DE102005027556A1 - New Raf kinase inhibitor peptide useful in the preparation of medicament for the treatment of tumor - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verbindungen, die in der Lage sind die Bindung von Ras, insbesondere onkogenem Ras, an seine Effektoren zu inhibieren und dadurch den Ras-Signalweg zu blockieren. Diese Verbindungen sind zur Behandlung von Tumorerkrankungen von Nutzen, die auf mutierte, onkogene Formen des Ras-Proteins zurückzuführen sind.The The present invention relates to compounds disclosed in U.S.P. Location are the binding of Ras, in particular oncogenic Ras, to his To inhibit effectors and thereby block the Ras signaling pathway. These compounds are used to treat tumors of Benefits derived from mutated, oncogenic forms of Ras protein.
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verbindungen, die in der Lage sind die Bindung von Ras, insbesondere onkogenem Ras, an seine Effektoren zu inhibieren und dadurch den Ras-Signalweg zu blockieren. Diese Verbindungen sind zur Behandlung von Tumorerkrankungen von Nutzen, die auf mutierte, onkogene Formen des Ras-Proteins zurückzuführen sind.The The present invention relates to compounds disclosed in U.S.P. Location are the binding of Ras, in particular oncogenic Ras, to his To inhibit effectors and thereby block the Ras signaling pathway. These connections are useful for treating tumors that have mutated, Oncogenic forms of the Ras protein are due.
Das Ras-Protein ist Mitglied einer Superfamilie von GTP-bindenden Proteinen, die als Ras-Superfamilie bezeichnet wird. Die Mitglieder dieser Proteinsuperfamilie besitzen ein Molekulargewicht von 20–25 kDa und werden deswegen auch als kleine regulatorische GTPasen bezeichnet. Alle besitzen die Fähigkeit Guaninnukleotide zu binden und bis auf wenige Ausnahmen GTP zu GDP zu hydrolysieren. Diese enzymatische Aktivität bedingt ihre Rolle als molekulare Schalter, die zwischen einem Guanosintriphosphat-gebundenen aktiven Zustand und einem Guanosindiphosphat-gebundenen inaktiven Zustand zirkulieren. Nur in ihrem aktiven GTP-gebundenen Zustand sind die Ras-Proteine in der Lage, mit einer weiteren Klasse von Proteinen, den sogenannten Effektorproteinen zu interagieren und dadurch ein Signal intrazellulär weiterzuleiten. Die Funktion macht sie zu Schlüsselproteinen in einer intrazellulären Signalkaskade, die insbesondere die Zellproliferation kontrolliert. Aufgrund ihrer zentralen Rolle in der intrazellulären Signaltransduktion werden die Ras-Proteine durch zwei weitere Klassen von Proteinen reguliert. Das sind zum einen die GTPase aktivierenden Proteine (GTPase activating proteins, GAP), die die intrinsische GTP-Hydrolyse bis zu 106-fach beschleunigen und dadurch das Ras-Protein inaktivieren und zum anderen die Guaninnukleotidaustauschfaktoren (guanine nucleotide exchange factor, GEF), die die sehr langsame Dissoziation des GDP um mehrere Größenordnungen beschleunigen. Sie ermöglichen dadurch den Austausch des gebundenen GDP gegen das in der Zelle in etwa 50fach höherer Konzentration vorliegende GTP, wodurch das Ras-Protein aktiviert wird. Die Proteine der Ras-Superfamilie lassen sich weiter in verschiedene Proteinfamilien unterteilen, u.a. Rho-, Ran- und Ras-Proteine. Die Ras-Proteine lassen sich wiederum in Subfamilien unterteilen, z.B. die Rap-Proteine und die Ras-Proteine. Die Subfamilie der Ras-Proteine besteht aus H-Ras, N-Ras und K-Ras, die sich an ihrem C-terminalen Ende unterscheiden. Alle drei Proteine werden in der Zelle farnesyliert, H-Ras und N-Ras auch palmytoyliert, und sind über diese Lipidreste in der Zellmembran verankert. Dort werden sie als Reaktion auf die Aktivierung von Rezeptorkinasen und die folgende Membranrekrutierung von Adaptorproteinen und Ras-GEFs, z.B. Sos, aktiviert und können mit ihren Effektoren wechselwirken. Es gibt eine ganze Reihe von verschiedenen Ras-Effektoren, von besonderer Bedeutung sind aber die MAP(Mitogen activating protein)-Kinasekinasekinasen (MAPKKK), die über MAP-Kinasekinasen (MAPKK) und MAP-Kinasen (MAPK) die Zellteilung kontrollieren. Eine der bekanntesten MAP-Kinasekinasekinasen und Ras-Effektoren ist die Raf-Kinase, die durch die Bindung an aktiviertes Ras ihrerseits aktiviert wird und daraufhin die Signalkaskade fortsetzt, indem sie MAPKKs phosphoryliert. Diese phosphorylieren und aktivieren wiederum MAP-Kinasen, die dann in den Zellkern transportiert werden und dort verschiedene Transkriptionsfaktoren aktivieren.The Ras protein is a member of a superfamily of GTP-binding proteins called the Ras superfamily. The members of this protein superfamily have a molecular weight of 20-25 kDa and are therefore also referred to as small regulatory GTPases. All have the ability to bind guanine nucleotides and, with few exceptions, to hydrolyze GTP to GDP. This enzymatic activity dictates their role as molecular switches circulating between a guanosine triphosphate-bound active state and a guanosine diphosphate-linked inactive state. Only in their active GTP-bound state are the Ras proteins able to interact with another class of proteins, the so-called effector proteins, thereby relaying a signal intracellularly. The function makes them key proteins in an intracellular signaling cascade that specifically controls cell proliferation. Because of their central role in intracellular signal transduction, Ras proteins are regulated by two more classes of proteins. These include the GTPase-activating proteins (GAP), which accelerate intrinsic GTP hydrolysis by up to 10 6 -fold, thereby inactivating the Ras protein and, on the other hand, the guanine nucleotide exchange factor (GEF), which accelerate the very slow dissociation of GDP by several orders of magnitude. They thereby allow the exchange of the bound GDP against the GTP present in the cell in approximately 50 times higher concentration, whereby the Ras protein is activated. The proteins of the Ras superfamily can be further subdivided into different protein families, including Rho, Ran and Ras proteins. The Ras proteins can in turn be subdivided into subfamilies, eg the rap proteins and the ras proteins. The subfamily of Ras proteins consists of H-Ras, N-Ras and K-Ras, which differ at their C-terminal end. All three proteins are farnesylated in the cell, H-Ras and N-Ras also palmytoylated, and are anchored in the cell membrane via these lipid residues. There they are activated in response to the activation of receptor kinases and the subsequent membrane recruitment of adapter proteins and Ras-GEFs, eg Sos, and can interact with their effectors. There are a number of different Ras effectors, but of particular importance are the MAP (mitogen activating protein) kinase kinase kinases (MAPKKK), which control cell division via MAP kinase kinases (MAPKK) and MAP kinases (MAPK). One of the most well known MAP kinase kinase kinases and Ras effectors is the Raf kinase, which in turn is activated by binding to activated Ras and then continues the signaling cascade by phosphorylating MAPKKs. These in turn phosphorylate and activate MAP kinases, which are then transported to the nucleus and activate various transcription factors.
Der Ansatz der Signaltransduktionstherapie (STT) zielt auf Tumoren, die durch Mutationen von Proteinen der Signaltransduktion von der Zelloberfläche zum Zellkern entstehen. Im Fokus steht die Signalkette, die an verschiedenen Stellen des Körpers durch Zellteilung neue Zellen bereitstellt. Onkogene Mutationen treten in einzelnen Zellen auf und werden an die Tochterzellen vererbt, so dass sie sich ausbreiten. Die Wirkung der onkogenen Mutationen besteht in der permanenten Aufrechterhaltung des Signals zur Zellteilung, was eine ungeregelte Vermehrung der Zellen zur Folge hat.Of the Approach of signal transduction therapy (STT) targets tumors, caused by mutations of proteins of signal transduction of the cell surface to form the nucleus. The focus is on the signal chain, which at different Spots of the body Cell division provides new cells. Oncogenic mutations occur in individual cells and are inherited to the daughter cells, so that they spread out. The effect of oncogenic mutations consists in the permanent maintenance of the signal for cell division, which results in an unregulated multiplication of the cells.
Schon der Name des Ras-Proteins, der sich von einem Rattensarkom (rat sarcoma) ableitet, deutet auf die Beteiligung dieser Proteine an der Entstehung von Tumoren hin. Aufgrund der Schlüsselposition der Ras-Proteine in der Signaltransduktion der Zelle, haben einige Mutationen in diesen Proteinen grundlegende Auswirkungen auf die Zellteilung und die Ras-Proteine sind daher sogenannte Proto-Onkogene. Hierbei sind insbesondere die onkogenen Mutationen des Ras-Proteins zu nennen, die zu dessen konstitutiver Aktivierung führen und bei über 30% aller gefundenen Tumore eine Rolle spielen. Als besonders bedeutend haben sich hierbei die Mutationen an den Positionen Gly12, Gly13 und Q61 herausgestellt, die die Hydrolyse des gebundenen GTP weitgehend verhindern, so dass Ras konstitutiv aktiviert wird und damit das Signal für die Zellteilung ungeregelt aufrecht erhalten bleibt.Nice the name of the Ras protein derived from a rat sarcoma (rat sarcoma), indicates the involvement of these proteins the development of tumors. Because of the key position the Ras proteins in the signal transduction of the cell, have some Mutations in these proteins have a fundamental impact on the protein Cell division and the Ras proteins are therefore so-called proto-oncogenes. in this connection In particular, the oncogenic mutations of the Ras protein should be mentioned, which lead to its constitutive activation and over 30% of all tumors involved play a role. To be particularly significant Here are the mutations at the positions Gly12, Gly13 and Q61 the hydrolysis of the bound GTP is largely revealed prevent so that Ras is constitutively activated and thus the Signal for the cell division is maintained unregulated.
Aufgrund der Bedeutung des Ras-Proteins bei der Entstehung und Progression von Tumoren, ist es ein Ziel bestehender Bemühungen, eine Substanz oder eine Verbindung zu entwickeln, die in der Lage ist selektiv onkogenes Ras zu inhibieren. Zur Verwirklichung dieses Ziels wurden und werden verschiedene Ansätze diskutiert.by virtue of the importance of the Ras protein in the development and progression of tumors, it is a target of existing efforts, a substance or to develop a compound that is selectively oncogenic Ras to inhibit. To achieve this goal have been and become different approaches discussed.
Einer dieser Ansätze ist z.B. die Entwicklung von Stoffen, die selektiv die Farnesyltransferase hemmen und dadurch verhindern, dass Ras farnesyliert und zur Membran rekrutiert wird. Abseits der Zellmembran kann das im Cytoplasma lokalisierte Ras seine Funktion nicht mehr erfüllen und wird dadurch in seiner Funktion inhibiert. Schon vor langer Zeit wurden die ersten, vorklinische Untersuchungen durchgeführt, und nach langen Versuchsreihen sind heute zwei Präparate in Phase III klinischer Tests. Sie zeigen allerdings keine Wirkung bei den Tumoren, die von K-Ras und N-Ras abhängig sind (die alternative Form H-Ras spielt praktisch keine Rolle für Krebs beim Menschen). Bei einigen Ras-unabhängigen Tumoren wurde damit jedoch eine gute Wirkung erzielt, ohne dass man zur Zeit das betreffende Zielprotein schon identifiziert hat.One of these approaches is, for example, the development of substances that selectively inhibit farnesyltransferase and thereby prevent Ras farnesy and recruited to the membrane. Apart from the cell membrane, the Ras located in the cytoplasm can no longer fulfill its function and is thereby inhibited in its function. Long ago, the first preclinical examinations were carried out, and after long series of tests, two are now in Phase III clinical trials. However, they show no effect on the tumors that are dependent on K-Ras and N-Ras (the alternative form H-Ras plays virtually no role in cancer in humans). In some Ras-independent tumors, however, a good effect has been achieved without the target protein already being identified.
Ein anderer Ansatz zielt auf die Hemmung der Aktivierung von Ras, d.h. des Austauschs von gebundenem GDP gegen GTP ab. Obwohl sich dieser Ansatz experimentell als möglich erwiesen hat, wird er zurzeit offenbar aber nicht weiter verfolgt.One another approach is to inhibit the activation of Ras, i. the exchange of bonded GDP for GTP. Although this approach experimental as possible it appears that he is currently being prosecuted.
Weitere Ansätze zielen auf die Wiederherstellung der beeinträchtigten Hydrolyseaktivität des mutierten Ras durch verschiedene Verbindungen, u.a. Nukleotideanaloga, Peptide etc. ab, sind aber bisher wenig erfolgreich.Further approaches aim at restoring the impaired hydrolysis activity of the mutant Ras through various compounds, i.a. Nucleotide analogs, peptides etc., but so far have not been very successful.
Eine weitere Strategie hat die Blockierung der funktionalen Interaktion von Proteinen der Signalkette zum Ziel. Ein Angriffspunkt derzeitiger Wirkstoffe ist Ras und das nachfolgende (downstream) Glied der Kette, die Raf-Kinase. Bei jedem dieser Proteine sind onkogene Mutanten bekannt, die bei bestimmten Tumorarten häufig gefunden werden und als Ursache des Tumors anzunehmen sind. Der ideale Wirkstoff würde die onkogenen Varianten von Ras oder Raf erkennen, d.h. von den nativen Proteinen, wie sie in gesunden Zellen vorkommen, unterscheiden können und an der Signalweiterleitung hindern. Dazu würde es ausreichen, dass er an die aktivierte Form der onkogenen Proteine, die das Wachstumssignal weiterleiten, bindet und die Interaktion mit natürlichen Bindungspartnern unmöglich macht. Dies ist bezüglich der Spezifität von Wirkstoffen ein sehr hochgestecktes Ziel, da sich die onkogenen, konstitutiv aktiven Proteine nicht oder kaum von der aktvierten Form des nativen Proteins unterscheiden. Ein weniger spezifischer Wirkstoff wirkt auch auf das Ras gesunder Zellen, was sich als pharmakologische Nebenwirkung bemerkbar machen kann.A Another strategy has the blocking of functional interaction from proteins of the signal chain to the target. A point of attack of the present Active ingredients is Ras and the downstream member of the chain, the Raf kinase. Each of these proteins are oncogenic mutants known, which are commonly found in certain types of tumors and as a cause of the tumor. The ideal ingredient would be the recognize oncogenic variants of Ras or Raf, i. from the native ones Proteins, as they occur in healthy cells, can distinguish and prevent signal transmission. It would be enough for that to the activated form of oncogenic proteins, which are the growth signal forward, binds and makes the interaction with natural binding partners impossible. This is regarding of specificity of drugs is a very ambitious goal as the oncogenic, constitutively active proteins not or hardly activated by the Different form of the native protein. A less specific one Active ingredient also acts on the Ras of healthy cells, which proves to be pharmacological Side effect can be noticeable.
Es gab eine Reihe von frühen Versuchen, die Wechselwirkung von Ras und Raf, die sich in einem kurzlebigen Komplex verbinden (~ 100 ms), durch Anlagerung von Peptiden zu behindern. Eine Übersicht geben Wittinghofer und Waldmann (A Wittinghofer, A. & Waldmann, H. (2000) Ang. Chem. Int. Ed. 39, 4192-214). Peptide sind allerdings als Medikamente i.A. ungeeignet, da sie im Körper sehr schnell abgebaut werden und ungewollte Immunreaktionen hervorrufen können. Da zu diesem Zeitpunkt noch kein Strukturmodell des Ras-Raf-Komplexes vorhanden war, war das Design anderer kleiner Moleküle zur Inhibition der Ras-Raf Komplexbildung schwierig, wenn nicht gar unmöglich.It gave a number of early Try the interaction of Ras and Raf, resulting in a short-lived Complex connect (~ 100 ms) to hinder by addition of peptides. An overview give Wittinghofer and Waldmann (A Wittinghofer, A. & Waldmann, H. (2000) Ang. Chem. Int. Ed. 39, 4192-214). Peptides are, however as medicines i.A. unsuitable as they break down in the body very quickly and can cause unwanted immune reactions. There At this time no structural model of the Ras-Raf complex was present was the design of other small molecules for inhibition Ras-Raf complex formation is difficult, if not impossible.
Zurzeit
gibt es nur zwei wirksame nicht-peptidische Inhibitoren der Wechselwirkung
von Ras und Raf:
Sulindac ist als COX-2-Hemmer ein bereits
zugelassenes Medikament, hemmt aber über seine Abbauprodukte und
die seiner Derivate auch die Ras-Raf-Wechselwirkung, ohne dass der
Mechanismus vollständig
verstanden ist (Muller, O. et al. (2004) Angew. Chem. Int. Edit
43 (2004), 450-54; Herrmann, C. et al. (1998) Oncogene 17, 1769-76. Thompson,
H.J. et al. (1995) J. Natl. Cancer Inst 87, 1259-60). Eine neuere
Studie gibt jedoch Hinweise darauf, dass der Bereich am Rand der
Effektorschleife (Schalter I/Switch I-Region) von Ras, welcher der Kontaktfläche der
Wechselwirkung mit Raf dicht benachbart ist, daran beteiligt ist
(Waldmann, H. et al. (2004) Angew. Chem. Int. Edit 43, 454-58).At present, there are only two potent nonpeptidic inhibitors of Ras and Raf interaction:
Sulindac is already approved as a COX-2 inhibitor, but it also inhibits the Ras-Raf interaction through its degradation products and its derivatives, without fully understanding the mechanism (Muller, O. et al. (2004) Angew. Chem. Int., Edit 43 (2004), 450-54, Herrmann, C. et al., (1998) Oncogene 17, 1769-76, Thompson, HJ et al., (1995) J. Natl. Cancer Inst 87, 1259 60). However, a recent study indicates that the region at the edge of the effector loop (switch I / switch I region) of Ras, which is close to the contact surface of the interaction with Raf, is involved (Waldmann, H. et al. 2004) Angew. Chem. Int. Edit 43, 454-58).
Ein weiteres die Interaktion von Raf und Ras blockierendes Molekül, MCP-1 (Morphochem AG), konnte 2002 durch high-troughput screening identifiziert werden (Kato-Stankiewicz, J. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 14398-403). Angaben zur genauen Wirkungsweise liegen nicht vor. Die Entwicklung befindet sich noch im vorklinischen Stadium (Bollag, G. (2003) Curr. Opin. Investig. Drugs 4, 1436-41).One another interaction between Raf and Ras blocking molecule, MCP-1 (Morphochem AG), could be identified in 2002 by high-throughput screening (Kato-Stankiewicz, J. et al. (2002) Proc. Natl. Acad Sci., USA 99, 14398-403). Details on the exact mode of action are not available. The development is still in the preclinical stage (Bollag, G. (2003) Curr. Opin. Investig. Drugs 4, 1436-41).
Eine weitere Möglichkeit wäre die Inhibition der Raf Funktion. Sobald Raf an Ras gebunden hat, wird Raf aktiviert und phosphoryliert als Ser/Thr-Kinase im nächsten Schritt ein weiteres Protein aus der Familie der MAPK-Kinasen. Als Inhibitor für Raf ist der Wirkstoff „BAY-43-9006" von Bayer AG & Onyx, über dessen Entdeckung 2001 berichtet wurde (Lyons, J.F. et al. (2001) Endocrine-related cancer 8, 219–225) und dessen Entwicklung bis zur Phase III (Wirkungsvergleichsstudie) gediehen ist, am besten untersucht. Ähnliche Wirkstoffe von anderen Unternehmen sind bekannt (Bollag, G. (2003) Curr. Opin. Investig. Drugs 4, 1436-41). Die onkogene Mutationen von Raf sind allerdings mit anderen Tumorarten als die von onkogenem Ras verknüpft, deswegen sind Wirkstoffe, die die Funktion von onkogenem Raf blockieren nicht in gleichem Maße für die Behandlung von Tumoren, die durch onkogenes Ras verursacht werden, geeignet.A another possibility that would be Inhibition of the Raf function. Once Raf has tied to Ras, will Raf activates and phosphorylates as Ser / Thr kinase in the next step another protein from the family of MAPK kinases. As an inhibitor for Raf is the active ingredient "BAY-43-9006" from Bayer AG & Onyx, about its Discovery 2001 (Lyons, J.F. et al. (2001) Endocrine-related cancer 8, 219-225) and its development up to phase III (impact comparison study) prospered, best studied. Similar agents from others Companies are known (Bollag, G. (2003) Curr. Opin. Investig. Drugs 4, 1436-41). However, the oncogenic mutations of Raf are are associated with tumor types other than oncogenic Ras Drugs that do not block the function of oncogenic Raf to the same extent for the Treatment of tumors caused by oncogenic Ras, suitable.
Die molekularen Targets der vorgeschlagenen Wirkmechanismen sind teils Ras und Raf, teils auch andere für die Ras-Signaltransduktion wesentliche Enzyme. Die Arbeit an den verschiedenen Zielproteinen ist teilweise bis zu klinischen Studien und zugelassenen Wirkstoffen gediehen. Die Nebenwirkungen (Toxizität) sind allerdings unterschiedlich stark und beruhen darauf, dass die Wirkstoffe mit anderen als den Zielproteinen wechselwirken, also nicht hochspezifisch im allgemeinen Sinne sind.The molecular targets of the proposed mechanisms of action are partly Ras and Raf, others also other enzymes essential for Ras signal transduction. Work on the various target proteins has progressed, in part, to clinical trials and approved drugs. The Nebenwir However, toxicity is different and based on the fact that the active substances interact with other than the target proteins, ie they are not highly specific in the general sense.
Interessant ist auch die Spezifität im engeren Sinne, nämlich die Erkennung der onkogenen Mutante. Bei Ras wäre das die Unterscheidung zwischen nativem und onkogenem Ras. Bisher gibt es keinen Wirkstoff, der erwiesenermaßen spezifisch nur die onkogene Mutante eines Targetproteins (Ras oder Raf) hemmt. Die Signaltransduktion in gesunden Zellen wird deswegen stets auch beeinträchtigt.Interesting is also the specificity in the narrower sense, namely the recognition of the oncogenic mutant. For Ras, that would be the distinction between native and oncogenic Ras. So far, there is no drug that has been proven specific only the oncogenic mutant of a target protein (Ras or Raf) inhibits. The signal transduction in healthy cells is therefore always synonymous impaired.
Es besteht also ein Bedarf an einem Inhibitor der Ras-Raf-Interaktion, der möglichst spezifisch an aktiviertes, vorzugsweise nur onkogenes Ras bindet und die Interaktion mit den Effektoren, insbesondere Raf-Kinase verhindert. Mit solch einem Wirkstoff ließen sich Tumore, die auf einer Mutation im Ras-Gen beruhen effektiv behandeln.It So there is a need for an inhibitor of Ras-Raf interaction, the preferably binds specifically to activated, preferably only oncogenic Ras and prevents interaction with the effectors, especially Raf kinase. With such an active ingredient left Tumors that are based on a mutation in the Ras gene are effective to treat.
Beschreibung der ErfindungDescription of the invention
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Leitsubstanzen, die an Ras binden und die Interaktion mit seinen Effektoren beeinträchtigen oder verhindern. Besagte Substanzen binden präferentiell an das aktivierte Ras. Diese neue Eigenschaft, die bisher kein anderer Wirkstoff bietet, erzeugt indirekt eine hohe Spezifität für onkogenes Ras, da die native Form von Ras-GTP nach kurzer Zeit deaktiviert wird und deswegen in der Zelle nur in geringer Konzentration vorliegt. Onkogenes Ras ist dagegen konstitutiv aktiv und bietet sich daher als bevorzugtes Ziel des oben genannten Wirkstoffes an. Diese hohe Wirkstoffspezifität verhindert auch die Wechselwirkung mit nativem, inaktivem Ras-GDP und reduziert dadurch bei der Anwendung etwaige pharmakologische Nebenwirkungen auf die natürliche Funktion von Ras. Das geringe Restrisiko, dass der Wirkstoff an aktiviertes Ras-GTP der gesunden Zellen bindet, lässt sich durch molekulares Design weiter unterdrücken, indem Wirkstoffe mit einer verringerten Bindungsgeschwindigkeit ausgewählt werden, die während der kurzen Lebensdauer des nativen aktivierten Komplexes kaum anbinden können.object of the present invention are lead substances that bind to Ras and interfere with the interaction with its effectors or prevent. Said substances bind preferentially to the activated one Ras. This new property that no other active ingredient offers so far indirectly produces a high specificity for oncogenic Ras, as the native form deactivated by Ras-GTP after a short time and therefore in the Cell is present only in low concentration. Oncogenic Ras is By contrast, constitutively active and therefore offers itself as preferred Target of the above active substance. This high drug specificity prevents also the interaction with native, inactive Ras GDP and reduced thereby in the application any pharmacological side effects on the natural Function of Ras. The low residual risk that activated the active ingredient Ras-GTP binds to healthy cells, can be broken down by molecular Continue to suppress design, by adding active ingredients with a reduced binding rate selected be that while barely connect to the short lifespan of the native activated complex can.
Grundlegend für die Erfindung und die Entwicklung oben erwähnter Wirkstoffe ist dabei die Entdeckung einer distalen Bindenische in der dreidimensionalen Struktur des aktivierten Ras-Moleküls, die sich aufgrund ihrer Lage und Ladungsverteilung als Ziel für speziell darauf abgestimmte Substanzen anbietet. Die Bindenische reicht unter der Effektorschleife, die auch Schalter I-Region genannt wird und die Aminosäuren 25–40 von Ras umfasst, hindurch ins Innere des Proteins bis zum alpha-Phosphat des GTP. Schematisch gesehen bildet die Bindenische einen hohlen Tetraeder, der von vier Gruppen, nämlich den Seitenketten von Glu31, Asp33 und Asp38, sowie dem O2A des GTP aufgespannt wird. Diese „distale Bindenische" wird durch die Geometrie der vier an ihrer Bildung beteiligten chemischen Gruppen, d.h. die Carboxylgruppen von Glu31, Asp33 und Asp38, sowie dem Carbonylsauerstoff des alpha-Phosphats des GTP sterisch definiert. Die Bedeutung dieser Region bei der Interaktion mit den Effektoren konnte durch die Kristallstruktur des Komplexes aus Ras und der Raf-Bindedomäne bewiesen werden. Anderseits konnte durch Untersuchungen am Komplex aus Ras mit seinem GAP (p120-Ras-GAP-334) gezeigt werden, dass hier ein konservierter Lysin-Rest besagte distale Bindenische besetzt und dadurch die Bindung eines Effektors verhindert.Fundamental for the Invention and the development of the above-mentioned agents is included the discovery of a distal connective in the three-dimensional Structure of the activated Ras molecule, due to their Location and cargo distribution as a destination for specially coordinated Offers substances. The connective fish reaches under the effector loop, which is also called switch I region and amino acids 25-40 of Ras, through the inside of the protein to the alpha-phosphate of the GTP. Schematically, the Bindenische forms a hollow Tetrahedron, which consists of four groups, namely the side chains of Glu31, Asp33 and Asp38, as well as the O2A of the GTP. This "distal Bindenische "will through the geometry of the four chemical agents involved in their formation Groups, i. the carboxyl groups of Glu31, Asp33 and Asp38, as well as the sterically defined carbonyl oxygen of the alpha-phosphate of GTP. The importance of this region in interacting with the effectors could by the crystal structure of the complex of Ras and the Raf binding domain be proved. On the other hand, by investigations on the complex from Ras with his cap (p120-ras-cap-334) shown here a conserved lysine residue occupied said distal connective fish and thereby prevents binding of an effector.
Erfindungsgegenstand sind demnach Moleküle, die an die distale Bindenische der Effektorschleife von aktiviertem Ras binden und dadurch die Bindung an Raf-Kinase inhibieren, als Arzneimittel. Die Inhibitormoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zwei chemische Gruppen, ausgewählt aus dem alpha-Phosphat des an Ras gebundenen GTP und den Carboxylgruppen von Glu31, Asp33 und Asp38 von Ras, über Wasserstoffbrücken- oder Ionenpaar-Bindungen kontaktieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Inhibitormoleküle zu dem hohlen Tetraeder, der durch die Seitenkettencarboxylgruppen von Glu31, Asp33 und Asp38 sowie dem O2A des GTP aufgespannt wird und die distale Bindenische von aktiviertem Ras bildet, sterisch komplementär und kontaktieren mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, der oben genannten Gruppen über elektrostatische Wechselwirkungen, d.h. H-Brücken und/oder Ionenpaarbindungen, wodurch sie zu mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, der besagten chemischen Gruppen auch ladungsmäßig komplementär sind.Inventive subject matter are molecules, which is connected to the distal connective tissue of the effector loop of activated Ras and thereby inhibit the binding to Raf kinase, as Drug. The inhibitor molecules according to the present Invention are preferably characterized in that they at least two chemical groups selected from the alpha-phosphate the Ras bound GTP and the carboxyl groups of Glu31, Asp33 and Asp38 from Ras, about Hydrogen-bond or ion-pair bonds to contact. In a particularly preferred embodiment are the inhibitor molecules of the invention to the hollow Tetrahedron formed by the side-chain carboxyl groups of Glu31, Asp33 and Asp38 as well as the O2A of the GTP is spanned and the distal Bindenische of activated Ras forms, sterically complementary and contact at least two, preferably at least three, of the above Groups over electrostatic interactions, i. H-bonds and / or ion-pair bonds, thereby giving them at least two, preferably at least three, of said chemical groups are also complementary in charge.
Besagtes erfindungsgemäßes Inhibitormolekül kann ein Peptid mit einer Länge von 16–100, bevorzugt 16–50, besonders bevorzugt 16–30 Aminosäuren sein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.2 oder funktionale Varianten davon umfassen.said The inhibitor molecule according to the invention can be Peptide with a length from 16-100, preferably 16-50, more preferably 16-30 amino acids be that the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or functional variants thereof.
In
diesem Zusammenhang bezieht sich „funktionelle Variante" auf ein Peptid,
dass die Aminosäuresequenz
mit SEQ ID Nr. 2 umfasst, in welcher eine oder mehrere Aminosäuren durch
ihre entsprechenden D-Isomere, andere Aminosäuren oder Aminosäureanaloga
ersetzt worden sind, wobei die Funktionalität des Peptids beibehalten wird.
Bevorzugt ist dabei ein konservativer Aminosäurenaustausch, der die chemische
Eigenschaft der Aminosäure
beibehält.
Der Begriff „Funktionalität" bezieht sich in
diesem Zusammenhang auf die Fähigkeit
an Ras binden zu können.
Beispiele für
einen konservativen Aminosäureaustausch
schließen
Substitutionen ein, die innerhalb folgender Gruppen durchgeführt werden:
– Met, Ile,
Leu, Val
– Phe,
Tyr, Trp
– Arg,
Lys, His
– Ala,
Gly
– Gln,
Asn
– Ser,
Thr
– Glu,
Asp.In this context, "functional variant" refers to a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acids have been replaced by their corresponding D isomers, other amino acids or amino acid analogs, the functionality of the peptide A conservative amino acid substitution which retains the chemical property of the amino acid is preferred, The term "functionality" in this context refers to the ability to bind Ras. Examples of a conserva Active amino acid substitutions include substitutions made within the following groups:
- Met, Ile, Leu, Val
- Phe, Tyr, Trp
- Arg, Lys, His
- Ala, Gly
- Gln, Asn
- Ser, Thr
- Glu, Asp.
Weitere Substitutionsmöglichkeiten sind dem Durchschnittsfachmann bekannt.Further substitution possibilities are known to those of ordinary skill in the art.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Inhibitormolekül gemäß der vorliegenden Erfindung ein Peptid, das die Aminosäuresequenz mit SEQ ID Nr. 2 besitzt.In a particularly preferred embodiment is the inhibitor molecule according to the present Invention a peptide having the amino acid sequence with SEQ ID NO. 2 has.
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist ein Lysin in SEQ ID Nr. 2 oder einer funktionellen Variante
davon, durch 
In einer besonderen Ausführungsform ist das oben beschriebene Inhibitor-Peptid zyklisiert. Die Zyklisierung kann über eine Säureamidbindung zwischen dem Carboxy- und dem Amino-Terminus erfolgen, besonders bevorzugt ist aber eine Zyklisierung über die Seitenketten, vorzugsweise von Lys1 und Glu16.In a particular embodiment For example, the inhibitor peptide described above is cyclized. The cyclization can over an acid amide bond between the carboxy and the amino terminus, especially however, preference is given to cyclization via the side chains, preferably from Lys1 and Glu16.
Ferner
können
die Inhibitormoleküle
der vorliegenden Erfindung auch die allgemeine Formel
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist D1 eine Aminogruppe und/oder D2 eine Iminogruppe.In a preferred embodiment In the invention D1 is an amino group and / or D2 is an imino group.
Besonders bevorzugt sind Moleküle der Formel H2N-(CH2)n-NH2 und H2N-(CH2)n-NH-(C=NH)-NH2 mit n = 0 bis 7.Particularly preferred are molecules of the formula H 2 N- (CH 2 ) n -NH 2 and H 2 N- (CH 2 ) n -NH- (C = NH) -NH 2 where n = 0 to 7.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Molekül zur Inhibition der Ras-Raf-Interaktion ausgewählt aus Putrescin, Spermidin und Spermin.In a further embodiment The invention is the molecule for the inhibition of Ras-Raf interaction selected from putrescine, spermidine and spermine.
Die Inhibitormoleküle der vorliegenden Erfindung binden, unabhängig davon ob es sich bei ihnen um Peptide oder andere Verbindungen handelt, spezifisch an ein aktiviertes Ras-Protein, das aus der Gruppe, die aus K-Ras, N-Ras und H-Ras besteht, ausgewählt wird und bevorzugt an ein konstitutiv aktives, onkogenes Ras-Protein. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff „spezifisch" auf eine Dissoziationskonstante Kd, die kleiner als 10–1 M, vorzugsweise kleiner als 10–2 ist, und die Unterscheidung von unspezifischen Protein-Protein-Interaktionen erlaubt.The inhibitor molecules of the present invention, regardless of whether they are peptides or other compounds, specifically bind to an activated Ras protein selected from the group consisting of K-Ras, N-Ras and H-Ras is and prefers a constitutively active, oncogenic Ras protein. In this context, the term "specific" refers to a dissociation constant K d which is less than 10 -1 M, preferably less than 10 -2 , and which allows discrimination from non-specific protein-protein interactions.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Tumorerkrankungen die eine oder mehrere der obigen Verbindungen enthält.Also The invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of tumor diseases, one or more of the above Contains compounds.
Außerdem ist auch die Verwendung einer der oben beschriebenen Verbindungen oder einer, die oben beschriebenen Verbindungen enthaltenden, pharmazeutischen Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Tumorerkrankungen Bestandteil der Erfindung.Besides that is also the use of one of the compounds described above or a pharmaceutical containing the compounds described above Composition for the preparation of a medicament for the treatment of tumor diseases Component of the invention.
Strukturelle Grundlagen des vorgeschlagenen Wirkungsmechanismusesstructural Basics of the proposed mechanism of action
Die
Strategien zur Verifizierung der Inhibitorfunktion in vitroStrategies for verification the inhibitor function in vitro
Der
erfindungsgemäße Inhibitor
soll spezifisch in der distalen Bindenische von Ras binden, in welcher
die vier negativ geladenen Gruppen (
a) Spezifische Bindunga) Specific binding
Die spezifische Bindung eines Inhibitors am gewünschten Bindungsort kann sehr genau mit Infrarotexperimenten (FTIR) verfolgt werden. Durch Isotopenmarkierung der Phosphatsauerstoffe konnten Allin und Gerwert (C. Allin and K. Gerwert (2001) Biochemistry 40, 3037–3046) zeigen, dass die IR-Banden der drei Phosphatgruppen deutlich getrennt erscheinen, und die Banden zuordnen. Bildet ein Inhibitor die erfindungsgemäß gewünschte H-Brücke zum α-Phosphat aus, ist diese H-Brückenbindung im IR-Spektrum deutlich zu erkennen. Das gilt ebenso für H-Brücken, die zu den Carboxylgruppen von Glu31, Asp33 und Asp38 ausgebildet werden. Bindende und nichtbindende Gruppen können über selektive Mutagenese identifiziert werden, wobei die notwendigen Techniken dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Die erforderlichen Proteine, d.h. Ras und entsprechende Mutanten, können rekombinant mittels Techniken hergestellt werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.The Specific binding of an inhibitor at the desired binding site can be very be followed closely with infrared experiments (FTIR). By isotope labeling Allin and Gerwert (C. Allin and K. Gerwert (2001) Biochemistry 40, 3037-3046) show that the IR bands the three phosphate groups appear distinctly separate, and the bands assign. If an inhibitor forms the inventively desired H-bridge to the α-phosphate, this is H-bond clearly visible in the IR spectrum. This also applies to H-bridges, the to the carboxyl groups of Glu31, Asp33 and Asp38 are formed. Binding and non-binding groups can be identified by selective mutagenesis with the necessary techniques known to those of ordinary skill in the art are. The required proteins, i. Ras and corresponding mutants, can produced recombinantly by techniques known to one of ordinary skill in the art are known.
b) Inhibition der Raf-Bindungb) Inhibition of Raf binding
Die Bindungscharakteristika eines mittels oben angeführter Techniken identifizierten Bindungspartners, insbesondere in Bezug auf die qualitative und quantitative Bestimmung der Inhibition der Ras/Raf-Interaktion, können in weitergehenden Experimenten, die zum Standardrepertoire der Biochemie gehören, und u. a. den Einsatz von fluoreszenzspektroskopischen, kalorimetrischen und NMR-Messungen einschließen, bestimmt werden. In diesem Zusammenhang sind Messungen mit der Stopped-Flow-Methode (Fluoreszenzsspektroskopie) und der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) besonders geeignet.The Binding characteristics of a method identified by the above-mentioned techniques Binding partner, especially in relation to the qualitative and quantitative determination of inhibition of Ras / Raf interaction, can in further experiments, the standard repertoire of biochemistry belong, and u. a. the use of fluorescence spectroscopic, calorimetric and NMR measurements lock in, be determined. In this context, measurements are using the stopped-flow method (Fluorescence spectroscopy) and isothermal titration calorimetry (ITC) particularly suitable.
Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.It follows a sequence listing according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can from the official publication platform downloaded from the DPMA.
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| DE102005027556A DE102005027556A1 (en) | 2005-06-14 | 2005-06-14 | New Raf kinase inhibitor peptide useful in the preparation of medicament for the treatment of tumor |
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| DE102005027556A1 true DE102005027556A1 (en) | 2006-12-21 |
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ID=37489635
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|---|---|---|---|---|
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-
2005
- 2005-06-14 DE DE102005027556A patent/DE102005027556A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004083458A1 (en) * | 2003-03-20 | 2004-09-30 | Universite Catholique De Louvain | Medical use of ras antagonists for the treatment of capillary malformation |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNI- CATIONS 247, 176-180 (1998) * |
| J. PEPTIDE RES. 50, 1997, 483-492 * |
| RN 110-60-1 * |
| RN 124-20-9 * |
| RN 71-44-3, * |
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