DE102005055689A1 - Preparation of an insecticide, useful for controlling insects on plants, comprises culturing the Yersinia bacteria at a specific temperature - Google Patents

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Abstract

Preparation of an insecticide using Yersinia bacteria comprises culturing the bacterium at -10[deg]C to 30[deg]C, where the insecticide contains toxin of the species Yersinia. An independent claim is included for an insecticide produced by the above process. ACTIVITY : Insecticide. MECHANISM OF ACTION : None given.

Description

1. Hintergrund der Erfindung, Stand der Technik1. Background of the invention, State of the art

Viele Insektenlarven und adulte Tiere gelten weithin als Schädlinge und können insbesondere, aber nicht nur, in der Landwirtschaft erheblichen wirtschaftlichen Schaden anrichten. Um Insektenschaden insbesondere an Nutzpflanzen zu verhindern, werden gewöhnlich starke organische Pestizide und solche mit breitem Wirtsspektrum verwendet. Diese synthetischen Produkte besitzen allerdings erhebliche Nachteile sowohl für die Umwelt wie auch für die Personen, die mit dem Pestizid in Kontakt kommen.Lots Insect larvae and adult animals are widely regarded as pests and can especially, but not only, in agriculture considerable cause economic damage. In particular, insect damage to prevent crops are usually strong organic pesticides and those having a broad host range. These synthetic ones However, products have significant disadvantages both for the environment as well as for the persons who come in contact with the pesticide.

Die Entwicklung neuer, umweltfreundlicher Strategien zur Schädlingsbekämpfung wird daher sowohl durch öffentliche Bedenken bezüglich der Umweltbelastung wie auch die Entwicklung biologischer Instrumente zur Insektenbekämpfung vorangetrieben. Biologische Kontrollmechanismen stellen eine vielversprechende Alternative zu chemischen Mitteln dar. Zum einen besteht in der Natur ein großes Potential an Verteidigungs- und Angriffsstrategien, mit denen Organismen ihren evolutionären Erfolg und ihr Überleben sicherstellen. Zum anderen erlauben die neuartigen Methoden der Gen- und Biotechnologie, biologische Insektizide zu verbessern bzw. zur Lösung spezifischer Probleme zu modifizieren.The Develop new, greener pest control strategies therefore both by public Concerns regarding the environmental impact as well as the development of biological instruments for insect control promoted. Biological control mechanisms are promising Alternative to chemical means Nature a big one Potential for defense and attack strategies with which organisms their evolutionary Success and their survival to ensure. On the other hand, the novel methods of Genetic engineering and biotechnology to improve biological insecticides to the solution to modify specific problems.

Ein Beispiel für eine solche biologische Abwehrwaffe ist Bacillus thuringiensis (Bt), das bereits kommerziell genutzt und in der Landwirtschaft eingesetzt wird. Das insektizide Agens dieses Bakteriums ist das sog. Bt-Toxin mit limitierter Toxizität, das aufgrund seiner Unschädlichkeit für den menschlichen Organismus noch bis zur Ernte eingesetzt werden kann. Das Toxin wird seit 20 Jahren in transgenen Pflanzen, z. B. in Mais, Baumwolle oder Kartoffeln, zur Anwendung gebracht. Eine weitere Gruppe biologischer Agentien zur Insektenkontrolle sind bestimmte Familien von Nematoden, die als Überträger symbiotischer Bakterien bekannt sind. Diese bilden insektizide Toxine. Nematoden, die Bakterien tragen, befallen Insektenlarven, und die Bakterien werden anschließend ins Hämatocöl der Insekten freigesetzt, was zum Tod der Insekten führt.One example for such a biological defense weapon is Bacillus thuringiensis (Bt), that already used commercially and used in agriculture becomes. The insecticidal agent of this bacterium is the so-called Bt toxin with limited toxicity, because of its harmlessness for the human organism can still be used until harvest. The toxin has been present in transgenic plants for 20 years, e.g. In corn, Cotton or potatoes, used. Another Group of biological insect control agents are specific Families of nematodes, which are more symbiotic transmitters Bacteria are known. These form insecticidal toxins. nematodes, the bacteria carry infestation insect larvae, and the bacteria will be afterwards in hematocol of insects released, which leads to the death of insects.

Nachteile der vorhandenen biologischen SchädlingsbekämpfungsmittelDisadvantages of the existing ones biological pesticides

Gegen das Bt-Toxin wurden bereits erste Resistenzentwicklungen bei Schädlingen beobachtet. Durch den in Zukunft massiveren Einsatz von Bt-transgenen Pflanzen erscheint jedoch deren nachhaltige Wirkung fragwürdig. Darüber hinaus erfordert der Einsatz des Bt-Toxins die Entwicklung transgener Pflanzen, da es seine Wirksamkeit nur als integrierter Bestandteil der zu schützenden Pflanzen entfalten kann. Die Entwicklung solcher transgener Pflanzen wiederum erfordert jedoch den Einbau sog. Markergene, bei denen es sich in der Regel um Antibiotika-Resistenzmechanismen handelt. Die Aufnahme transgener Pflanzen in den menschlichen Magen-Darmtrakt kann dann aber den Transfer der Resistenzgene auf Bakterien zur Folge haben. Die Entfernung solcher Antibiotika-Markergene ist technisch zwar möglich, erfordert jedoch einen hohen Forschungs- und Entwicklungsaufwand. Zudem handelt es sich bei transgenen Pflanzen um starre Systeme, die unnötigerweise auch dann Verwendung finden, wenn während einer Vegetationsperiode keine schädlichen Insekten auftreten. Durch diesen großflächigen und zeitlich ausgedehnten Kontakt der Pflanzen mit den Schädlingen wird eine Resistenzbildung geradezu induziert.Versus Bt toxin has already become the first resistance to pests observed. Due to the massive use of Bt transgenes in the future However, plants seem questionable about their long-term effects. Furthermore requires the use of the Bt toxin the development of transgenic plants, as it only affects its effectiveness as an integral part of the plants to be protected can. The development of such transgenic plants in turn requires However, the incorporation of so-called marker genes, which are usually are antibiotic resistance mechanisms. The recording transgenic But then the plants in the human gastrointestinal tract can Transfer of the resistance genes to bacteria result. The distance Although such antibiotic marker genes is technically possible, requires however, a high research and development effort. It also acts In transgenic plants are rigid systems that unnecessarily also find use when during a growing season no harmful Insects occur. Through this large and time-extended Contact of the plants with the pests a resistance formation is virtually induced.

Als Alternativen zum Bt-Toxin gelten insektizide Toxine, die insbesondere von Photorhabdus, Xenorhabdus oder Serratia produziert werden (s. Patentliste). Diese oder verwandte Toxinträger können jedoch nicht direkt als Biozide eingesetzt werden, da sie nicht für längere Zeit im Boden oder in Gewässern überleben können. Sie sind zum Überleben zudem häufig auf eine Lebensgemeinschaft mit Nematoden angewiesen. Allerdings ist es gegenwärtig schwierig, teuer und ineffizient, solche Nematoden zur Insektenkontrolle herzustellen, aufzubewahren, und dann zu applizieren. Insektizide Toxine müssen daher mit anderen Methoden wie Sprays oder Lockfallen, oder aber in Form transgener Pflanzen appliziert werden, mit den damit verbundenen Nachteilen. Außerdem ist das Wirtsspektrum dieser Toxine eingeschränkt, da sie kaum Varianz aufweisen. Nach der erstmaligen Beschreibung der Photorhabdus-Toxingene wird daran gedacht, über heterologe Expression zu einer effizienteren Gewinnung dieses potentiellen Toxins zu gelangen.When Alternatives to Bt toxin apply insecticidal toxins, in particular produced by Photorhabdus, Xenorhabdus or Serratia (s. Patents). However, these or related toxin carriers can not be used directly as Biocides are used since they are not left in the ground or in the soil for long periods of time Waters survive can. They are for survival also often relied on a partnership with nematodes. Indeed is it present difficult, expensive and inefficient, such insect control nematodes produce, store, and then apply. insecticides Toxins need therefore with other methods like sprays or lock traps, or else in the form of transgenic plants, with the associated Disadvantages. Furthermore the host range of these toxins is limited because they have little variance. After the first description of the Photorhabdus toxin genes will be thought about it heterologous expression for more efficient recovery of this potential To get toxins.

Nachteilig bei diesen bisher beschriebenen Methoden ist allerdings, dass

  • i) ein effizientes Expressionssystem für die Toxingene nicht bekannt ist,
  • ii) die Erzeugung rekombinanter Stämme zur Expression der Toxingene dadurch erschwert wird, dass für die volle Funktionalität der Toxine eine Vielzahl von genetischen Determinanten benötigt wird,
  • iii) die Gewinnung reiner Toxine zur Applikation ineffizient, teuer und aufwändig ist, und
  • iv) die Spezifität der enzymatisch wirksamen Proteine von Photorhabdus ein limitiertes Spektrum an Zielinsekten bedingt.
A disadvantage of these methods described so far, however, is that
  • i) an efficient expression system for the toxin genes is not known,
  • ii) the production of recombinant strains for the expression of toxin genes is made more difficult by the fact that the full functionality of the toxins requires a large number of genetic determinants,
  • iii) recovering pure toxins for application is inefficient, expensive and expensive, and
  • iv) the specificity of the enzymatic proteins of Photorhabdus requires a limited spectrum of target insects.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine effiziente Methode zur Gewinnung insektizider Toxine zu entwickeln, die gleichzeitig als Alternative zu schon bekannten Toxinen verwendet werden können. Diese Aufgabe wird durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch die Zusammensetzung mit den Merkmalen der Ansprüche 1–8 gelöst. Die hier vorgestellte Erfindung legt eine neue DNA-Sequenz aus Yersinia enterocolitica offen. Diese Sequenz kodiert für insektizide Toxine. Bislang war eine insektizide Wirkung von Yersinien oder deren so genannter insektizider Toxine nicht gezeigt worden. Das überraschende Ergebnis war nun, dass Extrakte von Y. enterocolitica, die an Insektenlarven verfüttert wurden, zu deren Tod führen. Die insektizide Wirkung dieser Toxine wird hier erstmals gezeigt. Eine weitere überraschende Feststellung war, dass die für die insektizide Wirkung von Y. enterocolitica verantwortlichen Gene bei 37°C nicht exprimiert werden. Vielmehr wurde gefunden, dass die Genexpression mit abnehmender Temperatur ansteigt, wobei ein Maximum der Expression bei etwa 10°C–25°C beobachtet wird. Die hier vorgestellte Erfindung liefert also eine neue Möglichkeit der Expression der Toxingene von Yersinien, die dazu führt, dass insektizide Toxine von Yersinien effizient gegen Insekten wirksam werden [Bresolin et al. (2005) Low temperature-induced insecticidal activity of Yersinia enterocolitica. Mol. Microbiol., in press]The object of the invention is therefore to develop an efficient method for obtaining insecticidal toxins, which can be used simultaneously as an alternative to known toxins. This object is achieved by the method with the features of claim 1 and by the composition tion with the features of claims 1-8 solved. The invention presented here discloses a new DNA sequence from Yersinia enterocolitica. This sequence encodes insecticidal toxins. So far, an insecticidal effect of Yersinia or its so-called insecticidal toxins has not been demonstrated. The surprising result was that extracts of Y. enterocolitica fed to insect larvae cause their death. The insecticidal activity of these toxins is shown here for the first time. Another surprising finding was that the genes responsible for the insecticidal activity of Y. enterocolitica are not expressed at 37 ° C. Rather, it has been found that gene expression increases with decreasing temperature, with maximum expression being observed at about 10 ° C-25 ° C. Thus, the present invention provides a new way of expressing the toxin genes of Yersinia, which causes insecticidal toxins of Yersinia to become effective against insects [Bresolin et al. (2005) Low temperature-induced insecticidal activity of Yersinia enterocolitica. Mol. Microbiol., In press]

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine einfache Art der Anwendung der hergestellten insektiziden Toxine zu entwickeln. Diese Aufgabe wird durch die Verwendung mit den Merkmalen des Anspruchs 9 gelöst. Dabei macht man sich zunutze, dass insektizide Toxine nur unter bestimmten Temperaturen, nämlich Umwelttemperaturen, exprimiert werden, und zwar in einem Organismus, der ubiquitär in der Umwelt vorkommt und sich dort auch vermehren kann. Das beschriebene bakterielle System kann somit zur direkten Applikation als Insektizid, oder zur Expression insektizider Polypeptide verwendet werden. In beiden Fällen führt die hier vorgestellte Erfindung dazu, dass insektizide Toxine von Yersinien effizient zur Anwendung gebracht werden können.A Another object of the invention is a simple type of application of the insecticidal toxins produced. This task will solved by use with the features of claim 9. there it makes use of the fact that insecticidal toxins only under certain Temperatures, namely Environmental temperatures, in an organism, the ubiquitous in occurs in the environment and can multiply there. The described bacterial system can thus be used directly as an insecticide, or for expression of insecticidal polypeptides. In both cases leads the invention presented here to insecticidal toxins of Yersinia can be applied efficiently.

2. Die Erfindung wird anhand der Abbildungen näher erläutert.2. The invention is explained in more detail with reference to the figures.

Es zeigenIt demonstrate

1: Die sog. Pathogenitätsinsel tc-PAIYe aus Y. enterocolitica. 1 : The so-called pathogenicity island tc-PAI Ye from Y. enterocolitica.

2: Nachweis der temperaturabhängigen insektiziden Aktivität von Y. enterocolitica, und der enzymatischen Aktivität von Polypeptid TcaA. 2 : Detection of the temperature-dependent insecticidal activity of Y. enterocolitica, and the enzymatic activity of polypeptide TcaA.

3: Expressionsprofil des Genes tcaA, das für eine Untereinheit des insektiziden Toxins kodiert. 3 : Expression profile of the gene tcaA which codes for a subunit of the insecticidal toxin.

4: Die Maxima der Expression des Genes tcaA bei verschiedenen Wachstumstemperaturen. 4 : The maxima of the expression of the gene tcaA at different growth temperatures.

5: Ähnlichkeiten der auf der Pathogenitätsinsel kodierten Proteine in Yersinia-Arten. 5 : Similarities of proteins encoded on the pathogenicity island in Yersinia species.

3. Detaillierte Beschreibung: Gegenstand, Wesensmerkmale, Vorteile und mögliche Anwendungen der hier vorgestellten Erfindung3. Detailed description: Subject, Essentials, Benefits and Possible Applications of Here presented invention

Die hier vorgestellte Erfindung liefert ein neuartiges insektizides Toxin, das von Bakterien der Gattung Yersinia produziert und freigesetzt wird. Die Toxingene sind auf einer sog. Pathogenitätsinsel (tc-PAIYe) von etwa 20 Kilobasen Länge lokalisiert. Diese Geninsel ist spezifisch für den verwendeten Stamm Y. enterocolitica W22703. Ähnliche, aber nicht gleiche Geninseln sind aus Y. pestis, Y. pseudotuberculosis und einem weiteren Y. enterocolitica-Stamm bekannt. Die Erfindung ist daher nicht beschränkt auf toxinkodierende Sequenzen, die hier offenbart werden. Von besonderem Interesse sind vielmehr weitere Yersinia-Stämme, die toxinkodierende Sequenzen tragen, und insektizide Proteine, die von Yersinien produziert werden.The present invention provides a novel insecticidal toxin produced and released by bacteria of the genus Yersinia. The toxin genes are located on a so-called pathogenicity island (tc-PAI Ye ) of about 20 kilobases in length. This gene island is specific to the strain Y. enterocolitica W22703 used. Similar but not identical gene islands are known from Y. pestis, Y. pseudotuberculosis and another Y. enterocolitica strain. The invention is therefore not limited to toxin-encoding sequences disclosed herein. Rather, of particular interest are other Yersinia strains carrying toxin-encoding sequences and insecticidal proteins produced by Yersinia.

Bestimmte in der Erfindung verwendete Ausdrücke haben die folgende Bedeutung:
Die hier diskutierten Proteine werden üblicherweise als „Insektizid" bezeichnet. Damit ist gemeint, dass die Proteine eine funktionale Aktivität gegenüber Insekten aufweisen. Mit „funktionaler Aktivität" ist gemeint, dass die Toxine zur Insektenkontrolle verwendet werden können, da die Toxine oral aktiv sind, und dass sie einen toxischen, wachstumshemmenden oder entwicklungshemmenden Effekt auf Insekten haben. Die Toxine können auch dazu in der Lage sein, die Nahrungsaufnahme von Insekten zu unterbrechen oder zu verhindern, was zum Tod der Insekten führen kann, aber nicht muss. Der Ausdruck „Yersinia-Toxin" meint jedes von Yersinien produziertes Protein mit funktionaler Aktivität gegenüber Insekten.Certain terms used in the invention have the following meaning:
The proteins discussed herein are commonly referred to as "insecticides." By "functional activity" is meant that the toxins can be used for insect control because the toxins are orally active. and that they have a toxic, growth-inhibiting or development-inhibiting effect on insects. The toxins may also be capable of disrupting or preventing the ingestion of insects, which may or may not result in the death of the insects. The term "Yersinia toxin" means any protein produced by Yersinia having functional activity against insects.

Wesensmerkmale, Vorteile und Anwendung der hier vorgestellten Erfindung werden mit den folgenden Einzelheiten offenkundig.Essentials Advantages and application of the invention presented here are with the following details.

Sequenz und insektizide Aktivität: Die vorliegende Erfindung beschreibt eine genetische Sequenz, eine sog. Genom- oder Pathogenitätsinsel, die aus dem Lebensmittelkeim Yersinia enterocolitica isoliert wurde (<210>1–11). Die isolierte Sequenz kodiert für insektizide Toxine (<210> 3, 4, 5, 6, 7) und für regulatorische Proteine (<210> 1, 2). Die in dieser Erfindung offengelegte Sequenz umfaßt weitere Virulenzdeterminanten, die an der insektiziden Wirkung von Yersinien auf Insekten beteiligt sind (<210> 8, 9, 10, 11). Dazu zählen zwei Phagen-ähnliche Gene, die für ein Holin und ein Endolysin kodieren. Die in 1 gezeigte Pathogenitätsinsel, die die hier offenbarte Sequenz aufweist, ist daher eine neue Virulenzdeterminante, die die insektiziden Eigenschaften von Y. enterocolitica essentiell bestimmt.Sequence and insecticidal activity: The present invention describes a genetic sequence, a so-called genome or pathogenicity island, isolated from the food germ Yersinia enterocolitica (<210> 1-11). The isolated sequence encodes insecticidal toxins (<210> 3, 4, 5, 6, 7) and regulatory proteins (<210> 1, 2). The sequence disclosed in this invention includes other virulence determinants involved in the insecticidal activity of Yersinia on insects (<210> 8, 9, 10, 11). These include two phage-like genes that code for a holin and an endolysin. In the 1 As shown, the pathogenicity island exhibited by the sequence disclosed herein is a novel virulence determinant which essentially determines the insecticidal properties of Y. enterocolitica.

Weiterhin wird hier demonstriert, dass diese Toxine von Y. enterocolitica eine biologische, d. h. insektizide Funktion besitzen. Das Toxin wirkt toxisch gegenüber Insekten. Das wird dadurch belegt, dass Extrakte eines Wildtyps von Y. enterocolitica nach Verfütterung an Insektenlarven des Tabakschwärmers (Manduca sexta) toxisch auf diese Larven wirken (2). Der Zusammenhang zwischen genetischen Determinanten (Toxingene) und der insektiziden Aktivität ist kausal (2). Dies wird dadurch belegt, dass eine Deletionsmutante von tcaA (<210> 3) nicht mehr toxisch wirkt, und dass die Toxizität des gleichen Stammes nach Komplemetierung durch ein rekombinantes tcaA-Gen wiederhergestellt wird.Furthermore, it is demonstrated here that these Y. enterocolitica toxins have a biological, ie insecticidal, function. The toxin is toxic to insects. This is evidenced by the fact that extracts of a wild-type Y. enterocolitica after being fed to insect larvae of the tobacco swarm (Manduca sexta) are toxic to these larvae ( 2 ). The relationship between genetic determinants (toxin genes) and insecticidal activity is causal ( 2 ). This is demonstrated by the fact that a deletion mutant of tcaA (<210> 3) is no longer toxic, and that the toxicity of the same strain is restored after completion by a recombinant tcaA gene.

Ausführungsbeispiel: Ein Y. enterocolitica-Stamm wird in 300 ml LB-Medium mit 20 μg/ml Nalidixinsäure für 48 h inkubiert. Die Kultur wird dann zentrifugiert (7000 × g, 15 min, 4°C), und das bakterielle Sediment wird dreimal in 10 ml PBS (10 mM Phosphatpuffer, pH 7.4; 2,7 mM KCl; 137 mM NaCl) gewaschen. Das letzte Pellet wird in 3 ml PBS aufgenommen und durch viermalige Ultraschallbehandlung lysiert (25% Leistung für 30 Sekunden). Das Zelllysat wird dann gefiltert (Porengröße 0,2 μm) und bei 4°C aufbewahrt. Die Proteinkonzentration wird gemessen und auf 0,2 mg/ml eingestellt. Jeweils 50 μl gibt man dann auf ein künstliches Futtermittel für Insektenlarven, das Streptomycin (20 μg/ml), Cefataxim und Tetracyclin (beide 100 μg/ml) enthält. Die Larven werden anschließend mehrerer Tage auf diesem Futtermittel kultiviert.Embodiment: A Y. enterocolitica strain is incubated in 300 ml of LB medium with 20 μg / ml nalidixic acid for 48 h. The culture is then centrifuged (7000 xg, 15 min, 4 ° C), and the Bacterial sediment is washed three times in 10 ml PBS (10 mM phosphate buffer, pH 7.4; 2.7mM KCl; 137 mM NaCl). The last pellet will taken in 3 ml PBS and by four times ultrasonic treatment lysed (25% power for 30 seconds). The cell lysate is then filtered (pore size 0.2 μm) and at 4 ° C stored. The protein concentration is measured and adjusted to 0.2 mg / ml. 50 μl each then you give up on an artificial Feed for insect larvae, the streptomycin (20 μg / ml), Cefataxim and tetracycline (both 100 μg / ml). The larvae are then several Cultivated days on this feed.

Expression der Yersinia-Toxine: Einige der für das insektizide Toxin kodierenden Gene, nämlich tcaA (<210> 3) und tcaB (<210> 4), die auf der genannten Pathogenitätsinsel tc-PAIYe liegen, werden von Y. enterocolitica bei 37°C kaum, bei Temperaturen zwischen 25°C und 10°C jedoch stark transkribiert werden (3, 4). Bei diesen Temperaturen erhält man also eine maximale Toxinexpression. Bei Körpertemperatur wird das Toxin dagegen nicht exprimiert. Es wird also bei einer Infektion des Menschen oder eines Säugetieres durch Y. enterocolitica von diesen nicht gebildet. Um das Yersinia-Toxin also effizient zu exprimieren, muss ein entsprechender Mikroorganismus bei Temperaturen zwischen 10°C und 25°C kultiviert werden. Ein entsprechender Mikroorganismus ein Vertreter einer Yersinia-Art, die die Toxingene. Die Induktion einzelner Toxin-Gene ist temperaturabhängig (3, 4). Insbesondere bewirkt eine Absenkung der Wachstumstemperatur von 37°C auf 10°C bis 25°C, dass die Transkription der enzymatisch aktiven Toxine um etwa 4.6 logarithmische Größenordnungen steigt (3, 4). Diese hier dargestellten, bislang unbekannten Transkriptions- und Expressionseigenschaften können also für eine hocheffiziente Expression der Toxine unter den definierten Bedingungen eingesetzt werden. Ebenso wünschenswert ist die Möglichkeit, den (heterologen) Träger der Toxingene unter nicht-permissiven Bedingungen (37°C) zu kultivieren, um unerwünschte Nebenwirkungen einer Überexpression zu verhindern. Die insektiziden Proteine können anschließend aufgereinigt werden. Um die Toxingene in einem anderen mikrobiellen Organismus oder in einer Yersinia-Art, die die Toxingene nicht enthält, zu exprimieren, ist die Anwesenheit von Promotorsequenzen und/oder regulatorischen Genen erforderlich. Insbesondere kann aber ein Teil der hier offengelegten Sequenz, der Promotoren und regulatorische Gene aufweist, verwendet werden. Das führt dazu, dass die oben beschriebenen Expressionseigenschaften erhalten bleiben. Für die Expression der Toxingene wichtige Promotorsequenzen befinden sich in Bezug auf die Transkriptionsrichtung vor der für die Toxine kodierenden Sequenzen. Dort befinden sich zudem zwei regulatorische Gene, tcaR1 und tcaR2.Expression of Yersinia Toxins: Some of the genes encoding the insecticidal toxin, tcaA (<210> 3) and tcaB (<210> 4), located on said pathogenicity island tc-PAI Ye are recognized by Y. enterocolitica at 37 Barely transcribed, but strongly transcribed at temperatures between 25 ° C and 10 ° C ( 3 . 4 ). Thus, at these temperatures, maximum toxin expression is obtained. At body temperature, however, the toxin is not expressed. It is therefore not formed in an infection of the human or a mammal by Y. enterocolitica of these. In order to efficiently express the Yersinia toxin, a corresponding microorganism must be cultured at temperatures between 10 ° C and 25 ° C. A corresponding microorganism is a member of a Yersinia species containing the toxin genes. The induction of individual toxin genes is temperature-dependent ( 3 . 4 ). In particular, lowering the growth temperature from 37 ° C. to 10 ° C. to 25 ° C. causes the transcription of the enzymatically active toxins to increase by approximately 4.6 logarithmic orders of magnitude ( 3 . 4 ). These previously unknown transcription and expression properties can thus be used for highly efficient expression of the toxins under the defined conditions. It is also desirable to be able to cultivate the (heterologous) carrier of toxin genes under non-permissive conditions (37 ° C) to prevent undesirable side effects of overexpression. The insecticidal proteins can then be purified. In order to express the toxin genes in another microbial organism or in a Yersinia species that does not contain the toxin genes, the presence of promoter sequences and / or regulatory genes is required. In particular, however, a portion of the sequence disclosed herein having promoters and regulatory genes may be used. As a result, the expression properties described above are preserved. Promoter sequences important for expression of the toxin genes are located upstream of the toxin coding sequences with respect to the direction of transcription. There are also two regulatory genes, tcaR1 and tcaR2.

Ausführungsbeispiel: Der Y. enterocolitica-Stamm W22703 wird in 10 ml LB-Medium mit 20 μg/ml Nalidixinsäure über Nacht inkubiert. Anschließend wird die Kultur in 100 ml LB-Medium mit 20 μg/ml Nalidixinsäure 1:10.000 verdünnt und bei einer Temperatur zwischen 10°C und 25°C inkubiert. Anschließend werden die überexprimierten Toxingene aufgereinigt, oder es werden Ganzzell-Proteinextrakte hergestellt (s. Ausführungsbeispiel oben).Embodiment: The Y. enterocolitica strain W22703 is dissolved in 10 ml of LB medium containing 20 μg / ml nalidixic acid overnight incubated. Subsequently the culture is in 100 ml of LB medium with 20 ug / ml nalidixic acid 1: 10,000 dilute and incubated at a temperature between 10 ° C and 25 ° C. Then be the overexpressed Toxin genes are purified or whole cell protein extracts produced (see embodiment above).

tcaA-Gene aus Yersinien: Die bislang untersuchten insektiziden Bakterien weisen unterschiedliche Wirtsspektren auf. Während P. luminescens stark letal auf Larven des Tabakschwärmers wirkt, ist die toxische Aktivität von X. nematophilus besonders ausgeprägt bei der Verfütterung an Larven von Pieris brassicae (Großer Kohlweißling). Ein Sequenzvergleich aller bislang in Yersinia-Stämmen identifizierten Toxin-Gene ergibt eine hohe Variabilität einzelner Genabschnitte. Zu den homologen Proteinen aus P. luminescens und anderen Yersinia-Arten weisen die in Y. enterocolitica gefundenen Tc-Proteine Ähnlichkeiten von 20–80% auf (5). Die genannten Befunde zeigen, dass Yersinia-Arten einen Pool von Toxin-Varianten enthalten, die sich gegen eine Vielzahl unterschiedlicher Insektenarten richtet. Das ermöglicht die Erzeugung von rekombinanten Yersinia-Stämmen (s. u.), in welche die variablen Abschnitte der Toxingene kloniert werden. Beispielsweise kann das tcaA-Gen des Stammes Y. enterocolitica W22703 durch das tcaA-Gen eines anderen Stammes mit den bekannten Methoden ersetzt werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das tcaA-Gen eines anderen Stammes in einen der bekannten Expressionsvektoren zu klonieren und den rekombinanten Vektor dann in die tcaA-Deletionsmutante des Stammes W22703 (W22703ΔtcaA) zu transferieren. Entsprechend kann mit Stämmen außer W22703 verfahren werden, die die genannte Pathogenitätsinsel nach der Übertragung aus W22703 enthalten. Die so hergestellten Stämme können dann aufgrund ihrer möglichen wirtsspezifischen Aktivitäten eingesetzt werden.tcaA genes from Yersinia: The insecticidal bacteria investigated so far have different host spectra. While P. luminescens is highly lethal to larvae of the tobacco swarmer, the toxic activity of X. nematophilus is particularly pronounced when fed to larvae of Pieris brassicae (Great cabbage white). A sequence comparison of all previously identified in Yersinia strains toxin genes results in a high variability of individual gene segments. Among the homologous proteins from P. luminescens and other Yersinia species, the Tc proteins found in Y. enterocolitica have similarities of 20-80% ( 5 ). These findings indicate that Yersinia species contain a pool of toxin variants that target a wide variety of insect species. This allows the generation of recombinant Yersinia strains (see below) into which the variable portions of the toxin genes are cloned. For example, the tcaA gene of the strain Y. enterocolitica W22703 can be replaced by the tcaA gene of another strain by the known methods. Another possibility is to clone the tcaA gene of another strain into one of the known expression vectors and then to transfer the recombinant vector into the tcaA deletion mutant of the strain W22703 (W22703ΔtcaA). Correspondingly, it is possible to proceed with strains other than W22703 which contain said pathogenicity island after the transfer from W22703. The thus prepared strains can then be used because of their possible host-specific activities.

Ausführungsbeispiel: Zunächst werden Yersinia-Stämme nach tcaA-Genen oder weiteren Toxingenen oder nach einer genannten Pathogenitätsinsel mit Toxingenen abgesucht. Diese Suche geschieht mit Southern-Blot-Analyse, oder mittels PCR. Zur Southern-Blot-Analyse wird mittels der Primerkombination A (5'-ggtgctgaagtcaacacc-3') and B (5'-aggaacttcctgactgcg-3') eine Sonde hergestellt, die an die Nukleotide 144 bis 572 von tcaB1 bindet. Zur PCR-Detektion werden die Oligonukleotide eingesetzt, die spezifisch für die einzelnen Toxingene sind. Solcherart detektierte Gene werden dann mittels PCR (mögliche Primer: 5'-ccggaattcgaaaaaggtgctggac-3' und 5'-ccggaattctgagtgggtaagttcatc-3' amplifiziert und in den Vektor pACYC184 über die Schnittstelle EcoRI kloniert. Das rekombinante Vektorkonstrukt wird dann durch Transformation in einen Yersinien-Stamm überführt.Embodiment: First become Yersinia strains after tcaA genes or other toxin genes or after one Pathogenicity island with Searched toxin genes. This search is done with Southern blot analysis, or by PCR. For Southern blot analysis by means of the primer combination A (5'-ggtgctgaagtcaacacc-3 ') and B (5'-aggaacttcctgactgcg-3') prepared a probe, which binds to nucleotides 144 to 572 of tcaB1. For PCR detection the oligonucleotides are used which are specific to the individual Toxin genes are. Such genes are then detected by PCR (possible Primer: 5'-ccggaattcgaaaaaggtgctggac-3 'and 5'-ccggaattctgagtgggtaagttcatc-3' amplified and into the vector pACYC184 the interface EcoRI cloned. The recombinant vector construct is then transformed into a Yersinia strain by transformation.

Applikationen des Yersinia-Toxins: Es gibt mehrere Möglichkeiten, wie das Toxin von Insekten aufgenommen werden kann. Es ist beispielsweise möglich, die von Insektenlarven aufgenommene Nahrung mit dem gereinigten Toxin zu besprühen. Das Toxin könnte aber auch direkt durch orale Aufnahmen von Yersinien-Bakterien ohne den Umweg der Aufreinigung aufgenommen werden.applications Yersinia toxin: There are several options, such as the toxin can be absorbed by insects. It is possible, for example, the food taken from insect larvae with the purified toxin to spray. The Toxin could but also directly by oral images of Yersinia bacteria without taken the detour of the purification.

Die Gruppe der Yersinien beinhaltet die drei humanpathogenen Spezies Yersinia pseudotuberculosis und Yersinia enterocolitica, die beide gastrointestinale Erkrankungen in Säugetieren auslösen können, sowie Yersinia pestis, den Erreger der Pest. Allerdings sind auch eine Reihe nicht-humanpathogener Yersinia-Arten bekannt, z. B., aber nicht nur, Y. ruckeri, Y. kristensenii, Y. frederiksenii, Y. intermedia, und Y. aldovae, die ubiquitär in der Umwelt vorkommen. Ihr besonderes Kennzeichen ist das Wachstum bei niedrigen Temperaturen bis unter 0°C. Dies ermöglicht ihnen ihre genetische Ausstattung und zeichnet sie vor anderen Bakterien aus. Diese Stämme können Gene der beschriebenen Pathogenitätsinsel besitzen. Diese Gene können aber auch zum Teil oder vollständig fehlen. Im Rahmen der hier beschriebenen Erfindung können diese nicht-humanpathogenen Arten mit den zur Toxin-Expression nötigen Determinanten ausgestattet werden. Dazu wird die angegebene Nukleotidsequenz ganz oder in Teilen in diese nicht-pathogenen Arten transferiert. Das Ergebnis dieses Prozesses sind dann rekombinante Stämme, die die Nukleotidsequenz chromosomal inseriert tragen, oder auf einem frei replizierenden Vektor. Die Toxinexpression erfolgt dann in der gleichen Weise wie für Y. enterocolitica beschrieben. Im Gegensatz zu einem humanpathogenen Stamm können diese rekombinanten Toxinträger dann direkt als Insektizid in die Umwelt ausgebracht werden. Die Überlebensvorteile von Yersinien bei Umwelttemperatur, sowie die Überexpression der Toxingene bei den gleichen Temperaturen, stellen nach Aufnahme durch das Zielinsekt ein ideales biologisches Insektizid dar, das billig und effizient herstellbar ist und leicht appliziert werden kann.The Group of Yersinia includes the three human pathogenic species Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica, both can trigger gastrointestinal diseases in mammals, as well Yersinia pestis, the causative agent of the plague. However, there is one too Series of non-human pathogenic Yersinia species, e.g. B., but not only Y. ruckeri, Y. kristensenii, Y. frederiksenii, Y. intermedia, and Y. aldovae, the ubiquitous occur in the environment. Its special feature is the growth in low temperatures below 0 ° C. This allows them their genetic Equipment and distinguishes it from other bacteria. These strains can be genes the described pathogenicity island have. These genes can but also partly or completely absence. Within the scope of the invention described herein, these may non-human pathogenic species with the determinants necessary for toxin expression be equipped. For this, the specified nucleotide sequence is whole or partially transferred to these non-pathogenic species. The The result of this process are then recombinant strains that carry the nucleotide sequence chromosomally inserted, or on a freely replicating vector. Toxin expression then takes place in the same way as for Y. enterocolitica. Unlike a human pathogen Tribe can do this recombinant toxin carrier then be applied directly as an insecticide in the environment. The survival benefits of Yersinia at ambient temperature, as well as the overexpression of toxin genes at the same temperatures, post intake by the target insect An ideal biological insecticide that is cheap and efficient can be produced and easily applied.

Ausführungsbeispiel: Der Y. enterocolitica-Stamm W22703 wird in 10 ml LB-Medium mit 20 μg/ml Nalidixinsäure über Nacht inkubiert. Anschließend wird die Kultur in 100 ml LB-Medium mit 20 μg/ml Nalidixinsäure 1:10.000 verdünnt und bei einer Temperatur zwischen 10°C und 25°C inkubiert. Anschließend werden die Bakterienzellen aufgereinigt auf Pflanzen ausgebracht, wo sie von den Insekten oder ihren Larven aufgenommen werden.Embodiment: The Y. enterocolitica strain W22703 is dissolved in 10 ml of LB medium containing 20 μg / ml nalidixic acid overnight incubated. Subsequently the culture is in 100 ml of LB medium with 20 ug / ml nalidixic acid 1: 10,000 dilute and incubated at a temperature between 10 ° C and 25 ° C. Then be The bacterial cells purified on plants are applied to where they are be picked up by the insects or their larvae.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.It follows a sequence listing according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can from the official publication platform downloaded from the DPMA.

Claims (10)

Ein Verfahren zur Herstellung eines Insektizids, das unter Verwendung eines Bakteriums der Gattung Yersinia hergestellt wird, wobei das Bakterium bei Temperaturen zwischen –10°C und 30°C kultiviert wird und insektizide Toxingene aus der Gattung Yersinia enthält.A method for producing an insecticide, that produced using a bacterium of the genus Yersinia wherein the bacterium is cultured at temperatures between -10 ° C and 30 ° C and insecticidal toxin genes of the genus Yersinia. Ein Verfahren zur Herstellung eines Insektizids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein insektizides Yersinia-Toxin mittels einer gereinigten Kultur einer nicht humanpathogenen Yersinia-Art hergestellt wird.A process for the preparation of an insecticide Claim 1, characterized in that an insecticidal Yersinia toxin by means of a purified culture of a non-human pathogenic Yersinia species will be produced. Ein Verfahren zur Herstellung eines Insektizids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein insektizides Yersinia-Toxin mittels einer gereinigten Kultur der Art Yersinia enterocolitica hergestellt wird.A process for the preparation of an insecticide Claim 1, characterized in that an insecticidal Yersinia toxin by means of a purified culture of the species Yersinia enterocolitica will be produced. Ein Verfahren zur Herstellung eines Insektizids nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein insektizides Yersinia-Toxin mittels einer gereinigten Kultur des Stammes Yersinia enterocolitica W22703 hergestellt wird.A process for the preparation of an insecticide Claim 3, characterized in that an insecticidal Yersinia toxin by means of a purified culture of the strain Yersinia enterocolitica W22703 is produced. Ein Verfahren zur Herstellung eines Insektizids nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein insektizides Yersinia-Toxin mittels einer gereinigten Kultur des Stammes Yersinia enterocolitica W22703ΔtcaA hergestellt wird.A process for the preparation of an insecticide Claim 4, characterized in that an insecticidal Yersinia toxin by means of a purified culture of the strain Yersinia enterocolitica W22703ΔtcaA becomes. Ein Verfahren zur Herstellung eines Insektizids nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass ein insektizides Yersinia-Toxin durch die Sequenzen <210> 1–11 repräsentiert wird.A method for producing an insecticide according to any one of claims 1-5, characterized in that an insecticidal Yersinia toxin the sequences <210> 1-11 are represented. Ein Verfahren zur Herstellung eines Insektizids nach dem Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein insektizides Yersinia-Toxin mittels der in den Sequenzen <210> 1–11 enthaltenen Promoter- und Regulatorsequenzen hergestellt wird.A process for the preparation of an insecticide to claim 6, characterized in that an insecticidal Yersinia toxin by means of the promoter and regulator sequences contained in the sequences <210> 1-11 will be produced. Ein Verfahren zur Herstellung eines Insektizids nach einem der Ansprüche 1–7, dadurch gekennzeichnet, dass ein insektizides Yersinia-Toxin bei Temperaturen zwischen 10°C und 25°C produziert wird.A process for the preparation of an insecticide one of the claims 1-7, by characterized in that an insecticidal Yersinia toxin at temperatures between 10 ° C and 25 ° C is produced. Ein Insektizid, dadurch gekennzeichnet, dass es nach einem der Ansprüche 1–8 hergestellt wird.An insecticide, characterized in that it after one of the claims 1-8 made becomes. Die Verwendung eines nach dem Anspruch 9 hergestellten Insektizids zur Kontrolle von Insekten, dadurch gekennzeichnet, dass Yersinien auf Pflanzen ausgebracht werden.The use of a manufactured according to claim 9 Insecticide for the control of insects, characterized that Yersinia be applied to plants.
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US20040055036A1 (en) * 1997-07-17 2004-03-18 Commonwealth Scientific And Industrial Organisation Toxin genes from the bacteria xenorhabdus nematophilus and photorhabdus luminescens

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