DE102005063175A1 - Separation of cells and bio-particles and/or molecules, for animals and biotechnology and medical diagnosis, adds functionalized micro-particles for recognition and bonding to be separated by membranes - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung beschreibt eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Isolieren von Zellen, Biopartikeln und/oder Molekülen aus Flüssigkeiten. Mit ihr können unter Verwendung geeigneter Träger und bekannter Immobilisierungsverfahren spezifische Biopartikel erkannt und abgetrennt werden. Anwendungsgebiete der Erfindung sind Tiere, die Biotechnologie (einschließlich der biologischen Forschung) und die medizinische Diagnostik.The The invention describes an apparatus and method for isolation of cells, bioparticles and / or molecules of liquids. With her you can under Use of suitable carriers and known immobilization method specific bioparticles be recognized and separated. Fields of application of the invention are Animals involved in biotechnology (including biological research) and medical diagnostics.
Die Isolierung von Zellen, Biopartikeln und/oder Molekülen aus Flüssigkeiten ist auf vielen technischen Gebieten von Bedeutung, zahlreiche Verfahren sind dazu bekannt.The Isolation of cells, bioparticles and / or molecules liquids is important in many technical fields, numerous procedures are known.
Die Zellanalyse und die Zellseparation werden seit Jahrzehnten mittels Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) vorgenommen. Es ist die Methode der Wahl für die Analytik spezifischer Zellpopulationen durch Oberflächenmarker. Probleme bereitet die FACS-Anwendung für die Isolierung großer Zellzahlen. Das die Zellen enthaltende Medium muss stark verdünnt werden, die Trennzeit ist relativ lange für größere Zellmengen und es bereitet Probleme, aseptische Bedingungen einzuhalten. Das Verfahren verursacht insgesamt erhebliche Kosten.The Cell analysis and cell separation have been used for decades Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). It is the Method of choice for the analysis of specific cell populations by surface markers. The FACS application is prepared for the isolation of large numbers of cells. The medium containing the cells must be heavily diluted The separation time is relatively long for larger cell volumes and it prepares Problems with observing aseptic conditions. The procedure causes overall significant costs.
Zur Erkennung und Isolierung von Biopartikeln und Zellen werden seit mehr als 10 Jahren im wachsenden Maße magnetische Trennverfahren eingesetzt. Dazu werden entweder die Fängermoleküle mit Eisen beladen oder einen Eisenkern enthaltende Mikropartikel werden mit dem Fängermolekül beschichtet. Die Abtrennung erfolgt durch ein starkes magnetisches Feld. Die immunmagnetische Separation, erfolgreich kommerzialisiert u.a. durch Dynal und Miltenyi Biotec, hat sich als einfache, relativ kostengünstige Methode der Zelltrennung etabliert. Besonders im Vergleich zur Fow-Zytometrie hat sich die magnetische Separation für die Isolierung von relativ seltenen Zelltypen bewährt, so z.B. für die Isolierung fetaler Zellen aus dem mütterlichen Blut für die pränatale Diagnostik. Eine weitere Anwendung ist der Nachweis von Tumorzellen im Blut nach chirurgischer Entfernung des Primärtumors zur Einleitung weiterer Behandlungen.to Detection and isolation of bioparticles and cells have been around more than 10 years increasingly magnetic separation processes used. For this purpose, either the catcher molecules are loaded with iron or a Iron core-containing microparticles are coated with the capture molecule. The separation is carried out by a strong magnetic field. The immuno-magnetic separation, successfully commercialized u.a. by Dynal and Miltenyi Biotec, has proven to be a simple, relatively inexpensive method the cell separation established. Especially compared to Fow cytometry has become the magnetic separation for proven the isolation of relatively rare cell types, so e.g. For the isolation of fetal cells from maternal blood for prenatal diagnosis. Another application is the detection of tumor cells in the blood after surgical removal of the primary tumor to induce others Treatments.
Für therapeutische Zwecke werden heute routinemäßig syngene CD34+-periphere Blutstammzellen von Patienten, die an bestimmten malignen Erkrankungen des Blut bildenden Systems leiden, für eine Reimplantation gewonnen. Das geschieht vorzugsweise durch die Aufreinigung von Leukozyten mit spezifischen Antikörpern, die an Magnetic Beads gekoppelt sind. Für die Zellfraktionierung während der Blut/Zell-Spende stehen mehrere Systeme zur Verfügung, die die unterschiedliche Größe und spezifische Dichte der Blutzellen für eine Trennung im Schwerefeld (Zentrifugation) nutzen.For therapeutic purposes, syngeneic CD34 + peripheral blood stem cells from patients suffering from certain malignancies of the blood-forming system are routinely recovered for reimplantation. This is preferably done by the purification of leukocytes with specific antibodies coupled to magnetic beads. For cell fractionation during the blood / cell donation several systems are available that use the different size and specific gravity of the blood cells for a separation in the gravitational field (centrifugation).
Ein Nachteil aller Sortierungsverfahren ist, dass sie nicht kontinuierlich durchgeführt werden können. D.h. es wird eine Blut- bzw. Lymphozyten-Probe entnommen, die Zellen werden mit den immunmagnetischen Partikeln inkubiert. Nach dem Abtrennen und Waschen werden die Zellen vom Magnetpartikel abgelöst und können dann für therapeutische Zwecke eingesetzt werden.One Disadvantage of all sorting methods is that they are not continuous carried out can be. That a blood or lymphocyte sample is taken, the cells are incubated with the immunomagnetic particles. After disconnecting and Washing, the cells are detached from the magnetic particle and then can for therapeutic Purposes are used.
Ein guter Überblick über FACS und MACS wird gegeben in „Fow Cytometry and Sorting" (Ed. Melamed et al., Wiley & Sons, Inc., New York, 1990).One good overview of FACS and MACS is given in "Fow Cytometry and Sorting "(Ed et al., Wiley & Sons, Inc., New York, 1990).
Andere
Methoden der Isolierung und/oder Entfernung von Zellen sind beschrieben
in
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches System zur Abtrennung von Zellen, Biopartikeln und anderen Molekülen zu entwickeln, das für Tiere angewendet werden kann, ebenso in der Biotechnologie einschließlich der biologischen Forschung und in der medizinischen Diagnostik.Of the Invention is based on the object, a simple system for separation of cells, bioparticles, and other molecules that develop for animals can be applied, as well as in biotechnology including biological research and in medical diagnostics.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1, 14 und 29–30 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.The Invention is according to claims 1, 14 and 29-30 realized the subclaims are preferred variants.
Die Erfindung beschreibt ein einfaches Trennverfahren, das überall dort angewendet werden kann, wo für das zu separierende Agens eines Stoffgemisches ein spezifischer Ligand funktionsfähig an eine Oberfläche immobilisiert werden kann. Die eigentliche Separation erfolgt durch Sortierung nach Partikelgröße (Filtration, Sieben).The Invention describes a simple separation process that exists everywhere can be applied where for the agent of a mixture to be separated is a specific one Ligand functional to a surface can be immobilized. The actual separation is done by Sorting by particle size (filtration, Seven).
Für die Lösung dieser Aufgabe werden Standard-Verfahren der Kopplung spezifischer Liganden an einen festen Träger genutzt.For the solution of this The task will be based on standard methods of coupling specific ligands a solid carrier used.
Als feste Träger kommen bekannte Biopolymere wie Membranen oder Partikel aus organischen oder synthetischen Polymeren zum Einsatz. Die Oberfläche kann biokompatibel sein und bestehen aus Kollagen, gereinigten Proteinen, gereinigten Peptiden, Polysacchariden wie z.B. Chitosan, Alginat, Dextran, Zellulose, Glycosaminoglycanen oder synthetische Polymere wie Polystyren, Polyester, Polyäther, Polyanhydride, Polyalkylcyanoacrylate, Polyacrylamide, Polyorthoester, Polyvinylacetate, Blockcopolymere, Polypropyle, Polytetrafluoroäthylen (PTFE) oder Polyurethan. Darüber hinaus können die Polymere Milchsäure-Polymere oder Copolymere (Milchsäure und/oder Glykol- Säure (PLGA) enthalten.As solid carriers known biopolymers such as membranes or particles of organic or synthetic polymers are used. The surface may be biocompatible and consist of collagen, purified proteins, purified peptides, polysaccharides such as chitosan, alginate, dextran, cellulose, glycosaminoglycans or synthetic polymers such as polystyrene, polyesters, polyethers, polyanhydrides, polyalkylcyanoacrylates, polyacrylamides, polyorthoesters, polyvinyl acetates, block copolymers, Polypropyls, polytetrafluoroethylene (PTFE) or polyurethane. In addition, the polymers may contain lactic acid polymers or copolymers (lactic acid and / or glycolic acid (PLGA).
Die verwendeten Oberflächen können biodegradierbar oder nicht-biodegradierbar sein.The used surfaces can biodegradable or non-biodegradable.
Die benutzten spezifischen Liganden für die Bindung der Ziel-Moleküle auf der Oberfläche von Zellen können natürlich oder synthetischer Natur sein, so z.B. Antikörper, Antikörperfragmente, Peptide, Polypeptide, Glykopeptide, lösliche Rezeptoren, Steroide, Hormone, Mitogene, Antigene, Superantigene, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Leptine, Virusproteine, Adhäsionsmoleküle oder Chemokine.The used specific ligands for the binding of the target molecules on the surface of cells Naturally or synthetic nature, e.g. Antibodies, antibody fragments, peptides, polypeptides, Glycopeptides, soluble Receptors, steroids, hormones, mitogens, antigens, superantigens, Growth factors, cytokines, leptins, viral proteins, adhesion molecules or Chemokines.
Für die spezifische Verwendung wird mindestens ein Antikörper oder ein Antikörperfragment eingesetzt, wobei die spezifischen Liganden kovalent an diese gebunden oder über Spacer oder Linker an sie fixiert sind.For the specific Use at least one antibody or antibody fragment is used, wherein the specific ligands are covalently bound to them or via spacers or linkers are fixed to them.
Die Trägersubstanz kann jegliche Geometrie aufweisen. Membranen als Kapillare oder Partikel bieten den Vorteil einer großen Oberfläche. Für das zu beschreibende Verfahren werden Mikropartikel mit einem Durchmesser von > 10 μm < 800 μm, vorzugsweise 50–500 μm eingesetzt. Für andere Aufgabenstellungen können aber auch größere oder kleinere Partikel eingesetzt werden.The vehicle can have any geometry. Membranes as capillary or Particles offer the advantage of a large surface. For the procedure to be described are microparticles with a diameter of> 10 microns <800 microns, preferably 50-500 microns used. For others Tasks can but also larger or smaller particles are used.
Die mit spezifischen Liganden (z.B. Antikörper gegen CD34 oder CD1d, oder gegen HIV-gp120) aktivierten Mikropartikel werden mit entnommenem Blut, das mit üblichen Antikoagulantien behandelt wird, ex-vivo in Kontakt gebracht. Das geschieht in einem besonderen Reaktionsraum. Soll der Reaktionsraum in einen extra-korporalen Kreislauf verbracht werden, sichern Schlauchverbindungen, Ventile, Filter und Pumpen, verbunden mit der Sicherungstechnik, dass das System ohne Nebenwirkungen für den Patienten nach entsprechender Antikoagulation betrieben werden kann.The with specific ligands (e.g., antibodies to CD34 or CD1d, or against HIV gp120) activated microparticles are extracted with blood, that with usual Anticoagulants is treated, brought in contact ex-vivo. The happens in a special reaction room. Should the reaction space be placed in an extra-corporeal circuit, secure hose connections, Valves, filters and pumps associated with the safety technology, that the system with no side effects for the patient after appropriate Anticoagulation can be operated.
Die Zielzellen werden durch die funktionalisierten Mikropartikel gebunden. Die Abtrennung der nun beladenen Mikropartikel geschieht durch hydrostatischen Druck unter Verwendung einer Membran (Siebe), vorzugsweise in Form einer Röhre, die alle Blutbestandteile ungehindert durchtreten lässt (Porengröße > 10 μm < 800 μm) aber die Mikropartikel zurückhält. Dabei kann die Filtration sowohl durch vertikale wie auch tangentiale Druckeinwirkung erfolgen. Die im Lumen verbleibenden Partikel werden in das Reaktionsgefäß zurückgeführt oder für analytische oder präparative Zwecke abgeleitet.The Target cells are bound by the functionalized microparticles. The separation of the now loaded microparticles is done by hydrostatic Pressure using a membrane (sieves), preferably in the form a tube, which allows all blood components to pass unhindered (pore size> 10 μm <800 μm) but the Retains microparticles. there Filtration can be done by both vertical and tangential Pressure applied. The particles remaining in the lumen become returned to the reaction vessel or for analytical or preparative Derived purposes.
Nach Unterbrechung der Blutzufuhr kann das Reaktionsgefäß für die Ablösung der Zellen von den Mikropartikeln genutzt werden. Die so vereinzelten, dispergierten Zellen können mittels gleichen Verfahrens von den Partikeln abgetrennt werden und stehen nun für diagnostische Anwendungen zur Verfügung.To Interruption of the blood supply, the reaction vessel for the replacement of the Cells are used by the microparticles. The so isolated, dispersed cells can be separated from the particles by the same procedure and now stand for diagnostic applications available.
Eine weitere Anwendung ist die gezielte Isolierung verschiedener Zelltypen mit dem Ziel der Co-Kultivation, immer dann, wenn die jeweiligen Zelltypen Oberflächen-Moleküle und/oder Biomoleküle wie Cytokine anderer Zelltypen benötigen, um ihre gewünschte Funktion zu erfüllen.A Another application is the targeted isolation of different cell types with the goal of co-cultivation, whenever the respective Cell types Surface molecules and / or Like biomolecules Need cytokines of other cell types, to your desired To fulfill function.
Um für den notwendigen Zell-Zell-Kontakt eine ausreichende Nähe der gewünschten Zielzellen zu erreichen, können mehrere spezifische Liganden auf einem Partikel gebunden sein.Around for the necessary cell-cell contact sufficient proximity of the desired Can reach target cells multiple specific ligands bound to a particle.
Spezifische Zellen für diese Anwendung können u.a. T-Zellen, B-Zellen oder Stammzellen sein.specific Cells for this application can et al T cells, B cells or stem cells.
Das Verfahren kann sowohl diskontinuierlich wie auch kontinuierlich durchgeführt werden. Aus der hohen Variabilität in der Partikelgestaltung hinsichtlich Material, Durchmesser und Oberflächenmodifikationen ergibt sich eine riesige Vielfalt von Anwendungsmöglichkeiten bei Tieren, in der medizinischen Diagnostik, aber auch in der Biotechnologie und der biologischen ForschungThe Process can be both batchwise and continuously carried out become. From the high variability in the particle design in terms of material, diameter and surface modifications There is a huge variety of possible applications in animals, in medical diagnostics, but also in biotechnology and biological research
Ausführungsbeispiel 1Embodiment 1
Isolierung von CD4-positiven Zellen aus RattenvollblutIsolation of CD4-positive Cells from rat whole blood
Ascitis Antikörper (RIB 5/2) wurden mit Hilfe vom Millipore Montage Antibody Purification Kit (LSK2 ABG 20) nach Protokoll durchgeführt.ascites antibody (RIB 5/2) were using the Millipore Montage Antibody Purification Kit (LSK2 ABG 20) performed according to protocol.
Die Aufreinigung wurde anschließend mit einem SDS Denaturierungs-Gel (10%) überprüft.The Purification was subsequently checked with an SDS denaturing gel (10%).
Kopplung der Anti-CD4 Antikörper an die Polymethylmethcrylat (PMA)-PartikelCoupling of the anti-CD4 antibody to the polymethylmethacrylate (PMA) particles
- 1. 1 ml PMA (Partikeldurchmesser = 40 μm +/– 10 μm; 10 mg/ml; COOH/PEG-COOH modifiziert,) zentrifugiert 2 min 3.000 × g, Überstand verwerfen und in 1 ml 0,1 M MES Puffer pH 6.3 aufnehmen.1. 1 ml PMA (particle diameter = 40 μm +/- 10 μm, 10 mg / ml; COOH / PEG-COOH modified,) centrifuged 2 min 3,000 × g, supernatant discard and take up in 1 ml of 0.1 M MES buffer pH 6.3.
- 2. 2 mg EDC und 2,4 mg N-Hydroxysuccinimid in 0,5 ml 0,1 M MES Puffer pH 6,3 lösen und zu der PMA-Partikel-Suspension geben. 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rühren inkubieren (Aktivierung der Partikel).2. 2 mg EDC and 2.4 mg N-hydroxysuccinimide in 0.5 ml 0.1 M MES Dissolve buffer pH 6.3 and add to the PMA particle suspension. 1 hour at room temperature with stirring incubate (activation of the particles).
- 3. PMA-Partikel separieren durch Zentrifugation und 2mal waschen mit 0,1 M MES Puffer pH 6,3.3. Separate PMA particles by centrifugation and wash twice with 0.1 M MES buffer pH 6.3.
- 4. Aktivierte PMA-Partikel in 1 ml 0,1 M MES Puffer pH 6.3 aufnehmen mit 100–150 μg Antikörper; Kopplungsreaktion bei Raumtemperatur für 16 Stunden (über Nacht).4. Activated PMA particles in 1 ml of 0.1 M MES Puf take pH 6.3 with 100-150 μg antibody; Coupling reaction at room temperature for 16 hours (overnight).
- 5. Neutralisation freier Bindungsstellen durch Zugabe von 100 μl 1 M Ethanolamine mit anschließender Inkubation für 1 Stunde.5. Neutralization of free binding sites by adding 100 μl of 1 M ethanolamine with following Incubation for 1 hour.
- 6. Separieren mittels Zentrifugation und waschen der funktionalisierten PMA-Partikel mit PBS 3 mal.6. Separate by centrifugation and wash the functionalized PMA particles with PBS 3 times.
-
7. Aufnahme der anti-CD4-PMA-Partikel in 1 ml PBS pH 7,4 und
Lagerung bei 4°C. Überprüfung der
Antikörperkopplung
mittels Goat-anti-Maus Antikörper
PE markiert (
1 ).7. Incorporation of anti-CD4 PMA particles in 1 ml PBS pH 7.4 and storage at 4 ° C. Verification of antibody coupling by means of Goat-anti-mouse antibody PE (1 ).
Spezifische Zellisolierung von CD4 positiven Zellen aus VollblutSpecific cell isolation of CD4 positive cells from whole blood
- 1. 4 ml anti-coaguliertes Ratten-Vollblut wird mit 1 ml (1 mg Partikel) funktionalisierter anti-CD4-PMA-Partikel Suspension gemischt.1. 4 ml of anti-coagulated rat whole blood with 1 ml (1 mg particles) of functionalized anti-CD4 PMA particles Suspension mixed.
- 2. 60 min bei Raumtemperatur wippend inkubieren.2. Incubate for 60 min at room temperature.
- 3. Trennen der anti-CD4-PMA-Partikel (mit und ohne gebundene Zellen) aus dem Vollblut durch Filtration des Blut-Partikel-Gemisches mittels einer speziellen Kammer mit einem Zellsieb (40 μm).3. Separation of anti-CD4 PMA particles (with and without bound Cells) from the whole blood by filtration of the blood-particle mixture by means of a special chamber with a cell sieve (40 μm).
- 4. Waschen der anti-CD4-PMA-Partikel mit 30 ml PBS (1% FCS)4. Washing the anti-CD4 PMA particles with 30 ml PBS (1% FCS)
- 5. Aufnahme der Partikel aus der Siebkammer in ca. 1 ml PBS, Vortexen (Mixen) für 15–20 Sekunden.5. Take the particles out of the sieve chamber in approx. 1 ml PBS, Vortexing (mixing) for 15-20 Seconds.
-
6. Entnahme einer Partikelprobe für mikroskopische Analyse (
2 ).6. Taking a particle sample for microscopic analysis (2 ). -
7. FACS-Analytik der Leukozyten-Fraktion im Rattenvollblut vor
und nach Behandlung mit den anti-CD4-PMA-Partikel (
3 und4 ).7. FACS analysis of the leukocyte fraction in rat whole blood before and after treatment with the anti-CD4 PMA particles (3 and4 ).
Ablösen und Qualifizierung der Zellen von den Partikeln.Replacement and qualification of the Cells from the particles.
- 1. anti-CD4-PMA-Partikel den anhaftenden Zellen werden durch vorsichtige Zentrifugation sedimentiert.1. anti-CD4 PMA particles become the adherent cells sedimented by careful centrifugation.
- 2. Aufnehmen des Sediments in PBS, 2 mM EDTA, 3 mM Mercaptoethanol und 20 U Papain.2. Take up the sediment in PBS, 2mM EDTA, 3mM mercaptoethanol and 20 U Papain.
- 3. Inkubation unter Mischen für 30 min.3. Incubation with mixing for 30 min.
- 4. Trennen von Zellen und Partikeln durch eine Filtration mittels einer speziellen Kammer mit einem Zellsieb (40 μm); Waschen der Partikel mit 30 ml PBS (1 FCS); Aufnahme der Partikel aus dem Zellsieb in ca. 1 ml PBS; Vortexen (Mixen) für 15–20 Sekunden und Wiederholen des Waschens.4. Separation of cells and particles by filtration using a special chamber with a cell strainer (40 μm); Washing the particles with 30 ml PBS (1 FCS); Absorption of the particles from the cell strainer in approx. 1 ml of PBS; Vortexing (mixing) for 15-20 seconds and repeating the washing.
-
5. Isolierte Lymphozytenfraktion durch Zentrifugation 350 × g aufkonzentrieren
und mittels FACS analysiert (
5 ).5. Concentrate the isolated lymphocyte fraction by centrifugation 350 × g and analyze by FACS (5 ).
Ausführungsbeispiel 2Embodiment 2
Isolierung eines Proteins (IgG) aus einem Zell-LysatIsolation of a protein (IgG) from a cell lysate
Ascites Antikörper (RIB 5/2) wurden mit Hilfe vom Millipore Montage Antibody Purification Kit (LSK2 ABG 20) nach Protokoll durchgeführt.ascites antibody (RIB 5/2) were using the Millipore Montage Antibody Purification Kit (LSK2 ABG 20) performed according to protocol.
Die Aufreinigung wurde anschließend mit einem SDS Denaturierungs-Gel (10%) überprüft.The Purification was subsequently checked with an SDS denaturing gel (10%).
Kopplung der (Maus-IgG2) Anti-CD4 Antikörper an die Polymethylmethcrylat (PMA)-PartikelCoupling of the (mouse IgG 2 ) anti-CD4 antibody to the polymethylmethacrylate (PMA) particles
- 1. 1 ml PMA (Partikeldurchmesser = 40 μm +/– 10 μm; 10 mg/ml; COOH/PEG-COOH modifiziert,) zentrifugiert 2 min 3.000 × g, Überstand verwerfen und in 1 ml 0,1 M MES Puffer pH 6.3 aufnehmen.1. 1 ml PMA (particle diameter = 40 μm +/- 10 μm, 10 mg / ml; COOH / PEG-COOH modified,) centrifuged 2 min 3,000 × g, supernatant discard and take up in 1 ml of 0.1 M MES buffer pH 6.3.
- 2. 2 mg EDC und 2,4 mg N-Hydroxysuccinimid in 0,5 ml 0,1 M MES Puffer pH 6,3 lösen und zu der PMA-Partikel-Suspension geben. 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rühren inkubieren (Aktivierung der Partikel).2. 2 mg EDC and 2.4 mg N-hydroxysuccinimide in 0.5 ml 0.1 M MES Dissolve buffer pH 6.3 and add to the PMA particle suspension. 1 hour at room temperature with stirring incubate (activation of the particles).
- 3. PMA-Partikel separieren durch Zentrifugation und 2mal waschen mit 0,1 M MES Puffer pH 6,3.3. Separate PMA particles by centrifugation and wash twice with 0.1 M MES buffer pH 6.3.
- 4. Aktivierte PMA-Partikel in 1 ml 0,1 M MES Puffer pH 6.3 aufnehmen mit 100–150 μg Antikörper; Kopplungsreaktion bei Raumtemperatur für 16 Stunden (über Nacht).4. Take up activated PMA particles in 1 ml 0.1 M MES buffer pH 6.3 with 100-150 μg antibody; coupling reaction at room temperature for 16 hours (over Night).
- 5. Neutralisation freier Bindungsstellen durch Zugabe von 100 μl 1 M Ethanolamine mit anschließender Inkubation für 1 Stunde.5. Neutralization of free binding sites by adding 100 μl of 1 M ethanolamine with following Incubation for 1 hour.
- 6. Separieren mittels Zentrifugation und waschen der funktionalisierten PMA-Partikel mit PBS 3 mal.6. Separate by centrifugation and wash the functionalized PMA particles with PBS 3 times.
-
7. Aufnahme der Maus-IgG-PMA-Partikel in 1 ml PBS pH 7,4 und
Lagerung bei 4°C. Überprüfung der
Antikörperkopplung
mittels Goat-anti-Maus Antikörper
PE markiert (
1 ).7. Incorporation of mouse IgG PMA particles in 1 ml PBS pH 7.4 and storage at 4 ° C. Verification of antibody coupling by means of Goat-anti-mouse antibody PE (1 ).
Spezifische Isolierung von Goat-anti-Maus-IgG aus einem Zell-Lysatspecific Isolation of Goat anti-mouse IgG from a cell lysate
- 1. 1 ml Zelllysat (HepG2, 4 × 106) werden mit 1 mg Goat-anti-Maus-IgG versetzt.1. 1 ml of cell lysate (HepG2, 4 × 10 6 ) is mixed with 1 mg Goat anti-mouse IgG.
- 2. Dem Proteingemisch werden 0,1 ml (100 μg Partikel) funktionalisierte Maus-IgG-PMA-Partikel Suspension zugegeben.2. The protein mixture is functionalized with 0.1 ml (100 μg of particles) Mouse IgG PMA particle suspension added.
- 3. 60 min bei Raumtemperatur wippend inkubieren.3. Incubate for 60 min at room temperature.
- 4. Trennen der Maus-IgG-PMA-Partikel (mit und ohne dem gebundenen Goat-anti-Maus-IgG) aus dem Zelllysat durch Filtration mittels einer speziellen Kammer mit einer Siebmembran (10 μm).4. Separate the mouse IgG PMA particles (with and without the bound Goat anti-mouse IgG) from the cell lysate by filtration through a special chamber with a sieve membrane (10 μm).
- 5. 3 × Waschen der PMA-Partikel mit je 5 ml PBS.5. Wash 3 times the PMA particle with 5 ml PBS each.
Ablösen und Qualifizierung des Proteins von den Partikeln.Replacement and qualification of the Protein from the particles.
- 1. Aufnahme der funktionalisierten PMA-Partikel mit den anhaftenden Proteinen aus der Siebkammer in 0,5 ml Citratpuffer pH 2,2; Inkubation für 30 min.1. Recording of the functionalized PMA particles with the adhering proteins from Siebkam in 0.5 ml citrate buffer pH 2.2; Incubation for 30 min.
- 2. Abtrennung der Partikeln durch eine Filtration mittels einer speziellen Kammer mit einer Siebmembran (10 μm); Waschen der Partikel mit 2 ml Citratpuffer.2. Separation of the particles by filtration by means of a special chamber with a sieve membrane (10 μm); Wash the particles with 2 ml citrate buffer.
-
3. Abgelöste
Proteine im Citratpuffer analysieren (
6 ).3. Analyze detached proteins in citrate buffer (6 ).
Ausführungsbeispiel 3Embodiment 3
Die
In
Legende zu den Abbildungen:Legend to the pictures:
- 11
- Zelllysat vor Proteinaufreinigungcell lysate before protein purification
- 22
- Eluierte Proteine von den Sephadex Beadseluted Proteins from the Sephadex Beads
- 33
- Eluierte Proteine von den Sephadex Beadseluted Proteins from the Sephadex Beads
- 44
- Zelllysat vor Proteinaufreinigungcell lysate before protein purification
- 11
- Gemisch von Zellen/Partikeln/Molekülenmixture of cells / particles / molecules
- 22
- Funktionalisierte Partikelfunctionalized particle
- 33
- Funktionalisierte Partikel mit den adsorbierten Zielzellen/Partikeln/Molekülenfunctionalized Particles with the adsorbed target cells / particles / molecules
- 11
- Medium mit Zellgemisch und funkionalisierten Parikelnmedium with cell mixture and functionalized particles
- 22
- Zellgemisch ohne funktionalisierte Partikelcell mixture without functionalized particles
- 33
- Zellgemisch mit funktionalisierten Partikelncell mixture with functionalized particles
- 44
- HohlfasermembranHollow fiber membrane
- 55
- Siebscree
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102012102999A1 (en) | 2012-04-05 | 2013-10-10 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Treating blood, blood products and/or organs under in vitro, and ex vivo condition, involves obtaining blood, blood products and/or organs from human or animal body and removing amyloid beta oligomers from products |
WO2013150126A2 (en) | 2012-04-05 | 2013-10-10 | Forschungzentrum Jülich Gmbh | Method for treating blood, blood products and organs |
US9464118B2 (en) | 2012-04-05 | 2016-10-11 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Polymers containing multivalent amyloid-beta-binding D-peptides and their use |
-
2005
- 2005-12-30 DE DE102005063175A patent/DE102005063175A1/en not_active Withdrawn
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102012102999A1 (en) | 2012-04-05 | 2013-10-10 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Treating blood, blood products and/or organs under in vitro, and ex vivo condition, involves obtaining blood, blood products and/or organs from human or animal body and removing amyloid beta oligomers from products |
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US9591845B2 (en) | 2012-04-05 | 2017-03-14 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Method for treating blood, blood products and organs |
US10123530B2 (en) | 2012-04-05 | 2018-11-13 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Method for treating blood, blood products and organs |
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