DE102005027796A1

DE102005027796A1 - Verfahren zum Auffinden eines Wirkstoffs, welcher ein Abtöten von Tumorzellen bei einer Tumorerkrankung eines Säugetiers oder Menschen ermöglicht

Info

Publication number: DE102005027796A1
Application number: DE200510027796
Authority: DE
Inventors: Georg Prof. Dr. Bauer; Kai Dr. Lamottke; Christian Dr. Haug
Original assignee: BICOLL GmbH
Current assignee: BICOLL GmbH
Priority date: 2005-06-15
Filing date: 2005-06-15
Publication date: 2006-12-21
Anticipated expiration: 2025-06-16
Also published as: DE102005027796B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden eines Wirkstoffs, welcher ein Abtöten von Tumorzellen durch Auslösen von Apoptose bei einer Tumorerkrankung eines Säugetiers oder Menschen ermöglicht.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Auffinden eines Wirkstoffs, welcher ein Abtöten von Tumorzellen durch Auslösen von Apoptose bei einer Tumorerkrankung eines Säugetiers oder Menschen ermöglicht. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines nach einem erfindungsgemäßen Verfahren aufgefundenen oder auffindbaren Wirkstoffs zur Herstellung eines Medikaments zum spezifischen Auslösen von Apoptose in Tumorzellen bei einer Tumorerkrankung in einem Säugetier oder Menschen.

Im Folgenden wird zwischen Tumorzellen und transformierten Zellen unterschieden. Transformierte Zellen sind Zellen, die in vitro durch die Expression spezifischer Onkogene, durch die Wirkung von chemischen oder physikalischen Karzinogenen oder spontan in einen transformierten Zustand übergangen sind und ein Potenzial zur Tumorbildung besitzen. Bei den transformierten Zellen ist die Hemmung der Proliferation durch Kontakt mit anderen Zellen aufgehoben. Darüber hinaus besitzen sie die Fähigkeit, auch ohne Anheftung an ein festes Substrat, Kolonien zu bilden. Tumorzellen sind dagegen Zellen eines Tumors oder Zellen die direkt oder indirekt aus einem Tumor stammen. Es kann sich dabei auch um Zellen einer aus einem Tumor etablierten Zelllinie handeln. Der Tumor kann nach Inokulation von in vitro transformierten Zellen entstanden sein. Die aus einem Tumor isolierten Zellen oder Zellen einer aus den isolierten Zellen etablierten ex-vivo-Tumorzelllinie werden hier auch als "ex-vivo-Tumorzellen" be zeichnet. Sowohl Tumorzellen als auch transformierte Zellen produzieren extrazelluläre Superoxidanionen.

Aus den Veröffentlichungen Ziff. 1 bis 7 der Literaturliste ist es bekannt, dass transformierte Hamsterzellen nach Inokulation in Mäuse Tumore erzeugen. Zellen von aus den Tumoren etablierten Zelllinien zeigten im Vergleich mit den zur Inokulation verwendeten transformierten Zellen eine wesentlich höhere Tumorigenität. Ein Zellextrakt aus diesen Zellen zeigte, dass die Tumorzellen in ihrem Inneren mehr Katalase enthielten, als die transformierten Ausgangszellen.

Aus Engelmann, I. und Bauer, G., Anticancer Research 20 (2000), Seiten 2297 bis 2306 ist es bekannt, dass mit TGF-β oder FGF stimulierte nicht transformierte Fibroblasten als Effektorzellen benachbarte transformierte Zellen durch interzelluläre Induktion von Apoptose vernichten können. Nicht transformierte Zellen bleiben dagegen unbeschadet. Beim Vergleich von ex-vivo-Tumorzellen mit Zellen aus in vitro transformierten Zelllinien zeigte sich, dass die ex-vivo-Tumorzellen eine erhöhte Resistenz gegenüber interzellulärer Induktion von Apoptose aufweisen. Diese Resistenz wird darauf zurückgeführt, dass die Tumorzellen mehr endogene Überlebensfaktoren produzieren als andere Zellen. Aus den von den transformierten Zellen freigesetzten Superoxidanionen kann spontan Wasserstoffperoxid entstehen. Effektorzellen setzen eine Peroxidase frei, welche die Synthese von hypochloriger Säure aus Wasserstoffperoxid und Chlorionen katalysiert. Die hypochlorige Säure reagiert mit Superoxidanionen im Bereich einer transformierten Zelle und bildet dort hochreaktive Hydroxylradikale. Weiterhin setzen Effektorzellen Stickstoffmonoxidradikale frei, die mit den Superoxidanionen zu hochreaktivem Peroxynitrit in unmittelbarer Nähe der transformier ten Zelle reagieren. Peroxynitrit und Hydroxylradikale induzieren die Apoptose der transformierten Zelle. In der Publikation werden verschiedene potenzielle Möglichkeiten von Tumorzellen erörtert, der Induktion der Apoptose zu entgehen. Beispielsweise könnte eine erhöhte intrazelluläre Glutathion-Konzentration der Apoptoseinduktion entgegenwirken. Die Erzeugung von Katalase durch transformierte Zellen würde zum Abbau von Wasserstoffperoxid führen und dadurch mit der Erzeugung hypochloriger Säure wechselwirken. Katalase könnte auch einer Inaktivierung von NO durch Wasserstoffperoxid entgegenwirken und dadurch zu einer Erhöhung der Peroxynitritkonzentration führen. Katalase könnte also einerseits durch eine verringerte Inaktivierung von NO zu einer gesteigerten Apoptoserate oder durch eine verringerte Erzeugung von hypochloriger Säure und damit von Apoptose auslösenden Hydroxylradikalen zu einer verringerten Apoptoserate führen. Weiterhin ist es bekannt, dass Wasserstoffperoxid mit NO-Radikalen zu Hydroxylradikalen reagiert. Bei der Reaktion werden einerseits die für die Peroxynitrit-Bildung erforderlichen NO-Radikale verbraucht, so dass weniger Apoptose auslösendes Peroxynitrit entstehen würde, andererseits entstehen jedoch möglicherweise Apoptose auslösende Hydroxylradikale.

Insgesamt ist nicht klar, ob die Wasserstoffperoxid abbauende Katalase oder deren Wasserstoffperoxid erzeugender Gegenspieler Superoxiddismutase einen Schutz vor interzellulärer Apoptoseinduktion bietet oder die Apoptoseinduktion fördert.

Aus Haberstroh, K. et al., International Journal of Oncology 21 (2002), Seiten 145 bis 151 ist es bekannt, dass von transformierten Zielzellen stammende reaktive Sauerstoffspezies (ROS) einen inhibitorischen Effekt auf NO-vermittelte Apoptose haben. Der inhibitorische Effekt kann durch Katalase auf gehoben und durch die Erzeugung von Wasserstoffperoxid mittels Glukoseoxidase verstärkt werden. Die Wirkung der Katalase führt also zu einer gesteigerten Apoptoserate.

Aus Cicchetti, R. und Argentin, G., Mutagenesis (2003), Band 18 (2), Seiten 127 bis 132 ist es bekannt, dass die Genotoxizität der Pestizide Phosphamidon und Dieldrin Schäden an DNA durch Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies und damit durch oxidativen Stress verursachen. Bei mit Kulturen primärer Maus-Lungenfibroblasten durchgeführten Versuchen wurde 3-Aminotriazol und Mercaptosuccinat als Inhibitoren von Katalase bzw. Glutathionperoxidase der Kultur zugesetzt. Dabei wurde festgestellt, dass Katalase eine Verminderung der Schäden durch Phosphamidon verursacht. Die Ergebnisse lassen keine Rückschlüsse auf die Wirkung zellulärer Effektoren zu.

Aus Ferret, P. J. et al., BMC Immunology (2002), Band 3 (1), Seite 3 ist es bekannt, dass Makrophagen nach Stimulation durch Zytokine Effektormoleküle erzeugen, welche Mikroorganismen aber auch die Makrophagen selbst zerstören können. In Versuchen wurden Zellen der murinen Makrophagen-Leukämiezelllinie RAW 264.7 in vitro mit Lipopolysacharid (LPS) und/oder Interferon-gamma (IFN-gamma) stimuliert. Dadurch wurde endogene NO-Produktion induziert. Ein Teil der aktivierten Makrophagen konnte sich selbst vor Zerstörung schützen. Diese Makrophagen haben einen Phänotyp angenommen, welcher sogar dann überlebt, wenn eine Apoptose induzierende Dosis des NO-Donors DETA-NO zugesetzt wird. Diese Zellen weisen einen erhöhten Pegel an Superoxiddismutase (SOD), Katalase und Glutathion auf. Die Stimulation der RAW 264.7 Zellen mit LPS und/oder IFN-gamma in Gegenwart von spezifischen Inhibitoren von SOD, Aminotriazol als Katalaseinhibitor und Buthioninsulfoximin (BSO) als Glutathioninhibitor zeigte, dass dadurch das Ent stehen des resistenten Phänotyps verhindert werden konnte. Die Autoren schlussfolgern, dass es einen direkten kausalen Zusammenhang zwischen dem Überleben eines Teils von Makrophagen und einer Hochregulation eines autoprotektiven intrazellulären Redox-Puffer-Systems gibt, welcher gleichzeitig mit der Modulation der Expression von apoptotischen Molekülen der Bc12-Bc1-XL/Bax-Bad-Familie stattfindet. Die Autoren gehen davon aus, dass das in RAW 264. 7-Zellen beobachtete Phänomen ein allgemeines Phänomen bei Makrophagen ist.

Aus Hanada, H. et al., Free Radical Biology & Medicine (1997), Band 23 (2), Seiten 294 bis 301 ist es bekannt, dass in den Zellen des sich durch Apoptose auflösenden Kaulquappenschwanzes die Aktivität von SOD erhöht ist, während gleichzeitig die Aktivität von Katalase verringert ist. Der apoptotische Prozess wurde durch Zusatz von Wasserstoffperoxid und Aminotriazol als Katalaseinhibitor zum Kulturmedium deutlich verstärkt. Die Autoren schlussfolgern, dass apoptotischer Zelltod im Kaulquappenschwanz zumindest teilweise durch einen Mechanismus ausgelöst werden könnte, der von aktiven Sauerstoffspezies abhängig ist. Rückschlüsse auf die Verhältnisse in Säugerzellen können daraus nicht gezogen werden.

Aus Hermann, C. et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology (1997), Band 17 (12), Seiten 3588 bis 3592 ist es bekannt, dass Scherstress bei humanen Endothelzellen durch oxidativen Stress induzierte Apoptose hemmt. Diese Hemmung der Apoptose konnte teilweise verhindert werden durch Hemmung von Glutathionbiosynthese mittels BSO oder Stickoxidsynthase mittels NG-Monomethyl-L-Argenin, während die Hemmung von Katalase durch Aminotriazol keinen Einfluss auf die hemmende Wirkung von Scherstress hatte.

Aus Higuchi, Y. et al., Jpn. J. Cancer Res. 82 (8) (1991), Seiten 942 bis 949 ist es bekannt, dass Glukoseoxidase zur Bildung von Wasserstoffperoxid führt. In Mäusen verhindert die Verabreichung von Glukoseoxidase das Tumorwachstum. Die Wirkung von Glukoseoxidase wurde durch die kombinierte Verabreichung mit Katalase-Inhibitoren, wie 3-Aminotriazol, Hydroxylamin und Natriumazid oder dem Glutathionsynthetaseinhibitor Buthionin-(S,R)-Sulfoximin in vivo verstärkt.

Aus der US 6,359,004 B1 ist es bekannt, einen selektiven Inhibitor für das Produkt eines antinitrosativen Stressgens zu verabreichen, um in einem Säugetier das Wachstum von pathologisch proliferierenden Säugetierzellen zu hemmen. Unter einem antinitrosativen Stressgen wird ein Gen verstanden, das für ein Produkt kodiert, welches nitrosierende Spezies abbaut oder vernichtet, nitrosativ inhibierte biologische Moleküle denitrosiert, um ihre Funktion wieder herzustellen oder andere Produkte oder Stoffwechselwege hoch reguliert, welche schützend gegenüber nitrosativem Stress sind. Bei dem Inhibitor kann es sich beispielsweise um Aminotriazol handeln, welches Katalase inhibiert und durch spezielle Maßnahmen spezifisch gemacht worden ist. Katalase setzt als Nebenreaktion NO₂ ^– zu NO₃ ^– um. Da NO₂ ^– nach Aktivierung durch H₂O₂ ein viel strengeres nitrosierendes Agens als NO₃ ^– ist, führt die Inhibierung der Katalase zur Anwesenheit eines stärker nitrosierenden Agens. Zur Hemmung des Wachstums von pathologisch proliferierenden Krebszellen ist Aminotriazol durch Quervernetzung mit einem gegen ein Epitop einer Krebszelle gerichteten Antikörper selektiv gemacht worden. Zur Hemmung der Proliferation von pathologisch proliferierenden Zellen, welche eine Restenose verursachen, ist Aminotriazol durch Bindung an das Polymer eines Polymerstents oder durch Einbau in einen porö sen Polymerstent selektiv gemacht worden. Nachteilig ist dabei, dass es zur Bereitstellung der Sensitivität stets vorgesehen ist, den Wirkstoff an ein Hilfsmittel zu binden. Weiterhin ist es nachteilig, dass der Wirkstoff lediglich zur Hemmung des Wachstums von pathologisch proliferierenden Säugetierzellen und nicht zu deren Vernichtung vorgesehen ist.

Transformierte Zellen und Tumorzellen zeichnen sich durch extrazelluläre Superoxidanionenproduktion aus. Die extrazellulär vorhandenen Superoxidanionen beeinflussen die Wirkung von Effektoren auf diese Zellen. Diese Effektoren können von den Tumorzellen selbst oder von anderen Zellen in der Umgebung der Tumorzellen, den so genannten Effektorzellen, freigesetzt werden. Der Effektor kann auch von außen zugesetzt werden und ein normalerweise von Zellen sezernierter Effektor, ein Analogon dieses Effektors oder ein diesen Effektor oder dessen Analogon erzeugender Stoff, insbesondere ein NO-Donor, sein. Zur Apoptose führende Signalwege sind zur Verdeutlichung in 1 dargestellt. Von Effektorzellen oder Tumorzellen kann Peroxidase ("P") und/oder Stickstoffmonoxid ("∙NO") als Effektor freigesetzt werden. Die Superoxidanionen beeinflussen die folgenden vier für Tumorzellen und transformierte Zellen spezifischen Signalwege:

1. Wasserstoffperoxid entsteht durch spontane Dismutation aus Superoxidanionen. Eine von Effektorzellen freigesetzte Peroxidase synthetisiert aus dem Wasserstoffperoxid und Chloridionen HOCl, welches dann mit den Superoxidanionen interagiert. Dabei werden Apoptose induzierende Hydroxylradikale gebildet (1, Reaktion 1, HOCl/Hydroxylradikalsignalweg). Die Superoxidanionen werden nur von transformierten Zellen und Tumorzellen generiert und weisen wegen ihrer kurzen Halbwertszeit nur eine sehr begrenzte Diffusionsreichweite auf. Die Bildung von Hydroxylradikalen erfolgt deshalb nur in unmittelbarer Nähe dieser Zellen. Die Auslösung der Apoptose auf diesem Weg ist daher selektiv für transformierte Zellen.
2. Von Effektorzellen oder den transformierten Zellen oder den Tumorzellen freigesetztes NO interagiert mit den Superoxidanionen der transformierten Zellen und bildet Apoptose auslösendes Peroxynitrit (1, Reaktion 2, NO/Peroxynitritweg).
3. Das als spontanes Oxidationsprodukt von NO gebildete Nitrit interagiert mit HOCl und bildet Apoptose auslösendes Nitrylchlorid (1, Reaktion 3).
4. In einer Eisen-katalysierten Fenton-Reaktion entstehen Hydroxylradikale, welche in transformierten Zellen Apoptose auslösen können, wenn deren Glutathionspiegel erniedrigt ist (1, Reaktion 4).

Tumorzellen zeichnen sich gegenüber transformierten Zellen dadurch aus, dass die Auslösung von Apoptose mittels Effektoren gehemmt ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren anzugeben, mit welchem ein Wirkstoff aufgefunden werden kann, welcher ein, insbesondere spezifisches, Abtöten von Tumorzellen durch Auslösen von Apoptose mittels eines Effektors bei einer Tumorerkrankung eines Säugetiers oder Menschen ermöglicht. Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung eines mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgefundenen oder auffindbaren Wirkstoffs anzugeben.

Die Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 2, 11, 14 und 20 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 3 bis 10, 12, 13, 15 bis 19 und 21 bis 24.

Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zum Auffinden eines Wirkstoffs vorgesehen, welcher ein, insbesondere spezifisches, Abtöten von Tumorzellen durch Auslösen von Apoptose mittels eines Effektors bei einer Tumorerkrankung eines Säugetiers oder Menschen ermöglicht, mit folgenden Schritten:

a1) Bereitstellen mehrerer Versuchsansätze durch Aussaat von Tumorzellen in je ein Kulturgefäß mit Zellkulturmedium, wobei die Tumorzellen oder zusätzlich ausgesäte Effektorzellen, welche potenziell Apoptose auslösende zelluläre Effektoren freisetzen, jeweils in einer Zelldichte ausgesät werden, die geeignet ist, bei Zusatz eines auf das Äußere der Tumorzellen wirkenden Katalaseinhibitors und Inkubation der Versuchsansätze unter für die Kultivierung der Tumorzellen oder der Tumorzellen und Effektorzellen geeigneten Bedingungen, zu Apoptose der Tumorzellen zu führen,
b1) Zugabe mindestens je eines potenziellen Wirkstoffs zu jeweils einem der Versuchsansätze, wobei mindestens ein Versuchsansatz verbleibt, zu dem kein potenzieller Wirkstoff zugesetzt wird,
c1) Inkubation der Versuchsansätze unter für die Kultivierung der Tumorzellen geeigneten Bedingungen und
d1) Ermitteln des Versuchsansatzes/der Versuchsansätze, in welchem/welchen der Anteil apoptotischer Tumorzellen höher ist als in dem Versuchsansatz, in welchem kein potenzieller

Wirkstoff enthalten ist, und damit des/der in dem Versuchsansatz/den Versuchsansätzen mit dem höheren Anteil apoptotischer Tumorzellen enthaltenen Wirkstoffs/Wirkstoffe.

Weiterhin ist erfindungsgemäß ein Verfahren zum Auffinden eines Wirkstoffs vorgesehen, welcher ein, insbesondere spezifisches, Abtöten von Tumorzellen durch Auslösen von Apoptose mittels eines Effektors bei einer Tumorerkrankung eines Säugetiers oder Menschen ermöglicht, mit folgenden Schritten:

a2) Bereitstellen mehrerer Versuchsansätze durch Aussaat von Tumorzellen in je ein Kulturgefäß mit Zellkulturmedium und Zusatz je eines Effektors in einer definierten Konzentration, wobei der Effektor ein Effektor ist, welcher in der definierten Konzentration in diesen Tumorzellen dann Apoptose auslöst, wenn die Wirkung der extrazellulär wirkenden Katalase der Tumorzellen inhibiert wird,
b2) Zugabe mindestens je eines potenziellen Wirkstoffs zu jeweils einem der Versuchsansätze, wobei mindestens ein Versuchsansatz verbleibt, zu dem kein potenzieller Wirkstoff zugesetzt wird,
c2) Inkubation der Versuchsansätze unter für die Kultivierung der Tumorzellen geeigneten Bedingungen und
d2) Ermitteln des Versuchsansatzes/der Versuchsansätze, in welchem/welchen der Anteil apoptotischer Tumorzellen höher ist als in dem Versuchsansatz, in welchem kein potenzieller Wirkstoff enthalten ist, und damit des/der in dem Versuchsansatz/den Versuchsansätzen mit dem höheren Anteil apoptotischer Tumorzellen enthaltenen Wirkstoffs/Wirkstoffe.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zu Grunde, dass die spezifische Eigenschaft von Tumorzellen, resistent gegenüber der Auslösung von Apoptose durch die oben beschriebenen Signalwege zu sein, durch Wirkstoffe aufgehoben werden kann. Ist die Resistenz aufgehoben, können die von Tumorzellen selbst oder von benachbarten Zellen sezernierten Effektoren in den Tumorzellen die Auslösung einer Apoptose und damit ein spezifisches Abtöten von Tumorzellen bewirken. Dies kann letztendlich zum Auflösen des Tumors führen.

Weiterhin liegt der Erfindung die Erkenntnis zu Grunde, dass Tumorzellen und transformierte Zellen selbst eine Effektorfunktion aufweisen können, beispielsweise indem sie NO oder Peroxidase freisetzen. Dadurch können unter geeigneten Versuchsbedingungen und in einem Tumor die Tumorzellen durch Auslösen von Apoptose durch Effektoren zerstört werden. Die Effektoren können dabei sowohl von nicht transformierten Zellen, wie Fibroblasten oder Makrophagen, als auch von den Tumorzellen selbst freigesetzt werden.

Transformierte Zellen erweisen sich regelmäßig als sensitiv für interzelluläre oder autokrine Apoptoseinduktion, während sich Tumorzellen stets resistent gegenüber beiden Formen der Apoptoseinduktion zeigen. Als autokrin wird die Apoptoseinduktion bezeichnet, wenn die gleichen oder dieselben Zellen wie die, bei denen Apoptose ausgelöst wird, die Apoptose auslösenden Effektoren freisetzen. Diese Resistenz wird während der Tumorentstehung in einem Organismus erworben. Die Tumorentstehung geht offensichtlich mit einer Selektion von Zellen einher, die gegen die oben genannten zur Apoptoseauslösung führenden Signalwege resistent sind.

Weiterhin liegt der Erfindung die Erkenntnis zu Grunde, dass der Resistenz der Tumorzellen die in 2 veranschaulichten Blockaden der oben dargestellten Signalwege Nr. 1 bis 4 zu Grunde liegen. Die Tumorzellen weisen an ihrer Membranaußenseite Katalasemoleküle ("CAT") auf, welche die oben genannten Signalwege Nr. 1 bis 4 unterbrechen können. Da Wasserstoffperoxid essenziell für den HOCl-Weg, die Eisen-katalysierte Fenton-Reaktion und den Nitrylchloridweg ist, führt die Zerstörung des Wasserstoffperoxids durch die Katalase zu einem Zusammenbruch dieser drei Signalwege. Die Erfinder haben erkannt, dass auch Peroxynitrit von der Katalase als Substrat akzeptiert und abgebaut wird und dadurch den NO/Peroxynitritweg unterbricht. Die Erfinder haben erkannt, dass die Expression membranständiger Katalase als einzige phänotypische Veränderung von Tumorzellen genügt, um die Resistenz gegenüber den Effektoren zu bewirken. Die Erfinder haben weiterhin erkannt, dass durch Hemmung der Aktivität dieser Katalase die Sensitivität der Zellen gegenüber den Effektoren wiederhergestellt werden kann.

Der Erfindung liegt die allgemeine erfinderische Idee zu Grunde, dass Tumorzellen eine extrazellulär wirkende Katalase aufweisen und die Tumorzellen durch die Hemmung von deren Wirkung sensitiv gegenüber von Tumorzellen oder Effektorzellen freigesetzten oder von außen zugegebenen Apoptose auslösenden Effektoren werden. Dadurch lassen sich bei Hemmung der Wirkung der Katalase Bedingungen ermitteln, unter denen die Tumorzellen sensitiv gegenüber den Effektoren sind. Unter diesen Bedingungen lassen sich dann Wirkstoffe finden, welche die Resistenz der Tumorzellen gegenüber diesen Effektoren vermindern oder aufheben.

Durch Zusatz eines auf das Äußere der Zellen wirkenden Katalaseinhibitors ist es möglich, für Schritt lit. a1) durch Routineexperimente die Zelldichte zu bestimmen, bei welcher die Effektorzellen oder die Tumorzellen selbst eine für die Auslösung von Apoptose in den Tumorzellen bei Hemmung der Katalaseaktivität ausreichende Menge an Effektor sezernieren. Für Schritt lit. a2) kann durch Routineexperimente bei Hemmung der Wirkung der extrazellulär wirkenden Katalase der Tumorzellen ein zur Auslösung von Apoptose in den Tumorzellen geeigneter Effektor und eine dazu geeignete definierte Konzentration des Effektors ausgewählt werden. Die Katalase der Tumorzellen kann beispielsweise dadurch inhibiert werden, dass 3-Aminotriazol (3-AT) als Katalaseinhibitor zugesetzt wird. Nach Bestimmung der Bedingungen für die Versuchsansätze kann dann ein Wirkstoff ermittelt werden, welcher wie der Katalaseinhibitor die Auslösung von Apoptose in den Tumorzellen durch die zellulären Effektoren ermöglicht. Der aufgefundene Wirkstoff kann entweder ebenfalls die Wirkung der extrazellulär wirkenden Katalase der Tumorzellen hemmen oder auf andere Weise die Signalwege der Zelle so beeinflussen, dass die Effektoren die Auslösung von Apoptose bewirken.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem in Schritt lit. a2) zugesetzten Effektor um Peroxynitrit (PON). Beim Schritt lit. d1) oder d2) ist in dem Versuchsansatz/den Versuchsansätzen mit dem höheren Anteil apoptotischer Tumorzellen die Zahl der apoptotischen Tumorzellen vorzugsweise größer als die Zahl der nicht apoptotischen Tumorzellen. Dadurch können hochwirksame Wirkstoffe ermittelt werden.

Bevorzugt werden die Tumorzellen zwischen den Schritten lit. a1) und lit. b1) oder lit. a2) und lit. b2) solange inkubiert, bis sie adhärieren und/oder beginnen, sich zu vermeh ren. Dadurch wird die Zuverlässigkeit des Verfahrens erhöht, weil keine Zellen nur deshalb in Apoptose gehen, weil sie vor Zugabe des Wirkstoffs nicht vollständig adhäriert sind und durch den Wirkstoff am Adhärieren gehindert werden.

Als besonders günstig hat es sich erwiesen, wenn die Tumorzellen in einer Dichte zwischen 10 000 und 30 000 Zellen, insbesondere zwischen 20 000 und 27 000 Zellen, vorzugsweise zwischen 24 000 und 26 000 Zellen pro 0,75 cm² und/oder pro 200 μl Medium ausgesät werden. In dieser Dichte sind viele Tumorzellen in der Lage, eine ausreichende Menge zellulärer Effektoren freizusetzen, um damit autokrin Apoptose auszulösen, wenn ein geeigneter Wirkstoff zugesetzt wird.

Vorzugsweise sind die Tumorzellen solche Tumorzellen, deren spontane Apoptoserate kleiner als 5%, insbesondere kleiner als 2%, vorzugsweise kleiner als 1%, ist. Die niedrige spontane Apoptoserate ermöglicht eine sehr sensitive Detektion von weniger wirksamen Wirkstoffen, die jedoch dennoch, z. B. wegen ihrer einfachen Herstellbarkeit, von großem Interesse sein können. Als besonders günstig hat es sich erwiesen, wenn die Tumorzellen Zellen der murinen Fibrosarkomzelllinie L929 (Nummer bei der DSMZ – Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, 38124 Braunschweig, Deutschland (DSMZ): ACC 2) sind. Diese Zellen weisen eine besonders niedrige spontane Apoptoserate auf.

Weiter steigern lässt sich die Sensitivität des Verfahrens, wenn den Versuchsansätzen vor oder während des Schritts lit. c1) oder lit. c2) ein Wachstumsfaktor, vorzugsweise TGF-β, insbesondere TGF-β-1, zugesetzt wird. Dadurch lässt sich die durch einen Wirkstoff auslösbare Apoptoserate weiter steigern.

Bei den Tumorzellen sollte es sich um solche Tumorzellen handeln, bei denen Apoptose durch zelluläre Effektoren nur ausgelöst werden kann, wenn die Aktivität einer extrazellulären wirkenden Katalase dieser Zellen gehemmt wird.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem Katalaseinhibitor um 3-Aminotriazol (3-AT).

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Auffinden eines Wirkstoffs, welcher ein, insbesondere spezifisches, Abtöten von Tumorzellen durch Auslösen von Apoptose mittels eines Effektors bei einer Tumorerkrankung eines Säugetiers oder Menschen ermöglicht mit folgenden Schritten:

a3) Bereitstellen mehrerer Versuchsansätze mit je einer Katalase und einem Substrat der Katalase sowie eines Nachweissystems für die Aktivität der Katalase,
b3) Zugabe mindestens je eines potenziellen Wirkstoffs zu jeweils einem der Versuchsansätze, wobei mindestens ein Versuchsansatz verbleibt, zu dem kein potenzieller Wirkstoff zugesetzt wird,
c3) Inkubation der Versuchsansätze und Bestimmung der Aktivität der Katalase in den Versuchsansätzen und
d3) Ermitteln des Versuchsansatzes/der Versuchsansätze, in welchem/welchen die Aktivität der Katalase im Vergleich zu dem Versuchsansatz, in dem kein potenzieller Wirkstoff enthalten ist, gehemmt worden ist und damit des/der in dem Versuchsansatz/den Versuchsansätzen mit der gehemmten Aktivität der Katalase eingesetzten Wirkstoffs/Wirkstoffe.

Dieses Verfahren weist den Vorteil auf, dass dazu keine Zellkultur betrieben werden muss. Da durch Hemmung der Wirkung einer Katalase der Tumorzellen eine Sensitivierung der Tumorzellen gegenüber zellulären Effektoren erreichbar ist, kann durch Identifizierung eines Inhibitors der Katalase ein Wirkstoff aufgefunden werden, der ein spezifisches Abtöten von Tumorzellen durch Auslösen von Apoptose ermöglicht. Die Versuchsansätze gemäß lit. a3 können beispielsweise mittels eines kommerziell erhältlichen Kits ("Cayman Catalase Assay Kit", Katalog-Nr. 707002, Cayman Chemical Company, 1180 E. Ellsworth Road, Ann Arbor, MI 48108, USA) bereitgestellt werden. Bei der in den Versuchsansätzen gemäß lit. a3) enthaltenen Katalase kann es sich um eine Katalase handeln, welche mit der extrazellulär wirkenden Katalase der Tumorzellen, zumindest im aktiven Zentrum der Katalase, identisch oder nahezu identisch ist.

Um Wirkstoffe von den nach den bisher beschriebenen Verfahren aufgefundenen Wirkstoffen auszusondern, welche nicht spezifisch für Tumorzellen sind, können die folgenden weiteren Schritte durchgeführt werden:

e) Bereitstellen weiterer Versuchsansätze durch Aussaat nicht transformierter Zellen eines Säugetiers oder eines Menschen in je ein Kulturgefäß mit Zellkulturmedium,
f) Zugabe des/der bei Schritt lit. d1), d2) oder d3) ermittelten Wirkstoffs/Wirkstoffe zu jeweils einem der Versuchsansätze, wobei mindestens ein Versuchsansatz verbleibt, zu dem kein Wirkstoff zugesetzt worden ist,
g) Inkubation der Versuchsansätze unter den für die Kultivierung der Zellen geeigneten Bedingungen und
h) Ermitteln des Versuchsansatzes/der Versuchsansätze, in welchem/welchen der Anteil apoptotischer Zellen höher ist als in dem Versuchsansatz, in dem kein Wirkstoff enthalten ist, und damit des/der in dem Versuchsansatz/den Versuchsansätzen mit dem höheren Anteil apoptotischer Zellen enthaltenen Wirkstoffs/Wirkstoffe.

Als nicht transformierte, d. h. normale, Zellen können, vorzugsweise aus einer Primärkultur gewonnene, diploide Fibroblasten, insbesondere Hautfibroblasten, verwendet werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens aufgefundenen oder auffindbaren Wirkstoffs zur Herstellung eines Medikaments zum spezifischen Auslösen von Apoptose in Tumorzellen bei einer Tumorerkrankung in einem Säugetier oder Menschen. Vorzugsweise enthält das Medikament keine Glukoseoxidase. Der Wirkstoff ist bevorzugt nicht Aminotriazol und/oder kein eine Substratumsetzung durch eine Katalase verringernder Stoff.

Bevorzugt ist der Wirkstoff ein aus Pflanzen gewonnener oder aus Pflanzen gewinnbarer Stoff oder Extrakt. Der Wirkstoff ist vorzugsweise ein lipophiler Pflanzenextrakt oder eine Fraktion einer chromatografischen Trennung eines, insbesondere lipophilen, Pflanzenextrakts. Die chromatografische Trennung kann eine mittels Umkehrphasenchromatografie erfolgte Trennung sein.

Die Erfindung betrifft weiterhin einen Wirkstoff, welcher mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens aufgefunden worden ist oder auffindbar ist, wobei der Wirkstoff nicht Aminotriazol ist. Der Wirkstoff eignet sich insbesondere zur Verwendung als Medikament.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:

1 eine Übersicht über die durch zelluläre Effektoren vermittelten Signalwege in einer transformierten Zelle,

2 eine Übersicht über die Mechanismen, mit welchen sich Tumorzellen gegen die Wirksamkeit zellulärer Effektoren schützen,

3a, b den prozentualen Anteil apoptotischer Tumorzellen der Zelllinie L929 bei Zusatz von 3-AT und TGF-β in Abhängigkeit von der Zeit,

4 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der Tumorzellline L929 bei Zusatz von 3-AT und TGF-β in Abhängigkeit von der Zelldichte,

5 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der Tumorzelllinie L929 nach Zusatz aufeinanderfolgender Fraktionen einer chromatografischen Trennung eines Pflanzenextrakts,

6a, b mikroskopische Aufnahmen einer Kultur der humanen Ovarialkarzinomzelllinie BG-1 nach Färbung durch den DNA-bindenden Farbstoff Bisbenzimid,

7a, b mikroskopische Aufnahmen der Tumorzelllinie SIHA und der humanen Fibroblastenzelllinie Alpha-1 nach Zugabe einer Fraktion der chromatografischen Trennung des Pflanzenextrakts und Färbung der Zellkerne mit Bisbenzimid und

8 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der humanen Neuroblastomzelllinie CHP-134 nach Inkubation in Gegenwart verschiedener Zusätze.

Die dargestellten Experimente wurden mit folgenden Zellen bzw. Zellen der folgenden Zelllinien durchgeführt:

L929: murine Fibrosarkomzelllinie; Nummer bei der DSMZ: ACC 2.
SIHA: humane Zervixkarzinomzelllinie; Nummer bei der American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA: ATCC HTB-35.
BG-1: humane Ovarialkarzinomzelllinie, beschrieben bei Stopper, H., Schmitt, E., Gregor, C., Mueller, S. O., Fischer, W., Mutagenesis (2003), Band 18, Seiten 243 bis 247.
CHP-134: humane Neuroblastomzelllinie; beschrieben in Fulda, S., Honer, M., Menke-Moellers, I. und Berthold, F., European Journal of Cancer (1995), Band 314, Seiten 616 bis 621.
Humane Fibroblastenzellline Alpha-1: Die Zelllinie wurde nach Standardverfahren wie folgt aus der Vorhaut eines gesunden Kinds etabliert: Stücke der Vorhaut wurden mit Eagle's Minimal Essential Medium (Eagle's MEM) gewaschen, mechanisch zerkleinert und über Nacht mit Kollagenase (1 mg/ml) verdaut.

Anschließend wurden die Zellen durch Pipettieren vereinzelt und durch Zentrifugation abgesondert. Die Zellen wurden daraufhin in Eagle's MEM aufgenommen und in Zellkulturflaschen überführt. Nach erfolgter Proliferation wurden die Zellen abgelöst, auf Einfriergefäße verteilt, tiefgefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Zur Durchführung der hier beschriebenen Versuche wurden die Zellen aufgetaut und nach Standardverfahren in Zellkulturmedium kultiviert.
Alle im Folgenden dargestellten Experimente wurden in Eagle's MEM mit 5% fötalem Kälberserum (FKS) als Zellkulturmedium durchgeführt. Das Zellkulturmedium enthielt 40 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 10 μg/ml Neomycin und 10 U/ml Nystatin (Reg.-Nr. 48453, ICN Pharmaceuticals, Bolongarostr. 82-84, 65929 Frankfurt, Deutschland). Die Kultur der Zellen erfolgte jeweils im gleichen Zellkulturmedium in 48-Loch-Platten. Eagle's MEM (Katalog-Nr. T031-50) und FKS (Katalog-Nr. S0115) sind von der Firma Biochrom AG, Leonorenstr. 2-6, 12247 Berlin, Deutschland bezogen worden. Die Konzentrationsangaben bezeichnen jeweils die Endkonzentration im jeweiligen Versuchsansatz. Bei den Versuchen sind die folgenden Zusätze jeweils in den angegebenen Endkonzentrationen eingesetzt worden, sofern nichts anderes angegeben ist:

3-AT: 25 mmol/l
TGF-β-1 ("TGF-BETA" oder "TGF"): 20 ng/ml

Der NO-Synthetasehemmer 3-Bromo-7-Nitroindazol (3-Br-7-NI) (Katalog-Nr. CNN-252) wurde von der Firma Biomol GmbH, Waidmann-Str. 35, 22769 Hamburg bezogen.
3-AT (Katalog-Nr. A8056) und Superoxiddismutase (SOD) (Katalog-Nr. 52515) wurde von der Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Eschenstr. 5, 82024 Taufkirchen, Deutschland bezogen. TGF-β-1 wurde gemäß Strauss, S. C. et al., Int. J. Oncol. (1995), Band 7, Seiten 565 bis 572 aus einem Extrakt humaner Thrombozyten gereinigt. Die Bestimmung des prozentualen Anteils apoptotischer Zellen erfolgte mittels eines Durchlicht-Phasenkontrastmikroskops nach den bekannten Apoptosekriterien Membranblebbing, Kernkondensation und Kernfragmentation.
3a und 3b zeigen das Ergebnis eines Versuchs zur autokrinen Apoptoseinduktion in Zellen der murinen Fibrosarkomzelllinie L929 in Gegenwart des Katalaseinhibitors 3-AT. Es wurden jeweils 25 000 L929-Zellen pro Versuchsansatz in ein Loch einer 48-Loch-Platte (Bodenfläche: 0,75 cm²) in je 200 μm Zellkulturmedium ausgesät. Nach dem Anwachsen der Zellen wurde jeweils 3-AT in den angegebenen Konzentrationen zugesetzt. Bei den in 3b dargestellten Versuchen ist gleichzeitig mit 3-AT jeweils auch TGF-β-1 zugesetzt worden. Bei den mit "Kontrolle" und "TGF-Beta" gekennzeichneten Versuchsreihen ist kein 3-AT zugesetzt worden. Der Anteil apoptotischer Zellen ist in Abhängigkeit von der Zeit nach Zusatz von 3-AT bestimmt worden. 3a und 3b zeigen, dass die Induktion der Apoptose in den hier eingesetzten Tumorzellen von der Konzentration an 3-AT abhängig ist und durch TGF-β-1 zusätzlich gesteigert wird. Der Versuch erlaubt es, die geeignete Inkubationszeit und Konzentration eines Katalaseinhibitors zu bestimmen, um für Schritt lit. a1) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine geeignete Zelldichte zu bestimmen.
4 zeigt das Ergebnis der Auslösung vom Apoptose in L929-Zellen in Gegenwart von TGF-β-1 und 3-AT. Für den Versuch wurden dieselben Bedingungen wie bei den in 3a und 3b dargestellten Versuchen gewählt, wobei die Zellen jedoch in unterschiedlicher Dichte ausgesät worden sind und TGF-β-1 in einer Konzentration von 20 ng/ml eingesetzt worden ist. In 4 gibt die Abszisse die Zahl der Zellen pro Ansatz zu Beginn des Experiments wieder. Die Kontrollen enthielten weder 3-AT noch TGF-β oder nur TGF-β. Die Zahl der apoptotischen Zellen wurde jeweils 30,5 und 49,4 Stunden nach Zusatz von 3-AT bestimmt. Der Versuch zeigt die Abhängigkeit der autokrinen Apoptoseauslösung von der Zelldichte. Der Versuch ermöglicht die Bestimmung der gemäß dem Schritt lit. a1) des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehenen geeigneten Zelldichte.
Für die im Folgenden dargestellten Versuche wurden wie folgt gewonnene Lösungen von Fraktionen eines Pflanzenextrakts eingesetzt:
Getrocknetes Pflanzenmaterial wurde mit Dichlormethan und anschließend mit Essigsäureethylester durch Kochen am Rückfluss extrahiert. Die entstandenen Extrakte wurden filtriert, vereint und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Der so gewonnene lipophile Extrakt wurde in 2 ml eines Acetonitril-Wasser-Gemischs gelöst. Die Fraktionen wurden durch präparative Umkehrphasenchromatografie mittels einer mit C18 Säulenmaterial gefüllten Chromatografiesäule gewonnen. Dazu wurden an das Säulenmaterial gebundene Stoffe aus dem Extrakt mittels eines aus Lösungsmittel A (95% Wasser, 5% Acetonitril) und Lösungsmittel B (100% Acetonitril) bestehenden Gradientensystems eluiert. Es wurden 96 aufeinander folgend eluierte Fraktionen mit einem Volumen von je 12 ml gesammelt. Das in den Fraktionen enthaltene Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft. Die Fraktionen wurden bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. 150 μg jeder Fraktion wurden in 200 μl eines Gemisches aus Wasser, Ethanol und Dimethylsulfoxid gelöst.
Bei dem Versuch zu dem in 5 dargestellten Versuchsergebnis wurden jeweils 25 000 L929-Zellen in 48-Loch-Platten in 200 μl Zellkulturmedium ausgesät. Zu den Zellen wurden jeweils 20 ng/ml TGF-β-1 und jeweils 2 μl einer Lösung einer der aufeinander folgend eluierten Fraktionen einer chromatografischen Trennung eines ersten Pflanzenextrakts zugesetzt. Zur Bereitstellung einer Positivkontrolle war zu Fraktion Nr. 1 3-AT zugesetzt worden, so dass im Zellkulturmedium, dem diese Fraktion zugesetzt worden war, eine Endkonzentration von 25 mmol/l 3-AT erreicht wurde. Nach 48 Stunden wurde der Prozentsatz apoptotischer Zellen bestimmt. Das Ergebnis zeigt, dass beispielsweise die Fraktionen 13 und 17 ein Abtöten von Tumorzellen durch autokrines Auslösen von Apoptose ermöglichen.
6a und 6b zeigen fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen je einer Kultur von Zellen der humanen Ovarialkarzinomzelllinie BG-1. Die Zellen wurden wie in 3 für L929-Zellen beschrieben, in einer Dichte von 25 000 Zellen pro Ansatz ausgesät. Nach dem Anwachsen der Zellen wurden bei dem in 6b dargestellten Ansatz 2 μl einer Lösung einer Fraktion 59 einer chromatografischen Trennung eines zweiten Pflanzenextrakts zugesetzt. Nach 48 Stunden Inkubation wurden die Zellen mit dem DNA-bindenden Farbstoff Bisbenzimid in einer Konzentration von 1 μg/ml gefärbt und fluoreszenzmikroskopisch bei einer Anregungswellenlänge von 340 bis 380 nm untersucht. Der Vergleich der 6a und 6b zeigt, dass Fraktion 59 in der Lage ist, in den untersuchten Ovarialkarzinomzellen eine autokrine Auslösung von Apoptose zu ermöglichen. Die in dem in 5 dargestellten Versuch eingesetzten Lösungen der Fraktionen 13 und 17 der chromatografischen Trennung des ersten Pflanzenextrakts lieferten dasselbe Ergebnis, wenn sie in dem hier dargestellten Versuch statt der Lösung der Fraktion 59 eingesetzt wurden. Auch die Fraktionen 13 und 17 ermöglichen in den untersuchten Ovarialkarzinomzellen eine autokrine Auslösung von Apoptose.
7a zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von Zellen der Tumorzelllinie SIHA und 7b eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von Zellen der humamen Fibroblastenzelllinie Alpha-1. Zellen beider Zelllinien wurden, wie in der Beschreibung zu 3 dargestellt, in einer Dichte von 25 000 Zellen pro Vertiefung einer 48-Loch-Platte ausgesät. Zu beiden Versuchsansätzen sind jeweils 2 μl der in dem in 5 dargestellten Versuch eingesetzten Lösung der Fraktion 13 der chromatografischen Trennung des ersten Pflanzenextrakts zugesetzt worden. Nach 48 Stunden Inkubation wurden die Zellen mit 1 μg/ml Bisbenzimid gefärbt und fluoreszenzmikroskopisch bei einer Anregungswellenlänge von 340 bis 380 nm untersucht.
In 7a ist zu sehen, dass in den eingesetzten Tumorzellen durch Zusatz der Fraktion 13 autokrin Apoptose ausgelöst worden ist, während dies bei den in 7b dargestellten Fibroblasten nicht der Fall war. Das Ergebnis zeigt, dass Fraktion 13 spezifisch auf Tumorzellen, nicht jedoch auf normale Zellen wirkt. Das parallele Testen auf Tumorzellen und Fibroblasten oder sonstigen nicht transformierten Zellen erlaubt eine schnelle Identifikation von selektiv auf Tumorzellen wirkenden Substanzen.
Bei dem Versuch zu dem in 8 dargestellten Versuchsergebnis sind je 12 500 Zellen der humanen Neuroblastomzelllinie CHP-134 in eine Vertiefung einer 48-Loch-Platte in 400 μl Zellkulturmedium ausgesät worden. Die Ansätze enthielten jeweils 2 μl der in dem in 5 dargestellten Versuch eingesetzten Lösungen der Fraktionen 13 ("fr. 6/13-8") und 17 ("fr. 6/17-5"), und teilweise zusätzlich 150 U/ml SOD, 10 μmol/l 3-Br-7-NI, 25 μmol/l des Caspase-9-Inhibitors Z-LEHD-FMK der Firma R&D Systems GmbH, 65205 Wiesbaden, Borsigstr. 7, Deutschland, Katalog-Nr. FMK008 ("CASP9 INH") und 12,5 μmol/l des p53-Inhibitors Pifithrin der Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Eschenstr. 5, 82024 Taufkirchen, Deutschland, Katalog-Nr. P4359 ("PIF"). Kontrollansätze enthielten keine Zusätze bzw. 50 mmol/l 3-AT. Nach 48 Stunden Inkubation wurde der Anteil apoptotischer Zellen bestimmt. Das Ergebnis zeigt, dass die Fraktionen 13 und 17 in der Lage sind, eine autokrine Apoptoseinduktion der eingesetzten Tumorzellen zu ermöglichen. Dabei spielen extrazelluläre Superoxidanionen und von den Zellen gebildetes NO eine zentrale Rolle. Die Rolle der Superoxidanionen ergibt sich aus der die Apoptoserate senkenden Wirkung von SOD, welches Superoxidanionen zu Wasserstoffperoxid umsetzt. Dadurch stehen Superoxidanionen nicht mehr zur Verfügung, um mit NO zu Peroxynitrit zu reagieren. Die Rolle von NO ergibt sich aus der die Apoptoserate senkenden Wirkung des 3-Br-7-NI, welches die Synthese von NO hemmt. Da sowohl 3-Br-7-NI als auch SOD jeweils zu einer Verringerung der durch die Fraktionen 13 und 17 erhöhten Apoptoserate geführt haben, ist offensichtlich, dass die Auslösung der Apoptose über den NO/Peroxynitritweg erfolgt. Die Verringerung der Apoptoserate durch den Caspase-9-Inhibitor zeigt, dass intrazellulär Caspase-9 an der Apoptoseauslösung beteiligt ist, während p53 keine Rolle zu spielen scheint, weil Pifithrin keine Wirkung zeigt. Die Wirkung des Caspase-9-Inhibitors bestätigt, dass es sich bei den mikroskopisch ermittelten apoptotischen Zellen tatsächlich um apoptotische Zellen handelt.
Literaturliste:

1) Deichman GI und Vendrow EL, Int. J. Cancer 37, 401-409, 1986
2) Deichman GI, Kluchareva TE, Matveeva VA, Kushlinsky NE, Bassalyk LS und Vendrow EL, Int. J. Cancer 44, 904-907, 1989
3) Deichman GI, Mateeva VA, Kaskina LM, Dyakova NA, Uvarova EN, Nikiforov MA und Gudkov AV, Int. J. Cancer 75, 277-283, 1998
4) Deichman GI, Dyakova N, Kashkina L, Matveeva V, und Uvarova E, Immunology Letters 70, 37-42, 1999
5) Deichmann GI, Kashkina LM, Mizenina OA, Gorojanskaya EG, Nififorov MA, Gudkov AV, Dyakova NA, Komelkov AV, Priluskaya MO, Kushlinsky NE und Tatosyan AG, Int. J. Cancer 66, 747-752, 1996
6) Deichmann GI, Kashleva HA, Kluchareva TE and Matveeva VA, Int. J. Cancer 44, 908-910, 1989.
7) Deichmann GI, Seminars in Cancer Biology 431, 1-10, 2002

Claims

Verfahren zum Auffinden eines Wirkstoffs, welcher ein Abtöten von Tumorzellen durch Auslösen von Apoptose mittels eines Effektors bei einer Tumorerkrankung eines Säugetiers oder Menschen ermöglicht, mit folgenden Schritten: a1) Bereitstellen mehrerer Versuchsansätze durch Aussaat von Tumorzellen in je ein Kulturgefäß mit Zellkulturmedium, wobei die Tumorzellen oder zusätzlich ausgesäte Effektorzellen, welche potenziell Apoptose auslösende zelluläre Effektoren freisetzen, jeweils in einer Zelldichte ausgesät werden, die geeignet ist, bei Zusatz eines auf das Äußere der Tumorzellen wirkenden Katalaseinhibitors und Inkubation der Versuchsansätze unter für die Kultivierung der Tumorzellen oder der Tumorzellen und Effektorzellen geeigneten Bedingungen, zu Apoptose der Tumorzellen zu führen, b1) Zugabe mindestens je eines potenziellen Wirkstoffs zu jeweils einem der Versuchsansätze, wobei mindestens ein Versuchsansatz verbleibt, zu dem kein potenzieller Wirkstoff zugesetzt wird, c1) Inkubation der Versuchsansätze unter für die Kultivierung der Tumorzellen geeigneten Bedingungen und d1) Ermitteln des Versuchsansatzes/der Versuchsansätze, in welchem/welchen der Anteil apoptotischer Tumorzellen höher ist als in dem Versuchsansatz, in welchem kein potenzieller Wirkstoff enthalten ist, und damit des/der in dem Versuchsansatz/den Versuchsansätzen mit dem höheren Anteil apoptotischer Tumorzellen enthaltenen Wirkstoffs/Wirkstoffe.
Verfahren zum Auffinden eines Wirkstoffs, welcher ein Abtöten von Tumorzellen durch Auslösen von Apoptose mittels eines Effektors bei einer Tumorerkrankung eines Säugetiers oder Menschen ermöglicht, mit folgenden Schritten: a2) Bereitstellen mehrerer Versuchsansätze durch Aussaat von Tumorzellen in je ein Kulturgefäß mit Zellkulturmedium und Zusatz je eines Effektors in einer definierten Konzentration, wobei der Effektor ein Effektor ist, welcher in der definierten Konzentration in diesen Tumorzellen dann Apoptose auslöst, wenn die Wirkung der extrazellulär wirkenden Katalase der Tumorzellen inhibiert wird, b2) Zugabe mindestens je eines potenziellen Wirkstoffs zu jeweils einem der Versuchsansätze, wobei mindestens ein Versuchsansatz verbleibt, zu dem kein potenzieller Wirkstoff zugesetzt wird, c2) Inkubation der Versuchsansätze unter für die Kultivierung der Tumorzellen geeigneten Bedingungen und d2) Ermitteln des Versuchsansatzes/der Versuchsansätze, in welchem/welchen der Anteil apoptotischer Tumorzellen höher ist als in dem Versuchsansatz, in welchem kein potenzieller Wirkstoff enthalten ist, und damit des/der in dem Versuchsansatz/den Versuchsansätzen mit dem höheren Anteil apoptotischer Tumorzellen enthaltenen Wirkstoffs/Wirkstoffe.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Effektor Peroxynitrit (PON) ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei beim Schritt lit. d1) oder d2) in dem Versuchsansatz/den Ver suchsansätzen mit dem höheren Anteil apoptotischer Tumorzellen die Zahl der apoptotischen Tumorzellen größer ist als die Zahl der nicht apoptotischen Tumorzellen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Tumorzellen zwischen den Schritten lit. a1) und lit. b1) oder lit. a2) und lit. b2) solange inkubiert werden, bis sie adhärieren und/oder beginnen, sich zu vermehren.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Tumorzellen in einer Dichte zwischen 10 000 und 30 000 Zellen, insbesondere zwischen 20 000 und 27 000 Zellen, vorzugsweise zwischen 24 000 und 26 000 Zellen pro 0,75 cm² und/oder pro 200 μl Medium ausgesät werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Tumorzellen solche Tumorzellen sind, deren spontane Apoptoserate kleiner als 5%, insbesondere kleiner als 2%, vorzugsweise kleiner als 1%, ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Tumorzellen Zellen der murinen Fibrosarkomzelllinie L929 sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei den Versuchsansätzen vor oder während des Schritts lit. c1) oder lit. c2) ein Wachstumsfaktor, vorzugsweise TGF-β, insbesondere TGF-β-1, zugesetzt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Katalaseinhibitor 3-Aminotriazol ist.
Verfahren zum Auffinden eines Wirkstoffs, welcher ein Abtöten von Tumorzellen durch Auslösen von Apoptose mittels eines Effektors bei einer Tumorerkrankung eines Säugetiers oder Menschen ermöglicht, mit folgenden Schritten: a3) Bereitstellen mehrerer Versuchsansätze mit je einer Katalase und einem Substrat der Katalase sowie eines Nachweissystems für die Aktivität der Katalase, b3) Zugabe mindestens je eines potenziellen Wirkstoffs zu jeweils einem der Versuchsansätze, wobei mindestens ein Versuchsansatz verbleibt, zu dem kein potenzieller Wirkstoff zugesetzt wird, c3) Inkubation der Versuchsansätze und Bestimmung der Aktivität der Katalase in den Versuchsansätzen und d3) Ermitteln des Versuchsansatzes/der Versuchsansätze, in welchem/welchen die Aktivität der Katalase im Vergleich zu dem Versuchsansatz, in dem kein potenzieller Wirkstoff enthalten ist, gehemmt worden ist und damit des/der in dem Versuchsansatz/den Versuchsansätzen mit der gehemmten Aktivität der Katalase eingesetzten Wirkstoffs/Wirkstoffe.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zum Ermitteln des Wirkstoffs/der Wirkstoffe, welcher/welche nicht spezifisch für Tumorzellen ist/sind, die folgenden weiteren Schritte durchgeführt werden: e) Bereitstellen weiterer Versuchsansätze durch Aussaat nicht transformierter Zellen eines Säugetiers oder eines Menschen in je ein Kulturgefäß mit Zellkulturmedium, f) Zugabe des/der bei Schritt lit. d1), d2) oder d3) ermittelten Wirkstoffs/Wirkstoffe zu jeweils einem der Versuchsansätze, wobei mindestens ein Versuchsansatz verbleibt, zu dem kein Wirkstoff zugesetzt worden ist, g) Inkubation der Versuchsansätze unter den für die Kultivierung der Zellen geeigneten Bedingungen und h) Ermitteln des Versuchsansatzes/der Versuchsansätze, in welchem/welchen der Anteil apoptotischer Zellen höher ist als in dem Versuchsansatz, in dem kein Wirkstoff enthalten ist, und damit des/der in dem Versuchsansatz/den Versuchsansätzen mit dem höheren Anteil apoptotischer Zellen enthaltenen Wirkstoffs/Wirkstoffe.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei die nicht transformierten Zellen diploide Fibroblasten, insbesondere Hautfibroblasten, sind.
Verwendung eines mittels eines Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche aufgefundenen oder auffindbaren Wirkstoffs zur Herstellung eines Medikaments zum spezifischen Auslösen von Apoptose in Tumorzellen bei einer Tumorerkrankung in einem Säugetier oder Menschen.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Medikament keine Glukoseoxidase enthält und/oder der Wirkstoff nicht Aminotriazol ist.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei der Wirkstoff kein eine Substratumsetzung durch eine Katalase verringernder Stoff ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei der Wirkstoff ein aus Pflanzen gewonnener oder aus Pflanzen gewinnbarer Stoff oder Extrakt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei der Wirkstoff ein lipophiler Pflanzenextrakt oder eine Fraktion einer chromatografischen Trennung eines, insbesondere lipophilen, Pflanzenextrakts ist.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die chromatografische Trennung eine mittels Umkehrphasenchromatografie erfolgte Trennung ist.
Wirkstoff, welcher mittels eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 aufgefunden worden ist oder auffindbar ist, wobei der Wirkstoff nicht Aminotriazol ist.
Wirkstoff nach Anspruch 20, wobei der Wirkstoff kein eine Substratumsetzung durch eine Katalase verringernder Stoff ist.
Wirkstoff nach Anspruch 20 oder 21, wobei der Wirkstoff ein aus Pflanzen gewonnener oder aus Pflanzen gewinnbarer Stoff oder Extrakt ist.
Wirkstoff nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei der Wirkstoff ein lipophiler Pflanzenextrakt oder eine Fraktion einer chromatografischen Trennung eines, insbesondere lipophilen, Pflanzenextrakts ist.
Wirkstoff nach Anspruch 23, wobei die chromatografische Trennung eine mittels Umkehrphasenchromatografie erfolgte Trennung ist.