DE102004046540A1

DE102004046540A1 - Annexin modulation and infection resistance

Info

Publication number: DE102004046540A1
Application number: DE102004046540A
Authority: DE
Inventors: Florian Prof. Dr. Lang; Philipp Lang; Stephan Huber
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date: 2004-09-21
Filing date: 2004-09-21
Publication date: 2006-04-06
Also published as: WO2006032330A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Substanz zur therapeutischen oder/und prophylaktischen Behandlung von Infektionskrankheiten, die Verwendung dieser Substanz zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von Infektionen, ein Verfahren zum Identifizieren einer Substanz, die die Funktion oder Expression von Annexin modifiziert, eine durch dieses Verfahren identifizierte oder identifizierbare Substanz, eine Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten, eine Zusammensetzung, die eine der vorgenannten Substanzen aufweist, ein Verfahren zur Feststellung einer modifizierten, vorzugsweise reduzierten, Anfälligkeit eines Lebewesens für Infektionen und ein Verfahren zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung eines Lebewesens, das von einer Infektionskrankheit betroffen ist oder bei dem die Gefahr einer Infektion besteht.The present invention relates to a substance for the therapeutic and / or prophylactic treatment of infectious diseases, the use of this substance for the manufacture of a medicament for the treatment or prophylaxis of infections, a method for identifying a substance that modifies the function or expression of annexin, a by this A method of identifying or identifying a substance, a method of preparing a pharmaceutical composition for the treatment or prophylaxis of infectious diseases, a composition comprising any of the foregoing, a method of detecting a modified, preferably reduced, susceptibility of a subject to infection and a method of therapeutic or prophylactic treatment of a subject afflicted or at risk of an infectious disease.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Substanz zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung von Infektionskrankheiten, die Verwendung dieser Substanz zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von Infektionen, ein Verfahren zum Identifizieren einer Substanz, die die Funktion oder Expression von Annexin modifiziert, eine durch dieses Verfahren identifizierte oder identifizierbare Substanz, ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten, eine Zusammensetzung, die eine der vorgenannten Substanzen aufweist, ein Verfahren zur Feststellung einer modifizierten, vorzugsweise reduzierten Anfälligkeit eines Lebewesens für Infektionen, und ein Verfahren zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung eines Lebewesens, das von einer Infektionskrankheit betroffen ist oder bei dem die Gefahr einer Infektion besteht.The The present invention relates to a substance for therapeutic or prophylactic treatment of infectious diseases that Use of this substance for the manufacture of a medicament for Treatment or prophylaxis of infections, a method of identification a substance that modifies the function or expression of annexin, an identified or identifiable by this method Substance, a process for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment or prophylaxis of infectious diseases, a composition, having one of the aforementioned substances, a method for Determination of a modified, preferably reduced susceptibility of a living being for Infections, and a method of therapeutic or prophylactic Treatment of a living being affected by an infectious disease or where there is a risk of infection.

Derartige Substanzen, Zusammensetzungen und Verfahren sind im Stand der Technik allgemein bekannt.such Substances, compositions and methods are in the art well known.

Infektionskrankheiten sind ansteckende und nicht-ansteckende Krankheiten bei Tier und Mensch mit akutem oder chronischem Verlauf, die durch Infektion mit bestimmten Erregern, wie Viren, Bakterien, Pilzen, Protozoen, Würmern, Arthropoden, Prionen etc., entstehen. Das Zusammenwirken von Infektion, schädigender Wirkung der Erreger und spezifischer Abwehr des Körpers führt zu einem charakteristischen Bild einer bestimmten Infektionskrankheit und bestimmt deren Verlauf.infectious diseases are contagious and non-contagious diseases in animal and Person with acute or chronic course, caused by infection with certain pathogens, such as viruses, bacteria, fungi, protozoa, worms, Arthropods, prions, etc. arise. The interaction of infection, damaging Effect of the pathogen and specific defense of the body leads to a characteristic picture of a certain infectious disease and determines their course.

Infektionskrankheiten stehen weltweit an erster Stelle der Todesursachen. 1995 wurden 17,3 Millionen Todesfälle durch die häufigsten Infektionskrankheiten akute Atemwegsinfektionen, Durchfall, Tuberkulose, Malaria, Hepatitis, AIDS und Masern verursacht. Das Phänomen der sich weltweit immer stärker ausbreitenden Infektionskrankheiten wird mit Besorgnis beobachtet und u.a. von der Weltgesundheitsorganisation als alarmierend bezeichnet.infectious diseases are the number one causes of death worldwide. 1995 were 17.3 million deaths through the most common Infectious diseases acute respiratory infections, diarrhea, tuberculosis, Malaria, hepatitis, AIDS and measles causes. The phenomenon of getting stronger all over the world spreading infectious diseases is being watched with concern and u.a. called alarming by the World Health Organization.

Der Entstehung und Manifestierung von Infektionskrankheiten wird mittels Schutzimpfungen, d.h. durch aktive Immunisierung, vorzubeugen versucht. Obgleich mit diesen Maßnahmen verschiedene Infektionskrankheiten regional eliminiert oder gar weltweit ausgerottet werden konnten, wie z.B. Pocken, gibt es nach wie vor eine bedeutende Zahl von Erregern. Dies liegt u.a. daran, dass eine entsprechende Immuntherapie häufig wirkungslos ist, da die Erreger sich durch verschiedenste Mechanismen dem Zugriff durch das Immunsystem entziehen. Ein weiteres Problem im Zusammenhang mit einer aktiven Immunisierung ist die häufig starke Belastung für den zu immunisierenden Organismus.Of the Emergence and manifestation of infectious diseases is by means of Vaccinations, i. through active immunization, trying to prevent. Although with these measures various infectious diseases are eliminated regionally or even could be eradicated worldwide, such as Smallpox, there are still before a significant number of pathogens. This is u.a. remember that a corresponding immunotherapy is often ineffective, since the The pathogen is accessed through a variety of mechanisms to withdraw the immune system. Another problem related with active immunization is often the strong burden for the too immunizing organism.

Eine Vielzahl von Infektionskrankheiten wird nach wie vor mit klassischen Antibiotika behandelt. Diese Maßnahme hat jedoch den Nachteil, dass sich resistente Erregerstämme ausbilden. So sind inzwischen 50 bis 60 % der Malariaerreger resistent gegen das Malariamittel Chloroquin, und auch gegen die neuen Medikamente Mefloquin oder Atovaquon/Proguanil bestehen bereits erste Resistenzen.A Variety of infectious diseases remains classic Treated antibiotics. This measure However, it has the disadvantage that resistant pathogen strains are formed. In the meantime, 50 to 60% of the malaria pathogens are resistant to the malaria drug chloroquine, and also against the new drugs Mefloquine or atovaquone / proguanil already have their first resistance.

Andere bspw. bei viralen Infektionen eingesetzte Substanzen, wie z.B. Interferone, greifen auf mannigfaltige Weise in den Stoffwechsel, das Wachstum und die Differenzierung von Zellen ein und verursachen damit eine Vielzahl von Nebenwirkungen.Other for example, substances used in viral infections, e.g. interferons, engage in a variety of ways in the metabolism, growth and the differentiation of cells, causing one Variety of side effects.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, eine Substanz bereitzustellen, mit der gezielt Infektionen behandelt bzw. diesen vorgebeugt werden kann, bei der jedoch die Nachteile aus dem Stand der Technik vermieden werden. Insbesondere soll eine Resistenzbildung der Erreger und das Auftreten von Nebenwirkungen weit gehend vermieden werden.task It is therefore an object of the present invention to provide a substance which with the targeted infections are treated or prevented can, but avoided the disadvantages of the prior art become. In particular, a resistance formation of the pathogens and the occurrence of side effects are largely avoided.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung einer Substanz gelöst, die derart gestaltet ist, dass diese die Expression oder/und Funktion von Annexin moduliert.These Task is solved by providing a substance that is designed such that this expression or / and function modulated by annexin.

Annexine bilden eine heterogene Gruppe von calciumbindenden Proteinen. Annexine werden auch als Calelectrine, Calpactine, Chromobindine, Endonexine, Lipocortine oder Synesine bezeichnet. Annexine besitzen eine relative Molekülmasse von ca. 35 kDa und ein etwa 80 aminosäurenlanges konserviertes Fragment, das bis zu acht Mal innerhalb eines Proteins wiederholt sein kann. Annexine kommen, außer in Hefen, in allen eukaryotischen Organismen vor. Mittlerweile werden die Annexine in Untergruppen eingeteilt, die bislang mit Ziffern von I bis XIII bzw. 1 bis 13 bezeichnet werden.annexins form a heterogeneous group of calcium binding proteins. annexins are also called calelectrins, calpactins, chromobindins, endonexins, Lipocortins or syneasine called. Annexins have a relative molecular mass of about 35 kDa and about 80 amino acid long conserved fragment, the can be repeated up to eight times within a protein. annexins come, except in yeast, in all eukaryotic organisms. Meanwhile the annexins divided into subgroups, which so far with digits from I to XIII and 1 to 13, respectively.

Annexine treten in vivo als cytoplasmatische lösliche Proteine auf. Annexin II wird für die calciumabhängige Exo- und Endocytose verantwortlich gemacht; es kann calciumabhängig an Membranen binden. Annexin XIII trägt am N-Terminus einen Myristoylrest und scheint am polaren Vesikeltransport in Darmepithelzellen beteiligt zu sein. Annexin VI scheint in Muskelzellen die Calciumausschüttung nach elektrischer Reizung zu steuern. Die genaue Funktion der Annexine ist jedoch bislang noch weit gehend unklar. Eine Übersicht zu Annexinen findet sich in Gerke V. und Moss S.E. (2002), „Annexins: from structure to function", Physiol. Rev. 82: S. 331 bis 371.annexins occur in vivo as cytoplasmic soluble proteins. annexin II is for the calcium dependent Exo- and endocytosis blamed; it may be calcium dependent Bind membranes. Annexin XIII carries a myristoyl residue at the N-terminus and appears to be involved in polar vesicle transport in intestinal epithelial cells to be. Annexin VI appears in muscle cells after the calcium release after control electrical irritation. The exact function of annexins However, it is still largely unclear. An overview to annexins can be found in Gerke V. and Moss S.E. (2002), "Annexins: from structure to function ", Physiol. Rev. 82: pp. 331-371.

Vor diesem Hintergrund war es deshalb besonders überraschend und vorteilhaft, dass mittels einer Substanz, die die Expression oder Funktion von Annexin moduliert, ein Mittel bereitgestellt wird, mit dem selektiv und hochspezifisch Infektionen vorgebeugt werden kann bzw. Infektionskrankheiten therapiert werden können. Ein Zusammenhang zwischen der Infektionsanfälligkeit eines Organismus und dem Expressionsniveau oder der Funktion von Annexin ist bislang im Stand der Technik nicht beschrieben oder auch nur angedacht worden.In front this background, it was therefore particularly surprising and beneficial that by means of a substance, the expression or function of Annexin modulates, a means is provided with which selectively and highly specific infections can be prevented or infectious diseases can be treated. A connection between the susceptibility to infection of an organism and the level of expression or the function of annexin is so far not described in the prior art or even thought about.

Erfindungsgemäß kann die Substanz sowohl chemisch als auch biochemisch oder biologisch definiert sein. Es kann sich also um eine klassisch chemisch synthetisierte Verbindung, aber auch um ein Peptid oder um eine Nucleinsäure handeln. Erfindungsgemäß wird der Begriff der Expression im weitesten Sinne verstanden und erfasst den gesamten Vorgang der Bildung eines funktionellen Proteins. Die Expression oder auch Funktion von Annexin kann erfindungsgemäß durch die Substanz auf sämtlichen Ebenen der Biosynthese, wie Transkription, Prozessierung der RNA, Translation, Faltung des Proteins, Lokalisierung des Proteins an seinen physiologischen Ort moduliert werden. Annexin kann durch die Substanz auch in seiner Aktivität moduliert werden.According to the invention, the Substance be defined both chemically and biochemically or biologically. So it can be a classically chemically synthesized compound, but also a peptide or a nucleic acid act. According to the invention Concept of expression in the broadest sense understood and captured the whole process of the formation of a functional protein. The Expression or function of annexin can according to the invention by the substance on all Levels of biosynthesis, such as transcription, RNA processing, Translation, folding of the protein, localization of the protein its physiological location be modulated. Annexin can by the substance can also be modulated in its activity.

Unter „modulieren" wird erfindungsgemäß eine Aktivierung, Inhibierung, Verstärkung, Hemmung oder ein vollständiges Ausschalten der Expression oder physiologischen Funktion von Annexin, bspw. durch einen sogenannten Knockout verstanden.Under "modulate" according to the invention is an activation, Inhibition, amplification, Inhibition or a complete Switching off the expression or physiological function of annexin, For example, understood by a so-called knockout.

Dabei ist es bevorzugt, wenn die Substanz derart gestaltet ist, dass die Expression oder/und Funktion von Annexin inhibiert wird.there it is preferred if the substance is designed such that the Expression or / and function of annexin is inhibited.

Erfindungsgemäß wird unter Inhibition die vollständige oder teilweise Hemmung der physiologischen Funktion bzw. Aktivität oder der natürlichen Expression von Annexin verstanden.According to the invention is under Inhibition the complete or partial inhibition of the physiological function or activity or the natural Expression of annexin understood.

Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass Mäuse, bei denen mittels gentechnischer Maßnahmen das Annexin-Gen (im Folgenden Annexin) ausgeschaltet wird, eine drastisch höhere Überlebensrate nach einer Infektion mit dem Malaria-Erreger im Vergleich zu ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern haben. Solche sogenannten Annexin-Knockout-Mäuse überleben die sonst für Mäuse tödlich verlaufende Infektion mit dem Parasiten Plasmodium berghei. Im Vergleich starben alle entsprechenden Wildtyp-Mäuse an der gleichen Infektion.The Inventors have surprisingly found that mice, in which by genetic engineering the annexin gene (im Following Annexin) is switched off, a drastically higher survival rate after infection with the malaria parasite compared to theirs Have wild-type littermates. Such so-called annexin knockout mice survive otherwise for Mice deadly Infection with the parasite Plasmodium berghei. In comparison died all corresponding wild-type mice at the same infection.

Dabei hat sich gezeigt, dass Zellen, bspw. Erythrocyten, die von intrazellulären Erregern infiziert wurden und aus Annexin-Knockout-Mäusen stammen, im Vergleich zu entsprechend infizierten Zellen aus Wildtyp-Mäusen vom körpereigenen Immunsystem beschleunigt erkannt und „entsorgt" werden. Mit dem Knockout des Annexin-Gens wird, wie die Erfinder erkannt haben, ein Faktor ausgeschaltet, der bei Infektionsverläufen eine zentrale Rolle spielt. Offenbar verhindert die Expression von Annexin die frühzeitige Erkennung von infizierten Zellen und damit deren Eliminierung.there It has been shown that cells, such as erythrocytes, by intracellular pathogens infected and derived from annexin knockout mice, in comparison to correspondingly infected cells from wild-type mice of endogenous Immune system accelerated detected and "disposed of" with the knockout of the annexin gene is, as the inventors have recognized, a factor switched off, the in infection progressions one central role plays. Apparently, the expression of annexin prevents the early one Detection of infected cells and their elimination.

Diese Erkenntnis der Erfinder hat zur Konzeption der erfindungsgemäßen Substanz geführt, mit der ganz gezielt ein Mangel an funktionellem Annexin bei einem Wirt herbeigeführt werden kann. Bei einem mit der erfindungsgemäßen Substanz behandelten oder ggf. vorbehandelten Wirt wird deshalb gezielt das Immunsystem gegen die Erreger mobilisiert und eine Resistenz oder drastisch verminderte Anfälligkeit gegenüber Infektionen, wie bspw. Malaria, herbeigeführt.These Knowledge of the inventor has the concept of the substance according to the invention guided, with the very deliberate lack of functional annexin at one Host induced can be. In a treated with the substance according to the invention or pretreated host is therefore targeted against the immune system the pathogens mobilized and resistance or drastically diminished susceptibility across from Infections, such as malaria, brought about.

Von besonderem Vorteil ist hier, dass mit der erfindungsgemäßen Substanz an körpereigenen Strukturen angesetzt wird und nicht, wie bei den meisten Antibiotika, in den Stoffwechsel eines Erregers eingegriffen, wogegen dieser leicht Resistenzen ausbilden kann. Die Gefahr der Ausbildung solcher Resistenzen gegen die erfindungsgemäße Substanz ist deshalb extrem gering. Da es sich nach Erkenntnissen der Erfinder bei Annexin um ein zentrales Protein handelt, das bei Infektionen durch unterschiedlichste Erreger involviert zu sein scheint, weist die erfindungsgemäße Substanz deshalb ein besonders breites Wirkungsspektrum auf, wohingegen viele der im Stand der Technik bekannten Antibiotika nur gegenüber bestimmten Erregern wirksam sind.Of particular advantage here is that the substance of the invention is used on the body's own structures and not, as in most antibiotics, intervened in the metabolism of a pathogen, whereas this can easily form resistance. The risk of the formation of such resistance to the substance according to the invention is therefore extremely low. Since, according to findings of the inventors at Annexin is a central protein that appears to be involved in infections by a variety of pathogens, therefore, the substance of the invention has a particularly broad spectrum of activity, whereas many of the known in the art antibiotics are effective only against certain pathogens.

In diesem Zusammenhang haben die Erfinder auch ein Verfahren zum Identifizieren einer Substanz entwickelt, die die Funktion oder/und Expression von Annexin modifiziert und das folgende Schritte aufweist: (a1) Bereitstellung eines von Annexin abgeleiteten Peptides, oder (a2) Bereitstellung eines biologischen Systems, das ein von Annexin abgeleitetes Peptid exprimiert; (b1) In-Kontakt-bringen des Peptides mit einer Testsubstanz unter Bedingungen, die die Bindung der Testsubstanz an das Peptid ermöglichen, oder (b2) Einbringen einer Testsubstanz in das biologische System, und (c) Feststellung, ob die Testsubstanz aus Schritt (b1) die Funktion oder aus Schritt (b2) die Expression des Peptides moduliert, vorzugsweise inhibiert.In In this connection, the inventors also have a method for identifying a substance that develops the function or / and expression modified by annexin and having the following steps: (a1) Providing an annexin-derived peptide, or (a2) Providing a biological system that is an annexin derived Peptide expressed; (b1) contacting the peptide with a Test substance under conditions that the binding of the test substance allow for the peptide or (b2) introducing a test substance into the biological system, and (c) determining if the test substance of step (b1) has the function or from step (b2) modulates the expression of the peptide, preferably inhibited.

Erfindungsgemäß werden in dem Verfahren nacheinander die Schritte (a1), (b1) und (c) oder die Schritte (a2), (b2) und (c) durchgeführt.According to the invention in the process sequentially the steps (a1), (b1) and (c) or steps (a2), (b2) and (c) are performed.

Die Erfinder haben erkannt, dass eine erfindungsgemäße Substanz identifiziert werden kann, ohne dass in den Schritten (a1) und (a2) zwingend das gesamte Annexinprotein bereitgestellt werden muss, sondern lediglich ein davon abgeleitetes Peptid. Hierunter ist ein Abschnitt des Gesamtannexinproteins zu verstehen, der zumindest für die physiologische Funktionen, d.h. enzymatische oder katalytische oder sonstige Aktivität des Annexins mitverantwortlich ist. Eine Substanz, die die Aktivität oder Expression eines solchen Peptides moduliert, zeigt selbstverständlich auch Wirkung gegenüber dem Gesamtannexinprotein. Es versteht sich, dass im Rahmen dieses Verfahrens auch das Gesamtannexinprotein verwendet werden kann.The Inventors have recognized that a substance according to the invention can be identified can, without necessarily in the steps (a1) and (a2) the entire Annexin protein must be provided, but only one derived peptide. Below is a section of the totalannexin protein to understand, at least for the physiological functions, i. enzymatic or catalytic or other activity the annexin is partly responsible. A substance that has the activity or expression Of course, modulating such a peptide also shows Effect over the totalannexin protein. It is understood that under this Method also the totalannexinprotein can be used.

Die Erfinder haben ferner erkannt, dass mithilfe eines biologischen Systems eine Substanz identifiziert werden kann, die die Expression von Annexin modifiziert. Ein solches biologisches System kann durch einen gesamten eukaryotischen oder prokaryotischen Organismus oder auch durch ein in vitro-Expressionssystem aus Bakterien, Baculoviren, kultivierten Zellen oder Xenopus-Oocyten bzw. aus entsprechenden Extrakten bereitgestellt werden.The Inventors have also recognized that using a biological Systems a substance can be identified that expression modified by annexin. Such a biological system can by an entire eukaryotic or prokaryotic organism or also by an in vitro expression system of bacteria, baculoviruses, cultured cells or Xenopus oocytes or from corresponding Extracts are provided.

In Schritt (b1) muss die Testsubstanz, um als erfindungsgemäße Substanz zu fungieren, an das annexinabgeleitete Peptid binden, d.h. es muss ein Zustand etabliert werden, in dem sich die zu testende Substanz zumindest in unmittelbarer Nähe zu dem Peptid befindet und deshalb in der Lage ist, die Aktivität bzw. Funktion des Peptides zu beeinflussen. Bedingungen, die das In-Kontakt-bringen des Peptides mit der Testsubstanz ermöglichen oder die in dem biologischen System vorherrschen müssen, um eine expressionsmodulierende Aktivität zu erfassen, sind im Bereich der Protein- oder Enzymbiochemie oder der Molekularbiologie wohl bekannt. In diesem Zusammenhang finden bspw. übliche physiologische oder biologische Puffersysteme Verwendung, wie Tris-, HEPES oder PBS-basierte Puffer, ggf. versetzt mit verschiedenen Salzen in geeigneten Konzentrationen oder mit weiteren üblichen Zusätzen. Die Feststellung in Schritt (c) erfolgt mit dem Fachmann bekannten Funktionalitäts-, Aktivitäts- oder Expressionstests. Eine Anleitung, wie hier zweckmäßigerweise vorgegangen werden kann, findet sich bspw. in Sambrook J. und Russel D.W., (2001), "Molecular Cloning – A Laboratory Handbook", Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition, deren Inhalt durch Bezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung ist.In Step (b1) requires the test substance to be a substance of the invention to bind to the annexin-derived peptide, i. it must a condition can be established in which the substance to be tested at least close is located to the peptide and therefore is able to the activity or function of the To influence peptides. Conditions that make the contact of the Allow peptides with the test substance or in the biological System must prevail, to capture an expression modulating activity are in the range protein or enzyme biochemistry or molecular biology known. In this context, for example, usual physiological or biological buffer systems use, such as Tris, HEPES or PBS-based Buffer, possibly mixed with various salts in suitable concentrations or with other usual ones Additives. The determination in step (c) is carried out by those skilled in the art of functionality, activity or expression tests. A guide, as appropriate proceeded here can be found, for example, in Sambrook J. and Russel D.W., (2001), "Molecular Cloning - A Laboratory Handbook, "Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition, their content by Reference is part of the present application.

Das vorstehend beschriebene Verfahren hat den Vorteil, dass dem Fachmann ein zielführender Weg vorgegeben wird, mit dem eine nahezu unbegrenzte Anzahl von Substanzen aufgefunden werden kann, die zur Behandlung oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten verwendet werden können und die weit gehend frei von den Nachteilen sind, die die bisher im Stand der Technik gegen Infektionskrankheiten eingesetzten Substanzen aufweisen.The The method described above has the advantage that the person skilled in the art a goal-oriented Path is given, with which an almost unlimited number of Substances that can be found for treatment or prophylaxis can be found of infectious diseases can be used and the largely free of the disadvantages that are currently in the art against Have substances used in infectious diseases.

Vor diesem Hintergrund ist auch eine solche Substanz Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die durch das vorstehende Verfahren identifiziert wurde bzw. identifizierbar ist.In front This background also makes such a substance the subject of present invention identified by the above method was or is identifiable.

Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung ist die Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: niedermolekularen Wirkstoffen, Antikörpern und genetischen Konstrukten.To In a preferred development, the substance is selected from the group consisting of: low - molecular active substances, antibodies and genetic constructs.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass besonders geeignete, einfach und kostengünstig herstellbare Darstellungsformen der erfindungsgemäßen Substanz bereitgestellt werden, die auch als Arzneimittel gut formulierbar sind.These measure has the advantage that particularly suitable, easy and inexpensive producible forms of presentation the substance according to the invention which can also be well formulated as a drug are.

Bei niedermolekularen Wirkstoffen oder auch „small molecules" handelt es sich um einen Sammelbegriff für chemische Substanzen mit Aktivitäten in biologischen Systemen, wobei deren Molekulargewichte in der Regel unter etwa 1.000 bis 1.200 Da liegen. Ein solcher Wirkstoff hat den Vorteil, dass dieser mittels etablierter Synthesemethoden in großmaßstäblicher Art und Weise hergestellt werden kann und hinreichend stabil ist. Ferner können solche niedermolekularen Wirkstoffe ausgehend von chemisch definierten oder biologischen Leitstrukturen, wie bspw. Peptiden, mit den Methoden des sog. „rational drug design" oder der sog. „molecular evolution" durch chemische Synthese optimiert werden. Die Herstellung von niedermolekularen Wirkstoffen ist dem Fachmann geläufig; siehe Böhm et al. (2002), „Wirkstoffdesign", Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.at Low molecular weight drugs or "small molecules" are a collective term for chemical substances with activities in biological systems, their molecular weights usually being below about 1,000 to 1,200 Da. Such an active ingredient has the advantage that this by means of established synthetic methods in large-scale Way can be made and is sufficiently stable. Furthermore, can Such low molecular weight drugs starting from chemically defined or biological lead structures, such as peptides, with the methods the so-called "rational drug design "or the so-called "molecular evolution " optimized chemical synthesis. The production of low molecular weight Active ingredients are familiar to the person skilled in the art; see Böhm et al. (2002), "Drug Design", Spectrum Academic Publisher, Heidelberg.

Unter genetischen Konstrukten werden Nucleinsäuremoleküle verstanden, wie Vektoren, Plasmide, Sonden oder vergleichbare Moleküle, die zum Handwerkszeug des Molekularbiologen gehören und mit denen gezielt die Expression oder/und Funktion von Annexin moduliert werden kann. Derartige genetische Konstrukte haben den Vorteil, dass diese wesentlich stabiler und robuster als Peptide sind und nahezu unbegrenzt gelagert werden können. Die Herstellung eines genetischen Kostruktes ist bspw. in der Abhandlung von Joseph Sambrook und David W. Russel (a.a.O.) beschrieben.Under Genetic constructs are understood to be nucleic acid molecules, such as vectors, Plasmids, probes or similar molecules that are the tools of the Include molecular biologists and with which specifically the expression and / or function of annexin can be modulated. Such genetic constructs have the Advantage that these are much more stable and robust than peptides are and can be stored almost indefinitely. The production of a Genetic Kostruktes is, for example, in the treatise of Joseph Sambrook and David W. Russel (supra).

Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Substanz für eine Antisense-Annexin-Sonde oder/und eine Annexin-RNAi oder/und für transdominant inhibitorisches Annexin codiert.there is it preferred according to the invention if the substance for an antisense annexin probe or / and an annexin RNAi and / or for transdominant encoded inhibitory annexin.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Expression oder/und Funktion von Annexin gezielt und bereits auf einem genetischen Level mittels der sog. Antisense-Technologie moduliert bzw. inhibiert wird.These measure has the advantage that the expression and / or function of annexin targeted and already on a genetic level by means of the so-called Antisense technology is modulated or inhibited.

Eine Antisense-Annexin-Sonde ist ein genetisches Konstrukt, d.h. eine DNA- oder RNA-Sequenz, die komplementär zu einer funktionellen Messenger-RNA oder -DNA oder Teilen davon ist, die für Annexin codieren. Diese Sonde ist in der Lage, sich an die komplementäre Struktur anzulagern, die für Annexin codiert, und dabei die Translation und/oder Transkription des Codierungsbereiches zu blockieren.A Antisense annexin probe is a genetic construct, i. a DNA or RNA sequence that is complementary to a functional messenger RNA or DNA or parts thereof encoding annexin. This probe is able to attach to the complementary structure that for annexin coded, and thereby the translation and / or transcription of the coding area to block.

Annexin-RNAi steht für Annexin-RNA „interference", auch siRNA (für „silencing" RNA) genannt. Eine solche RNAi ist eine doppelsträngige RNA (dsRNA), die weit gehend homolog zu der natürlichen Messenger-RNA ist. Eine solche RNAi, die in einen Organismus oder eine Zelle eingebracht wird, erkennt und bindet die entsprechend homologe mRNA und führt über einen bislang noch weit gehend ungeklärten Mechanismus zu einem Abbau der letzteren und zu einem Knockout-Phänotyp im Hinblick auf das entsprechende Gen bzw. Genprodukt; vgl. Fire et al. (1998), „Potent and specific genetic interference by double-stranded RNS in Caenorhabditis elegans", Nature 391: S. 806 bis 811.Annexin-RNAi stands for Annexin RNA "interference", also called siRNA (for "silencing" RNA). Such RNAi is a double-stranded RNA (dsRNA), which is largely homologous to the natural messenger RNA. One such RNAi that is introduced into an organism or a cell is recognized and binds the corresponding homologous mRNA and leads via a so far still largely unexplained Mechanism for a degradation of the latter and a knockout phenotype in the Regard to the corresponding gene or gene product; see. Fire et al. (1998), "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans ", Nature 391: pp. 806-811.

Transdominant inhibitorisches Annexinprotein ist durch eine Mutation gekennzeichnet, bspw. eine Punktmutation, die dazu führt, dass ein solch modifiziertes Annexin funktionsunfähig ist. Wenn eine solch mutierte Form des Annexins in einer Zelle exprimiert wird, wird das Wildtyp-Annexin bis hin zu einer nicht messbaren Hintergrundaktivität supprimiert und damit ausgeschaltet.trans Dominant inhibitory annexin protein is characterized by a mutation For example, a point mutation that leads to such a modified Annexin inoperable is. When such a mutated form of annexin is expressed in a cell becomes, the wild-type Annexin is up to an immeasurable Background activity suppressed and thus switched off.

Vor diesem Hintergrund ist Gegenstand der vorliegende Erfindung auch eine vorgehend beschriebene Substanz zur medizinischen Verwendung.In front This background is also the subject of the present invention a previously described substance for medical use.

Die Erfinder haben nämlich erstmals eine Substanz, die die Expression oder/und Funktion von Annexin moduliert bzw. inhibiert, bereitgestellt, die im Bereich der Medizin eingesetzt wird. Die erfindungsgemäße Substanz eignet sich sowohl als Therapeutikum als auch als prophylaktisches Mittel. Die Substanz kann bspw. auch in der Tierhaltung verwendet werden, um bei Tieren Infektionsresistenzen zu schaffen. So kann mit Mitteln der Gentechnologie bei Zuchttieren gezielt das Annexin-Gen ausgeschaltet werden und so auf einfache Art und Weise das Problem der Infektionen durch verschiedenste veterinärpathogene Erreger vermieden werden.The In fact, inventors have first a substance that affects the expression and / or function of Annexin modulates or inhibits, provided in the field the medicine is used. The substance according to the invention is suitable both as a therapeutic as well as a prophylactic agent. The substance can also be used in animal husbandry, for example, in animals To create infection resistance. So can by means of gene technology in breeding animals targeted the annexin gene are turned off and so easily the problem of infection through various veterinary pathogens Pathogens are avoided.

Die erfindungsgemäße Substanz ist zur Behandlung oder/und Prophylaxe von Infektionskrankheiten geeignet, insbesondere von solchen, die durch intrazelluläre Erreger verursacht werden, vorzugsweise von Parasitämie und/oder Malaria.The substance according to the invention is suitable for the treatment or / and prophylaxis of infectious diseases, especially those caused by intracellular pathogens, preferably of parasitemia and / or malaria.

Die Erfinder haben ein universelles Prinzip erkannt und eine Substanz konzipiert, die gegen eine Vielzahl von weiteren Erregern wirksam ist, wie gegen Legionellen, Mycobacterien, Viren etc. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ganz gezielt von den Erfindern erstmals erkannte Mechanismen therapeutisch bzw. diagnostisch genutzt werden. So werden nämlich Zellen, bspw. Erythrocyten, die von derartigen Erregern infiziert wurden, vom Immunsystem dann beschleunigt „entsorgt", wenn das Annexinprotein in seiner Expression oder/und Funktion inhibiert ist. Durch diese Ausgestaltung der Substanz wird ganz gezielt ein Wirkstoff geschaffen, der spezifisch gegen intrazelluläre Erreger gerichtet ist.The inventors have recognized a universal principle and designed a substance which is effective against a large number of other pathogens, such as against legionella, mycobacteria, viruses, etc. This measure has the advantage that mechanisms that have been specifically recognized by the inventors for the first time therapeutically or diagnostically be used. For example, cells, for example erythrocytes, become infected by such pathogens were accelerated by the immune system then "disposed of" when the annexin protein is inhibited in its expression and / or function.This embodiment of the substance is quite specifically created an active substance that is specifically directed against intracellular pathogens.

Die erfindungsgemäße Substanz ist vorzugsweise derart gestaltet, dass diese selektiv die Expression oder/und Funktion von Annexin in Erythrocyten moduliert.The substance according to the invention is preferably designed to selectively express or / and Function of annexin modulated in erythrocytes.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Substanz gezielt als Therapeutikum gegenüber einer solchen Infektion eingesetzt werden kann, die über den Befall von Erythrocyten erfolgt, wie bspw. Malaria. Annexin, das in anderen Zellen vorhanden ist und dort seine physiologische Funktion ausübt, wird nicht beeinflusst. Nebenwirkungen werden durch diese Maßnahme nochmals reduziert.These measure has the advantage that the substance is targeted as a therapeutic against a such infection can be used, over the infestation of erythrocytes takes place, such as malaria. Annexin present in other cells is there and exerts its physiological function is not affected. side effects be through this measure again reduced.

Vor diesem Hintergrund ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch die Verwendung der vorstehend beschriebenen Substanz zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder/und Prophylaxe von Infektionskrankheiten, insbesondere von solchen durch intrazelluläre Erreger verursachten Infektionskrankheiten wie Malaria.In front This background is also the subject of the present invention the use of the substance described above for the preparation a medicament for the treatment or / and prophylaxis of infectious diseases, in particular of such infectious diseases caused by intracellular pathogens like malaria.

Ein weiterer Gegenstand betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder/und Prophylaxe von Infektionskrankheiten, das folgende Schritte aufweist: (a) Bereitstellung einer Substanz, die die Expression und/oder Funktion von Annexin moduliert, und (b) Formulierung dieser Substanz in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, wobei als Substanz die erfindungsgemäße oder erfindungsgemäß identifizierte Substanz verwendet wird.One Another object relates to a process for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prophylaxis of infectious diseases comprising the steps of: (a) providing a substance that affects the expression and / or function of annexin modulates, and (b) formulation of this substance in a pharmaceutical acceptable carrier, wherein the substance according to the invention or inventively identified Substance is used.

Bei der Infektionskrankheit handelt es sich vorzugsweise um eine solche, die durch intrazelluläre Erreger verursacht ist, vorzugsweise um Parasitämie oder Malaria.at the infectious disease is preferably one which by intracellular Pathogen, preferably parasitemia or malaria.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, vorzugsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die erfindungsgemäße Substanz und ggf. einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.One Another object of the present invention relates to a composition, preferably a pharmaceutical composition containing the substance according to the invention and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.

Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik umfangreich beschrieben; vgl. Arthur H. Kibbe (2000), „Handbook of Pharmaceutical Excipients", Third Edition, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press. Der Inhalt dieser Publikation ist durch Bezugnahme Gegenstand der vorliegenden Beschreibung.pharmaceutical acceptable carriers are extensively described in the art; see. Arthur H. Kibbe (2000), "Handbook of Pharmaceutical Excipients ", Third Edition, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press. The content of this publication is the subject matter of reference the present description.

Die Erfinder haben darüber hinaus erkannt, dass über das Niveau der Annexin-Expression bzw. der Annexin-Funktion eine Diagnose bzw. Aussage darüber getroffen werden kann, inwiefern das betroffene Lebewesen eine Anfälligkeit für Infektionen hat, vorzugsweise verursacht durch intrazelluläre Erreger, wie Malaria.The Inventors have about it also recognized that over the level of annexin expression or annexin function a Diagnosis or statement about it It can be taken to what extent the affected animal is susceptible for infections has, preferably caused by intracellular pathogens, such as malaria.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft deshalb ein Verfahren zur Feststellung einer modifizierten, vorzugsweise reduzierten Anfälligkeit eines Lebewesens für Infektionen, das folgende Schritte aufweist: (a) Bereitstellung einer biologischen Probe des Lebewesens; (b) Analyse der Probe auf das Vorhandensein einer modifizierten, vorzugsweise reduzierten Annexin-Funktion oder Annexin-Expression, und (c) Korrelation eines positiven Befundes in Schritt (b) mit der Diagnose einer modifizierten, vorzugsweise reduzierten Anfälligkeit des Lebewesens.One Another object of the present invention therefore relates a method for determining a modified, preferably reduced susceptibility of a being for infections, comprising the following steps: (a) providing a biological Sample of the living thing; (b) analysis of the sample for the presence a modified, preferably reduced annexin function or Annexin expression, and (c) correlation of a positive finding in step (b) with the diagnosis of a modified, preferably reduced susceptibility of the living thing.

Ein derartiges Verfahren kann sowohl beim Menschen als auch bei Tieren, wie z.B. Zuchttieren, durchgeführt werden. Je nach dem Ergebnis kann sich eine gezielte Behandlung des Lebewesens anschließen, bei dem die erfindungsgemäße Substanz als Therapeutikum oder auch andere im Stand der Technik beschriebene Substanzen gegen Infektionskrankheiten Verwendung finden können. Ferner schafft das erfindungsgemäße Verfahren nun die Grundlage für die Entscheidung, ob bspw. eine aktive Immunisierung sinnvoll erscheint oder ob auf Grund einer reduzierten Annexin-Funktion oder Annexin-Expression eine reduzierte Anfälligkeit gegenüber einer Infektion vorliegt und deshalb keine ggf. für den entsprechenden Organismus belastenden Maßnahmen getroffen werden müssen.One such method can be used both in humans and in animals, such as. Breeding animals, performed become. Depending on the result may be a targeted treatment of the living thing, in which the substance according to the invention as a therapeutic or other described in the prior art Substances against infectious diseases can be used. Further creates the method according to the invention now the basis for the decision whether, for example, an active immunization makes sense or whether due to a reduced annexin function or annexin expression a reduced susceptibility to one Infection exists and therefore no, if necessary, for the corresponding organism incriminating measures must be taken.

Obwohl bevorzugt festgestellt wird, ob das Lebewesen eine reduzierte Anfälligkeit für Infektionen hat, kann auch festgestellt werden, ob eine erhöhte Anfälligkeit vorliegt. So wird nämlich eine solche Feststellung dann erfolgen, wenn die Annexin-Funktion oder Annexin-Expression über das Normalmaß hinaus verstärkt ist. Die Annexin-Funktion ist bspw. auch dann verstärkt, wenn das Protein eine überdurchschnittlich hohe Aktivität zeigt.Although it is preferred to determine whether the animal has a reduced susceptibility to infection, it can also be determined whether there is an increased susceptibility. Indeed, such a determination will be made if the annexin function or annexin expression is enhanced beyond the normal level. The annexin function is enhanced, for example, even if the protein has an above-average activity shows.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur therapeutischen oder/und prophylaktischen Behandlung eines Lebewesens, das von einer Infektionskrankheit betroffen ist oder/und bei dem die Gefahr einer Infektion besteht, das folgende Schritte aufweist: (a) Bereitstellung einer Substanz, die die Expression und/oder Funktion von Annexin reduziert, und (b) Einbringung der Substanz in das Lebewesen.One Another object of the present invention relates to a method for the therapeutic and / or prophylactic treatment of a living being, which is affected by an infectious disease and / or in which There is a risk of infection, which includes the following steps: (a) providing a substance that has the expression and / or function reduced by annexin, and (b) introduction of the substance into the animal.

Mit einem solchen Verfahren können bspw. Personen behandelt werden, die erhöhten Kontakt mit infektiösen Erregern haben, wie medizinisches Personal oder auch Entwicklungshelfer. Aber auch Zuchttiere können mit diesem Verfahren gezielt behandelt und ggf. immunisiert werden.With such a method can For example, persons are treated who have increased contact with infectious agents have, like medical staff or development workers. But also breeding animals can be specifically treated with this method and possibly immunized.

Dabei ist es bevorzugt, dass als Substanz die eingangs beschriebene, erfindungsgemäße Substanz verwendet wird. Die Einbringung der Substanz in das Lebewesen kann sowohl oral als auch über eine Injektion oder auf sonstige Art und Weise erfolgen. Dabei reicht eine Kurzzeitbehandlung des Lebewesens zur Erzielung einer reduzierten Infektionsanfälligkeit oder ggf. Immunisierung in der Regel aus.there it is preferred that the substance of the invention described above is used as the substance becomes. The introduction of the substance into the living being can both oral as well over an injection or otherwise. It is enough a short-term treatment of the living being to achieve a reduced susceptibility to infection or possibly immunization usually off.

Ein weiterer Gegenstand betrifft auch Verfahren zur therapeutischen oder/und prophylaktischen Behandlung eines Lebewesens, das von einer Infektionskrankheit betroffen ist oder/und bei dem die Gefahr einer Infektion besteht, das folgende Schritte aufweist: Bereitstellung einer Substanz, die die Expression und/oder Funktion von Annexin reduziert, und (b) Einbringung der Substanz in das Lebewesen, bei dem die Expression oder/und Funktion von Annexin reduziert wird.One Another subject also relates to methods of therapeutic or / and prophylactic treatment of a living being by a Infectious disease is affected or / and at the risk of infection consists of the following steps: providing a substance, which reduces the expression and / or function of annexin, and (b) introduction of the substance into the animal in which expression or / and Function of annexin is reduced.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It it is understood that the above and the following yet to be explained Features not only in the specified combination, but also usable in other combinations or alone are without departing from the scope of the present invention.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Eigenschaften und Vorteile ergeben, und die insbesondere rein illustratorisch sind und die Reichweite der Erfindung in keiner Weise einschränken. Dabei wird auf die beigefügten Abbildungen Bezug genommen:The The present invention will now be explained in more detail with reference to exemplary embodiments which give further properties and advantages, and in particular are purely illustrative and the scope of the invention in no Limit the way. It is attached to the attached Figures referenced:

1 Interaktion von cytosolischem Ca²⁺ mit dem Zellvolumen und der Phosphatidylserinexposition; 1 Interaction of cytosolic Ca ²⁺ with cell volume and phosphatidylserine exposure;

2 Entfernung von Phosphatidylserin exponierenden Zellen aus dem zirkulierenden Blut; 2 Removal of phosphatidylserine-exposed cells from circulating blood;

3 beschleunigte Phosphatidylserinexposition von Erythrocyten aus Trägern der Sichelzellanämie und in Annexin7-Knockout-Mäusen; 3 accelerated phosphatidylserine exposure of erythrocytes from sickle cell anemia carriers and in annexin 7 knockout mice;

4 Parasitämie und Überleben von Plasmodium berghei-infizierten Annexin7+/+- und Annexin7–/–- Mäusen. 4 Parasitemia and survival of Plasmodium berghei infected Annexin7 + / + and Annexin7 - / - mice.

Beispiel 1: Annexin-Knockout-MausExample 1: Annexin knockout mouse

Die Herstellung und Eigenschaften von Annexin-Knockout-Mäusen (Annexin7–/–- Mäusen) ist im Stand der Technik beschrieben; vgl. Herr et al. (2001), "Loss of annexin A7 leads to alterations in frequency-induces shortening of isolated murine cardiomyocytes", Mol. Cell. Biol., 21: S. 4119 bis 4128, Diese Mäuse zeigen eine gestörte frenquenzinduzierte Verkürzung der cardinalen Aktionspotenziale und erhöhte Gliazellproliferation. Erythrocyten aus Annexin7-Knockout-Mäusen sind geringfügig aber signifikant resistenter gegenüber osmotischer Schwellung.The Production and properties of annexin knockout mice (annexin 7 - / - mice) described in the prior art; see. Mr. et al. (2001), "Loss of annexin A7 leads to alterations in frequency-inducing shortening of isolation murine cardiomyocytes ", Mol. Cell. Biol., 21: pp. 4119-4128, These mice show a disturbed frequency-induced shortening Cardinal action potentials and increased glial cell proliferation. Erythrocytes from Annexin7 knockout mice are minor, however significantly more resistant to osmotic Swelling.

Beispiel 2: Blutwerte der Knockout-MäuseExample 2: Blood values the knockout mice

Den Annexin7–/–- Mäusen und Wildtyp-Mäusen (Annexin7+/+- Mäusen) wurde Blut entnommen und die Blutwerte wurden bestimmt. Das Ergebnis dieser Untersuchung ist in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1: Erythrocytenzahl (10⁶/μl), gepacktes Zellvolumen (Hämatocrit, %), mittleres corpusculäres Volumen (fl), Reticulocytenzahl (RTC, %), mittleres corpusculäres Hämoglobin (MCH, pg), Hämoglobin (HBG, g/100 ml), Anzahl der weißen Blutzellen (WBC, 1000/μl) and Thrombocytenzahl (PLT, 1000/μl) in Mäusen ohne Annexin7 (annexin7–/–) und in ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern (Annexin7+/+). Alle Werte entsprechen arithmetischen Mitteln ± SEM, n = 6). Erythrocyten und Leukocytenzahlen wurden unter Verwendung eines MDM 905 (Medical Diagnostics Marx, Butzbach, Deutschland) bestimmt. The Annexin7 - / - mice and wild-type mice (Annexin7 + / + mice) were bled and blood levels were determined. The result of this study is shown in Table 1.

Table 1: Erythrocyte count (10 ⁶ / μl), packed cell volume (hematocrit,%), mean corpuscular volume (fl), reticulocyte count (RTC,%), mean corpuscular hemoglobin (MCH, pg), hemoglobin (HBG, g / 100 ml ), White blood cell counts (WBC, 1000 / μl) and platelet count (PLT, 1000 / μl) in mice lacking Annexin7 (annexin7 - / -) and their wild-type littermates (annexin7 + / +). All values correspond to arithmetic mean ± SEM, n = 6). Erythrocytes and leukocyte counts were determined using an MDM 905 (Medical Diagnostics Marx, Butzbach, Germany).

Wie in Tabelle 1 gezeigt, war die Anzahl von Erythrocyten und die Hämoglobinkonzentration in Annexin7–/–- Mäusen leicht aber signifikant geringer als in Annexin7+/+- Mäusen. Die anderen Erythrocytenparameter waren zwischen Annexin7–/–- und Annexin7+/+- Mäusen nicht signifikant unterschiedlich. Die Anzahl von Thrombocyten und die Anzahl von Leukocyten waren in Annexin7–/–- Mäusen im Vergleich zu ihren Annexin7+/+-Wurfgeschwistern gleichermaßen erhöht.As shown in Table 1 was the number of erythrocytes and the hemoglobin concentration in Annexin7 - / - mice easily but significantly lower than in Annexin7 + / + mice. The other erythrocyte parameters were between Annexin7 - / - and Annexin7 + / + - mice not significantly different. The number of platelets and the number of leukocytes was in Annexin7 - / - mice compared to their Annexin7 + / + littermates equally elevated.

Beispiel 3: Integrität der Zellmembran von Erythrocyten aus Annexin-Knockout-MäusenExample 3: Integrity of the cell membrane of erythrocytes from annexin knockout mice

Intakte Erythrocyten zeigen eine Phosphatidylserinsymmetrie und exponieren kein Phosphatidylserin an ihrer Zelloberfläche. Bei Infektionen bspw. oxidativem Stress, Energiedepletion, osmotischem Schock kommt es zur Aktivierung von Ca²⁺-permeablen Kanälen. Der darauf folgende Eintritt von Calcium in die Zelle führt zur Aktivierung einer Ca²⁺-sensitiven Scramblase mit darauf folgender Phosphatidylserinexposition an der Zelloberfläche; vgl. Duraton et al. (2002), „Oxidation induces a Cl(–)-dependent cation conductance in human red blood cells", J. Physiol., 539: S. 847 bis 855; Andrews et al. (2002), "Phorbol ester stimulates a protein kinase C-mediated agatoxin-TK-sensitive calcium permeability pathway in human red blood cells", Blood, 100: S. 3392 bis 3399. Das Phosphatidylserin an der Zelloberfläche lässt sich durch Bindung von extrazellulärem Annexin nachweisen.Intact erythrocytes show phosphatidylserine symmetry and do not expose phosphatidylserine to their cell surface. In infections, for example, oxidative stress, energy depletion, osmotic shock leads to the activation of Ca ²⁺ -permeable channels. The subsequent entry of calcium into the cell leads to activation of a Ca ²⁺ -sensitive scramblase with subsequent exposure to phosphatidylserine at the cell surface; see. Duraton et al. (2002), "Oxidation induces a Cl (-) - dependent cationic conductance in human red blood cells", J. Physiol., 539: pp. 847-855; Andrews et al. (2002), "Phorbol ester stimulates a protein Kinase C-mediated agatoxin TK-sensitive calcium permeability pathway in human red blood cells ", Blood, 100: 3392-3399. The phosphatidylserine on the cell surface can be detected by binding extracellular annexin.

An Erythrocyten aus Annexin7-defizienten Mäusen (Annexin7–/–) und Wildtyp-Wurfgeschwistern (Annexin7+/+) wurden mit dem Ca²⁺-Ionophor Ionomycin infektiöse Zustände simuliert. Ionomycin wurde in einer Konzentration von 1 μM eingesetzt und die Erythrocyten wurden für eine Stunde inkubiert. Die Annexinbindung wurde im fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) analysiert.Erythrocytes from Annexin7-deficient mice (Annexin7 - / -) and wild-type littermates (Annexin7 + / +) were used to simulate infectious conditions with the Ca ²⁺ ionophore Ionomycin. Ionomycin was used at a concentration of 1 μM and the erythrocytes were incubated for one hour. The annexin binding was analyzed in fluorescence activated cell sorter (FACS).

Das Ergebnis eines solchen Experiments ist in 1 dargestellt. Teilabbildung (A) zeigt die Originalhistogramme von annexinbindenden Erythrocyten (Zellzählungen) aus Annexin7+/+- (obere Reihe) und Annexin7–/–- Mäusen vor (links) und nach (rechts) Exposition an Ionomycin. In Teilabbildung (B) sind arithmetische Mittel ± SEM (n = jeweils 8) der annexinbindenden Erythrocyten (Annexinbindung) in Annexin7–/–- (unausgefüllte Säulen, Anx7 KO) und Annexin7+/+- Mäusen (ausgefüllte Säulen, WT) vor (linke Säulen, -) und nach (rechte Säulen, +) Ionomycinexposition (Iono) gezeigt. * indiziert einen signifikanten Unterschied zwischen den Kontrollansätzen und den Ansätzen mit Ca²⁺-Ionophorionomycin, # indiziert einen signifikanten Unterschied zwischen Erythrocyten aus Annexin7–/–- und Annexin7+/+- Mäusen (ANOVA).The result of such an experiment is in 1 shown. Partial panel (A) shows the original histograms of annexin-binding erythrocytes (cell counts) from Annexin7 + / + (top row) and Annexin7 - / - mice before (left) and after (right) exposure to ionomycin. Partial figure (B) shows arithmetic mean ± SEM (n = 8 each) of annexin-binding erythrocytes (annexin binding) in Annexin7 - / - (open columns, Anx7 KO) and Annexin7 + / + - mice (solid columns, WT) (left) Columns, -) and after (right columns, +) ionomycin exposure (Iono). * indicates a significant difference between the control and Ca ²⁺ -Ionophorionomycin approaches, # indicates a significant difference between erythrocytes from Annexin7 - / - and Annexin7 + / + - mice (ANOVA).

In den Teilabbildungen (C) und (D) ist die zytosolische freie Ca²⁺-Konzentration in Annexin7–/–- und Annexin7+/+- Erythrocyten gezeigt. Die Originalhistogramme (C) zeigen die Ca²⁺-sensitive Fluoreszenz von Fluo-3-beladenen Erythrocyten in unbehandelten Annexin7+/+- (links) und Annexin7–/–- (Mitte) Erythrocyten und in Annexin7+/+- Erythrocyten, die für 20 Minuten mit 1 μM Ionomycin für 20 Minuten behandelt wurden (rechts). In Teilabbildung (D) sind arithmetische Mittel ± SEM (n = 4) von Fluo-3-Fluoreszenzen in unbehandelten Annexin7+/+- (ausgefüllte Säulen) und Annexin7–/–- (unausgefüllte Säulen) Erythrocyten und Annexin7+/+- Erythrocyten behandelt mit Ionomycin (schraffierte Säule, Iono; 1 μM) dargestellt.The partial images (C) and (D) show the cytosolic free Ca ²⁺ concentration in Annexin7 - / - and Annexin7 + / + erythrocytes. The original histograms (C) show the Ca ²⁺ -sensitive fluorescence of fluo-3-loaded erythrocytes in untreated annexin7 + / + (left) and annexin7 - / - (middle) erythrocytes and Annexin7 + / + erythrocytes treated with 1 μM ionomycin for 20 minutes for 20 minutes (right). In part (D) arithmetic mean ± SEM (n = 4) of fluo-3 fluorescents in untreated annexin7 + / + (filled columns) and annexin7 - / - (open column) erythrocytes and annexin7 + / + erythrocytes are treated with Ionomycin (hatched column, Iono, 1 μM).

In Teilabbildung (D) ist das Ergebnis eines Experiments dargestellt, in dem die Auswirkung des Ca²⁺-Ionophor Ionomycin (1 μM) auf das Erythrocytenvolumen untersucht wurde. Dargestellt sind arithmetische Mittel ± SEM (n = jeweils 6) der Vorwärtsstreuung in der FACS-Analyse von Erythrocyten aus Annexin7–/–- (unausgefüllte Säulen) und Annexin7+/+- Mäusen (ausgefüllte Säulen) vor (linke Säulen) und eine Stunde nach (rechte Säulen) Exposition an das Ca²⁺-Ionophor Ionomycin (1 μM). * indiziert einen signifikanten Unterschied zwischen den Kontrollansätzen und den Ansätzen, die Ca²⁺-Ionophor Ionomycin (1 μM) enthielten, # indiziert einen signifikanten Unterschied zwischen Erythrocyten aus Annexin7–/–- und Annexin7+/+- Mäusen.Partial figure (D) shows the result of an experiment in which the effect of Ca ²⁺ ionophore ionomycin (1 μM) on erythrocyte volume was investigated. Shown are arithmetic mean ± SEM (n = 6 each) of forward scatter in the FACS analysis of erythrocytes from Annexin7 - / - (unfilled columns) and Annexin7 + / + mice (filled columns) before (left columns) and one hour after (right columns) Exposure to the Ca ²⁺ ionophore Ionomycin (1 μM). * indicates a significant difference between the control and the approaches containing Ca ²⁺ ionophore ionomycin (1 μM) # indicates a significant difference between erythrocytes from Annexin7 - / - and Annexin7 + / + mice.

Die Experimente wurden bei 37°C in Ringer-Lösung enthaltend 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 32 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), 5 mM Glukose, 1 mM CaCl₂ pH = 7,4, durchgeführt. Die FACS-Analyse wurde im Wesentlichen so durchgeführt wie in Andree et al. (1990), „Binding of vascular anticoagulant alpha (VAC alpha) to planar phospholipid bilayers", J. Biol. Chem., 265: S. 4923 bis 4928 beschrieben. Nach der Inkubation wurden die Zellen in Annexin-Bindepuffer enthaltend 125 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4 und 5 mM CaCl₂ gewaschen. Die Erythrocyten wurden mit Annexin-Flous (Boehringer Mannheim, Deutschland) bei einer 1:50 Verdünnung gefärbt. Nach 10 Minuten wurden die Proben 1:5 verdünnt und mittels Durchflusscytometrieanalyse (FACS-Calibur von Beckton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) vermessen. Die Zellen wurden über Vorwärtsstreuung analysiert und die Annexin-Fluoreszenzintensität wurde im Fluoreszenzkanal FL-1 bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm vermessen.Experiments were performed at 37 ° C in Ringer's solution containing 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO ₄ , 32 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES), 5 mM glucose, 1 mM CaCl 2 ₂ pH = 7.4. The FACS analysis was performed essentially as in Andree et al. (1990), Binding of vascular anticoagulant alpha (VAC alpha) to planar phospholipid bilayers, J. Biol. Chem., 265: pp. 4923 to 4928. After incubation, the cells were incubated in annexin binding buffer containing 125 mM NaCl , 10 mM HEPES, pH 7.4 and 5 mM CaCl _2. The erythrocytes were stained with Annexin-Flous (Boehringer Mannheim, Germany) at a 1:50 dilution After 10 minutes, the samples were diluted 1: 5 and analyzed by flow cytometry (FACS-Calibur from Beckton Dickinson, Heidelberg, Germany) The cells were analyzed by forward scattering and the annexin fluorescence intensity was measured in fluorescence channel FL-1 at an excitation wavelength of 488 nm and an emission wavelength of 530 nm.

Die intrazellulären Ca²⁺-Messungen wurden durchgeführt wie beschrieben; Andrews et al. (2002), „Phorbol ester stimulates a protein kinase C-mediated agatoxin-TK-sensitive calcium permeability pathway in human red blood cells", Blood, 100: S. 3392 bis 3399. Zusammengefasst, die Erythrocyten wurden mit Fluo-3/AM (Calbiochem, Bad Soden, Deutschland) durch Zugabe von 2 μl einer Fluo-3/AM-Stammlösung (2,0 mM in Dimethylsulfoxid [DMSO]) zu 1 ml Erythrocytenlösung (0,16 % Hämatocrit in Ringer) beladen. Die Zellen wurden bei 37°C für 15 Minuten unter kräftigem Schütteln und lichtgeschützt inkubiert. Weitere 2 μl von Fluo-3/AM wurden hinzugegeben und es folgte eine weitere Inkubation für 25 Minuten. Fluo-3/AM-beladene Erythrocyten wurden bei 1000 g für 3 Minuten bei 22°C zentrifugiert und zweimal mit Ringer-Lösung enthaltend 0,5 % Rinderserumalbumin (Sigma, Taufkirchen, Deutschland) und einmal mit reinem Ringer gewaschen. Für die Durchflusscytometrie wurden die Fluo-3/AM-beladenen Erythrocyten in 1 ml Ringer (0,16 % Hämatocrit), in Ca²⁺-Ionophor Ionomycin (1 μM; Sigma, Taufkirchen, Deutschland) oder in Lösungsmittel (0,1 % DMSO) allein resuspendiert und für verschiedene Zeiten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Ca²⁺-abhängige Fluoreszenzintensität im Fluoreszenzkanal FL-1 mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm vermessen.Intracellular Ca ²⁺ measurements were performed as described; Andrews et al. (2002), "Phorbol ester stimulates a protein kinase C-mediated agatoxin TK-sensitive calcium permeability pathway in human red blood cells", Blood, 100: pp. 3392-3399. In summary, the erythrocytes were labeled with Fluo-3 / AM (Calbiochem, Bad Soden, Germany) by adding 2 μl of a Fluo-3 / AM stock solution (2.0 mM in dimethylsulfoxide [DMSO]) to 1 ml of erythrocyte solution (0.16% hematocrit in Ringer) incubated at 37 ° C for 15 minutes with vigorous shaking, protected from light, another 2 μl of Fluo-3 / AM were added, followed by another incubation for 25 minutes Fluo-3 / AM-loaded erythrocytes were set at 1000 g for 3 minutes centrifuged at 22 ° C. and washed twice with Ringer's solution containing 0.5% bovine serum albumin (Sigma, Taufkirchen, Germany) and once with pure Ringer For flow cytometry, the Fluo-3 / AM-loaded erythrocytes were dissolved in 1 ml Ringer (0 , 16% hematocrit) in Ca ²⁺ ionophore ionomycin (1 M; Sigma, Taufkirchen, Germany) or in a solvent (0.1% DMSO) alone resuspended and incubated for various times at 37 ° C. Subsequently, the Ca ²⁺ -dependent fluorescence intensity was measured in the fluorescence channel FL-1 with an excitation wavelength of 488 nm and an emission wavelength of 530 nm.

Dabei zeigt sich, dass die Anzahl von annexinbindenden Erythrocyten in Annexin7–/–- Mäusen signifikant größer als in Annexin7+/+- Mäusen ist. Die Exposition an das Ca²⁺-Ionophor Ionomycin (1 μM) triggert den Zusammenbruch der Phosphatidylserinasymmetrie in Erythrocyten, was zu einem verstärkten Binden von Annexin an die Zelloberfläche sowohl in Annexin7–/–- als auch Annexin7+/+- Mäusen führt. Die Anzahl von annexinbindenden Zellen nach einstündiger Behandlung mit 1 μM Ionomycin war signifikant größer in Annexin7–/–- Mäusen als in Annexin7+/+- Mäusen. Gleichermaßen triggert osmotischer Schock, Energiedepletion und Enthemmung des Ca²⁺-permeablen Kationenkanals durch Cl^–-Entfernung die Annexinbindung in Annexin7–/–- Erythrocyten und Annexin7+/+- Erythrocyten, ein Effekt, der wieder in Erythrocyten aus Annexin7–/–- Mäusen signifikant verstärkt ist (Daten nicht gezeigt).It shows that the number of annexin-binding erythrocytes in Annexin7 - / - mice is significantly larger than in Annexin7 + / + - mice. Exposure to the Ca ²⁺ ionophore ionomycin (1 μM) triggers the collapse of phosphatidylserine asymmetry in erythrocytes, leading to increased binding of annexin to the cell surface in both Annexin7 - / - and Annexin7 + / + mice. The number of annexin-binding cells after 1 hour treatment with 1 μM ionomycin was significantly greater in Annexin7 - / - mice than in Annexin7 + / + mice. Likewise, osmotic shock, energy depletion and disinhibition of the Ca ²⁺ -permeable cation channel by Cl ^- removal triggers annexin binding in annexin 7 - / - erythrocytes and annexin 7 + / + erythrocytes, an effect that reverts to erythrocytes from annexin 7 - / - mice is significantly enhanced (data not shown).

Der verstärkte Effekt von Ionomycin auf die Phosphatidylserumexposition von Annexin7–/–- Erythrocyten war begleitet von einer gleichermaßen erhöhenden Auswirkung auf die Vorwärtsstreuung, die das Erythrocytenzellvolumen wiederspiegelt. Auf eine Behandlung mit Ionomycin führt der Calciumeinstrom zur Stimulation von Ca²⁺-aktivierten, Charybdotoxin und Clotrimazol sensitiven K⁺-Kanälen mit nachfolgender Erythrocytenhyperpolarisation, durch die Cl^– aus der Zelle ausgeschleust wird. Der Verlust von KCl und damit von Zellwasser auf Grund von Osmose führt zur Zellschrumpfung.The increased effect of ionomycin on the phosphatidylserum exposure of annexin7 - / - erythrocytes was accompanied by an equally increasing effect on forward scattering, which reflects the erythrocyte cell volume. Upon treatment with ionomycin, the calcium influx leads to the stimulation of Ca ²⁺ -activated, charybdotoxin and clotrimazole-sensitive K ⁺ channels with subsequent erythrocyte hyperpolarization, which releases Cl ^- from the cell. The loss of KCl and thus of cell water due to osmosis leads to cell shrinkage.

Die Fluo-3-Fluoreszenz ergab, dass cytosolisches Ca²⁺ in Annexin7–/–- Erythrocyten im Vergleich zu Annexin7+/+- Erythrocyten nicht erhöht war. Deshalb resultiert die verstärkte Phosphatidylserinexposition von Annexin7–/–- Erythrocyten aus der erhöh ten Sensitivität gegenüber Ca²⁺, nicht aus erhöhter intrazellulärer Ca²⁺-Konzentration. Demnach greift ein Verlust von Annexin7 in einen Schritt stromabwärts des Ca²⁺ mit dem Triggern der Phosphatidylserinexposition und Aktivierung von K⁺-Kanälen ein. Der Effekt kann zusammenhängen mit der Ca²⁺-Bindefähigkeit von Annexin7, was zur Abschwächung von Ca²⁺-sensitiven Prozessen führen könnte. Ferner könnte Annexin7 in die Aktivierung der Phospholipase A₂ verwickelt sein, die eine wichtige Rolle bei der Erythrocytenapoptose spielen könnte.Fluo-3 fluorescence revealed that cytosolic Ca ^{2+ was} not increased in annexin 7 - / - erythrocytes compared to annexin7 + / + erythrocytes. Therefore, the increased phosphatidylserine exposure results from Annexin7 - / - Erythrocytes from the increased sensitivity to Ca ²⁺ , not from increased intracellular Ca ²⁺ concentration. Thus, loss of annexin 7 in one step downstream of Ca ²⁺ interferes with triggering phosphatidylserine exposure and activation of K ⁺ channels. The effect may be related to the Ca ²⁺ binding capacity of Annexin7, which could lead to the attenuation of Ca ²⁺ -sensitive processes. Furthermore, annexin 7 could be involved in the activation of phospholipase A ₂ , which could play an important role in erythrocyte apoptosis.

Beispiel 4: "Entsorgung" von Ionomycin behandelten Erythrocyten aus Annexin-Knockout-Mäusen aus dem BlutExample 4: "Disposal" of ionomycin-treated Erythrocytes from annexin knockout mice from the blood

Macrophagen sind mit Rezeptoren ausgestattet, die spezifisch sind für Phosphatidylserin. Es wurde vermutet, dass Erythrocyten, die an ihrer Oberfläche Phosphatidylserin exponieren, von Macrophagen erkannt, gebunden, phagocytiert und degradiert werden.macrophages are equipped with receptors specific for phosphatidylserine. It has been suggested that erythrocytes have phosphatidylserine on their surface exposed, recognized by macrophages, bound, phagocytosed and be demoted.

In 2 ist in Teilabbildung (A) das Ergebnis eines Experiments dargestellt, in dem die Annexinbindung von Erythrocyten aus Wildtyp-Mäusen vor (links) und nach Exposition an Ca²⁺-Ionophor Ionomycin (10 μM, 1 Stunde) mittels FACS-Analyse bestimmt wurde. In Teilabbildung (B) ist das Ergebnis eines Experiments dargestellt, in dem die Zellen aus (A) mit dem Oberflächenmarker CFSE (5-Carboxyfluorescindiacetatsuccinylester, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) markiert wurden. In einem Experiment, dessen Ergebnis in den Teilabbildungen (C) und (D) dargestellt ist, wurde das Verschwinden von unbehandelten und Ionomycin behandelten CFSE-markierten Zellen aus dem zirkulierenden Blut nach Injektion in die Schwanzvene untersucht. In Teilabbildung (C) sind die Originalhistogramme von CFSE-markierten unbehandelten (obere Reihe) oder Ionomycin behandelten (untere Reihe) Erythrocyten 2, 5, 20 und 120 Minuten nach Injektion dargestellt. Aufgetragen sind arithmetische Mittel ± SEM (n = 6, D) des prozentualen Anteils von CFSE-markierten unbehandelten (unausgefüllte Symbole, Kontrolle) oder Ionomycin behandelten (ausgefüllte Symbole) Erythrocyten nach Injektion. In den Teilabbildungen (E) und (F) ist die Menge von CFSE-markierten unbehandelten (linke Säule R in (E), a und c in (F)) oder Ionomycin behandelten (ausgefüllte Symbole, rechte Säule I in (E), b und d in (F)) Erythrocyten in der Milz gezeigt.In 2 Partial image (A) shows the result of an experiment in which the annexin binding of erythrocytes from wild-type mice was determined before (left) and after exposure to Ca ²⁺ ionophore Ionomycin (10 μM, 1 hour) by means of FACS analysis. Partial image (B) shows the result of an experiment in which the cells from (A) were labeled with the surface marker CFSE (5-carboxyfluorescinediacetatsuccinyl ester, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA). In an experiment, the result of which is shown in sub-figures (C) and (D), the disappearance of untreated and ionomycin-treated CFSE-labeled cells from the circulating blood after injection into the tail vein was examined. In panel (C), the original histograms of CFSE-labeled untreated (top row) or ionomycin-treated (bottom row) erythrocytes are shown 2, 5, 20, and 120 minutes after injection. Plotted are arithmetic mean ± SEM (n = 6, D) of the percentage of CFSE-labeled untreated (open symbols, control) or ionomycin-treated (solid symbols) erythrocytes after injection. In the partial illustrations (E) and (F), the amount of CFSE-labeled untreated (left column R in (E), a and c in (F)) or ionomycin-treated (filled symbols, right column I in (E), b and d in (F)) erythrocytes in the spleen.

Dabei zeigt sich, dass Ionomycin behandelte Phosphatidylserin exponierende Erythrocyten schneller aus dem zirkulierenden Blut entfernt werden als unbehandelte. In diesen Experimenten exponierten etwa zwei Drittel von Ionomycin behandelten Erythrocyten Phosphatidylserin an ihrer Oberfläche. Die Erythrocyten wurden mit CFSE markiert und in Mäuse injiziert. Wie in 2 gezeigt, verschwinden etwa zwei Drittel der Ionomycin behandelten Erythrocyten innerhalb von 20 Minuten. Hierzu im Gegensatz werden weniger als 5 % der unbehandelten Erythrocyten aus dem zirkulierenden Blut innerhalb von 120 Minuten entfernt. Nach Isolierung von verschiedenen Organen zeigte sich, dass sich der größte Teil von markierten Zellen in der Milz akkumuliert.It can be seen that erythrocytes exposed to ionomycin-treated phosphatidylserine are more rapidly removed from the circulating blood than untreated ones. In these experiments, about two-thirds of ionomycin-treated erythrocytes exposed phosphatidylserine to their surface. The erythrocytes were labeled with CFSE and injected into mice. As in 2 About two-thirds of the ionomycin-treated erythrocytes disappear within 20 minutes. In contrast, less than 5% of the untreated circulating blood red blood cells are removed within 120 minutes. After isolation of various organs, most of the labeled cells accumulated in the spleen.

Beispiel 5: Kinetik der Zellmembranumgestaltung bei Erythrocyten von Trägern der Sichelzell-Anämie und aus Annexin7-Knockout-MäusenExample 5: Kinetics of Cell membrane remodeling in erythrocytes of carriers of sickle cell anemia and from Annexin7 knockout mice

Bei einer Plasmodium-Infektion findet man die Induktion von oxidativem Stress in der Wirtszelle; vgl. Duranton et al. (2003), „Electrophysiological properties of the Plasmodium falciparum-induced cation conductance of human erythrocytes", Cell. Physiol. Biochem. 13: S 189 bis 198. Dadurch kommt es zur Aktivierung von Erythrocytenionenkanälen und zum Calcium-Einstrom; Duranton et al. (2004), „Organic osmolyte permeabilities of the malaria-induced anion conductances in human erythrocytes", J. Gen. Physiol. 123: S. 417 bis 426. Es wurde deshalb untersucht, ob die Infektion die Phosphatidylserinexposition triggert.at a plasmodium infection one finds the induction of oxidative Stress in the host cell; see. Duranton et al. (2003), "Electrophysiological properties of the Plasmodium falciparum-induced cation conductance of human erythrocytes ", Cell. Physiol. Biochem. 13: S 189 to 198. That's what happens Activation of erythrocyte ion channels and calcium influx; Duranton et al. (2004), "Organic osmolyte permeabilities of the malaria-induced anionic conductances in human erythrocytes ", J. Gen. Physiol. 123: pp. 417 to 426. It was therefore investigated whether the infection triggers the phosphatidylserine exposure.

In 3 ist in den Teilabbildungen (A) und (B) das Ergebnis eines Experiments dargestellt, mit dem die Annexinbindung von humanen Erythrocyten vor und 48 Stunden nach Infektion mit Plasmodium falciparum dargestellt ist. In Teilabbildung (A) sind die Originalblots von infizierten Erythrocyten von gesunden Individuen (links) oder Trägern der Sichelzellanämie (rechts) gezeigt. Dargestellt sind arithmetische Mittel ± SEM (n = jeweils 10³ bis 10⁶) (C) von nicht infizierten (linke Säule) oder infizierten (rechte Säule) Erythrocyten aus gesunden Individuen (gefüllte Säulen) oder Erythrocyten aus Trägern der Sichelzellanämie (unausgefüllte Säulen). * indiziert einen signifikanten Unterschied zwischen nicht-infizierten und infizierten Erythrocyten, # indiziert einen signifikanten Unterschied zwischen normalen Erythrocyten und Erythrocyten aus Trägern der Sichelzellanämie.In 3 the results of an experiment showing the annexin binding of human erythrocytes before and 48 hours after infection with Plasmodium falciparum are shown in the partial illustrations (A) and (B). Partial image (A) shows the original blots of infected erythrocytes from healthy individuals (left) or carriers of sickle cell anemia (right). Shown are arithmetic mean ± SEM (n = each 10 ³ to 10 ⁶ ) (C) of uninfected (left column) or infected (right column) erythrocytes from healthy individuals (filled columns) or erythrocytes from carriers of sickle cell anemia (unfilled columns) , * indicates a significant difference between uninfected and infected erythrocytes, # indicates a significant difference between normal erythrocytes and erythrocytes from carriers of sickle cell anemia.

Teilabbildung (C) zeigt das Ergebnis eines Experiments, in dem die Annexinbindung von infizierten Erythrocyten in Mäusen untersucht wurde, die mit Plasmodium berghei infiziert wurden. Dargestellt sind arithmetische Mittel ± SEM (n = 6 bis 12) der Annexinbindung in infizierten Erythrocyten aus Annexin7–/–- (unausgefüllte Säulen) und Annexin7+/+- (ausgefüllte Säulen) Mäusen. * indiziert einen signifikanten Unterschied zwischen Annexin7–/–- und Annexin7+/+- Mäusen.Panel (C) shows the result of an experiment in which the annexin binding of infected erythrocytes was studied in mice infected with Plasmodium berghei. Shown are arith mean ± SEM (n = 6 to 12) of annexin binding in infected erythrocytes from Annexin7 - / - (unfilled columns) and Annexin7 + / + - (filled columns) mice. * indicates a significant difference between Annexin7 - / - and Annexin7 + / + mice.

Für eine Infektion von humanen Erythrocyten wurde das humane Pathogen P. falciparum vom Stamm BINH (Binh et al. (1997), „Differential effects of human serum and cells on the growth of Plasmodium falciparum adapted to serum-free in vitro culture conditions", Am. J. Trop. Med. Hyg. 57: S 594 bis 600) und FCR-3 (Jensen J.B. und Trager W. (1978), "Plasmodium falciparum in culture: establishment of additional strains", Am. J. Trop. Med. Hyg. 27: S. 743 bis 746) in vitro (Huber et al. (2002), Plasmodium falciparum activates endogenous Cl(–)channels of human erythrocytes by membrane oxidation", EMBO 21: S. 22 bis 30) in humanen RBCs (Blutgruppe 0+) aus Blutbanken herangezogen. Die Parasiten wurden wie zuvor beschrieben bei einem Hämatocrit von 5 % und einer Parasitämie von 2 bis 10 % in RPMI 1640 Medium versetzt mit Albumax II (0,5 %, Gibco, Karlsruhe, Deutschland) in einer Atmosphäre von 90 % N₂, 5 % CO₂, 5 & O₂ kultiviert.For infection of human erythrocytes, the human pathogen P. falciparum of strain BINH (Binh et al. (1997), "Differential effects of human serum and cells on the growth of Plasmodium falciparum adapted to serum-free in vitro culture conditions", Med. Hyg 57: S 594 to 600) and FCR-3 (Jensen JB and Trager W. (1978), "Plasmodium falciparum in culture: establishment of additional strains", Am.J. Trop. Med. Hyg. 27: pp. 743-746) in vitro (Huber et al. (2002), Plasmodium falciparum activates endogenous Cl (-) channels of human erythrocytes by membrane oxidation ", EMBO 21: pp. 22-30) human RBCs (blood group 0+) from blood banks. The parasites were treated as previously described with a hematocrit of 5% and a parasitemia of 2 to 10% in RPMI 1640 medium mixed with Albumax II (0.5%, Gibco, Karlsruhe, Germany) in an atmosphere of 90% N ₂ , 5 % CO ₂ , 5 & O ₂ cultured.

Für eine Infektion von Mäusen wurden P. berghei-ANKA-Parasitenbefallene Maus-RBCs (2 × 10⁶) intraperitoneal (Huber et al. (2004), „Plasmodium induces swelling-activated ClC-2 anion channels in the host erythrocyte", J. Biol. Chem.) in geschlechts- und altersmäßig abgestimmte Annexin7+/+- und Annexin7–/–- Mäuse injiziert und die Parasitämie wurde täglich durch Syto-16-Färbung (Syto 16) in der FACS-Analyse bestimmt.For murine infection, P. berghei ANKA parasite-challenged mouse RBCs (2x10 ⁶ ) were administered intraperitoneally (Huber et al., 2004, Plasmodium induces swelling-activated ClC-2 anion channels in the host erythrocyte, J Biol. Chem.) Were injected into sexually and age matched Annexin7 + / + and Annexin7 - / - mice and parasitemia was determined daily by Syto-16 staining (Syto 16) in the FACS analysis.

Dabei zeigt sich, dass eine in vitro-Infektion von humanen Erythrocyten mit Plasmodium falciparum in der Tat zu einem Anstieg der Annexinbindung führt. Überraschenderweise nimmt die Zahl von Annexin bindenden Erythrocyten schneller bei Erythrocyten aus Trägern der Sichelzellkrankheit zu, begleitet von einem schnelleren Anstieg der Annexinbindung nach Behandlung mit 1 μM Ionomycin oder 1 μM Tertbutylhydroperoxid (Lang et al. (2002), „Enhanced erythrocyte apoptosis in sickle cell anemia, thalassemia and glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency", Cell. Physiol. Biochem. 12: S. 365 bis 372). Eine in vivo-Infektion von Annexin7–/–- und Annexin7+/+- Mäusen führt gleichermaßen zu einem Anstieg von Phosphatidylserin exponierenden Zellen, wobei dieser Effekt in Annexin7–/–- Mäusen verstärkt ist.there shows that an in vitro infection of human erythrocytes with Plasmodium falciparum indeed an increase in annexin binding leads. Surprisingly decreases the number of annexin-binding erythrocytes faster Erythrocytes from carriers sickle cell disease, accompanied by a faster increase Annexin binding after treatment with 1 μM ionomycin or 1 μM Tertbutylhydroperoxid (Lang et al. (2002), "Enhanced erythrocyte apoptosis in sickle cell anemia, thalassemia and glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency ", Cell. Physiol. Biochem. 12: pp. 365 to 372). In vivo infection of annexin7 - / - and annexin7 + / + - mice leads equally to one Increase in phosphatidylserine-exposed cells, this one Effect in Annexin7 - / - mice is enhanced.

Beispiel 6: Anfälligkeit von Annexin-Knockout-Mäusen gegenüber MalariaExample 6: Vulnerability of annexin knockout mice across from malaria

In einem weiteren Experiment wurden sowohl Annexin7+/+- als auch Annexin7–/–- Mäuse mit Plasmodium berghei infiziert und der Krankheitsverlauf wurde verfolgt.In In another experiment both annexin7 + / + and annexin7 - / - mice were included Plasmodium berghei became infected and the course of the disease was followed up.

Das Ergebnis eines solchen Experiments ist in 4 dargestellt. Dabei sind in Teilabbildung (A) die Originalhistogramme der Parasitämie in Annexin7+/+- (obere Reihe) und Annexin7–/–- Mäusen (untere Reihe) 9, 20 und 26 Tage nach der Infektion mit Plasmodium berghei dargestellt. In Teilabbildung (B) sind die arithmetischen Mittel ± SEM (n = 1 – 6, siehe 4(C)) der Parasitämie in Annexin7+/+- (ausgefüllte Symbole) und Annexin7–/–- Mäusen (unausgefüllte Symbole) in Abhängigkeit der Tage nach der Infektion mit Plasmodium berghei dargestellt. In Teilabbildung (C) ist das Ergebnis eines Experiments aufgetragen, mit dem das Überleben von Annexin7+/+- (unausgefüllte Symbole, Ausgangszahl 6) und Annexin7–/–- Mäusen (ausgefüllte Symbole, Ausgangszahl 6) nach Infektion mit Plasmodium berghei untersucht wurde.The result of such an experiment is in 4 shown. Partial image (A) shows the original histograms of parasitemia in Annexin7 + / + (upper row) and Annexin7 - / - mice (lower row) 9, 20 and 26 days after infection with Plasmodium berghei. In sub-figure (B) the arithmetic mean ± SEM (n = 1 - 6, see 4 (C) ) parasitemia in Annexin7 + / + - (filled symbols) and Annexin7 - / - mice (open symbols) depending on the days after infection with Plasmodium berghei. Partial figure (C) plots the result of an experiment that examined the survival of Annexin7 + / + (blank symbols, baseline number 6) and Annexin7 - / - mice (solid symbols, baseline number 6) after infection with Plasmodium berghei.

Dabei zeigt sich, dass sich in infizierten Annexin7+/+- Mäusen eine ausgeprägte Parasitämie entwickelt. Hierzu im Gegensatz entwickelt sich in Annexin7–/–- Mäusen die Parasitämie wesentlich langsamer und überschreitet keinen Wert von durchschnittlich 20 %. Die abgeschwächte Parasitämie in Annexin7–/–- Mäusen war begleitet von einem deutlichen Unterschied in der Überlebensrate zwischen Annexin7–/–- und Annexin7+/+- Mäusen. Keine der Annexin7+/+- Mäuse überlebte die Infektion mit Plasmodium berghei. Hierzu im Gegensatz starb lediglich eine von 6 Annexin7–/–- Mäusen an der Infektion. Die verbliebenen fünf Tiere waren noch 10 Wochen nach der Infektion am Leben. Von diesen Mäusen wurde 6 Wochen nach der Infektion Blut entnommen und in Wildtyp-Mäuse injiziert. Sämtliche Wildtyp-Mäuse starben an Malariainfektion, was belegte, dass Plasmodium berghei in den Annexin7–/–- Erythrocyten persistierte, jedoch vom Immunsystem des infizierten Annexin7-Knockout-Tieres in Schach gehalten wurde.there shows that in infected Annexin7 + / + mice a pronounced parasitaemia developed. In contrast, in Annexin7 - / - mice develops the parasitaemia much slower and exceeds no value averaging 20%. The attenuated parasitemia in annexin 7 - / - mice was accompanied by a significant difference in the survival rate between Annexin7 - / - and Annexin7 + / + - Mice. None of the Annexin7 + / + mice survived the infection with Plasmodium berghei. In contrast, died in contrast only one of 6 Annexin7 - / - mice the infection. The remaining five animals were still 10 weeks alive after the infection. Of these mice, 6 weeks after Infection was drawn from blood and injected into wild-type mice. All Wild-type mice died of malaria infection, which proved that Plasmodium berghei in the annexin7 - / - erythrocytes persisted, but from the immune system of the infected Annexin7 knockout animal was kept in check.

Claims

Substance that is designed so that this modulates the expression and / or function of annexin.

Substance according to claim 1, characterized that it is designed such that the expression and / or function is inhibited.

Substance according to claim 1 or 2, characterized that the substance is selected is from the group consisting of: low-molecular active substances, antibodies genetic constructs.

Substance according to claim 3, characterized that the genetic construct for an antisense annexin probe or / and an annexin RNAi and / or for transdominant encoded inhibitory annexin.

Substance according to one of the preceding claims medical use.

Substance according to one of the preceding claims Treatment or / and prophylaxis of infectious diseases, in particular of such by intracellular Pathogens caused infectious diseases, preferably malaria.

Substance according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the substance is designed such that these selectively the expression and / or function of annexin in erythrocytes modulated.

Use of a substance after one of the previous ones claims for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of infectious diseases, especially those caused by intracellular pathogens caused infectious diseases, preferably malaria.

Method for identifying a substance that modified the function and / or expression of annexin, the following Steps: (a1) provision of an annexin derived Peptides, or (a2) providing a biological system, which expresses an annexin-derived peptide; (b1) bring in contact of the peptide with a test substance under conditions involving binding allow the test substance to the peptide, or (b2) introduce a test substance in the biological system, and (c) finding whether the test substance from step (b1) is the function or from step (b2) modulates the expression of the peptide.

Method according to claim 9, characterized in that in step (c) it is determined whether the test substance from step (b1) the function or the test substance from step (b2) the expression of the peptide.

Substance, identified and identifiable by the method according to claim 9 or 10.

Process for the preparation of a pharmaceutical Composition for the treatment or / and prophylaxis of infectious diseases, which has the following steps: (a) providing a substance, which modulates the expression and / or function of annexin, and (B) Formulation of this substance in a pharmaceutically acceptable Carrier, thereby in that step (a) is carried out by carrying out the method according to claim 9 or 10 takes place, or that as substance the substance after a the claims 1 to 7 or 11 is used.

Method according to claim 12, characterized in that that the infectious disease is such, by intracellular Pathogen is caused, preferably around malaria.

Composition containing the substance according to one of claims 1 to 7 or 11.

Composition according to Claim 14, characterized that the composition is a pharmaceutical composition and a pharmaceutically acceptable carrier.

Method for determining a modified, preferably reduced susceptibility of a living being for Infections, which includes the following steps: (a) Provision a biological sample of the living being; (b) analysis of the sample to the presence of a modified, preferably reduced Annexin function or annexin expression, and (c) correlation a positive finding in step (b) with the diagnosis of a modified, preferably reduced susceptibility of the living thing.

Method according to claim 16, characterized in that that the infectious disease is such, by intracellular Pathogen is caused, preferably around malaria.

Method for therapeutic and / or prophylactic Treatment of a living being affected by an infectious disease is and / or where there is a risk of infection, the following Steps: (a) provision of a substance that the Expression and / or function of annexin reduced, and (B) Introduction of the substance into the living being.

Method according to claim 18, characterized that as a substance, the substance according to any one of claims 2 to 7 or 11 is used.

Method according to claim 18 or 19, characterized that the infectious disease is such, by intracellular Pathogen is caused, preferably around malaria.

Method for therapeutic and / or prophylactic Treatment of a living being affected by an infectious disease or / and where there is a risk of infection, by characterized in that in the animal the expression and / or function is reduced by annexin.