DE102005042544A1

DE102005042544A1 - Influencing the Cardiac Fc Receptor for the Treatment of Dilated Cardiomyopathy

Info

Publication number: DE102005042544A1
Application number: DE102005042544A
Authority: DE
Inventors: Alexander PD Dr. med. Staudt; Andreas Prof. Dr. med. Greinacher; Stephan Prof. Dr. med. Felix; Petra Dr. rer. med. Eichler; Christiane Timpert
Original assignee: Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald
Current assignee: FELIX, STEPHAN, PROF.DR.MED., 17489 GREIFSWALD, DE; STAUDT, ALEXANDER, PROF.DR.MED., 17498 NEUENKI, DE
Priority date: 2005-09-07
Filing date: 2005-09-07
Publication date: 2007-03-08
Also published as: WO2007028592A1; WO2007028592B1

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von funktionellen Antikörpern oder Teilen davon sowie von Wirkstoffen zur Herstellung von Medikamenten zur Verfügung, die eine Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie (DCM) ermöglichen. Insbesondere dienen die Medikamente der Beeinflussung der Fc-Rezeptoren, die erstmalig auf Herzmuskelzellen nachgewiesen werden konnten. Diese Befunde und die bereitgestellten Medikamente dienen der Behandlung einer der häufigsten Herzerkrankungen.The present invention provides the use of functional antibodies or parts thereof as well as active substances for the manufacture of medicaments which enable the treatment of dilated cardiomyopathy (DCM). In particular, the drugs serve to influence the Fc receptors, which could be detected for the first time on cardiac muscle cells. These findings and the medications provided are used to treat one of the most common heart diseases.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Antikörpern oder Teilen davon, oder von funktionellen Äquivalenten von Antikörpern oder Teilen davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie. Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung von Wirkstoffen zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die in der Lage sind, die Aktivität des Fc-Receptors auf Herzmuskelzellen bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie zu beeinflussen, das heißt deren Aktivität zu reduzieren.The The present invention relates to the use of antibodies or Parts thereof, or of functional equivalents of antibodies or parts of which for the manufacture of a medicament for the treatment of the dilated Cardiomyopathy. Furthermore, the invention relates to the use of active ingredients for the preparation of pharmaceutical compositions, which are able to increase the activity of the Fc receptor on heart muscle cells in patients with dilated cardiomyopathy, the is called their activity to reduce.

Hintergrund der Erfindungbackground the invention

Die dilatative Kardiomyopathie ("dilative cardiomyopathy", DCM) ist eine Erkrankung des Herzmuskels, bei der die Herzkammern vergrößert sind. Gleichzeitig ist die Pumpfähigkeit des Herzen eingeschränkt. Dadurch kommt es zu einer Minderversorgung des Organismus und zu den Krankheitssymptomen einer Herzschwäche (Herzinsuffizienz, Herzrhythmusstörungen) (P. Richardson et al., Report of the 1995 WHO/International Society and Federation of Cardiology Task Force on the Definition and Classification of Cardiomyopathies, Circulation 1996, 93, 841–842; A. Nohria et al., JAMA 2002, 287, 628–640).The dilated cardiomyopathy ("dilative cardiomyopathy " DCM) is a disease of the heart muscle in which the ventricles are enlarged. simultaneously is the pumpability of the heart restricted. This leads to a shortage of the organism and to the symptoms of heart failure (heart failure, cardiac arrhythmia) (Richardson, et al., Report of the 1995 WHO / International Society and Federation of Cardiology Task Force on the Definition and Classification of Cardiomyopathies, Circulation 1996, 93, 841-842; A. Nohria et al., JAMA 2002, 287, 628-640).

Die dilatative Kardiomyopathie ist die häufigste Form der Herzmuskelerkrankung. Allein in Deutschland sind rund 500.000 Menschen betroffen. Dabei sind Männer häufiger betroffen als Frauen. Das betrifft die Formen der dilatativen Kardiomyopathie, bei der keine Entstehungsursache erkennbar ist. Diese Form wird auch als idiopathische (ohne erkennbare Ursache) dilatative Kardiomyopathie bezeichnet.The Dilated cardiomyopathy is the most common form of heart muscle disease. In Germany alone, around 500,000 people are affected. there are men frequently affected as women. This concerns the forms of dilated cardiomyopathy, in which no cause of origin is recognizable. This shape will also as an idiopathic (without identifiable cause) dilated cardiomyopathy designated.

Als ein möglicher Auslöser für eine dilatative Kardiomyopathie werden Virusinfektionen vermutet, denn bei vielen Betoffenen hat man in Untersuchungen eine Viruspersistenz im Herzmuskel festgestellt. Außerdem ist bei vielen Betroffenen eine erhöhte Produktion von Immunglobulinen (Antikörpern) vom Typ IgG vorhanden, was auf eine Aktivierung des Immunsystems durch einen Erreger hinweist.When a possible one trigger for one dilated cardiomyopathy, viral infections are suspected because Many patients have a virus persistence in examinations detected in the heart muscle. Furthermore is an increase in the production of immunoglobulins in many sufferers (Antibodies) IgG type is present, indicating activation of the immune system indicated by a pathogen.

Das Immunsystem kann nicht nur durch äußere Anstöße angeregt werden. Unter bestimmten Umständen kann der körpereigene Schutzmechanismus auch den eigenen Körper angreifen: das Immunsystem des Menschen ist so aufgebaut, dass es praktisch gegen jede beliebige Kombination von Eiweißkörpern (Proteinen) aktiv werden kann. Da der Mensch selbst eine Vielzahl unterschiedlicher Eiweiße herstellt, kann das Immunsystem sich auch gegen diese körpereigenen Strukturen wenden. Um das zu verhindern, werden die Abwehrzellen im Lymphsystem im Verlauf ihrer Reifung zu Zellen mit unterschiedlichen Funktionen "ausgebildet". Abwehrzellen, die gegen den eigenen Körper gerichtet sind, werden aussortiert. Diese Fähigkeit des Immunsystems wird als Immuntoleranz bezeichnet.The Immune system can not be stimulated only by external impulses. Under certain circumstances the body's own Protective mechanism also attacking your own body: the immune system of man is constructed so that it is practically against any Combination of protein bodies (proteins) can become active. Because man himself is a variety of different proteins The immune system can also fight against this body's own Turn structures over. To prevent that, the immune cells become in the lymphatic system in the course of their maturation to cells with different Functions "trained". Immune cells that against your own body are sorted out. This ability of the immune system will termed immune tolerance.

Im Laufe eines Lebens kann beim Menschen die Immuntoleranz verloren gehen oder geschwächt werden. Dann entwickelt das Immunsystem Antikörper gegen das eigene Körpergewebe. Diese Antikörper werden deshalb auch als Autoantikörper bezeichnet.in the Over the course of a lifetime, immune tolerance in humans can be lost go or be weakened. Then the immune system develops antibodies against its own body tissue. These antibodies are therefore also called autoantibodies.

Eine derartige Reaktion (Autoimmunreaktion) wird als Ursache von Autoimmunerkrankungen angesehen.A Such a reaction (autoimmune reaction) is considered to be the cause of autoimmune diseases.

Antigene sind Stoffe, die vom Immunsystem als körperfremd erkannt und bekämpft werden. Sie lösen eine Immunreaktion (Immunantwort) aus. Dabei werden die vom Körper als fremd erkannten Antigene durch Antikörper bekämpft, die von bestimmten Zellen des Immunsystems produziert werden. Die Antikörper heften sich an die Antigene und behindern so z.B. die Vermehrung von Viren, oder sie markieren Bakterien, so dass diese durch Phagozyten (Makrophagen, Monozyten und Granulozyten) erkannt und bekämpft werden können. Dabei muss für jedes Antigen ein ganz bestimmter, spezifischer Antikörper produziert werden.antigens are substances that are recognized and combated by the immune system as foreign. They solve an immune reaction (immune response). Here, the body as foreign antigens recognized by antibodies fought by specific cells of the immune system. The antibodies attach to the antigens and hinder, e.g. the multiplication of viruses, or they mark bacteria, so that these by phagocytes (macrophages, monocytes and granulocytes) recognized and combated can be. It must be for each antigen produces a very specific, specific antibody become.

Zur Zerstörung der Antigene werden sie über den angebundenen Antikörper an Antikörperbindungsstellen (Fc-Rezeptoren) angelagert, die sich auf der Zellmembran der Phagozyten befinden. Durch Aktivierung kontraktiler Strukturen werden die Antikörper mitsamt den gebundenen Antigenen in das Innere der Phagozyten aufgenommen (phagozytiert) und abgebaut.to destruction the antigens they are about attached antibody at antibody binding sites (Fc receptors) attached to the cell membrane of phagocytes are located. By activation of contractile structures, the antibodies are included the bound antigens are incorporated into the interior of the phagocytes (phagocytosed) and degraded.

Körpereigene Strukturen können auch wie Antigene erscheinen, wenn sie vom Immunsystem fälschlicherweise als fremd angesehen werden. Dadurch wird die oben bezeichnete Autoimmunreaktion ausgelöst. Im Falle der dilatativen Kardiomyopathie wird vermutet, dass auch solche Autoimmunmechanismen für die zunehmende Herzmuskelschwäche verantwortlich gemacht werden können (H. Nishimura et al., Science 2001, 291, 319–322; T. Okazaki et al., Nat. Med. 2003, 9, 1477–1483).Endogenous Structures can Also, as antigens appear when mistaken by the immune system be regarded as foreign. This triggers the above-mentioned autoimmune reaction. In the event of Dilated cardiomyopathy is thought to be synonymous Autoimmune mechanisms for the increasing heart muscle weakness responsible can be made (H. Nishimura et al., Science 2001, 291, 319-322; T. Okazaki et al., Nat. Med. 2003, 9, 1477-1483).

Herkömmliche Ansätze vor dem Hintergrund der Autoimmunreaktionsvermutung zur Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie setzen an einer Reinigung des Blutes des Patienten an. Dabei werden aus dem Plasma die entsprechenden (Auto-) Antikörper durch Immunadsorptionsverfahren herausgefiltert. Die Immunadsorption ist ein invasives Verfahren, das unspezifisch oder spezifisch Antikörper herausfiltern kann, und allgemein die betreffende Antikörpergruppe (Immunglobuline IgG) temporär eliminiert. Eine Unterdrückung der Immunreaktion (sogenannte Immunsuppression) und somit auch eine Unterdrückung der Schädigung des Herzmuskelgewebes durch die Autoantikörper ist die Folge. Allerdings ist ein Ersetzen der herausgefilterten Antikörper durch körperfremde Antikörper notwendig. Nebenwirkungen sind eine verminderte oder gar fehlende Abwehrkraft gegenüber Infektionen. Des weiteren sind diese Verfahren sehr zeitaufwendig und kostenintensiv.Conventional approaches against the background of the autoimmune reaction presumption for the treatment of dilated cardiomyopathy are based on a purification of the blood of the patient. The corresponding (auto) antibodies are filtered out of the plasma by immunoadsorption methods. Immunoadsorption is an invasive procedure which can filter out nonspecific or specific antibodies and, in general, temporarily eliminates the relevant antibody group (immunoglobulins IgG). A suppression of the immune reaction (so-called immunosuppression) and thus a suppression of the damage of the heart muscle tissue by the autoantibodies is the result. However, it is necessary to replace the antibodies filtered out by antibodies that are foreign to the body. Side effects are a diminished or even lack of resistance to infections. Furthermore, these methods are very time consuming and costly.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie bereitzustellen, das nicht das allgemeine und unspezifische Herausfiltern von Antikörpern durch die invasive Immunadsorption erfordert und dadurch die Immunsuppression und die damit verbundenen Nebenwirkungen vermeiden kann.Of the The present invention is therefore based on the object, a method to provide for the treatment of dilated cardiomyopathy, this is not the general and nonspecific filtering out of antibodies invasive immunoadsorption requires immunosuppression and avoid the associated side effects.

Beschreibung der Zeichnungendescription the drawings

1 zeigt die Wirkung intakter IgG/Antikörperfragmente auf isolierte, feldstimulierte Ratten-Herzmuskelzellen. Veränderungen der Calcium-Transienten und der systolischen Zellverkürzung während der Inkubation (% Änderung gegenüber dem Ausgangswert + SEM) mit:

A) Intakten IgG aus dem Plasma gesunder Blutspender (Kontroll-IgG, n = 11)
B) Intakten IgG von DCM-Patienten (DCM IgG, n = 11)
C) F(ab')₂-Fragmenten der entsprechenden DCM IgG (n = 11)
D) Intakten DCM-IgG nach Präinkubierung mit den F(ab')₂-Fragmenten der entsprechenden DCM-Patienten (n = 11)
E) Intakten DCM-IgG nach Präinkubierung mit den F(ab')₂-Fragmenten der Kontrollen (n = 11)
F) Intakten DCM-IgG nach Präinkubierung der Herzmuskelzellen mit humanen Fc-Fragmenten (n = 6)
G) Ziege-anti-Mensch-F(ab')-IgG nach Präinkubierung mit F(ab')₂-Fragmenten der entsprechenden DCM-Patienten (n = 11)

+++ p < 0,001 signifikant verschieden von den Kontroll-IgG
*** p < 0,001 signifikant verschieden von den DCM-IgG 1 shows the effect of intact IgG / antibody fragments on isolated, field-stimulated rat myocardial cells. Changes in calcium transients and systolic cell shortening during incubation (% change from baseline + SEM) with:

A) Intact IgG from the plasma of healthy blood donors (control IgG, n = 11)
B) Intact IgG of DCM patients (DCM IgG, n = 11)
C) F (ab ') ₂ fragments of the corresponding DCM IgG (n = 11)
D) Intact DCM-IgG after preincubation with the F (ab ') ₂ fragments of the corresponding DCM patients (n = 11)
E) Intact DCM-IgG after preincubation with the F (ab ') ₂ fragments of the controls (n = 11)
F) Intact DCM-IgG after preincubation of the heart muscle cells with human Fc fragments (n = 6)
G) goat anti-human F (ab ') - IgG after preincubation with F (ab') ₂ fragments of the corresponding DCM patients (n = 11)

+++ p <0.001 significantly different from the control IgG
*** p <0.001 significantly different from DCM IgG

2 ist eine Zusammenfassung der funktionellen Befunde. Intakte IgG von DCM-Patienten induzieren negative inotrope Wirkungen (A), ihre entsprechenden F(ab')2-Fragmente hingegen nicht (B). Diese F(ab')2-Fragmente inhibierten die Wirkung intakter DCM-IgG (C), wie auch die Fc-Fragmente normaler IgGs (D). Die Rekonstituierung der Fc-Teile durch aufeinander folgende Inkubierung der Herzmuskelzellen mit DCM F(ab')2-Fragmenten und Ziege-anti-Mensch-F(ab')-IgG induzierte eine negative inotrope Wirkung (E); (AG = Antigen; FcγRIIa = Fcγ-Rezeptor IIa). 2 is a summary of the functional findings. Intact IgG from DCM patients induce negative inotropic effects (A) but their corresponding F (ab ') 2 fragments do not (B). These F (ab ') 2 fragments inhibited the effect of intact DCM-IgG (C), as did the Fc fragments of normal IgGs (D). Reconstitution of the Fc portions by sequential incubation of the heart muscle cells with DCM F (ab ') 2 fragments and goat anti-human F (ab') IgG induced a negative inotropic effect (E); (AG = antigen; FcγRIIa = Fcγ receptor IIa).

Gegenstand der Erfindungobject the invention

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie zur Verfügung, indem Antikörper oder Teile bzw. Äquivalente der Antikörper oder von deren Teilen verwendet werden, um Medikamente zur Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie herzustellen. Ebenfalls zur Verfügung gestellt werden Verfahren zur Herstellung von Medikamenten, die Wirkstoffe enthalten, welche die Aktivität des Fc-Receptors auf Herzmuskelzellen direkt oder indirekt beeinflussen, und die der Behandlung von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie dienen.The The present invention provides methods for the treatment of the dilated Cardiomyopathy available, by antibodies or parts or equivalents the antibody or parts thereof are used to treat medication of dilated cardiomyopathy. Also provided Become methods of making drugs, the active ingredients contain the activity directly or indirectly affect the Fc receptor on heart muscle cells, and which are used to treat patients with dilated cardiomyopathy.

Die Erfindung beruht auf dem unerwarteten Befund, dass Antikörperbindungsstellen (Fc-Rezeptoren) nicht nur auf Zellen des Immunsystems zu finden sind, sondern auch auf Herzmuskelzellen. Auf der Basis dieses Befundes kann die für die dilatative Kardiomyopathie charakteristische fortschreitende Verminderung der Leistungsfähigkeit des Herzen beispielsweise durch eine Blockierung der Fc-Rezeptoren, vorzugsweise durch eine spezifische Blockierung, und damit durch Verhinderung der Bindung von Antikörpern an die Herzmuskelzellen behandelt werden.The The invention is based on the unexpected finding that antibody binding sites (Fc receptors) not only to find cells of the immune system are, but also on heart muscle cells. On the basis of this finding can the for the dilated cardiomyopathy characteristic progressive diminution the efficiency of the heart, for example by blocking the Fc receptors, preferably by a specific blocking, and thus by prevention the binding of antibodies be treated to the heart muscle cells.

Unter Antikörpern sind vollständige Antikörper, insbesondere humanen Ursprungs zu verstehen. Ebenfalls verwendet werden können erfindungsgemäß Antikörperteile, insbesondere Fc-Fragmente, F(ab')₂ oder F(ab')-Fragmente etc. Auch modifizierte Antikörper, beispielsweise humanisierte Antikörper oder andere mittels rekombinanter Technik hergestellter Antikörper, wie z.B. einzellkettige variable Domänen (so genannt scFv), können verwendet werden.Antibodies are to be understood as meaning complete antibodies, in particular of human origin. Antibody parts, in particular Fc fragments, F (ab ') ₂ or F (ab') fragments etc. can also be used according to the invention. Also modified antibodies, for example humanized antibodies or other antibodies produced by recombinant technology, such as single-chain variable domains (cf. called scFv) can be used.

Die Antikörper können mit Hilfe von auf diesem Fachgebiet allgemein bekannten Technologien hergestellt werden und umfassen auch monoklonale und polyklonale Antikörper.The antibody can manufactured using technologies well known in the art and also include monoclonal and polyclonal antibodies.

Ebenfalls von der Erfindung umfasst, sind funktionelle Äquivalente der Antikörper oder deren Fragmente. Diese funktionellen Äquivalente können mit Hilfe der im experimentellen Teil beschriebenen Verfahren in vitro identifiziert werden. Sie umfassen beispielsweise Proteine (Poly- oder Oligopeptide), kleine organische Moleküle etc., so lange diese in der Lage sind, die intrazellulären Calcium-Transienten und/oder die systolische Zellverkürzung zu beeinflussen, indem sie die Aktivität des Herzmuskel-Fc-Rezeptors direkt oder indirekt beeinflussen, d.h. dass sie dessen Aktivität reduzieren, bestenfalls blockieren.Also encompassed by the invention are functional equivalents of the antibodies or fragments thereof. These functional equivalents can be identified in vitro using the methods described in the experimental section. They include, for example, proteins (poly- or oligopeptides), small organic molecules, etc., as long as they are in the They are able to influence the intracellular calcium transients and / or the systolic cell shortening by directly or indirectly influencing the activity of the cardiac muscle Fc receptor, ie by reducing its activity, at best blocking it.

Ferner stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Wirkstoffen zur Beeinflussung der Aktivität des Fc-Rezeptors zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie bereit.Further The present invention provides the use of active ingredients for influencing the activity of the Fc receptor for the manufacture of a medicament for treatment dilated cardiomyopathy.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Inhibitoren um Fc-Fragmente von Antikörpern, bevorzugt Fc-Fragmente von IgG-Antikörpern und ganz besonders bevorzugt IgG3-Fragmente. Diese Fragmente können mit Hilfe bekannter Verfahren gewonnen werden, beispielsweise durch die Spaltung von Antikörpern mit Enzymen wie Pepsin. Es können auch rekombinant hergestellte Fc-Fragmente verwendet werden, die wiederum eine modifizierte Aminosäuresequenz aufweisen können, indem beispielsweise einzelne oder mehrere ausgetauscht, deletiert oder Aminosäuren hinzugefügt wurden. Verfahren zur Rekombination von Genen sind dem Fachmann einschlägig bekannt.In a preferred embodiment the inhibitors are Fc fragments of antibodies, preferably Fc fragments of IgG antibodies and most preferably IgG3 fragments. These fragments can with Help known methods are obtained, for example by the Cleavage of antibodies with enzymes like pepsin. It can also recombinantly produced Fc fragments are used, the may again have a modified amino acid sequence by for example, one or more exchanged, deleted or amino acids added were. Methods for the recombination of genes are those skilled in the art relevant known.

Ebenfalls bevorzugt zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von dilatativer Kardiomyopathie werden Wirkstoffe verwendet, die in der Lage sind, direkt oder indirekt die Signaltransduktion über den Fc-Rezeptor intrazellulär zu beeinflussen, d.h. dass eine geringere Aktivität von nachgeschalteten physiologischen Vorgängen messbar ist. Beispiele für derartige Wirkstoffe sind Tyrosinkinase-Inhibitoren, z.B. PP2, welches ein selektiver Inhibitor der Tyrosinkinase Src ist. Die Wirkung dieser Wirkstoffe kann anhand der im experimentellen Teil beschriebenen Verfahren untersucht werden.Also preferred for the preparation of medicaments for the treatment of dilated Cardiomyopathy uses agents that are able to to directly or indirectly affect signal transduction via the Fc receptor intracellularly, i. that a lower activity of downstream physiological processes is measurable. Examples for such Active ingredients are tyrosine kinase inhibitors, e.g. PP2, which is a selective inhibitor of tyrosine kinase Src is. The effect of these agents can be determined by the experimental Part described procedures are examined.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden F(ab')₂- oder F(ab')-Fragmente von Antikörpern verwendet, um ein Medikament zur Behandlung von dilatativer Kardiomyopathie herzustellen. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von F(ab')₂- oder F(ab')-Fragmenten, die Antigene erkennen, welche auch von (Auto-)Antikörpern des zu behandelnden Patienten erkannt werden.In another preferred embodiment of the present invention, F (ab ') ₂ or F (ab') fragments of antibodies are used to prepare a medicament for the treatment of dilated cardiomyopathy. Particularly preferred is the use of F (ab ') ₂ or F (ab') fragments which recognize antigens which are also recognized by (auto) antibodies of the patient to be treated.

Um die Spezifität der Antikörper gegen bestimmte Antigene zu untersuchen, können in vitro Untersuchungen mit den Antikörpern des betreffenden Patienten durchgeführt werden.Around the specificity the antibody to study against specific antigens, in vitro studies with the antibodies of the patient concerned.

Hierbei werden Antikörper mit potenziell erkannten Antigenen inkubiert. Im Vergleich mit Kontrollantigenen kann so ermittelt werden, mit welchen Antigenen die Antikörper des Patienten spezifisch reagieren. So können individuell ausgewählte F(ab')₂- oder F(ab')-Fragmente in maßgeschneiderten Medikamenten an den Patienten verabreicht werden. Jedes Medikament kann ein oder mehrere antigenspezifische F(ab')₂- oder F(ab')-Fragmente enthalten.This involves incubating antibodies with potentially recognized antigens. In comparison with control antigens it can thus be determined with which antigens the antibodies of the patient react specifically. Thus, individually selected F (ab ') ₂ or F (ab') fragments can be administered to the patient in customized medications. Each drug may contain one or more antigen-specific F (ab ') ₂ or F (ab') fragments.

Geeignete Verfahren zur Identifizierung spezifischer Antikörper-Antigen-Interaktionen sind dem Fachmann bekannte ELISA-, RIA- oder Western-Blot Assays, um nur einige zu nennen. Diese in vitro Verfahren können dadurch charakterisiert werden, dass sie die folgenden Schritte umfassen:

a) Inkubieren von Antikörpern einer Testperson, vorzugsweise eines Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie, mit Kandidaten-Antigen und Kontroll-Antigenen,
b) Messung der Bindung von Antikörpern an die Antigene,
c) Ermitteln der Antigenspezifität durch Vergleich der Messergebnisse.

Suitable methods for identifying specific antibody-antigen interactions are ELISA, RIA or Western blot assays known to those skilled in the art, to name only a few. These in vitro methods can be characterized as comprising the following steps:

a) incubating antibodies of a subject, preferably a patient with dilated cardiomyopathy, with candidate antigen and control antigens,
b) measuring the binding of antibodies to the antigens,
c) Determining the antigen specificity by comparing the measurement results.

Als potenzielle Antigene können sowohl virale, bakterielle, pilzliche, vorzugsweise jedoch humane Antigene genannt werden. Bei den humanen Antigenen ist insbesondere an Herzmuskelzellen-spezifische Antigene zu denken. Besonders zu erwähnen sind Mitochondrien-Antigene, Antigene von kontraktilen Proteinen, von Beta-1-Rezeptoren oder von muskarinergen Rezeptoren.When potential antigens can both viral, bacterial, fungal, but preferably human Called antigens. In particular, human antigens are to think of cardiomyocyte-specific antigens. Especially too are mentioned Mitochondrial antigens, antigens of contractile proteins, of Beta-1 receptors or muscarinic receptors.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Wirkstoffe verwendet, die in der Lage sind, die Aktivität von Fc-Rezeptoren direkt oder indirekt zu beeinflussen, um Medikamente zur Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie herzustellen. Das bedeutet, dass die Wirkstoffe in der Lage sind, die Aktivität der Fc-Rezeptoren auf in vitro kultivierten Herzmuskelzellen zu beeinflussen, wenn sie mit solchen Herzmuskelzellen verglichen werden, zu denen der zu testende Wirkstoff nicht hinzugegeben wurde. Der Nachweis der Expression von Fc-Rezeptoren auf den Zellen kann mittels Immunfluoreszenz und den im experimentellen Teil angegebenen Verfahren oder gegebenenfalls einer Analyse mit einem Fluoreszenz-aktivierten-Zell-Sorter (FACS) durchgeführt werden. Das FACS-Verfahren ist dem Fachmann bekannt. Beispiele für Wirkstoffe, die zur Beeinflussung der Fc-Rezeptoren geeignet sein könnten, sind Interferon-Beta, Dexamethason, Anti-TNF-alpha-Antikörper, Anti-Interferon-Gamma-Antikörper etc. Erfindungsgemäß wird überraschenderweise die Verwendung von Fc-Fragmenten von Antikörpern zur Beeinflussung der Aktivität des Fc-Rezeptors offenbart.In a further embodiment The invention uses active ingredients that are capable of the activity of Fc receptors directly or indirectly affect medication for the treatment of dilated cardiomyopathy. The means that the agents are capable of increasing the activity of Fc receptors on in vitro cultured cardiomyocytes, when they are compared with those heart muscle cells, to which the drug to be tested was not added. The proof of Expression of Fc receptors on the cells can be assessed by immunofluorescence and the method given in the experimental section or, if appropriate an analysis with a fluorescence-activated cell sorter (FACS) be performed. The FACS process is known to the person skilled in the art. Examples of active ingredients, for influencing the Fc receptors could be suitable are interferon-beta, dexamethasone, anti-TNF-alpha-antibodies, anti-interferon-gamma-antibodies etc. According to the invention is surprisingly the use of Fc fragments of antibodies to influence the activity of the Fc receptor.

Des weiteren stellt die vorliegende Anmeldung ein Screening-Verfahren zur Verfügung, das dem Auffinden von funktionell aktiven Antikörpern oder Wirkstoffen, die die Aktivität von Fc-Rezeptoren auf Herzmuskelzellen beeinflussen, dient. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

a) Kultivieren von Herzmuskelzellen,
b) Inkubieren der kultivierten Herzmuskelzellen mit dem zu testenden Antikörper oder Wirkstoff sowie gegebenenfalls ohne den zu testenden Antikörper oder Wirkstoff, und gegebenenfalls mit einer Kontrollsubstanz (z.B. einer Fc-Isotyp-spezifischen Kontrolle),
c) Messen der Aktivität der Fc-Rezeptoren nach Inkubation der Herzmuskelzellen mit dem zu testenden Antikörper oder Wirkstoff sowie gegebenenfalls ohne den zu testenden Antikörper oder Wirkstoff, und gegebenenfalls mit der Kontrollsubstanz,
d) Vergleichen der Aktivität der Fc-Rezeptoren anhand der Messergebnisse aus Schritt (c), und
e) Bestimmen, ob der zu testende Antikörper oder Wirkstoff die Aktivität der Fc-Rezeptoren beeinflusst.

Furthermore, the present application provides a screening method for finding functionally active antibodies or agents that affect the activity of Fc receptors on cardiomyocytes. This procedure includes the following steps:

a) culturing myocardial cells,
b) incubation of the cultured cardiomyocytes with the antibody or active substance to be tested and optionally without the antibody or active substance to be tested, and if appropriate with a control substance (eg an Fc isotype-specific control),
c) measuring the activity of the Fc receptors after incubation of the heart muscle cells with the antibody or active substance to be tested and optionally without the antibody or active substance to be tested, and optionally with the control substance,
d) comparing the activity of the Fc receptors using the measurement results from step (c), and
e) Determining whether the antibody or drug to be tested affects the activity of the Fc receptors.

Ein geeignetes Messverfahren zur Bestimmung der Expression der Fc-Rezeptoren ist die Immunfluoreszenz oder die FACS-Analyse anhand kultivierter Herzmuskelzellen und Fc-Rezeptorspezifischer Antikörper. Spezielle Beispiele für die Messung der Aktivität der Fc-Rezeptoren sind die Beeinflussung der Calcium-Transienten oder der systolischen Zellverkürzung, die im experimentellen Teil unten ausführlich beschrieben werden.One suitable measurement method for determining the expression of Fc receptors is immunofluorescence or FACS analysis using cultured cardiomyocytes and Fc receptor specific antibody. Specific examples of the measurement of activity The Fc receptors are influencing the calcium transients or systolic cell shortening, which are described in detail in the experimental part below.

Die erfindungsgemäß funktionellen Antikörper oder Wirkstoffe können mit bekannten Hilfsstoffen, wie Verdünnungsmitteln, Farbstoffen, Stabilisatoren, etc., welche dem Fachmann bekannt sind, in Form pharmazeutischer Formulierungen zur erfindungsgemäßen Verwendung hergestellt werden.The according to the invention functional antibody or agents can with known excipients, such as diluents, dyes, Stabilizers, etc., which are known in the art, in the form pharmaceutical formulations for use according to the invention getting produced.

Die erfindungsgemäßen Medikamente können auf jedem Weg verabreicht werden, z.B. oral, parenteral, intravenös etc. Die Dosis wird in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Individuum bestimmt. Die Verabreichung kann ein- oder mehrmals täglich erfolgen. Ebenfalls umfasst von der Erfindung sind Darreichungsformen, die mehr als einen Wirkstoff umfassen, bzw. Kombinationstherapien mit anderen Medikamenten.The medicaments of the invention can be administered by any route, e.g. oral, parenteral, intravenous etc. The Dose becomes dependent determined by the individual to be treated. The administration can done once or several times daily. Also encompassed by the invention are dosage forms which comprise more than one active ingredient, or combination therapies with other medicines.

Experimenteller Teilexperimental part

Herstellung von Plasma-IgGmanufacturing of plasma IgG

Von 11 Patienten mit dilatative Kardiomyopathie (DCM) wurde IgG aus Plasma gewonnen, das Antikörper enthält, die eine negative inotrope Wirkung auf Herzmuskelzellen ausüben. Dieses Verfahren wurde in Staudt A., Staudt Y., Dörr M. et al., Potential role of humeral in cardiac dysfunction of patients suffering from dilated cardiomyopathy. J. Am Coll Cardiol 2004;44:829–36 beschrieben. Die negativen inotropen Wirkungen wurden als Reduzierung der systolischen Zellverkürzung (>10%) definiert, die durch eine Abnahme der Calcium-Transienten (>10%) verursacht wird. Die DCM wurde mit Standardverfahren diagnostiziert (Felix SB, Staudt A., Dorffel WV, et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomised study. J. Am Coll Cardiol. 2000;35:1590–8). Antikörper wurden mit Hilfe einer Anti-IgG-Säule (PlasmaSelect, Teterow, Deutschland) gereinigt, über 30 Stunden gegen Experimentierbuffer (117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM MgCl₂ 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM CaCl₂, 20 mM Glucose und 10 mM HEPES; pH 7,3) dialysiert (MWCO 100 KD), zur Inaktivierung von Komplement inkubiert (56°C, 30 min) (Felix SB, et al., supra; Staudt A, et al., supra) und bei –70°C in Aliquots aufbewahrt. Auf gleiche Weise wurde IgG von gesunden Blutspendern (Kontrollen) gewonnen.Of 11 patients with dilated cardiomyopathy (DCM), IgG was obtained from plasma containing antibodies that have a negative inotropic effect on heart muscle cells. This procedure was described in Staudt A., Staudt Y., Dörr M. et al., Potential role of humeral in cardiac dysfunction of patients suffering from dilated cardiomyopathy. J. Coll Coll 2004; 44: 829-36. The negative inotropic effects were defined as a reduction in systolic cell shortening (> 10%) caused by a decrease in calcium transients (> 10%). The DCM was diagnosed by standard methods (Felix SB, Staudt A., Dorffel WV, et al., Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study J. Am Coll Cardiol., 2000; : 1590-8). Antibodies were purified using an anti-IgG column (Plasma Select, Teterow, Germany), exposed to experimental buffer (117 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 0.6 mM MgCl _2, 1.2 mM KH ₂ PO ₄ , 1.2 mM CaCl ₂ , 20 mM glucose and 10 mM HEPES, pH 7.3) (MWCO 100 KD), incubated to inactivate complement (56 ° C, 30 min) (Felix SB, et al., Supra; Staudt A, et al., Supra) and stored at -70 ° C in aliquots. Similarly, IgG was obtained from healthy blood donors (controls).

Messung der intrazellulären Calcium-Transienten und der systolischen Zellverkürzungmeasurement of intracellular Calcium transients and systolic cell shortening

Die Isolierung ventrikulärer Herzmuskelzellen aus adulten Wistar-Ratten und die Messungen der intrazellulären Calcium-Transienten und der systolischen Zellverkürzungen wurden nach bekannten Verfahren durchgeführt (Felix SB, et al., supra; Kubin T, Ando H, Scholz D, et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am J Physiol 1999;276:H2179–87).The Isolation of ventricular Cardiac muscle cells from adult Wistar rats and the measurements of intracellular Calcium transients and systolic cell shortening were performed by known methods (Felix SB, et al., supra; Kubin T, Ando H, Scholz D, et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am J Physiol 1999; 276: H2179-87).

Die Herzmuskelzellen wurden in Experimentierbuffer suspendiert und mit der fluoreszierenden Calciumsonde Fura 2-AM markiert. Einzelne Herzmuskelzellen wurden feldstimuliert (1 Hz, 5 ms) und kontinuierlich mit Experimentierbuffer (2 ml/min) bedeckt, welcher IgG von Patienten (300 μg/ml), Kontroll-IgG (300 μg/ml), anti-F(ab')- Antikörper (30 μg/ml) beziehungsweise die entsprechenden F(ab')₂-(56 μg/ml) oder Fc-Fragmente (30 μg/ml) enthält. Die Fluoreszenzmessungen wurden mit einem Photomultiplier-System (IonOptix, Milton, MA) aufgezeichnet. Veränderungen der intrazellulären Calcium- Transienten wurden aus dem Verhältnis der Fluoreszenzintensität bei zwei Wellenlängen abgeleitet. Ein Videoanalysesystem (IonOptix, Milton, MA) wurde für die Messungen der Zelllänge verwendet (siehe Staudt A, et al. Supra; Ren J, Walsh MF, Hamaty M, Sowers JR, Brown RA. Altered inotropic response to insulin-like growth factor I in diabetic rat heart: influence of intracellular Ca2+ and nitric oxide. Am J Physiol 1998;275:H823–30). Die relative Veränderung der Calcium-Transienten und der systolischen Zellverkürzung wurde als Mittelwert der Experimente an mindestens sechs verschiedenen Herzmuskelzellen von sechs verschiedenen Herzmuskelzell-Präparationen je IgG-Präparation definiert Felix SB, et al., supra). Die Experimente wurden geblindet durchgeführt. Bei allen Experimenten wurden Antikörper mit (positive Kontrolle) und ohne funktionelle Wirkung (negative Kontrolle) zusätzlich an der gleichen Herzmuskelzell-Präparation getestet. Jede Herzmuskelzelle wurde nur für eine einzige Untersuchung von einer Probe verwendet.The heart muscle cells were suspended in experimental buffer and labeled with the fluorescent calcium probe Fura 2-AM. Single myocardial cells were field-stimulated (1 Hz, 5 ms) and continuously covered with experimental buffer (2 ml / min) containing IgG from patients (300 μg / ml), control IgG (300 μg / ml), anti-F (ab '). ) - antibodies (30 μg / ml) or the corresponding F (ab ') ₂ - (56 μg / ml) or Fc fragments (30 μg / ml). The fluorescence measurements were recorded with a photomultiplier system (IonOptix, Milton, MA). Changes in intracellular calcium transients were derived from the ratio of fluorescence intensity at two wavelengths. A video analysis system (IonOptix, Milton, MA) was used for cell length measurements (see Staudt A, Supra, Ren J, Walsh MF, Hamaty M, Sowers JR, Brown RA, Altered inotropic response to insulin-like growth factor I in diabetic rat heart: influence of intracellular Ca2 + and nitric oxide, J J Physiol 1998; 275: H823-30). The relative change in calcium transients and systolic cell shortening was defined as the mean of the experiments on at least six different myocardial cells from six different myocardial cell preparations per IgG preparation. Felix SB, et al. Sup ra). The experiments were carried out blinded. In all experiments, antibodies with (positive control) and no functional effect (negative control) were additionally tested on the same heart muscle cell preparation. Each myocardial cell was used only for a single assay of one sample.

Um zu bestimmen, ob die funktionellen Wirkungen durch den F(ab')₂-Teil der Antikörper verursacht werden, wurden mit Hilfe eines Pepsinverdaus (Biogenes; Berlin, Deutschland) F(ab')₂-Fragmente aus den IgG-Präparaten der Patienten und der Kontrollen hergestellt. IgG und die entsprechenden F(ab')₂ Fragmente jedes Patienten wurden in äquimolaren Konzentrationen verwendet. Zur Untersuchung der Beteiligung des Fc-Teils der Antikörper an den funktionellen Wirkungen, wurden Fc-Fragmente normaler IgG's durch Standardverfahren hergestellt (Behringwerke, Marburg, Deutschland). Zur Rekonstituierung der Fc-Teile der IgG-F(ab')₂-Fragmente, wurden Herzmuskelzellen mit den F(ab')₂-Fragmenten von DCM-Patienten (56 μg/ml; 30 Minuten) präinkubiert, gespült und mit Ziege-anti-Mensch-F(ab')-IgG (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland; 30 μg/ml) bedeckt.In order to determine whether the functional effects are caused by the F (ab ') ₂ part of the antibodies, F (ab') ₂ fragments were prepared from the IgG preparations of the patients using a pepsin digest (Biogenes; Berlin, Germany) and the controls made. IgG and the corresponding F (ab ') ₂ fragments of each patient were used in equimolar concentrations. To study the contribution of the Fc part of the antibodies to the functional effects, Fc fragments of normal IgG were prepared by standard methods (Behringwerke, Marburg, Germany). To reconstitute the Fc portions of the IgG-F (ab ') ₂ fragments, heart muscle cells were preincubated with the F (ab') ₂ fragments from DCM patients (56 μg / ml, 30 minutes), rinsed, and streaked with anti-human F (ab ') IgG (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Germany; 30 μg / ml).

Isolierung menschlicher Herzmuskelzellen aus EndomyokardialBiopsateninsulation human heart muscle cells from endomyocardial biopsies

Die Isolierung menschlicher Herzmuskelzellen wurde durchgeführt wie beschrieben (Peeters GA, Sanguinetti MC, Eki Y, et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. Am J Physiol 1995;268:H1757–66). Von DCM-Patienten (n = 8) erhielten wir 8-10 Endomyocardialbiopsate aus dem interventrikulären Septum des rechten Ventrikels (Staudt A, Schaper F, Stangl V, et al. Immunohistological changes in dilated cardiomyopathy induced by immunoadsorption therapy and subsequent immunoglobulin substitution. Circulation 2001;103:2681–6). Ein Teil der Endomycardialbiopsate wurde in eiskalter HEPES-gepufferter Salzlösung (120 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,5 mM MgSO₄, 5,0 mM Natriumpyruvat, 20 mM Glucose, 10 mM HEPES, und 6 mM Nitrilotriessigsäure (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland)) sofort für die Zellisolierung ins Labor überführt:. Die Biopsate wurden in ein 2 ml Röhrchen für den enzymatischen Verdau in ein Wasserbad (35°C) gestellt. Das kontinuierlich begaste Medium der Verdaureaktion bestand aus der oben erwähnten HEPES-gepufferten Lösung mit einer Calcium Konzentration von 50 μM und 1% Rinderserumalbumin. In einem ersten Schritt wurden die Biopsate für 15 min mit Protease vom Typ XXIV (4 U/ml; Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) inkubiert. Dann wurden die Biopsate in ein frisches Röhrchen gegeben, das Puffer mit einer Kombination aus 1 mg/ml Collagenase-A (Worthington) und 0,5 mg/ml Hyaluronidase (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) enthält. Nach 20 min wurden die Zellen zentrifugiert (4 min, 240 xg) und der Überstand wurde für weitere 20 min Inkubation durch eine frische, reine Kollagenase-A-Lösung ersetzt. Um den Verdauprozess zu beenden, wurde das Zellpellet einmal im Medium ohne Enzym gewaschen. Schließlich wurde das Zellpellet in 1,5 ml PBS-Puffer resuspendiert und durch einen Filter gegeben, um unverdautes Gewebe zu entfernen.Isolation of human myocardial cells was performed as described (Peeters GA, Sanguinetti MC, Eki Y, et al., Method for Isolation of Human Ventricular Myocytes from Single Endocardial and Epicardial Biopsies, Am J Physiol 1995; 268: H1757-66). From DCM patients (n = 8) we obtained 8-10 endomyocardial biopsies from the interventricular septum of the right ventricle (Staudt A, Schaper F, Stangl V, et al., Immunohistological changes in dilated cardiomyopathy induced by immunoadsorption therapy and subsequent immunoglobulin substitution 2001; 103: 2681-6). A portion of the endomycardial biopsy specimens were resuspended in ice-cold HEPES buffered saline (120 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.5 mM MgSO ₄ , 5.0 mM sodium pyruvate, 20 mM glucose, 10 mM HEPES, and 6 mM nitrilotriacetic acid (Sigma); Aldrich Chemie, Taufkirchen, Germany)) immediately transferred to the laboratory for cell isolation. The biopsies were placed in a 2 ml tube for enzymatic digestion in a water bath (35 ° C). The continuously aerated medium of the digestion reaction consisted of the above-mentioned HEPES-buffered solution with a calcium concentration of 50 μM and 1% bovine serum albumin. In a first step, the biopsies were incubated for 15 min with prototype XXIV (4 U / ml, Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Germany). The biopsies were then placed in a fresh tube containing buffer with a combination of 1 mg / ml collagenase A (Worthington) and 0.5 mg / ml hyaluronidase (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Germany). After 20 min, the cells were centrifuged (4 min, 240 xg) and the supernatant was replaced with a fresh, pure collagenase A solution for a further 20 min. Incubation. To complete the digestion process, the cell pellet was washed once in the medium without enzyme. Finally, the cell pellet was resuspended in 1.5 ml of PBS buffer and passed through a filter to remove undigested tissue.

Indirekte Immunfluoreszenzindirect immunofluorescence

Den isolierten Herzmuskelzellen wurde ermöglicht, sich auf Deckgläschen anzuheften (1h, 37°C); sie wurden mit Paraformaldehyd fixiert (2% in PBS, 10 min, Raumtemperatur); mit PBS/3%, BSA/0,05%, und Tween 20 für 15 min blockiert; mit polyklonalen Antikörpern aus der Ziege gegen den Fcγ-Rezeptor I (CD 64), gegen Fcγ-Rezeptor II (CD 32), Fcγ-Rezeptor IIa, Fcγ-Rezeptor IIb/c, and Fcγ-Rezeptor III (CD 16) (4 μg/ml, 2 h, Raumtemperatur) gefärbt. IgG aus Ziegen wurde als Negativkontrolle verwendet, und ein polyklonaler Antikörper aus Ziegen gegen Troponin I diente als Positivkontrolle. Zum Nachweis wurden die Zellen mit Rhodamin-konjugiertem Rinder-anti-Ziege-IgG-Antikörpern (30 min bei Raumtemperatur, 1:400) inkubiert. Isolierte menschliche Herzmuskelzellen wurden nach dem gleichen Immunfluoreszenz-Protokoll wie die Ratten-Herzmuskelzellen behandelt, aber mit einer Antikörperbehandlung, die in Lösung durchgeführt wurde. Alle primären und sekundären Antiköper wurden von Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg, Deutschland) bezogen. Die Deckgläschen wurden mit GelMount (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) auf Objektträgern fixiert und mit einem Fluoreszenzmikroskop (Leica DMLB, Benzheim, Deutschland) untersucht.The Isolated cardiomyocytes were allowed to attach to coverslips (1h, 37 ° C); they were fixed with paraformaldehyde (2% in PBS, 10 min, room temperature); blocked with PBS / 3%, BSA / 0.05%, and Tween 20 for 15 min; with polyclonal antibodies from the goat against the Fcγ receptor I (CD 64), against Fcγ receptor II (CD32), Fcγ receptor IIa, Fcγ receptor IIb / c, and Fcγ receptor III (CD 16) (4 μg / ml, 2 h, room temperature). Goat IgG was used as a negative control, and a polyclonal antibody from goats versus troponin I served as a positive control. As proof the cells were treated with rhodamine-conjugated bovine anti-goat IgG antibodies (30 min at room temperature, 1: 400). Isolated human Cardiac muscle cells were tested according to the same immunofluorescence protocol like the rat heart muscle cells treated but with an antibody treatment, the in solution carried out has been. All primary and secondary antibodies were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg, Germany). The coverslips were using GelMount (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Germany) on slides fixed and with a fluorescence microscope (Leica DMLB, Benzheim, Germany) examined.

Statistikstatistics

Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM (± Standardabweichung) dargestellt. Die Analysen schlossen Vergleiche zwischen den Gruppen (Kontrollen gegenüber DCM-Patienten) und innerhalb der Gruppen ein. Univariate post-hoc Analysen wurden mit Hilfe des Mann-Whitney U-Tests und des Wilcoxon-Tests durchgeführt, nach einer Gesamtuntersuchung. Die Signifikanz wurde auf der Grundlage eines Niveaus von p < 0,05 beurteilt.The Results are presented as mean ± SEM (± standard deviation). The analyzes included comparisons between groups (controls across from DCM patients) and within the groups. Univariate post-hoc analyzes were performed with Help of the Mann-Whitney U test and the Wilcoxon test performed after an overall examination. The significance was based a level of p <0.05 assessed.

ErgebnisseResults

Wirkungen intakter IgGs und von F(ab')₂-Fragmenten von DCM-PatientenEffects of intact IgGs and F (ab ') ₂ fragments from DCM patients

Die intakten IgG-Fraktionen (300 μg/mL) aus dem Plasma von 11 DCM-Patienten mit negativen inotropen Antikörpern (mittleres Alters = 46 ± 3 Jahre; 10 Männer/1 Frau; EF < 30%, NYHA III-IV) reduzierten die Calcium-Transienten um –14 ± 1% und die systolische Zellverkürzung bei Ratten-Herzmuskelzellen um –19 ± 1% (p < 0,001 gegenüber Kontroll-IgG). Kontroll-IgG zeigte keine Wirkung. Die F(ab')₂ Fragmente der IgGs der Patienten und der Kontrollen zeigten keine funktionellen Wirkungen (p < 0,001 vs. DCM IgG), was darauf hinweist, dass die Bindung von F(ab')₂ an das Antigen selbst nicht ausreichend ist, um negative inotrope Wirkungen zu induzieren (siehe 1).The intact IgG fractions (300 μg / ml) from the plasma of 11 DCM patients with negative inotropic antibodies (mean age = 46 ± 3 years; 10 men / 1 woman; EF <30%, NYHA III-IV) reduced calcium transients by -14 ± 1% and systolic cell shortening in rat myocardial cells by -19 ± 1% (p <0.001 vs control IgG). Control IgG showed no effect. The F (ab ') ₂ fragments of the IgGs of the patients and the controls showed no functional effects (p <0.001 vs. DCM IgG), indicating that the binding of F (ab') ₂ to the antigen itself is not sufficient to induce negative inotropic effects (see 1 ).

Wenn man Herzmuskelzellen mit den F(ab')₂ Fragmenten (56 μg/mL) von jedem der 11 DCM-Patienten für 30 Minuten präinkubierte, mit Puffer spülte und die Herzmuskelzellen mit intakten IgGs des jeweiligen Patienten bedeckte, blockierten die F(ab')₂-Fragmente die negative inotrope Wirkung der intakten IgGs des Patienten (p < 0,001 gegenüber IgG von DCM-Patienten) (1). F(ab')₂-Fragmente von Kontroll-IgGs (n = 6) inhibierten die Wirkungen der intakten IgGs von DCM-Patienten hingegen nicht. Dies weist darauf hin, dass die F(ab')₂-Fragmente von DCM-Patienten die Bindung intakter Antikörper an ihr jeweiliges Antigen inhibieren. Das heißt das dieses ein Prozess ist, der offensichtlich für die Induzierung der beobachteten funktionellen Wirkungen der IgGs von DCM-Patienten auf Herzmuskelzellen (2) notwendig ist.By preincubating myocardial cells with the F (ab ') ₂ fragments (56 μg / mL) from each of the 11 DCM patients for 30 minutes, flushing with buffer and covering the heart muscle cells with intact IgGs of the respective patient, blocked the F (ab') ) ₂ fragments the negative inotropic effect of intact IgGs of the patient (p <0.001 vs IgG of DCM patients) ( 1 ). F (ab ') ₂ fragments of control IgGs (n = 6), however, did not inhibit the effects of intact IgGs from DCM patients. This indicates that the F (ab ') ₂ fragments of DCM patients inhibit binding of intact antibodies to their respective antigen. That is, this is a process apparently for inducing the observed functional effects of the IgGs of DCM patients on cardiomyocytes ( 2 ) necessary is.

Um zu untersuchen, ob die Antikörper der verschiedenen DCM-Patienten an die gleichen oder an verschiedene Antigen-Bindungsstellen binden, wurden Herzmuskelzellen mit F(ab')₂- Fragmenten eines Patient präinkubiert, gespült, und dann mit IgG-Antikörpern eines anderen Patienten bedeckt. Die F(ab')₂-Fragmente von drei verschiedenen Patienten wurden auf diese Weise gegenüber Antikörpern von drei anderen DCM-Patienten getestet. Als Hinweis auf für die Beteiligung verschiedener Herzmuskel-Antigene bei 8 von 9 Blockierungs-Experimenten wurde erachtet, dass die F(ab')₂-Fragmente von DCM-Patienten nicht die Wirkungen funktionell aktiver, intakter Antikörper anderer DCM-Patienten inhibierten.To examine whether the antibodies of different DCM patients bind to the same or different antigen binding sites, heart muscle cells were preincubated with F (ab ') ₂ fragments from one patient, rinsed, and then covered with IgG antibodies from another patient , The F (ab ') ₂ fragments from three different patients were tested in this way against antibodies from three other DCM patients. As an indication of the involvement of various myocardial antigens in 8 of 9 blocking experiments, it was considered that the F (ab ') ₂ fragments of DCM patients did not inhibit the effects of functionally active, intact antibodies of other DCM patients.

Beteiligung des Fc-Teils der Antikörper an den funktionellen Wirkungenparticipation of the Fc portion of the antibodies at the functional effects

Den F(ab')₂-Fragmenten fehlt der Fc-Teil der intakten IgGs. Im Gegensatz zu der spezifischen Antigen-Bindungsregion des F(ab')₂-Teils, unterscheiden sich die Fc-Teile verschiedener Antikörper einer IgG-Unterklasse strukturell nicht. Um die Beteiligung des Fc-Teils an den funktionellen Wirkungen der Autoantikörper zu untersuchen, prä-inkubierten wir Herzmuskelzellen mit menschlichen Fc-Fragmenten (30 μg/mL) für 30 Minuten, spülten diese, überdeckten die Herzmuskelzellen mit den IgG-Antikörpern von DCM-Patienten (n = 6), und analysierten die inotropen Wirkungen. Während die Fc-Fragmente selbst keine Wirkung zeigten, hemmte eine Präinkubation von Herzmuskelzellen mit Fc-Fragmenten normaler IgGs die funktionellen Wirkungen der IgGs aus DCM-Patienten vollständig (p < 0,001 gegenüber IgG von Patienten) (1).The F (ab ') ₂ fragments lack the Fc portion of the intact IgGs. In contrast to the specific antigen-binding region of the F (ab ') ₂ part, the Fc parts of different antibodies of an IgG subclass do not differ structurally. To investigate the contribution of the Fc portion to the functional effects of autoantibodies, we pre-incubated heart muscle cells with human Fc fragments (30 μg / mL) for 30 minutes, rinsing them, overlaying the heart muscle cells with the DCM IgG antibodies. Patients (n = 6), and analyzed the inotropic effects. While the Fc fragments themselves were not effective, preincubation of heart muscle cells with Fc fragments of normal IgGs completely inhibited the functional effects of IgGs from DCM patients (p <0.001 versus IgG from patients) ( 1 ).

Um zu bestätigen, dass sowohl der F(ab')-Teil als auch der Fc-Teil der IgGs der DCM-Patienten für die funktionellen Wirkungen der Antikörper benötigt werden, rekonstituierten wir den Fc-Teil der F(ab')₂-Fragmente von DCM-IgG-Antikörpern durch aufeinander folgende Inkubierung von Ratten-Herzmuskelzellen mit den F(ab')₂-Fragmenten von DCM-IgG, gefolgt von intaktem Ziege-anti-Mensch-F(ab') IgG. Das führte wieder zur Reduzierung der systolischen Zellverkürzung (–20 ± 2%) der Calcium-Transienten (–14 ± 2%) und ist vergleichbar mit den intakten IgGs der Patienten (p < 0,001 gegenüber Kontroll-IgG, 1). Die aufeinander folgende Inkubierung von Herzmuskelzellen mit F(ab')₂ Fragmenten von Kontroll-IgG und Ziege-anti-Mensch-F(ab')-IgG zeigte keine funktionellen Wirkungen. Dieses ist ein weiterer Beweis dafür, dass IgGs von DCM-Patienten funktionelle Wirkungen auf Herzmuskelzellen nur dann ausüben, wenn sie mit dem F(ab')-Teil und dem Fc-Teil an die Herzmuskelzellen binden können (2).To confirm that both the F (ab ') part and the Fc part of the IgGs of the DCM patients are needed for the functional effects of the antibodies, we reconstituted the Fc part of the F (ab') ₂ fragments of DCM-IgG antibodies by sequential incubation of rat cardiac myocytes with the F (ab ') ₂ fragments of DCM-IgG, followed by intact goat anti-human F (ab') IgG. This again led to a reduction of the systolic cell shortening (-20 ± 2%) of the calcium transients (-14 ± 2%) and is comparable to the intact IgGs of the patients (p <0.001 compared to control IgG, 1 ). Sequential incubation of myocardial cells with F (ab ') ₂ fragments of control IgG and goat anti-human F (ab') IgG showed no functional effects. This is further evidence that DCM patient IgGs exert functional effects on cardiomyocytes only when they can bind to the heart muscle cells with the F (ab ') portion and the Fc portion ( 2 ).

Nachweis von Fcγ-Rezeptoren auf Herzmuskelzellen der Ratte und des Menschenproof of Fc.gamma receptors on rat and human cardiac muscle cells

Die Bindung des IgG-Fc-Teils erfolgt über Fcγ-Rezeptoren. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz wurden die Fcγ-Rezeptoren-II (CD32) auf Ratten Herzmuskelzellen nachgewiesen, die mit Anti-Fcγ-IIa Antikörpern positiv gefärbt wurden, jedoch nicht mit Antikörpern gegen Fcγ-Rezeptor IIb/Anti-Fcγ-Receptor IIc, Fcγ-Rezeptor III oder Fcγ Rezeptor I. Menschliche Herzmuskelzellen, die aus Endomyokardialbiopsaten von DCM-Patienten isoliert wurden (n = 8), wurden ebenfalls positiv mit Antikörpern gegen den Fcγ-Rezeptor IIa gefärbt, jedoch nicht mit Antikörper gegen Fcγ-Rezeptoren IIb oder Fcγ-Rezeptor IIc (5). Normales IgG der Ziege und Antikörper gegen Troponin I dienten als negative und bzw. positive Kontrollen.The binding of the IgG Fc portion is via Fcγ receptors. Immunofluorescence was used to detect Fcγ receptor II (CD32) on rat myocardial cells which were stained positive with anti-Fcγ-IIa antibodies, but not with antibodies to Fcγ receptor IIb / anti-Fcγ receptor IIc, Fcγ- Receptor III or Fcγ Receptor I. Human cardiomyocytes isolated from endomyocardial biopsies from DCM patients (n = 8) were also stained positively with antibodies to Fcγ receptor IIa, but not with antibody to Fcγ receptors IIb or Fcγ. Receptor IIc ( 5 ). Goat normal IgG and troponin I antibodies served as negative and / or positive controls, respectively.

Claims

Use of an active ingredient for influencing the activity of the Fc receptor on heart muscle cells for the manufacture of a medicament for the treatment of dilated cardiomyopathy.

Use of an antibody or a part thereof or a functional equivalent an antibody or part thereof for the manufacture of a medicament for treatment of dilated cardiomyopathy.

Use according to claim 1 or 2, wherein the active substance or the antibody or part thereof or the functional equivalent an antibody or part of it is an Fc receptor inhibitor is.

Use according to claim 3, wherein the Fc receptor inhibitor the Fc fragment of an antibody is.

Use according to claim 4, wherein the Fc fragment is an IgG Fc fragment.

Use according to claim 5, wherein the Fc fragment is an IgG3 Fc fragment.

Use according to claim 1, wherein the drug is signal transduction by the Fc receptor affected.

Use according to claim 7, wherein the active ingredient is a tyrosine kinase inhibitor.

Use according to claim 2, wherein the part of an antibody is an F (ab ') or F (ab') ₂ fragment.

Use according to claim 9, wherein the F (ab ') or F (ab') ₂ fragment is patient specific.

Screening method for finding functional active antibodies or for finding agents that control the activity of Fc receptors on cardiomyocytes, comprising the following steps: a) Cultivating myocardial cells, b) incubating the cultured Cardiac muscle cells with the antibody or active substance to be tested, and optionally without the antibody to be tested or Active substance, and optionally with a control substance, c) Measuring the activity the Fc receptors after incubation of the heart muscle cells with the testing antibodies or active ingredient and optionally without the antibody to be tested or Active substance, and optionally with the control substance, d) Compare the activity the Fc receptors based on the results of step (c) and e) Determine whether the antibody or drug to be tested is the activity of the Fc receptors affected.