DE102005011979B4

DE102005011979B4 - microscope

Info

Publication number: DE102005011979B4
Application number: DE200510011979
Authority: DE
Inventors: Ralf KRÜGER
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2005-03-14
Filing date: 2005-03-14
Publication date: 2010-05-12
Anticipated expiration: 2025-03-15
Also published as: DE102005011979A1; WO2006097070A1

Abstract

Mikroskop, insbesondere zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe, mit einer Lichtquelle (3), einem im Beleuchtungsstrahlengang (1) angeordneten x-y-Scanner (8) und einem Objektiv, wobei sowohl Beleuchtungslicht (7) als auch Detektionslicht durch das Objektiv geführt werden, wobei das einfallende Beleuchtungslicht (7) in der Ebene der Objektivpupille einen Fokus aufweist, wobei die Objektivpupille im Verlauf des Scannens durch Aneinanderreihung einzelner Beleuchtungspunkte zweidimensional, vorzugsweise ringförmig, beleuchtet wird, und wobei an der Probe oder an einer Probenabdeckung vorzugsweise totalreflektiertes Beleuchtungslicht (Reflexionslicht) (9) in den Beleuchtungsstrahlengang (1) zurückkehrt, dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang (1) der Ausprägung des Reflexionslichts (9) angepasste Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts (9) vom Beleuchtungslicht (7) und zum Ableiten des Reflexionslichts (9) in eine Lichtfalle (12) vorgesehen sind und dass die Mittel den x-y-Scanner (8) umfassen, der das an der optischen Achse gespiegelte Reflexionslicht (9) mit einem Winkelversatz (10) gegenüber dem Beleuchtungslicht (7) in einen Reflexionsstrahlengang (2) ablenkt.Microscope, in particular for the evanescent illumination of a sample, comprising a light source (3), an xy scanner (8) arranged in the illumination beam path (1) and an objective, both illuminating light (7) and detection light being passed through the objective, wherein the incident illuminating light (7) in the plane of the objective pupil has a focus, wherein the objective pupil is illuminated in the course of the scanning by juxtaposition of individual illumination points two-dimensional, preferably annular, and wherein on the sample or on a sample cover preferably totally reflected illumination light (reflection light) (9 ) in the illumination beam path (1), characterized in that in the illumination beam path (1) the expression of the reflection light (9) adapted means for spatially separating the reflection light (9) from the illumination light (7) and for deriving the reflection light (9) in a Light trap (12) are provided and that d The means comprise the x-y scanner (8), which deflects the reflection light (9) mirrored on the optical axis with an angular offset (10) relative to the illumination light (7) into a reflection beam path (2).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskop, insbesondere zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe, mit einer Lichtquelle, einem im Beleuchtungsstrahlengang angeordneten x-y-Scanner und einem Objektiv, wobei sowohl Beleuchtungslicht als auch Detektionslicht durch das Objektiv geführt werden, wobei das einfallende Beleuchtungslicht in der Ebene der Objektivpupille einen Fokus aufweist, wobei die Objektivpupille im Verlauf des Scannens durch Aneinanderreihung einzelner Beleuchtungspunkte zweidimensional, vorzugsweise ringförmig, beleuchtet wird, und wobei an der Probe oder an einer Probenabdeckung vorzugsweise totalreflektiertes Beleuchtungslicht (Reflexionslicht) in den Beleuchtungsstrahlengang zurückkehrt.The The present invention relates to a microscope, in particular for evanescent Illumination of a sample, with a light source, one in the illumination beam path arranged x-y scanner and a lens, wherein both illumination light as well as detection light are passed through the lens, wherein the incident Illuminating light has a focus in the plane of the objective pupil, wherein the lens pupil in the course of the scanning by juxtaposing individual illumination points two-dimensional, preferably annular, illuminated and, preferably, on the sample or on a sample cover totally reflected illumination light (reflection light) in the illumination beam path returns.

Bei der Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie wird das Brechungsverhalten von Licht beim Übergang von einem optisch dichteren in ein optisch dünneres Medium genutzt. So ergibt sich beispielsweise für den Übergang von Deckglas (n1 = 1,518) zu Wasser (n2 = 1,33) ein kritischer Winkel von 61°, der Winkel der Total-Reflexion. Unter den Bedingungen der Total-Reflexion (Winkel ≥ 61°) bildet sich im Medium mit geringerem Brechungsindex eine stehende evaneszente Welle. Die Intensität dieser Well fällt exponentiell mit dem Abstand zur Grenzfläche ab. Aufgrund dessen werden von der Grenzfläche weiter entfernte Fluorophore nicht angeregt. Die Hintergrundfluoreszenz wird erheblich reduziert. Der Bildkontrast wird dabei verbessert und die Auflösung wird gleichzeitig deutlich gesteigert. Voraussetzung für die Nutzung des voranstehend geschilderten Phänomens ist ein ausreichend großer Unterschied der Brechungsindizes von Deckglas und Medium.at Total internal reflection microscopy becomes refractive behavior of light at the transition used by a visually denser in a visually thinner medium. So results for example for the transition from cover glass (n1 = 1.518) to water (n2 = 1.33) a critical angle from 61 °, the Angle of total reflection. In the conditions of total reflection (Angle ≥ 61 °) forms in the medium with a lower refractive index, a standing evanescent Wave. The intensity this well falls exponentially with the distance to the interface. Because of that from the interface removed fluorophore unexcited. The background fluorescence is significantly reduced. The image contrast is improved and the resolution becomes at the same time significantly increased. Prerequisite for use of the above-described phenomenon is sufficient greater Difference of refractive indices of cover glass and medium.

Aus der US 2002/0097489 A1 ist ein Mikroskop mit evaneszenter Beleuchtung einer Probe bekannt. Das Mikroskop beinhaltet eine Weißlichtquelle, deren Licht über eine Schlitzblende durch das Mikroskopobjektiv hindurch in den eine Probe tragenden Objektträger zur evaneszenten Beleuchtung eingekoppelt wird. Das Beleuchtungslicht pflanzt sich in dem Objektträger durch totalinterne Reflektion fort, wobei die Beleuchtung der Probe nur im Bereich des aus dem Objektträger herausragenden evaneszenten Feldes erfolgt. Mikroskope dieser Art sind unter dem Begriff TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Microscope) bekannt. Die z-Auflösung von TIRF-Mikroskopen ist aufgrund des nur ca. 100 nm in die Probe ragenden evaneszenten Feldes außerordentlich gut.From the US 2002/0097489 A1 is a microscope with evanescent illumination of a sample known. The microscope includes a white light source whose light is coupled via a slit through the microscope objective into the specimen carrying slide for evanescent illumination. The illumination light propagates in the slide by total internal reflection, whereby the illumination of the sample takes place only in the region of the projecting from the slide evanescent field. Microscopes of this type are known by the term TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Microscope). The z-resolution of TIRF microscopes is exceptionally good due to the evanescent field projecting only about 100 nm into the sample.

Aus der DE 101 08 796 A1 ist ein hochaperturiges Objektiv, insbesondere für TIRF-Anwendungen, bekannt. Das Objektiv besteht aus einer ersten Linse mit einer positiven Brechkraft, einer zweiten Linse mit negativer Brechkraft, wobei das Brennweitenverhältnis zwischen den beiden Linsen im Bereich von – 0,4 und – 0,1 liegt und die Gesamtbrechkraft größer Null ist. Ferner beinhaltet das Objektiv zwei positive Linsen, deren Verhältnisdurchmesser zur Brennweite größer 0,3 und kleiner 0,6 ist. Ferner beinhaltet das Objektiv eine Negativlinse und einer Sammellinse, wobei die Negativlinse der Frontgruppe zugewandt ist und das Brennweitenverhältnis der Negativlinse und der Sammellinse zwischen – 0,5 und – 2 liegt.From the DE 101 08 796 A1 is a high-aperture objective, especially for TIRF applications known. The objective consists of a first lens having a positive refractive power, a second lens having a negative refractive power, the focal length ratio between the two lenses being in the range of -0.4 and -0.1 and the total refractive power being greater than zero. Furthermore, the lens includes two positive lenses whose focal diameter to focal length is greater than 0.3 and less than 0.6. Further, the objective includes a negative lens and a condenser lens, the negative lens facing the front group and the focal length ratio of the negative lens and the condenser lens being between -0.5 and -2.

Aus der DE 102 17 098 A1 ist eine Auflichtbeleuchtungsanordnung für die TIRF-Mikroskopie bekannt. Die Auflichtbeleuchtungsanordnung beinhaltet eine Beleuchtungsquelle, die im Betrieb ein polarisiertes Beleuchtungsstrahlenbündel abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse propagiert und eine Umlenkeinrichtung, die das Beleuchtungsstrahlenbündel umlenkt und parallel zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt. Es ist bei dieser Auflichtbeleuchtungsanordnung vorgesehen, dass das von der Beleuchtungsquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlenbündel s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer Phasendifferenz aufweist und die Umlenkeinrichtung das Beleuchtungsstrahlenbündel x-mal reflektiert, wobei x = (n × 180° – d)/60°.From the DE 102 17 098 A1 For example, a reflected-light illumination arrangement for TIRF microscopy is known. The incident light illumination arrangement includes an illumination source which emits in operation a polarized illumination beam which propagates at an angle to the optical axis and a deflection device which deflects the illumination beam and couples it parallel to the optical axis into the objective. It is provided in this incident illumination arrangement that the illumination beam emitted from the illumination source has s and p polarization directions with a phase difference and the deflection device reflects the illumination beam x times, where x = (n × 180 ° -d) / 60 °.

Aus der DE 101 43 481 A1 ist ein Mikroskop zur TIRM (Total Internal Reflection Microscopy) bekannt. Das Mikroskop weist ein Mikroskopgehäuse und ein Objektiv auf. Das von einer Beleuchtungseinrichtung ausgehende Beleuchtungslicht kann über einen in das Mikroskopgehäuse einschiebbaren Adapter eingekoppelt werden.From the DE 101 43 481 A1 is a microscope for TIRM (Total Internal Reflection Microscopy) known. The microscope has a microscope housing and a lens. The illumination light emanating from a lighting device can be coupled in via an adapter which can be inserted into the microscope housing.

Aus der US 2004/0001253 A1 ist ein Mikroskop mit einem optischen Beleuchtungssystem bekannt, das ein einfaches Umschalten zwischen evaneszenter Beleuchtung und Reflektionsbeleuchtung ermöglicht. Das Beleuchtungssystem beinhaltet eine Laserlichtquelle, deren Licht in eine optische Faser eingekoppelt wird. Ferner ist eine Auskoppeloptik vorgesehen, die das aus der Faser austretende Licht in einen hinteren Brennpunkt des Mikroskopobjektivs fokussiert. Die optische Faser ist in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs verschiebbar.From the US 2004/0001253 A1 is a microscope with a lighting optical system known that allows easy switching between evanescent lighting and reflection lighting. The illumination system includes a laser light source whose light is coupled into an optical fiber. Furthermore, a coupling-out optical system is provided, which focuses the light emerging from the fiber into a rear focal point of the microscope objective. The optical fiber is displaceable in a plane perpendicular to the optical axis of the microscope objective.

Aus der DE 102 29 935 A1 ist eine Einrichtung zur Einkopplung von Licht in einem Mikroskop bekannt. Dort wird in der Leuchtfeldblendenebene durch eine als Schieber ausgeführte Lichtleitfaser-Einkopplung Laserlicht auf das Präparat gerichtet. Die Erfindung ist insbesondere für das TIRF-Verfahren geeignet.From the DE 102 29 935 A1 is a device for coupling light in a microscope known. There, laser light is directed onto the specimen in the field diaphragm plane by means of an optical fiber coupling designed as a slide. The invention is particularly suitable for the TIRF process.

In der Rastermikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Detektionslicht, als Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahlenbündels wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Probenebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Detektionslichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet. Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahls in drei Dimensionen abgetastet.In scanning microscopy, a sample is illuminated with a light beam to observe the detection light emitted by the sample, as reflection or fluorescent light. The focus of a Be The illumination beam is moved by means of a controllable beam deflection device, generally by tilting two mirrors, in a sample plane, wherein the deflection axes are usually perpendicular to one another, so that one mirror deflects in the x direction and the other in the y direction. The tilting of the mirror is accomplished, for example, with the help of galvanometer actuators. The power of the detection light coming from the object is measured as a function of the position of the scanning beam. Usually, the control elements are equipped with sensors for determining the current mirror position. Especially in confocal scanning microscopy, an object with the focus of a light beam is scanned in three dimensions.

Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog. Anregungsblende – fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Diese Detektionsanordnung wird Descan-Anordnung genannt. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts mit dem Fokus des Beleuchtungslichtstrahlenbündels zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt.One confocal scanning microscope generally comprises a light source a focusing optics, with the light of the source on a pinhole - the so-called. Excitation aperture - focused is a beam splitter, a beam deflecting device for beam control, a microscope optics, a detection aperture and the detectors for Detection of the detection or fluorescent light. The illumination light is over a Beam splitter coupled. The fluorescence emitted by the object or reflection light passes over the beam deflector back to the beam splitter, this happens, then to the detection panel to be focused behind which the detectors are located. These Detection arrangement becomes descan arrangement called. Detection light that does not come directly from the focus region, takes another light path and does not pass the detection aperture, so that one obtains a point information by sequential Scanning of the object with the focus of the illumination light beam a three-dimensional image leads. Usually, a three-dimensional image is formed by layerwise image data acquisition achieved.

Wie bereits zuvor erwähnt, geht es hier um Mikroskope, die sich für TIRF-Untersuchungen eignen. Dabei wir eine Probe unter sehr flachem Winkel beleuchtet, nämlich zur Erzeugung von Total-Reflexion an der Probenoberfläche, an einem Deckglas oder dergleichen. Im Stand der Technik verwendet man dazu Objektive mit sehr großer Apertur, um große Beleuchtungsaperturen zu ermöglichen. Die Fluoreszenz-Anregung erfolgt über eine Laserlichtquelle, wobei der Laser regelmäßig auf einen Punkt am Pupillenrand des Objektivs abgebildet wird. Aus dem Stand der Technik ist es auch bereits bekannt, zur Fluoreszenz-Anregung Gasentladungs-Lampen zu verwenden. In der Aperturebene des Beleuchtungsstrahlengangs wird dabei eine Ringblende eingebracht, so dass nur der Pupillenrand des Objektivs beleuchtet wird.As mentioned earlier, this is about microscopes that are suitable for TIRF investigations. Here we illuminate a sample at a very shallow angle, namely to Generation of total reflection on the sample surface, on a coverslip or the like. Used in the prior art one to lenses with very large Aperture to large illumination apertures to enable. The fluorescence excitation via a laser light source, wherein the laser on regularly a point is shown on the pupil edge of the lens. From the state It is also already known in the art for fluorescence excitation To use gas discharge lamps. In the aperture plane of the illumination beam path In this case, a ring diaphragm is introduced, so that only the pupil edge the lens is illuminated.

Bei der Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie ist das totalreflektierte Beleuchtungslicht problematisch, da es in den Beleuchtungsstrahlengang zurückkehrt und ohne besondere Maßnahmen in den Detektionsstrahlengang gelangt. Zur Vermeidung von Falschlicht muss es daher ausgekoppelt und absorbiert werden.at Total Internal Reflection Microscopy is totally reflected Illumination light is problematic, as it is in the illumination beam path returns and without special measures gets into the detection beam path. To avoid misleading it must therefore be disconnected and absorbed.

Aus der DE 102 58 945 A1 ist für sich gesehen ein TIRF-Mikroskop bekannt, bei dem gemäß dortiger 3 eine Lichtfallenanordnung vorgesehen ist, der das durch Totalreflexion an der Grenzfläche reflektierte Anregungslicht zugeführt wird. Dabei wird reflektiertes Beleuchtungslicht eindimensional beleuchteter Punkte der Objektivaustrittspupille über eine Spiegelanordnung ausgeblendet. Handelt es sich bei dem reflektierten Beleuchtungslicht um ein zweidimensionales Beleuchtungsmuster, ist eine wirksame Ausblendung mit der bekannten Anordnung nicht möglich.From the DE 102 58 945 A1 in itself a TIRF microscope is known in which according to there 3 a light trap arrangement is provided to which the excitation light reflected by total reflection at the interface is supplied. In this case, reflected illumination light of one-dimensionally illuminated points of the objective exit pupil is masked out via a mirror arrangement. If the reflected illumination light is a two-dimensional illumination pattern, effective masking with the known arrangement is not possible.

Aus der DE 199 23 822 A1 ist ein Mikroskop bekannt, welches eine Lichtquelle und einen in einem Beleuchtungsstrahlengang angeordneten Scanner sowie ein Objektiv umfasst. Sowohl Beleuchtungslicht als auch Detektionslicht werden durch das Objektiv geführt, wobei das einfallende Beleuchtungslicht in der Ebene der Objektivpupille einen Fokus aufweist. Im Verlauf des Scannens wird die Objektivpupille durch Aneinanderreihung einzelner Beleuchtungspunkte ringförmig beleuchtet. An der Probe oder an einer Probenabdeckung reflektiertes Beleuchtungslicht kehrt in den Beleuchtungsstrahlengang zurück, wobei im Beleuchtungsstrahlengang der Ausprägung des Reflexionslichts angepasste Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht und zum Ableiten des Reflexionslichts in eine Lichtfalle vorgesehen sind.From the DE 199 23 822 A1 a microscope is known which comprises a light source and a scanner disposed in an illumination beam path and a lens. Both illumination light and detection light are guided through the objective, wherein the incident illumination light has a focus in the plane of the objective pupil. In the course of scanning, the objective pupil is illuminated annularly by stringing individual illumination points. Illumination light reflected by the sample or on a specimen cover returns to the illuminating beam path, wherein means adapted for spatial separation of the reflection light from the illuminating light and for diverting the reflection light into a light trap are provided in the illuminating beam path of the characteristic of the reflection light.

Bei Scannmikroskopen werden Beleuchtungs- und Detektionslicht üblicherweise über denselben Scanner geleitet, wobei dort der Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang zusammen fallen. Bei der TIRF-Beleuchtung wird Licht üblicherweise in den seitlichen Bereich des Objektivs eingeleitet, um den für die Totalreflexion nötigen Winkel zu erzielen. Damit fallen Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang nicht zusammen. Es ist nicht bekannt, die TIRF-Beleuchtung über denselben Scanner zu leiten und aufgrund des Strahlenverlaufs über den Scanner die Trennung von Beleuchtungs- (Detektions-) und Reflexionslicht zu bewerkstelligen.at Scanning microscopes usually become illumination and detection light over the same Scanners led, where there the illumination and detection beam path fall together. Light is common in TIRF lighting introduced into the lateral area of the lens to the total reflection force To achieve angles. Thus fall illumination and detection beam path not together. It is not known the TIRF lighting over it To guide scanner and due to the beam path over the Scanner the separation of illumination (detection) and reflection light to accomplish.

Aus der DE 102 01 870 A1 ist für sich gesehen ein Scannmikroskop bekannt, bei dem sowohl der Beleuchtungsstrahlengang als auch der Detektionsstrahlengang über einen Scannspiegel geführt wird. Dabei wird mit einem Winkelversatz versehenes Licht zu einer konfokalen Blende geführt.From the DE 102 01 870 A1 In itself a scanning microscope is known, in which both the illumination beam path and the detection beam path are guided via a scanning mirror. In this case, provided with an angular offset light is guided to a confocal aperture.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop der gattungsbildenden Art derart auszugestalten und weiterzubilden, dass bei zweidimensionalem Beleuchtungsmuster Falschlicht im Detektionsstrahlengang weitestgehend vermieden wird.The present invention is based on the object, a microscope of the generic type in such a way and further develop that in two-dimensional illumination pattern stray light in the detection beam path is largely avoided.

Das erfindungsgemäße Mikroskop löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist das gattungsbildende Mikroskop dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang der Ausprägung des Reflexionslichts angepasste Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht und zum Ableiten des Reflexionslichts in eine Lichtfalle vorgesehen sind und dass die Mittel den x-y-Scanner umfassen, der das an der optischen Achse gespiegelte Reflexionslicht mit einem Winkelversatz gegenüber dem Beleuchtungslicht in einen Reflexionsstrahlengang ablenkt.The Microscope according to the invention solve the above Task by the features of claim 1. Thereafter that is generic microscope characterized in that in the illumination beam path the expression adapted to the reflection light means for spatially separating the reflection light from the illumination light and for deriving the reflection light in a Light trap are provided and that the means comprise the x-y scanner, the mirrored at the optical axis reflection light with a Angular misalignment opposite deflects the illumination light in a reflection beam path.

In erfindungsgemäßer Weise ist erkannt worden, dass man auch bei zweidimensionalen Beleuchtungsmustern eine Ausblendung des totalreflektierten Beleuchtungslichts zur Vermeidung von Fehllicht im Detektionsstrahlengang mit einfachen Mitteln realisieren kann, nämlich dadurch, dass im Beleuchtungsstrahlen gang besondere Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht vorgesehen sind. Diese besonderen Mittel sind der Ausprägung des Reflexionslichts angepasst. Mit anderen Worten handelt es sich hier um Mittel, die entsprechend der zweidimensionalen Ausprägung des Reflexionslichts konstruiert sind, so dass die Ausblendung ausschließlich in Bezug auf das konkret ausgebildete Reflexionslicht stattfinden kann. So ist in Bezug auf die die Ausblendung bewerkstelligenden Mittel nicht nur deren exakte Positionierung sondern auch die Form der in Bezug auf die Ausblendung wirksamen Fläche von besonderer Bedeutung.In according to the invention has been recognized that even with two-dimensional lighting patterns a blanking of the totally reflected illumination light to avoid from mislighting in the detection beam path realize with simple means can, namely in that in the illumination beam passage special means for spatial separation the reflection light from the illumination light are provided. These special means are the expression adapted to the reflection light. In other words, it is here by means corresponding to the two-dimensional form of the reflection light are designed so that the blanking exclusively in Reference to the concretely formed reflection light can take place. So, in terms of the fade-out remedies not only their exact positioning but also the shape of the in terms of blanking effective area of particular importance.

Wie bereits zuvor ausgeführt, dienen die Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht. Des Weiteren ist eine Lichtfalle vorgesehen, in die das vom Beleuchtungslicht räumlich getrennte Reflexionslicht zur Absorption hineingeleitet wird. So lässt sich wirksam verhindern, dass das Reflexionslicht im Umfange seiner zweidimensionalen Ausprägung als Falschlicht in den Detektionsstrahlengang gelangt und somit die Abbildung bzw. Messung verfälscht.As already executed before, serve the means for spatial Separating the reflection light from the illumination light. Furthermore a light trap is provided, into which the illumination light spatial separate reflected light is introduced for absorption. So let yourself effectively prevent the reflection light in the scope of its two-dimensional shaping as a false light enters the detection beam path and thus the image or measurement falsified.

An dieser Stelle sei angemerkt, dass es sich bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop um ein Mikroskop jedweder Bauart handeln kann, wobei es sich dabei insbesondere um ein Mikroskop zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe handelt. Dabei wird ein Mikroskopobjektiv evaneszent beleuchtet, nämlich durch eine punktförmige Beleuchtung der Objektivaustrittspupille. Durch einen zweidimensionalen Scanner lassen sich beliebige Punkte in der Objektivpupille ausleuchten. Aufgrund der bei der TIRF-Mikroskopie auftretenden Totalreflexion des Beleuchtungslichts muss das Reflexionslicht aus dem Beleuchtungsstrahlengang ausgekoppelt und absorbiert werden, damit kein Falschlicht in den Detektionsstrahlengang gelangen kann. Mit bisher bekannten Mitteln war dies äußerst aufwendig oder unmöglich, da nämlich die evaneszente Beleuchtung ein meist ringförmiges Beleuchtungsmuster in der Objektivaustrittspupille aufweist. So geht es hier in erster Linie um das Ausblenden und um die Absorption zweidimensionaler Beleuchtungsmuster, insbesondere bei der TIRF-Mikroskopie.At It should be noted that it is the microscope according to the invention can be a microscope of any type, which is it in particular a microscope for the evanescent illumination of a Sample acts. In the process, a microscope objective is illuminated evanescently, namely by a punctate Illumination of the lens exit pupil. Through a two-dimensional Scanners can illuminate any points in the objective pupil. Due to the total reflection occurring in TIRF microscopy of the illumination light, the reflection light from the illumination beam path must be coupled and absorbed, so no false light in the Detection beam path can get. With previously known means This was extremely expensive or impossible there namely the evanescent lighting a mostly annular illumination pattern in the lens exit pupil has. That's the way it is here first Line around hiding and absorption two-dimensional Illumination pattern, especially in TIRF microscopy.

Die Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht umfassen bereits vorhandene Bauteile, nämlich den x-y-Scanner. Dieser x-y-Scanner dient über seine eigentliche Scannfunktion hinaus dazu, das an der optischen Achse gespiegelte Reflexionslicht mit einem Winkelversatz gegenüber dem Beleuchtungslicht in einen Reflexionsstrahlengang abzulenken, so dass das Reflexionslicht vom einfallenden Beleuchtungslicht getrennt ist.The Means for spatial Separating the reflection light from the illumination light already include existing components, namely the x-y scanner. This x-y scanner serves over its actual scanning function beyond that on the optical axis mirrored reflection light with an angular offset from the To deflect illumination light into a reflection beam path, see above that the reflection light is separated from the incident illumination light is.

Zur Funktionsweise des Mikroskops sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass als Lichtquelle meist eine Laserlichtquelle dient, wobei das Licht mittels Lichtleitfaser in das Mikroskop eingekoppelt wird. Der an der Faser austretende Strahl hat typischerweise eine sehr kleine numerische Apertur, so in etwa im Bereich von 0,08. Üblicherweise wird das divergente Licht kollimiert und trifft als Parallelstrahl auf den Scanner, der üblicherweise in einer konjugierten Ebene zum Objekt angeordnet ist. Im weiteren Verlauf gelangt das Licht in das Objektiv und beleuchtet die Objektivpupille punktförmig, und zwar je nach Stellung des Scanners. Im Bewegungsablauf des Scanners entsteht ein zweidimensionales Beleuchtungsmuster in der Objektivpupille, und zwar entsprechend den Bedürfnissen der TIRF-Mikroskopie. Von dort aus gelangt das Beleuchtungslicht zur Probenoberfläche bzw. zu deren Abdeckung. Nach Totalreflexion an der Probe bzw. an der Objektabdeckung läuft der Strahl an der optischen Achse gespiegelt in den Beleuchtungsstrahlengang zurück. Aufgrund der Ablenkung durch den x-y-Scanner erhält der Reflexionslichtstrahl bzw. der daraus gebildete Reflexionsstrahlengang einen Winkelversatz gegenüber dem einfallenden Beleuchtungslicht, so dass der x-y-Scanner als Bestandteil der zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht dienenden Mittel betrachtet werden kann.to Functionality of the microscope should be noted at this point, that as the light source usually serves a laser light source, the Light is coupled by means of optical fiber into the microscope. The beam exiting the fiber typically has a very high small numerical aperture, approximately in the range of 0.08. Usually the divergent light is collimated and hits as a parallel beam the scanner, usually is arranged in a conjugate plane to the object. In the further Course passes the light into the lens and illuminates the lens pupil point-like, depending on the position of the scanner. In the movement of the scanner creates a two-dimensional illumination pattern in the objective pupil, according to the needs TIRF microscopy. From there comes the illumination light to the sample surface or to their cover. After total reflection on the sample or on the object cover is running the beam at the optical axis mirrored in the illumination beam path back. Due to the deflection by the x-y scanner receives the reflection light beam or the reflection beam path formed therefrom an angular offset across from the incident illumination light, so that the x-y scanner as Part of the spatial separation Considering the reflection light from the illumination light means can be.

Des Weiteren ist es von Vorteil, wenn in dem vom Beleuchtungsstrahlengang abgewinkelten Reflexionsstrahlengang eine der zweidimensionalen Ausprägung des Reflexionslichts angepasste Ablenkeinrichtung für das Reflexionslicht vorgesehen ist. Bei der Ablenkeinrichtung kann es sich um einen Spiegel handeln. Sofern das Reflexionslicht – entsprechend der Prägung des Beleuchtungslichts – eine ringförmige Anordnung der einzelnen Beleuchtungspunkte aufweist, könnte die Ablenkeinrichtung entsprechend als Ringspiegel ausgeführt sein, nämlich exakt im Reflexionsstrahlengang angeordnet und auf die Ausprägung des Reflexionslichts abgestimmt.Furthermore, it is advantageous if, in the reflection beam path which is angled away from the illumination beam path, a deflection device adapted to the two-dimensional expression of the reflection light is provided for the reflection light. The deflector may be a mirror. If the reflection light - ent speaking of the embossing of the illumination light - has an annular arrangement of the individual illumination points, the deflecting device could be designed accordingly as an annular mirror, namely arranged exactly in the reflection beam path and matched to the expression of the reflection light.

Zur Realisierung einer hinreichend großen Ablenkeinrichtung, die zur weiterreichenden Ablenkung des Reflexionslichts geeignet ist, ist es von weiterem Vorteil, wenn die Ablenkeinrichtung möglichst weit von dem x-y-Scanner entfernt ange ordnet ist, damit nämlich das Reflexionslicht hinreichend weit vom Beleuchtungsstrahlengang entfernt ist, nämlich unter Zugrundelegung des durch den x-y-Scanner erzielten Winkelversatzes des Reflexionslichts in Bezug auf das Beleuchtungslicht.to Realization of a sufficiently large deflection device, the suitable for further diversion of the reflection light, it is of further advantage if the deflection as far as possible away from the x-y scanner is arranged, namely the Reflection light sufficiently far away from the illumination beam path is, namely under Based on the angle offset achieved by the x-y scanner of the reflection light with respect to the illumination light.

Zuvor ist bereit erwähnt worden, dass sich als Lichtquelle ganz besonders eine Laserlichtquelle eignet, deren Licht über eine Lichtleitfaser in den Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt wird. Das aus der Lichtleitfaser austretende Licht ist divergent, so dass der Lichtleitfaser ein Kollimator zur Parallelisierung des Lichts nachgeschaltet ist. Insoweit ist es von Vorteil, wenn die Ablenkeinrichtung nahe des der Lichteinkopplung folgenden Kollimators, nämlich zwischen dem Kollimator und dem x-y-Scanner, angeordnet ist, und zwar möglichst weit vom x-y-Scanner entfernt.before is mentioned has been found that a laser light source is particularly suitable as a light source, their light over an optical fiber coupled into the illumination beam path becomes. The light emerging from the optical fiber is divergent, so that the optical fiber is a collimator for parallelizing the Light is downstream. In that regard, it is advantageous if the Deflection device near the light coupling following collimator, namely between the collimator and the x-y scanner, and while possible far away from the x-y scanner.

In Bezug auf die Anordnung der Ablenkeinrichtung, so beispielsweise des Spiegels bzw. des Ringspiegels, ist es denkbar, diesen im Rahmen einer alternativen Ausgestaltung nahe der Lichteinkopplung vorzusehen, so beispielsweise nahe dem Faserende einer Lichtleitfaser, die zum Einkoppeln in das Beleuchtungslicht dient. Insoweit ist es möglich, die Ablenkeinrichtung im Bereich des Fokus des Reflexionslichts, d. h. neben der Faser, anzuordnen, wobei an dieser Stelle darauf hingewiesen sei, dass eine solche Anordnung aufgrund der Nähe zur Faser und der erforderlichen Rotationssymmetrie schwierig in der Realisierung ist.In Regarding the arrangement of the deflector, such as of the mirror or the annular mirror, it is conceivable, this in the frame to provide an alternative embodiment near the light coupling, such as near the fiber end of an optical fiber used for Coupling into the illumination light is used. In that regard, it is possible the Deflection device in the region of the focus of the reflection light, d. H. next to the fiber, it should be noted at this point be that such an arrangement due to the proximity to the fiber and the required Rotational symmetry is difficult to realize.

Dennoch ist es möglich, die Ablenkeinrichtung nahe der Lichteinkopplung vorzusehen, und zwar insbesondere in einer konjugierten Ebene zur Lichteinkopplung. Im Konkreten kann die Ablenkeinrichtung unmittelbar neben der Lichteinkopplung bzw. dem Faserende angeordnet sein, wobei die Ablenkeinrichtung selbst wiederum an die Faser gekoppelt sein kann oder mit der Faser eine bauliche Einheit bildet. Wesentlich ist dabei, dass die Ablenkeinrichtung möglichst nahe am Austrittsende der Lichtleitfaser zur Wirkung kommt.Yet Is it possible, to provide the deflector near the light entrance, namely in particular in a conjugate plane for light coupling. in the Concretely, the deflection can be directly next to the light coupling or be arranged at the fiber end, wherein the deflection device itself in turn may be coupled to the fiber or with the fiber structural unit forms. It is essential that the deflection preferably comes close to the exit end of the optical fiber to the effect.

In Bezug auf die erfindungsgemäße Lehre ist von Bedeutung, dass das Reflexionslicht eine Prägung wie das Beleuchtungslicht in Bezug auf die räumliche Verteilung der Beleuchtungspunkte aufweist. Entsprechend sind die Ablenkeinrichtung und die Lichtfalle auszubilden, wobei die zuvor erörterte Ablenkeinrichtung selbst als Lichtfalle zur Absorption des Lichts dienen kann. Ebenso ist es möglich, dass der Ab lenkeinrichtung die eigentliche Lichtfalle nachgeordnet ist, wobei auch die Lichtfalle eine der Ausprägung des Reflexionslichts angepasste Wirkfläche haben kann. Diese Wirkfläche kann entsprechend der Ausgestaltung der Ablenkeinrichtung ringförmig ausgebildet sein, wobei eine solche Vorkehrung nicht zwingend erforderlich ist, sofern eine hinreichend gute Ausblendung des Reflexionslichts aus dem Beleuchtungsstrahlengang mittels der Ablenkeinrichtung bereits stattgefunden hat.In Reference to the teaching of the invention It is important that the reflection light is an imprint like the illumination light with respect to the spatial distribution of the illumination points having. Accordingly, the deflector and the light trap form, with the previously discussed deflection itself as a light trap can serve to absorb the light. As well Is it possible, that from the steering device downstream of the actual light trap is, wherein the light trap adapted to the expression of the reflection light Have effective area can. This effective area can be annular according to the design of the deflection be such a provision is not mandatory, provided a sufficiently good suppression of the reflection light the illumination beam path by means of the deflection already took place.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigtIt are now different ways to design the teaching of the present invention in an advantageous manner and further education. On the one hand to the claim 1 subordinate claims and on the other hand to the following explanation of a preferred embodiment of the invention with reference to the drawing. Combined with the explanation of the preferred embodiment The invention with reference to the drawings are also generally preferred Embodiments and developments of the teaching explained. In the drawing shows

die einzige Fig. in einer schematischen Ansicht den prinzipiellen Verlauf des Beleuchtungslichts und des Reflexionslichts bis hin zu einer Lichtfalle.the only Fig. In a schematic view of the basic course of the illumination light and the reflection light up to a Light trap.

Die einzige Figur zeigt den Beleuchtungsstrahlengang 1 und den Reflexionsstrahlengang 2 in einem Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops.The single figure shows the illumination beam path 1 and the reflection beam path 2 in an embodiment of a microscope according to the invention.

Im Konkreten wird das Beleuchtungslicht 7 über eine Laserlichtquelle 3 zur Verfügung gestellt, wobei das Licht über eine Lichtleitfaser 4 in den Beleuchtungsstrahlengang 1 eingekoppelt wird. Das Beleuchtungslicht 7 tritt am Lichtaustritt 5 der Lichtleitfaser 4 in zunächst divergenter Form aus und wird mittels Kollimator 6 kollimiert bzw. parallelisiert. Das Beleuchtungslicht 7 gelangt parallel zu einem x-y-Scanner 8, der in einer konjugierten Ebene zu einem in der Figur nicht gezeigten Objekt angeordnet ist.Specifically, the illumination light becomes 7 via a laser light source 3 provided, the light over an optical fiber 4 in the illumination beam path 1 is coupled. The illumination light 7 occurs at the light exit 5 the optical fiber 4 in an initially divergent form and is collimated 6 collimated or parallelized. The illumination light 7 gets parallel to an xy scanner 8th which is arranged in a conjugate plane to an object not shown in the figure.

Im weiteren Verlauf wird die in der Figur nicht gezeigte Objektivpupille punktförmig beleuchtet, wobei sich aufgrund der Scannbewegung des x-y-Scanners 8 ein zweidimensionales Beleuchtungsmuster zur TIRF-Beleuchtung ergibt.In the further course, the objective pupil (not shown in the figure) is spot-illuminated, whereby due to the scanning movement of the xy-scanner 8th gives a two-dimensional illumination pattern for TIRF illumination.

Nach Totalreflexion am Objekt bzw. an der Objektabdeckung läuft das totalreflektierte Reflexionslicht 9 zurück in den Beleuchtungsstahlengang 1 bis hin zum x-y-Scanner 8, wobei das Reflexionslicht 9 an der optischen Achse gespiegelt ist.After total reflection on the object or on the object cover, the totally reflected reflection light runs 9 back into the lighting steel gangway 1 right up to the xy scanner 8th , wherein the reflection light 9 is mirrored on the optical axis.

Das Reflexionslicht 9 kehrt somit in den Beleuchtungsstrahlengang 1 zurück. Aufgrund der Ablenkung durch den x-y-Scanner 8 erfährt das Reflexionslicht 9 einen durch den Pfeil 10 angedeuteten Winkelversatz gegenüber dem einfallenden Beleuchtungslicht 7.The reflection light 9 thus returns to the illumination beam path 1 back. Due to the distraction of the xy scanner 8th experiences the reflection light 9 one by the arrow 10 indicated angle offset with respect to the incident illumination light 7 ,

Nahe dem Kollimator 6 ist ein Ringspiegel 11 angeordnet, der derart dimensioniert und positioniert ist, dass er jeden reflektierten Beleuchtungspunkt des Reflexionslichts 9 aufnimmt und ihn über den Reflexionsstrahlengang 2 zu einer Lichtfalle 12 leitet. Dort wird das Reflexionslicht 9 absorbiert, nachdem es von dem Beleuchtungsstrahlengang 1 abgelenkt worden ist.Near the collimator 6 is a ring mirror 11 arranged, which is dimensioned and positioned so that it each reflected point of illumination of the reflection light 9 picks it up and over the reflection beam path 2 to a light trap 12 passes. There is the reflection light 9 absorbed after it from the illumination beam path 1 has been distracted.

In Bezug auf weitere vorteilhafte Ausgestaltungen, die sich der einzigen Figur nicht entnehmen lassen, sei zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung verwiesen.In Reference to further advantageous embodiments, which are the only Figure can not be inferred, to avoid repetition refer to the general part of the description.

Schließlich sei angemerkt, dass das voranstehend beschriebene Ausführungsbeispiel der Erörterung der erfindungsgemäßen Lehre dient, diese jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiel einschränkt.Finally, be noted that the embodiment described above the discussion the teaching of the invention serves, but does not restrict to the embodiment.

Claims

Microscope, in particular for the evanescent illumination of a sample, with a light source ( 3 ), one in the illumination beam path ( 1 ) xy scanners ( 8th ) and a lens, wherein both illumination light ( 7 ) as well as detection light are passed through the lens, wherein the incident illumination light ( 7 ) in the plane of the objective pupil has a focus, wherein the objective pupil is illuminated in the course of the scanning by stringing individual illumination points two-dimensionally, preferably annular, and wherein on the sample or on a sample cover preferably totally reflected illumination light (reflection light) ( 9 ) in the illumination beam path ( 1 ), characterized in that in the illumination beam path ( 1 ) the expression of the reflection light ( 9 ) adapted means for the spatial separation of the reflection light ( 9 ) of the illumination light ( 7 ) and for deriving the reflection light ( 9 ) into a light trap ( 12 ) and that the funds use the xy scanner ( 8th ), which reflects the reflected light at the optical axis ( 9 ) with an angular offset ( 10 ) with respect to the illumination light ( 7 ) in a reflection beam path ( 2 ) distracts.

Microscope according to claim 1, characterized in that in the reflection beam path ( 2 ) one of the two-dimensional expression of the reflection light ( 9 ) adapted deflecting device for the reflection light ( 9 ) is provided.

Microscope according to claim 2, characterized in that that the deflection device is designed as a mirror.

Microscope according to claim 2 or 3, characterized in that the deflection device as a ring mirror ( 11 ) is executed.

Microscope according to one of claims 2 to 4, characterized in that the deflection device as far as possible from the xy scanner ( 8th ) is located away.

Microscope according to one of claims 2 to 5, characterized in that the deflecting means close to a collimator following a light coupling ( 6 ), between the collimator ( 6 ) and the xy scanner ( 8th ) is arranged.

Microscope according to one of claims 2 to 5, characterized in that the deflecting means close to the light coupling, preferably near the fiber end of an optical fiber ( 4 ) is arranged.

Microscope according to claim 7, characterized in that that the deflection device in a conjugate plane for light coupling is arranged.

Microscope according to claim 7, characterized in that that the deflection immediately adjacent to the light coupling is arranged.

Microscope according to one of claims 7 to 9, characterized that the deflection device is coupled to the fiber or with the Fiber forms a structural unit.

Microscope according to one of claims 2 to 10, characterized in that the deflection device as a light trap ( 12 ) is carried out or that the deflecting the light trap ( 12 ) is subordinate

Microscope according to one of claims 1 to 11, characterized in that the light trap ( 12 ) one of the characteristics of the reflection light ( 9 ) has adapted effective area.

Microscope according to claim 12, characterized in that the effective area of the light trap ( 12 ) is annular.