DE102005023055A1 - Making DNA fragments for determining DNA methylation pattern involves digesting DNA with methylation-specific restriction enzyme; and ligating adapters to restriction fragments, followed by primer mediated-amplification of ligated fragments - Google Patents

Making DNA fragments for determining DNA methylation pattern involves digesting DNA with methylation-specific restriction enzyme; and ligating adapters to restriction fragments, followed by primer mediated-amplification of ligated fragments Download PDF

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Taman Rujan
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Abstract

Making a selected mixture of DNA fragments involves obtaining a solution comprising genomic DNA; digesting the genomic DNA with at least one methylation-specific restriction enzyme, where the DNA is cut at corresponding unmethylated restriction sites; and ligating adapters to the restriction fragments, followed by primer mediated-amplification of adapter-ligated fragments to provide a size biased fragment amplificate. Independent claims are included for the following: (1) determining a DNA methylation pattern using mixture of DNA fragments; (2) a DNA test kit comprising a container, a restriction enzyme component, and a DNA microarray; and (3) an oligonucleotide array and method of making the oligonulceotide array.

Description

Gebiet der ErfindungTerritory of invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Fragmenten einer Polynukleinsäure mit den folgenden Verfahrensstufen: a) es wird eine Lösung enthaltend die Polynukleinsäure hergestellt, b) optional erfolgt eine Aufbereitungsverfahrensstufe, in welcher Substanzen, die keine Polynukleinsäure sind, abgereichert werden und/oder die Polynukleinsäure angereichert wird, c) es wird der Lösung ein nicht-methylierungsspezifisches Restriktionsenzym zugegeben, wobei die Polynukleinsäure an für die Restriktionsenzyme spezifischen, Schnittstellen geschnitten wird, d) aus der in Stufe c) erhaltenen Lösung werden Fragmente mit einer Länge von weniger als 50 Basen abgetrennt, e) an die in Stufe d) erhaltenen Fragmente werden Linker ligiert, f) der in Stufe e) erhaltenen Lösung wird dann ein methylierungsspezifisches Restriktionsenzym zugegeben, wobei die Polynukleinsäure an methylierbaren, jedoch nicht methylierten Schnittstellen zu den Fragmenten geschnitten wird, und g) die in Stufe f) erhaltenen Fragmente werden einer Amplifikationsverfahrensstufe unterzogen.The The invention relates to a process for the preparation of a mixture of fragments of a polynucleic acid having the following process steps: a) it becomes a solution containing the polynucleic acid produced, b) optionally there is a treatment process stage in which Substances that are not polynucleic acid are depleted and / or the polynucleic acid c) the solution becomes non-methylation specific Restriction enzyme was added, wherein the polynucleic acid on for the restriction enzymes specific, cut interfaces, d) from the in step c) solution obtained become fragments with a length of less than 50 bases separated, e) to those obtained in step d) Fragments are ligated to linker, f) the solution obtained in step e) becomes then a methylation-specific restriction enzyme added, where the polynucleic acid at methylatable, but not methylated, interfaces to the fragments and g) are the fragments obtained in step f) subjected to an amplification process step.

Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung des Methylierungsmusters einer Polynukleinsäure, ein Test-Kit zur Durchführung eines der vorstehenden Verfahren, die Verwendung eines Verfahrens zur Untersuchung des Methylierungsmusters einer Polynukleinsäure zur Identifizierung eines indikationsspezifischen Targets sowie eines Modulators für ein solchen Targets, die Verwendung eines solchen Modulators zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit der spezifischen Indikation, sowie die Verwendung eines solchen Verfahrens oder eines Test-Kits zur Diagnose einer Erkrankung.Of Furthermore, the invention relates to a method for the investigation of Methylation pattern of a polynucleic acid, a test kit for performing a the above method, the use of a method for Investigation of the Methylation Pattern of a Polynucleic Acid for Identification of an indication-specific target as well as a Modulators for Such a target, the use of such a modulator for Preparation of a pharmaceutical composition with the specific Indication, as well as the use of such a method or a Test kits for diagnosing a disease.

Hintergrund der Erfindung und Stand der Technikbackground the invention and the prior art

Viele Erkrankungen, insbesondere Krebserkrankungen, gehen einher mit veränderter Genexpression. Hierbei kann es sich einerseits um Mutationen der Gene selbst handeln, welche zu einer Expression veränderter Proteine -oder zur Inhibierung oder Überexpression der Proteine oder Enzyme führen. Eine Modulation der Expression kann aber auch durch epigenetische Veränderungen, insbesondere DNA-Methylierung, erfolgen. Solche epigenetischen Veränderungen berühren die eigentliche DNA-Codierungssequenz nicht. Es hat sich herausgestellt, dass DNA-Methylierungsprozesse weitreichende Implikationen für die Gesundheit aufweisen, und es scheint klar, dass Kenntnisse über Methylierungsprozesse und Änderungen im Methyl-Metabolismus sowie DNA-Methylierung wesentlich zum Verständnis von Erkrankungen, der Prophylaxe, Diagnose, sowie Therapie von Erkrankungen sind.Lots Diseases, especially cancers, are associated with altered Gene expression. On the one hand this can be mutations of the Acting genes themselves, which changed to expression Proteins -or to inhibit or overexpress the proteins or enzymes. Modulation of expression can also be achieved by epigenetic changes, especially DNA methylation. Such epigenetic changes touch not the actual DNA coding sequence. It turned out DNA methylation processes have far-reaching health implications and it seems clear that knowledge about methylation processes and changes in methyl metabolism as well as DNA methylation essential for understanding of diseases, prophylaxis, diagnosis, as well as therapy of diseases are.

Die präzise Kontrolle von Genen, welche nur einen kleinen Anteil des gesamten Genoms von Säugetieren darstellen, ist eine Frage der Regulation im Lichte des Umstandes, dass der überwiegende Anteil der DNA im Genom nicht kodierend ist. Die Anwesenheit solcher Rumpf-DNA, welche Introns, repetetive Elemente und potenziell aktiv transposierbare Elemente enthält, erfordert effektive Mechanismen für ihre dauerhafte Unterdrückung (Silencing). Es scheint, dass die Methylierung von Cytosin durch S-Adenosylmethionin(SAM)-abhängige DNA Methyltransferasen, welche 5-Methylcytosin bilden, einen solchen Mechanismus für die Änderung von DNA-Protein-Interaktionen darstellt. Gene können von methylierungsfreien Promotern selbst dann transkribiert werden, wenn benachbarte transkribierte oder nichttranskribierte Regionen umfangreich methyliert sind. Dies erlaubt die Nutzung und Regulierung von Promotern funktionaler Gene, während die Rumpf-DNA, einschließlich transposierbarer Elemente, unterdrückt wird: Methylierung findet auch statt für die langfristige Unterdrückung von X-gelinkten Genen und kann entweder zur Abnahme oder zum Anstieg des Ausmaßes der Transkription führen, abhängig davon, wo die Methylierung in der Transkriptionseinheit stattfindet.The precise Control of genes, which only a small proportion of the total Genomes of mammals is a question of regulation in the light of the circumstance, that the vast one Proportion of DNA in the genome is non-coding. The presence of such Hull DNA, which introns, repetitive elements and potentially active contains transposable elements, requires effective mechanisms for their permanent suppression (silencing). It appears that the methylation of cytosine by S-adenosylmethionine (SAM) -dependent DNA Methyltransferases which form 5-methylcytosine, such Mechanism for the change of DNA-protein interactions represents. Genes can be from be transcribed even without methylation-free promoters, when adjacent transcribed or non-transcribed regions are extensively methylated. This allows the use and regulation of promoters of functional genes, while the hull DNA, including transposable Elements, suppressed Methylation also takes place for the long-term suppression of X-linked genes and may either decrease or increase the extent of Transcription, depending on where the methylation takes place in the transcription unit.

Nahezu die gesamte natürliche DNA-Methylierung in Säugetieren ist beschränkt auf Cytosin-Guanosin (CpG) Dinukleotid-Palindromsequenzen, welche durch DNA-Methyltransferasen kontrolliert werden. CpG Dinukleotide machen ca. 1 bis 2% aller Dinukleotide aus und sind in sog. CpG-Inseln konzentriert. Diese CpG-Inseln sind normaler Weise hypomethyliert und oft mit Promoter-Gebieten von Genen gekoppelt. Veränderungen der Genexpression, beispielsweise im Zusammenhang mit Krebs, können durch Abweichungen der CpG-Inselmethylierung bedingt sein. Die Folgen solcher DNA-Methylierungsabweichungen sind oft die Unterdrückung der Expression von Tumor-Suppressorgenen und Cytosin zu Thymin-Mutationen, welche aus der Deaminierung von 5-Methylcytosin zu Thymin resultieren. Aber auch Hypermethylierung kann mit der Entstehung von Krankheiten assoziiert sein.Nearly the entire natural DNA methylation in mammals is limited on cytosine-guanosine (CpG) dinucleotide palindrome sequences which by DNA methyltransferases to be controlled. CpG dinucleotides make up about 1 to 2% of all Dinukleotide and are concentrated in so-called. CpG islands. These CpG islands are normally hypomethylated and often with promoter areas coupled by genes. changes Gene expression, for example, in connection with cancer, can Deviations of the CpG island methylation be conditional. The consequences Such DNA methylation deviations are often the suppression of Expression of tumor suppressor genes and cytosine to thymine mutations, which result from the deamination of 5-methylcytosine to thymine. But hypermethylation can also be linked to the development of diseases be associated.

Die effiziente Detektion von DNA-Methylierungsmustern ist folglich ein wichtiges Werkzeug zur Entwicklung neuer Ansätze zur Verhinderung, Diagnose und Behandlung von Krankheiten sowie zum Screening nach Targets. Insbesondere können auch personenspezifische Methylierungsprofile erstellt und eine maßgeschneiderte Therapie für die betreffende Person hieraus hergeleitet werden. Schließlich kann hiermit die Wirkung einer Therapie überwacht werden.The efficient detection of DNA methylation patterns is therefore a important tool for developing new approaches to prevention, diagnosis and treatment of diseases as well as screening for targets. In particular, you can also created person-specific methylation profiles and a customized Therapy for the person concerned can be deduced from this. Finally, can hereby the effect of a therapy can be monitored.

Ein Verfahren zur Untersuchung von Methylierungsmustern bzw. zur Bestimmung von hypermethylierten CpG-Inseln ist die Differenzielle Methylierungs Hybridisierung (DMH, Differential Methylation Hybridization [Huang et al, Hum Mol Genet, 8: 459–470, 1999]). Im Rahmen dieser Technologie wird das eingangs genannte Verfahren eingesetzt, wobei die erhaltenen Fragmente auf einen DNA-Chip, welcher geklonte CpG-Inseln trägt, hybridisiert werden. Bei dem insoweit bekannten Verfahren wird die aus einer Gewebeprobe stammende DNA zunächst mit einem einzigen nicht-methylierungs-spezifischen Restriktionsenzym, beispielsweise MseI, geschnitten. Die erhaltenen Fragmente werden dann mit Linkern ligiert. Die so erhaltene Mischung von Fragmenten wird dann mit methylierungsspezifischen Endonukleasen, beispielsweise BstUI und/oder HpaII, geschnitten und mittels PCR amplifiziert. Nach einem Reinigungsschritt werden die Amplicons mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Die vorstehenden Schritte werden einerseits mit DNA aus erkranktem Gewebe und andererseits mit DNA aus benachbartem gesunden Gewebe gleichen Gewebetyps durchgeführt, wobei die jeweils erhaltenen Fragmente mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Beide Fragmentlösungen werden dann auf den DNA-Chip mit CpG-Inseln cohybridisiert. Nach Waschverfahrensstufen wird schließlich ein Abbild des DNA-Chips mit einem handelsüblichen und für die Fluoreszenzstrahlung sensitiven Scanner durchgeführt. Das Abbild bzw. das darin erkennbare Muster floureszierender Punkte lässt sich dann dahingehend analysieren, für welche CpG-Clone Unterschiede in der Methylierung vorliegen. Hierzu wird lediglich beispielhaft ergänzend auf die Literaturstelle Wei et al, Clinical Cancer Research, 8: 2246–2252 (2002) verwiesen. Ergänzend wird zur Technologie sowie verfahrentechnischer Details auf die Literaturstelle WO2003/087774 (PCT/US03/11598) verwiesen.A method for studying Methy For the determination of hypermethylated CpG islands, Differential Methylation Hybridization (DMH, Differential Methylation Hybridization [Huang et al., Hum Mol Genet. 8: 459-470, 1999]) is known. In the context of this technology, the method mentioned is used, wherein the resulting fragments are hybridized to a DNA chip carrying cloned CpG islands. In the process known so far, the DNA derived from a tissue sample is first cut with a single non-methylation-specific restriction enzyme, for example MseI. The resulting fragments are then ligated with linkers. The mixture of fragments thus obtained is then cut with methylation-specific endonucleases, for example BstUI and / or HpaII, and amplified by PCR. After a purification step, the amplicons are coupled with a fluorescent dye. The above steps are carried out on the one hand with DNA from diseased tissue and on the other hand with DNA from adjacent healthy tissue of the same tissue type, wherein the respective fragments obtained are labeled with different fluorescent dyes. Both fragment solutions are then co-hybridized to the DNA chip with CpG islands. After washing process steps, finally, an image of the DNA chip with a commercially available and sensitive to the fluorescence radiation scanner is performed. The image or the recognizable pattern of flourescent points can then be analyzed for which CpG clones there are differences in the methylation. By way of example, reference is additionally made, by way of example, to the Wei et al reference, Clinical Cancer Research, 8: 2246-2252 (2002). In addition, reference is made to the literature WO2003 / 087774 (PCT / US03 / 11598) to the technology and procedural details.

Bei den insoweit bekannten DNA-Experimenten werden zur Reduktion der Komplexität der erhaltenen Fragmentlösung typischer Weise Fragmente mit einer Länge von < 100 Basen ausgefiltert bzw. nicht amplifiziert und so abgereichert (Huang et al., Hum Mol Genet, 8: 459–470 (1999). Dabei wird eine Reduktion der Komplexität der Mischung an Fragmenten auf maximal 1/10 erreicht. Zudem ist es nachteilig, dass durch den Einsatz nicht-methylierungs-spezifischer Restriktionsenzyme potenziell interessante Fragmente, nämlich Fragmente mit potentiell für eine Erkrankung spezifischen Methylierungen, zuvor bereits methylierungsunspezifisch geschnitten werden und folglich der nachfolgenden Analyse nicht mehr zur Verfügung stehen, wenn sie kleiner als 100 Basenpaare werden.at the known DNA experiments are used to reduce the complexity the fragment solution obtained typically fragments with a length of <100 bases filtered out or not amplified and thus depleted (Huang et al., Hum Mol Genet, 8: 459-470 (1999). This will reduce the complexity of the mixture of fragments reached to a maximum of 1/10. In addition, it is disadvantageous that by the Use of non-methylation-specific restriction enzymes potentially interesting fragments, namely Fragments with potential for a disease specific methylations previously methylation-unspecific and thus the subsequent analysis will not be cut more available stand if they are smaller than 100 base pairs.

In dem Verfahren des Standes der Technik werden theoretisch alle Fragmente, die nicht durch methylierungsspezifische Restriktionsenzyme geschnitten werden, im letzten Schritt amplifiziert. Da die Anzahl der Fragmente, die zugleich eine Restriktionserkennungssequenz haben und heruntermethyliert sind, verschwindend gering sind, ist die Komplexität der Mischung extrem hoch und es wird praktisch versucht, den größten Teil des gesamten Genoms zu amplifizieren. Die Reduktion der Komplexität wäre in diesen Zusammenhängen besonders wünschenswert, da eine sehr grosse Anzahl unterschiedlicher Fragmente zu vergleichsweise kleinen Amplifikationsfaktoren führt, i.e. jedes einzelne Fragment wird für sich betrachtet nur sehr geringfügig amplifiziert, insbesondere ist der Unterschied in der Kopienzahl von methylierten und unmethylierten Fragmenten gering mit der Folge, dass Microarray Plattformen kaum in der Lage sind, solche Unterschiede zuverlässig zu detektieren. Aber selbst wenn der Amplifikationsfaktor erhöht werden könnte, so wäre die Detektion von einzelnen Fragmenten aus der sehr großen Population verschiedener Fragmente auf Grund von Kreuzhybridisierungseffekten nicht oder allenfalls sehr unsicher möglich. Zu der Problematik (zu) hoher Komplexität wird ergänzend auf die Literaturstelle Lucito et al., Genetic Research (2000) verwiesen.In theoretically all fragments, which are not cut by methylation-specific restriction enzymes be amplified in the last step. Because the number of fragments, which at the same time have a restriction recognition sequence and down methylated are, vanishingly small, is the complexity of the mix extremely high and it is practically tried, the most part of the entire genome. The reduction of complexity would be in these cohere particularly desirable because a very large number of different fragments too comparatively leads to small amplification factors, i.e. every single fragment is considered very rare slight amplified, in particular, the difference in the copy number of methylated and unmethylated fragments with low consequence, that microarray platforms are barely capable of such differences reliable to detect. But even if the amplification factor is increased could, that would be the detection of individual fragments from the very large population various fragments due to cross-hybridization effects not or at most very unsafe possible. To the problem (to) high complexity will be complementary to the reference Lucito et al., Genetic Research (2000).

Ein weiteres Problem des insofern bekannten Standes der Technik ist, dass das eingesetzte nicht methylierungspezifische Restriktionsenzym, typischerweise MseI, vermehrt in CG-armen Regionen schneidet und die CpG Inseln, welche die interessanten Regionen darstellen, in langen Fragmenten verbleiben, die typischerweise 10.000 und mehr Basenpaare umfassen. Solche langen Fragmente sind jedoch einerseits schwer zu amplifizieren und zu detektieren. Andererseits sind Regionen, in denen CpG Inseln gleich methyliert sind (Komethylierungsblöcke) meist kürzer als 500 Basenpaare. Folglich kann das insofern bekannte Verfahren nur Unterschiede in komethylierten Regionen detektieren. Wenn ein CpG in einer Erkennungssequenz jedoch heruntermethyliert ist, wird diese Erkennungssequenz geschnitten.One Another problem of the known prior art is that the non-methylation-specific restriction enzyme used, typically MseI, increasingly cuts in CG-poor regions and the CpG islands, which represent the interesting regions, in long fragments, typically 10,000 and more Base pairs include. However, such long fragments are on the one hand difficult to amplify and detect. On the other hand, regions in which CpG islands are the same methylated (Komethylierungsblöcke) mostly shorter as 500 base pairs. Consequently, the method known so far only detect differences in cometised regions. When a However, CpG is downmethylated in a recognition sequence cut this recognition sequence.

Technisches Problem der Erfindung Technical problem of invention

Der Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde, einerseits die Komplexität einer erhaltenen DNA-Fragmentlösung zu reduzieren, und andererseits die Anzahl interessanter Fragmente, i.e. enthaltend CpG Inseln, in der Fragmentlösung zu erhöhen.Of the The invention is therefore based on the technical problem, on the one hand the complexity an obtained DNA fragment solution and on the other hand the number of interesting fragments, i.e. containing CpG islands, in the fragment solution increase.

Grundzüge der Erfindung und bevorzugte AusführungsbeispieleBroad features of the invention and preferred embodiments

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Fragmenten einer Polynukleinsäure mit den folgenden Verfahrensstufen:

  • a) Es wird eine Lösung enthaltend die Polynukleinsäure hergestellt,
  • b) optional erfolgt eine Aufbereitungsverfahrensstufe, in welcher Substanzen, die keine Polynukleinsäure sind, angereichert werden und/oder die Polynukleinsäure angereichert wird,
  • c) es werden der Lösung zumindest zwei verschiedene nicht-methylierungsspezifische Restriktionsenzyme zugegeben, wobei die Polynukleinsäure an für die Restriktionsenzyme spezifischen Schnittstellen geschnitten wird,
  • d) aus der in Stufe c) erhaltenen Lösung werden Fragmente mit einer Länge von weniger als 50 Basen abgetrennt,
  • e) an die in Stufe d) erhaltenen Fragmente werden Linker ligiert,
  • f) der in Stufe e) erhaltenen Lösung wird dann ein methylierungsspezifisches Restriktionsenzym zugegeben, wobei die Polynukleinsäure an methylierbaren, jedoch nicht methylierten Schnittstellen zu den Fragmenten geschnitten wird, und
  • g) die in Stufe f) erhaltenen Fragmente werden einer Amplifikationsverfahrensstufe unterzogen.
To solve this technical problem, the invention teaches a method for producing a mixture of fragments of a polynucleic acid with the following process steps:
  • a) A solution containing the polynucleic acid is prepared,
  • b) optionally a treatment process step takes place in which substances which are not polynucleic acid are enriched and / or the polynucleic acid is enriched,
  • c) at least two different non-methylation-specific restriction enzymes are added to the solution, the polynucleic acid being cut at interfaces specific for the restriction enzymes,
  • d) fragments of less than 50 bases in length are separated from the solution obtained in step c),
  • e) linkers are ligated to the fragments obtained in step d),
  • f) the solution obtained in step e) is then added a methylation-specific restriction enzyme, wherein the polynucleic acid is cut at methylatable, but not methylated, interfaces to the fragments, and
  • g) the fragments obtained in step f) are subjected to an amplification process step.

Vorzugsweise werden Fragmente von einer Länge im Bereich 50 Basen bis 5.000 Basen selektiv angereichert werden.Preferably become fragments of a length be selectively enriched in the range 50 bases to 5,000 bases.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Lösung mit einer Mischung von Fragmenten einer Polynukleinsäure erhalten, welche beispielsweise für die DMH besonders geeignet ist. Überraschenderweise wird trotz der Erhöhung der Anzahl an Schnitten durch Einsatz mehrerer verschiedener nicht methylierungspezifischer Restriktionsenzyme dennoch eine Erhöhung der Anzahl interessanter Fragmente, i.e. enthaltend CpG Inseln, erreicht, mit der Folge, dass die Komplexität, bezogen auf den Anteil von CpG Inseln enthaltenden Fragmenten in der zu amplifizierenden Mischung an Fragmenten, erniedrigt wird. Demgegenüber wurde im Stand der Technik versucht die Komplexität durch möglichst wenige Schnitte mit nicht methylierungsspezifischen Restriktionsenzymen zu reduzieren. Mit der Erfindung ist gegenüber dem Stand der Technik eine Reduktion der Komplexität der Mischung (Anteil an Fragmenten mit CpG Inseln an der Gesamtanzahl an Fragmenten, die amplifiziert werden) auf 1/100 erreichbar, i.e. um einen Faktor 10 besser als im Stand der Technik.With the method according to the invention becomes a solution obtained with a mixture of fragments of a polynucleic acid, which for example the DMH is particularly suitable. Surprisingly will despite the increase the number of cuts by using several different not methylation-specific restriction enzymes nevertheless an increase in Number of interesting fragments, i.e. containing CpG islands, reached, with the consequence that the complexity, relative to the share of CpG islands containing fragments in the mixture to be amplified on fragments, is degraded. In contrast, in the prior art tries the complexity by as few as possible Sections with non-methylation-specific restriction enzymes to reduce. With the invention over the prior art is a Reduction of complexity of the mixture (fraction of fragments with CpG islands in the total number fragments that are amplified) to 1/100, i.e., by a factor of 10 better than in the prior art.

Bevorzugt ist es, wenn in Stufe c) drei verschiedene nicht-methylierungspezifische Restriktionsen-zyme zugegeben werden. Weiterhin bevorzugt ist es, wenn zumindest eines der, vorzugsweise alle, nicht-methylierungspezifischen Restriktionsenzyme Erkennungssequenzen einer Länge von vier Basen schneiden, insbesondere Erkennungssequenzen, welche kein CG enthalten. Durch den Einsatz von Restriktionsenzymen mit Erkennungssequenzen einer Länge von vier Basen wird die Entstehung langer und folglich für die Amplifikation unvorteilhafter Fragmente verhindert bzw. reduziert.Prefers it is when in step c) three different non-methylation-specific restriction enzymes be added. It is further preferred if at least one the, preferably all, non-methylation-specific restriction enzymes Recognition sequences of a length cut of four bases, in particular recognition sequences, which no CG included. Through the use of restriction enzymes with Recognition sequences of a length of four bases, the emergence becomes longer and consequently for the amplification unfavorable fragments prevented or reduced.

Vorteilhafterweise erzeugen zumindest eines der, vorzugsweise alle, nicht methylierungspezifischen Restriktionsenzyme sticky ends, insbesondere sticky ends mit einem TA enthaltenden Überhang. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von nicht methylierungspezifischen Restriktionsenzymen, welche eine Erkennungssequenz von vier Basen zu sticky ends schneiden, wobei alle Restriktionsenzyme gleiche Überhänge erzeugen.advantageously, produce at least one of, preferably all, non-methylation specific Restriction enzymes sticky ends, especially sticky ends with a TA containing overhang. Especially preference is given to the use of non-methylation-specific restriction enzymes, which cut a recognition sequence from four bases to sticky ends, where all restriction enzymes produce equal overhangs.

Es ist aber auch nicht ausgeschlossen, nicht eines oder mehrere nicht methylierungspezifische Restriktionsenzyme, die sticky end erzeugen, in Verbindung mit einem oder mehreren nicht methylierungspezifischen Restriktionsenzymen einzusetzen, die blunt ends erzeugen, da auch eine Ligation von einem Fragment mit einem sticky end mit einem Fragment mit einem blunt end möglich ist.It but is not excluded, not one or more not methylation-specific restriction enzymes that produce sticky end, in conjunction with one or more non-methylation-specific Use restriction enzymes that produce blunt ends, as well a ligation of a fragment with a sticky end with a fragment possible with a blunt end is.

Die nicht methylierungspezifischen Restriktionsenzyme sind vorzugsweise ausgewählt aus zumindest zwei, besser drei, Elementen der Gruppe bestehend aus „MseI, BfaI, Csp6I, Tru1I, Tvu1I, Tru9I, Tvu9I, MaeI und XspI". Besonders bevorzugt ist der Einsatz einer Kombination von MseI, BfaI und Csp6I.The non-methylation-specific restriction enzymes are preferred selected consisting of at least two, better three, elements of the group from "MseI, BfaI, Csp61, Tru1I, Tvu1I, Tru9I, Tvu9I, MaeI and XspI. "Especially preferred is the use of a combination of MseI, BfaI and Csp6I.

Grundsätzlich kann die Stufe c) mit gemeinsamer, i.e. gleichzeitiger, Zugabe aller nicht methylierungspezifischen Restriktions zur Lösung erfolgen. Es ist aber auch möglich, die Restriktionsenzyme im Rahmen der Stufe c) subsequent der Lösung zuzugeben.Basically the step c) with common, i.e. at the same time, adding all non-methylation-specific restriction to the solution. It but it is also possible add the restriction enzymes in step c) subsequent to the solution.

Grundsätzlich ist jedes methylierungsspezifische Restriktionsenzym im Rahmen der Erfindung verwendbar. Vorzugsweise ist das methylierungsspezifische Restriktionsenzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "BstUI, BshI236I, AccII, BstFNI, MvnI, HpaII (HapII), HhaI, AciI, SmaI, HinP1I, HpyCH4IV, EagI und Mischungen aus zwei oder mehr der vorstehenden Enzyme". Bevorzugt ist eine Mischung enthaltend die Restriktionsenzyme BstUI, HpaII, AciI und HinP1I.Basically any methylation-specific restriction enzyme useful in the invention. Preferably, the methylation-specific restriction enzyme selected from the group consisting of "BstUI, BshI236I, AccII, BstFNI, MvnI, HpaII (HapII), HhaI, AciI, SmaI, HinP1I, HpyCH4IV, EagI and mixtures of two or more of the above Enzymes. "Preferred is a mixture containing the restriction enzymes BstUI, HpaII, AciI and HinP1I.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in der Regel auf eine Polynukleinsäure angewandt werden, die eine natürlich vorkommende DNA ist. Dabei kann es sich insbesondere um eine genomische DNA, beispielsweise eine humane genomische DNA, handeln.The inventive method will usually be applied to a polynucleic acid, which is a Naturally occurring DNA is. This may in particular be a genomic DNA, for example a human genomic DNA.

Bevorzugterweise werden in Verfahrensstufe e) Fragmente mit einer Länge im Bereich von 100 Basen bis 1.000 Basen selektiv angereichert. Hierdurch wird die optimale Reduktion der Komplexität erreicht, wobei gleichzeitig dennoch praktisch alle potentiell interessanten Fragmente angereichert werden.preferably, in step e) fragments with a length in the range from 100 bases to 1000 bases selectively enriched. This will achieving the optimal reduction of complexity while being at the same time yet enriched virtually all potentially interesting fragments become.

Die Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zur Untersuchung des Methylierungsmusters einer Polynukleinsäure, insbesondere einer genomischen DNA aus einer Gewebeprobe eines Patienten, mit den folgenden Verfahrensstufen: A) es wird ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 durchgeführt, B) anschließend werden die selektiv angereicherten Fragmente mit einer mittels eines physikalischen Detektionsverfahrens detektierbaren Substanz gekoppelt, C) eine Lösung enthaltend die Fragmente aus Stufe B) wird unter Bedingungen mit einem DNA-Microarray, das eine Mehrzahl von verschiedenen immobilisierten Nukleinsäuren mit jeweils zumindest einer Methylierungsstelle an jeweils zugeordneten verschiedenen Orten auf dem DNA-Microarray trägt, kontaktiert, unter welchen eine Hybridisierung von Fragmenten mit korrelierten immobilisierten Nukleinsäuren unter definierter Stringenz erfolgt, D) optional wird eine Waschverfahrensstufe durchgeführt, E) mittels des physikalischen Detektionsverfahrens werden ortsaufgelöst diejenigen immobilisierten Nukleinsäuren detektiert, an welchen Fragmente aus der Lösung hybridisiert sind.The The invention further relates to a method for the investigation of Methylation pattern of a polynucleic acid, in particular a genomic DNA from a tissue sample of a patient, using the following process steps: A) A method according to any one of claims 1 to 8 is carried out, B) subsequently are the selectively enriched fragments with a by means of a coupled to the physical detection method detectable substance, C) a solution containing the fragments from step B) is under conditions a DNA microarray that immobilized a plurality of different ones nucleic acids each with at least one methylation site to each assigned various locations on the DNA microarray, contacted, among which a hybridization of fragments with correlated immobilized nucleic acids under defined stringency, D) is optionally a washing process stage carried out, E) by means of the physical detection method, those are immobilized in a spatially resolved manner nucleic acids detects to which fragments are hybridized from the solution.

Dabei kann die detektierbare Substanz beispielsweise ein Fluoreszenzfarbstoff sein, wobei das Detektionsverfahren dann ein für die von dem Fluoreszenzfarbstoff emittierte Fluoreszenzstrahlung selektives Scannen (eindimensional oder zweidimensional, je nach Anordnung der verschiedenen immobilisierten Nukleinsäuren auf dem Chip) umfasst. Der Fluoreszenzfarbstoff kann beispielsweise Cy3 und/oder Cy5 sein. Dem Durchschnittsfachmann sind selbstverständlich viele weitere geeignete Fluoreszenzfarbstoffe bekannt.there For example, the detectable substance may be a fluorescent dye be, wherein the detection method then for the of the fluorescent dye emitted fluorescence radiation selective scanning (one-dimensional or two-dimensional, depending on the arrangement of the different immobilized nucleic acids on the chip). The fluorescent dye can, for example Cy3 and / or Cy5. Of course, many will be familiar to one of ordinary skill in the art Other suitable fluorescent dyes known.

Dieses erfindungsgemäße Verfahren kann für verschiedene Zwecke eingesetzt werden. Einerseits kann damit die DMH durchgeführt werden, wozu an anderer Stelle dieser Anmeldung Erläuterungen angebracht sind. Es ist aber auch für diagnostische Zwecke einsetzbar. In letzterem Falle enthalten die immobilisierten Nukleinsäuren beispielsweise Nukleinsäuresequenzen, deren Methylierungsstellen bei Vorliegen einer definierten Erkrankung gegenüber dem Normalzustand nicht methyliert sind. Dann werden hiermit hybridisierende Fragmente der untersuchten DNA indiziell dafür sein, dass die Erkrankung vorliegt, da die Fragmente ausschließlich solche sind, die in der untersuchten DNA nicht methyliert sind. Selbstverständlich kann auch bzw. zusätzlich umgekehrt mit immobilisierten Nukleinsäuren gearbeitet werden, die im Krankheitsfall methyliert sind.This inventive method can for different purposes are used. On the one hand, so can the DMH performed to which explanations are attached elsewhere in this application are. But it is also for can be used for diagnostic purposes. In the latter case, the immobilized nucleic acids for example, nucleic acid sequences, their methylation sites in the presence of a defined disease compared to the Normal state are not methylated. Then are hereby hybridizing Fragments of the DNA studied may be indicative of the disease is present, since the fragments are exclusively those, which in the examined DNA are not methylated. Of course you can also or additionally conversely, working with immobilized nucleic acids, the are methylated in case of illness.

Dann wird durch Nicht-Hybridisierung eine Ausschlussinformation erhalten.Then is obtained by non-hybridization exclusion information.

Anstelle der Diagnose einer Erkrankung kann aber auch festgestellt werde, ob ein Response auf eine bestimmte Therapie erfolgt oder nicht. Dann enthalten die immobilisierten Nukleinsäuren beispielsweise Nukleinsäuresequenzen, deren Methylierungsstellen bei einem non-Responder gegenüber dem Responder nicht methyliert sind. Dann werden hiermit hybridisierende Fragmente der untersuchten DNA indiziell dafür sein, dass der Patient ein non-Responder ist, da die Fragmente ausschließlich solche sind, die in der untersuchten DNA nicht methyliert sind. Folglich kann die betreffende Therapie verworfen werden. Entsprechend umgekehrt kann durch entsprechende Auswahl der immobiliserten Nukleinsäuren auch positiv auf Response geprüft werden. Auch kann die Korrelation Response/non-Response und methyliert/nicht-methyliert umgekehrt den vorstehenden Zusammenhängen sein.Instead of but the diagnosis of a disease can also be determined whether or not there is a response to a particular therapy. Then, the immobilized nucleic acids contain, for example, nucleic acid sequences, their methylation sites in a non-responder compared to Responders are not methylated. Then are hereby hybridizing Fragments of the DNA studied may be indicative of the patient's involvement Non-responder is because the fragments are exclusively those in the examined DNA are not methylated. Consequently, the relevant Therapy discarded. Conversely, by appropriate Selection of immobilized nucleic acids also positive for response checked become. Also, the correlation may be response / non-response and methylated / unmethylated conversely be the above relationships.

Im Rahmen dieser Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das DNA-Microarray grundsätzlich immobiliserte Nukleinsäuren tragen, deren Methylierung oder Nichtmethylierung mit einer Mehrzahl verschiedener definierter Erkrankungen korreliert sind. Dann wird die DNA des Patienten gleichzeitig auf die Mehrzahl der verschiedenen Erkrankungen untersucht. Auf Grund der Komplexität solcher Untersuchungen kann es sich jedoch auch empfehlen, wenn das DNA-Microarray ausschließlich Nukleinsäuren trägt, welche Nukleinsäuresequenzen enthalten, die bei einer einzigen definierten Erkrankung gegenüber dem Normalzustand nicht methyliert oder methyliert sind. Entsprechendes gilt analog im Falle der Prüfung auf Response,in the As part of this variant of the method according to the invention, the DNA microarray can in principle be immobilized nucleic acids carry their methylation or non-methylation with a majority different defined diseases are correlated. Then it will be the patient's DNA simultaneously to the majority of the different Diseases studied. Due to the complexity of such investigations can However, it is also recommended if the DNA microarray carries only nucleic acids which Contain nucleic acid sequences, which in a single defined disease compared to the Normal state not methylated or methylated. The same applies analogously in the case of the test on response,

Anschließend an diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft die Erfindung des Weiteren ein Test-Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit den folgenden Komponenten: i) einer ersten Restriktionsenzymkomponente, welche zumindest zwei verschiedene nicht methylierungspezifische Restriktionsenzyme enthält, ii) einer zweiten Restriktionsenzymkomponente, welche ausschließlich ein methylierungsspezifisches Restriktionsenzym oder mehrere solcher Enzyme umfasst, und iii) einem DNA-Mikroarray, welches eine Mehrzahl von verschiedenen immobilisierten Nukleinsäuren mit jeweils einer Methylierungsstelle an jeweils zugeordneten verschiedenen Orten auf dem DNA-Microarray trägt. Dabei enthalten die Nukleinsäuren zweckmäßigerweise Nukleinsäuresequenzen, die bei einer Mehrzahl von verschiedenen definierten Erkrankungen oder einer einzigen definierten Erkrankung gegenüber dem Normalzustand nicht methyliert oder methyliert sind. Die definierte Erkrankung kann beispielsweise eine spezifische Krebserkrankung sein.Afterwards this variant of the method according to the invention the invention further relates to a test kit for carrying out the inventive method with the following components: i) a first restriction enzyme component, which are at least two different non-methylation-specific Contains restriction enzymes, ii) a second restriction enzyme component which is exclusively a methylation-specific restriction enzyme or more Includes enzymes, and iii) a DNA microarray, which a plurality of different immobilized nucleic acids each having a methylation site each associated with different locations on the DNA microarray carries. there contain the nucleic acids expediently Nucleic acid sequences, the in a plurality of different defined diseases or a single defined disease compared to the normal state methylated or methylated. The defined disease can for example, a specific cancer.

In dem Test-Kit können eine oder mehrere der folgenden Komponenten zusätzlich enthalten sein: i) ein Linker oder mehrere Linker, ggf. in geeigneter Lösung, ii) eine Ligase, ggf. in geeigneter Lösung, iii) Substanzen oder Lösungen zur Durchführung einer PCR, iv) ein Farbstoff oder mehrere Farbstoffe, ggf. mit Kopplungsreagenz, ggf. in Lösung, v) Substanzen oder Lösungen zur Durchführung einer Hybridisie rung, und/oder vi) Substanzen oder Lösungen zur Durchführung einer Waschverfahrensstufe.In the test kit, one or more of the following components may additionally contain: i) a linker or a plurality of linkers, if appropriate in a suitable solution, ii) a ligase, if appropriate in a suitable solution, iii) substances or solutions for carrying out iv) one or more dyes, optionally with coupling reagent, if appropriate in solution, v) substances or solutions for carrying out a hybridization, and / or vi) substances or solutions for carrying out a washing process step.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist aber auch im Rahmen der Discovery von Targets geeignet. Targets sind Proteine oder Enzyme deren Modulation mit definierten Erkrankungen korreliert sind. Mit der Feststellung einer solchen Korrelation kann dann eine Substanz ausgewählt oder geschaffen werden, die das Target oder Target-Vorläufer oder Target-Nachfolger (up-stream oder down-stream des festgestellten Targets in einem biologischen Pathway) so moduliert, dass die krankheitskorrelierte Modulation des Targets aufgehoben wird. Solche Substanzen sind dann zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Prophylaxe oder Therapie der Erkrankung geeignet.The inventive method but is also suitable in the context of the discovery of targets. targets are proteins or enzymes whose modulation with defined diseases are correlated. By establishing such a correlation then a substance can be selected or be created containing the target or target precursor or Target successor (up-stream or down-stream of the detected Targets in a biological pathway) so modulated that the disease-related modulation of the target is canceled. Such substances are then for production pharmaceutical compositions for prophylaxis or therapy suitable for the disease.

Daher betrifft die Erfindung des Weiteren die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung eines indikationsspezifischen Targets, wobei eine erste Lösung mit DNA, welche aus einer Gewebeprobe mit erkranktem Gewebe entstammt, dem erstgenannten erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen wird, wobei eine zweite Lösung mit DNA, welche aus einer zum erkrankten Gewebe benachbarten Gewebeprobe mit gesundem Gewebe gleicher Gewebeart entstammt, ebenfalls dem erstgenannten erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen wird, wobei die erste Lösung und die zweite Lösung gleichzeitig oder nacheinander mit zwei gleichen DNA-Microarrays oder einem einzigen DNA-Microarray kontaktiert und hierauf hybridisiert werden, wobei solche immobilisierten Nukleinsäuren selektiert werden, an welche ausschließlich die Fragmente der ersten Lösung oder der zweiten Lösung hybridisiert sind, und wobei für eine selektierte Nukleinsäure das von dieser selektierten Nukleinsäure codierte Protein, Peptid oder Enzym identifiziert wird. Hierbei wird das DNA-Microarray typischerweise eine Vielzahl verschiedener Klone tragen, die bekannte Methylierungstellen enthalten. Diese sind beispielsweise aus Gendatenbanken erhältlich. Die Herstellung solcher DNA-Microarrays ist dem Fachmann wohl vertraut und braucht daher hier nicht näher erläutert zu werden.Therefore the invention further relates to the use of a method according to the invention for Identification of an indication-specific target, wherein a first solution with DNA, which comes from a tissue sample with diseased tissue, the first-mentioned method according to the invention subjected to a second solution with DNA, which consists of a tissue sample adjacent to the diseased tissue with healthy tissue of the same type of tissue, also subjected to the first-mentioned method according to the invention being, being the first solution and the second solution simultaneously or sequentially with two identical DNA microarrays or a single DNA microarray and hybridized thereto, wherein such immobilized nucleic acids are selected on which exclusively the fragments of the first solution or the second solution hybridizes are, and where for a selected nucleic acid the protein encoded by this selected nucleic acid, peptide or enzyme is identified. In this case, the DNA microarray is typically a Many different clones carry the known methylation sites contain. These are available, for example, from genetic databases. The preparation of such DNA microarrays is well known to those skilled in the art and therefore does not need to be closer explained to become.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist aber auch im Rahmen der Discovery von Responsemarkern geeignet. Responsemarker sind Proteine oder Enzyme, die mit einer Wirkung oder nicht-Wirkung einer spezifischen chemischen Therapie einer definierten Erkrankung korreliert sind. Mit der Feststellung einer solchen Korrelation und deren Analyse bei einem Patienten können dann für eine prospektive Therapie die Erfolgsaussichten festgestellt werden undoder es kann eine patientenspezifische Therapie entwickelt werden durch Ausschluss von therapeutischen Maßnahmen, für welche der Patient ein non-Responder ist.The inventive method is also suitable for the discovery of response markers. Response markers are proteins or enzymes that have an effect or non-effect a specific chemical therapy of a defined disease are correlated. By establishing such a correlation and their analysis in a patient can then for a prospective therapy the Chances of success are determined and or it may be a patient-specific one Therapy be developed by excluding therapeutic Activities, for which the patient is a non-responder.

Daher betrifft die Erfindung des Weiteren die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung eines Responsemarkers, wobei eine erste Lösung mit DNA, welche aus einer Gewebeprobe mit Gewebe aus einem non-Responder entstammt, einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 unterworfen wird, wobei eine zweite Lösung mit DNA, welche aus einer Gewebeprobe gleicher Gewebeart jedoch von einem Responder entstammt, einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 unterworfen wird, wobei die erste Lösung und die zweite Lösung gleichzeitig oder nacheinander mit dem DNA-Microarray kontaktiert und hierauf hybridisiert werden, wobei solche immobilisierten Nukleinsäuren selektiert werden, an welche ausschließlich die Fragmente der ersten Lösung oder der zweiten Lösung hybridisiert oder nicht hybridisiert sind, und wobei für eine selektierte Nukleinsäure das von dieser selektierten Nukleinsäure codierte Protein, Peptid oder Enzym identifiziert wird.Therefore the invention further relates to the use of a method according to the invention for Identification of a response marker, using a first solution DNA derived from a tissue sample with tissue from a non-responder, a method according to any one of claims 1 to 8 is subjected, wherein a second solution with However, DNA, which from a tissue sample of the same tissue type of a responder, a method according to any one of claims 1 to 8, the first solution and the second solution being simultaneously or contacted sequentially with the DNA microarray and then on be hybridized, wherein such immobilized nucleic acids selected to which exclusively the Fragments of the first solution or the second solution hybridized or unhybridized, and wherein for a selected nucleic acid the protein, peptide or protein encoded by this selected nucleic acid Enzyme is identified.

Im Rahmen des vorstehenden Verfahrens zur Discovery eines Targets kann des Weiteren ein bekannter Modulator des vorstehend ermittelten codierten Proteins, Peptids oder Enzyms der spezifischen Indikation des erkrankten Gewebes zugeordnet werden. Daher umfasst die Erfindung auch die Verwendung eines mit einem solchen Verfahren zugeordneten Modulators zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit der spezifischen Indikation, insbesondere einer spezifischen Krebsindikation.in the Under the above method for the discovery of a target can Furthermore, a known modulator of the above-determined coded protein, peptide or enzyme of specific indication be associated with the diseased tissue. Therefore, the invention includes also the use of one associated with such a method Modulator for the preparation of a pharmaceutical composition with the specific indication, in particular a specific cancer indication.

Für die USA betrifft die Erfindung schließlich die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens oder eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Diagnose einer Erkrankung, insbesondere einer Krebserkrankung. Hierbei wird einem Patienten eine Gewebeprobe entnommen, welche dann in fachüblicher Weise aufbereitet und mittels des Testkits dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen wird.For the USA Finally, the invention relates to the Use of a method according to the invention or a test kit according to the invention for the diagnosis of a disease, in particular a cancer. In this case, a tissue sample is taken from a patient, which then in usual practice Manned manner and means of the test kit the method of the invention is subjected.

Definitionendefinitions

Der Begriff der Behandlung umfasst auch die Prophylaxe sowie die Nachbehandlung (z.B. bei nicht mehr detektierbarem Tumor oder bei stabilem Tumor). Der Begriff der Prophylaxe umfasst im Zusammenhang mit der Detektion auch die Vorsorgeuntersuchung. Die Begriffe der Detektion bzw. Diagnose und/oder der Behandlung bzw. Therapie einer Krebserkrankung umfassen optional auch die Detektion und/oder Behandlung von Metastasen aus Primärtumoren in sonstigen GewebenOf the Concept of treatment also includes prophylaxis and post-treatment (e.g., no longer detectable tumor or stable tumor). The term prophylaxis includes in connection with the detection also the check-up. The terms of detection or diagnosis and / or the treatment or therapy of a cancer include optional also the detection and / or treatment of metastases from primary tumors in other tissues

Geeignete Targets bzw. für geeignete Targets codierende Nukleinsäuresequenzen sind den in der Beschreibung angegebenen Literaturstellen entnehmbar.Suitable targets or for suitable tar gets coding nucleic acid sequences are the literature references given in the description.

Die Amplifikation eines Fragments einer Polynukleinsäure kann beispielsweise mittels der PCR Technologie durchgeführt werden. Zu den experimentellen Details wird beispielsweise auf die Literaturstelle WO2003/087774 verwiesen.The Amplification of a fragment of a polynucleic acid can, for example, by means of performed the PCR technology become. For example, the experimental details are based on the Reference WO2003 / 087774 referenced.

Zur Definition eines linkers sowie dessen Aufbau und Struktur wird ebenfalls auf die Literaturstelle WO2003/087774 verwiesen.to Definition of a linker as well as its structure and structure will also be to the document WO2003 / 087774 referenced.

Methylierungsspezifische Restriktionsenzyme sind Enzyme, welche eine Nukleinsäuresequenz schneiden, wenn die Erkennungsstelle nicht methyliert oder hemimethyliert ist. Ist die Erkennungsstelle dagegen methyliert, erfolgt der Schnitt nicht oder mit verringerter Effizienz. Bevorzugt sind methylierungsspezifische Restriktionsenzyme, deren Erkennungssequenz ein cg Dinukleotid enthält (beispielsweise cgcg oder cccggg) und nicht schneiden, wenn das Cytosin in diesem Dinukleotid am Kohlenstoffatom C5 methyliert ist. Die Erkennungssequenz ist vorzugsweise 4 bis 6 Basenpaare lang und bei dem Restriktionsenzym handelt es sich dann um einen Vierer-Cutter oder Sechser-Cutter.methylation Specific Restriction enzymes are enzymes that cut a nucleic acid sequence, if the recognition site is not methylated or hemimethylated. However, if the recognition site is methylated, the cut is made not or with reduced efficiency. Preference is given to methylation-specific Restriction enzymes whose recognition sequence contains a cg dinucleotide (for example cgcg or cccggg) and do not cut if the cytosine in this dinucleotide is methylated at the carbon atom C5. The recognition sequence is preferably 4 to 6 base pairs in length and in the restriction enzyme is it then a four-cutter or six-cutter.

Nicht-methylierungsspezifische Restriktionsenzyme sind Restriktionsenzyme, welche eine Nukleinsäuresequenz unabhängig von dem Methylierungsstatus mit nahezu gleicher Effizienz schneiden.Non-methylation-specific Restriction enzymes are restriction enzymes which are a nucleic acid sequence independently from the methylation state with almost the same efficiency.

Ein Restriktionsenzym erzeugt beim Schnitt ein blunt end, wenn der Doppelstrang der geschnittenen Nukleinsäure bei exakt einander gegenüberliegenden, bezogen auf den Doppelstrang, Schnittstellen geschnitten wird. Ein Restriktionsenzym erzeugt beim Schnitt ein sticky end, wenn der Doppelstrang der geschnittenen Nukleinsäure nicht bei exakt einander gegenüberliegenden, bezogen auf den Doppelstrang, Schnittstellen geschnitten wird, sondern bei einem Strang des Doppelstranges einen Überhang entstehen läßt.One Restriction enzyme produces a blunt end when cut when the duplex the cut nucleic acid at exactly opposite, based on the double strand, interfaces is cut. One Restriction enzyme produces a sticky end when cut Double strand of cut nucleic acid not at exactly each other opposite, based on the double strand, interfaces is cut, but at One strand of the double strand gives rise to an overhang.

Ein Methylierungsmuster einer Polynukleinsäure bezeichnet die Charakterisierung der Nukleinsäuresequenz dahingehend, welche methylierbaren Nukleotide methyliert sind und welche methylierbaren Nukleotide nicht methyliert sind. Ein Methylierungsmuster kann für definierte Teilbereiche der Polynukleinsäure oder für die gesamte Polynukleinsäure bestimmt sein.One Methylation pattern of a polynucleic acid refers to the characterization the nucleic acid sequence as to which methylatable nucleotides are methylated and which methylatable nucleotides are not methylated. A methylation pattern can for defined portions of the polynucleic acid or for the entire polynucleic acid determined be.

Ein Testkit bezeichnet ein Konvolut von zumindest einer chemischen, biologischen und/oder physikalischen Kitkomponente zusammen mit einer Anleitung bzw. Beschreibung, worin angegeben ist, für die Detektion welcher Erkrankung das Testkit bestimmt ist. Im Rahmen eines Testkits können auch Standardreagenzien und/oder Standardkurven in beliebiger Form (gedruckt, auf Datenträger gespeichert, Link zu einer Datenbank) enthalten sein.One Testkit means a bundle of at least one chemical, biological and / or physical kit component together with a guide or description, wherein indicated, for the detection which disease the test kit is intended for. As part of a test kit can also standard reagents and / or standard curves in any form (printed, on disk stored, link to a database).

Ein DNA-Microarray ist ein beliebiges Konstrukt mit einem Substrat bzw. Träger, auf oder in welchem verschiedene Nukleinsäurespezies, wie Gene, Genfragmente, oder sonstige Oligonukleotide oder Polynukleotide, jeweils an unterschiedlichen definierten und den jeweiligen Nukleinsäurenspezies zugeordneten Orten angeordnet sind. Hierbei ist an jeweils einem Ort eine Nukleinsäurespezies angeordnet, es kann aber auch an jeweils einem Ort ein definiertes Gemisch verschiedener Nukleinsäurespezies angeordnet sein, wobei dann jeder Ort ein anderes Gemisch trägt. Dabei können die Nukleinsäuren immobilisiert sein, dies ist aber nicht zwingend notwendig, je nach verwendetem Substrat bzw. Träger. Nicht beschränkende Beispiele für Microarrays sind: Nukleinsäure-Chips, Gen-Chips, Microtiterplatten mit Nukleinsäurelösungen in den Wells, wobei die Nukleinsäuren immobilisiert oder nicht immobilisiert sein können, und Membranen mit darauf immobilisierten Nukleinsäuren.One DNA microarray is any construct with a substrate or Carrier, on or in which different nucleic acid species, such as genes, gene fragments, or other oligonucleotides or polynucleotides, each at different defined and assigned to the respective nucleic acid species locations are arranged. Here, one nucleic acid species is in each case at one location arranged, but it can also in each case a defined one Mixture of different nucleic acid species arranged be, where then every place carries a different mixture. there can the nucleic acids be immobilized, but this is not mandatory, depending on used substrate or carrier. Non-limiting examples for Microarrays are: nucleic acid chips, Gene chips, microtiter plates with nucleic acid solutions in the wells, wherein the nucleic acids immobilized or not immobilized, and membranes with thereon immobilized nucleic acids.

Als Modulator eines Targets ist eine Verbindung oder Substanz bezeichnet, welche entweder die Bildung des Targets inhibiert oder induziert, oder gebildetes Target in der Aktivität reduziert oder aktiviert, bezogen auf die in vitro oder in vivo Aktivität in Abwesenheit der Substanz. Insofern kann ein Modulator einerseits eine Substanz sein, welche in der Entstehungskaskade des Targets modulierend eingreift. Auf der anderen Seite kann ein Modulator eine Substanz sein, welche mit gebildetem Target eine Bindung eingeht, und zwar dergestalt, dass weitere physiologische Wechselwirkungen mit endogenen Substanzen zumindest reduziert oder erhöht sind. Als Modulatoren können auch Moleküle dienen, welche die Transkription des Zielgens beeinflussen und inhibieren oder aktivieren. Solche Moleküle können beispielsweise Polyamide oder Zinkfingerproteine sein, die durch Bindung an DNA-Regionen der basalen Transkriptionsmaschinerie die Transkription verhindern. Die Transkription kann indirekt auch über die Inhibierung von Transkriptionsfaktoren geschehen, die für die Transkription des Zielgens essentiell sind. Die Inhibierung solcher Transkriptionsfaktoren kann über die Bindung an sogenannte Decoy-Rptamere gewährleistet werden.When Modulator of a target is called a compound or substance, which either inhibits or induces the formation of the target, or reduced or activated target formed in the activity, based on in vitro or in vivo activity in the absence of the substance. In this respect, a modulator on the one hand be a substance which modulating in the creation cascade of the target. On on the other hand, a modulator can be a substance which binds with formed target, in such a way, that further physiological interactions with endogenous substances at least reduced or increased are. As modulators can also molecules serve, which influence and inhibit the transcription of the target gene or activate. Such molecules can For example, be polyamides or zinc finger proteins by Binding to DNA regions of the basal transcriptional machinery Prevent transcription. Transcription can also indirectly via the Inhibition of transcription factors done for transcription of the target gene are essential. The inhibition of such transcription factors can over the Binding to so-called decoy Rptamere be guaranteed.

Modulatoren können natürliche oder synthetische Moleküle sein, die spezifisch an ein Target oder einen Target-Vorläufer oder Target-Nachfolger binden. Es kann sich auch um targetspezifische Antikörper handeln, beispielsweise humane, humanisierte und nicht-humanisierte polyklonale oder monoklonale Antikörper. Der Begriff des Antikörpers umfasst desweiteren Phage-Display-Antikörper, Ribozym-Display Antikörper (kovalente Fusion zwischen RNA und Protein) und RNA-Display Antikörper (in vitro hergestellt). Der Begriff umfasst auch Antikörper, welche durch Chimerisierung, Humanisierung oder De-Immunisierung modifiziert sind, sowie spezifische Fragmente der leichten und/oder der schweren Kette des variablen Bereiches zu Grunde liegender Antikörper vorstehender Art. Die Herstellung bzw. Gewinnung solcher Antikörper mit vorgegebenen Immunogenen ist dem Durchschnittsfachmann wohl vertraut und braucht nicht näher erläutert zu werden. Weiterhin umfaßt sind bispezifische Antikörper, welche einerseits an ein Auslösemolekül einer Immun-Effektorzelle (z.B. CD3, CD16, CD64) und andererseits an ein Antigen der Tumorzielzelle binden. Dies bewirkt letzendlich im Bindungsfall, daß beispielsweise eine Tumorzelle getötet wird. Modulatoren können beispielsweise auch geeignete targetspezifische Anticaline und Affibodies sein, die einen Antikörper mimikrieren.Modulators may be natural or synthetic molecules that specifically bind to a target or target precursor or target follower. They may also be target-specific antibodies, for example human, humanized and non-humanized polyclonal or monoclonal antibodies. The term antibody also includes phage display antibody, ribo zym-display antibody (covalent fusion between RNA and protein) and RNA-display antibody (produced in vitro). The term also includes antibodies modified by chimerization, humanization, or de-immunization, as well as specific light and / or heavy chain variable region heavy chain fragments of the foregoing art. The production or recovery of such antibodies with predetermined immunogens is well known to the average expert and need not be explained in detail. Also included are bispecific antibodies which on the one hand bind to a triggering molecule of an immune effector cell (eg CD3, CD16, CD64) and on the other hand to an antigen of the tumor target cell. This ultimately causes in the case of binding that, for example, a tumor cell is killed. For example, modulators may also be suitable target-specific anticalins and affibodies that mimic an antibody.

Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise erfolgen. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+, K+, Li+ oder Cyclohexylammonium infrage. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen,. Tropfen oder Lösungen zur Injektion (i.v., i.p., i.m., s.c.) oder Vernebelung (Aerosole), transdermale Systeme, sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendeter Modulator in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter Inhibitordosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist.The galenic preparation of a pharmaceutical composition according to the invention can be carried out in the usual way. Suitable counterions for ionic compounds are, for example, Na + , K + , Li + or cyclohexylammonium. Suitable solid or liquid pharmaceutical preparation forms are, for example, granules, powders, dragees, tablets, (micro) capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions. Drops or solutions for injection (iv, ip, im, sc) or nebulization (aerosols), transdermal systems, as well as preparations with protracted release of active ingredient, in the preparation of which conventional auxiliaries such as excipients, blasting, binding, coating, swelling Lubricants or lubricants, flavors, sweeteners and solubilizers. As excipients may be magnesium carbonate, titanium dioxide, lactose, mannitol and other sugars, talc, milk protein, gelatin, starch, cellulose and its derivatives, animal and vegetable oils such as cod liver oil, sunflower, peanut or sesame oil, polyethylene glycols and solvents, such as sterile water and monohydric or polyhydric alcohols, for example glycerol. A pharmaceutical composition according to the invention can be prepared by mixing at least one modulator used according to the invention in a defined dose with a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable carrier and optionally further suitable active ingredients, additives or excipients with a defined inhibitor dose and preparing it to the desired dosage form.

Eine spezifische Krebserkrankung kann eine organspezifische Krebserkrankung, wie beispielsweise Lungenkrebs, Ovarkrebs, Hodenkrebs, Prostatakrebs, Pankreaskrebs, Krebs eines Organs des Verdauungstraktes, usw. sein. Geeignete Sequenzen im Rahmen aller Aspekte der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise in den Literaturstellen DE 20121979 U1 , DE 20121978 U1 , DE 20121977 U1 , DE 20121975 U1 , DE 20121974 U1 , DE 20121973 U1 , DE 20121972 U1 , DE 20121971 U1 , DE 20121970 U1 , DE 20121969 U1 , DE 20121968 U1 , DE 20121967 U1 , DE 20121966 U1 , DE 20121965 U1 , DE 20121964 U1 , DE 20121963 U1 , DE 20121961 U1 , DE 20121960 U1 , DE 10019173 A1 , DE 10019058 A1 , DE 10013847 A1 , DE 10032529 A1 , DE 10054974 A1 , DE 10043826 A1 , DE 10054972 A1 , DE 10037769 A1 , DE 10061338 A1 , DE 10245779 A1 , DE 10164501 A1 , DE 10161625 A1 , DE 10230692 , DE 10255104 , EP 1268855 , EP 1283905 , EP 1268857 , EP 1294947 , EP 1370685 , EP 1395686 , EP 1421220 , EP 1451354 , EP 1458893 , EP 1340818 , EP 1399589 , EP 1478784 , WO 2004/035803, und WO 2005/001141 beschrieben, auf welche hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.A specific cancer can be an organ specific cancer such as lung cancer, ovarian cancer, testicular cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, digestive tract cancer, etc. Suitable sequences within the scope of all aspects of the present invention are, for example, in the literature DE 20121979 U1 . DE 20121978 U1 . DE 20121977 U1 . DE 20121975 U1 . DE 20121974 U1 . DE 20121973 U1 . DE 20121972 U1 . DE 20121971 U1 . DE 20121970 U1 . DE 20121969 U1 . DE 20121968 U1 . DE 20121967 U1 . DE 20121966 U1 . DE 20121965 U1 . DE 20121964 U1 . DE 20121963 U1 . DE 20121961 U1 . DE 20121960 U1 . DE 10019173 A1 . DE 10019058 A1 . DE 10013847 A1 . DE 10032529 A1 . DE 10054974 A1 . DE 10043826 A1 . DE 10054972 A1 . DE 10037769 A1 . DE 10061338 A1 . DE 10245779 A1 . DE 10164501 A1 . DE 10161625 A1 . DE 10230692 . DE 10255104 . EP 1268855 . EP 1283905 . EP 1268857 . EP 1294947 . EP 1370685 . EP 1395686 . EP 1421220 . EP 1451354 . EP 1458893 . EP 1340818 . EP 1399589 . EP 1478784 WO 2004/035803 and WO 2005/001141, to which reference is hereby expressly made.

Responsemarker sind Proteine oder Enzyme, die mit der zellulären Antwort einer Zelle auf eine exogene Substanz, insbesondere einer therapeutischen Substanz korreliert sind. Verschiedene Patienten reagieren verschieden auf eine spezifische Therapie. Dies beruht auf patientenindividuelle zelluläre Reaktionen auf eine therapeutische Substanz.response marker are proteins or enzymes that interfere with the cellular response of a cell an exogenous substance, especially a therapeutic substance are correlated. Different patients react differently a specific therapy. This is based on patient-individual cellular reactions to a therapeutic substance.

Durch differentielle Analyse von gleichen Geweben verschiedener Personen, wobei die Personen die gleiche Erkrankung erleiden und mit der gleichen Therapie behandelt werden, jedoch unterschiedlich auf die Therapie ansprechen, können solche Responsemarker identifiziert werden, wobei einerseits das (differentielle) Vorhandensein eines Proteins oder Enzyms aber auch dessen Fehlen es als Responsemarker qualifiziert.By differential analysis of the same tissues of different persons, whereby the persons suffer the same illness and with the same therapy treated, but respond differently to therapy, can Such response markers are identified, on the one hand the (differential) presence of a protein or enzyme as well whose absence qualifies it as a response marker.

BeispieleExamples

Beispiel 1: Herstellung zweier Lösungen mit jeweils einer genomischen DNA aus zwei benachbarten Gewebeproben eines Patienten.Example 1: Preparation two solutions each with a genomic DNA from two adjacent tissue samples a patient.

Proben von Tumorgewebe und benachbartem nicht-neoplastischem Gewebe werden von Patienten erhalten, die einer Mastektomie unterworfen wurden. Die genomische DNA aus diesen Geweben wird jeweils mit Hilfe des QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) isoliert unter Befolgung der Herstellervorschriften. Man erhält zwei Präparationen, eine mit genomischer DNA aus krankem Gewebe und eine mit genomischer DNA aus gesundem Gewebe.rehearse of tumor tissue and adjacent non-neoplastic tissue are from patients received, which were subjected to a mastectomy. The genomic DNA from these tissues is each using the QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) isolated in accordance with the manufacturer's instructions. You get two preparations, one with genomic DNA from diseased tissue and one with genomic DNA DNA from healthy tissue.

Beispiel 2: Herstellung eines DNA-Microarrays mit CpG-reichen DNA Fragmenten.Example 2: Preparation a DNA microarray with CpG-rich DNA fragments.

Ein DNA-Microarray wird gemäß den Vorschriften der Literaturstelle Yan et al., Cancer Res., 61: 8375–8380 (2001) hergestellt.One DNA microarray is made according to regulations the reference Yan et al., Cancer Res., 61: 8375-8380 (2001) produced.

Beispiel 3: Herstellung von zwei Lösungen mit Fragmenten der jeweiligen DNA Proben aus Beispiel 1.Example 3: Production of two solutions with fragments of the respective DNA samples from Example 1.

Jeweils 2 μg der genomischen DNA der Präparationen aus Beispiel 1 werden zunächst mit je 5 units der nicht methylierungsspezifischen Restriktionsenzyme MseI, BfaI und Csp6I (erhältlich von New England Biolab und MBI Fermenters) für 16 Stunden bei 37°C entsprechend den Herstellervorschriften fragmentiert. Dann werden diese Restriktionsenzyme bei 65°C für 20 Minuten inaktiviert.Each 2 μg of genomic DNA of the preparations from Example 1 are first each with 5 units of non-methylation-specific restriction enzymes MseI, BfaI and Csp6I (available from New England Biolab and MBI Fermenters) for 16 hours at 37 ° C the manufacturer's instructions fragmented. Then these restriction enzymes become involved 65 ° C for 20 minutes inactivated.

Hiernach wird mit Hilfe des QuiaQuick PCR-Produktaufreinigungssäulensets (Qiagen, Hilden, Germany) aufgereinigt. Dabei werden Fragmente kürzer als 100 Basen abgetrennt. Dann wird in Anlehnung an die Vorgehensweise der Literaturstelle Huang et al., Hum Mol Genet, 8(3): 459–470 (1999) eine Ligation von Adaptern durchgeführt. Hierzu sind verschiedene Modifikationen des ursprünglichen Protokolls möglich, die folgend beschrieben werden. Für die Ligation wird die fragmentierte DNA mit 500 pmol Adapter, 400 units T4 DNA Ligase (New England Biolabs), dem vom Hersteller empfohlenen Volumen Ligase 10 × Puffer und ATP gemischt und für 16 Stunden bei 16°C inkubiert. Die Adapter werden zuvor hergestellt indem ein äquimolares Gemisch der Oligonucleotide H24 (5'-AGG CAA CTG TGC TAT CCG AGG GAT-3') und H12-M (5'-CGA TCC CTC GGA-3') zunächst für 5 min bei 95°C denaturiert und dann schrittweise auf 25°C abgekühlt werden. Die ligierte DNA wird schließlich mit Hilfe des QuiaQuick PCR-Produktaufreinigungssäulensets (Qiagen, Hilden, Germany) aufgereinigt.hereafter Using the QuiaQuick PCR product purification column set (Qiagen, Hilden, Germany). Fragments become shorter than 100 bases separated. Then it is based on the procedure Huang et al., Hum Mol Genet. 8 (3): 459-470 (1999) Ligation performed by adapters. There are several modifications to the original protocol possible, which will be described below. For the ligation, the fragmented DNA with 500 pmol adapter, 400 units of T4 DNA ligase (New England Biolabs), the manufacturer's recommended volume of ligase 10x buffer and ATP mixed and for 16 hours at 16 ° C incubated. The adapters are previously made by an equimolar Blend the oligonucleotides H24 (5'-AGG CAA CTG TGC TAT CCG AGG GAT-3 ') and H12-M (5'-CGA TCC CTC GGA-3') first for 5 min at 95 ° C denatured and then gradually cooled to 25 ° C. The ligated DNA finally becomes using the QuiaQuick PCR product purification column set (Qiagen, Hilden, Germany).

Hiernach wird mit je 10 units der methylierungssensitiven Restriktionsenzyme BstU1, Hap II, HpyCH4IV und HinP1 (erhältlich von: New England Biolabs) für 8 Stunden bei 37°C und anschließend für 8 Stunden bei 60°C entsprechend den Angaben des Herstellers fragmentiert.hereafter is used with 10 units each of the methylation-sensitive restriction enzymes BstU1, Hap II, HpyCH4IV and HinP1 (available from: New England Biolabs) for 8 hours at 37 ° C and subsequently for 8 hours at 60 ° C fragmented according to the manufacturer's instructions.

Etwa 10 ng der so erhaltenen Fragmente werden in eine PCR Reaktion eingesetzt, welche gleichzeitig der Amplifikation einer Repräsentation von DNA Fragmenten im Grössenbereich von 100–1000 bp und der Fluoreszenzmarkierung dieser PCR Produkte dient. Der PCR Reaktionsansatz enthält 350 μM dNTPs, 0,7 μl Cy5/Cy3-CTP (Amersham), 2,5 μM Cy5/Cy3 markierter Primer (H24, MWG), 5 units DeepVent (exo-) DNA Polymerase, 10 μl 10x Puffer und 5% DMSO in einem Volumen von 100μl.Approximately 10 ng of the fragments thus obtained are used in a PCR reaction, which simultaneously amplify a representation of DNA fragments in the size range from 100-1000 bp and fluorescent labeling of these PCR products. Of the PCR reaction mixture contains 350 μM dNTPs, 0.7 μl of Cy5 / Cy3-CTP (Amersham), 2.5 μM Cy5 / Cy3 labeled primer (H24, MWG), 5 units of DeepVent (exo-) DNA polymerase, 10 μl 10x Buffer and 5% DMSO in a volume of 100μl.

Man erhält jeweils Proben aus gesundem und aus benachbartem kranken Gewebe, welche zur Hybridisierung mit dem DNA-Microarray aus Beispiel 3 geeignet sind.you receives samples from both healthy and adjacent diseased tissue, which are suitable for hybridization with the DNA microarray of Example 3.

Beispiel 4: Hybridisierung der Proben auf dem DNA-MicroarrayExample 4: Hybridization the samples on the DNA microarray

Die beiden in Beispiel 3 erhaltenen Lösungen werden jeweils mit einem DNA-Microarray gemäß Beispiel 3 hybridisiert. Die Hybridisierung und die Detektion erfolgt entsprechend der Literaturstelle Huang et al., Hum Mol Genet, 8(3): 459–470 (1999). Man erhält zwei Methylierungsmuster, wobei ein Vergleich der beiden Methylierungsmuster Unterschiede zwischen krankem und gesundem Gewebe erkennen läßt. Im Falle der Unterschiede wird der jeweilige Klon des DNA-Microarrays identifiziert und einem Expressionsprodukt zugeordnet. Dieses Expressionsprodukt ist dann bei dem betreffenden Patienten differenziell exprimiert. Bestätigt sich die differenzielle Expression auch im Falle von anderen Patienten mit gleicher Erkrankung und ggf. entsprechenden Zelllinien, dann ist das betreffende Expressionsprodukt ein geeignetes Target zur Suche nach Substanzen, die das Expressionsprodukt hemmen oder induzieren (je nachdem, ob die differentielle Expression „krank"/"gesund" größer oder kleiner als 1 ist).The both solutions obtained in Example 3 are each with a DNA microarray according to example 3 hybridized. The hybridization and the detection takes place accordingly Huang et al., Hum Mol Genet. 8 (3): 459-470 (1999). you receives two methylation patterns, with a comparison of the two methylation patterns Identify differences between diseased and healthy tissue. In the event of the differences, the respective clone of the DNA microarray is identified and a Associated with expression product. This expression product is then differentially expressed in the patient concerned. Confirms the differential expression also in the case of other patients with the same disease and, if appropriate, corresponding cell lines, then the expression product in question is a suitable target for Search for substances that inhibit or induce the expression product (depending on whether the differential expression "ill" / "healthy" greater or less than 1).

Beispiel 5: Vergleich der Fragmentlängenverteilung einer erfindungsgemäß hergestellten Fragmentmischung mit der Fragmentlängenverteilung gemäß dem Stand der Technik.Example 5: Comparison the fragment length distribution of a produced according to the invention Fragment mixture with the fragment length distribution according to the state of the technique.

Es wurde erfindungsgemäß eine Mischung von Fragmenten einer Polynukleinsäure gemäß Beispiel 3, Abschnitt 1, durchgeführt. Zum Vergleich wurde das Verfahren gemäß der Literaturstelle Huang et al., s.o., durchgeführt. Für beiden Fragmentlösungen wurden dann ein Fragmentlängen-Histogramm erstellt.It Was inventively a mixture of Fragments of a polynucleic acid according to example 3, section 1. For comparison, the method according to Huang et al., supra. For both Fragment solutions were then a fragment length histogram is created.

Die Ergebnisse sind in den 1 und 2 dargestellt. In beiden Figuren sind die Fragmentlängenverteilungen für Fragmente ohne methylierungsspezifische Restriktionsstellen mit durchbrochenen Linien gezeigt. Die durchgehenden Linien geben die Fragmentlängenverteilungen für Fragmente mit methylierungspezifischen Restriktionstellen an. Letztere sind für die weitere Analyse besonders interessant. 1 zeigt die Ergebnisse gemäß dem Stand der Technik. 2 zeigt die Ergebnisse gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.The results are in the 1 and 2 shown. Both figures show fragment length distributions for fragments without methylation-specific restriction sites with broken lines. The solid lines indicate the fragment length distributions for fragments having methylation-specific restriction sites. The latter are particularly interesting for further analysis. 1 shows the results according to the prior art. 2 shows the results according to the method of the invention.

Aus einer vergleichenden Betrachtung der 1 und 2 erkennt man, dass beim erfindungsgemäßen Verfahren der Anteil an Fragmenten ohne methylierungsspezifische Restriktionsstellen und einer Fragmentlänge unter 100 bp vergleichsweise hoch ist. Folglich werden durch Abtrennung bzw. nicht-amplifikation solcher kurzen Fragmente besonders die uninteressanten Fragmente eliminiert. Die Komplexität einer erfindungsgemäß hergestellten Fragmentlösung ist daher reduziert in dem Sinne, dass der Anteil an Fragmenten über 100 bp, welche methylierungsspezifische Restriktionsstellen enthalten, erhöht ist. Auf der anderen Seite sind durch das erfindungsgemäße Verfahren die CpG-reichen Regionen, die für die weitere Analyse von Interesse sind, vergleichsweise kürzer geschnitten, wodurch deren Amplifikation und Detektion beachtlich erleichert wird. Zudem ist die Wahrscheinlichkeit, dass alle CpGs in den Fragmenten komethyliert sind, erhöht.From a comparative analysis of the 1 and 2 it can be seen that in the method according to the invention the proportion of fragments without methylation-specific restriction sites and a fragment length below 100 bp is comparatively high. Thus, by separation or non-amplification of such short fragments, particularly the uninteresting fragments are eliminated. The complexity of a fragment solution prepared according to the invention is therefore reduced in the sense that the proportion of fragments above 100 bp, which methylation-specific restriction sites is increased. On the other hand, by the method according to the invention, the CpG-rich regions, which are of interest for the further analysis, cut comparatively shorter, whereby their amplification and detection is considerably facilitated. In addition, the probability that all CpGs in the fragments are methylated is increased.

Claims (22)

Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Fragmenten einer Polynukleinsäure mit den folgenden Verfahrensstufen: a) Es wird eine Lösung enthaltend die Polynukleinsäure hergestellt, b) optional erfolgt eine Aufbereitungsverfahrensstufe, in welcher Substanzen, die keine Polynukleinsäure sind, angereichert werden und/oder die Polynukleinsäure angereichert wird, c) es werden der Lösung zumindest zwei verschiedene nicht-methylierungsspezifische Restriktionsenzyme zugegeben, wobei die Polynukleinsäure an für die Restriktionsenzyme spezifischen Schnittstellen geschnitten wird, d) aus der in Stufe c) erhaltenen Lösung werden Fragmente mit einer Länge von weniger als 50 Basen abgetrennt, e) an die in Stufe d) erhaltenen Fragmente werden Linker ligiert, f) der in Stufe e) erhaltenen Lösung wird dann ein methylierungsspezifisches Restriktionsenzym zugegeben, wobei die Polynukleinsäure an methylierbaren, jedoch nicht methylierten Schnittstellen zu den Fragmenten geschnitten wird, und g) die in Stufe f) erhaltenen Fragmente werden einer Amplifikationsverfahrensstufe unterzogen.Process for the preparation of a mixture of fragments a polynucleic acid with the following process steps: a) It is containing a solution the polynucleic acid produced, b) optionally, a treatment process stage, in which substances that are not polynucleic acid are enriched and / or the polynucleic acid is enriched, c) the solution becomes at least two different ones non-methylation-specific restriction enzymes added, wherein the polynucleic acid on for the restriction enzymes will cut specific interfaces, d) from the solution obtained in step c) become fragments with a length separated from less than 50 bases, e) to those in step d) fragments obtained are ligated linker, f) the in step e) solution obtained then a methylation-specific restriction enzyme is added, where the polynucleic acid at methylatable, but not methylated, interfaces to the fragments is cut, and g) the fragments obtained in step f) are subjected to an amplification process step. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Stufe c) drei verschiedene nicht-methylierungspezifische Restriktionsenzyme zugegeben werden.The method of claim 1, wherein in step c) three various non-methylation-specific restriction enzymes added become. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei zumindest eines der, vorzugsweise alle, nicht-methylierungspezifischen Restriktionsenzyme Erkennungssequenzen einer Länge von vier Basen schneiden, insbesondere Erkennungssequenzen, welche kein CG enthalten.The method of claim 1 or 2, wherein at least one of, preferably all, non-methylation-specific restriction enzymes Recognition sequences of a length cut of four bases, in particular recognition sequences, which no CG included. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei zumindest eines der, vorzugsweise alle, nicht methylierungspezifischen Restriktionsenzyme sticky ends, insbesondere sticky ends mit einem TA enthaltenden Überhang, erzeugen.Method according to one of claims 1 to 3, wherein at least one of, preferably all, non-methylation-specific restriction enzymes sticky ends, in particular sticky ends with a TA-containing overhang, produce. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die nicht methylierungspezifischen Restriktionsenzyme ausgewählt sind aus zumindest zwei Elementen der Gruppe bestehend aus „MseI, BfaI, Csp6I, Tru1I, Tvu1I, Tru9I, Tvu9I, MaeI und XspI".Method according to one of claims 1 to 4, wherein the not methylation-specific restriction enzymes are selected from at least two elements of the group consisting of "MseI, BfaI, Csp6I, Tru1I, Tvu1I, Tru9I, Tvu9I, MaeI and XspI ". Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das methylierung spezifische Restriktionsenzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "BstUI, BshI236I, AccII, BstFNI, MvnI, HpaII (HapII), HhaI, AciI, SmaI, HinP1I, HpyCH4IV, EagI und Mischungen aus zwei oder mehr der vorstehenden Enzyme".Process according to any one of claims 1 to 5, wherein the methylation specific restriction enzyme is selected from the group consisting from "BstUI, BshI236I, AccII, BstFNI, MvnI, HpaII (HapII), HhaI, AciI, SmaI, HinP1I, HpyCH4IV, EagI and mixtures of two or more of the above enzymes ". Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Polynukleinsäure eine natürlich vorkommende DNA, insbesondere eine humane genomische DNA, ist.A method according to any one of claims 1 to 6, wherein the polynucleic acid is a Naturally occurring DNA, especially a human genomic DNA. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei in Verfahrensstufe g) Fragmente mit einer Länge im Bereich von 50 bis 2.000 Basen, vorzugsweise 80 bis 2.000 Basen, höchstvorszugsweise 100 bis 1.000 Basen, insbesondere 100 bis 800 Basen, selektiv angereichert werden.Method according to one of claims 1 to 7, wherein in process stage g) Fragments with a length in the range of 50 to 2,000 bases, preferably 80 to 2,000 bases, höchstvorszugsweise 100 to 1,000 bases, in particular 100 to 800 bases, selectively enriched become. Verfahren zur Untersuchung des Methylierungsmusters einer Polynukleinsäure mit den folgenden Verfahrensstufen: A) Es wird ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 durchgeführt, B) anschließend werden die selektiv angereicherten Fragmente mit einer mittels eines Detektionsverfahrens detektierbaren Substanz gekoppelt, C) eine Lösung enthaltend die Fragmente aus Stufe B) wird unter Bedingungen mit einem DNA-Microarray, das eine Mehrzahl von verschiedenen immobilisierten Nukleinsäuren mit jeweils zumindest einer Methylierungsstelle an jeweils zugeordneten verschiedenen Orten auf dem DNA-Microarray trägt, kontaktiert, unter welchen eine Hybridisierung von Fragmenten mit korrelierten immobilisierten Nukleinsäuren unter definierter Stringenz erfolgt, D) optional wird eine Waschverfahrensstufe durchgeführt, E) mittels des physikalischen Detektionsverfahrens werden ortsaufgelöst diejenigen immobilisierten Nukleinsäuren detektiert, an welchen Fragmente aus der Lösung hybridisiert sind und/oder an welchen Fragmente der Lösung nicht hybridisiert sind.Method for studying the methylation pattern a polynucleic acid with the following process steps: A) It becomes a procedure according to one of claims 1 performed until 8, B) subsequently are the selectively enriched fragments with a by means of a Coupled detection method detectable substance, C) a solution containing the fragments from step B) is under conditions a DNA microarray that immobilized a plurality of different ones nucleic acids each with at least one methylation site to each assigned various locations on the DNA microarray, contacted, among which a hybridization of fragments with correlated immobilized nucleic acids under defined stringency, D) optionally becomes one Washing process stage performed, e) by means of the physical detection method, those are spatially resolved immobilized nucleic acids detects to which fragments are hybridized from the solution and / or on which fragments of the solution are not hybridized. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die detektierbare Substanz ein Fluoreszenzfarbstoff ist, und wobei das Detektionsverfahren ein für die von dem Fluoreszenzfarbstoff emittierte Fluoreszenzstrahlung selektives Scannen umfasst.The method of claim 9, wherein the detectable Substance is a fluorescent dye, and wherein the detection method one for the fluorescent radiation emitted by the fluorescent dye selective Scanning includes. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus „Cy3 und Cy5".The method of claim 10, wherein the fluorescent dye selected is from the group consisting of "Cy3 and Cy5". Verfahrert nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die immobilisierten Nukleinsäuren Nukleinsäuresequenzen enthalten, deren Methylierungsstellen bei Vorliegen einer definierten Erkrankung gegenüber dem Normalzustand nicht methyliert oder methyliert sind.A process according to any one of claims 9 to 11, wherein the immobilized nucleic acids contain nucleic acid sequences whose methylation sites are not methylated in the presence of a defined disease compared to the normal state or me are thylated. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das DNA-Microarray ausschließlich Nukleinsäuren trägt, welche Nukleinsäuresequenzen enthalten, die bei einer einzigen definierten Erkrankung gegenüber dem Normalzustand nicht methyliert oder methyliert sind.A method according to any one of claims 9 to 12, wherein the DNA microarray exclusively nucleic acids wearing, which nucleic acid sequences contained in a single defined disease compared to the Normal state not methylated or methylated. Test-Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 mit den folgenden Komponenten: einer ersten Restriktionsenzymkomponente, welche zumindest zwei verschiedene nicht methylierungspezifische Restriktionsenzyme enthält, einer zweiten Restriktionsenzymkomponente, welche ausschließlich ein methylierungsspezifisches Restriktionsenzym oder mehrere solcher Enzyme umfasst, und einem DNA-Microarray, welches eine Mehrzahl von verschiedenen immobilisierten Nukleinsäuren mit jeweils einer Methylierungsstelle an jeweils zugeordneten verschiedenen Orten auf dem DNA-Microarray trägt.Test kit for performing a procedure according to one of the claims 1 to 13 with the following components: a first restriction enzyme component, which are at least two different non-methylation-specific Contains restriction enzymes, one second restriction enzyme component which exclusively contains methylation-specific restriction enzyme or more Includes enzymes, and a DNA microarray, which is a plurality of different immobilized nucleic acids each having a methylation site at each assigned different locations on the DNA microarray carries. Test-Kit nach Anspruch 14, wobei die Nukleinsäuren Nukleinsäuresequenzen enthalten, die bei einer einzigen definierten Erkrankung gegenüber dem Normalzustand nicht methyliert oder methyliert sind.A test kit according to claim 14, wherein the nucleic acids are nucleic acid sequences contained in a single defined disease compared to the Normal state not methylated or methylated. Test-Kit nach Anspruch 15, wobei die Erkrankung eine spezifische Krebserkrankung ist.The test kit of claim 15, wherein the disease is a specific cancer. Test-Kit nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei eine oder mehrere der folgenden Komponenten zusätzlich enthalten ist: ein Linker oder mehrere Linker, ggf. in geeigneter Lösung, eine Ligase, ggf. in geeigneter Lösung, Substanzen oder Lösungen zur Durchführung einer PCR, ein Farbstoff oder mehrere Farbstoffe, ggf. mit Kopplungsreagenz, ggf. in Lösung, Substanzen oder Lösungen zur Durchführung einer Hybridisierung, und/oder Substanzen oder Lösungen zur Durchführung einer Waschverfahrensstufe.A test kit according to any one of claims 13 to 15, wherein one or more of the following components are included: one Left or more linkers, if appropriate in a suitable solution, a ligase, possibly in a suitable solution, substances or solutions to carry out a PCR, one or more dyes, if necessary with Coupling reagent, if necessary in solution, substances or solutions to carry out a hybridization, and / or Substances or solutions for execution a washing process step. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 11 zur Identifizierung eines indikationsspezifischen Targets, wobei eine erste Lösung mit DNA, welche aus einer Gewebeprobe mit erkranktem Gewebe entstammt, einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 unterworfen wird, wobei eine zweite Lösung mit DNA, welche aus einer zum erkrankten Gewebe benachbarten Gewebeprobe mit gesundem Gewebe gleicher Gewebeart entstammt, einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 unterworfen wird, wobei die erste Lösung und die zweite Lösung gleichzeitig oder nacheinander mit dem DNA-Microarray kontaktiert und hierauf hybridisiert werden, wobei solche immobilisierten Nukleinsäuren selektiert werden, an welche ausschließlich die Fragmente der ersten Lösung oder der zweiten Lösung hybridisiert oder nicht hybridisiert sind, und wobei für eine selektierte Nukleinsäure das von dieser selektierten Nukleinsäure codierte Protein, Peptid oder Enzym identifiziert wird.Use of a method according to any one of claims 9 to 11 for identifying a indication-specific targets, in which a first solution with DNA, which originates from a tissue sample with diseased tissue, a Method according to one of the claims 1 to 8 is subjected, wherein a second solution with DNA, which consists of a tissue sample adjacent to the diseased tissue derived from healthy tissue of the same tissue type, a process according to one of claims 1 is subjected to 8, wherein the first solution and the second solution are simultaneous or contacted sequentially with the DNA microarray and then hybridized, where such immobilized nucleic acids are selected, to which only the fragments of the first solution or the second solution hybridized or unhybridized, and where for a selected nucleic acid the protein, peptide or protein encoded by this selected nucleic acid Enzyme is identified. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 11 zur Identifizierung eines Responsemarkers, wobei eine erste Lösung mit DNA, welche aus einer Gewebeprobe mit Gewebe aus einem non-Responder entstammt, einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 unterworfen wird, wobei eine zweite Lösung mit DNA, welche aus einer Gewebeprobe gleicher Gewebeart jedoch von einem Responder entstammt, einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 unterworfen wird, wobei die erste Lösung und die zweite Lösung gleichzeitig oder nacheinander mit dem DNA-Microarray kontaktiert und hierauf hybridisiert werden, wobei solche immobilisierten Nukleinsäuren selektiert werden, an welche ausschließlich die Fragmente der ersten Lösung oder der zweiten Lösung hybridisiert oder nicht hybridisiert sind, und wobei für eine selektierte Nukleinsäure das von dieser selektierten Nukleinsäure codierte Protein, Peptid oder Enzym identifiziert wird.Use of a method according to any one of claims 9 to 11 for identifying a response marker, being a first solution with DNA, which consists of a tissue sample with tissue from a non-responder is subjected to a method according to one of claims 1 to 8, in which a second solution with DNA, which from a tissue sample of the same tissue type, however originated from a responder, a method according to any one of claims 1 to 8 is subjected wherein the first solution and the second solution are simultaneous or contacted sequentially with the DNA microarray and then hybridized, where such immobilized nucleic acids are selected, to which only the fragments of the first solution or the second solution hybridized or unhybridized, and where for a selected nucleic acid the protein, peptide or protein encoded by this selected nucleic acid Enzyme is identified. Verwendung nach Anspruch 18, wobei ein an sich bekannter Modulator des codierten Proteins, Peptids oder Enzyms der spezifischen Indikation des erkrankten Gewebes zugeordnet wird.Use according to claim 18, wherein one known per se Modulator of the specific protein, peptide or enzyme encoded Indication of the diseased tissue is assigned. Verwendung eines mit einem Verfahren nach Anspruch 20 zugeordneten Modulators zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit der spezifischen Indikation, insbesondere einer spezifischen Krebsindikation.Use of a method according to claim 20 associated modulator for producing a pharmaceutical Composition with the specific indication, in particular one specific cancer indication. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 13 oder eines Test-Kits nach einem der Ansprüche 14 bis 17 zur Diagnose einer Erkrankung, insbesondere einer Krebserkrankung.Use of a method according to any one of claims 9 to 13 or a test kit according to any one of claims 14 to 17 for diagnosis a disease, especially a cancer.
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