DE102004049532A1

DE102004049532A1 - Sequencing of Nucleic Acids via Beach Displacement

Info

Publication number: DE102004049532A1
Application number: DE200410049532
Authority: DE
Inventors: Achim Fischer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-10-09
Filing date: 2004-10-09
Publication date: 2006-04-13
Also published as: WO2006040104A2; WO2006040104A3

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Nukleinsäuresequenzierung, umfassend die Schritte: DOLLAR A 1. Bereitstellen mindestens einer zu sequenzierenden Nukleinsäure in immobilisierter und mindestens teilweise doppelsträngiger Form, DOLLAR A 2. Hybridisierung eines Sequenzierprimers an einen der beiden Stränge der Nukleinsäure, DOLLAR A 3. Sequenzierung mindestens eines Abschnitts der Nukleinsäure unter Verlängerung des Sequenzierprimers und unter strand displacement desjenigen Nukleinsäurestrangs, welcher an den primerbindenden Strang hybridisiert vorlag.The invention relates to a method for nucleic acid sequencing, comprising the steps: DOLLAR A 1. Providing at least one nucleic acid to be sequenced in immobilized and at least partially double-stranded form, DOLLAR A 2. Hybridization of a sequencing primer to one of the two strands of nucleic acid, DOLLAR A 3rd Sequencing of at least a portion of the nucleic acid with extension of the sequencing primer and under strand displacement of that nucleic acid strand which hybridized to the primer binding strand.

Description

Aus dem Stand der Technik sind Sequenzierungsverfahren zur Bestimmung der Nukleotidsequenz von Nukleinsäuren bekannt, die auf dem Prinzip der Primerextension beruhen. Hier sind die "klassische" Sequenzierung nach Sanger (Inkorporation von Kettenterminator-Nukleotiden, gefolgt von einer elektrophoretischen Analyse der Reaktionsprodukte) sowie Festphasen-basierte Verfahren bekannt, bei denen auf eine Auftrennung der Reaktionsprodukte nach Länge verzichtet wird. Vielmehr wird hier ein jedes Inkorporationsereignis detektiert, was sowohl durch die Einführung von Markierungsgruppen in die zur Verlängerung eingesetzten Nukleotidbausteine als auch durch die Bestimmung von Reaktionsnebenprodukten geschehen kann. Vier verschiedene Klassen solcher Verfahren werden beispielsweise in WO 03/102231 diskutiert. Der Vorteil dieser zweiten Gruppe von Verfahren besteht darin, daß eine hohe Parallelisierung möglich ist, ohne daß der Aufwand für eine große Zahl von Elektrophoreseläufen betrieben werden muß. Der Nachteil gegenüber dem Kettenabbruch-Verfahren liegt jedoch in der deutlich kürzeren Leseweite. Diese ergibt sich aus u.a. aus einem nicht perfekten Ablauf der Sequenzierungsreaktion: mit einer niedrigen Rate werden auch falsche Nukleotidbausteine in den wachsenden Strang inkorporiert, was während der Sequenzierung zu einer fortschreitenden Desynchronisierung der Stränge führt. Hierdurch verschlechtert sich von Zyklus zu Zyklus der Signal-Rausch-Abstand, bis schließlich kein eindeutiges Signal mehr erhalten werden kann. Die Leseweite solcher Verfahren liegt oftmals unter 50 bp, was für die Assemblierung von Teilsequenzen zu Contigs einen großen Nachteil darstellt. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, diesen Nachteil des Stands der Technik wenigstens teilweise zu überwinden.Out the prior art are sequencing methods for the determination the nucleotide sequence of nucleic acids known on the principle based on the primer extension. Here are the "classic" Sanger sequencing (incorporation of Chain terminator nucleotides followed by an electrophoretic Analysis of the reaction products) as well as solid-phase based methods in which a separation of the reaction products according to Length omitted becomes. Rather, every incorporation event is detected here, which both through the introduction of labeling groups in the nucleotide building blocks used for extension as also done by the determination of reaction by-products can. For example, four different classes of such methods discussed in WO 03/102231. The advantage of this second group of Method is that a high parallelization possible is without the Effort for a big Number of electrophoresis runs must be operated. The disadvantage opposite The chain termination method, however, lies in the significantly shorter read range. This results from u.a. from a not perfect expiration of the Sequencing Reaction: at a low rate, also false nucleotide building blocks become incorporated into the growing strand, which during sequencing too a progressive desynchronization of the strands leads. hereby worsens from cycle to cycle the signal-to-noise ratio, until finally no clear Signal can be obtained more. The reading range of such procedures is often below 50 bp, which is for the assembly of subsequences to contigs is a big disadvantage represents. The object of the present invention is to overcome this disadvantage of the prior art at least partially overcome.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Nukleinsäuresequenzierung, umfassend die Schritte:

1. Bereitstellen mindestens einer zu sequenzierenden Nukleinsäure in immobilisierter und mindestens teilweise doppelsträngiger Form,
2. Hybridisierung eines Sequenzierprimers an einen der beiden Stränge der Nukleinsäure,
3. Sequenzierung mindestens eines Abschnitts der Nukleinsäure unter Verlängerung des Sequenzierprimers und unter strand displacement desjenigen Nukleinsäurestrangs, welcher an den primerbindenden Strang hybridisiert vorlag.

The invention relates to a method for nucleic acid sequencing, comprising the steps:

1. providing at least one nucleic acid to be sequenced in immobilized and at least partially double-stranded form,
2. hybridization of a sequencing primer to one of the two strands of the nucleic acid,
3. Sequencing at least a portion of the nucleic acid with extension of the sequencing primer and strand displacement of that nucleic acid strand which hybridized to the primerbindenden strand was present.

Bei der zu sequenzierenden Nukleinsäure kann es sich um jede beliebige Nukleinsäure handeln, bevorzugt sind jedoch genomische DNA, aus genomischer DNA erzeugte Klone (beispielsweise in Plasmid-, Phagen-, Bakerienchromosomen- oder Hefechromosomen-Vektoren) sowie durch die Umschreibung von mRNA erhaltene, einzel- oder doppelsträngige cDNA. Bevorzugterweise liegt die Nukleinsäure in einer Form vor, in der mindestens ein Ende eine bekannte Teilsequenz trägt, mit welcher der Sequenzierprimer hybridisieren kann. Häufig werden zahlreiche Nukleinsäuren zur Sequenzierung eingesetzt, welche sich in Form klonaler Inseln auf einer Oberfläche befinden (s. beispielsweise WO 03/102231) und durch Amplifikation gewonnen wurden. Es ist bevorzugt, daß die zu sequenzierenden Nukleinsäuren beidseitig von bekannten Sequenzabschnitten flankiert sind, die im Falle der gleichzeitigen Sequenzierung mehrerer verschiedener Nukleinsäuren in der Regel im wesentlichen allen Nukleinsäuren gemeinsam sind. Die Immobilisierung der Nukldeinsäuren erfolgt häufig über das 5'-Ende eines der beiden Stränge. Beispielsweise kann dies über die Inkorporation immobilisierter Primer im Zuge einer PCR stattfinden. Zur Immobilisierung wird im übrigen auf die Lehre der WO 03/102231 verwiesen.at the nucleic acid to be sequenced can it is any nucleic acid, are preferred however, genomic DNA, clones generated from genomic DNA (e.g. in plasmid, phage, bakery chromosome or yeast chromosome vectors) and by the transcription of mRNA obtained, single- or double-stranded cDNA. Preferably, the nucleic acid is in a form in which at least one end carries a known partial sequence with which the sequencing primer can hybridize. Become frequent numerous nucleic acids used for sequencing, which take the form of clonal islands on a surface (see for example WO 03/102231) and by amplification were won. It is preferred that the nucleic acids to be sequenced are bilateral Flanked by known sequence sections, which in the case of simultaneous sequencing of several different nucleic acids in which are generally common to all nucleic acids. Immobilization of the nuclear acids is often about that 5'-end of one of two strands. For example, this can be over the incorporation of immobilized primers take place in the course of a PCR. For immobilization is incidentally on the teaching of WO 03/102231 referenced.

Die Hybridisierung eines Sequenzierprimers setzt voraus, daß ein Abschnitt eines der Nukleinsäurestränge einzelsträngig vorliegt oder in den einzelsträngigen Zustand überführt werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vor der Hybridisierung des Sequenzierprimers der am Ort der Sequenzierprimer-Bindungsstelle vorliegende Doppelstrang der zu sequenzierenden Nukleinsäure destabilisiert. Dies kann etwa erfolgen, indem der entsprechende Gegenstrang auf eine Weise verändert wird, daß die Bildungsenergie (d.h., die Bindungsstärke) des Doppelstrangs herabgesetzt wird. Beispielsweise kann dies erreicht werden, indem der Gegenstrang einen oder mehrere Uracil-Reste enthält. Wird die Nukleinsäure dann mit UNG (Uracil N-Glycosylase) behandelt, werden die Uracil-Basen vom Strang gespalten und somit die Stabilität des Doppelstrangs herabgesetzt. Nach dieser Destabilisierung ist eine Hybridbildung des entsprechenden Gegenstrangs mit dem Sequenzierprimer energetisch günstiger, so daß der Sequenzierprimer unter Verdrängung des ursprünglichen Gegenstrangs hybridisieren kann. Ein ähnlicher Effekt ist auch ohne vorherige Destabilisierung erzielbar, wenn die Hybridstärke aus Strang und Sequenzierprimer die Hybridstärke des entsprechenden Nukleinsäureabschnitts überwiegt. Handelt es sich bei dem Nukleinsäureabschnitt um ein Hybrid aus zwei DNA-Strängen, so ist dies erreichbar, indem der Sequenzierprimer RNA- oder PNA-Nukleotide enthält.The Hybridization of a sequencing primer requires that a section one of the nucleic acid strands is single-stranded or in the single-stranded ones Condition are transferred can. In a preferred embodiment the method according to the invention is pre - hybridized to the site of the sequencing primer Sequencing primer binding site present double strand destabilizes the nucleic acid to be sequenced. This can be done, for example, by adding the corresponding counter strand a way changed will that the Energy of formation (i.e., the bond strength) of the duplex decreased becomes. For example, this can be achieved by using the opposite strand contains one or more uracil residues. If the nucleic acid then treated with UNG (uracil N-glycosylase), the uracil bases split by the strand and thus reduced the stability of the double strand. To This destabilization is a hybrid formation of the corresponding Gegenstrangs with the sequencing primer energetically favorable, so that the Sequencing primer under displacement of the original antithesis can hybridize. A similar one Effect is achievable without prior destabilization, though the hybrid strength from strand and sequencing primer the hybrid strength of the corresponding nucleic acid section predominates. Is it the nucleic acid segment a hybrid of two DNA strands, this is achievable by using the sequencing primer RNA or PNA nucleotides contains.

Dementsprechend ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Nukleinsäuresequenzierung, umfassend die Schritte:

1. Bereitstellen mindestens einer zu sequenzierenden Nukleinsäure in immobilisierter und mindestens teilweise doppelsträngiger Form,
2. Destabilisierung des Nukleinsäure-Doppelstrangs mindestens in dem Abschnitt, in welchem sich die Primerbindungsstelle des Sequenzierprimers befindet,
3. Hybridisierung eines Sequenzierprimers an einen der beiden Stränge der Nukleinsäure,
4. Sequenzierung mindestens eines Abschnitts der Nukleinsäure unter Verlängerung des Sequenzierprimers und unter strand displacement desjenigen Nukleinsäurestrangs, welcher an den primerbindenden Strang hybridisiert vorlag.

Accordingly, a further subject of the invention is a method for nucleic acid sequencing, comprising the steps:

1. Provide at least one to sequence nucleic acid in immobilized and at least partially double-stranded form,
2. Destabilization of the nucleic acid double strand at least in the section in which the primer binding site of the sequencing primer is located,
3. hybridization of a sequencing primer to one of the two strands of the nucleic acid,
4. Sequencing at least a portion of the nucleic acid with extension of the sequencing primer and under strand displacement of that nucleic acid strand which hybridized to the primerbindenden strand was present.

Hierbei wird die Immobilisierung häufig über das 5'-Ende eines der beiden Stränge der zu sequenzierenden Nukleinsäure vorgenommen. Dieser Strang enthält dann den im Zuge der Destabilisierung betroffenen Abschnitt, und der Sequenzierprimer hybridisiert mit dem Gegenstrang, welcher nicht kovalent immobilisiert ist, sondern nur mittelbar durch Wasserstoffbrückenbindungen an den immobilisierten Gegenstrang gebunden ist.in this connection immobilization is often over the 5'-end of one of two strands the nucleic acid to be sequenced performed. Contains this strand then the section affected by the destabilization, and the sequencing primer hybridizes to the opposite strand, which is not is covalently immobilized, but only indirectly by hydrogen bonds is bound to the immobilized Gegenstrang.

Die Sequenzierung mindestens eines Abschnitts der Nukleinsäure erfolgt durch Strangverlängerung des Sequenzierprimers, also eines Oligonukleotids, welches an die in einzelsträngiger Form vorliegende zu sequenzierende Nukleinsäure hybridisiert ist. Dieses Oligonukleotid wird dann von einer Polymerase in Gegenwart von Nukleotidbausteinen, dNTPs, verlängert. Die Verlängerung wird detektiert, und aus der Identität der inkorporierten Nukleotidbausteine kann auf die Sequenz der Nukleinsäure geschlossen werden. Die Beobachtung der Inkorporationsereignisse kann beispielsweise über die Detektion von Reaktionsnebenprodukten erfolgen. Beispielsweise beschreiben Ronaghi et al. (Science 281, 363-365 [1998]) die Detektion von Pyrophosphat als Nebenprodukt einer Primerextension. Wird zu einem Zeitpunkt jeweils nur eine Nukleotidsorte (z.B. dATP) angeboten, so erfolgt eine Extension nur dann, wenn auf dem zu sequenzierenden Strang an der betreffenden Position das hierzu komplementäre Nukleotid (in diesem Fall also "T") vorliegt. Eine Extension kann anhand des entstehenden Pyrophosphats detektiert werden. Wird nach Entfernung der uninkorporiert gebliebenen Nukleotide eine andere Nukleotidsorte (z.B. dCTP) angeboten, kann wiederum eine Extension nur dann erfolgen und gemessen werden, wenn sich an der betreffenden Postion des zu sequenzierenden Strangs die komplementäre Base (hier ein "G") befindet. Alternativen zur Sequenzierung unter Bestimmung von Reaktionsnebenprodukten bestehen in der Inkorporation markierter Nukleotide, der Inkorporation reversibel markierter Nukleotide sowie der Inkorporation markierter reversibler Abbruchnukleotide. Hinsichtlich einer Diskussion dieser Verfahren wird auf die WO 03/102231 verwiesen. Allen vier Sequenzierverfahren ist jedenfalls gemeinsam, daß ein Sequenzierprimer an eine bekannte Teilsequenz der zu sequenzierenden Nukleinsäure hybridisiert wird, mittels einer Polymerase verlängert wird und die Verlängerungsereignisse detektiert werden. Aus der Aufzeichnung der Verlängerungsereignisse (genauer: aus der Kenntnis darüber, zu welchem Zeitpunkt welche Sorte von Nukleotidbaustein (und wieviel hiervon) in den wachsenden Strang inkorporiert wurde) läßt sich dann die Sequenz mindestens eines Abschnitts der zu sequenzierenden Nukleinsäure bestimmen. Da der Strang, an den der Sequenzierprimer gebunden hat, noch in zumindest teilweise hybridisierter Form mit dem Gegenstrang der betreffenden Nukleinsäure vorliegt, wird zur Durchführung eine Polymerase eingesetzt, welche strand displacement-Aktivität besitzt. Beispiele für solche Polymerasen sind etwa das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, Vent Polymerase oder das große Fragment der Bst DNA-Polymerase (s.a. New England Biolabs-Katalog 2002/2003, S. 79).The Sequencing of at least a portion of the nucleic acid takes place by strand extension the sequencing primer, ie an oligonucleotide, which is attached to the in single-stranded Form present to be sequenced nucleic acid is hybridized. This Oligonucleotide is then amplified by a polymerase in the presence of nucleotide building blocks, dNTPs, extended. The extension is detected and from the identity of the incorporated nucleotide building blocks can be concluded on the sequence of the nucleic acid. The Observation of the incorporation events, for example, via the Detection of reaction by-products take place. For example, describe Ronaghi et al. (Science 281, 363-365 [1998]) the detection of pyrophosphate as a byproduct of primer extension. Will be at a time in each case only one nucleotide variety (for example dATP) is offered an extension only if on the strand to be sequenced at the position in question, the complementary nucleotide (in this case "T"). A Extension can be detected by the resulting pyrophosphate become. Will after removal of the unincorporated nucleotides another nucleotide variety (e.g., dCTP) may be offered an extension can only be done and measured when at the relevant position of the strand to be sequenced, the complementary base (here a "G") is located. alternatives for sequencing to determine reaction by-products in the incorporation of labeled nucleotides, the incorporation reversible labeled nucleotides as well as the incorporation of labeled reversible termination nucleotides. For a discussion of these methods, reference is made to WO 03/102231 directed. In any case, all four sequencing methods are common, the existence Sequencing primer to a known subsequence of the sequence to be sequenced Nucleic acid hybridizes is extended by means of a polymerase and the extension events be detected. From the record of extension events (more precisely: from the knowledge about at what time which kind of nucleotide building block (and how much of this) was incorporated into the growing strand) can be then the sequence of at least a portion of the sequence to be sequenced nucleic acid determine. Because the strand to which the sequencing primer has bound still in at least partially hybridized form with the opposite strand the relevant nucleic acid is present, is to carry out used a polymerase which has strand displacement activity. examples for such polymerases are about the Klenow fragment of DNA polymerase I, Vent polymerase or the large fragment Bst DNA polymerase (see New England Biolabs Catalog 2002/2003, p. 79).

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die zu sequenzierende Nukleinsäure nacheinander von beiden Enden her sequenziert. In der Regel wird dies geschehen, indem in einer Richtung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sequenziert wird, während die Sequenzierung in die andere Richtung nach dem Stand der Technik erfolgt. Dabei ist besonders bevorzugt, daß die Summe der Leseweiten der Sequenzierung von einem Ende und der Sequenzierung vom anderen Ende die Gesamtlänge der Nukleinsäure mindestens erreicht, insbesondere überschreitet. Weiterhin besonders bevorzugt ist eine Größenselektionierung der für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzten Nukleinsäuren, so daß bei bekannter Leseweite Nukleinsäuremoleküle selektiert werden können, bei denen sich die Sequenzierungen vom einen Ende und vom anderen Ende ungefähr um einen gewünschten Betrag überlappen. Die Größenselektionierung kann auf übliche Weise stattfinden, beispielsweise über präparative Gelelektrophorese, Gelchromatographie oder größenselektive Fällung mittels PEG.In a preferred embodiment the nucleic acid to be sequenced is sequentially from both Ends ago sequenced. In general, this will be done by in a direction is sequenced by the method according to the invention, while the Sequencing in the other direction according to the prior art he follows. It is particularly preferred that the sum of the readings the sequencing of one end and the sequencing of the other End the total length the nucleic acid at least achieved, in particular exceeds. Still special preferred is a size selection the for the inventive method used nucleic acids, so that when known Read-wide nucleic acid molecules selected can be where the sequencing is from one end and the other End about to a desired Overlap amount. The Größenselektionierung can on usual Take place, for example via preparative gel electrophoresis, Gel chromatography or size-selective precipitation by means of PEG.

Humane genomische DNA wird mechanisch geschert und mit BAL-31-Nuclease behandelt, so daß Fragmente einer Größe von ca. 10 bp bis 500 bp entstehen. Die Enden werden mit Klenow-Polymerase "repariert" (d.h. in glatte Enden überführt), und die Fragmentmischungen werden in einem präparativen Agarosegel aufgetrennt. Es wird eine Fraktion der Länge 50 bp bis 70 bp isoliert. An die so größenselektierten Fragmente werden zwei verschiedene doppelsträngige Linker A und B (Länge: je 20 bp) ligiert, die ebenfalls über je ein glattes Ende verfügen. Es wird verdünnt und wie in WO 03/102231 beschrieben mit zwei Primern A und B amplifiziert, die mit jeweils einem Strang eines der beiden Linker hybridisieren können. Die Amplifikation findet statt in Gegenwart einer Oberfläche (Nucleolink), die zusätzlichen Primer A in immobilisierter Form trägt, und ereignet sich in mikroskopisch kleinen, mit der Oberfläche abschließenden Reaktionskammern (siehe WO 03/102231). An den Positionen, an welchen Primer A die Base "T" aufweist, zeichnet sich der immobilisierte Primer A jedoch im Gegensatz zum gelösten Primer A durch Uracil-Basen aus. Nach Abschluß der Amplifikation werden die mit der Oberfläche abschließenden Reaktionskammern entfernt, und es wird gewaschen. Dann wird mit UDG behandelt, um die Uracil-Basen des immobilisierten Strangs der Nukleinsäuren zu entfernen und die Doppelstränge im Bereich von Linker A zu destabilisieren.Human genomic DNA is mechanically sheared and treated with BAL-31 nuclease to give fragments of about 10 bp to 500 bp in size. The ends are "repaired" (ie, blunted) with Klenow polymerase, and the fragment mixtures are separated in a preparative agarose gel. It is a fraction of length 50 bp to 70 bp isolated. Two different double-stranded linkers A and B (length: 20 bp each) are ligated to the thus size-selected fragments, each also having a smooth end. It is diluted and amplified as described in WO 03/102231 with two primers A and B, which hybridize with one strand of each of the two linkers can. The amplification takes place in the presence of a surface (nucleolink) bearing additional primer A in immobilized form, and occurs in microscopically small, surface-capping reaction chambers (see WO 03/102231). At the positions at which primer A has the base "T", however, the immobilized primer A is characterized by uracil bases in contrast to the dissolved primer A. After completion of the amplification, the surface reaction chambers are removed and washed. Then, it is treated with UDG to remove the uracil bases of the immobilized strand of nucleic acids and to destabilize the duplexes in the region of linker A.

Dann wird mit Primer A in Hybridisierungspuffer inkubiert, um eine Verdrängung des immobilisierten, UDG-behandelten Primers A durch gelösten intakten Primer A zu erreichen. Nach Abschluß der Hybridisierung wird kurz gewaschen, und es wird mittels einer Polymerase mit strand displacement-Aktivität (beispielsweise Klenow-Polymerase) sequenziert. Die Sequenzierung erfolgt, indem je eines der vier Nukleotide in Reaktionspuffer, der auch das Enzym enthält, hinzugegeben wird, wobei die Nukleotide durch Fluoreszenzgruppen markiert sind. Nach erfolgter Inkubation wird kurz gewaschen und anhand der Markierungsgruppen detektiert, ob (und ggf. wie viel) Nukleotid inkorporiert wurde. Dann wird das gleiche nacheinander mit den übrigen drei Nukleotiden durchgeführt, und der Zyklus beginnt von neuem. Nach Erreichen der gewünschten Leseweite von 40 bp wird denaturiert und gewaschen, so daß nur noch der immobilisierte Strang (in einzelsträngiger Form) auf der Oberfläche vorliegt. Dann wird mit Primer B in Hybridisierungspuffer inkubiert, kurz gewaschen, und sequenziert wie beschrieben, wobei die Polymerase nun durch eine Polymerase ersetzt wird, welche über keine strand displacement-Aktivität verfügt (beispielsweise T7 Polymerase). Nach Erreichen der gewünschten Leseweite von 40 bp werden die erhaltenen Sequenzen assembliert, d.h. es wird die Überlappung zwischen der ersten Sequenz und dem reversen Komplement der zweiten Sequenz identifiziert, und beide Sequenzen werden zu einem Contig zusammengeführt. Wurden wie in WO 03/102231 auf der Oberfläche "klonale Inseln" erzeugt, so werden die Detektion der Nukleotid-Inkorporationen während der Sequenzierung sowie die Assemblierung von erster und zweiter Sequenz für jede einzelne dieser klonalen Inseln durchgeführt.Then is incubated with primer A in hybridization buffer to allow displacement of the immobilized, UDG-treated primer A by dissolved intact To reach primer A. After completion of the hybridization will be short washed, and it is by means of a polymerase with strand displacement activity (for example Klenow polymerase). The sequencing is done by each one of the four nucleotides in reaction buffer, which also contains the enzyme added is, wherein the nucleotides are marked by fluorescent groups. After incubation is washed briefly and on the basis of the marker groups detects whether (and how much, if any) nucleotide has been incorporated. Then the same is done in succession with the remaining three nucleotides, and the cycle begins again. After reaching the desired Leseweite of 40 bp is denatured and washed, so that only the immobilized strand (in single-stranded form) is present on the surface. Then incubate with primer B in hybridization buffer, in short washed and sequenced as described, the polymerase now is replaced by a polymerase which has no strand displacement activity (for example T7 polymerase). After reaching the desired read range of 40 bp the resulting sequences are assembled, i. it will be the overlap between the first sequence and the reverse complement of the second Sequence identified, and both sequences are merged into a contig. were As in WO 03/102231 produces "clonal islands" on the surface, the detection of the Nucleotide incorporations during the Sequencing as well as the assembly of first and second sequence for every performed single of these clonal islands.

Claims

A method of nucleic acid sequencing comprising the steps: 1. Providing at least one to be sequenced nucleic acid in immobilized and at least partially double-stranded form, Second Hybridization of a sequencing primer to one of the two strands of the Nucleic acid, Third Sequencing at least a portion of the nucleic acid under renewal the sequencing primer and the strand displacement of that nucleic acid strand, which was hybridized to the primer binding strand.

A method of nucleic acid sequencing comprising the steps: 1. Providing at least one to be sequenced nucleic acid in immobilized and at least partially double-stranded form, Second Destabilization of the nucleic acid double strand at least in the section in which the primer binding site of the sequencing primer is, 3. Hybridization of a sequencing primer to one of two strands the nucleic acid, 4th Sequencing at least a portion of the nucleic acid under renewal the sequencing primer and the strand displacement of that nucleic acid strand, which was hybridized to the primer binding strand.

Method according to claim 2, characterized in that that the Destabilization of the double strand takes place in that the sequencing nucleic acid via incorporation a uracil-containing immobilized primer was immobilized and the immobilized nucleic acid treated with UDG.

Method according to one of claims 1-3, characterized that the Hybridization energy of hybridization between sequencing primer and Primer binding site the hybridization energy of the relevant Section in the nucleic acid molecule to be sequenced exceeds.

Method according to one of claims 1-4, characterized that the to be sequenced nucleic acids sequentially sequenced from both ends.

Method according to one of claims 1-5, characterized in that that the to be sequenced nucleic acids a size selection be subjected.