DE102005040833A1

DE102005040833A1 - TIRF-Beleuchtung für Mikroskope

Info

Publication number: DE102005040833A1
Application number: DE200510040833
Authority: DE
Inventors: Rolf Dr. Wartmann
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Jenoptik AG
Priority date: 2005-08-25
Filing date: 2005-08-25
Publication date: 2007-03-08

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine optische Anordnung zur mikroskopischen Beobachtung einer Probe (2) bei TIRF-Beleuchtung, umfassend ein Mikroskopobjektiv (1), ein einerseits mit einem Immersionsmedium (8) und andererseits zumindest partiell mit der Probe (2) in Berührung stehendes Deckglas (3), und durch das Immersionsmedium (8) und das Deckglas (3) hindurch auf die Grenzfläche (9) zwischen dem Deckglas (3) und der Probe (2) gerichtetes, Fluoreszenz anregendes Beleuchtungslicht (4). DOLLAR A Bei einer optischen Anordnung dieser Art ist DOLLAR A - das Beleuchtungslicht (4), der Dunkelfeldbeleuchtung bei Mikroskopen entsprechend, außerhalb des Mikroskopobjektivs (1) geführt, und DOLLAR A - im Beleuchtungslicht (4) ist ein Beugungsgitter (6) so angeordnet, daß aufgrund der damit erzielten Beugung mindestens ein Teil des Beleuchtungslichtes (4) unter einem Winkel delta auf die Grenzfläche (9) zwischen dem Deckglas (3) und der Probe (2) gerichtet ist, der zur Totalreflexion an der Grenzfläche (9) führt. DOLLAR A Damit ist erreicht, daß das Mikroskopobjektiv (1) nur noch den Detektionsstrahlengang aufzunehmen hat, wozu Aperturen kleiner als 1.4 ausreichend sind.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine optische Anordnung zur mikroskopischen Beobachtung einer Probe bei TIRF-Beleuchtung, umfassend ein Mikroskopobjektiv, ein zwischen dem Mikroskopobjektiv und der Probe angeordnetes, zumindest partiell mit der Probe in Berührung stehendes Deckglas und auf die Grenzfläche zwischen dem Deckglas und der Probe gerichtetes, Fluoreszenz anregendes Beleuchtungslicht.
Als TIRF-Mikroskopie (TIRF – Total Internal Reflection Fluoreszenz) wird ein Sachgebiet der Mikroskopie bezeichnet, bei dem die hinter einem Deckglas befindliche Probe unter einem so flachen Winkel beleuchtet wird, daß das Beleuchtungslicht an der Grenzfläche zwischen Deckglas und Probe totalreflektiert wird. Dabei bildet sich ein evaneszentes Wellenfeld aus, das den Teil der Probe beeinflußt, der in direktem Kontakt mit dem Deckglas steht. Dieser Einfluß kann beobachtet werden, und es werden aus diesem Einfluß Schlußfolgerungen auf Probeneigenschaften gewonnen.

Das Prinzip der Erzeugung evaneszenter Wellenlängen im Zusammenhang mit der TIRF-Mikroskopie ist beispielsweise erläutert in Kramer, „Evaneszente Wellen in der Mikroskopie", Zeitschrift Photonik, Heft 2/2004, Seite 42ff.

Es sind optische Anordnungen bekannt, bei denen die TIRF-Beleuchtung als Auflichtbeleuchtung durch das Mikroskopobjektiv hindurch auf die Grenzfläche zwischen Deckglas und Probe gerichtet ist. Wegen der notwendig flachen Winkel, unter denen das Beleuchtungslicht auf das Deckglas treffen muß, können dazu nur sehr hochaperturige Mikroskopobjektive genutzt werden, denn um sicher zu stellen, daß kein Licht auf direktem Wege zur Probe gelangt, das die TIRF-Beleuchtung stören würde, steht stets nur die äußerste Randzone des Mikroskopobjektivs für das Beleuchtungslicht zur Verfügung. Die Apertur muß deshalb deutlich größer als 1.4 sein.

Derartig hochaperturige Mikroskopobjektive sind verhältnismäßig teuer. Das ist der Grund dafür, weshalb die TIRF-Mikroskopie derzeit noch sehr kostspielig ist.

Von diesem Stand der Technik ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine optische Anordnung zur mikroskopischen Beobachtung einer Probe bei TIRF-Beleuchtung zu entwickeln, die den Einsatz von Mikroskopobjektiven mit geringerer numerischer Apertur ermöglicht und damit weniger kostenintensiv ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit einer optischen Anordnung der eingangs beschriebenen Art, bei der

– das Beleuchtungslicht, der Dunkelfeldbeleuchtung bei Mikroskopen entsprechend, außerhalb des Mikroskopobjektivs geführt ist und
– im Beleuchtungslicht ein Beugungsgitter so angeordnet ist, daß aufgrund der Beugung mindestens ein Teil des Beleuchtungslichtes unter einem Winkel δ auf die Grenzfläche zwischen dem Deckglas und der Probe gerichtet ist, der zur Totalreflexion an der Grenzfläche führt.

Erfindungsgemäß läuft das Beleuchtungslicht nicht mehr wie bisher üblich durch das Mikroskopobjektiv hindurch, sondern ist nach dem Prinzip der Dunkelfeldbeleuchtung in Strahlengängen außerhalb des Mikroskopobjektivs geführt. Damit ist erreicht, daß das Mikroskopobjektiv nur noch den Detektionsstrahlengang aufzunehmen hat, wozu Aperturen kleiner als 1.4 ausreichend sind.

Um trotzdem die Totalreflexion an der Grenzfläche zwischen Deckglas und Probe herbeizuführen und damit das erforderliche evaneszente Wellenfeld zu erzeugen, muß einerseits zwischen dem Beugungsgitter und dem Deckglas ein Immersionsmedium hinreichend hoher Brechzahl vorliegen und andererseits das Beleuchtungslicht am Beugungsgitter so gebeugt werden, daß zumindest ein Teil des Beleuchtungslichtes zur Grenzfläche gelangt und dort totalreflektiert wird.

Dies wird beispielsweise erreicht, wenn das Beugungsgitter eine Gitterkonstante aufweist, die bewirkt, daß das Beleuchtungslicht der ersten Beugungsordnung unter dem Winkel δ zum Deckglas und zur Probe gerichtet ist.

Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn als Beugungsgitter ein auf einem Substrat ausgebildetes Phasengitter vorgesehen und dieses zwischen dem Mikroskopobjektiv und dem Deckglas positioniert ist. Dabei sollten die Brechzahlen des Deckglases, des Immersionsmediums und des Substrates etwa gleich groß sein. Von besonderem Vorteil ist es, wenn die Differenz der Brechzahlen untereinander gleich oder kleiner 0,1 ist.

Die Totalreflexion wird beispielsweise erzielt, wenn das Phasengitter folgende Bedingungen erfüllt:

mit

– d der Strukturbreite des Phasengitters,
– λ der Wellenlänge des Beleuchtungslichtes,
– n₁ der Brechzahl des Substrates, auf welches das Phasengitter aufgebracht ist,
– n₀ der Brechzahl der Probensubstanz,
– α dem Winkel, unter dem der Beleuchtungsstrahlengang in das Substrat eintritt, auf dem das Phasengitter aufgebracht ist,
– t der Strukturtiefe des Phasengitters unter der Voraussetzung einer Brechzahldifferenz von (n₁ – 1) im Phasengitter, und
– s der Quadratwurzel aus n₁·n₁ – cosα·cosα.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispieles näher erläutert werden. Die zugehörige 1 zeigt den prinzipiellen Aufbau der optischen Anordnung nach der Erfindung.
In 1 ist ein Mikroskopobjektiv 1 symbolisch dargestellt, in welches das von einer Probe 2 kommende Licht eintritt. Beleuchtet wird die hinter einem Deckglas 3 angeordnete Probe 2 mit Beleuchtungslicht 4, das in einem Strahlengang außerhalb des Mikroskopobjektivs 1 geführt ist.
Auf dem Weg zur Probe 2 trifft das Beleuchtungslicht 4 zunächst auf einen Ringspiegel 5, der zentrisch zum Mikroskopobjektiv 1 angeordnet ist, und von dem es zunächst auf ein Beugungsgitter 6 reflektiert wird, und zwar so, daß das Beleuchtungslicht 4 unter einem Winkel α auf das Beugungsgitter 6 und das Substrat 7 trifft, auf welches das Beugungsgitter 6, beispielhaft als Phasengitter ausgeführt, aufgebracht ist.
Beim Durchgang durch das Substrat 7 wird das Beleuchtungslicht 4 gebrochen. Dabei wäre der Neigungswinkel β, unter dem der gebrochene Anteil A des Beleuchtungslichtes aus dem Substrat 7 in Richtung auf die Probe 2 austritt, zu steil, um die gewünschte Totalreflexion an der Grenzfläche zwischen dem Deckglas 3 und der Probe 2 hervorrufen zu können.
Dieser Anteil A würde demzufolge als direktes Licht zur Probe 2 gelangen und dadurch die TIRF-Beleuchtung stören. Aufgrund der Wirkung des Beugungsgitters 6 jedoch wird der Anteil A, da er der 0-ten Ordnung des Beleuchtungslichtes entspricht, ausgelöscht. Es kann diesbezüglich also kein störendes Beleuchtungslicht zur Probe 2 gelangen.
Der in die -1-te Ordnung gebeugte Anteil B' des Beleuchtungslichts 4 tritt unter einem noch steileren Neigungswinkel γ als der Anteil A aus dem Substrat 7 aus und ist daher ebenfalls nicht zur Erzeugung der Totalreflexion geeignet, er läuft jedoch an der Probe 2 vorbei und kann demzufolge ebenfalls nicht die TIRF-Beleuchtung stören.
Dagegen erfährt der in die 1-te Ordnung gebeugte Anteil B des Beleuchtungslichts beim Austritt aus dem Substrat 7 eine deutliche Abflachung und erreicht nach Durchlaufen eines Immersionsmediums 8 und des Deckglases 3 die Grenzfläche 9 zwischen Probe 2 und Deckglas 3 unter einem Winkel δ, der wie gewünscht zur Totalreflektion an dieser Grenzfläche 9 führt und dabei ein evaneszentes Wellenfeld ausbildet, das den Teil der Probe 2 beeinflußt, der in direktem Kontakt mit dem Deckglas 3 steht.
Mit dieser Anordnung ist die Beobachtung der Probe bei TIRF-Beleuchtung mit Mikroskopobjektiven möglich, deren Apertur wesentlich kleiner sein kann, als dies bisher im Stand der Technik erforderlich gewesen ist. Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist damit gelöst.
In einem konkreten Ausführungsbeispiel betragen:

– die Wellenlänge λ des Beleuchtungslichts 546 nm,
– die Brechzahl des Substrates 9 n₁ = 1.52,
– die Brechzahl der Probensubstanz n₀ = 1.33,
– die Brechzahl des Immersionsmediums n = 1,53 bis 1,4
– der Winkel α = 10°.

Als Immersionsmedium kann beispielsweise ein Immersionsöl mit der Brechzahl n = 1,518 genutzt werden.
Unter diesen Bedingungen ergeben sich

– eine notwendige Strukturbreite d des Phasengitters mit d = 1,2 μm,
– s = 1,185
– eine erforderliche Strukturtiefe t des Phasengitters mit t = 72 nm unter der Voraussetzung einer Brechzahldifferenz von (n₁ – 1) im Phasengitter.

1: Mikroskopobjektiv
2: Probe
3: Deckglas
4: Beleuchtungslicht
5: Ringspiegel
6: Phasengitter
7: Substrat
8: Immersionsmedium
9: Grenzschicht
A, B, B': Anteile des Beleuchtungslichtes

Claims

Optische Anordnung zur mikroskopischen Beobachtung einer Probe, umfassend: – ein Mikroskopobjektiv (1), – ein einerseits mit einem Immersionsmedium (8) und andererseits zumindest partiell mit der Probe (2) in Berührung stehendes Deckglas (3), – durch das Immersionsmedium (8) und das Deckglas (3) hindurch auf die Grenzfläche (9) zwischen Deckglas (3) und Probe (2) gerichtetes, Fluoreszenz anregendes Beleuchtungslicht (4), wobei – sich aufgrund von Totalreflexion an dieser Grenzfläche (9) ein Wellenfeld ausbildet, das den Teil der Probe (2) beeinflußt, der in direktem Kontakt mit dem Deckglas (3) steht, und – aus diesem Einfluß ein auf die Eigenschaften der Probe (2) bezogenes Beobachtungsergebnis gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, – daß das Beleuchtungslicht (4) in Strahlengängen außerhalb des Mikroskopobjektivs (1) geführt ist, – im Beleuchtungslicht (4) ein Beugungsgitter (6) angeordnet ist, und – aufgrund der damit erzielten Beugung mindestens ein Anteil (B) des Beleuchtungslichtes (4) unter einem Winkel δ auf die Grenzfläche (9) gerichtet ist, der zur Totalreflexion an der Grenzfläche (9) führt.
Optische Anordnung nach Anspruch 1 bei der das Beugungsgitter (6) bewirkt, daß das Beleuchtungslicht (4) der ersten Beugungsordnung unter dem Winkel δ auf die Grenzfläche (9) gerichtet ist.
Optische Anordnung nach Anspruch 1 oder 2, bei der als Beugungsgitter (6) ein auf einem Substrat ausgebildetes Phasengitter vorgesehen und dieses zwischen dem Mikroskopobjektiv (1) und dem Deckglas (3) angeordnet ist.
Optische Anordnung nach Anspruch 3, bei der die Brechzahlen des Deckglases (3), des Immersionsmediums (8) und des Substrates (7) etwa gleich groß sind.
Optische Anordnung nach Anspruch 4, bei der die Differenz der Brechzahlen untereinander gleich oder kleiner 0,1 ist.
Optische Anordnung nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei der als Immersionsmedium (8) ein Immersionsöl vorgesehen ist.
Optische Anordnung nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei der das Phasengitter die Bedingung erfüllt:
mit – d der Strukturbreite des Phasengitters, – λ der Wellenlänge des Beleuchtungslichts, – n₁ der Brechzahl des Substrates, auf welches das Phasengitter aufgebracht ist, – n₀ der Brechzahl der Probensubstanz, – α dem Winkel, unter dem der Beleuchtungsstrahlengang in das Substrat eintritt, auf dem das Phasengitter aufgebracht ist, – t der Strukturtiefe des Phasengitters unter der Voraussetzung einer Brechzahldifferenz von (n₁ – 1) im Phasengitter, und – s der Quadratwurzel aus n₁·n₁ – cosα·cosα.
Optische Anordnung nach einem der vorgenannten Ansprüche mit dem Winkel α < 25°.