündel
erzeugt wird. Alle linienförmigen
Probenstrahlenbündel
sind zueinander parallel und wiederum voneinander beabstandet und
enthalten entlang der Linienrichtung die entsprechende spektrale
Information vom zugeordneten Ort im entsprechenden Abschnitt A1–A4 der
Probe. Das Objektiv 25, der Teilerwürfel 24, der Filter 28,
die zweite Tubuslinse 29 sowie die Blende 30 bilden
eine erste Detektionseinheit D1.
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Die
durch die Blende 30 transmittierten Probenstrahlenbündel werden
mittels einer ersten Detektorlinse 35 nach unendlich abgebildet,
dann mittels einem nachgeschalteten Prisma 36 quer zur
linienförmigen
Erstreckungsrichtung spektral aufgespalten und mit einer dem Prisma 36 nachgeordneten zweiten
Detektorlinse 37 auf einen flächigen, ortsauflösenden CMOS-Sensor 38 (Detektor)
abgebildet. Die Detektorlinsen 35, 37 und das
Prisma 36 bilden eine zweite Detektionseinheit D2, die
zusammen mit der ersten Detektionseinheit D1 und dem Sensor 38 das
Detektionsmodul DM des Mikroskops bilden
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Der
CMOS-Sensor 38 ist in einer schematischen Draufsicht in 5 gezeigt,
wobei jedes Pixel als Quadrat dargestellt ist. In dem hier gezeigten
Beispiel umfaßt
der Sensor 38 zur Vereinfachung der Darstellung acht Zeilen
(x-Richtung) und zwölf
Spalten (y-Richtung). Der Sensor 38 ist so ausgerichtet, daß die linienförmige Erstreckung
der Probenstrahlenbündel
mit der y-Richtung zusammenfällt,
so daß entlang
der x-Richtung die spektrale Aufspaltung stattfindet.
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In 6 ist
die Intensitätsverteilung
I der ersten Zeile 39 des Sensors 38 schematisch
dargestellt. Unter der Annahme, daß der Detektionsfilter 28 die Anregungsstrahlung
nicht komplett unterdrücken kann,
liegen die größten Intensitäten jeweils
bei der Wellenlänge
der Anregungsstrahlungen und sind hier mit r, g, b sowie UV für die rote,
grüne,
blaue Wellenlänge
bzw. die UV-Wellenlänge
gekennzeichnet. An jede Anregungsstrahlung schließt sich
durch die spektrale Aufspaltung (hier nach rechts) das Spektrum
der jeweiligen Fluoreszenzstrahlung 40, 41, 42, 43 an.
Es ist somit möglich,
die Probe 26 gleichzeitig mit allen gewünschten Anregungswellenlängen (hier vier)
anzuregen und die Fluoreszenz spektral sowie nach Anregungswellenlänge aufzulösen. Da
die Probe 26 linienförmig
beleuchtet und konfokal linienförmig
detektiert wird, kann jeweils der entsprechende Abschnitt A1–A4 der
Probe 26 örtlich
aufgelöst
entlang der Erstreckungsrichtung der Abschnitte A1–A4 detektiert
werden. Durch die Bewegung des Probentisches 27 entlang
des Doppelpfeils P wird dann eine streifenförmige Abtastung der Probe 26 ermöglicht, so
daß ein
Bild der Fluoreszenzstrahlung der Probe zusammengesetzt werden kann.
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Der
CMOS-Sensor 38 kann vorteilhaft dazu genutzt werden, nur
die Spalten (x-Koordinate) auszulesen, die der zu detektierenden
Fluoreszenzstrahlung entsprechen. Damit ist eine schnelle Auswertung
möglich.
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Ferner
können
vorteilhaft einzelne Spalten zusammengeschaltet und zusammen ausgelesen werden,
was auch als Hardwarebinning bezeichnet wird. Damit kann die spektrale
Auflösung
der Detektion verändert
und eingestellt werden.
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Alternativ
ist es möglich,
das Prisma 38 gegen ein anderes Prisma auszuwechseln, das
ein anderes Dispersionsverhalten aufweist, so daß bei gleichem Ablenkwinkel
mittels des Prismas unterschiedliche spektrale Auflösungen vorliegen.
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Bei
der beschriebenen Ausführungsform
des Laser-Scanning-Mikroskops wird vorteilhaft nur ein Minimum an
bewegten Teilen benötigt,
hier nur der Probentisch 27. Da das Mikroskop mit einem
einzigen Scan über
den zu untersuchenden Probenbereich die gesamte spektrale Information
der Probe 26 als Funktion der Anregungs- und Detektionswellenlänge vermessen
kann, eignet sich das Mikroskop auch sehr gut für die Realisierung eines schnellen, bildgebenenden
Flow-Zytometers.
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Wenn
man dreidimensionale Probenbilder erzeugen will, wird die Probe 26 mehrfach
mit unterschiedlichen Fokustiefen der linienförmig fokussierten Laserstrahlenbündel 10–13 abgescannt.
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In 7 ist
eine Abwandlung der Ausführungsform
von 1 gezeigt, wobei gleiche Bauelemente bzw. Bauteile
mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet sind und zu deren Beschreibung
auf die obigen Ausführungen
verwiesen wird. Im Unterschied zu der in 1 gezeigten
Ausführungsform
weist die Ausführungsform
von 7 keinen flächigen,
ortsauflösenden
Sensor, sondern einen linienförmigen ortsauflösenden Sensor 44 (also
ein eindimensional auflösender
Sensor und keinen zweidimensional auflösenden Sensor wie bei 1)
auf, der sich hier senkrecht zur Zeichenebene erstreckt. Zwischen
der zweiten Detektorlinse 37 und dem Sensor 44 ist
ein um eine senkrecht zur Zeichenebene verlaufenden Drehachse drehbarer
Ablenkspiegel 45 angeordnet, der aus der spektralen Aufspaltung
der linienförmigen
Probenstrahlenbündel
die Linie mit der gewünschten,
zu detektierenden Wellenlänge
auf den Sensor 44 lenkt. Damit können bei dieser Ausführungsform
die einzelnen Linien nur zeitlich nacheinander detektiert werden.
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In 8 ist
eine Abwandlung der Laserquelle 1 sowie der nachgeordneten
Optik bis zur Spaltblende 17 schematisch dargestellt. Auch
hier sind gleiche Elemente wie bei der Ausführungsform von 1 mit
gleichen Bezugszeichen bezeichnet und zu deren Beschreibung wird
auf die obigen Ausführungen
verwiesen. Die Laserstrahlenbündel 10, 11, 12 und 13 werden
mit Hilfe der Linsen 46, 47, 48 und 49 kollimiert
und mittels einem Umlenkspiegel 50 sowie drei dichroitischer
Spiegel 51, 52 und 53 zu einem gemeinsamen
Laserstrahlenbündel 55 überlagert.
Das überlagerte
Laserstrahlenbündel
wird mittels eines Gitters 55 in Abhängigkeit der Wellenlängen in
vier Teilstrahlenbündel
aufgespalten, die dann mittels der Linse 15 und dem diffraktiv-optischen
Element 16 auf die Spaltblende 17 als vier Laserstrahlenbündel mit
linienförmigem
Querschnitt und nahezu homogener Intensitätsverteilung treffen. Der weitere
Strahlverlauf ist wie bei den in 1 bzw. 7 gezeigten
Ausführungsform.
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Statt
des Prismas 36 zur spektralen Aufspaltung der Probenstrahlenbündel kann
auch ein Gitter oder jedes andere dispersive optische Element verwendet
werden, um die gewünschte
spektrale Aufspaltung zu erzielen.
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Die
Filter 23 und 28 sind jeweils etwas zur optischen
Achse geneigt, um den Einfluß von
unerwünschten
Reflexionen an den Filtern zu minimieren. Die Filter 23 und 28 können auch
weggelassen werden.
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In
einer Abwandlung der Ausführungsformen von 1 und 7 wird
das Prisma 36 durch ein Prisma mit korrigierter Dispersion
ersetzt, das somit nur die gewünschte
Umlenkung der Probenstrahlenbündel
und keine spektrale Aufspaltung durchführt. Es kann auch ein Umlenkspiegel
statt des Prismas 36 vorgesehen werden. Das Prisma 36 kann
auch vollständig
entfallen. In diesem Fall müssen
lediglich die dem Prisma 36 nachfolgenden Optikelemente
so angeordnet werden, daß die
Probenstrahlenbündel immer
noch auf den Detektor 38, 44 treffen.
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In
diesem Fall ist es bevorzugt, daß zumindest der Filter 28 vorgesehen
ist, um die Wellenlängen
der anregenden Laserstrahlung herauszufiltern. Ferner ist es auch
möglich,
unmittelbar vor dem Detektor 38, 44 einen entsprechenden
Filter vorzusehen. Beispielsweise kann ein sogenannter Kammfilter
verwendet werden.
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In 9 ist
eine weitere Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops
gezeigt. Diese weitere Ausführungsform
unterscheidet sich von der ersten Ausführungsform von 1 im
wesentlichen durch die Art, wie die linienförmig fokussierten Laserstrahlenbündel 10 bis 13 über die
Probe 26 bewegt werden. Die gleichen Elemente wie bei der
in 1 gezeigten Ausführungsform tragen daher bei
der Darstellung in 9 die gleichen Bezugszeichen
und zu deren Beschreibung wird auf die obigen Ausführungen
verwiesen. Der Unterschied zwischen beiden Ausführungsformen zeigt sich nach
dem Objektiv 25, das nun die Laserstrahlenbündel 10 bis 13 in
eine Zwischenbildebene 56 abbildet. Der Zwischenbildebene 56 sind
eine Tubuslinse 57, ein Scannerspiegel 58 sowie
ein Scanobjektiv 59 in dieser Reihenfolge nachgeordnet,
die zusammen eine Scaneinheit 60 bilden. Die Probe 28 liegt
auf einem Probentisch 61.
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Der
Scannerspiegel 58 ist drehbar, wie durch den Pfeil S1 angedeutet
ist, so daß die
Laserstrahlenbündel 10 bis 13 quer
zu ihrer linienförmigen
Ausrichtung über
die Probe 26 geführt
werden können, wie
durch den Doppelpfeil S2 angedeutet ist. Die Relativbewegung zwischen
dem Laserstrahlenbündel 10 bis 13 und
der Probe 26 erfolgt hier somit aufgrund der Drehung des
Scannerspiegels 60. Daher muß der Probentisch 61 nicht
bewegbar sein. Natürlich
ist es möglich,
auch einen bewegbaren Probentisch vorzusehen und gegebenenfalls
die Bewegung des Probentisches 61 zusammen mit der Scaneinheit 60 zur
Ablenkung der Laserstrahlenbündel 10 bis 13 zu
nutzen.