DE102005009099A1 - New camptothecin-peptide derivatives, useful for treating cancer - Google Patents

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Abstract

Campothecin-peptide derivatives (I) are new. Campothecin-peptide derivatives of formula (I) are new. R 1hydrogen or hydroxy; R 2hydrogen, amino, nitro or N,N-dimethylaminomethyl; R 3hydrogen or ethyl; R 4hydrogen, alkyl or aryl; R 5hydrogen, optionally substituted alkyl or aryl; P 1, P 3Ala, Gly, Leu, Ile, norleucine (Nle) and/or Phe; P 2, P 4Leu, Ile, Nle and/or Phe; X aaamino acid with a basic sidechain; n : 0-3; m : 1-3; k : 0-5; p : 0-6; and PM : protein-binding group. An independent claim is included for the preparation of (I). [Image] ACTIVITY : Cytostatic. MECHANISM OF ACTION : None given.

Description

Die Erfindung betrifft Camptothecin-Peptid-Derivate, die eine proteinbindende Gruppe enthalten und unter Beteiligung der Cathepsine B und/oder D enzymatisch im Körper unter Freisetzung des Wirkstoffs oder eines niedermolekularen Wirkstoff-Derivates spaltbar sind.The The invention relates to camptothecin peptide derivatives which are protein binding Group included and involving cathepsins B and / or D enzymatically in the body cleavable with release of the drug or a low molecular weight drug derivative are.

Camptothecin (CPT) ist ein Alkaloid mit tumorhemmenden Eigenschaften (Wall M. E., et al. J. Am. Chem. Soc. 1966, 88, 3888–3890), dessen Derivate wie Topotecan oder Irinotecan zur Behandlung verschiedener Krebserkrankungen eingesetzt werden (Kollmannsberger C., et al. Oncology 1999, 56, 1–12, Rothenberg M. L. Oncologist 2001, 6, 66–80). Jedoch sind Therapien mit diesen Arzneistoffen von Nebenwirkungen begleitet. Um das Nebenwirkungsprofil und die Wirksamkeit von CPT bzw. CPT-Derivaten zu verbessern, wurden makromolekulare Transportformen von CPT durch Kopplung des Wirkstoffs an synthetische Polymere wie Poly(ethylenglykol) (Greenwald R. B., et al. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 551–562, Conover C. D., et al. Anti-Cancer Drug Design 1999, 14, 499–506), HPMA-Copolymere (Fraier D., et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 2000, 22, 505–514) oder HPMA-Copolymere in Verbindung mit Peptid-Spacern entwickelt (Caiolfa V. R., et al. J. Controlled Release 2000, 65, 105–119, Zamai M., et al. Mol. Cancer Ther. 2003, 2, 29–40).camptothecin (CPT) is an alkaloid with anti-tumor properties (Wall M. E., et al. J. Am. Chem. Soc. 1966, 88, 3888-3890), whose derivatives such Topotecan or irinotecan for the treatment of various cancers (Kollmannsberger C., et al., Oncology 1999, 56, 1-12, Rothenberg M.L. Oncologist 2001, 6, 66-80). However, there are therapies accompanied by side effects with these drugs. To the side effect profile and to improve the efficacy of CPT and CPT derivatives, respectively Macromolecular transport of CPT by coupling of the drug to synthetic polymers such as poly (ethylene glycol) (Greenwald R. B., et al. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 551-562, Conover C.D., et al. Anti-Cancer Drug Design 1999, 14, 499-506), HPMA copolymers (Fraier D., et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 2000, 22, 505-514) or HPMA copolymers developed in conjunction with peptide spacers (Caiolfa V.R., et al., J. Controlled Release 2000, 65, 105-119, Zamai M., et al. Mol. Cancer Ther. 2003, 2, 29-40).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Prodrugs von CPT zu schaffen, die CPT oder CPT-Derivate im Tumor freisetzen.Of the Invention has for its object to provide prodrugs of CPT, release the CPT or CPT derivatives in the tumor.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Camptothecin-Peptid-Derivate der allgemeinen Formel

Figure 00020001
worin R1 = H oder OH, R2 = H, NH2, NO2 oder N,N-Dimethylaminomethyl, R3 = H oder Ethyl, R4 = H, Alkyl oder Aryl, R5 = H, Alkyl oder Aryl, von denen die beiden letztgenannten gegebenenfalls substituiert sein können, P1-P4 = L- oder D-Aminosäuren, Xaa eine löslichkeitsvermittelnde Aminosäure, n = 0 bis 3, m = 1 bis 3, k = 0 bis 5, p = 0 bis 6 bedeuten und PM eine proteinbindende Gruppe ist.This object is achieved by camptothecin-peptide derivatives of the general formula
Figure 00020001
wherein R 1 = H or OH, R 2 = H, NH 2 , NO 2 or N, N-dimethylaminomethyl, R 3 = H or ethyl, R 4 = H, alkyl or aryl, R 5 = H, alkyl or aryl, of which the latter two may optionally be substituted, P 1 -P 4 = L- or D-amino acids, X aa a solubilizing amino acid, n = 0 to 3, m = 1 to 3, k = 0 to 5, p = 0 to 6 and PM is a protein binding group.

Eine integrierte hydrolytisch oder enzymatisch spaltbare Sollbruchstelle erlaubt hierbei eine kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs oder eines Aminoacyl-Wirkstoff-Derivates in vivo, sodass Camptothecin-Derivate der vorliegenden Erfindung Prodrugs darstellen.A Integrated hydrolytic or enzymatic cleavable breaking point allows a controlled release of the drug or an aminoacyl drug derivative in vivo, so camptothecin derivatives of the present invention Represent prodrugs.

Die erfindungsgemäßen CPT-Derivate sind aus einer antitumoral wirksamen Camptothecin-Komponente, einem Spacermolekül, einer Peptidkette und einem heterobifunktionellen Crosslinker aufgebaut. Im Folgenden wird dieser Aufbau näher erläutert: The CPT derivatives according to the invention are from an antitumoral active camptothecin component, a spacer molecule, a peptide chain and a heterobifunctional crosslinker. This structure is explained in more detail below:

Die antitumoral wirksame CPT-Komponente ist ein Wirkstoff der allgemeinen Formel

Figure 00030001
worin
R1 = H, OH
R2 = H, NH2, NO2 oder N,N-Dimethylaminomethyl
R3 = H, Ethyl
bedeuten, welcher eine freie 20-Hydroxygruppe aufweist. Bevorzugte Wirkstoffe sind Camptothecin, Topotecan, 10-Hydroxycamptothecin, 9-Aminocamptothecin und 9-Nitrocamptothecin.The antitumor active CPT component is an active ingredient of the general formula
Figure 00030001
wherein
R 1 = H, OH
R 2 = H, NH 2 , NO 2 or N, N-dimethylaminomethyl
R 3 = H, Ethyl
which has a free 20-hydroxy group. Preferred active ingredients are camptothecin, topotecan, 10-hydroxycamptothecin, 9-aminocamptothecin and 9-nitrocamptothecin.

Das Spacermolekül ist eine Aminocarbonsäure der allgemeinen Formel

Figure 00030002
in der
R4 = H, Alkyl oder Aryl, bevorzugt H
R5 = H, Alkyl oder Aryl, gegebenenfalls substituiert, bevorzugt H oder Methyl
n = 0 bis 3
bedeuten.The spacer molecule is an aminocarboxylic acid of the general formula
Figure 00030002
in the
R 4 = H, alkyl or aryl, preferably H
R 5 = H, alkyl or aryl, optionally substituted, preferably H or methyl
n = 0 to 3
mean.

Besonders bevorzugte Spacer sind 4-Aminobutansäure, 5-Aminopentansäure, 3-Aminopropansäure sowie L- und D-Alanin.Especially Preferred spacers are 4-aminobutanoic acid, 5-aminopentanoic acid, 3-aminopropanoic acid and L- and D-alanine.

Die Peptidkette setzt sich aus einer durch die Cathepsine B und/oder D spaltbaren Sequenz sowie einer N-terminalen löslichkeitsvermittelnden Komponente zusammen und hat die allgemeine Formel

Figure 00030003
in der
P1-P4 = L- oder D-Aminosäuren
Xaa = eine Aminosäure mit basischer Seitenkette
bedeuten.The peptide chain is composed of a cleavable by the cathepsins B and / or D sequence and an N-terminal solubility-promoting component and has the general formula
Figure 00030003
in the
P 1 -P 4 = L- or D-amino acids
X aa = an amino acid with a basic side chain
mean.

Die Aminosäuren P1 und P3 sind bevorzugt ausgewählt unter den Aminosäuren Alanin, Glycin, Leucin, Isoleucin, Norleucin, Valin und/oder Phenylalanin. Die Aminosäuren P2 und P4 sind bevorzugt ausgewählt unter den Aminosäuren Leucin, Isoleucin, Norleucin und/oder Phenylalanin.The amino acids P 1 and P 3 are preferably selected from the amino acids alanine, glycine, leucine, isoleucine, norleucine, valine and / or phenylalanine. The amino acids P 2 and P 4 are preferably selected from the amino acids leucine, isoleucine, norleucine and / or phenylalanine.

Die löslichkeitsvermittelnde Gruppe Xaa ist bevorzugt ausgewählt unter den Aminosäuren Arginin, Lysin und Histidin. Eine besonders bevorzugte Gruppe ist Arginin.The solubilizing Group Xaa is preferably selected among the amino acids Arginine, lysine and histidine. A particularly preferred group is Arginine.

Der heterobifunktionelle Crosslinker ist eine Carbonsäure mit einer proteinbindenden Gruppe der allgemeinen Formel

Figure 00040001
in der
k = 0 bis 5
p = 0 bis 6
PM = proteinbindende Gruppe
bedeuten.The heterobifunctional crosslinker is a carboxylic acid having a protein binding group of the general formula
Figure 00040001
in the
k = 0 to 5
p = 0 to 6
PM = protein binding group
mean.

Die proteinbindende Gruppe (PM) ist bevorzugt ausgewählt unter einer 2-Dithiopyridylgruppe, einer Halogenacetamidgruppe, einer Halogenacetatgruppe, einer Disulfidgruppe, einer Acrylsäureestergruppe, einer Monoalkylmaleinsäureestergruppe, einer Monoalkylmaleaminsäureamidgruppe, einer N-Hydroxysuccinimidylestergruppe, einer Isothiocyanatgruppe, einer Aziridingruppe oder einer Maleinimidgruppe. Eine besonders bevorzugte proteinbindende Gruppe ist die Maleinimidgruppe.The protein binding group (PM) is preferably selected from a 2-dithiopyridyl group, a haloacetamide group, a haloacetate group, a disulfide group, an acrylic ester group, a monoalkylmaleic acid ester group, a monoalkylmaleamic acid amide group, an N-hydroxysuccinimidyl ester group, an isothiocyanate group, an aziridine group or a maleimide group. A special preferred protein binding group is the maleimide group.

Wirkstoff und Spacermolekül sind durch eine Esterbindung zwischen der 20-Hydroxygruppe des Wirkstoffs und einer Carboxylgruppe des Spacermoleküls verbunden. Die Bindung zwischen Spacermolekül und der Crosslinker-Peptid-Einheit besteht aus einer Amidbindung zwischen der Aminogruppe des Spacermoleküls und der C-terminalen Carboxylgruppe der Crosslinker-Peptid-Einheit. Die Bindung zwischen Crosslinker und der Peptidkette besteht aus einer Amidbindung zwischen dem N-Terminus der Peptidkette und der Carboxylgruppe des Crosslinkers.active substance and spacer molecule are by an ester bond between the 20-hydroxy group of the active ingredient and a Carboxyl group of the spacer molecule connected. The bond between spacer molecule and the crosslinker-peptide unit consists of an amide bond between the amino group of the spacer molecule and the C-terminal carboxyl group of the crosslinker peptide unit. The Binding between crosslinker and the peptide chain consists of a Amide bond between the N-terminus of the peptide chain and the carboxyl group of the Crosslinker.

Eine wesentliche Eigenschaft der erfindungsgemäßen CPT-Derivate besteht darin, dass die Bindungen zwischen Wirkstoff und Spacermolekül sowie zwischen Spacermolekül und. dem Crosslinker hydrolytisch und/oder enzymatisch unter Beteiligung der Cathepsine B und/oder D spaltbar sind, wodurch eine kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs oder eines Aminoacyl-Wirkstoff-Derivates in Tumorgewebe ermöglicht wird. Die Cathepsine B und D werden in vielen humanen Tumoren überexprimiert, wodurch sie einen idealen Angriffspunkt für eine Targetorientierte, enzymatische Aktivierung von Prodrugs darstellen (Yan, S., et al. Biol. Chem. 1998, 2, 113–123, Leto, G., et al. Clin. Exp. Metastasis 2004, 91–106). Des Weiteren zeigen die erfindungsgemäßen CPT-Derivate eine rasche Spaltung in experimentellen Tumorhomogenaten (siehe Beispiel 5).A essential property of the CPT derivatives according to the invention is that the bonds between drug and spacer molecule as well between spacer molecule and. the crosslinker hydrolytically and / or enzymatically with participation the Cathepsins B and / or D are cleavable, creating a controlled release the active ingredient or an aminoacyl drug derivative in tumor tissue allows becomes. Cathepsins B and D are overexpressed in many human tumors, making them an ideal target for a target-oriented, enzymatic Activation of prodrugs (Yan, S., et al., Biol. Chem. 2, 113-123, Leto, G., et al. Clin. Exp. Metastasis 2004, 91-106). Further show the CPT derivatives of the invention a rapid cleavage in experimental tumor homogenates (see Example 5).

Die Herstellung der erfindungsgemäßen CPT-Derivate erfolgt bevorzugt durch Kondensation von Camptothecin-Derivaten der allgemeinen Formel

Figure 00050001
in der
R1 = H oder OH
R2 = H, NH2, NO2 oder N,N-Dimethylaminomethyl
R3 = H oder Ethyl
bedeuten, mit Spacern der allgemeinen Formel
Figure 00060001
worin
R = eine dem Fachmann geläufige Schutzgruppe für Amine, bevorzugt Boc oder Fmoc
R4 = H, Alkyl oder Aryl, bevorzugt H
R5 = H, Alkyl oder Aryl, gegebenenfalls substituiert, bevorzugt H oder Methyl
n = 0 bis 3
bedeuten.The preparation of the CPT derivatives according to the invention is preferably carried out by condensation of camptothecin derivatives of the general formula
Figure 00050001
in the
R 1 = H or OH
R 2 = H, NH 2 , NO 2 or N, N-dimethylaminomethyl
R 3 = H or ethyl
mean, with spacers of the general formula
Figure 00060001
wherein
R = a protective group for amines known to the person skilled in the art, preferably Boc or Fmoc
R 4 = H, alkyl or aryl, preferably H
R 5 = H, alkyl or aryl, optionally substituted, preferably H or methyl
n = 0 to 3
mean.

Dabei werden als Reagenzien zur Aktivierung der Carboxylgruppe des Spacers vorzugsweise N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIPC), (Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium-Hexafluorophosphat (BOP), O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat (HATU) oder 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid unter Zusatz gängiger Katalysatoren bzw. Hilfsbasen wie z. B. Trialkylamine, Pyridin, 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder Hydroxybenzotriazol (HOBt) und/oder Scandium(III)trifluormethansulfonat eingesetzt. Die Umsetzung erfolgt zweckmäßig in einem polar-aprotischen organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in Dichlormethan, N,N-Dimethylformamid und Tetrahydrofuran. Die Umsetzungen werden zweckmäßig bei Temperaturen zwischen –10°C und Raumtemperatur durchgeführt, wobei die Reaktionszeit normalerweise zwischen 30 Minuten und 48 Stunden liegt. Die Aufarbeitung kann z. B. durch Umkristallisation aus Methanol oder Ethanol, oder durch Säulenchromatographie z. B. an Kieselgel erfolgen. Hierbei verwendete Laufmittel sind bevorzugt Chloroform-Methanol-Gemische, die gegebenenfalls Zusätze von Aminen oder Carbonsäuren enthalten können.N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIPC), (benzotriazol-1-yloxy) tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP), O, are preferably used as reagents for activating the carboxyl group of the spacer - (Azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) or 2-chloro-1-methylpyridinium iodide with addition of common catalysts or auxiliary bases such. B. trialkylamines, pyridine, 4-dimethylaminopyridine (DMAP) or hydroxybenzotriazole (HOBt) and / or scandium (III) trifluoromethanesulfonate used. The reaction is conveniently carried out in a polar aprotic organic solvent, preferably in dichloromethane, N, N-dimethylformamide and tetrahydrofuran. The reactions are conveniently carried out at temperatures between -10 ° C and room temperature, the reaction time normally being between 30 minutes and 48 hours. The workup may, for. B. by recrystallization from methanol or ethanol, or by column chromatography z. B. on silica gel. The mobile phase used here are preferably chloroform-methanol mixtures which may optionally contain additions of amines or carboxylic acids.

Anschließend wird die Schutzgruppe der Amino-Funktion entfernt. Diese Abspaltung kann z. B. durch Behandlung mit Trifluoressigsäure/Dichlormethan-Gemischen oder Piperidin erreicht werden. In einer für das Verfahren bevorzugten Ausführungsweise wird die Boc-geschütze Prodrugvorstufe 30 min mit Trifluoressigsäure/Dichlormethan 1:1 behandelt und das Produkt durch Fällung mit Diethylether isoliert.Subsequently, will removed the protective group of the amino function. This splitting can z. B. by treatment with trifluoroacetic acid / dichloromethane mixtures or piperidine can be achieved. In a preferred for the process FOR CARRYING OUT becomes the Boc-gunner Prodrug precursor treated with trifluoroacetic acid / dichloromethane 1: 1 for 30 min and the product by precipitation isolated with diethyl ether.

Danach wird die erhaltene Prodrugvorstufe, der allgemeinen Formel

Figure 00070001
worin
R1 = H oder OH
R2 = H, NH2, NO2 oder N,N-Dimethylaminomethyl
R3 = H oder Ethyl
R4 = H, Alkyl oder Aryl, bevorzugt H
R5 = H, Alkyl oder Aryl, gegebenenfalls substituiert, bevorzugt H, Methyl
n = 0 bis 3
bedeuten, durch Kondensation umgesetzt mit einer Crosslinker-Peptid-Einheit der allgemeinen Formel
Figure 00070002
worin
m = 1 bis 3
k = 0 bis 5
p = 0 bis 6
PM = proteinbindende Gruppe
bedeuten.Thereafter, the resulting prodrug precursor, the general formula
Figure 00070001
wherein
R 1 = H or OH
R 2 = H, NH 2 , NO 2 or N, N-dimethylaminomethyl
R 3 = H or ethyl
R 4 = H, alkyl or aryl, preferably H
R 5 = H, alkyl or aryl, optionally substituted, preferably H, methyl
n = 0 to 3
mean, converted by condensation with a crosslinker peptide unit of the general formula
Figure 00070002
wherein
m = 1 to 3
k = 0 to 5
p = 0 to 6
PM = protein binding group
mean.

Dabei werden als Reagenzien zur Aktivierung der Carboxylgruppe der Crosslinker-Peptid-Einheit vorzugsweise O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat (HATU), (Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium-Hexafluorophosphat (BOP), N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIPC), N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid unter Zusatz gängiger Katalysatoren bzw. Hilfsbasen wie z. B. N-Ethyldiisopropylamin (DIEA), Trialkylamine, Pyridin, 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder Hydroxybenzotriazol (HOBt) eingesetzt. Die Umsetzung erfolgt zweckmäßig in einem polaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in N,N-Dimethylformamid. Die Umsetzungen werden zweckmäßig bei Temperaturen zwischen –10°C und Raumtemperatur durchgeführt, wobei die Reaktionszeit normalerweise zwischen 30 Minuten und 48 Stunden liegt. Die Aufarbeitung erfolgt z. B. durch Säulenchromatographie bevorzugt an C18-RP-Kieselgel. Bevorzugt verwendete Laufmittel sind hierbei Acetonitril-Wasser-Gemische, die gegebenenfalls Zusätze von Aminen oder Carbonsäuren, bevorzugt Trifluoressigsäure, enthalten können.In this case, as reagents for activating the carboxyl group of the crosslinker-peptide unit preferably O- (azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU), (benzotriazol-1-yloxy) tris (Dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP), N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIPC), N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) or 2-chloro-1-methylpyridinium iodide with addition of conventional catalysts or auxiliary bases such. As N-ethyldiisopropylamine (DIEA), trialkylamines, pyridine, 4-dimethylaminopyridine (DMAP) or hydroxybenzotriazole (HOBt) used. The reaction is expediently carried out in a polar organic solvent, preferably in N, N-dimethylformamide. The reactions are conveniently carried out at temperatures between -10 ° C and room temperature, the reaction time normally being between 30 minutes and 48 hours. The workup is z. B. by column chromatography, preferably on C 18 RP silica gel. Preferably used mobile phase are acetonitrile-water mixtures, which may optionally contain additions of amines or carboxylic acids, preferably trifluoroacetic acid.

Nach einer bevorzugten Ausführungsweise wird Camptothecin zuerst mit Bocgeschützter 4-Aminobutansäure (Boc-GABA) und nachfolgender Abspaltung der Schutzgruppe zum Camptothecin-20-O-(4-aminobutanoat)-Trifluoracetat umgesetzt, welches anschließend mit EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-OH (EMC = 6-Maleinimidocapronsäure) unter Benutzung von HATU als Kopplungsreagenz kondensiert wird (siehe Beispiel 1).To a preferred embodiment camptothecin is first labeled with Boc protected 4-aminobutyric acid (Boc-GABA) and subsequent deprotection of camptothecin-20-O- (4-aminobutanoate) trifluoroacetate implemented, which subsequently with EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-OH (EMC = 6-maleimidocaproic acid) under Use of HATU as a coupling reagent is condensed (see Example 1).

Durch die Verwendung löslichkeitsvermittelnder Arginingruppen lässt sich die Wasserlöslichkeit gegenüber CPT signifikant steigern. Solche Verbindungen weisen typischerweise eine gegenüber CPT um mehr als 400-fach gesteigerte Löslichkeit in isotonischer Kochsalzlösung auf (siehe Beispiel 2).By the use of solubilizing Argining groups lets the water solubility across from Significantly increase CPT. Such compounds typically one opposite CPT increased by more than 400-fold solubility in isotonic saline (see Example 2).

Die erfindungsgemäßen proteinbindenden Camptothecin-Derivate werden parenteral, bevorzugt intravenös appliziert. Dazu werden die erfindungsgemäßen CPT-Derivate als Lösungen, Feststoffe oder Lyophilisate, gegebenenfalls unter Verwendung üblicher Hilfsstoffe bereitgestellt. Solche Hilfsstoffe sind beispielsweise Polysorbate, Glucose, Lactose, Mannitol, Dextrane, Zitronensäure, Tromethamol, Triethanolamin, Aminoessigsäure und/oder synthetische Polymere. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen CPT-Derivate in einem isotonischen Puffer gelöst appliziert. Die Löslichkeit des CPT-Derivates kann gegebenenfalls durch pharmazeutische Lösungsmittel wie etwa 1,2-Propandiol, Ethanol, Isopropanol, Glycerol und/oder Poly(ethylenglykol) mit einem Molekulargewicht von 200 bis 600 g/mol, bevorzugt Poly(ethylenglykol) mit einem Molekulargewicht von 600 g/mol, und/oder Löslichkeitsvermittler wie z. B. Tween 80, Cremophor oder Polyvinylpyrrolidon verbessert werden.The protein binding agents according to the invention Camptothecin derivatives are administered parenterally, preferably intravenously. These are the CPT derivatives of the invention as solutions, Solids or lyophilisates, optionally using conventional Auxiliary materials provided. Such adjuvants are, for example Polysorbates, glucose, lactose, mannitol, dextranes, citric acid, tromethamol, Triethanolamine, aminoacetic acid and / or synthetic polymers. Preference is given to the CPT derivatives according to the invention dissolved in an isotonic buffer applied. The solubility of the CPT derivative may optionally be controlled by pharmaceutical solvents such as 1,2-propanediol, ethanol, isopropanol, glycerol and / or Poly (ethylene glycol) having a molecular weight of 200 to 600 g / mol, preferably poly (ethylene glycol) having a molecular weight of 600 g / mol, and / or solubilizer such as B. Tween 80, Cremophor or polyvinylpyrrolidone improved become.

Ein wesentliches Merkmal der erfindungsgemäßen CPT-Derivate liegt in einer raschen kovalenten Bindung an Serumproteine über die proteinbindende Gruppe, wodurch eine makromolekulare Transportform des Wirkstoffs generiert wird. Von Serumproteinen wie Transferrin, Albumin und LDL ist eine erhöhte Aufnahme in Tumorgewebe bekannt (Kratz F.; Beyer U. Drug Delivery 1998, 5, 281–299), sodass diese im Rahmen der Erfindung als endogene Träger für Zytostatika herangezogen werden können. Ein besonders bevorzugtes Serumprotein ist zirkulierendes Humanserumalbumin (HSA), das mit einer durchschnittlichen Konzentration von 30 bis 50 g/L die Hauptprotein-Komponente des menschlichen Blutes bildet (Peters T. Adv. Protein Chem. 1985, 37, 161–245) und eine freie Cysteingruppe (Cystein-34-Gruppe) an der Oberfläche des Proteins aufweist, welche zur Anbindung von thiolbindenden Gruppen wie Maleinimiden oder Disulfiden geeignet ist (WO 00/76551). Dass das erfindungsgemäße Maleinimid-funktionalisierte CPT-Derivate schnell und selektiv an HSA binden, zeigt Beispiel 3. Die Reaktion der neuen CPT-Derivate mit Serumproteinen kann auch extrakorporal durchgeführt werden, z. B. mit einer zur Infusion vorgesehenen Albumin-, Blut- oder Serummenge.One An essential feature of the CPT derivatives according to the invention lies in one rapid covalent binding to serum proteins via the protein binding group, thereby generating a macromolecular transport form of the active ingredient becomes. Of serum proteins such as transferrin, albumin and LDL is one increased Uptake in tumor tissue known (Kratz F. Beyer U. Drug Delivery 1998, 5, 281-299), so that they are within the scope of the invention as endogenous carrier for cytostatics can be used. A particularly preferred serum protein is circulating human serum albumin (HSA), with an average concentration of 30 to 50 g / L forms the main protein component of human blood (Peters T. Adv. Protein Chem. 1985, 37, 161-245) and a free cysteine group (Cysteine-34 group) on the surface of the protein which is used to bind thiolbindenden groups as Maleinimiden or disulfides is suitable (WO 00/76551). That the maleimide-functionalized invention Shows that CPT derivatives bind HSA rapidly and selectively 3. The reaction of the new CPT derivatives with serum proteins can also be performed extracorporeal, z. B. with an intended for infusion albumin, blood or serum amount.

Gegenüber Camptothecin-Konjugaten mit synthetischen Polymeren als Trägersystemen besitzen die der Erfindung zugrunde liegenden CPT-Peptid-Derivate den Vorteil, chemisch eindeutig definiert zu sein.Compared with camptothecin conjugates with synthetic polymers as carrier systems have the Invention underlying CPT-peptide derivatives the advantage chemically to be clearly defined.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung näher.The explain the following examples the invention in conjunction with the accompanying drawings closer.

In der Zeichnung stellen dar:In of the drawing represent:

1 ein Chromatogramm von humanem Blutplasma; bei λ = 370 nm ist lediglich eine geringfügige Absorption zu beobachten. 1 a chromatogram of human blood plasma; at λ = 370 nm only a slight absorption is observed.

2 ein Chromatogramm von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT, das zuvor 30 min mit humanem Plasma inkubiert wurde (Detektion bei λ = 280 und 370 nm). 2 a chromatogram of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT previously incubated with human plasma for 30 min (detection at λ = 280 and 370 nm).

3 ein Chromatogramm des HSA-Konjugats von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT nach Spaltung durch Cathepsin B. 3 a chromatogram of the HSA conjugate of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT after cleavage by Cathepsin B.

4 ein Chromatogramm des HSA-Konjugats von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT nach Spaltung in HT29-Kolorektaltumor-Homogenat bei pH 5,0. 4 a chromatogram of the HSA conjugate of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT after cleavage into HT29 colorectal tumor homogenate at pH 5.0.

5 ein Chromatogramm des HSA-Konjugats von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT nach Spaltung in HT29-Kolorektaltumor-Homogenat bei pH 7,4. 5 a chromatogram of the HSA conjugate of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT after cleavage into HT29 colorectal tumor homogenate at pH 7.4.

Beispiel 1 Herstellung von Camptothecin-20-O-(L-Alaninat)-Trifluoracetat

Figure 00100001
Example 1 Preparation of camptothecin-20-O- (L-alaninate) trifluoroacetate
Figure 00100001

Zu einer Suspension von Boc-L-Alanin (489 mg, 2.58 mmol), Camptothecin (300 mg, 0.861 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (330 mg, 2.58 mmol) sowie Scandium(III)trifluormethansulfonat (256 mg, 1.46 mmol) in 30 mL Dichlormethan wird unter Stickstoffatmosphäre bei –8°C N,N'-Diisopropylcarbodiimid (426 μL, 2.76 mmol) gegeben und 30 Minuten gerührt. Anschließend wird die Reaktionsmischung 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, die Feststoffe abfiltriert und das Filtrat jeweils einmal mit 60 mL 0.1 N HCl, 0.1 M NaHCO3 und destilliertem Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach Umkristallisation des Rückstands aus Methanol und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe durch 30 minütige Behandlung mit 1 mL Trifluoressigsäure/Dichlormethan (1:1) erhält man 292 mg Camptothecin-20-O-(L-alaninat)-Trifluoracetat als blassgelben Feststoff.To a suspension of Boc-L-alanine (489 mg, 2.58 mmol), camptothecin (300 mg, 0.861 mmol), 4-dimethylaminopyridine (330 mg, 2.58 mmol) and scandium (III) trifluoromethanesulfonate (256 mg, 1.46 mmol) in 30 mL of dichloromethane is added under nitrogen atmosphere at -8 ° C, N'-diisopropylcarbodiimide (426 μL, 2.76 mmol) and stirred for 30 minutes. The reaction mixture is then stirred for 2 hours at room temperature, the solids are filtered off and the filtrate is washed once each with 60 ml of 0.1 N HCl, 0.1 M NaHCO 3 and distilled water. The organic phase is dried over magnesium sulfate and the solvent removed in vacuo. Recrystallization of the residue from methanol and cleavage of the Boc protecting group by treatment with 1 mL trifluoroacetic acid / dichloromethane (1: 1) for 30 minutes gives 292 mg camptothecin-20-O- (L-alaninate) trifluoroacetate as a pale yellow solid.

Beispiel 2 Herstellung von Camptothecin-20-O-(3-Aminopropanoat)-Trifluoracetat

Figure 00110001
Example 2 Preparation of camptothecin-20-O- (3-aminopropanoate) trifluoroacetate
Figure 00110001

Zu einer Lösung von Boc-3-Aminopropansäure (489 mg, 2.87 mmol) in 100 mL Dichlormethan werden bei 0°C Camptothecin (300 mg, 0.861 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (210 mg, 1.72 mmol) sowie N,N'-Diisopropylcarbodiimid (420 μL, 2.87 mmol) unter Stickstoffatmosphäre gegeben und die entstandene Suspension sechzehn Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei eine klare Lösung entsteht. Anschließend wird zweimal mit 100 mL 0.1 N HCl gewaschen, die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach Umkristallisation des Rückstands aus Methanol und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe durch 30 minütige Behandlung mit 1 mL Trifluoressigsäure/Dichlormethan (1:1) erhält man 310 mg Camptothecin-20-O-(4-aminobutanoat)-Trifluoracetat als blassgelben Feststoff.To a solution of Boc-3-aminopropanoic acid (489 mg, 2.87 mmol) in 100 mL dichloromethane at 0 ° C camptothecin (300 mg, 0.861 mmol), 4-dimethylaminopyridine (210 mg, 1.72 mmol) and N, N'-diisopropylcarbodiimide (420 μL, 2.87 mmol) under a nitrogen atmosphere and the resulting Suspension stirred for sixteen hours at room temperature, wherein a clear solution arises. Subsequently is washed twice with 100 mL of 0.1 N HCl, the organic phase over magnesium sulfate dried and the solvent removed in a vacuum. After recrystallization of the residue from methanol and cleavage of the Boc protecting group by treatment with 1 mL trifluoroacetic acid / dichloromethane for 30 minutes (1: 1) receives 310 mg camptothecin-20-O- (4-aminobutanoate) trifluoroacetate as a pale yellow solid.

Beispiel 3 Herstellung von Camptothecin-20-O-[(((((((6-maleinimidohexanoyl)arginyl)arginyl)alanyl)leucyl)alanyl)leucyl)-4-aminobutanoat] (abgekürzt EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT)

Figure 00120001
Example 3 Preparation of camptothecin-20-O - [((((((6-maleinidohexanoyl) arginyl) arginyl) alanyl) leucyl) alanyl) leucyl) -4-aminobutanoate] (abbreviated EMC-Arg-Arg-Ala-Leu Ala-Leu-GABA-CPT)
Figure 00120001

Zu einer Lösung von Boc-4-aminobutansäure (583 mg, 2.87 mmol) in 100 mL Dichlormethan werden bei 0°C Camptothecin (300 mg, 0.861 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (210 mg, 1.72 mmol) sowie N,N'-Diisopropylcarbodiimid (420 μL, 0.861 mmol) unter Stickstoffatmosphäre gegeben und die entstandene Suspension sechzehn Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei eine klare Lösung entsteht. Anschließend wird zweimal mit 100 mL 0.1 N HCl gewaschen, die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach Umkristallisation des Rückstands aus Methanol und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe durch 30 minütige Behandlung mit 1 mL Trifluoressigsäure/Dichlormethan (1:1) erhält man 310 mg Camptothecin-20-O-(4-aminobutanoat)-Trifluoracetat als blassgelben Feststoff.To a solution of Boc-4-aminobutyric acid (583 mg, 2.87 mmol) in 100 mL dichloromethane at 0 ° C camptothecin (300 mg, 0.861 mmol), 4-dimethylaminopyridine (210 mg, 1.72 mmol) and N, N'-diisopropylcarbodiimide (420 μL, 0.861 mmol) under a nitrogen atmosphere and the resulting Suspension stirred for sixteen hours at room temperature, wherein a clear solution arises. Subsequently is washed twice with 100 mL of 0.1 N HCl, the organic phase over magnesium sulfate dried and the solvent removed in a vacuum. After recrystallization of the residue from methanol and cleavage of the Boc protecting group by treatment with 1 mL trifluoroacetic acid / dichloromethane for 30 minutes (1: 1) receives 310 mg camptothecin-20-O- (4-aminobutanoate) trifluoroacetate as a pale yellow solid.

Anschließend wird zu einer Lösung von Camptothecin-20-O-(4-aminobutanoat)-Trifluoracetat (43 mg, 0.079 mmol), [((((6-(Maleinimidohexanoyl)arginyl)arginyl)alanyl)leucyl)alanyl]leucin-Trifluoracetat (100 mg, 0.087 mmol) und N-Ethyldiisopropylamin (54 μL, 0.316 mmol) in 1.5 mL N,N-Dimethylformamid, O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat (33 mg, 0.087 mmol) unter Stickstoffatmosphäre gegeben und 35 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag im Vakuum getrocknet. Die Reinigung des Rohprodukts erfolgt durch präparative C18-RP-HPLC (Acetonitril/Wasser 40:60, 0.1% Trifluoressigsäure). Nach Lyophilisation erhält man 96 mg der Zielverbindung als leuchtend gelben Feststoff.
ESI-MS (4.0 kV, MeOH): m/z (%) 1307.6 ([M + H]+, 100), 1329.5 ([M + Na]+, 96) HPLC-Reinheit (λ = 370 nm, C18-RP-Säule, Acetonitril/Wasser 40:60, 0.1% TFA): > 95%Then, to a solution of camptothecin 20-O- (4-aminobutanoate) trifluoroacetate (43 mg, 0.079 mmol), [(((6- (maleimidohexanoyl) arginyl) arginyl) alanyl) leucyl) alanyl] leucine trifluoroacetate (100 mg, 0.087 mmol) and N-ethyldiisopropylamine (54 μL, 0.316 mmol) in 1.5 mL of N, N-dimethylformamide, O- (aza-benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (33 mg, 0.087 mmol) under nitrogen atmosphere and stirred for 35 minutes at room temperature. The product is precipitated with diethyl ether and the precipitate is dried in vacuo. The crude product is purified by preparative C 18 RP-HPLC (acetonitrile / water 40:60, 0.1% trifluoroacetic acid). After lyophilization, 96 mg of the target compound are obtained as a bright yellow solid.
ESI-MS (4.0 kV, MeOH): m / z (%) 1307.6 ([M + H] +, 100), 1329.5 ([M + Na] +, 96) HPLC purity (λ = 370 nm, C 18 RP column, acetonitrile / water 40:60, 0.1% TFA):> 95%

Beispiel 4 Löslichkeit von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT in isotonischer Kochsalzlösung.

Figure 00130001
Example 4 Solubility of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT in Isotonic Saline.
Figure 00130001

Ergebnis:Result:

Die erfindugsgemäßen CPT-Derivate zeigen somit gegenüber CPT eine um mehr als 400-fach gesteigerte Löslichkeit in isotonischer Kochsalzlösung.The inventive CPT derivatives thus show against CPT more than 400-fold increased solubility in isotonic saline.

Beispiel 5Example 5

Bindung von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT an HSA im HumanplasmaBinding of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT on HSA in human plasma

Humanplasma wurde durch Chromatographie an einer C18-RP-HPLC-Säule (Symmetry® 300-5 4.6 × 250 mm von Waters) durch Gradientenelution (Fluss: 1.2-1.8 mL/min; Eluent A: 30% 200 mM K2HPO4 pH 7, 70% Acetonitril; Eluent B: 72.5% 200 mM K2HPO4 pH 7, 28.5% Acetonitril; Gradient: 26 min Eluent B isokrat., 15 min 0–100% Eluent A linear) in seine Proteinbestandteile aufgetrennt und bei 254 nm detektiert (siehe 1).Human plasma was by chromatography on a C 18 RP-HPLC column (Symmetry ® 300-5 4.6 x 250 mm Waters) by gradient elution (flow: 1.2-1.8 mL / min; mobile phase A: 30% 200 mM K 2 HPO 4 pH 7, 70% acetonitrile; eluent B: 72.5% 200 mM K 2 HPO 4 pH 7, 28.5% acetonitrile; gradient: 26 min eluent B isocrat., 15 min 0-100% eluent A linear) into its protein constituents and at 254 nm detected (see 1 ).

Nun werden 1.56 mg EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT in 200 μL Tris-Puffer (pH 7.4) bei Raumtemperatur gelöst (5 mM Lösung) und 10 μL dieser Lösung mit 490 μL Humanplasma 30 min lang bei 37°C inkubiert und die Probe anschließend auf die C18-RP-HPLC-Säule aufgetragen (Methode s. oben). Bei Messung der Absorption bei 370 nm zeigt sich, dass der überwiegende Teil von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT an Albumin gebunden vorliegt (siehe 2).Now 1.56 mg of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT are dissolved in 200 μL Tris buffer (pH 7.4) at room temperature (5 mM solution) and 10 μL of this solution with 490 μL human plasma for 30 min long incubated at 37 ° C and the sample then applied to the C 18 RP-HPLC column (method see above). Measuring absorbance at 370 nm reveals that the majority of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT is bound to albumin (see 2 ).

Beispiel 6Example 6

Stabilität von HSA-Konjugaten von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT- in HumanplasmaStability of HSA conjugates of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT in human plasma

Die Plasmastabilität der durch Inkubation von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT mit humanem Blutplasma generierten HSA-Konjugate wird mit der in Beispiel 3 beschriebenen HPLC-Methode durch Messung der Abnahme der Peakflächen (λ = 370 nm) bestimmt:
Konjugat mit EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT: nach 48 h sind noch > 95% des HSA-Konjugats vorhanden.The plasma stability of the HSA conjugates generated by incubation of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT with human blood plasma is measured by the HPLC method described in Example 3 by measuring the decrease in the peak areas (λ = 370 nm) determined:
Conjugate with EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT: after 48 h,> 95% of the HSA conjugate is still present.

Somit zeigt das Konjugat eine gute Stabilität in Humanplasma.Consequently the conjugate shows good stability in human plasma.

Beispiel 7Example 7

Enzymatische Spaltung von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT durch Cathepsin BEnzymatic cleavage of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT by Cathepsin B

1.56 mg EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT werden in 200 μL Tris-Puffer pH 7.4 (für Cathepsin B) gelöst. 10 μL dieser Lösung werden über 30 Minuten mit 40 μL einer 20%igen HSA-Lösung bei 37°C inkubiert. Nachfolgend werden 10 μL Cathepsin-B-Lösung (71.7 μg/ml) zugegeben und jeweils mit Puffer auf ein Volumen von 500 μL verdünnt.1:56 mg of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT are dissolved in 200 μL Tris buffer pH 7.4 (for Cathepsin B) solved. 10 μL of this solution be over 30 minutes with 40 μL a 20% HSA solution incubated at 37 ° C. Below are 10 μL Cathepsin B solution (71.7 μg / ml) added and each diluted with buffer to a volume of 500 μL.

Die Bestimmung der Spaltprodukte erfolgt mit der in Beispiel 3 beschriebenen HPLC-Methode (3).The determination of the cleavage products is carried out using the HPLC method described in Example 3 ( 3 ).

Ergebnis:Result:

Nach nur zweistündiger Spaltung mit Cathepsin B ist nach einer Retentionszeit von 13 Minuten ein niedermolekulares CPT-Derivat, sowie nach 5 Minuten CPT-GABA erkennbar.To only two hours Cathepsin B cleavage is after a retention time of 13 minutes a low molecular weight CPT derivative and after 5 minutes CPT-GABA recognizable.

Beispiel 8Example 8

Enzymatische Spaltung von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT in HT29-Kolorektaltumor-HomogenatEnzymatic cleavage of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT in HT29 colorectal tumor homogenate

1.56 mg EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT werden in 200 μL Tris-Puffer pH 7.4 bzw. Natriumacetat-Puffer pH 5.0 gelöst. 10 μL dieser Lösung werden über 30 Minuten mit 40 μL einer 20%igen HSA-Lösung bei 37°C inkubiert. Nachfolgend werden 10 μL HT29-Kolorektaltumor-Homogenat zugegeben und mit Puffer auf ein Volumen von 500 μL verdünnt.1:56 mg of EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT are dissolved in 200 μL Tris buffer pH 7.4 or sodium acetate buffer pH 5.0 dissolved. 10 μL of this solution will last for 30 minutes with 40 μL a 20% HSA solution at 37 ° C incubated. Below are 10 μL HT29 colorectal tumor homogenate added and buffered Volume of 500 μL diluted.

Herstellung des Tumor-Homogenats: Das Tumormaterial wird mittels eines Skalpells stark zerkleinert und 200 mg der Masse werden mit 800 μL Puffer (Tris-Puffer pH 7.4 bzw. Natriumacetat-Puffer pH 5.0) unter Zusatz von 3–4 Glasperlen im Schüttler homogenisiert. Anschließend wird bei 4°C zentrifugiert und der Überstand auf 200 μL aliquotiert.manufacturing of the tumor homogenate: The tumor material is determined by means of a scalpel heavily crushed and 200 mg of the mass are mixed with 800 μL buffer (Tris buffer pH 7.4 or sodium acetate buffer pH 5.0) with addition from 3-4 Glass beads in shaker homogenized. Subsequently is at 4 ° C centrifuged and the supernatant to 200 μL aliquoted.

Die Bestimmung der Spaltprodukte erfolgt mit der in Beispiel 3 beschriebenen HPLC-Methode (4 und 5).The determination of the cleavage products is carried out using the HPLC method described in Example 3 ( 4 and 5 ).

Ergebnis:Result:

Bei pH 5.0 ist nach 2 Stunden CPT-GABA erkennbar.at pH 5.0 is detectable after 2 hours CPT-GABA.

Bei pH 7.4 ist nach 2 Stunden ebenfalls CPT-GABA sowie nach 24 Stunden CPT als Spaltprodukt erkennbar.at pH 7.4 is also CPT-GABA after 2 hours and after 24 hours CPT recognizable as a cleavage product.

Somit ist eine Aktivierung des erfindungsgemäßen CPT-Derivates im experimentellen Tumor-Homogenat in seine Wirkformen nachgewiesen.Consequently is an activation of the CPT derivative of the invention in the experimental Tumor homogenate detected in its active forms.

Claims (26)

Ein Camptothecin-Derivat der Formel I:
Figure 00160001
worin R1 = H oder OH R2 = H, NH2, NO2 oder N,N-Dimethylaminomethyl R3 = H oder Ethyl R4 = H, Alkyl oder Aryl R5 = H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl P1, P3 = Alanin, Glycin, Leucin, Isoleucin, Norleucin, Valin und/oder Phenylalanin P2, P4 = Leucin, Isoleucin, Norleucin und/oder Phenylalanin Xaa = Aminosäure mit basischer Seitenkette n = 0 bis 3 m = 1 bis 3 k = 0 bis 5 p = 0 bis 6 PM eine proteinbindende Gruppe bedeutet.A camptothecin derivative of the formula I:
Figure 00160001
wherein R 1 = H or OH R 2 = H, NH 2 , NO 2 or N, N-dimethylaminomethyl R 3 = H or ethyl R 4 = H, alkyl or aryl R 5 = H, optionally substituted alkyl or aryl P 1 , P 3 = alanine, glycine, leucine, isoleucine, norleucine, valine and / or phenylalanine P 2 , P 4 = leucine, isoleucine, norleucine and / or phenylalanine X aa = amino acid with basic side chain n = 0 to 3 m = 1 to 3 k = 0 to 5 p = 0 to 6 PM means a protein binding group. Camptothecin-Derivat gemäß Anspruch 1, wobei PM eine Maleinimidgruppe, eine 2-Dithiopyridylgruppe, eine Halogenacetamidgruppe, eine Halogen acetatgruppe, eine Disulfidgruppe, eine Acrylsäureestergruppe, eine Monoalkylmaleinsäureestergruppe, eine Monoalkylmaleaminsäureamidgruppe, eine N-Hydroxysuccinimidylestergruppe, eine Isothiocyanatgruppe oder eine Aziridingruppe ist, die gegebenenfalls substituiert sein kann.Camptothecin derivative according to claim 1, wherein PM is a Maleimide group, a 2-dithiopyridyl group, a haloacetamide group, a haloacetate group, a disulfide group, an acrylic acid ester group, a monoalkylmaleic acid ester group, a monoalkylmaleamic acid amide group, an N-hydroxysuccinimidyl ester group, an isothiocyanate group or an aziridine group which may be optionally substituted. Camptothecin-Derivat nach Anspruch 2, wobei PM eine Maleinimidgruppe ist, die gegebenenfalls substituiert sein kann.Camptothecin derivative according to claim 2, wherein PM is a Maleimide group, which may be optionally substituted. Camptothecin-Derivat nach Anspruch 1, worin R1 = OH, R2 = N,N-Dimethylaminomethyl und R3 = H ist.A camptothecin derivative according to claim 1 wherein R 1 = OH, R 2 = N, N-dimethylaminomethyl and R 3 = H. Camptothecin-Derivat nach Anspruch 3, worin R1 = H, R2 = H und R3 = H ist.A camptothecin derivative according to claim 3, wherein R 1 = H, R 2 = H and R 3 = H. Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin R4 = H, R5 = H, Methyl, Hydroxymethyl, Phenylmethyl, 4-Hydroxyphenylmethyl, Imidazolylmethyl, Indolylmethyl, CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2, CH(CH3)CH2CH3, CH(OH)CH3, CH2COOH, CH2CH2COOH, CH2CONH2, CH2CH2CONH2, CH2(CH2)3NH2, CH2CH2SCH3 oder CH2(CH2)2NHC(NH)NH2 ist.Camptothecin derivative according to any one of the preceding claims, wherein R 4 = H, R 5 = H, methyl, hydroxymethyl, phenylmethyl, 4-hydroxyphenylmethyl, imidazolylmethyl, indolylmethyl, CH (CH 3 ) 2 , CH 2 CH (CH 3 ) 2 , CH (CH 3 ) CH 2 CH 3 , CH (OH) CH 3 , CH 2 COOH, CH 2 CH 2 COOH, CH 2 CONH 2 , CH 2 CH 2 CONH 2 , CH 2 (CH 2 ) 3 NH 2 , CH 2 CH 2 SCH 3 or CH 2 (CH 2 ) 2 NHC (NH) NH 2 . Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin P1 und P3 gleich oder unterschiedlich sind und Alanin, Glycin, Leucin, Isoleucin, Norleucin, Valin oder Phenylalanin bedeuten.Camptothecin derivative according to any one of the preceding claims, wherein P 1 and P 3 are the same or different and denote alanine, glycine, leucine, isoleucine, norleucine, valine or phenylalanine. Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin P2 und P4 gleich oder unterschiedlich sind und Leucin, Isoleucin, Norleucin oder Phenylalanin bedeuten.Camptothecin derivative according to any one of the preceding claims, wherein P 2 and P 4 are the same or different and denote leucine, isoleucine, norleucine or phenylalanine. Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin Xaa = Arginin, Lysin oder Histidin bedeuten.Camptothecin derivative according to any one of the preceding claims, wherein X aa = arginine, lysine or histidine. Camptothecin-Derivat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin n = 0 bis 3, m = 1 bis 3, k = 0 bis 5 und p = 0 bis 6 ist.Camptothecin derivative according to any one of the preceding Claims, wherein n = 0 to 3, m = 1 to 3, k = 0 to 5 and p = 0 to 6. Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin Xaa = Arginin und m = 2 bedeuten.Camptothecin derivative according to any one of the preceding claims, wherein X aa = arginine and m = 2. Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin P1, P3 = Alanin und P2, P3 = Leucin bedeuten.Camptothecin derivative according to any one of the preceding claims, wherein P 1 , P 3 = alanine and P 2 , P 3 = leucine. Verfahren zur Herstellung von Camptothecin-Derivaten nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Camptothecin-Derivat der allgemeinen Formel II
Figure 00180001
in der R1 = H oder OH R2 = H, NH2, NO2 oder N,N-Dimethylaminomethyl R3 = H oder Ethyl bedeuten, wobei etwaige nukleophile Gruppen an R1, R2 und R5 gegebenenfalls durch geeignete Schutzgruppen geschützt vorliegen, mit einem Spacer der allgemeinen Formel III
Figure 00180002
in der R = Boc-Schutzgruppe oder andere gängige Aminoschutzgruppe R4 = H, Alkyl oder Aryl R5 = H, Alkyl oder Aryl n = 0 bis 3 PM = eine proteinbindende Gruppe bedeuten, in Gegenwart von Carbonsäure-Aktivierungsreagenzien und unter Zusatz gängiger Katalysatoren bzw. Hilfsbasen umgesetzt werden.Process for the preparation of camptothecin derivatives according to one of the preceding claims, characterized in that a camptothecin derivative of the general formula II
Figure 00180001
in which R 1 = H or OH, R 2 = H, NH 2 , NO 2 or N, N-dimethylaminomethyl R 3 = H or ethyl, where any nucleophilic groups on R 1 , R 2 and R 5 are optionally protected by suitable protective groups present, with a spacer of the general formula III
Figure 00180002
in the R = Boc protective group or other common amino-protecting group R 4 = H, alkyl or aryl R 5 = H, alkyl or aryl n = 0 to 3 PM = a protein-binding group, in the presence of carboxylic acid activating agents and with addition of conventional catalysts or auxiliary bases are implemented. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Carbonsäure-Aktivierungsreagenzien N,N'-Diisopropylcarbodiimid, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, (Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium-Hexafluorophosphat oder 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid eingesetz werden.Method according to claim 13, characterized in that in that the carboxylic acid activating reagents are N, N'-diisopropylcarbodiimide, N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (Benzotriazol-1-yloxy) tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate or 2-chloro-1-methylpyridinium iodide. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass als Katalysatoren bzw. Hilfsbasen Trialkylamine, Pyridin, 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder Hydroxybenzotriazol (HOBt) und/oder Scandium(III)trifluormethansulfonat eingesetzt werden.Method according to claim 14, characterized in that that as catalysts or auxiliary bases trialkylamines, pyridine, 4-dimethylaminopyridine (DMAP) or hydroxybenzotriazole (HOBt) and / or scandium (III) trifluoromethanesulfonate be used. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Camptothecin mit einer Boc-Aminocarbonsäure unter Einsatz von N,N'-Diisopropylcarbodiimid und Dimethylaminopyridin umgesetzt wird.Method according to claim 13, characterized in that camptothecin with a Boc-aminocarboxylic acid Use of N, N'-diisopropylcarbodiimide and dimethylaminopyridine is reacted. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Camptothecin mit Boc-4-Aminobutansäure unter Einsatz von N,N'-Diisopropylcarbodiimid und Dimethylaminopyridin umgesetzt wird.Method according to claim 13, characterized in that camptothecin with Boc-4-aminobutanoic under Use of N, N'-diisopropylcarbodiimide and dimethylaminopyridine is reacted. Verfahren zur Herstellung von Camptothecin-Derivaten nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Camptothecin-O-acyl-Derivat der allgemeinen Formel IV
Figure 00190001
in der R1 = H oder OH R2 = H, NH2, NO2 oder N,N-Dimethylaminomethyl R3 = H oder Ethyl R4 = H, Alkyl oder Aryl R5 = H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl n = 0 bis 3 bedeuten, wobei etwaige nukleophile Gruppen an R1, R2 und R5 gegebenenfalls durch geeignete Schutzgruppen geschützt vorliegen, mit einer Crosslinker-Peptid-Einheit der allgemeinen Formel V
Figure 00200001
in der P1 und P3 gleich oder unterschiedlich sind und Alanin, Glycin, Leucin, Isoleucin, Norleucin, Valin oder Phenylalanin bedeuten P2 und P4 gleich oder unterschiedlich sind und Leucin, Isoleucin, Norleucin oder Phenylalanin bedeuten Xaa = Arginin, Lysin oder Histidin m = 1 bis 3 k = 0 bis 5 p = 0 bis 6 PM eine proteinbindende Gruppe bedeutet, in Gegenwart von Carbonsäure-Aktivierungsreagenzien und unter Zusatz gängiger Katalysatoren bzw. Hilfsbasen umgesetzt werden.Process for the preparation of camptothecin derivatives according to one of the preceding claims, characterized in that a camptothecin-O-acyl derivative of the general formula IV
Figure 00190001
in which R 1 = H or OH R 2 = H, NH 2 , NO 2 or N, N-dimethylaminomethyl R 3 = H or ethyl R 4 = H, alkyl or aryl R 5 = H, optionally substituted alkyl or aryl n = 0 to 3, wherein any nucleophilic groups on R 1 , R 2 and R 5 are optionally protected by suitable protective groups, with a crosslinker peptide unit of the general formula V
Figure 00200001
where P 1 and P 3 are the same or different and are alanine, glycine, leucine, isoleucine, norleucine, valine or phenylalanine, P 2 and P 4 are the same or different and are leucine, isoleucine, norleucine or phenylalanine X aa = arginine, lysine or histidine m = 1 to 3 k = 0 to 5 p = 0 to 6 PM means a protein-binding group, in the presence of carboxylic acid activating agents and with the addition of common catalysts or auxiliary bases are reacted. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Carbonsäure-Aktivierungsreagenzien N,N'-Diisopropylcarbodiimid, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, (Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium-Hexafluorophosphat, 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid oder O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat verwendet werden.Method according to claim 18, characterized in that the carboxylic acid activating reagents are N, N'-diisopropylcarbodiimide, N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (Benzotriazol-1-yloxy) tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate, 2-chloro-1-methylpyridinium iodide or O- (azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate be used. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Katalysatoren bzw. Hilfsbasen N-Ethyldiisopropylamin (DIEA), Trialkylamine, Pyridin, 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder Hydroxybenzotriazol (HOBt) eingesetzt werden.A method according to claim 18, characterized in that as catalysts or auxiliary bases N-ethyldiisopropylamine (DIEA), trialkylamines, pyridine, 4-dimethylaminopyridine (DMAP) or Hydroxybenzotri azole (HOBt) can be used. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Carbonsäure-Aktivierungsreagenz O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat in Verbindung mit N-Ethyldiisopropylamin (DIEA) verwendet wird.Method according to claim 18, characterized that as the carboxylic acid activating reagent O- (Azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate used in conjunction with N-ethyldiisopropylamine (DIEA). Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass ein Camptothecin-O-acyl-Trifluoracetat mit [((((6-(Maleinimidohexanoyl)arginyl)arginyl)alanyl)leucyl)alanyl]leucin-Trifluoracetat unter Einsatz von O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat in Verbindung mit N-Ethyldiisopropylamin (DIEA) umgesetzt wird.Method according to claim 18, characterized in that a camptothecin O-acyl trifluoroacetate with [((((6- (maleinimidohexanoyl) arginyl) arginyl) alanyl) leucyl) alanyl] leucine trifluoroacetate using O- (azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate in conjunction with N-ethyldiisopropylamine (DIEA). Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass Camptothecin-O-4-aminobutanoat-Trifluoracetat mit [((((6-(Maleinimidohexanoyl)arginyl)arginyl)alanyl)leucyl)alanyl]leucin-Trifluoracetat unter Einsatz von O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat in Verbindung mit N-Ethyldiisopropylamin (DIEA) umgesetzt wird.Method according to claim 18, characterized in that camptothecin O-4-aminobutanoate trifluoroacetate with [((((6- (maleinimidohexanoyl) arginyl) arginyl) alanyl) leucyl) alanyl] leucine trifluoroacetate using O- (azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate in conjunction with N-ethyldiisopropylamine (DIEA). Arzneimittel enthaltend ein Camptothecin-Derivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfsstoffen und/oder pharmazeutischen Lösungsmitteln.Medicament containing a camptothecin derivative according to one the claims 1 to 12, optionally together with conventional excipients and / or pharmaceutical solvents. Verwendung eines Camptothecin-Derivates nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Behandlung von Krebskrankheiten.Use of a camptothecin derivative after one the claims 1 to 12 for the treatment of cancerous diseases. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Krebskrankheiten, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 in eine therapeutisch annehmbare Lösung überführt.Process for the preparation of a medicament for the treatment of cancer diseases, characterized in that a compound according to one the claims 1 to 12 in a therapeutically acceptable solution.
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