DE102005040492A1

DE102005040492A1 - Perfusion- and preservation solution, useful for transplants and for perfusing and preserving organs for transplantation, comprises relaxin

Info

Publication number: DE102005040492A1
Application number: DE102005040492A
Authority: DE
Inventors: Markus Ulrich Dr. Böhnert; Franz Paul Dr. Armbruster
Original assignee: BOEHNERT MARKUS; Bohnert Markus Dr; Immundiagnostik AG
Current assignee: BOEHNERT MARKUS; Bohnert Markus Dr; Immundiagnostik AG
Priority date: 2004-08-27
Filing date: 2005-08-26
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2025-08-27
Also published as: DE102005040492B4

Abstract

Perfusion- and preservation solution (I), for transplants, comprises relaxin. An independent claim is also included for a method for perfusing and preserving of organs for the transplantation comprising adding aqueous (I). ACTIVITY : None given. MECHANISM OF ACTION : None given.

Description

GEBIET DER ERFINDUNGAREA OF INVENTION

Die Erfindung betrifft Lösungen zur Perfusion und Konservierung von biologischen Geweben und Organen und insbesondere eine Lösung zum Waschen, Spülen und zur Konservierung eines Lebertransplantats nach seiner Entnahme, während der extrakorporalen Lagerung und zur Reperfusion bei der Implantation.The Invention relates to solutions for perfusion and preservation of biological tissues and organs and in particular a solution for washing, rinsing and for the preservation of a liver transplant after its removal, while extracorporeal storage and reperfusion during implantation.

Die Funktionsaufnahme der Leber hängt, wie auch bei anderen Organen, wesentlich ab vom Ausmaß der Schädigung während der Ischämie. Je geringer die Organschädigung während des Konservierungsintervalls, desto schneller kann das Organ seine Aufgaben wieder übernehmen (Pegg DE et al., Organ Preservation: basic and applied aspects. 1982; Boston, Lancaster, the Hague, MTP Press Limited; Hochachka PW, Science 1986; 231: 234-241). Der Schutz der Leber während des Konservierungsintervalls ist somit von besonderer Bedeutung. Das Prinzip der Organkonservierung beruht auf einer Reduzierung der Stoffwechselaktivität durch Absenken der Temperatur. Alle transplantablen Organe werden zur Konservierung bei 0 bis 4°C kalt gelagert. Entsprechend der van't Hoff-Gleichung verlangsamt sich hierdurch der Metabolismus auf ca. ein Zwölftel. Bereits bei den ersten klinischen Lebertransplantationen nutzte Starzl eine auf 15°C abgekühlte Ringer-Laktat-Lösung zur Organprotektion (Belzer FO et al. Transplantation 1988; 45: 673-676. Singer D et al., Thorac.Cardiovasc.Surg. 1990; 38: 205-211. Starzl TE et al., Surg. Gynecol. Obstet. 1963; 117: 659-676). Ende der 60er Jahre folgten umfangreiche Konservierungsstudien, deren Ziel es war, den Temperaturbereich und die Zusammensetzung der Konservierungslösungen zu optimieren. Pienaar konnte im Schweinelebertransplantationsmodell zeigen, dass bereits durch Oberflächenkühlung Konservierungszeiten von 6 Stunden erreicht werden können (Pienaar BH et al., Transplantation 1991; 52: 38-43). Wird eine Konservierungslösung zur Durchspülung der Leber eingesetzt, lässt sich im Schweinemodell der Konservierungszeitraum auf mehr als 12 Stunden verdoppeln Nach der Entwicklung der Euro-Collins-Lösung (EC) findet heute vor allem die University-of-Wisconsin-Lösung (UW) Verwendung. Im Gegensatz zur EC-Lösung handelt es sich bei der UW-Lösung um eine hyperosmolare Flüssigkeit mit den impermeablen Substanzen Hydroxyethylstärke, Raffinose und Laktobionsäure. Aber auch die auf Histidin, Tryptophan und Ketoglutarat aufbauende HTK-Lösung nach Bretschneider wird von einigen Trans plantationszentren erfolgreich eingesetzt (Bretschneider HJ et al., 1988, Klinisch.The Functional uptake of the liver hangs, As with other organs, it depends significantly on the extent of the injury during the period Ischemia. The lower the organ damage while the preservation interval, the faster the organ can be Take over tasks again (Pegg DE et al., Organ Preservation: basic and applied aspects. 1982; Boston, Lancaster, the Hague, MTP Press Limited; Hochachka PW, Science 1986; 231: 234-241). The protection of the liver during the Conservation interval is thus of particular importance. The The principle of organ preservation is based on a reduction of Metabolic activity by Lowering the temperature. All transplantable organs become Preservation at 0 to 4 ° C stored cold. According to the van't Hoff equation, this slows down the metabolism to about a twelfth. Already used at the first clinical liver transplantation Starzl one at 15 ° C cooled Ringer's lactate solution for organ protection (Belzer FO et al., Transplantation 1988; 45: 673-676. Singer D et al., Thorac. Cardiovas. Surg. 1990; 38: 205-211. Starzl TE et al., Surg. Gynecol. Obstet. 1963; 117: 659-676). The End The 1960s were followed by extensive conservation studies, whose The aim was to increase the temperature range and composition of preservative solutions optimize. Pienaar could in the pig liver transplant model show that already by surface cooling preservation times of 6 hours can be achieved (Pienaar BH et al., Transplantation 1991; 52: 38-43). Will one Preservation solution for flushing the liver used, leaves in the pig model the preservation period is more than 12 Doubling hours After the development of the Euro-Collins solution (EC) finds today especially the University of Wisconsin solution (UW) Use. In contrast to the EC solution is in the UW solution around a hyperosmolar fluid with the impermeable substances hydroxyethyl starch, raffinose and lactobionic acid. But also based on histidine, tryptophan and ketoglutarate HTK solution according to Bretschneider is successfully used by some transplantation centers (Bretschneider HJ et al., 1988, Clinical.

Wochenschrift 66, 817-827). Wenngleich die meisten Lebern innerhalb der ersten 14 Stunden transplantiert werden, lassen sich so Konservierungszeiten von über 24 Stunden erzielen (Belzer FO et al., Transplantation 1988; 45: 673-676; Jamieson NV et al, Eur.J.Gastroenterol.Hepatol. 1989; 1: 83-86; Gubernatis G et al., Langenbecks.Arch.Chir. 1990; 375: 66-70; Erhard J et al., Transplant.Int. 1994; 7: 177-181) Es gibt somit vielerlei Lösungen für die Spülung und Konservierung von biologischen Geweben und Organen. WO 02/30192 (Arrington et al.) lehrt ferner Maschinen-Perfusionslösungen für den Erhalt von Organen und biologischen Geweben vor der Implantation, die unter anderem einen Stimulator für die zelluläre Energieerzeugung unter anaeroben Bedingungen und einen Fänger für freie Radikale enthalten. Die dort beschriebene wässrige Lösung enthält neben sterilem Wasser, Natriumgluconat (80 mM/L), Kaliumdihydrogenphosphat (25 mM/L), Adenin (5 mM/L), Ribose (5 mM/L), Calciumchlorid (0,5 mM/L), modifizierte Stärke von 40-60 kDa (50 g/L), Magnesiumgluconat (5 mM/L), HEPES (10 mM/L), Glucose (10 mM/L), Mannitol (30 mM/L), und insbesondere auch Insulin (40 U/L) und Superoxiddismutase (25 000 U/L). US 4 798 824 und US 4 879 283 (Belzer et al.) beschreiben Albumin-Lösungen für die Perfusion, die mit individuellen Abänderungen in der Regel folgende Bestandteile enthalten: Natriumbicarbonat (17,5 g/L), Kaliumdihydrogenphosphat (3,4 g/L), Glucose (1,5 g/L) Glutathion (9 g/L), Adenosin (1,3 g/L), HEPES (4,7 g/L), Penicillin (200K U/L) Dexamethason (8mg/L) Phenolsulphthalein als Indikator (12 mg/L), Insulin (40 U/L), Serumalbumin (150 mL/L) und Magnesiumsulphat (1 g/L).Weekly 66, 817-827). Although most livers are transplanted within the first 14 hours, preservation times of over 24 hours can be achieved (Belzer FO et al., Transplantation 1988; 45: 673-676; Jamieson NV et al., Eur.J.Gastroenterol.Hepatol. 1989; 1: 83-86; Gubernatis G et al., Langenbecks.Arch.Chir. 1990; 375: 66-70; Erhard J et al., Transplant.Int. 1994; 7: 177-181) Solutions for the rinsing and preservation of biological tissues and organs. WO 02/30192 (Arrington et al.) Further teaches machine perfusion solutions for preserving organs and biological tissues prior to implantation which include, among other things, an anaerobic cellular energy stimulator and a free radical scavenger. The aqueous solution described therein contains, in addition to sterile water, sodium gluconate (80 mM / L), potassium dihydrogen phosphate (25 mM / L), adenine (5 mM / L), ribose (5 mM / L), calcium chloride (0.5 mM / L ), modified starch of 40-60 kDa (50 g / L), magnesium gluconate (5 mM / L), HEPES (10 mM / L), glucose (10 mM / L), mannitol (30 mM / L), and in particular also insulin (40 U / L) and superoxide dismutase (25 000 U / L). US 4,798,824 and U.S. 4,879,283 (Belzer et al.) Describe albumin solutions for perfusion which, with individual modifications, usually contain the following components: sodium bicarbonate (17.5 g / L), potassium dihydrogen phosphate (3.4 g / L), glucose (1.5 g / L) glutathione (9 g / L), adenosine (1.3 g / L), HEPES (4.7 g / L), penicillin (200K U / L) dexamethasone (8 mg / L) phenolsulphthalein as indicator (12 mg / L), insulin (40 U / L), serum albumin (150 mL / L) and magnesium sulphate (1 g / L).

Alle diese Lösungen sollen das Transplantat beziehungsweise das Organ nicht schädigen, sondern konservieren. Andererseits besteht Uneinigkeit darüber, in welcher Phase die hauptsächlichen Schädigungen am Transplantat erfolgen: (i) bei der Explantation des Organs und der initialen warmen Ischämie, (ii) während der längeren kalten Ischämie, in der das Organ mit einer kalten Perfusions- und Konservierungslösung behandelt wird – hierbei wird das Spenderblut aus dem Organ gedrückt, um degenerative Prozesse im Organ zu vermeiden – oder (iii) bei der Reperfusion mit Blut beim Anschluss an den Empfängerkreislauf. Die Organschädigung können jedenfalls nicht eindeutig dem Explantationstrauma, der Phase der Ischämie, oder der Reperfusion zugeordnet werden. Typische degenerative Prozess sind der oxidative Stress (die Radikalbildung) und die Bildung von Neoantigenen, die zu einer zusätzlichen Aktivierung des Immunsystems und zu verstärkter Abstoßung führen. Bei der Leber wird angenommen, dass vor allem die plötzliche Reperfusion vielfältige Pathomechanismen bedingt wie Schädigungen an den Endothelien, neutrophile Extravasation, Plättchen- und Mastzellenaktivierung sowie eine Peroxidation von Zellmembranlipiden.All these solutions should not damage the graft or the organ, but conserve it. On the other hand, there is disagreement over which phase the major graft damage occurs: (i) in the explantation of the organ and the initial warm ischemia, (ii) during the prolonged cold ischemia in which the organ is treated with a cold perfusion and preservation solution - in which the donor blood is forced out of the organ to avoid degenerative processes in the organ - or (iii) when reperfused with blood when connected to the recipient's circulation. In any case, organ damage can not be clearly attributed to explant trauma, ischemia, or reperfusion. Typical degenerative processes include oxidative stress (the formation of radicals) and the formation of neoantigens, which lead to additional activation of the immune system and increased rejection. In the liver, it is believed that especially the sudden reperfusion manifold pathologies Such mechanisms as damage to the endothelia, neutrophil extravasation, platelet and mast cell activation and peroxidation of cell membrane lipids.

AUFGABE DER ERFINDUNGTASK OF THE INVENTION

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Lösung für die Perfusion und Konservierung von Transplantanten zwischen Ischämie und Reperfusion im Aufgabenkomplex einer Organtransplantation bereitzustellen, insbesondere der einer Lebertransplantation, welche die bekannten Nachteile des Stands der Technik überwindet.It Object of the invention, a method and a solution for perfusion and preservation of transplanters between ischemia and To provide reperfusion in the task complex of organ transplantation, especially that of a liver transplant, which are the known ones Disadvantages of the prior art overcomes.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGSUMMARY THE INVENTION

Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Perfusions- und Konservierungslösung gemäß Anspruch 1. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen beschrieben. Die Erfindung umfasst somit eine Perfusions- und Konservierungslösung für Transplantate, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie zudem Relaxin enthält, bevorzugt rekombinantes humanes Relaxin und zwar in einer Konzentration von 30 bis 300 μg pro L Lösung. Die Lösung ist bevorzugt ausgewählt aus Collins-Lösung, Euro-Collins-Lösung, UW-Lösung, Pike-Lösung, Bretschneider-Lösung, Belzer-Lösung, aber nicht auf diese Lösungen beschränkt. Es empfiehlt sich, die Perfusions-Konservierungslösung auszulegen auf eines der folgenden Organe: Leber, Niere, Herz, Pankreas, Leber. Vorteilhaft an der erfindungsgemäßen Lösung ist, dass sie Zellschäden im Organ nach Ischämie und/oder Reperfusion bekämpft und dass sie die Exprimierung- von Oberflächenantigenen und die Transplantatabstoßung bekämpft.These Task is solved by a perfusion and preservation solution according to claim 1. Preferred embodiments The invention are described in the subclaims. The invention thus comprises a transplant perfusion and preservation solution which is characterized in that it also contains relaxin, preferably recombinant human relaxin in a concentration of 30 to 300 μg per L solution. The solution is preferably selected from Collins solution, Euro-Collins solution, UW solution, Pike solution Bretschneider solution, Belzer solution, but not on these solutions limited. It is recommended to design the perfusion preservative solution on one of the following organs: liver, kidney, heart, pancreas, liver. An advantage of the solution according to the invention is that they have cell damage in the organ after ischemia and / or reperfusion and that it fights the expression of surface antigens and transplant rejection.

Die Erfindung basiert auf Forschungsergebnissen auf dem Gebiet des Imaging von funktionell aktiven Organen und aus der Untersuchung der Reperfusions-Schädigung bei Organtransplantationen. Bisher stand dabei die Leber im Mittelpunkt des Interesses. Die bereitgestellte Perfusions- und Konservierungslösung ist aber prinzipiell für alle Organe und Gewebe geeignet, insbesondere auch für Herz, Niere, Pankreas, und natürlich Leber. Beim sogenannten Organimaging wird das isolierte perfundierte Organ direkt spektrophotometrisch vermessen und beobachtet. Dazu wurden Rattenlebern isoliert und in einem geeigneten Kreislauf bei kontrolliertem Druck, Temperatur und Oxygenierung perfundiert. Die Perfusion ist prinzipiell mit Hämoglobin oder hämoglobinfrei möglich. Die Spektrophotometrie erlaubt die Messung von lokaler Hämoglobin-Konzentration und Oxygenierung, sowie des Redoxzustandes der Cytochrome im Organ. Gegenüber der Farbkodierten Doppler-Sonographie (FKDS), die nur die Perfusion im Organ oder Organabschnitten messbar macht, erlauben die genannten Parameter Aussagen über die Sauerstoffverteilung im Gewebe und speziell die Sauerstoffversorgung auf zellulärer Ebene. Diese Parameter können auch im nicht perfundierten Organ gemessen werden, was bei Transplantationen ein Organmonitoring in der Ischämiephase erlaubt.The The invention is based on research results in the field of imaging of functionally active organs and the study of reperfusion injury Organ transplants. So far, the liver was the focus of interest. However, the perfusion and preservation solution provided is in principle for all organs and tissues suitable, especially for heart, Kidney, pancreas, and of course Liver. In so-called organimaging, the isolated perfused Organ measured directly by spectrophotometry and observed. To rat livers were isolated and controlled in a suitable cycle Pressure, temperature and oxygenation perfused. The perfusion is in principle with hemoglobin or hemoglobin-free possible. Spectrophotometry allows the measurement of local hemoglobin concentration and oxygenation, as well as the redox state of the cytochromes in the organ. Across from Color-coded Doppler sonography (FKDS), which is just perfusion makes measurable in the organ or organ sections, allow the mentioned Parameter statements about the oxygen distribution in the tissue and especially the oxygen supply on cellular Level. These parameters can also be measured in the non-perfused organ, resulting in transplants an organ monitoring in the ischemic phase allowed.

Die erfindungsgemäßen Untersuchungen erfolgten an isolierten perfundierten Rattenlebern, wobei die Bedingungen einer Lebertransplantation simuliert wurden. Es erfolgten drei Ischämieversuche von drei und sechs Stunden. Die Organkonservierung erfolgte identisch wie bei menschlichen Transplantaten. Das Relaxin (siehe Übersicht von Bani D in Gen. Pharma. 28(1), 13-27, 1997) wurde erfindungsgemäß eingesetzt bei der Spülung nach der Entnahme und bei der Konservierung während der kalten Lagerung. Die Kontrollen erfolgten mit einer Perfusions- und Konservierungslösung ohne Relaxin. Die Zellschäden durch das Perfusat wurden über eine Bestimmung von MDA (Malonyldialdehyd), dem Endprodukt der Lipidperoxidation und der MPO (Myeloperoxidaseaktivität), einem Marker für die Akkumulierung von Neutrophilen, bestimmt. Der MDA-Spiegel diente also als Maß für die oxidative Belastung. Zur Bestimmung wurde das MDA in ein fluoreszierendes Produkt umgesetzt, mittels HLPC aufgetrennt und über die Fluoreszenz gemessen. In einem anderen Messverfahren wird die gesamt oxidative Kapazität, d.h. die Menge aller im Gewebe vorhandenen Lipidperoxide bestimmt. Dazu wurden die Lipidperoxide mit Peroxidase und Tetramethylbenzidin (TMB) umgesetzt, und das resultierende farbgebende Produkt bestimmt. Die Lebern wurden ferner immunhistochemisch auf MDA and MPO untersucht.The investigations according to the invention were performed on isolated perfused rat livers, with the conditions a liver transplant were simulated. There were three ischemic tests of three and six hours. The organ preservation was identical as with human transplants. The relaxin (see overview from Bani D in Gen. Pharma. 28 (1), 13-27, 1997) was used according to the invention when flushing after removal and preservation during cold storage. The controls were done with a perfusion and preservation solution without Relaxin. The cell damage through the perfusate were over a determination of MDA (malonyldialdehyde), the end product of lipid peroxidation and the MPO (myeloperoxidase activity), a marker for accumulation of neutrophils, determined. The MDA mirror thus served as a measure of the oxidative Burden. For determination, the MDA was transformed into a fluorescent Product reacted, separated by HLPC and measured by fluorescence. In another measurement method, the total oxidative capacity, i. the amount of all lipid peroxides present in the tissue is determined. To were the lipid peroxides with peroxidase and tetramethylbenzidine (TMB), and the resulting coloring product determined. The livers were also examined immunohistochemically for MDA and MPO.

Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass Relaxin in der Perfusions- und Konservierungslösung die Spiegel von MPO and MDA im Perfusat und in der immunhistochemischen Untersuchung herabsetzt und zwar insbesondere dann, wenn Relaxin bereits in der Perfusions- und Konservierungslösung vorhanden ist und nicht erst nachträglich zugesetzt wird. Dort kann es in überphysiologischen Mengen eingesetzt werden, vorzugsweise in einer Menge von 30 bis 300 ng/ml, also ca. 3- bis 6-fach (und höher) über den bekannten Mengen während der Reperfusion (Masini et al., Endocrinology, 1997, 138(11), 4713-4720; Bani et al, 1998, American J Pathol., 152(5), 1367-1376). Wird das Relaxin aber erst bei der Reperfusion zugesetzt, d.h. in den Blutkreislauf (Koronararterie) zum Organ (Herz) eingespritzt, bleibt die effektive Menge an Relaxin im Transplantatorgan temporär und niederkonzentriert. Durch den einsetzenden Blutkreislauf wird es zudem aus dem reperfundierten Organ ausgetragen. Wegen der systemischen Wirkung können keine hohen Relaxinkonzentration eingesetzt werden, bzw. die Relaxinkonzentration im Transplantat muss niedrig bleiben. Zudem beruht die Verabreichung von Relaxin bei der Reperfusion auf dem Konzept, hierdurch die Blutgefäße im Transplantatorgan zu dilatieren und eine bessere Versorgung und Mikrozirkulation mit frischem Blut zu erreichen bzw. das Organ auf den plötzlich einsetzenden Blutdruck so einzustellen, dass die Gefäße keinen Widerstand leisten (Bani G et al, Lab Invest., 73: 709-716, 1995; Bigazzi M et al., Acta Endocrinologica, 112:296-299; Bani G et al., Histol Hisopath., 3:337-343, 1988).The results clearly show that relaxin in the perfusion and preservation solution lowers the levels of MPO and MDA in the perfusate and in the immunohistochemical examination, especially if relaxin is already present in the perfusion and preservation solution and is not subsequently added. There it can be used in excess physiological amounts, preferably in an amount of 30 to 300 ng / ml, ie about 3 to 6 times (and higher) over the known amounts during reperfusion (Masini et al., Endocrinology, 1997 , 138 (11), 4713-4720, Bani et al, 1998, American J Pathol., 152 (5), 1367-1376). However, if the relaxin is added only during reperfusion, ie injected into the bloodstream (coronary artery) to the organ (heart), the effective amount of relaxin in the transplant organ remains temporary and low concentrated. Due to the onset of blood circulation, it is also discharged from the reperfused organ. Because of the systemic effect, no high relaxin concentration can be used, or the relaxin concentration in the graft must remain low. Moreover, the administration of relaxin in reperfusion is based on the concept of dilating the blood vessels in the transplant organ and achieving a better supply and microcirculation with fresh blood or adjusting the organ to the sudden onset of blood pressure so that the vessels do not resist ( Bani G et al, Lab Invest., 73: 709-716, 1995; Bigazzi M et al., Acta Endocrinologica, 112: 296-299; Bani G et al., Histol Hisopath., 3: 337-343, 1988). ,

Einem gänzlich anderen Prinzip wird gefolgt, wenn das Relaxin wie erfindungsgemäß der kalten Perfusions- bzw. Konservierungslösung zugesetzt wird. Hier werden die Organgefäße für ein Durchspülen mit der künstlichen Perfusions- und Konservierungslösung dilatiert und das Organ für die spätere Reperfusion vorbereitet. Es können somit sehr viel höhere Konzentrationen an Relaxin eingesetzt werden. Es wird vermutet, dass durch den Zusatz von Relaxin bereits in der Perfusions- und Konservierungslösung das Problem der Mikrozirkulation im Organ, welches insbesondere bei der Leber besteht, erfolgreich gelöst wird.a completely Another principle is followed when the relaxin as in the invention of the cold Perfusion or preservation solution is added. Here are the organ vessels for a flush with the artificial one Perfusion and preservation solution dilated and the organ for the later one Reperfusion prepared. It can thus much higher Concentrations of relaxin are used. It is believed that by the addition of relaxin already in the perfusion and preservation solution the problem of microcirculation in the organ, which in particular when the liver is successfully resolved.

Insbesondere bei Lebertransplantationen tritt das Problem auf, dass das eingesetzte Transplantat, wenn der Kreislauf geschwächt ist, dann nicht mehr vollständig durchblutet wird. Die Transplantation scheitert in solchen Fällen. Durch das Relaxin in der Perfusions- und Konservierungslösung wird der Strömungswiderstand im Organ erheblich gesenkt und dieses Problem behoben. Auch bei kleineren Organen, die einen geringeren Strömungswiderstand besitzen, ist eine bessere Anfangsdurchblutung vorteilhaft.Especially In liver transplants, the problem arises that the used Transplant, if the circulation is weakened, then no longer completely perfused becomes. The transplant fails in such cases. By the relaxin in the perfusion and preservation solution becomes the flow resistance Significantly lowered in the organ and this problem solved. Also at smaller organs, which have a lower flow resistance, is a better initial blood flow advantageous.

An dem Modell der isoliert perfundierten Rattenleber können daneben im Perfusat noch Parameter bestimmt werden, welche eine Aussage über den Organschaden, der durch das Reperfusionstrauma bei Transplantationen verursacht wird, erlauben. So können die MDA und die oxidative Kapazität bestimmt werden.At The model of isolated perfused rat liver may be next to it in the perfusate still parameters are determined, which give a statement about the Organ damage caused by the reperfusion trauma during transplants caused. So can the MDA and the oxidative capacity are determined.

In einem weiteren Schritt wurde Relaxin als Spül- und Konservierungslösung eingesetzt und die MDA und/oder der oxidativen Kapazität bestimmt. Es konnte so gezeigt werden, dass die Zellschäden in Leber durch die Verwendung von Relaxin erfolgreich unterdrückt werden können.In Relaxin was used as a rinsing and preserving solution in a further step and determines the MDA and / or the oxidative capacity. It could be shown that way be that cell damage be successfully suppressed in the liver by the use of relaxin can.

Relaxin wurde dabei als Zusatz zur Lösung beim Freispülen und als Aufbewahrungsmedium für die Leber während der Phase der Ischämie verwendet. Die Reperfusion erfolgte dann sowohl hämoglobinfrei als auch mit Blut. Die Phase der Ischämie hatte eine variable Dauer zwischen 1 und 6 Stunden. Die Lagerungstemperatur lag entweder bei 4°C oder bei 20°C zur Kontrolle.relaxin was there as an addition to the solution when flushing and as a storage medium for the liver while the phase of ischemia used. Reperfusion then took place both hemoglobin-free as well as with blood. The phase of ischemia had a variable duration between 1 and 6 hours. The storage temperature was either at 4 ° C or at 20 ° C for control.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGENBRIEF DESCRIPTION OF THE PICTURES

Es zeigt:It shows:

1 Diagramm des zeitlichen Verlaufs des MDA-Spiegels im Perfusat bei einer Spül- und Konservierungslösung ohne Relaxin (obere Kurve) und mit Relaxin (untere Kurve) mit R) bei warmer Ischämie; 1 Diagram of the time course of the MDA level in the perfusate in a flushing and preservation solution without relaxin (upper curve) and with relaxin (lower curve) with R) in warm ischemia;

2 Diagramm des zeitlichen Verlaufs des MDA-Spiegels im Perfusat bei einer Spül- und Konservierungslösung ohne Relaxin (obere Kurve) und mit Relaxin (untere Kurve) mit R) bei kalter Ischämie; 2 Diagram of the time course of the MDA level in the perfusate in a flushing and preservation solution without relaxin (upper curve) and with relaxin (lower curve) with R) in cold ischemia;

3 Diagramm des zeitlichen Verlauf der MPO-Spiegel im Perfusat bei einer Spül- und Konservierungslösung ohne Relaxin (obere Kurve) und mit Relaxin (untere Kurve mit R) bei warmer Ischämie; 3 Diagram of the time course of MPO levels in perfusate in a flushing and preservation solution without relaxin (upper curve) and with relaxin (lower curve with R) in warm ischemia;

4 Diagramm des zeitlichen Verlauf der MPO-Spiegel im Perfusat bei einer Spül- und Konservierungslösung ohne Relaxin (obere Kurve) und mit Relaxin (untere Kurve mit R) bei kalter Ischämie; 4 Diagram of the time course of the MPO levels in the perfusate in a flushing and preservation solution without relaxin (upper curve) and with relaxin (lower curve with R) in cold ischemia;

5 Diagramm einer spektrophotometrischen Abtastung der Oberfläche einer Leber nach 3,5 Stunden kalter Ischämie (ohne Relaxin in der Spüllösung) vor Reperfusion; 5 Diagram of a spectrophotometric scan of the surface of a liver after 3.5 hours of cold ischemia (without relaxin in the rinse) before reperfusion;

6 Diagramm einer spektrophotometrischen Abtastung der Oberfläche einer Leber nach 3,5 Stunden kalter Ischämie (ohne Relaxin in der Spüllösung) und eine Stunde Reperfusion ohne Relaxin; 6 Diagram of a spectrophotometric scan of the surface of a liver after 3.5 hours of cold ischemia (without relaxin in the rinsing solution) and one hour of reperfusion without relaxin;

7 Diagramm einer spektrophotometrischen Abtastung der Oberfläche einer Leber nach 3,5 Stunden kalter Ischämie (mit Relaxin in der Spüllösung) vor Reperfusion; 7 Diagram of a spectrophotometric scan of the surface of a liver after 3.5 hours cold ischemia (with relaxin in the rinsing solution) before reperfusion;

8 Diagramm einer spektrophotometrischen Abtastung der Oberfläche einer Leber nach 3,5 Stunden kalter Ischämie (mit Relaxin in der Spüllösung) und eine Stunde Reperfusion mit Relaxin; 8th Diagram of a spectrophotometric scan of the surface of a liver after 3.5 hours of cold ischemia (with relaxin in the rinse) and one hour of reperfusion with relaxin;

9 Immunhistochemie auf Zellschäden in zeitlich folgenden Leberschnitten nach Explantation (links), Ischämie (Mitte) und Reperfusion (rechts); obere Reihe: ohne Relaxin in der Spül- und Perfusionslösung; untere Reihe: mit Relaxin in der Spül- und Perfusionslösung – Blau: Zellkern-Färbung mit DAPI, Rot: MPO-Färbung (= Zellschaden) mit Carbocyanin; 9 Immunohistochemistry for cell damage in temporal liver sections after explantation (left), ischemia (middle) and reperfusion (right); upper row: without relaxin in the rinsing and perfusion solution; bottom row: with relaxin in the rinsing and perfusion solution - blue: cell nucleus staining with DAPI, red: MPO staining (= cell damage) with carbocyanine;

10 Immunhistochemie von Leberschnitten von 3 verschiedenen Lebern (= Nr. 16 links, Nr. 21 Mitte, Nr. 26 rechts) jeweils nach Reperfusion; links ohne Relaxin, Mitte mit Relaxin nur zur Reperfusion, rechts mit Relaxin zur Reperfusion und zur Spülung und Konservierung – Blau: Zellkern-Färbung mit DAPI, Rot: MDA-Färbung mit Carbocyanin. 10 Immunohistochemistry of liver sections of 3 different livers (= number 16 left, number 21 center, number 26 right) after reperfusion; left without relaxin, middle with relaxin only for reperfusion, right with relaxin for reperfusion and for rinsing and preservation - blue: cell nucleus staining with DAPI, red: MDA staining with carbocyanin.

MATERIAL UND METHODEMATERIAL AND METHOD

Tiermodellanimal model

Für die Versuche wurden männliche Wistar-Ratten (Charles River GmbH Sulzfeld) verwendet. Die Tiere wurden mit Wasser und Standardfutter ernährt, das sie nach Belieben konsumieren konnten. Die Ratten wurden in Standardkäfigen in Gruppen von 2 bis 4 gehalten.For the experiments became male Wistar rats (Charles River GmbH Sulzfeld) used. The animals They were fed with water and standard food, which they liked could consume. The rats were placed in standard cages in Groups of 2 to 4 kept.

Vor Versuchsbeginn wurde zunächst das Gewicht der Ratte bestimmt und anschließend die Narkose eingeleitet. Das Gewicht der Ratten lag im Mittel bei 355g.In front The beginning of the trial was initially determined the weight of the rat and then initiated the anesthesia. The weight of the rats averaged 355g.

Als Narkosemittel diente Ketavet^® 100mg/ml (Pharmacia & Upjohn GmbH Erlangen), das intraperitoneal appliziert wurde. Die Dosis lag bei 2,53 ml pro kg KGW (Standardabweichung 0,93ml pro kg KGW), entsprechend einer Menge von 250 mg Ketamin Hydrochlorid pro kg KGW. Im Mittel wurde also 0,9ml Ketavet pro Ratte injiziert. Die volle Narkosewirkung trat im Mittel nach 10 min. ein. Aufgrund des gewählten Narkosemittels war gewährleistet, dass die Ratten während der Operation bis zur Entnahme der Leber aus dem Kreislauf ohne Intubation selbstständig atmen konnten und kreislaufstabil blieben. Die einzelnen Schritte der Operation werden im folgenden Abschnitt detailliert beschrieben.As an anesthetic Ketavet ^® 100mg / ml was intraperitoneally administered was used (Pharmacia & Upjohn GmbH Erlangen, Germany). The dose was 2.53 ml per kg of body weight (standard deviation 0.93 ml per kg of body weight), corresponding to an amount of 250 mg of ketamine hydrochloride per kg of body weight. On average, 0.9 ml of ketavet per rat was injected. The full anesthetic effect occurred on average after 10 min. one. Due to the selected anesthetic it was ensured that the rats were able to breathe autonomously during the operation until removal of the liver from the circulation without intubation and remained stable in the circulation. The individual steps of the operation are described in detail in the following section.

Explantation der Leberexplantation the liver

Großzügige Rasur des Bauches bis hinter die hintere Axillarlinie sowie des Thorax bis zur vorderen Axillarlinie. Abheben der Haut mit einer Klemme und Abschneiden der Hautkappe. Mit chir. Klemme Bauchmuskulatur fest greifen und Bauchhöhle durch Inzisur eröffnen. Mit 4 Quetschklemmen Öffnung fixieren und nach kaudal großzügig eröffnen. Dann nach lateral zügig bis zu den hinteren Axillarlinien schneiden. Zuletzt vorsichtig den Längsschnitt nach kranial bis kurz vor das Zwerchfell setzen ohne dieses zu verletzen. Mit kleiner gebogenen Pinzette hinter dem Lig. falciforme durchgreifen und Faden durchziehen. Durch Doppelknoten nahe an der Leber ligieren, Fäden abschneiden und distal das Band durchtrennen.Generous shave of the abdomen to behind the posterior axillary line and the thorax to the front axillary line. Lifting the skin with a clamp and cutting off the skin cap. With chir. Clamp abdominal muscles firmly grasp and abdominal cavity open by incisor. With 4 squeeze clamps opening fix and open generously to caudal. Then laterally swiftly to cut to the rear axillary lines. Last careful the longitudinal section after cranial to put just before the diaphragm without hurting it. Use small curved tweezers behind the Lig. Falciforme and thread through. Ligate through double nodes close to the liver, Cut threads and distally cut the band.

Zu diesem Zeitpunkt wurde kurz unterbrochen, um in-situ-Messungen der Rattenleber durchzuführen. Da diese Messungen nur ca. zwei Minuten in Anspruch nahmen, bestand keine Gefahr, den Erfolg der Operation zu gefährden.To This time was briefly interrupted to in-situ measurements of To perform rat liver. There These measurements took only about two minutes, was no danger of jeopardizing the success of the operation.

Danach wurde die OP wie folgt fortgesetzt. Durch festes Anheben des Magens wird die Bursa omentalis mit dem darin liegendem Lobus caudatus der Leber dargestellt. Mit kleiner Präparierschere rechts des Lobus durch die Öffnung und durch Aufspreizen der Schere dieselbe verbreitern. Vorsichtig eventuell Bindegewebe, welches den Lobus fixiert, abtrennen. Mit Tupfer den Lobus durch die Öffnung schieben. Alle Darmanteile, Magen und Milz soweit wie möglich nach links mobilisieren, so daß die Bauchrückwand und v.a. die Gefäße darzustellen sind. Vena cava inf. zurückhaltend freipräparieren, mit gebogener kleiner Pinzette unterminieren. Faden durchziehen und mit Doppelknoten Ligatur vorbereiten. Zuerst V. portae von distal nach proximal vorsichtig herauspräparieren. Analog zur V. cava inf. Ligatur vorbereiten. 0,2ml Heparin (1000 IE) in die V. cava inf. spritzen. Mit Gefäßklemme V. portae distal abklemmen. Mit kleiner Pinzette ca 1-2cm distal der Leberpforte das Gefäß ergreifen und durch eine kleine Inzision eine Öffnung in V. porta schneiden. Zur Kanülierung wird eine ca. 4cm lange und ca. 1 mm im Querschnitt messender Plastikschlauch vorbereitet. Die Kanüle wird mit Mandrin durch die Öffnung eingeführt und vorgeschoben. Durch eine möglichst nicht zu tiefe Platzierung wird eine Perfusion aller Segmente erzielt. Durch Festziehen der vorbereiteten Ligatur wird die Kanüle am Bindegewebe fixiert. Eine Infusionsflasche mit Perfusat wird nun mit der V.portae-Kanüle konnektiert. Im folgenden wird die Leber mit Perfusat freigespült und bis zum OP-Ende weiter perfundiert. Eröffnung des Thorax mit einer Präparierschere von kaudal durch den linken Rippenbogen. Links am Herzen vorbeischneiden und Brustkorb bis zur oberen Apertur eröffnen. Es wird in diesem OP-Abschnitt zügiges Arbeiten angeraten, da sich durch den beidseitigen Pneumothorax das Blut vor dem rechten Herzen rückstaut. Mit kleiner Pinzette wird die Vena cava inf. oberhalb des Zwerchfells unterminiert und eine Ligatur vorbereitet. Dann Aufsuchen des rechten Vorhofes. Mit einer Inzision wird dieser eröffnet und die zweite Kanüle unter leichten Drehbewegungen nach kaudal in die Vena cava inf. vorgeschoben. Fixieren der Kanüle durch Zuziehen der Ligatur. Aus der Kanüle fließt nun reines blutfreies Perfusat., nur dann ist eine Perfusion der Leber sichergestellt. Durch einen Schnitt durch beide Herzkammern wird ein kompletter Kreislaufstillstand gesichert. Das Freipräparieren der Leber wird von kranial begonnen, indem der Operateur Herz und Vorhof von der oberen Kanüle abtrennt. Es sollten daraufhin die Lungen von der oberen Kanülierung wegpräpariert werden. Die Leberlappen werden nun der Reihe nach freipräpariert und auf einen Löffel aufgeladen. Zwerchfell nahe an oberer Kanülierung ablösen. Die untere Kanülierung muss unter äußerster Sorgfalt vom Retroperitoneum gelöst werden.Thereafter, the operation was continued as follows. By firm lifting of the stomach the omental bursa with the lobus caudatus of the liver lying in it is represented. Broaden the same with small dissecting scissors to the right of the lobe through the opening and by spreading the scissors. Carefully remove any connective tissue that fixes the lobe. Use a swab to push the lobe through the opening. As far as possible, mobilize all bowel parts, stomach and spleen to the left, so that the abdominal wall and especially the vessels are to be represented. Vena cava inf. restrainedly dissect, undermine with curved small forceps. Pull through the thread and prepare with double knot ligature. First carefully dissect V. portae from distal to proximal. Analogous to the V. cava inf. Prepare ligature. 0.2 ml heparin (1000 IU) into the V. cava inf. squirt. Disconnect distally with vascular clamp V. portae. With small tweezers approx. 1-2cm distal to the hepatic port, grasp the vessel and cut through a small incision an opening in the v. Porta. For cannulation is prepared a 4cm long and about 1 mm in cross-section measuring plastic tube. The cannula is inserted with stylet through the opening and advanced. By not too low placement as possible perfusion of all segments is achieved. By tightening the prepared ligature, the cannula is fixed to the connective tissue. An infusion bottle with perfusate is now connected to the V.portae cannula. In the following, the liver is flushed with perfusate and further perfused to the end of the operation. Opening of the thorax with a dissecting scissors from caudal through the left costal arch. Cut in on the left side of the heart and open the thorax up to the upper aperture. It is recommended in this surgical section, rapid work, as the two-sided pneumothorax the back pressure in front of the right heart. With small tweezers, the vena cava inf. undermined above the diaphragm and prepared a ligature. Then visit the right atrium. With an incision, this is opened and the second cannula with slight rotational movements in caudal into the vena cava inf. advanced. Fix the cannula by pulling the ligature. From the cannula now flows pure blood-free perfusate, only then a perfusion of the liver is ensured. A cut through both chambers of the heart ensures a complete cardiac arrest. Liver dissection is begun cranially by having the surgeon separate the heart and the atrium from the upper cannula. The lungs should then be removed from the upper cannulation. The liver lobes are now dissected in order and loaded onto a spoon. Detach diaphragm near upper cannulation. The lower cannulation must be released from the retroperitoneum with the utmost care.

Nun wird der Infusionsschlauch vorsichtig von der Kanüle diskonnektiert. Die Leber wird auf dem Löffel zum Versuchstisch getragen bzw. zur Aufbewahrung bei Versuchen mit Perfusionsstopp in ein Glas gelegt (s.u.). Beim Positionieren der Leber ist zuerst darauf zu achten, daß das Abflussröhrchen (Kanüle in V. cava. inf) zuerst im Abfluss positioniert werden muss. Es sollen keine Lappen den Abfluss behindern, wenn nötig kleine Schlauchstücke unterlegen.Now The infusion tube is carefully disconnected from the cannula. The liver becomes on the spoon too Trial table worn or for storage in experiments with Perfusionsstopp placed in a glass (s.u.). When positioning the liver is first to make sure that the drain tube (cannula in V. cava. inf) must first be positioned in the drain. It No rags should obstruct the drain, if necessary small Connectors inferior.

Die Vena Portakanüle wird nun vorsichtig mit dem Zufluss-Schlauch aus dem oberen Blasenfänger (s.u.) verbunden. Die Leber wird also antegrad über die Vena porta perfundiert. Aus dem Abflussröhrchen muss nun sichtbar etwas abfließen. Die Oberfläche der Lappen, auf denen eine Messung stattfinden soll, wird durch die Positionierung weitgehend eben geformt, um einen konstanten Abstand zum Lichtleiter zu gewährleisten.The Vena porta cannula Now carefully with the inflow tube from the upper bubble trap (s.u.) connected. The liver is thus perfused antegrade via the vena porta. Out of the drainpipe now visibly drain something. The surface the lobe on which a measurement is to take place is through the positioning largely flat, to a constant To ensure distance to the light guide.

Perfusionsapparaturperfusion

Das Perfusat bzw. das Erythrozyten-Perfusat-Gemisch wurde in einem Membranoxygenator (Hallow-fibre-Oxygenator Lilliput I D901, Dideco, Italien bei Erythrozyten-Perfusat-Gemisch bzw. Lilliput II D902 bei Hämoglobin-freiem Perfusat) mit 95% O₂ 5% CO₂ gesättigt. Durch einen mit dem Oxygenator verbundenen Wärmeaustauscher (NK 22 Haake, Germany) wurde das Perfusat konstant auf einer Temperatur von 20°C bzw. das Erythrozyten-Perfusat-Gemisch auf 37°C gehalten. Vom Oxygenator gelangte das Perfusat über einen oberen Blasenfänger durch die Vena-Porta-Kanüle in die Leber. Die Anordnung des Blasenfängers 15 cm über der Leber sowie ein Shunt zum unteren Blasenfänger, der ein Überlaufen verhindert, gewährleistet einen konstanten Perfusionsdruck von 15 cm Wassersäule. Die Leber lagerte auf einer Plexiglasplatte mit einer zentralen Öffnung, durch die die Vena-Cava-Kanüle als Abfluss gelegt wird. Über einen Trichter gelangte das Perfusat wieder zurück in das Schlauchsystem in den unteren Blasenfänger. Aus diesem Reservoir wird über eine Rollerpumpe (Stöckert Shiley, München) das Perfusat zurück zum Oxygenator gepumpt.The perfusate or the erythrocyte-perfusate mixture was in a membrane oxygenator (Hallow-fiber oxygenator Lilliput I D901, Dideco, Italy erythrocyte perfusate mixture and Lilliput II D902 in hemoglobin-free perfusate) with 95% O ₂ % CO ₂ saturated. The perfusate was kept constant at a temperature of 20 ° C. or the erythrocyte-perfusate mixture at 37 ° C. by means of a heat exchanger connected to the oxygenator (NK 22 Haake, Germany). From the oxygenator, the perfusate passed through an upper blister through the vena porta cannula into the liver. The arrangement of the bladder 15 cm above the liver and a shunt to the lower bladder, which prevents overflow, ensures a constant perfusion pressure of 15 cm water column. The liver was stored on a Plexiglas plate with a central opening, through which the vena cava cannula is drained. Via a funnel, the perfusate returned to the tube system in the lower bladder catcher. From this reservoir, the perfusate is pumped back to the oxygenator via a roller pump (Stöckert Shiley, Munich).

Erlanger-Mikrolichtleifer-Spekfro-Photometer (EMPHO II SSK)Erlanger micro light Leifer-Spekfro photometer (EMPHO II SSK)

Das EMPHO (H Frank et al 1989 Phys. Med. Biol. 34:1883-1900) wurde am Institut für Physiologie und Kardiologie der Universität Erlangen-Nürnberg entwickelt. Die Beleuchtungseinheit des Empho bestand aus einer wassergekühlten Xenon-Hochdruck-Bogenlampe (XBO 75 W / 2 Osram). Das von dieser erzeugte polychromatische Licht wurde zunächst von einem Linsensystem parallelisiert und nach Durchtritt durch einen Hitzefilter auf den Eingang des Lichtleiters fokusiert. Der beleuchtende Teil des Lichtleiters wurde innerhalb der optischen Achse auf den Brennpunkt des Linsensystems ausgerichtet. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, den Lichtleiter mit Hilfe zweier Schrauben in einer zur optischen Achse des einfallenden Lichtes senkrecht stehenden Ebene optimal zu positionieren.The EMPHO (H Frank et al 1989 Phys. Med. Biol. 34: 1883-1900) was published on Institute for Physiology and Cardiology developed at the University of Erlangen-Nuremberg. The lighting unit of the Empho consisted of a water-cooled xenon high-pressure arc lamp (XBO 75W / 2 Osram). The polychromatic light generated by this was first parallelized by a lens system and after passing through a heat filter focused on the input of the light guide. Of the illuminating part of the light guide was within the optical Axis aligned with the focal point of the lens system. Furthermore there is the possibility of the Light guide with the help of two screws in one to the optical axis optimally position the plane of incidence of the incident light.

Der Lichtleiter bestand aus einer sendenden und einer empfangenden Komponente. Die flexiblen Leiterfasern sind von einem Kunststoffmantel umgeben. Es wurde zwei verschiedene Lichtleitertypen mit jeweils 1 m Länge benutzt. Standardmäßig wurde ein Lichtleiter benutzt, bei dem sechs zirkulär angeordneten Empfängerlichtern um einen Sendelichtleiter gruppiert waren, wobei der Durchmesser der einzelnen Fasern jeweils 70 μm betrug. Zum Vergleich wurde bei einigen Messungen ein Lichtleiter mit nur einer beleuchtenden (Durchmesser 70 μm) und einer detektierenden Faser (Durchmesser 250 μm) verwendet.The light guide consisted of a transmitting and a receiving component. The flexible conductor fibers are surrounded by a plastic jacket. Two different light guide types, each 1 m long, were used. By default, a light guide was used in which six circularly arranged receiver lights were grouped around a transmission light guide, wherein the diameter of the individual fibers was 70 microns each. For comparison, in some measurements, a light guide with only one illuminating (By diameter 70 μm) and a detecting fiber (diameter 250 μm).

Dieser kombinierte Sende- und Empfängerlichtleiter wurde nun auf das zu untersuchende Gewebe aufgesetzt. Über einen Stab war er mit dem 3-D-Trieb verbunden, der auf diese Weise den Lichtleiter gemäß den Einstellungsparametern über die Leberoberfläche (um die x- und y-Achse) steuerte.This combined transmitting and receiving light guides was now placed on the tissue to be examined. About one Rod he was associated with the 3-D shoot, which in this way the Optical fiber according to the adjustment parameters over the liver surface (around the x and y axes).

Der auf den Lichtleiter zurückgestreute Anteil des Lichts wurde vom Empfängerlichtleiter dem Empfangsteil des Empho zugeführt.Of the backscattered on the light guide Proportion of light was from the receiver light guide supplied to the receiving part of the Empho.

Dort traf es auf eine rotierende Interferenzverlaufsfilterscheibe (Anders, Nabburg), die je nach Drehwinkel für einen Lichtwellenbereich zwischen 502 und 628 nm und zwischen 702 und 822nm (IR-Spektrum) durchlässig ist . Dadurch wurde das auftreffende Licht sequentiell in einzelne Wellenlängen zerlegt. Über einen Flüssigkeits-Lichtleiter (Schölly, Denzlingen) wurde das monochromatische Licht zu einem Photomultiplier (RCA C31034A) übertragen, der die eintreffenden Signale verstärkt und in ein analoges Stromsignal umwandelt. Der Photomultiplier kann in einem Spannungsbereich zwischen 0 und 2000 V manuell eingestellt werden. Eine Dekodierscheibe, die fest über eine Achse mit der rotierenden Interferenzverlaufsfilterscheibe verbunden ist, ermöglicht die Zuordnung des jeweiligen Drehwinkels zu einer bestimmten Wellenlänge, die von der Steuerelektronik erkannt wird. Im Abstand von jeweils 2 nm Wellenlänge wird einem Analog-Digital-Wandler (ADC) ein Triggersignal zugeführt. Zudem erzeugt die Triggereinheit nach jedem Spektrum ein Resetsignal, um die Aufnahme eines neuen Spektrums anzuzeigen. Je nach Umdrehungsgeschwindigkeit der Interferenzfilterscheibe können bis zu 100 Spektren pro Sekunde aufgenommen werden.There hit it on a rotating interference filter plate (Anders, Nabburg), depending on the angle of rotation for a light wave range between 502 and 628 nm and between 702 and 822 nm (IR spectrum) is permeable , As a result, the incident light was sequentially split into individual wavelengths. Via a liquid light guide (Schölly, Denzlingen), the monochromatic light became a photomultiplier (RCA C31034A), which amplifies the incoming signals and into an analog current signal transforms. The photomultiplier can be placed in a voltage range between 0 and 2000 V are set manually. A decoder that firmly over an axis with the rotating interference flow filter disc connected, allows the assignment of the respective angle of rotation to a specific wavelength, the is detected by the control electronics. At intervals of 2 each nm wavelength An analog-to-digital converter (ADC) is supplied with a trigger signal. moreover the trigger unit generates a reset signal after each spectrum, to display the recording of a new spectrum. Depending on the speed of rotation the interference filter disc can up to 100 spectra per second.

In dem ADW wird nun aus den Triggerimpulsen und dem analogen Stromsignal aus dem Photomultiplier ein digitales Signal erzeugt und der Recheneinheit (IBM-kompatibler PC) zugeführt. Die so berechneten Spektren können sowohl auf dem Bildschirm des Emphos schon während der Messung qualitativ beurteilt, als auch auf Festplatte gespeichert und später ausgewertet werden.In the ADW will now be out of the trigger pulses and the analog current signal from the photomultiplier generates a digital signal and the arithmetic unit (IBM compatible PC). The spectra calculated in this way can both on the screen of the Emphos already during the measurement qualitatively judged, as well as stored on hard disk and later evaluated become.

Um Referenzwerte für die nachfolgenden Lebermessungen zu erhalten, wurde eine Kalibrierung des Emphos durchgeführt. Analog zu den vorbeschriebenen Vorgehensweisen wurde eine Dunkel- und eine Hell-Kurve mit dem Lichtleiter aufgezeichnet. Dazu wurde für die Dunkel-Eichung der Lichtleiter sowohl von der Lichtquelle des Emphos abgetrennt, als auch der detektierende Teil des Lichtleiters komplett zugedeckt, so dass kein Umgebungslicht zum Empho gelangen konnte. Nun wurden mit einer Mittelungsrate entsprechend den nachfolgenden Messungsparametern Dunkelspektren gespeichert. Bei der Aufzeichnung der Hell-Kalibrierung wurde der wieder normal beleuchtete Lichtleiter mit seinem detektierenden Ende in 20 ml 2,5% Intralipid-Lösung gehalten, so dass diese komplett und gleichmäßig ausgeleuchtet wurde. Dies erwies sich als Referenz bei der Hell-Eichung für Lebermessungen. Analog zur Dunkel-Eichung wurden auch hier die Spektren aufgezeichnet und gespeichert. Hierbei wurde die Hochspannung des Photomultipiers so gewählt, dass das Hell-Spektrum der Intralipid-Lösung im oberen Drittel des Bildschirms lag. Auf diese Weise konnte eine aussagekräftige Darstellung der späteren Leberspektren gewährleistet werden. Die Hochspannung wurde während des Versuches nicht mehr verändert, um eine Vergleichbarkeit der Messungen zu erreichen. Eine Kalibrierung des Emphos wurde an jedem Versuchstag vor der ersten Messung auf immer gleiche Weise durchgeführt. (für weitere Einzelheiten, siehe Böhnert M et al, in Proceedings of SPIE, Supplement to Saratov Fall Meeting 2000, Optical Technologies in Biophysics and Medicine II. Hrsg. V. Tuchin 4241: 427-435; sowie 418-452) Around Reference values for to get the subsequent liver measurements became a calibration of the Emphos. Analogous to the procedures described above, a dark and a light curve recorded with the light guide. This was for the Dark calibration of the light guides from both the Emphos light source separated, as well as the detecting part of the light guide completely covered so that no ambient light could reach the Empho. Well with an averaging rate corresponding to the following Measurement parameters dark spectra stored. When recording The light calibration became the normally backlit light guide with its detecting end held in 20 ml 2.5% Intralipid solution, so that it was completely and evenly lit. This proved to be a reference in light calibration for liver measurements. Analogous to Dark calibration also here the spectra were recorded and stored. Here, the high voltage of the photomultiplier was chosen so that the bright spectrum of the intralipid solution in the upper third of the Screen was. In this way, a meaningful representation could later Guaranteed liver spectra become. The high voltage was during of the experiment no longer changed, to achieve comparability of the measurements. A calibration of the emphos was recorded on each test day before the first measurement always done the same way. (for further For details, see Böhnert M et al, in Proceedings of SPIE, Supplement to Saratov Case Meeting 2000, Optical Technologies in Biophysics and Medicine II. Ed. V. Tuchin 4241: 427-435; as well as 418-452)

Versuchsablaufexperimental procedure

Das Perfusat für die Leberperfusion wurde vor jedem Versuchstag von uns frisch zubereitet. Hierzu wurden die in Tabelle 1 angegebenen Mengen der Salze abgewogen und in 333,3ml Aqua destillata zur Lösung gebracht. Anschließend wurde die Lösung mit 500ml Haemofusin 10% (Baxter Deutschland GmbH) aufgefüllt. Bis zum Versuchsbeginn wurde das Perfusat im Kühlschrank bei 8°C. gelagert und kurz vor Benutzung wieder auf Raumtemperatur aufgewärmt. TABELLE 1

The perfusate for liver perfusion was freshly prepared by us before each test day. For this purpose, the amounts of the salts indicated in Table 1 were weighed and brought to solution in 333.3 ml of aqua destillata. The solution was then filled up with 500 ml Haemofusin 10% (Baxter Deutschland GmbH). Until the beginning of the experiment, the perfusate was refrigerated at 8 ° C. stored and warmed to room temperature shortly before use. TABLE 1

Bei den in dieser Studie durchgeführten Versuchen wurde zum einen reines Perfusat verwendet. Zum anderen wurde dem Perfusat vor Versuchsbeginn Erythrozyten beigemischt. Dabei handelte es sich um Schweineerythrozyten, die aus den Schlachthof direkt nach dem Schlachten abgeholt worden. Das Vollblut wurde in Röhrchen (Falcon) abgefüllt und in einer Zentrifuge 5 Minuten bei 2500 Umdrehungen zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgesaugt, mit physiologischer Kochsalzlösung aufgefüllt und vermischt. Das Waschen der Erythrozyten wurde 3 bis 4mal wiederholt und die Erythrozyten isoliert. Die Erythrozyten wurden bis Versuchsbeginn im Kühlschrank aufbewahrt und ca. 30 Minuten vor Einfüllen in das Perfusionssystem auf Zimmertemperatur gebracht. Im Kreislauf wurde das Perfusat-Erythrozyten-Gemisch weiter auf 37°C erwärmt.at performed in this study Try was used for a pure perfusate. On the other hand Erythrocytes were added to the perfusate prior to the start of the experiment. These were swine erythrocytes from the slaughterhouse picked up right after the slaughter. The whole blood was in tube (Falcon) bottled and centrifuged in a centrifuge for 5 minutes at 2500 revolutions. Subsequently was the supernatant filtered off with suction, filled up with physiological saline solution and mixed. The washing The erythrocytes were repeated 3 to 4 times and the erythrocytes isolated. The erythrocytes were in the refrigerator until the beginning of the experiment stored and placed on the perfusion system about 30 minutes before loading Room temperature brought. In the circulation the perfusate-erythrocyte mixture was continue to 37 ° C heated.

Bei Versuchen ohne wesentlichen Perfusionsstopp und Ischämiephase wurde die Leber unmittelbar nach ihrer Entnahme in den Kreislauf eingehängt (s.o.), dessen Perfusat schon mit 95% O₂, 5% CO₂ gesättigt war.In experiments without substantial perfusion stop and ischemia phase, the liver was mounted in the circulation immediately after its removal (see above), the perfusate of which was already saturated with 95% O ₂ , 5% CO ₂ .

Bei Versuchen mit Perfusionsstopp wurde von der Leber zwei kleine Läppchen ligiert und abgetrennt. Ein Läppchen wurde sofort nach der OP ohne Reperfusion mit dem Empho gemessen. Das andere wurde zusammen mit der Restleber in ca. 50ml Tutofusin^® AZ (Pfrimmer & Co, Pharmazeutische Werke Erlangen GmbH) derart eingelegt, dass beide komplett mit Flüssigkeit bedeckt waren. Der Perfusionsstopp dauerte je nach Versuch 1 h, 3h 30min oder 6h. Das Glas mit der Leber wurde entweder bei Zimmertemperatur (22°C.) bzw. bei 0°C. auf Eis in einer Kühlbox gelagert.In experiments with perfusion stop, two small lobules were ligated from the liver and separated. A patch was measured immediately after surgery with no reperfusion with the Empho. The other is inserted so that both were completely covered with liquid along with the rest of the liver in about 50ml Tutofusin ^® AZ (Primmer & Co, pharmaceutical plants Erlangen GmbH). The perfusion stop lasted 1 h, 3h 30min or 6h, depending on the experiment. The glass with the liver was either at room temperature (22 ° C.) Or at 0 ° C. stored on ice in a cool box.

15 Minuten vor Ablauf der geplanten Perfusionsstopps wurde zunächst nur das kleine abgetrennte Läppchen entnommen und ohne Reperfusion mit dem Empho gerastert. Die Restleber wurde nach Perfusionsstopp sofort an den Versuchskreislauf angeschlossen (analog den Versuchen ohne Perfusionsstopp) und in O₂-Sättigung perfundiert. Bei den Versuchen mit Hämoglobin (Hb) war das Perfusat von Beginn an mit gewaschenen Erythrozyten (s.o.) im Verhältnis von 10:1 (entspricht einem Hämatokrit von 0,1) vermengt.15 minutes before the expiration of the planned perfusion stops, only the small separated lobule was removed and rasterized with the emphos without reperfusion. The residual liver was immediately after perfusion stop connected to the experimental circuit (analogous to the experiments without perfusion stop) and perfused in O ₂ saturation. In the experiments with hemoglobin (Hb) the perfusate was mixed from the beginning with washed erythrocytes (see above) in the ratio of 10: 1 (corresponds to a hematocrit of 0.1).

Asservierung von Perfusatasservation from perfusate

Die Versuche waren bezüglich des Perfusionsstopps auf eine Zeitdauer von 3,5 Stunden standardisiert. Es gab folgende Varianten: Kalte Ischämie versus warme; hämoglobinfreies Perfusat versus Perfusat mit Hämoglobin; Versuche mit Relaxin (RLX) im Perfusat versus ohne. Das Perfusat, in dem MDA und die oxidative Kapazität bestimmt wurden, wurde nach einem standardisierten Abnahmeschema in 1,5 ml Eppendorfgefäße gefüllt. Im Anschluss wurden die eingefroren Abnahmezeitpunkte waren nach dem Freispülen der Leber, unmittelbar nach der Explantation, vor der Ischämiezeit, danach ab dem ersten Tropfen der Reperfusion und dann nach 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 30 Minuten, sowie nach 1, 3 und 6 Stunden. In den hier beschriebenen steht RLX für Relaxin und, sofern nichts anders angegeben, jeweils für eine Relaxinkonzentration von 300 μg pro Liter Perfusionslösung bzw. Spül- und Konservierungslösung.The Attempts were regarding standardized perfusion stop to a period of 3.5 hours. There were the following variants: cold ischemia versus warm; free hemoglobin Perfusate versus perfusate with hemoglobin; Experiments with relaxin (RLX) in the perfusate versus without. The perfusate, in which MDA and oxidative capacity were determined was after a standardized collection scheme in 1.5 ml Eppendorf tubes filled. in the Following the frozen take-off dates were after the connection flushing the liver, immediately after explantation, before ischemia, then from the first drop of reperfusion and then to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 30 minutes, and after 1, 3 and 6 hours. As used herein, RLX stands for relaxin and, if nothing else stated differently, each for a relaxin concentration of 300 μg per liter of perfusion solution or Rinsing and Preservation solution.

Messung der oxidativen Belastungmeasurement of oxidative stress

Bei 14 Ratten wurden die Lebern freipräpariert und in die Gefäße die Kanülen für die Perfusionslösung eingeführt. Die Lebern wurden mit verschiedenen Konzen trationen Relaxin in der Perfusionslösung gespült und einer warmen oder einer kalten Ischämie unterworfen. Von der austretenden Perfusatlösung wurde zu verschiedenen Zeitpunkten Proben genommen und die oxidative Belastung über den MDA-Gehalt sowie die oxidative Kapazität über die Menge der enthaltenen oxidierten Substanzen gemessen. In einem weiteren Versuch wurde Gewebsschnitte spektrometrisch auf ihre Sauerstoffversorgung untersucht. Die Ergebnisse zum oxidativen Stress der Rattenlebern sind in 1 und 2 graphisch dargestellt. Die Figuren zeigen, dass der oxidative Stress (der MDA-Spiegel im Perfusat) bei warmer Ischämie wesentlich höher ist als bei kalter Ischämie und dass der Zusatz von Relaxin in der Perfusionslösung in der frühen Reperfusionsphase vorteilhaft ist. 1 zeigt, dass Relaxin in der Perfusionslösung mit einer deutlich geringeren oxidativen Belastung in der initialen Phase nach der warmen Ischämie einherging. 2 bestätigt, dass auch bei der kalten Ischämie eine Wirkung für das Relaxin zu verzeichnen war. Die initialen MDA-Spiegel waren bei der Zusatz von Relaxin in der Perfusionslösung deutlich niedriger. Wird die sogenannte oxidative Kapazität (der MDO-Spiegel im Perfusat) bestimmt, dann ist festzustellen, dass Relaxin in der Perfusionslösung bei der warmen und vor allem bei der kalten Ischämie die oxidative Kapazität deutlich erniedrigt; siehe 3 und 4. Dies bedeutet, dass der Zusatz von Relaxin in der Perfusionslösung bei der warmen und der kalten Ischämie die oxidative Belastung des Organs durchgehend verringert.In 14 rats, the livers were dissected free and the tubes for the perfusion solution were introduced into the vessels. The livers were rinsed with various relaxin concentrations in the perfusion solution and subjected to warm or cold ischemia. The exiting perfusate solution was sampled at various times and the oxidative load was measured for MDA content and oxidative capacity by the amount of oxidized substances contained. In another experiment, tissue sections were examined spectrometrically for their oxygen supply. The results on the oxidative stress of rat livers are in 1 and 2 shown graphically. The figures show that the oxidative stress (the MDA level in the perfusate) is much higher in warm ischemia than in cold ischemia and that the addition of relaxin in the perfusion solution in the early reperfusion phase is beneficial. 1 shows that relaxin in the perfusion solution was associated with a significantly lower oxidative load in the initial phase after warm ischaemia. 2 confirmed that there was also an effect on relaxin in cold ischemia. The initial MDA levels were significantly lower with the addition of relaxin in the perfusion solution. If the so-called oxidative capacity (the MDO level in the perfusate) is determined, it can be seen that relaxin in the perfusion solution significantly reduces the oxidative capacity in warm and, above all, in cold ischaemia; please refer 3 and 4 , This means that the addition of relaxin in the perfusion solution during warm and cold ischemia continuously reduces the oxidative stress of the organ.

Indirekte Messungen des Sauerstoffgehaltes mit dem Erlanger Mikrolichtleiter-Spektrophotometer (EMPHO)Indirect measurements of the Oxygen content with the Erlanger micro light guide spectrophotometer (EMPHO)

Mit dem Spektrophotometer wurde mittels Lichtstreuung bei Leberpräparaten die Größe der Leberzellen über die Zeit bestimmt. Die den folgenden Abbildungen zugrunde liegenden spektrophotometrischen Messungen wurden zu zwei Phasen der Versuche durchgeführt. Am Ende der Ischämie-Phase, noch vor der Reperfusion, und in der Phase der Reperfusion, das heißt, nach einer Stunde Reperfusion. Die Abbildungen beruhen auf Versuchen mit hämoglobinfrei bzw. Erythrozyten-frei perfundierter Lebern. Die Dauer der Ischämie betrug 3,5 Stunden bei 4°C. Zu erkennen ist in allen Abbildungen das wellige Relief der abgetasteten Leber. Der wellige Charakter basiert dabei auf den im Gewebe prinzipiell immer vorhanden lokalen Sauerstoffgradienten zwischen arteriellem und venösem Schenkel. Diese Wellenstruktur muss, verschieden ausgeprägt, deswegen immer vorhanden sein. Wesent lich für die Wirkung von Relaxin ist die Tatsache, dass dieses Wellenrelief auf verschiedenen Niveaus der Lichtintensität (LI) liegt.With The spectrophotometer was examined by light scattering in liver preparations the size of the liver cells over the Time determines. The underlying the following figures Spectrophotometric measurements became two phases of the experiments carried out. At the end of the ischemia phase, even before reperfusion, and in the reperfusion phase, the is called, after an hour of reperfusion. The pictures are based on experiments with hemoglobin free or erythrocyte-free perfused livers. The duration of ischemia was 3.5 hours at 4 ° C. You can see the wavy relief of the scanned in all pictures Liver. The wavy character is based on the principle in the tissue always present local oxygen gradients between arterial and venous Leg. This wave structure must be different, therefore always be there. Essential for the effect of relaxin is the fact that this wave relief at different levels the light intensity (LI) is located.

5 zeigt, dass am Ende der Ischämie-Phase die LI-Werte ohne Relaxin (um 19000) deutlich über den LI-Werten mit Relaxin (um 7000) in 7 liegen. Im Verlauf der Reperfusion zeigt sich dann eine ähnliche Entwicklung. Die LI-Werte ohne Relaxin fallen im Verlauf (um 16000 in 6) genau wie diejenigen in den Versuchen mit Relaxin (um 5000 in 8). Die Streueigenschaften des Gewebes für Licht hängen von der Größe der intrazellulären Zellorganellen ab. Diese Größe variiert physiologischer Weise in Abhängigkeit von der Sauerstoffversorgung (Wellenstruktur bei Sauerstoffgradient zwischen arteriellem und venösem Schenkel). Außerdem ändert sich die Größe der Zellorganellen auch bei Ischämie bedingtem, sauerstoffabhängigem Energiemangel (fehlendes ATP). Dies lässt die Zellorganellen anschwellen. 5 shows that at the end of the ischaemia phase the LI values without relaxin (around 19000) are well above the LI values with relaxin (around 7000) in 7 lie. In the course of reperfusion, a similar development then appears. The LI values without relaxin fall in the course (by 16000 in 6 ) just like those in the Relaxin experiments (around 5000 in 8th ). The scattering properties of the tissue for light depend on the size of the intracellular cell organelles. This size varies physiologically depending on the oxygen supply (wave structure in oxygen gradient between arterial and venous limb). In addition, the size of the cell organelles also changes in ischemia-related, oxygen-dependent energy deficiency (lack of ATP). This causes the cell organelles to swell.

Diese Überlegungen zugrunde legend, zeigt die 5 höhere LI-Werte (= mehr zurückgestreutes Licht) im Sinne größerer intrazellulärer Zellorganellen als 7. Dies bedeutet, dass Relaxin die Ischämie bedingte Schwellung reduziert. Im Verlauf der Reperfusion (6 und 8) scheint diese Schwellung bei Wiedereinsetzen des oxidativen Metabolismus im Sinne sinkender LI-Werte wieder zurückzugehen. Die Unterschiede zwischen warm und kalt sind existent, aber für diese Betrachtung nicht relevant. Wichtig ist aber, dass die abgetastete Gewebeoberfläche (die bunte Fläche) auf verschiedenen Niveaus liegen. Bei den Versuchen ohne Relaxin lagen stets initial hohe LI-Werte vor (> 10000 bis über 20000), die eher kleiner wurden, während bei den Versuchen mit Relaxin die initialen Werte < 10000 waren und eher zunahmen. Hohe anfängliche LI-Werte stehen für viel Sauerstoff und große anfängliche Oxidationszellschäden, niedrige LI-Werte für anfangs geringere oxidative Zellschäden.Underlying these considerations, shows the 5 higher LI values (= more backscattered light) in the sense of larger intracellular cell organelles than 7 , This means that relaxin reduces ischaemia-related swelling. In the course of reperfusion ( 6 and 8th ) this swelling seems to revert to re-onset of oxidative metabolism in terms of decreasing LI values. The differences between warm and cold exist, but are not relevant to this consideration. But it is important that the scanned tissue surface (the colored area) are at different levels. In the experiments without Relaxin always initially high LI values were present (> 10,000 to over 20,000), which were rather smaller, while in the experiments with relaxin the initial values were <10000 and rather increased. High initial LI values indicate high levels of oxygen and large initial oxidation cell damage, low LI values for initially lower oxidative cell damage.

Immunhisfochemische Untersuchungen von perfundierten RattenlebernImmunohisochemical studies of perfused rat livers

9 und 10 zeigen immunhistochemische Färbungen von Kontrollen und erfindungsgemäß perfundierten Rattenlebern. Die Färbungen erfolgten mit Siriusrot (zur Darstellung der Eosinophilen mit Durchmessern von 12-15 μm; Leberzellen 20-30 μm), mit DAPI für die Färbung der Zellkerne sowie mit Carbocyanin-gekoppelten Antikörpern gegen MPO. Die Untersuchungen bestätigen die protektive Wirkung von Relaxin. Alle Proben bis auf die Kontrollen zeigten das Bild einer aktivierten Leber, das heißt, die Makrophagen waren aktiv. Dadurch wurde das Bild der gleichmäßig großen Leberzellkerne gestört. Die Makrophagen (Kupfersche Sternzellen) waren auch mit MPO zu erkennen. Eine deutlich erhöhte Aktivität der induzierbaren NOS als Marker für oxidativen Stress fand sich (mit NADPH-d) nur bei Lebern ohne Relaxin in der Perfusionslösung. Dies zeigt, dass eine Perfusionslösung ohne Relaxin zu einer sehr viel höheren Stressbelastung führt. 9 (untere Reihe) zeigt eine deutlich Reduzierung des Zellschadens (Rot-Färbung) durch die Anwendung von Relaxin (links vs. Mitte und rechts). 10 bestätigt, dass der Einsatz von Relaxin nicht nur zur Reperfusionslösung, sondern auch zur Spül- und Konservierungslösung nach der Explantation wird den protektiven Effekt von Relaxin erheblich vergrößert (Mitte vs. rechts). 9 and 10 show immunohistochemical staining of controls and inventively perfused rat livers. The staining was done with Sirius red (to show the eosinophils with diameters of 12-15 microns, liver cells 20-30 microns), with DAPI for the staining of cell nuclei and with carbocyanine-coupled antibodies against MPO. The studies confirm the protective effect of relaxin. All but the controls showed the image of an activated liver, that is, the macrophages active. This disturbed the image of evenly sized liver cell nuclei. The macrophages (Kupfersche stellate cells) were also recognizable with MPO. Significantly increased activity of inducible NOS as a marker for oxidative stress was found (with NADPH-d) only in livers without relaxin in the perfusion solution. This shows that a perfusion solution without relaxin leads to a much higher stress load. 9 (bottom row) shows a significant reduction in cell damage (red staining) through the use of relaxin (left vs. center and right). 10 confirms that the use of relaxin not only as a reperfusion solution but also as a rinsing and preservative solution after explantation significantly increases the protective effect of relaxin (middle vs. right).

Claims

Perfusion and preservation solution for transplants, characterized in that the solution contains relaxin.

A perfusion and preservation solution according to claim 1, wherein relaxin is recombinant human relaxin.

Perfusion and preservation solution according to claim 1 or 2, characterized in that the relaxin in a concentration from 30 to 300 μg per L solution is present.

Perfusion and preservation solution after any previous one Claim, characterized in that the solution is based on a Collins solution, a Euro-Collins solution, a UW solution, Pike solution Bretschneider solution Belzer solution.

Perfusion and preservation solution after any previous one Claim, characterized in that it is designed for a the following organs: liver, kidney, heart, pancreas, liver.

Perfusion and preservation solution after any previous one Claim, characterized in that it cell damage in the organ after ischemia and / or reperfusion.

Perfusion and preservation solution after any previous one Claim, characterized in that it the expression of Surface antigens and the graft rejection fought.

Method for perfusing and preserving organs for the Transplantation, characterized in that an aqueous Preservation and perfusion Relaxin is added.