DE102004054731A1 - New pharmaceutical composition comprising an oligonucleotide that is adapted to target nucleic acids encoding CD40, useful for preventing or treating an inflammatory, immune or autoimmune disorder - Google Patents
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Abstract
Description
Gebiet der ErfindungTerritory of invention
CD40 spielt eine Schlüsselrolle bei der Pathologie entzündlicher Krankheiten, und es wurde erwartet, daß man mit der Herabregulierung der CD40-Expression unter Anwendung von Antisense- oder RNAi-Technologien Hilfsmittel zur Behandlung dieser Erkrankungen in die Hand bekäme. Trotz der Tatsache, daß eine Reihe von Sequenzen gegen das Target in vitro validiert worden waren, war ein Beweis für das Konzept bei Tieren bislang nicht erbracht worden. Hier machen wir Träger/Arzneimittel-Kombinationen verfügbar, die eine Behandlung von entzündlichen Erkrankungen bei Säugern ermöglichen.CD40 plays a key role inflammatory in pathology Diseases, and it was expected to be downregulated CD40 expression using antisense or RNAi technologies Auxiliaries for the treatment of these diseases in the hand would get. In spite of the fact that a number of sequences against the target had been validated in vitro, was proof of the concept has not yet been provided in animals. Do it here we carrier / drug combinations available, the one treatment of inflammatory Diseases in mammals enable.
Hintergrund der Erfindungbackground the invention
CD40 wurde erstmals 1984 von Pauli et al. beschrieben (Cancer Immunol. Immunotherapy 17, 173-179). Das Protein wird hauptsächlich auf dendritischen Zellen und B-Zellen exprimiert und wechselwirkt mit seinem Liganden (CD40-Ligand oder CD154) mit T-Zellen. Die Signalgebung zwischen CD40 und CD154 ist entscheidend für die Entwicklung einer humoralen Immunantwort. Eine Überstimulierung des Signalwegs führt zu einem immunologischen Ungleichgewicht und in der Folge zu einer Vielzahl von immunassoziierten Störungen, darunter – ohne jedoch darauf beschränkt zu sein – Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit, multiple Sklerose, systemischer Lupus erythematodes, Rheumatoidarthritis, Asthma, entzündliche Darmerkrankungen, Psoriasis, Schilddrüsenentzündung und andere. Eine CD40-Überexpression kann auch beim Tumorwachstum beteiligt sein (Gruss et al.). CD40 gibt Signale in den NF-kB-Signalweg und führt in der Folge zur Aktivierung des Transkriptions faktors und schließlich zur Freisetzung von Cytokinen wie IL-11, TNFα oder IFNγ, die wiederum andere Zellen aktivieren und so die Entzündung durch einen positiven Feedback-Mechanismus fördern. Die Hemmung früher Ereignisse in dieser Schleife ist als wirksame Strategie zur Hemmung von Immunstörungen oder Entzündungsvorgängen anerkannt. Zu den Beispielen hierfür zählt die kompetitive Bindung von TNFα mit Antikörpern, die Rezeptorblockierung mit Antikörpern gegen den TNFα-Rezeptor, die kompetitive Hemmung der NF-kB-Bindung und vieles mehr. Insbesondere kann die CD40/CD154-Wechselwirkung mit Antikörpern blockiert werden, die gegen eine der Komponenten gerichtet sind, wie beschrieben bei Holstager et al. (J. Biol. Chem. 275, 15392-15398, 2000) oder Baccam und Bishop (Eur. J. Immunol. 29, 3855-3866, 1999). Allerdings verlangen die Nebenreaktionen der in der Entwicklung stehenden CD40-Antikörper nach alternativen Hilfsmitteln, um die Feedback-Schleife von Entzündungen an dieser Stelle zu unterbrechen.CD40 was first published in 1984 by Pauli et al. described (Cancer Immunol. Immunotherapy 17, 173-179). The protein is mainly on dendritic cells and B cells expressed and interacts with its ligand (CD40 ligand or CD154) with T cells. The signaling Between CD40 and CD154 is critical to the development of a humoral Immune response. An overstimulation the signal path leads to an immunological imbalance and subsequently to a Variety of immune-associated disorders, including - without, however limited to this to be - graft rejection, graft-versus-recipient disease, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, Asthma, inflammatory Intestinal diseases, psoriasis, thyroiditis and others. A CD40 overexpression can also be seen in Tumor growth be involved (Gruss et al.). CD40 gives signals in the NF-kB signal path and leads subsequently to the activation of the transcription factor and finally to the Release of cytokines such as IL-11, TNFα or IFNγ, which in turn other cells activate and so the inflammation through a positive feedback mechanism promote. The inhibition earlier Events in this loop is considered an effective inhibition strategy of immune disorders or inflammatory processes recognized. Examples of this counts the competitive binding of TNFα with antibodies receptor blocking with antibodies to the TNFα receptor, the competitive inhibition of NF-kB binding and much more. Especially Can the CD40 / CD154 interaction with antibodies be blocked, which are directed against one of the components, as described by Holstager et al. (J. Biol. Chem. 275, 15392-15398, 2000) or Baccam and Bishop (Eur J. Immunol 29, 3855-3866, 1999). However, the side reactions require those in development standing CD40 antibody for alternative aids to the feedback loop of inflammation to interrupt at this point.
Die
Protein-Expression kann in sehr spezifischer Weise herabreguliert
werden unter Verwendung von Oligonucleotiden wie etwa Antisense-Nucleinsäuren, geschlossenen
Nucleinsäuren
(LNA), Peptid-Nucleinsäuren
(PNA), Morpholinonucleinsäuren
(Morpholinos) oder small interfering RNAs (siRNA) mit unterschiedlicher
Chemie. US 2004/0186071 und
In der Fachwelt ist bekannt, daß Oligonucleotide, ungeachtet ihres eigentlichen chemischen Ursprungs, aufgrund der Instabilität in Körperflüssigkeiten oder ineffizienter Aufnahme in Zellen oder aus beiden Gründen keine therapeutische Wirksamkeit aufweisen. Chemische Abwandlungen dieser Oligonucleotide, die die vorstehend erwähnten Varianten umfassen – ohne jedoch darauf beschränkt zu sein – und sich auch auf die Bildung von Konjugaten mit Liganden oder Polymeren erstrecken, stellen eine Strategie zur Überwindung der praktischen Einschränkungen dar. Bei einer zweiten Gruppe von Strategien werden Trägersysteme, insbesondere Liposomen, für den Schutz, das Targeting und die verbesserte Aufnahme in Zellen verwendet. Ein solches Trägersystem muß die folgenden Kriterien möglichst optimal erfüllen: hohe Wirksamkeit der Einkapselung und wirtschaftliches Herstellungsverfahren, kolloidale Stabilität des Trägers in Körperflüssigkeiten, so daß die richtige biologische Verteilung und Aufnahme des intakten Träger/Oligonucleotid-Komplexes sichergestellt ist, verbesserte Aufnahme in Zellen und natürlich geringe Toxizität und Immunogenität. Anionische oder neutrale Liposomen sind oft ausgezeichnet im Hinblick auf die kolloidale Stabilität, da keine Aggregation zwischen dem Träger und Serumproteinen auftritt. Infolgedessen ist ihre biologische Verteilung ausgezeichnet. Allerdings fehlt diesen Trägern die Wirksamkeit bei der Einkapselung, und sie liefern kein endosomolytisches Signal, das die weitere Aufnahme in Zellen erleichtert (Klimuk et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 292, 480-488 (2000)).It is known in the art that oligonucleotides, regardless of their actual chemical origin, have no therapeutic efficacy due to instability in body fluids or inefficient uptake in cells or for both. Chemical modifications of these oligonucleotides which include, but are not limited to, the abovementioned variants, and which also extend to the formation of conjugates with ligands or polymers, are a strategy for overcoming the practical limitations. In a second group of strategies Carrier systems, in particular liposomes, used for protection, targeting and improved uptake into cells. Such a carrier system must meet the following criteria as optimally as possible: high efficiency of the encapsulation and economical method of preparation, colloidal stability of the carrier in body fluids to ensure proper biodistribution and uptake of the intact carrier / oligonucleotide complex, improved uptake into cells, and of course low toxicity and immunogenicity. Anionic or neutral liposomes are often excellent in colloidal stability because there is no aggregation between the carrier and serum proteins. As a result, their biodistribution is excellent. All However, these carriers lack the efficiency of encapsulation and do not provide an endosomolytic signal that facilitates further uptake into cells (Klimuk et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 292, 480-488 (2000)).
Zahlreiche Veröffentlichungen befassen sich mit kationischen liposomalen Systemen, z.B. Maurer et al., Molecular Membrane Biology 16, 129-140 (1999); Meidan et al., BBA 1464, 251-261 (2000); Fiset und Gounni, Reviews in Biology and Biotechnology 1(2), 27-33 (2001). Obwohl kationische Systeme hohe Beladungseffizienz ergeben, fehlt ihnen doch die kolloidale Stabilität, insbesondere nach Kontakt mit Körperflüssigkeiten. Ionische Wechselwirkungen mit Plasmaproteinen führen zu Aggregatbildung und folglich zu einer Verstopfung der Lungenkapillaren. Kationische Lipide erwiesen sich oft als toxisch.numerous Publications deal with cationic liposomal systems, e.g. mason et al., Molecular Membrane Biology 16, 129-140 (1999); Meidan et al., BBA 1464, 251-261 (2000); Fiset and Gounni, Reviews in Biology and Biotechnology 1 (2), 27-33 (2001). Although cationic systems high loading efficiency, but they lack the colloidal Stability, especially after contact with body fluids. Ionic interactions with plasma proteins lead to aggregate formation and consequently congestion of the pulmonary capillaries. cationic Lipids were often toxic.
Diese Einschränkungen wurden durch Zugabe von Komponenten überwunden, die den Trägern eine sterische Stabilisierung verleihen. Von Polyethylenglycolen unterschiedlicher Kettenlänge ist bekannt, daß sie die mit der Verwendung kationischer Komponenten in Körperflüssigkeiten verbundenen Probleme mit der Aggregation beseitigen, und PEGylierte kationische Liposomen zeigen verbesserte Kreislaufzeiten in vivo (Semple et al., BBA 1510, 152-166 (2001)). Dennoch wird das mit den kationischen Lipiden verbundene Problem der Eigentoxizität durch die Verwendung von PEG nicht gelöst.These restrictions were overcome by adding components that give the carriers a steric Confer stabilization. Different from polyethylene glycols chain length is known to be the Problems associated with the use of cationic components in body fluids eliminate aggregation, and PEGylated cationic liposomes show improved circulating times in vivo (Semple et al., BBA 1510, 152-166 (2001)). Nevertheless, this is associated with the cationic lipids Problem of self-toxicity not solved by the use of PEG.
Amphotere Liposomen stellen eine in neuerer Zeit beschriebene Klasse von Liposomen dar, die bei pH 7,5 eine anionische oder neutrale Ladung und bei pH 4 eine kationische Ladung aufweisen. Ausdrücklich erwähnt seien hier WO 02/066490, WO 02/066012 und WO 03/070735, alle an Panzner et al., worin eine ausführliche Beschreibung der amphoteren Liposomen gegeben ist. Weitere Offenbarungen sind in WO 03/070220 und WO 03/070735 gegeben, ebenfalls an Panzner et al., worin pH-empfindlichere Lipide für die Herstellung der amphoteren Liposomen beschrieben sind. Amphotere Liposomen weisen ausgezeichnete biologische Verteilung auf und zeigen bei Tieren sehr gute Verträglichkeit. Sie können Nucleinsäure-Moleküle mit hoher Effizienz einkapseln, und es wird beschrieben, daß sie Plasmide in Zellen transportieren.amphoteric Liposomes represent a class of liposomes recently described which at pH 7.5 is an anionic or neutral charge and at pH 4 have a cationic charge. Expressly mentioned here are WO 02/066490, WO 02/066012 and WO 03/070735, all to Panzner et al., Wherein a detailed Description of the amphoteric liposomes is given. Further revelations are given in WO 03/070220 and WO 03/070735, also to Panzner et al., wherein more pH sensitive lipids for the production of the amphoteric Liposomes are described. Amphoteric liposomes have excellent biodistribution and show in animals very good tolerability. You can High-nucleic acid molecules Encapsulate efficiency, and it is described that they are plasmids transport in cells.
Für jedes therapeutische Erzeugnis wird von Regulierungsbehörden wie z.B. der FDA eine Reihe von Kriterien definiert, die erfüllt werden müssen. Zusätzlich zu den bekannten Kriterien für den parenteralen Weg müssen Liposomen in mensch lichem Serum stabil sein (www.fda.gov/cder/guidance/index.htm, liposome drug products). Serumbestandteile, insbesondere Komplement, perforieren bekanntermaßen die Lipid-Membranen und verursachen dadurch die Freisetzung des eingekapselten Arzneimittels. Zu welchem Ausmaß eine solche Freisetzung eintritt, hängt sowohl von der Membran als auch von der Molekülgröße des Arzneimittels ab. Kleine Moleküle werden schnell freigesetzt; sehr große Moleküle wie Plasmide werden möglicherweise gar nicht beeinflußt. Notwendig ist daher die Bereitstellung von Formulierungen, die die hier betrachteten Oligonucleotide nur langsam oder in geringer Menge freisetzen.For each Therapeutic product is used by regulators like e.g. The FDA defines a set of criteria that are met have to. additionally to the known criteria for need the parenteral way Stable in human serum (www.fda.gov/cder/guidance/index.htm, liposome drug products). Serum components, in particular complement, perforate known the lipid membranes and thereby causing the release of the encapsulated drug. To what extent a such release occurs depends from both the membrane and the molecular size of the drug. little one molecules are released quickly; very large molecules like plasmids may become not affected at all. It is therefore necessary to provide formulations that support the Here, oligonucleotides considered only slowly or in small quantities release.
Alles in allem ist klar, daß CD40 ein attraktives Ziel für die Behandlung entzündlicher oder Immunstörungen darstellt. Die CD40-Expression läßt sich mit Oligonucleotid-Hemmern wie etwa Antisense- oder siRNA-Molekülen spezifisch hemmen. Allerdings gibt es keine Daten, die die erfolgreiche Anwendung der potentiellen Therapeutika in vivo zeigten. Die derzeitigen Liposomen-Technologien sind für die Bereitstellung einfacher Hilfsmittel zur Formulierung von Oligonucleotiden nicht optimal.Everything in all it is clear that CD40 an attractive destination for the treatment inflammatory or immune disorders represents. The CD40 expression can be with oligonucleotide inhibitors such as antisense or siRNA molecules specific inhibit. However, there is no data that the successful application of the potential therapeutics in vivo. The current liposome technologies are for the provision of simple tools for the formulation of oligonucleotides not optimal.
Aufgabe der hier beschriebenen Erfindung ist daher die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die hemmende, gegen CD40 gerichtete Oligonucleotide umfassen, die in vivo therapeutische Wirkung aufweisen.task The invention described herein is therefore the provision of Compositions inhibiting CD40-directed oligonucleotides include in vivo therapeutic effect.
Kurzbeschreibung der ErfindungSummary the invention
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind liposomale Formulierungen, umfassend Oligonucleotide und amphotere Liposomen, wobei die Oligonucleotide Nucleinsäuren zum Ziel haben, die für CD40 codieren und die Expression von CD40 in Säugerzellen modulieren, und wobei die amphoteren Liposomen bei pH 7,4 negativ oder neutral und bei pH4 kationisch ge laden sind. Die Erfindung betrifft des weiteren die Behandlung von Säugern, insbesondere Menschen, bei denen der Verdacht besteht, daß sie eine Krankheit oder einen Zustand aufweisen oder dafür anfällig sind, die bzw. der mit der Expression von CD40 verbunden ist, durch Verabreichen einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge der liposomalen Formulierungen.object of the present invention are liposomal formulations comprising Oligonucleotides and amphoteric liposomes, wherein the oligonucleotides nucleic acids to have the goal for CD40 and modulate the expression of CD40 in mammalian cells, and wherein the amphoteric liposomes are negative or neutral at pH 7.4 and are cationically charged at pH4. The invention further relates the treatment of mammals, especially people who are suspected of having one Illness or condition or are susceptible to it, the one with the expression of CD40 is linked by administering a therapeutically or prophylactically effective amount of the liposomal Formulations.
Ausführliche Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention
Bei der vorliegenden Erfindung werden Oligonucleotide eingesetzt, deren Ziel Nucleinsäuren sind, die für CD40 codieren, so daß die Expression von CD40 in Säugerzellen moduliert wird. Bei dieser Erfindung umfaßt der Begriff "Ziel-Nucleinsäure" oder der Begriff "CD40 codierende Nucleinsäure" DNA, die für CD40 codiert, sowie sämtliche von derartiger DNA abgeleiteten RNAs, die pre-mRNA oder mRNA sind. Spezifische Hybridisierung zwischen der Ziel-Nucleinsäure und einem oder mehreren Oligonucleotiden, die gegen solche Sequenzen gerichtet sind, führt zur Hemmung der CD40-Expression. Um ein solches spezifisches Targeting zu erreichen, muß das Oligonucleotid einen kontinuierlichen Strang aus Nucleotiden aufweisen, die zur Sequenz der Ziel-Nucleinsäure komplementär sind. Derartige Oligonucleotide können in der Länge variieren zwischen nur 10, vorzugsweise 15 und mehrbevorzugt 18 und 50, vorzugsweise 30 und besonders bevorzugt 25 Nucleotiden. Vorzugsweise passen Oligonucleotid und Zielsequenz perfekt zusammen, wobei jede Base des Oligonucleotids über einen ununterbrochenen Strang aus der vorstehend erwähnten Anzahl von Nucleotiden ein Basenpaar mit ihrer komplementären Base auf der Ziel-Nucleinsäure bildet. Weniger bevorzugt ist es, wenn dieses Sequenzpaar eine Fehlpaarung innerhalb des kontinuierlichen Strangs aus Basenpaaren enthält.at The present invention uses oligonucleotides whose Target nucleic acids are that for Encode CD40 so that the Expression of CD40 in mammalian cells is modulated. In this invention, the term "target nucleic acid" or the term "CD40-encoding nucleic acid" includes DNA encoding CD40, as well as all RNAs derived from such DNA which are pre-mRNA or mRNA. Specific hybridization between the target nucleic acid and one or more oligonucleotides resistant to such sequences directed, leads to inhibit CD40 expression. To achieve such specific targeting, the oligonucleotide must have a continuous strand of nucleotides that belong to the Sequence of the target nucleic acid are complementary. Such oligonucleotides can in length vary between only 10, preferably 15, and more preferably 18 and 50, preferably 30 and more preferably 25 nucleotides. Preferably, oligonucleotide and target sequence match perfectly, wherein each base of the oligonucleotide has an uninterrupted Strand from the aforementioned Number of nucleotides one base pair with its complementary base on the target nucleic acid forms. It is less preferred if this sequence pair is a mismatch contained within the continuous strand of base pairs.
Oligonucleotide, die die vorstehend erwähnten Kriterien erfüllen, lassen sich mit einer Reihe verschiedener chemischer Eigenschaften und Topologien aufbauen. Die Oligonucleotide können einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Zu den einzelsträngigen Oligonucleotiden gehören – ohne jedoch darauf beschränkt zu sein – DNA-basierte Oligonucleotide, geschlossene Nucleinsäuren, 2'-modifizierte Oligonucleotide und andere, die allgemein als Antisense-Oligonucleotide geläufig sind. Zu den Gerüst- oder Basenmodifikationen zählen – ohne jedoch darauf beschränkt zu sein – Phosphothioat-DNA (PTO), 2'O-Methyl-RNA (2'Ome), 2'O-Methoxyethyl-RNA (2'MOE), Peptid-Nucleinsäuren (PNA), N3'-P5'-Phosphoamidate (NP), 2'-Fluorarabinonucleinsäuren (FANA), geschlossene Nucleinsäuren (LNA), Morpholinphosphoamidat- (Morpholino), Cyclohexennucleinsäuren (CeNA), Tricyclo-DNA (tcDNA) und andere. Überdies sind auch gemischte chemische Gebilde in der Fachwelt bekannt, wobei diese aus mehr als einer einzigen Nucleotid-Spezies als Copolymere, Blockcopolymere oder Gapmere oder in anderen Anordnungen aufgebaut sind.oligonucleotides those mentioned above Fulfill criteria, can be treated with a number of different chemical properties and build topologies. The oligonucleotides may be single-stranded or double-stranded. To the single-stranded Oligonucleotides belong - without however limited to this to be - DNA based Oligonucleotides, closed nucleic acids, 2'-modified oligonucleotides and others, commonly referred to as antisense oligonucleotides common are. To the scaffolding or base modifications count - without, however limited to this to be - phosphothioate DNA (PTO), 2'-O-methyl RNA (2'Ome), 2'-O-methoxyethyl-RNA (2'MOE), peptide nucleic acids (PNA), N3'-P5'-phosphoamidate (NP), 2'-fluoroarabinonucleic acids (FANA), closed nucleic acids (LNA), morpholine phosphoamidate (morpholino), cyclohexene nucleic acids (CeNA), Tricyclo DNA (tcDNA) and others. Moreover, are also mixed chemical entities known in the art, these being more as a single nucleotide species as copolymers, block copolymers or Gapmere or in other arrangements are constructed.
Außer mit den obengenannten Oligonucleotiden kann die CD40-Expression auch mit doppelsträngigen RNA-Molekülen gehemmt werden, die die komplementären Sequenzmotive enthalten. Derartige RNA-Moleküle sind in der Fachwelt als siRNA-Moleküle bekannt. Wiederum wurden verschiedene chemische Eigenschaften dieser Klasse von Oligonucleotiden angepaßt. Auch DNA/RNA-Hybridsysteme sind in der Fachwelt bekannt.Except with In the above-mentioned oligonucleotides, CD40 expression can also be inhibited with double-stranded RNA molecules which are the complementary ones Sequence motifs included. Such RNA molecules are known in the art as known siRNA molecules. Again, different chemical properties of this class matched by oligonucleotides. DNA / RNA hybrid systems are also known in the art.
Ausdrücklich erwähnt seien
hier insbesondere
Liposomen, die Oligonucleotide tragen, müssen in Körperflüssigkeiten stabil sein, um den Verlust von Beladungsmolekülen zu vermeiden. Solche Körperflüssigkeiten können Komplement enthalten, ein bekannter Faktor, der zu Liposomen-Zerfall durch Porenbildung führt. Die Anfälligkeit gegenüber der Wirkung von Komplement läßt sich messen anhand der Freisetzung von fluoreszierenden Farbstoffen aus der inneren wäßrigen Phase der Liposomen, z.B. Freisetzung von Carboxyfluorescein. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen amphotere Liposomen:
- a) ein neutrales Lipid, vorzugsweise ein Phosphatidylcholin;
- b) Cholesterin;
- c) ein amphoteres Lipid oder alternativ eine Mischung aus Lipid-Komponenten mit amphoteren Eigenschaften.
- a) a neutral lipid, preferably a phosphatidylcholine;
- b) cholesterol;
- c) an amphoteric lipid or alternatively a mixture of lipid components with amphoteric properties.
Der bevorzugte Gehalt an Cholesterin in der Lipid-Phase beträgt zwischen 30 Mol-% und 50 Mol-%, bevorzugt zwischen 35 Mol-% und 45 Mol-%.Of the preferred content of cholesterol in the lipid phase is between 30 mol% and 50 mol%, preferably between 35 mol% and 45 mol%.
Der bevorzugte Gehalt an amphoteren Lipiden beträgt zwischen 5 und 30 Mol-%, vorzugsweise zwischen 10 und 25 Mol-%. Amphotere Lipide sind offenbart in WO 02/066489 sowie in WO 03/070735. Vorzugsweise sind die amphoteren Lipide ausgewählt aus der Gruppe HistChol, HistDG, iso-HistSuccDG, Acylcarnosin und HCChol.Of the preferred amphoteric lipid content is between 5 and 30 mol%, preferably between 10 and 25 mol%. Amphoteric lipids are disclosed in WO 02/066489 and in WO 03/070735. Preferably, the amphoteric Lipids selected from the group HistChol, HistDG, iso-HistSuccDG, acylcarnosine and HCChol.
Alternativ können die amphoteren Liposomen der vorliegenden Erfindung hergestellt werden unter Verwendung anionischer und/oder kationischer Komponenten, die auf den pH ansprechen, wie offenbart in WO 02/066012. Die amphoteren Mischungen werden nicht mit mehr als 50 Mol-% Gesamtlipidgehalt eingesetzt und liegen vorzugsweise zwischen 20 und 40 Mol-%. Kationische pH-empfindliche Lipide sind offenbart in WO 02/066489 A2/A3 und WO 03/070220 A1 sowie in den darin enthaltenen Zitaten. Die kationische Ladung kann auch mit konstitutiv geladenen Lipiden eingeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Bevorzugte kationische Komponenten sind ausgewählt aus der Gruppe DMTAP, DPTAP, DOTAP, DC-Chol, MoChol, HisChol, DPIM, CHIM, DORIE, DDAB, DAC-Chol, TC-Chol, DOTMA, DOGS, (C18)2Gly+ N,N-Dioctadecylamidoglycin, CTAP, CPyC, DODAP und DOEPC.Alternatively, the amphoteric liposomes of the present invention can be prepared under Use of anionic and / or cationic components responsive to pH as disclosed in WO 02/066012. The amphoteric mixtures are not used with more than 50 mol% Gesamtlipidgehalt and are preferably between 20 and 40 mol%. Cationic pH-sensitive lipids are disclosed in WO 02/066489 A2 / A3 and WO 03/070220 A1 and in the citations contained therein. The cationic charge may also be introduced with constitutively charged lipids known to those skilled in the art. Preferred cationic components are selected from the group DMTAP, DPTAP, DOTAP, DC-Chol, MoChol, HisChol, DPIM, CHIM, DORIE, DDAB, DAC-Chol, TC-Chol, DOTMA, DOGS, (C18) 2 Gly + N, N-dioctadecylamidoglycine, CTAP, CPyC, DODAP and DOEPC.
Die amphoteren Mischungen umfassen zudem anionische Lipide, die entweder konstitutiv oder unter gewissen Bedingungen dem pH entsprechend geladen sind, und auch diese Lipide sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugte Lipide zur Verwendung bei dieser Erfindung sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend DGSucc, DMPS, DPPS, DOPS, POPS, DMPG, DPPG, DOPG, POPG, DMPA, DPPA, DOPA, POPA, CHEMS und CetylP.The Amphoteric mixtures also include anionic lipids, either constitutively or under certain conditions according to the pH are charged, and these lipids are known in the art. preferred Lipids for use in this invention are selected from the group comprising DGSucc, DMPS, DPPS, DOPS, POPS, DMPG, DPPG, DOPG, POPG, DMPA, DPPA, DOPA, POPA, CHEMS and CetylP.
Auch neutrale Phosphatidylcholine sind in der Mischung in einer molaren Menge vorhanden, die dem Rest auf die beiden ersteren Gruppen entspricht, wenigstens aber zu 15 Mol-%, vorzugsweise in einer Menge von nicht weniger als 25 Mol-%. Bevorzugte Komponenten sind ausgewählt aus der Gruppe DMPC, DPPC, DSPC, POPC, DOPC oder aus Phosphatidylcholinen aus natürlichen Quellen wie etwa Sojabohnen-PC oder Ei-PC.Also Neutral phosphatidylcholines are in a mixture in the mixture Amount present, which corresponds to the rest on the two former groups, but at least 15 mol%, preferably in an amount of not less than 25 mole%. Preferred components are selected from the group DMPC, DPPC, DSPC, POPC, DOPC or phosphatidylcholines from natural Sources such as soybean PC or egg PC.
Einige Lipid-Zusammensetzungen sind besonders bevorzugt für die Verwendung bei dieser Erfindung. Solche Zusammensetzungen sind aus der nachstehend gegebenen Tabelle ausgewählt: Some lipid compositions are particularly preferred for use in this invention. Such compositions are selected from the table below:
Die Abkürzungen für die Lipide beziehen sich in erster Linie auf die übliche Verwendung in der Literatur und sind hier als hilfreicher Hinweis angegeben:
- DMPC
- Dimyristoylphosphatidylcholin
- DPPC
- Dipalmitoylphosphatidylcholin
- DSPC
- Distearoylphosphatidylcholin
- POPC
- Palmitoyl-oleoylphosphatidylcholin
- DOPC
- Dioleoylphosphatidylcholin
- DOPG
- Dioleoylphosphatidylglycerin
- POPG
- Palmitoyl-oleoylphosphatidylglycerin
- DMPG
- Dimyristoylphosphatidylglycerin
- DPPG
- Dipalmitoylphosphatidylglycerin
- DMPS
- Dimyristoylphosphatidylserin
- DPPS
- Dipalmitoylphosphatidylserin
- DOPS
- Dioleoylphosphatidylserin
- POPS
- Palmitoyl-oleoylphosphatidylserin
- DMPA
- Dimyristoylphosphatidsäure
- DPPA
- Dipalmitoylphosphatidsäure
- DOPA
- Dioleoylphosphatidsäure
- POPA
- Palmitoyl-oleoylphosphatidsäure
- Chems
- Cholesterinhemisuccinat
- DC-Chol
- 3-β-[N-(N',N'-Dimethylethan)carbamoyl]cholesterin
- CetylP
- Cetylphosphat
- DODAP
- (1,2)-Dioleoyloxypropyl)-N,N-dimethylammoniumchlorid
- DOEPC
- 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin
- DAC-Chol
- 3-β-[N-(N,N'-Dimethylethan)carbamoyl]cholesterin
- TC-Chol
- 3-β-[N-(N',N',N'-Trimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterin
- DOTMA
- (1,2-Dioleyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammoniumchlorid) (Lipofectin®)
- DOGS
- ((C18)2GlySper3+) N,N-Dioctadecylamidoglycylspermin (Transfectam®)
- CTAB
- Cetyltrimethylammoniumbromid
- CPyC
- Cetylpyridiniumchlorid
- DOTAP
- (1,2-Dioleoyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammonium-Salz
- DMTAP
- (1,2-Dimyristoyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammonium-Salz
- DPTAP
- (1,2-Dipalmitoyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammonium-Salz
- DOTMA
- (1,2-Dioleyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammoniumchlorid)
- DORIE
- (1,2-Dioleyloxypropyl)-3-dimethylhydroxyethylammoniumbromid
- DDAB
- Dimethyldioctadecylammoniumbromid
- DPIM CHIM
- Histaminylcholesterincarbamat
- MoChol
- 4-(2-Aminoethyl)morpholinocholesterinhemisuccinat
- HisChol
- Histaminylcholesterinhemisuccinat
- HCChol
- Nα-Histidinylcholesterincarbamat
- HistChol
- Nα-Histidinylcholesterinhemisuccinat
- AC
- Acylcarnosin, Stearyl- und Palmitoylcarnosin
- HistDG
- 1,2-Dipalmitoylglycerinhemisuccinat-Nα-histidinylhemisuccinat und Distearoyl-, Dimyristoyl-, Dioleoyl- oder Palmitoyl-oleoyl-Derivate
- IsoHistSuccDG
- 1,2-Dipalmitoylglycerin-Oα-histidinyl-Nα-hemisuccinat und Distearoyl-, Dimyristoyl-, Dioleoyl- oder Palmitoyl-oleoyl-Derivate
- DGSucc
- 1,2-Dipalmitoyglycerin-3-hemisuccinat und Distearoyl-, Dimyristoyl-, Dioleoyl- oder Palmitoyloleoyl-Derivate
- DMPC
- dimyristoyl
- DPPC
- dipalmitoylphosphatidylcholine
- DSPC
- distearoylphosphatidylcholine
- POPC
- Palmitoyl-oleoyl
- DOPC
- dioleoylphosphatidylcholine
- DOPG
- dioleoylphosphatidylglycerol
- POPG
- Palmitoyl-oleoylphosphatidylglycerin
- DMPG
- dimyristoyl
- DPPG
- dipalmitoyl
- DMPS
- dimyristoyl
- DPPS
- dipalmitoyl
- DOPS
- dioleoylphosphatidylserine
- POPS
- Palmitoyl-oleoylphosphatidylserin
- DMPA
- dimyristoylphosphatidic
- DPPA
- dipalmitoylphosphatidic
- DOPA
- dioleoylphosphatidic
- POPA
- Palmitoyl-oleoylphosphatidsäure
- Chems
- cholesterol hemisuccinate
- DC-Chol
- 3-β- [N- (N ', N'-dimethylethane) carbamoyl] cholesterol
- CetylP
- cetyl phosphate
- DODAP
- (1,2) -Dioleoyloxypropyl) -N, N-dimethyl ammonium chloride
- DOEPC
- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3 ethylphosphocholine-
- DAC-Chol
- 3-β- [N- (N, N'-dimethylethane) carbamoyl] cholesterol
- TC-Chol
- 3-β- [N- (N ', N', N'-Trimethylaminoethan) carbamoyl] cholesterol
- DOTMA
- (1,2-dioleyloxypropyl) -N, N, N-trimethylammonium chloride) (Lipofectin ®)
- DOGS
- ((C18) 2GlySper3 +) N, N-dioctadecylamidoglycylspermine (Transfectam ®)
- CTAB
- cetyltrimethylammonium
- CPyC
- cetylpyridinium
- DOTAP
- (1,2-Dioleoyloxypropyl) -N, N, N-trimethyl ammonium salt
- DMTAP
- (1,2-Dimyristoyloxypropyl) -N, N, N-trimethyl ammonium salt
- DPTAP
- (1,2-Dipalmitoyloxypropyl) -N, N, N-trimethyl ammonium salt
- DOTMA
- (1,2-dioleyloxypropyl) -N, N, N-trimethylammonium chloride)
- Dorie
- (1,2-dioleyloxypropyl) -3-dimethylhydroxyethylammoniumbromid
- DDAB
- dimethyldioctadecylammonium
- DPIM CHIM
- Histaminylcholesterincarbamat
- MoChol
- 4- (2-aminoethyl) morpholinocholesterinhemisuccinat
- HisChol
- Histaminylcholesterinhemisuccinat
- HCChol
- Nα-Histidinylcholesterincarbamat
- HistChol
- Nα-Histidinylcholesterinhemisuccinat
- AC
- Acylcarnosine, stearyl and palmitoylcarnosine
- HistDG
- 1,2-dipalmitoylglycerol hemisuccinate-Nα-histidinylhemisuccinate and distearoyl, dimyristoyl, dioleoyl or palmitoyl oleoyl derivatives
- IsoHistSuccDG
- 1,2-dipalmitoylglycerol-Oα-histidinyl-Nα-hemisuccinate and distearoyl, dimyristoyl, dioleoyl or palmitoyl-oleoyl derivatives
- DGSucc
- 1,2-dipalmitoyglycerol-3-hemisuccinate and distearoyl, dimyristoyl, dioleoyl or palmitoyl oleoyl derivatives
Verfahren zur Herstellung der Liposomen sowie zur Einkapselung der Oligonucleotide sind dem Fachmann bekannt. Dazu zählen – ohne jedoch darauf beschränkt zu sein – die Extrusion durch Membranen definierter Porengröße, die Injektion von Ethanol-Lipidlösungen in die Cargo enthaltende Wasserphase oder die Hochdruckhomogenisierung.method for the preparation of the liposomes as well as for the encapsulation of the oligonucleotides are known in the art. These include, but are not limited to, extrusion defined by membranes pore size, the injection of ethanol-lipid solutions in the cargo containing water phase or the high pressure homogenization.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das nichteingekapselte Oligonucleotid nach dem ersten Herstellungsschritt von den Liposomen abgetrennt. Auch hier ist die Methodik in der technischen Literatur ausführlich beschrieben, und zu den geeigneten Verfahrensschritten zählen – ohne jedoch darauf beschränkt zu sein – die Größenausschlußchromatographie, die Sedimentierung, die Dialyse oder die Ultrafiltration.In a preferred embodiment The present invention provides the non-encapsulated oligonucleotide separated from the liposomes after the first preparation step. Again, the methodology is described in detail in the technical literature, and suitable process steps include, but are not limited to, size exclusion chromatography, sedimentation, dialysis or ultrafiltration.
Die vorliegende Erfindung beschreibt liposomale Formulierungen von Oligonucleotiden, die gegen CD40 gerichtet sind. In den hier gegebenen Beispielen werden Beweise geliefert, daß derartige Formulierungen bei der Behandlung von Entzündungen oder Autoimmunstörungen therapeutisch wirksam sind.The present invention describes liposomal formulations of oligonucleotides, which are directed against CD40. In the examples given here evidence is provided that such Therapeutic formulations in the treatment of inflammation or autoimmune disorders are effective.
Die Verwendung der Formulierungen erfolgt daher für die Verhütung oder Behandlung von Entzündungen, Immun- oder Autoimmunstörungen, darunter – ohne jedoch darauf beschränkt zu sein – Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit, multiple Sklerose, systemischer Lupus erythematodes, Rheumatoidarthritis, Asthma, entzündliche Darmerkrankungen, Psoriasis, Schilddrüsenentzündung und andere.The Use of the formulations is therefore for the prevention or treatment of inflammation, Immune or autoimmune disorders, including - without but limited thereto to be - graft rejection, graft-versus-recipient disease, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, Asthma, inflammatory Intestinal diseases, psoriasis, thyroiditis and others.
Da die Formulierungen gegen Serumbestandteile stabil sind, ist eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die systemische Anwendung der Formulierungen bei Säugern, insbesondere Menschen, und es wird angenommen, daß die vernünftige Anwendung der Formulierungen im Bereich der Fähigkeiten eines Fachmanns liegt. Die Dosierung richtet sich nach der Schwere und dem Ansprechverhalten des behandelten Krankheitszustands, wobei der Gang der Behandlung mehrere Tage bis mehrere Monate dauert oder bis Heilung eingetreten oder ein Rückgang des Krankheitszustands erreicht ist. Optimale Dosierungsregimes lassen sich aus Messungen der Arzneimittel-Akkumulierung im Körper des Patienten berechnen. Der Durchschnittsfachmann kann ohne weiteres die optimale Dosierung, die Methodik der Dosierung und die Wiederholungsraten bestimmen. Die optimalen Dosierungen können je nach der relativen Wirkungsstärke der einzelnen Oligonucleotide in der Zusammensetzung unterschiedlich sein und können im allgemeinen anhand der EC50-Werte abgeschätzt werden, die sich bei Tiermodellen als wirksam erwiesen haben. Im allgemeinen beträgt die Dosis 1 μg bis 20 mg Oligonucleotid pro kg Körpergewicht und kann täglich, wöchentlich, monatlich oder jährlich oder sogar noch unregelmäßiger gegeben werden. Der Durchschnittsfachmann kann anhand der gemessenen Verweilzeiten und Konzentrationen des Arzneimittels in Körperflüssigkeiten oder Geweben ohne weiteres die Wiederholungsraten abschätzen. Nach erfolgreicher Behandlung kann es wünschenswert sein, den Patienten eine Erhaltungstherapie durchlaufen zu lassen, um das Wiederauftreten des Krankheitszustands zu verhindern, wobei die Formulierung in Erhaltungsdosen im Bereich von 1 μg bis 20 mg Oligonucleotid pro kg Körpergewicht einmal oder mehrmals täglich bis einmal jährlich verabreicht wird. Während die vorliegende Erfindung anhand bestimmter bevorzugter Ausführungsformen eingehend beschrieben wurde, dienen die folgenden Beispiele lediglich der Erläuterung der Erfindung und sollen diese nicht einschränken.Since the formulations are stable to serum components, a preferred embodiment of the present invention is the systemic application of the formulations to mammals, particularly humans, and it is believed that the rational use of the formulations is within the skill of the artisan. The dosage depends on the severity and responsiveness of the condition being treated, with the course of treatment lasting from several days to several months or until cure has occurred or a decline in the disease state is achieved. Optimum dosing regimens can be calculated from measurements of drug accumulation in the patient's body. One of ordinary skill in the art can readily determine the optimal dosage, the methodology of the dosage, and the repetition rates. The optimal dosages may vary depending on the relative potency of the individual oligonucleotides in the composition and can generally be estimated from the EC 50 values found to be effective in animal models. In general, the dose is 1 μg to 20 mg oligonucleotide per kg body weight and may be given on a daily, weekly, monthly or yearly or even more irregular basis. One of ordinary skill in the art can readily estimate the repetition rates based on the measured residence times and concentrations of the drug in body fluids or tissues. After successful treatment, it may be desirable allowing the patient to undergo maintenance therapy to prevent recurrence of the disease condition, wherein the formulation is administered in maintenance doses ranging from 1 μg to 20 mg oligonucleotide per kg body weight once or several times daily to once a year. While the present invention has been described in detail with reference to certain preferred embodiments, the following examples are merely illustrative of the invention and are not intended to be limiting thereof.
Beispiel 1:Example 1:
Herstellung von CD40-ODN enthaltenden LiposomenPreparation of CD40 ODN containing liposomes
Eine Mischung aus 30 Mol-% POPC, 10 Mol-% DOTAP, 20 Mol-% Chems und 40 Mol-% Chol wurde in Chloroform gelöst und in einem Rundkolben unter Vakuum zur Trockene eingedampft.A Mixture of 30 mol% POPC, 10 mol% DOTAP, 20 mol% Chems and 40 Mol% Chol was dissolved in chloroform and placed in a round bottomed flask evaporated to dryness under vacuum.
ODN mit der Sequenz TCCTAGATGGACCGCTGT wurde bezogen von Biognostik GmbH, Deutschland, und hatte die volle Phosphothioatnucleotid-Chemie (nach Gao, Dissertation Göttingen 2003, rAS3).ODN with the sequence TCCTAGATGGACCGCTGT was obtained from Biognostik GmbH, Germany, and had full phosphothioate nucleotide chemistry (after Gao, Dissertation Göttingen 2003, rAS3).
Der Lipid-Film wurde mit einer solchen Menge ODN-Lösung (20 mg pro ml CD40-ODN (18mer, voll phosphothioatiert) in 10 mM HEPES, 125 mM NaCl, pH 7,5) hydratisiert, daß die Lipid-Endkonzentration in der Suspension 100 mM betrug. Die Suspension wurde 45 Minuten in einem Wasserbad bei 50°C hydratisiert und 15 Minuten beschallt. Dann wurde die Suspension 3mal 30 Minuten bei –70°C gefroren und 15 Minuten bei 50°C aufgetaut.Of the Lipid film was treated with such an amount of ODN solution (20 mg per ml CD40-ODN (18mer, fully phosphothioated) in 10mM HEPES, 125mM NaCl, pH 7.5) hydrates that the Final lipid concentration in the suspension was 100 mM. The suspension was hydrated in a 50 ° C water bath for 45 minutes and 15 minutes sonication. Then the suspension was frozen 3 times for 30 minutes at -70 ° C and 15 minutes at 50 ° C thawed.
Die Liposomen-Suspension wurde 19mal durch Polycarbonat-Membranen mit einer Porengröße von 400 nm extrudiert. Nichteingekapseltes ODN wurde nach Verdünnung mit Wasser durch 15stündiges Sedimentieren bei 35 000 U/min und 15°C von der extrudierten Probe abgetrennt.The Liposomal suspension was washed 19 times by polycarbonate membranes with a Pore size of 400 nm extruded. Unencapsulated ODN was diluted with it after dilution Water through 15 hours Sediment at 35,000 rpm and 15 ° C from the extruded sample separated.
Unter den gleichen Bedingungen wurden andere Formulierungen mit eingekapseltem CD40-ODN hergestellt.Under In the same conditions, other formulations were encapsulated CD40 ODN prepared.
Tabelle 1: Beispiele für Smarticles-Formulierungen, die CD40-ODN einkapseln Table 1: Examples of Smarticles Formulations Encapsulating CD40 ODN
Die Menge des eingekapselten ODN wurde gemessen durch Überprüfen der optischen Dichte (OD) bei 260 nm. Die folgenden Mengen ODN wurden in den verschiedenen Smarticles-Formulierungen eingekapselt.The Amount of encapsulated ODN was measured by checking the optical density (OD) at 260 nm. The following quantities of ODN were encapsulated in the various Smarticles formulations.
Tabelle 2: Eingekapselte Menge ODN in verschiedenen Smarticles-Formulierungen Table 2: Encapsulated amount of ODN in different Smarticles formulations
Beispiel 2:Example 2:
Therapeutische Wirksamkeit bei ArthritisTherapeutic efficacy in arthritis
Weibliche Lewis-Ratten wurden 21 und 14 Tage vor Induktion einer Arthritis durch subkutane Injektionen von methyliertem Rinderserumalbumin (mBSA) in komplettem Freund-Adjuvans immunisiert. Am Tag 0 wurde die Arthritis durch intraartikuläre Injektion des Antigens (mBSA) in physiologischem Puffer in das rechte Kniegelenk induziert, während das linke Kniegelenk als nichtinjiziertes normales Kontrollgelenk diente.Female Lewis rats were 21 and 14 days before induction of arthritis by subcutaneous injections of methylated bovine serum albumin (mBSA) in complete Freund's adjuvant. On the day 0 became the arthritis by intraarticular Injection of the antigen (mBSA) in physiological buffer into the right knee joint induced while the left knee joint as uninjected normal control joint served.
Für die Behandlungsstudien wurde entweder freies (nichteingekapseltes) CD40-ODN oder liposomales CD40-ODN (Formulierung 1: POPO/DOTAP/Chems/Chol 30:10:20:40) 48 und 96 Stunden nach Induktion der Arthritis intravenös in die Schwanzvene von Ratten mit bestehender AIA 6 injiziert. Jede Dosierung enthielt 3 mg CD40-ODN pro kg Körpergewicht (eingekapseltes CD40-ODN) oder 3 und 15 mg CD40-ODN pro kg Körpergewicht (freies CD40-ODN9 bzw. freies CD40-ODN45).For the treatment studies was either free (unencapsulated) CD40 ODN or liposomal CD40 ODN (Formulation 1: POPO / DOTAP / Chems / Chol 30: 10: 20: 40) 48 and 96 hours after induction of arthritis intravenously Tail vein of rats injected with existing AIA 6. Each dosage contained 3 mg CD40 ODN per kg body weight (encapsulated CD40 ODN) or 3 and 15 mg CD40 ODN per kg body weight (free CD40-ODN9 or free CD40-ODN45).
Während des
Experiments wurde die Schwellung der Gelenke und das Körpergewicht
der Tiere beobachtet. Es kam zu einer signifikanten Abnahme (p < 0,05) der Schwellung
der Kniegelenke über
die 21 Tage nach Behandlung mit eingekapseltem CD40-ODN (liposomales
ODN,
Beispiel 3Example 3
Verträglichkeitcompatibility
Die
Tiere wurden behandelt wie in Beispiel 2 beschrieben und am Tag
21 nach Einsetzen der Entzündung
getötet.
Eine makroskopische Untersuchung zeigte keine Anzeichen von Unverträglichkeit
für die
Formulierungen, und es wurden keine Unterschiede zur Kontrollgruppe
gefunden. Des weiteren wurden die jeweiligen Organgewichte für Leber,
Milz, Thymus und Niere gemessen. Bei der mit liposomalem CD40-ODN
behandelten Gruppe wurde eine leichte Abnahme des Lebergewichts
beobachtet, alle übrigen
Organgewichte waren unbeeinflußt
(
Legenden zu den FigurenLegends about the figures
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-
2004
- 2004-11-05 DE DE200410054731 patent/DE102004054731A1/en not_active Withdrawn
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