DE102004046154A1

DE102004046154A1 - Method for mass spectrometry

Info

Publication number: DE102004046154A1
Application number: DE200410046154
Authority: DE
Inventors: Stephen Leicester
Original assignee: Micromass UK Ltd
Current assignee: Micromass UK Ltd
Priority date: 2003-09-24
Filing date: 2004-09-23
Publication date: 2005-06-30
Also published as: GB0322356D0; JP4651341B2; DE202004014858U1; JP2005099021A; GB2408261A; CA2482095C; GB0421095D0; CA2482095A1

Abstract

Ein Verfahren zur Identifizierung posttranslational modifizierter Proteine wird offenbart. Das Verfahren umfaßt das Massenanalysieren von Peptidionen und dann die Subtraktion der bekannten Zunahme der Masse aufgrund einer oder mehrerer Modifikationen von Interesse von der bestimmten Masse des Peptids. Der resultierende Wert, der die Masse repräsentiert, die das Peptid hätte, wäre das Protein, von dem es abgeleitet ist, nicht modifiziert wurden, wird dann zur Durchsuchung gegen eine Peptiddatenbank verwendet. Eine Auswahlliste möglicher Peptide wird durch Auswahl von Peptiden, die sowohl die korrekte Masse als auch das korrekte Masse-Ladungs-Verhältnis (innerhalb einer benutzerspezifizierten Toleranz) aufweisen und die auch wenigstens eine der benutzerausgewählten Modifikationen von Interesse unterstützen, gebildet. Jedes in die Auswahlliste aufgenommene Peptid wird dann nacheinander bezüglich Fragmentationsdaten, die in Beziehung stehen zu dem experimentell beobachteten Peptid, verglichen bzw. bewertet.A method for identifying posttranslationally modified proteins is disclosed. The method involves mass analyzing of peptide ions and then subtracting the known increase in mass due to one or more modifications of interest from the particular mass of the peptide. The resulting value, representing the mass that the peptide would have if the protein from which it is derived, were not modified, is then used to screen against a peptide database. A shortlist of possible peptides is formed by selecting peptides that have both the correct mass and the correct mass-to-charge ratio (within a user-specified tolerance) and that also support at least one of the user-selected modifications of interest. Each peptide included in the selection list is then successively compared for fragmentation data related to the experimentally observed peptide.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung eines modifizierten Proteins, ein Massenspektrometer mit Mitteln zur Identifizierung eines modifizierten Proteins und eine Vorrichtung zur Identifizierung eines modifizierten Proteins.The The present invention relates to a method of identification a modified protein, a mass spectrometer with means for identifying a modified protein and a device to identify a modified protein.

Die in der DNA gespeicherte genetische Information definiert die Sequenz von Aminosäuren in Polypeptiden (Proteinen). Der genetische Code kann aufgefasst werden als die Menge von Regeln umfassend, durch welche DNA-Nukleotidbasenpaarsequenzen in eine korrespondierende Sequenz von Aminosäuren translatiert bzw. übersetzt werden. Ein Codewort (Codon) für eine Aminosäure besteht aus einer Sequenz von drei Nukleotidbasenpaaren. Die Sequenz von Basenpaaren in DNA wird zunächst auf informationsübertragende Messenger-RNA-Moleküle (mRNA) in einem Transkription genannten Verfahren übertragen. Diese dienen dann als Templat für die Synthese von Polypeptiden in einem Translation bzw. Übersetzung genannten Verfahren. Die Translation erfolgt in Ribosomen in dem Zytoplasma. Die so gebildeten Polypeptidketten lassen das Ribosom in einer „unmodifizierten" Form. Die Polypeptidketten können jedoch dann auf verschiedene Arten modifiziert werden. Einige, wie etwa diejenigen, die die Aminosäure Zystein enthalten, können sich selbst modifizieren, indem sie in eine bestimmte Form falten, so dass sie Disulfid-Bindungen zwischen den Zysteinen bilden können.The genetic information stored in the DNA defines the sequence of amino acids in polypeptides (proteins). The genetic code can be understood are defined as the set of rules by which DNA nucleotide base pair sequences translated or translated into a corresponding sequence of amino acids become. A codeword (codon) for an amino acid consists of a sequence of three nucleotide base pairs. The sequence of base pairs in DNA becomes first on information transferring Messenger RNA molecules (mRNA) in a transcription method. These then serve as a template for the Synthesis of polypeptides in translation mentioned method. Translation takes place in ribosomes in the Cytoplasm. The polypeptide chains thus formed leave the ribosome in an "unmodified" form, however, the polypeptide chains can then modified in different ways. Some, like those that are the amino acid Cysteine may contain modify themselves by folding into a particular shape, so that they can form disulfide bonds between the cysteines.

Dies bestimmt die Form des Proteins, und oftmals ist es die Form des Proteins, die seine Funktion bestimmt. Andere können durch die chemische Derivatisierung von bestimmten funktionalen Gruppen spezifischer Aminosäuren modifiziert werden. Beispielsweise kann die funktionale Gruppe auf der Aminosäure Tyrosin phosphoryliert werden. Dies verändert die Polarität und die Form des Polypeptids und kann es in die Lage versetzen, bestimmte Funktionen auszuführen, oder es daran hindern, bestimmte Funktionen auszuführen. Die oben genannten sind Beispiele von post-translationalen Modifikationen, die auftreten, nachdem das Polypeptid synthetisiert wurde und wenn das Polypeptid sich mit anderen Polypeptiden oder Chemikalien frei vermischt. Es gibt zahlreiche Formen der post-translationalen Modifikationen, die fast alle irgendeine Form einer chemischen Derivatisierung einer funktionalen Gruppe beinhalten. Diese umfassen die Methylation, Hydroxylation, Oxidation, Formylation, Acetylation, Carboxylation, Phosphorlyation, Sulphation, Cysteinylation, Glycosalation, Farnesylation, Myristoylation, Biotinylation, Palmitoylation und Stearoylation. Einige dieser Modifikationen sind häufiger bzw. üblicher als andere.This determines the shape of the protein, and often it is the shape of the protein Protein that determines its function. Others may be due to chemical derivatization modified by specific functional groups of specific amino acids become. For example, the functional group on the amino acid tyrosine be phosphorylated. This changed the polarity and the shape of the polypeptide and can enable it to perform certain functions, or prevent it from performing certain functions. The The above are examples of post-translational modifications that occur after the polypeptide has been synthesized and if that Polypeptide freely mixed with other polypeptides or chemicals. There are many forms of post-translational modifications, almost all of them have some form of chemical derivatization include functional group. These include the methylation, Hydroxylation, oxidation, formylation, acetylation, carboxylation, Phosphorylation, sulphation, cysteinylation, glycosalation, farnesylation, Myristoylation, biotinylation, palmitoylation and stearoylation. Some of these modifications are more common than others.

Die Fähigkeit, Proteine zu identifizieren (im allgemeinen als „Proteincharakterisierung" bezeichnet) ist auf dem Gebiet der Life Sciences bzw. Lebenswissenschaften von besonderer Bedeutung. Die Proteinidentifikation kann das Erkennen eines Proteins durch Vergleich experimenteller Daten mit Daten, die in einer Proteindatenbank gehalten werden, umfassen. Alternativ kann die Proteinidentifikation das Ab-Initio-Erarbeiten der Sequenz von Aminosäuren, die ein Protein bilden, beinhalten.The Ability, To identify proteins (commonly referred to as "protein characterization") in the field of life sciences or life sciences of particular Importance. Protein identification can be the recognition of a protein by comparing experimental data with data stored in a protein database to be held. Alternatively, the protein identification the ab-initio-working out the sequence of amino acids that to form a protein.

Die Fähigkeit, Proteine zu identifizieren oder zu charakterisieren, welche post-translational modifiziert wurden, ist von besonderem Interesse. Massenspektrometrie wird üblicherweise als ein Mittel zur Identifizierung von Proteinen und post-translational modifizierter Proteine verwendet.The Ability, To identify or characterize proteins that are post-translational have been modified is of particular interest. Mass spectrometry becomes common as a means of identifying proteins and post-translationally modified Used proteins.

Es ist bekannt, experimentelle Massenspektraldaten, die durch Massenanalysieren von Peptidproben erhalten wurden, mit theoretischen Peptiddaten, die von Proteinsequenzdatenbanken oder Exprimierten-Sequenz-Tag-Datenbanken (EST) generiert wurden, zu vergleichen. Theoretische Peptiddaten können durch Vorhersage der Peptide, die gebildet würden, wenn Proteine, die in der Proteindatenbank aufgelistet sind, digestiert werden, erhalten werden. Digestregeln können auf eine oder mehrere Proteine, die in der Proteindatenbank aufgelistet sind, angewendet werden, wonach das Masse-Ladungs-Verhältnis der resultierenden Peptidprodukte bestimmt werden kann.It is known, experimental mass spectral data by mass analysis of peptide samples, with theoretical peptide data, that of protein sequence databases or expressed sequence tag databases (EST) were generated. Theoretical peptide data can be analyzed by Prediction of peptides that would be formed when proteins expressed in the protein database listed are to be digested become. Digest rules can to one or more proteins listed in the protein database are applied, according to which the mass-to-charge ratio of resulting peptide products can be determined.

Zusätzlich zum Vergleich von experimentellen Massenspektraldaten mit theoretischen Peptiddaten ist es auch bekannt, Fragmentationsdaten (oder MS/MS-Daten) zu verwenden, um Peptide und das Protein, vom welchem diese abgeleitet bzw. deriviert sind, zu identifizieren. Peptidionen werden, wenn sie Hochenergiekollisionen in einer Kollisions- oder Fragmentationszelle eines Massenspektrometers ausgesetzt werden, in eine Anzahl von Fragmentionen fragmentieren, welche dann massenanalysiert werden können. Das Verfahren, durch das Peptidionen fragmentieren, kann auch ausgehend von Peptiden, die theoretisch erwartet werden von der Digestation eines Proteins, das in der Proteindatenbank aufgelistet ist, simuliert werden. Theoretische Fragmentationsdaten, die durch Vorhersage der möglichen Fragmentierung von Peptiden erhalten werden, können dann mit experimentell erhaltenen Fragmentations-Massenspektraldaten verglichen werden.In addition to Comparison of experimental mass spectral data with theoretical Peptide data it is also known fragmentation data (or MS / MS data) to use peptides and the protein from which these are derived or derived. Peptide ions become, though high-energy collisions in a collision or fragmentation cell a mass spectrometer, in a number of Fragment ions fragment, which are then mass analyzed can. The process by which peptide ions fragment can also be proceeding of peptides that are theoretically expected from the digestion of a protein listed in the protein database become. Theoretical fragmentation data obtained by prediction of the possible Fragmentation of peptides can then be obtained experimentally obtained fragmentation mass spectral data.

Die Verwendung von Fragmentations- oder MS/MS-Daten ist besonders wirkungsvoll bzw. leistungsfähig bei der Proteincharakterisierung (und insbesondere für Proteine, die post-translational modifiziert wurden), da die aufgrund der Fragmentation eines Peptidions gebildeten Fragmentionen sowohl von der Position (Location) als auch der Art irgendwelcher post-translationaler Modifikationen, die das Protein beeinflußt haben, abhängen wird.The use of fragmentation or MS / MS data is particularly effective in protein characterization (and especially for proteins that have been post-translationally modified), since the fragment ions formed due to the fragmentation of a peptide ion are affected both by location as well as kind of which will depend on post-translational modifications that have affected the protein.

Frühe Techniken zum Vergleich experimenteller Massenspektraldaten mit theoretischen Peptiddaten beinhalteten den direkten Vergleich experimenteller Massenspektraldaten mit Peptiddaten, die in einer indexierten vordigestierten Peptiddatenbank gehalten werden. Dieser Ansatz war geeignet für die Identifizierung unmodifizierter Proteine, erlaubte jedoch nicht die Identifikation von post-translational modifizierten Proteinen, da die Peptiddatenbank Proteine, die post-translational modifiziert waren, nicht unterstützte.Early techniques to compare experimental mass spectral data with theoretical Peptide data included the direct comparison of experimental Mass spectral data with peptide data predicted in an indexed Be held peptide database. This approach was suitable for identification unmodified proteins, but did not allow identification of post-translationally modified proteins, as the peptide database Proteins that were post-translationally modified were unsupported.

Der zunehmende Bedarf an Unterstützung von Proteincharakterisierung und insbesondere post-translational modifizierter Proteine bedeutete, dass ein anderer Ansatz gewählt werden mußte, um post-translational modifizierte Proteine zu identifizieren. Es wurde bislang nicht als praktikabel erachtet, Peptiddaten, die aus einem digestierten post-translational modifizierten Protein abgeleitet sind, bezüglich konventionell indexierter vordigestierter Peptiddatenbanken zu durchsuchen bzw. zu untersuchen, da Einzelheiten jedes unmodifizierten Peptids, das in der Peptiddatenbank gespeichert ist, ergänzt werden müßten durch zahlreiche zusätzliche Eintragungen bezüglich aller möglicher Kombinationen von Modifikationen und der verschiedenen Permutationen der Position derartiger Modifikationen. Eine Peptiddatenbank, die sämtliche möglichen Modifikationen und Permutationen modifizierbarer Positionen beinhaltete, wäre so groß, dass ihre Benutzung unpraktikabel wäre, da Suchzeiten zur Durchsuchung einer derartigen Datenbank sehr langsam bzw. lang wären.Of the increasing need for support from Protein characterization and especially post-translationally modified Proteins meant that a different approach had to be taken to post-translationally to identify modified proteins. It has not been so far considered feasible, peptide data that digested from a post-translationally modified protein, with respect to conventionally indexed to screen or examine pre-established peptide databases, as details of each unmodified peptide stored in the peptide database is, added would have to go through numerous additional Entries Re of all possible Combinations of modifications and the different permutations the position of such modifications. A peptide database, the all potential Modifications and permutations of modifiable positions included, would be like that large, that their use would be impractical, since search times for searching such a database would be very slow or long.

In Anbetracht der Unpraktikabilität des Versuches der Verwendung einer Peptiddatenbank, die Einträge für alle möglichen Modifikationen eines Proteins beinhaltet, besteht der herkömmliche Ansatz zur Identifizierung post-translational modifizierter Proteine darin, vielmehr mit einer herkömmlichen Proteindatenbank (im Gegensatz zu einer vordigestierten Peptiddatenbank) zu beginnen. In der Proteindatenbank aufgelistete Proteine werden dann theoretisch laufend bzw. fliegend digestiert, d. h. die Proteine werden theoretisch digestiert, jedes Mal wenn experimentelle Peptiddaten zur Analyse eingegeben werden.In Considering the impracticality of trying to use a peptide database containing entries for all possible ones Modifications of a protein involves the conventional Approach to identifying post-translationally modified proteins in it, rather with a conventional protein database (as opposed to a predigested peptide database). Proteins listed in the protein database will become theoretical digested on the fly, d. H. the proteins become theoretical Digests every time experimental peptide data for analysis be entered.

Gemäß dem herkömmlichen Ansatz werden beliebige bestimmte Modifikationen, die ein Benutzer in Erwägung ziehen möchte, dann vollständig oder teilweise auf die Peptidprodukte angewendet, die aus der theoretischen Digestion bzw. Digestierung des Proteins resultieren. Die resultierenden theoretisch modifizierten Peptiddaten können dann mit den tatsächlichen experimentellen Massenspektraldaten verglichen werden. Der herkömmliche Ansatz erlaubt daher Suchen zur Unterstützung einer beliebigen Anzahl potentieller (d. h. variabler oder zufälliger) Modifikationen. Einer der Nachteile bei dem herkömmlichen Ansatz besteht jedoch dar in, dass es relativ lange dauert, Proteine, die in einer Proteindatenbank aufgelistet sind, theoretisch zu digestieren. Da auch die theoretische Digestion von Proteinen, die in einer Proteindatenbank aufgelistet sind, laufend bzw. fliegend stattfindet, muß jedes derart erzeugte Peptid bezüglich sämtlicher Kombinationen oder Modifikationen, die ein Benutzer in Erwägung zu ziehen wünscht, analysiert werden. Ferner existieren potentiell verschiedene unterschiedliche Permutationen von Modifizierern, die in Betracht gezogen werden müssen. Beispielsweise muß, wenn ein Peptid verschiedene modifizierbare Positionen hat und eine einzelne Modifikation in Erwägung gezogen wird, jede modifizierbare Position nacheinander in Erwägung gezogen werden bei der Erzeugung der theoretischen Peptiddaten und bei der Suche nach der besten Übereinstimmung bzw. dem besten Fit (Kombination und Permutation) bezüglich der experimentellen Daten. Folglich ist der herkömmliche Ansatz relativ langsam insbesondere wenn eine Anzahl von Modifizierern berücksichtigt werden soll.According to the conventional Approach will be any specific modifications that a user in consideration want to pull, then completely or partially applied to the peptide products resulting from the theoretical Digestion or digestion of the protein result. The resulting theoretically modified peptide data can then match the actual experimental mass spectral data are compared. The conventional one Approach therefore allows searches to support any number potential (i.e., variable or random) modifications. one the disadvantages of the conventional Approach, however, is that it takes a relatively long time for proteins, which are listed in a protein database to theoretically digest. As well as the theoretical digestion of proteins in a protein database are listed, running or flying, each must thus produced peptide all Combinations or modifications that a user might consider wants to pull, to be analyzed. Furthermore, there are potentially several different ones Permutations of modifiers that need to be considered. For example must, if a peptide has different modifiable positions and a single one Modification is under consideration Any modifiable position is considered in turn are used in the generation of the theoretical peptide data and in the Looking for the best match or the best fit (combination and permutation) with respect to the experimental data. As a result, the conventional approach is relatively slow especially when considering a number of modifiers shall be.

Es wird daher angestrebt, ein schnelleres Verfahren zur Identifizierung oder Charakterisierung eines Proteins, dass post-translational modifiziert ist, zur Verfügung zu stellen.It Therefore, the aim is a faster identification process or characterization of a protein that post-translationally modified is available to deliver.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung eines modifizierten Proteins bereitgestellt
mit folgenden Schritten:
Digestierung eines modifizierten Proteins zur Herstellung einer Anzahl von Peptiden;
Ionisieren wenigstens eines der Anzahl von Peptiden zur Bildung eines oder mehrerer Peptidionen;
Massenanalysieren eines oder mehrerer Peptidionen zur Bestimmung der Masse oder des Masse-Ladungs-Verhältnisses wenigstens eines der Peptide oder der Peptidionen; und Identifizieren des modifizierten Proteins durch:

(i) Bestimmen der theoretischen unmodifizierten Masse oder des theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnisses, die bzw. das ein Peptid oder ein Peptidion haben würde, wäre das Protein, von dem das Peptid oder Peptidion abgeleitet ist, nicht modifiziert worden;
(ii) Durchsuchen einer Datenbank von Peptiden unter Verwendung der theoretischen unmodifizierten Masse oder des theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnisses; und
(iii) Bestimmung von Peptiden in der Datenbank mit einer Masse oder einem Masse-Ladungs-Verhältinis, die bzw. das der theoretischen unmodifizierten Masse oder dem theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnis entspricht.

In accordance with the present invention, a method for identifying a modified protein is provided
with the following steps:
Digesting a modified protein to produce a number of peptides;
Ionizing at least one of the number of peptides to form one or more peptide ions;
Mass analyzing one or more peptide ions to determine the mass or mass to charge ratio of at least one of the peptides or the peptide ions; and identifying the modified protein by:

(i) determining the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio that a peptide or a peptide ion would have, the protein from which the peptide or peptide ion is derived would not have been modified;
(ii) searching a database of peptides using the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified mass-to-charge ratio; and
(iii) Determination of peptides in the database with a mass or a mass-charge Ver which corresponds to the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio.

Das modifizierte Protein wurde vorzugsweise post-translational modifiziert, beispielsweise durch Methylierung bzw. Methylation, Hydroxylierung bzw. Hydroxylation, Oxidierung bzw. Oxidation, Formylierung bzw. Formylation, Acetylierung bzw. Acetylation, Carboxylierung bzw. Carboxylation, Phosporylierung bzw. Phosphorlyation, Sulphatierung bzw. Sulphation, Cysteinylierung bzw. Cysteinylation, Glycosalierung bzw. Glycosalation, Farnesylierung bzw. Farnesylation, Myristoylierung bzw. Myristoylation, Biotinylierung bzw. Biotinylation, Palmitoylierung bzw. Palmitoylation oder Stearoylierung bzw. Stearoylation.The modified protein has preferably been post-translationally modified, for example by Methylation or methylation, hydroxylation or hydroxylation, Oxidation or oxidation, formylation or formylation, acetylation or acetylation, carboxylation or carboxylation, phosphorylation or phosphorylation, sulphating or sulphation, cysteinylation or cysteinylation, glycosylation or glycosalation, farnesylation or farnesylation, myristoylation or myristoylation, biotinylation or biotinylation, palmitoylation or palmitoylation or stearoylation or stearoylation.

Eine oder mehrere interessierende Modifikationen werden vorzugsweise bestimmt, ausgewählt oder anderweitig in Erwägung gezogen. Das modifizierte Protein wird vorzugsweise bestimmt oder in Erwägung gezogen als mittels wenigstens einer interessierenden Modifikation modifiziert. Wenigstens eine oder mehrere (vorzugsweise sämtliche) Kombinationen von Modifikationen von Interesse werden vorzugsweise enummeriert. Eine maximale Anzahl von Modifikationen wird vorzugsweise bestimmt, ausgewählt oder in Erwägung gezogen. Vorzugsweise umfaßt der Schritt der Enumerierung durch Kombinationen von Modifikationen von Interesse die Enumerierung durch Kombinationen von Modifikationen von Interesse bis zu einer maximalen Anzahl von Modifikationen.A or several modifications of interest are preferred determined, selected or otherwise considered drawn. The modified protein is preferably determined or considering drawn as by means of at least one modification of interest modified. At least one or more (preferably all) Combinations of modifications of interest are preferred enummeriert. A maximum number of modifications is preferred determined, selected or considering drawn. Preferably comprises the step of enumerating through combinations of modifications of interest the enumeration by combinations of modifications of Interest up to a maximum number of modifications.

Der Schritt der Bestimmung der theoretischen unmodifizierten Masse oder des theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnisses umfaßt vorzugsweise die Berechnung oder Bestimmung der Masse oder des Masse-Ladungs-Verhältnisses einer Kombination von Modifikationen von Interesse. Die theoretische unmodifizierte Masse oder das theoretische unmodifizierte Masse-Ladungs-Verhältnis wird vorzugsweise erhalten durch Veränderung, Umkehrung, Gegenwirken, Negieren, Unmodifizierung bzw. Entmodifizierung oder Anpassung der Masse oder des Masse-Ladungs-Verhältnisses eines experimentell beobachteten Peptids oder Peptidions in Anbetracht einer Kombination von Modifikationen von Interesse. Insbesondere kann dies die Subtraktion (oder weniger vorzugsweise die Addition) der Masse oder des Masse-Ladungs-Verhältnisses der Kombination von Modifikationen von Interesse von (zu) der Masse oder dem Masse-Ladungs-Verhältnis des Peptids oder Peptidions, wie es durch den Schritt des Massenanalysierens erhalten wurde, beinhalten.Of the Step of determining the theoretical unmodified mass or of the theoretical unmodified mass-to-charge ratio preferably comprises the calculation or determination of mass or mass-to-charge ratio of a Combination of modifications of interest. The theoretical unmodified Mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio preferably obtained by change, Inversion, counteraction, negation, unmodification or de-modification or adjustment of mass or mass-to-charge ratio an experimentally observed peptide or peptide ion in consideration a combination of modifications of interest. Especially may this be the subtraction (or less preferably the addition) the mass or mass-to-charge ratio of the combination of Modifications of interest from (to) the mass or mass-to-charge ratio of the Peptides or peptide ions as determined by the mass analysis step was received.

Das Verfahren umfasst vorzugsweise das Bestimmen, das Auswählen oder das In-Erwägung-Ziehen einer erlaubten Masse oder Masse-Ladungs-Verhältnis-Toleranz zwischen der theore tischen unmodifizierten Masse oder dem theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnisses des Peptids oder des Peptidions und der Masse oder dem Masse-Ladungs-Verhältnis von Peptiden, die in der Datenbank aufgelistet sind. Die Massentoleranz kann innerhalb eines Bereiches liegen, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (i) < 0,01 Da; (ii) 0,01 – 0,02 Da; (iii) 0,02 – 0,03 Da; (iv) 0,03 – 0,04 Da; (v) 0,04 – 0, 05 Da; (vi) 0,05 – 0,06 Da; (vii) 0,06 – 0,07 Da; (viii) 0,07 – 0,08 Da; (ix) 0,08 – 0,09 Da; (x) 0,09 – 0,10 Da; und (xi) > 0,10 Da.The Method preferably comprises determining, selecting or taking into consideration a permissible mass or mass-to-charge ratio tolerance between the theoretically unmodified mass or the theoretical unmodified Mass to charge ratio of the peptide or peptide ion and the mass or mass-to-charge ratio of Peptides listed in the database. The mass tolerance can be within an area selected from the group which consists of: (i) <0.01 There; (ii) 0.01-0.02 There; (iii) 0.02-0.03 There; (iv) 0.03-0.04 There; (v) 0.04-0, 05 Da; (vi) 0.05-0.06 Da; (vii) 0.06-0.07 There; (viii) 0.07-0.08 There; (ix) 0.08-0.09 There; (x) 0.09-0.10 There; and (xi)> 0.10 There.

Die Masse-Ladungs-Verhältnis-Toleranz kann in einen Bereich fallen, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (i) ≤ 0,1 Masse-Ladungs-Verhältnis-Einheiten; (ii) ≤ 0,01 Masse-Ladungs-Verhältnis-Einheiten; (iii) ≤ 0,001 Masse-Ladungs-Verhältnis-Einheiten; (iv) ≤ 0,0001 Masse-Ladungs-Verhältnis-Einheiten; (v) ≤ 0,00001 Masse-Ladungs-Verhältnis-Einheiten; (vi) ≤ 0,000001 Masse-Ladungs-Verhältnis-Einheiten.The Mass-to-charge ratio tolerance can fall into an area selected from the group which consists of: (i) ≤ 0.1 Mass to charge ratio units; (ii) ≤ 0.01 Mass to charge ratio units; (iii) ≤ 0.001 Mass to charge ratio units; (iv) ≤ 0.0001 Mass to charge ratio units; (v) ≤ 0.00001 Mass to charge ratio units; (vi) ≤ 0.000001 Mass to charge ratio units.

Der Schritt des Durchsuchens einer Datenbank von Peptiden umfaßt vorzugsweise die Bestimmung oder die Auswahl von Peptiden, die in der Datenbank aufgelistet sind, die eine Masse oder ein Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen, das der theoretischen unmodifizierten Masse oder dem theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnis entspricht innerhalb der Massen- oder Masse-Ladungs-Verhältnis-Toleranz.Of the A step of searching a database of peptides preferably comprises the determination or selection of peptides in the database are listed which have a mass or mass-to-charge ratio, that of the theoretical unmodified mass or the theoretical one unmodified mass-to-charge ratio corresponds within the mass or mass-to-charge ratio tolerance.

Das Verfahren umfaßt ferner vorzugsweise die Bestimmung eines Peptids in der Datenbank von Peptiden, dass eine Masse oder ein Masse-Ladungs-Verhältnis aufweist, die bzw. das der theoretischen unmodifizierten Masse oder dem theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnis entspricht bis zu einer oberen Grenze der Massen- oder Masse-Ladungs-Verhältnis-Toleranz. In ähnlicher Weise umfaßt das Verfahren vorzugsweise die Bestimmung eines Peptids in der Datenbank von Peptiden, das eine Masse oder ein Masse-Ladungs-Verhältnis aufweist, das der theoretischen unmodifizierten Masse oder dem theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnis innerhalb einer unteren Grenze der Massen- oder Masse-Ladungs-Verhältnis-Toleranz entspricht. Peptide in der Datenbank von Peptiden mit Massen oder Masse-Ladungs-Verhältnissen zwischen der oberen Grenze und der unteren Grenze werden vorzugsweise ausgewählt und bilden eine erste bzw. initiale Liste von Peptiden.The Method includes furthermore, preferably the determination of a peptide in the database of peptides that have a mass or a mass-to-charge ratio, that of the theoretical unmodified mass or the theoretical one unmodified mass-to-charge ratio is equivalent to one upper limit of mass or mass-to-charge ratio tolerance. In similar Way the method preferably comprises the determination of a peptide in the database of peptides having a mass or mass-to-charge ratio, that of the theoretical unmodified mass or the theoretical one unmodified mass-to-charge ratio within a lower limit of mass or mass-to-charge ratio tolerance equivalent. Peptides in the database of peptides with masses or Mass-to-charge ratios between the upper limit and the lower limit are preferably selected and form a first or initial list of peptides.

Peptide in der ersten Liste von Peptiden, die tatsächlich nicht wenigstens eine der Kombinationen von Modifikationen von Interesse unterstützen, werden vorzugsweise zurückgewiesen, fallengelassen oder mit einer niedrigeren Priorität versehen, wodurch eine Auswahlliste bzw. Shortlist möglicher Peptide gebildet wird. Als Ergebnis weisen vorzugsweise wenigstens eine Mehrzahl von Peptiden in der Auswahlliste möglicher Peptide auf: (i) Eine Masse oder ein Masse-Ladungs-Verhältnis, die bzw. das der theoretischen unmodifizierten Masse oder dem theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnis des Peptids oder des Peptidions innerhalb der Massen- oder Masse-Ladungs-Verhältnis-Toleranz entspricht; und (ii) wenigstens die gleiche Anzahl und Art modifizierbarer Positionen zur Unterstützung wenigstens einer der Kombinationen von Modifikationen von Interesse.Peptides in the first list of peptides that do not actually support at least one of the combinations of modifications of interest are preferably rejected, dropped, or given a lower priority where is formed by a selection list or shortlist of possible peptides. As a result, preferably at least a plurality of peptides in the shortlist of candidate peptides have: (i) a mass or mass-to-charge ratio equal to the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio of the peptide or protein Peptidions within the mass or mass-charge ratio tolerance corresponds; and (ii) at least the same number and type of modifiable positions supporting at least one of the combinations of modifications of interest.

Bei dem bevorzugten Verfahren wird bestimmt, ob die modifizierbaren Positionen eines Peptids in der Auswahlliste der möglichen Peptide exakt einer Kombination von Modifikatio nen von Interesse entspricht. Wenn die modifizierbaren Positionen eines Peptids in der Auswahlliste möglicher Peptide exakt oder im Wesentlichen einer Kombination von Modifikationen von Interesse entspricht, wird das Peptid in der Auswahlliste verglichen mit bzw. bewertet bezüglich Fragmentations- oder MS/MS-Massenspektraldaten, die dem Peptidion entsprechen. Der Vergleich bzw. die Bewertung beinhaltet die Bestimmung, Evaluierung oder Berechnung der Nähe des Fits zwischen theoretischen Daten und experimentellen Daten. Wenn jedoch die modifizierbaren Positionen eines Peptids in der Auswahlliste möglicher Peptide nicht exakt oder im Wesentlichen einer Kombination von Modifikationen von Interesse entsprechen bzw. mit diesen übereinstimmen, werden die Modifikationen von Interesse entsprechend dem Rest, den sie betreffen, gruppiert. Kombinationen modifizierbarer Positionen werden dann vorzugsweise enumeriert, und Modifikationen von Interesse werden unter den modifizierbaren Positionen permutiert, vorzugsweise auf einer gruppenweisen Basis bzw. einer Basis per Gruppe. Jedes permutierte Peptid wird dann vorzugsweise verglichen oder korrigiert bezüglich Fragmentations- oder MS/MS-Massenspektraldaten, die dem Peptidion entsprechen.at the preferred method determines whether the modifiable Positions of a peptide in the selection list of the possible Peptide corresponds exactly to a combination of modifications of interest. If the modifiable positions of a peptide in the selection list potential Peptides exactly or essentially a combination of modifications of interest, the peptide in the selection list is compared with or with regard to Fragmentation or MS / MS mass spectral data corresponding to the peptide ion correspond. The comparison or assessment includes the determination, Evaluation or calculation of the closeness of the fit between theoretical Data and experimental data. However, if the modifiable Positions of a peptide in the selection list of possible peptides are not exact or essentially a combination of modifications of interest correspond or agree with these, The modifications will be of interest according to the rest they concern, grouped. Combinations of modifiable positions then preferably enumerated, and modifications become of interest permuted under the modifiable positions, preferably on a group-by-group basis or a basis by group. Every permuted Peptide is then preferably compared or corrected for fragmentation or MS / MS mass spectral data, the correspond to the peptide ion.

Die Datenbank umfaßt vorzugsweise eine Datenbank von Peptiden, die von unmodifizierten Proteinen abgeleitet sind. Die in der Datenbank gelisteten bzw. aufgelisteten Peptide sind vorzugsweise entsprechend ihrer Masse oder ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis angeordnet. Insbesondere können die Peptide entsprechend dem monoisotopischen Masse-Ladungs-Verhältnis angeordnet sein.The Database includes preferably a database of peptides derived from unmodified proteins are derived. The ones listed or listed in the database Peptides are preferably arranged according to their mass or mass-to-charge ratio. In particular, the Peptides arranged according to the monoisotopic mass-to-charge ratio be.

Der Schritt der Identifizierung des modifizierten Proteins umfaßt vorzugsweise die Wiederholung der Schritte (i), (ii) und (iii) für eine Anzahl unterschiedlicher Peptide oder Peptidionen.Of the The step of identifying the modified protein preferably comprises repeating steps (i), (ii) and (iii) for a number different peptides or peptide ions.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Massenspektrometer bereitgestellt mit:
einer Ionenquelle zur Ionisierung wenigstens eines einer Anzahl von Peptiden, die von einer Digestion eines modifizierten Proteins abgeleitet bzw. deriviert sind, zur Bildung eines oder mehrerer Peptidionen;
einem Massenanalysator zum massenanalysieren eines oder mehrerer der Peptidionen zur Bestimmung der Masse oder des Masse-Ladungs-Verhältnisses wenigstens eines der Peptide oder der Peptidionen; und
Identifizierungsmittel zur Identifizierung des modifizierten Proteins, wobei, bei der Verwendung, die Identifizierungsmittel

(i) die theoretische unmodifizierte Masse oder das theoretische unmodifizierte Masse-Ladungs-Verhältnis bestimmen, das ein Peptid oder Peptidion hätte, wäre das Protein, von dem das Peptid oder Peptidion abgeleitet ist, nicht modifiziert worden;
(ii) die Datenbank von Peptiden unter Verwendung der theoretischen unmodifizierten Masse oder des theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnisses durchsuchen; und
(iii) Peptide in der Datenbank bestimmen, die eine Masse oder ein Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen, die bzw. das der theoretischen unmodifizierten Masse oder dem theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnis entspricht.

In accordance with another aspect of the present invention, a mass spectrometer is provided with:
an ion source for ionizing at least one of a number of peptides derived from a digest of a modified protein to form one or more peptide ions;
a mass analyzer for mass analyzing one or more of the peptide ions to determine the mass or mass-to-charge ratio of at least one of the peptides or the peptide ions; and
Identification means for identifying the modified protein, wherein, in use, the identification means

(i) determine the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass to charge ratio that a peptide or peptide ion would have had if the protein from which the peptide or peptide ion is derived has not been modified;
(ii) search the database of peptides using the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified mass-to-charge ratio; and
(iii) determine peptides in the database which have a mass or mass-to-charge ratio equal to the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung eines modifizierten Proteins bereitgestellt mit folgenden Schritten:

(i) Bestimmung der theoretischen unmodifizierten Masse oder des theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnisses, welches ein Peptid oder Peptidion hätte, wäre das Protein, von dem das Peptid oder das Peptidion abgeleitet ist, nicht modifiziert worden;
(ii) Durchsuchen einer Datenbank von Peptiden unter Verwendung der theoretischen unmodifizierten Masse oder des theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnisses; und
(iii) Bestimmung von Peptiden in der Datenbank, die eine Masse oder ein Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen, die bzw. das der theoretischen unmodifizierten Masse oder dem theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnis entspricht.

According to another aspect of the present invention there is provided a method of identifying a modified protein comprising the steps of:

(i) determining the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio which would have a peptide or peptide ion, the protein from which the peptide or peptide ion is derived would not have been modified;
(ii) searching a database of peptides using the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified mass-to-charge ratio; and
(iii) Determination of peptides in the database which have a mass or mass-to-charge ratio equal to the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zur Identifizierung eines modifizierten Proteins bereitgestellt, wobei bei der Verwendung die Vorrichtung

(i) die theoretische unmodifizierte Masse oder das theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnis bestimmt, welche bzw. welches ein Peptid oder Peptidion hätte, wäre das Protein, von dem das Peptid oder Peptidion abgeleitet ist, nicht modifiziert worden;
(ii) eine Datenbank von Peptiden unter Verwendung der theoretischen unmodifizierten Masse oder des theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnisses durchsucht; und
(iii) Peptide in der Datenbank bestimmt, die eine Masse oder ein Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen, die bzw. das der theoretischen unmodifizierten Masse oder dem theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnis entspricht.

According to another aspect of the present invention, there is provided an apparatus for identifying a modified protein, wherein in use, the apparatus

(i) the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio determines what would have a peptide or peptide ion if the protein from which the peptide or peptide ion is derived were not modified;
(ii) a database of peptides under use searched for the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio; and
(iii) determining in the database peptides having a mass or mass-to-charge ratio equal to the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio.

(a) Bestimmung, Auswählen und In-Erwägung-Ziehen einer oder mehrerer Modifikationen von Interesse;
(b) Enumerierung durch bzw. über eine oder mehrere Kombinationen von Modifikationen von Interesse;
(c) Berechnen der Masse oder des Masse-Ladungs-Verhältnisses einer oder mehrerer Kombinationen von Modifikationen von Interesse;
(d) Subtrahieren der berechneten Masse oder des berechneten Masse-Ladungs-Verhältnisses einer der Kombinationen von Modifikationen von Interesse von der experimentell bestimmten Masse oder dem experimentell bestimmten Masse-Ladungs-Verhältnisses eines Peptids oder Peptidions zur Bestimmung einer theoretischen unmodifizierten Masse oder eines theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnisses, die bzw. das ein Peptid oder Peptidion hätte, wäre das Protein, von dem das Peptidion abgeleitet ist, nicht modifiziert worden;
(e) Durchsuchen einer Datenbank von Peptiden unter Verwendung der theoretischen unmodifizierten Masse oder des theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnisses zur Ausgabe einer ersten Liste von Peptiden;
(f) Entfernung von Peptiden aus der ersten Liste von Peptiden, die die Kombination von Modifikationen von Interesse nicht unterstützen können, zur Erzeugung einer Auswahlliste von Peptiden; und
(g) Vergleichen bzw. Bewerten von Peptiden in der Auswahlliste von Peptiden bezüglich Fragmentations-Massenspektraldaten.

(a) determining, selecting and considering one or more modifications of interest;
(b) enumerating through or over one or more combinations of modifications of interest;
(c) calculating the mass or mass-to-charge ratio of one or more combinations of modifications of interest;
(d) subtracting the calculated mass or mass-to-charge ratio of one of the combinations of modifications of interest from the experimentally determined mass or the experimentally determined mass-to-charge ratio of a peptide or peptide ion to determine a theoretical unmodified mass or a theoretical unmodified mass Mass-to-charge ratio that would have a peptide or peptide ion, the protein from which the peptide ion is derived would not have been modified;
(e) searching a database of peptides using the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified mass-to-charge ratio to output a first list of peptides;
(f) removing peptides from the first list of peptides that can not support the combination of modifications of interest to generate a selection list of peptides; and
(g) Comparing peptides in the selection list of peptides for fragmentation mass spectral data.

(a) eine oder mehrere Modifikationen von Interesse bestimmt, auswählt oder in Erwägung zieht;
(b) durch eine oder mehrere Kombinationen von Modifikationen von Interesse enumeriert;
(c) die Masse oder das Masse-Ladungs-Verhältnis einer oder mehrerer Kombinationen von Modifikationen von Interesse berechnet;
(d) die berechnete Masse oder das berechnete Masse-Ladungs-Verhältnis einer der Kombinationen von Modifikationen von Interesse von der experimentell bestimmten Masse oder dem experimentell bestimmten Masse-Ladungs-Verhältnis eines Peptids oder Peptidions subtrahiert zur Bestimmung einer theoretischen unmodifizierten Masse oder eines theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnisses, die bzw. das ein Peptid oder ein Peptidion hätte, wäre das Protein, von dem das Peptid oder Peptidion abgeleitet ist, nicht modifiziert worden;
(e) die Datenbank von Peptiden unter Verwendung der theoretischen unmodifizierten Masse oder des theoretischen unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnisses zur Ausgabe einer ersten Liste von Peptiden durchsucht;
(f) aus der ersten Liste von Peptiden Peptide entfernt, die die Kombination von Modifikationen von Interesse nicht unterstützen können, zur Erzeugung einer Auswahlliste von Peptiden; und
(g) Peptide in der Auswahlliste von Peptiden gegen Fragmentations-Massenspektraldaten vergleicht bzw. bewertet.

(a) determines, selects or considers one or more modifications of interest;
(b) enumerated by one or more combinations of modifications of interest;
(c) calculating the mass or mass-to-charge ratio of one or more combinations of modifications of interest;
(d) the calculated mass or mass-to-charge ratio of one of the combinations of modifications of interest subtracted from the experimentally determined mass or the experimentally determined mass-to-charge ratio of a peptide or peptide ion to determine a theoretical unmodified mass or a theoretical unmodified mass Mass-to-charge ratio that would have a peptide or a peptide ion, the protein from which the peptide or peptide ion is derived would not have been modified;
(e) searching the database of peptides using the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified mass-to-charge ratio to output a first list of peptides;
(f) removing peptides from the first list of peptides that are incapable of supporting the combination of modifications of interest to produce a selection list of peptides; and
(g) compares peptides in the selection list of peptides against fragmentation mass spectral data.

Das bevorzugte Verfahren zur Identifizierung eines modifizierten Proteins beinhaltet das direkte Suchen bezüglich einer indexierten vordigestierten unmodifizierten Peptiddatenbank bzw. einer Datenbank für indexierte vordigestierte unmodifizierte Peptide. Herkömmlicherweise wurde es nicht als möglich angesehen, Peptiddaten bezüglich eines post-translational modifizierten Proteins direkt gegen eine Peptidatenbank bezüglich unmodifizierter Proteine zu durchsu chen. Die bevorzugte Ausführungsform zeigt jedoch, dass diese Annahme nicht korrekt ist.The preferred method for identifying a modified protein involves direct searching for an indexed predefined unmodified Peptide database or a database for indexed predigested ones unmodified peptides. traditionally, it was not considered possible Peptide Data Re a post-translational modified protein directly against a peptide database with respect to unmodified To search proteins. However, the preferred embodiment shows that this assumption is incorrect.

Vorteilhafterweise erlaubt die bevorzugte Ausführungsform eine beliebige Zahl variabler (zufälliger) Modifikationen zu betrachten bzw. in Erwägung zu ziehen und ist somit genau so leistungsstark wie herkömmliche Ansätze. Da jedoch die bevorzugte Ausführungsform nicht das laufende theoretische Digestieren von Proteinen, die in einer Proteindatenbank aufgelistet sind, beinhaltet, und anschließend ein Indexieren dieser Proteine, ist sie wesentlich schneller.advantageously, allows the preferred embodiment to consider any number of variable (random) modifications or in consideration pull and is thus just as powerful as conventional Approaches. However, since the preferred embodiment not the ongoing theoretical digesting of proteins that occur in a protein database, includes, and then a Indexing these proteins, it is much faster.

Ein wichtiger Aspekt der bevorzugten Ausführungsform ist, das die Masse oder das Masse-Ladungs-Verhältnis eines experimentell beobachteten Peptids geändert, umgekehrt oder anderweitig „entmodifiziert" wird, um der Wirkung, die eine bestimmte post-translationale Modifikation auf die Masse des Peptids hat, entgegenzuwirken. Die Mehrzahl der posttranslationalen Modifikationen von Interesse haben die Wirkung der Zunahme bzw. Vergrößerung der Masse oder des Masse-Ladungs-Verhältnisses des Proteins und somit wird die Masse oder das Masse-Ladungs-Verhältnis verschiedener Peptide, die von dem Protein abgeleitet sind, ebenfalls erhöht werden. Eine Ausnahme hierzu ist die Dehydrierung, die den Effekt der Reduzierung der Masse oder des Masse-Ladungs-Verhältnisses eines Proteins hat.An important aspect of the preferred embodiment is that the mass or mass-to-charge ratio of an experimentally observed peptide is changed, reversed, or otherwise "de-modified" to reduce the effect that a particular post-translational modification has on the bulk of the peptide. The majority of the post-translational modifications of interest have the effect of increasing or increasing the mass or mass-to-charge ratio of the protein, and thus the mass or mass-to-charge ratio of various peptides derived from the protein becomes one exception is dehydration, which has the effect of reducing the mass or mass-to-charge ratio of a protein.

Der Schritt des Entgegenwirkens, der Umkehr oder der Negierung der Wirkung einer post-translationalen Modifikation beinhaltet die Bestimmung der Masse oder des Masse-Ladungs-Verhältnisses, die ein experimentell gemessenes Peptid hätte, wäre das korrespondierende Protein, von dem das Peptid abgeleitet ist, nicht einer post-translationalen Modifika tion unterzogen worden. Die bevorzugte Ausführungsform nimmt daher an, dass variable oder zufällige bzw. beliebige Modifikationen dem Protei n widerfahren sind (und somit die resultierenden Peptide beeinflußt haben), und durchsucht eine herkömmliche indexierte vordigestierte Peptiddatenbank unmodifizierter Peptide unter Verwendung der kalkulierten bzw. berechneten Masse oder des berechneten Masse-Ladungs-Vehältnisses des unmodifizierten Peptids, d. h. mit den Effekten möglicher Modifikationen umgekehrt.Of the Step of opposing, reversing or negating the effect a post-translational modification involves the determination mass or mass-to-charge ratio, which would have an experimentally measured peptide, would be the corresponding protein, from which the peptide is derived, not a post-translational one Modification been subjected. The preferred embodiment therefore assumes that variable or random or any modifications the protein (and thus the resulting peptides) affected have) and searches a conventional one indexed predicted peptide database of unmodified peptides using the calculated or calculated mass or calculated mass-charge ratio of the unmodified peptide, d. H. with the effects of possible modifications vice versa.

Zur Verminderung der Gesamtsuchzeiten so weit wie möglich filtert die bevorzugte Ausführungsform mögliche Peptide (d. h. Peptide, die in der Peptiddatenbank gelistet sind, die eine Masse oder ein Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen, das der Masse oder dem Masse-Ladungs-Verhältnis der experimentell beobachteten Peptide wie anschließend entmodifiziert entspricht) mit hoher Geschwindigkeit. Dies ermöglicht, dass Peptide, die in der Peptiddatenbank aufgelistet sind und die korrekte Masse oder das korrekte Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen, die jedoch nicht tatsächlich die Modifikationen von Interesse unterstützen können, ausgeschlossen oder entfernt werden. Dies gewährleistet, dass diejenigen in der Auswahlliste enthaltenen Peptide, die das Filterungsverfahren passieren, geeignete modifizierbare Positionen aufweisen, auf die die Modifikationen von Interesse gewirkt haben können. Auf diese Weise kann die bevorzugte Ausführungsform schnell diejenigen Peptide bestimmen, die dann als mögliche Übereinstimmungen bzw. Zuordnungen für die experimentellen Peptiddaten betrachtet werden sollten.to Reduction of the total search times as far as possible filters the preferred one embodiment possible Peptides (i.e., peptides listed in the peptide database, which have a mass or mass-to-charge ratio that of the mass or the mass-to-charge ratio of the experimentally observed peptides as subsequently de-modified corresponds) at high speed. This allows for peptides that are in of the peptide database are listed and the correct mass or that have correct mass-to-charge ratio, the but not actually which may support modifications of interest, excluded or removed become. This ensures those contained in the selection list peptides containing the Filtering processes happen, suitable modifiable positions exhibited by the modifications of interest can. In this way, the preferred embodiment can quickly do those Peptides are then determined as possible matches or mappings for the experimental peptide data should be considered.

Sobald Peptide zur Erzeugung einer Auswahlliste möglicher Peptide gefiltert sind, werden diese möglichen Peptide in einer zweiten Charakterisierungsstufe analysiert und mit den experimentellen Daten verglichen bzw. bezüglich dieser bewertet. Herkömmlicherweise wurde für jedes experimentell beobachtete Peptid, das zu analysieren war, ein theoretischer Digest eines oder mehrerer Proteine, die in einer Proteindatenbank aufgelistet sind, durchgeführt. Die Zeit für einen theoretischen Digest von Proteinen, die in einer Proteindatenbank aufgelistet sind, kann einen Großteil zur Gesamtsuchzeit beitragen, obwohl effiziente Algorithmen bekannt sind zur Bestimmung der Digestprodukte eines Proteins. Ferner muß jedes Protein, das durch die theoretische Digestierung eines Proteins erzeugt wird, dann durch Anwendung von Kombinationen von vom Benutzer ausgewählten beliebigen Modifizierern (wenn irgendwelche hiervon angewendet werden können) auf ein gegebenes Peptid verarbeitet bzw. prozessiert werden, und dann die Modifikation(en) unter allen unterschiedlichen möglichen modifizierbaren Positionen auf dem fraglichen Peptidkern mutiert werden. Dies ist rechnerzeitaufwendig und trägt zu langsamen Gesamtsuchzeiten bei, die charakteristisch sind für herkömmliche Verfahren zur Identifizierung post-translational modifizierter Proteine.As soon as Peptides are filtered to produce a selection list of possible peptides, become these possible Analyzed peptides in a second characterization stage and compared or compared with the experimental data rated. traditionally, was for every experimentally observed peptide to analyze a theoretical digest of one or more proteins in one Protein database are listed performed. The time for one theoretical digest of proteins in a protein database can contribute much to the overall search time, though efficient algorithms are known for determining the digestion products a protein. Furthermore, each must Protein, by the theoretical digestion of a protein then by using combinations of user-selected ones Modifiers (if any of them can be applied) a given peptide is processed, and then the modification (s) among all different possible ones modifiable positions on the peptide core in question become. This is computer time consuming and contributes to slow overall search times at, which are characteristic for conventional Method for identifying post-translationally modified proteins.

Das bevorzugte Verfahren zur Identifizierung eines modifizierten Proteins weist zwei wichtige Vorteile über die herkömmlichen Ansätze auf. Erstens ist es gemäß der bevorzugten Ausführungsform nicht notwendig, ein in einer Proteindatenbank enthaltenes bzw. aufgelistetes Protein theoretisch zu digestieren oder die Peptidliste zu indexieren, wodurch diese relativ zeitaufwendigen Schritte vermieden werden können. Zweitens kann die Anzahl von möglichen Peptiden, die charakterisiert werden müssen, in schneller Weise reduziert oder anderweitig beschränkt werden.The preferred method for identifying a modified protein has two important advantages the conventional ones approaches on. First, it is according to the preferred one embodiment not necessary, one contained in a protein database or to theoretically digest the listed protein or the peptide list indexing, thus avoiding these relatively time-consuming steps can be. Second, the number of possible peptides, that need to be characterized be quickly reduced or otherwise limited.

Obwohl nicht wesentlich für die vorliegende Erfindung, ist die bevorzugte Ausführungsform insbesondere vorteilhaft, wenn genaue Massenspektraldaten verwendet werden. Dies ist beispielsweise durch Verwendung eines Hybridquadrupol-Flugzeit-Massenspektrometers möglich, und ermöglicht signifikant schnellere Gesamtsuchzeiten. Beispielsweise können typische Suchzeiten gemäß der bevorzugten Ausführungsform wenigstens acht Mal schneller als herkömmliche Suchen sein, wenn genaue Massenspektraldaten verwendet werden. Die Verwendung genauer Massenspektraldaten ermöglicht, dass die Peptidfilterung besonders wirksam ist bei der Reduzierung der Anzahl möglicher Peptide, die dann betrachtet oder charakterisiert werden müssen.Even though not essential for the present invention is the preferred embodiment particularly advantageous when using accurate mass spectral data become. This is for example by using a hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometer possible, and allows significantly faster overall search times. For example, typical Search times according to the preferred embodiment be at least eight times faster than conventional searches, if accurate Mass spectral data can be used. The use of accurate mass spectral data allows that peptide filtering is particularly effective at reducing the number of possible Peptides that must then be considered or characterized.

Verschiedene Ausführungsformen der Erfindung werden nun, rein beispielhaft, und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, beschrieben.Various embodiments The invention will now be described, by way of example only, and with reference on the attached Drawings, described.

1 zeigt eine Anzahl verschiedener möglicher posttranslationaler Modifikationen, die ein Protein betreffen können, wobei die Massenänderung aus einer derartigen Modifikation resultiert und die Peptidposition, auf die derartige Modifikationen anwendbar sind; 1 Figure 4 shows a number of different possible post-translational modifications which may involve a protein, the mass change resulting from such modification and the peptide position to which such modifications are applicable;

2 zeigt die gemäß der bevorzugten Ausführungsform unternommenen Schritte in einer ersten Stufe, die die Unmodifizierung bzw. Entmodifizierung der Masse oder des Masse-Ladungs-Verhältnisses experimentell beobachteter Peptide, die Durchsuchung einer Peptiddatenbank nach Peptiden, die der Masse oder dem Masse-Ladungs-Verhältnis des unmodifizierten bzw. entmodifizierten Peptids bis hin zu einer vorgegebenen Toleranz entsprechen und dann die Filterung mög licher Peptide zum Ausschließen von Peptiden, die nicht in der Lage sind, die Modifikationen von Interesse zu unterstützen, zur Erzeugung einer Auswahlliste von möglichen Peptiden, die sowohl die korrekte Masse oder das korrekte Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen und die auch theoretisch die Modifikation en) von Interesse unterstützen, umfaßt; 2 shows the steps taken according to the preferred embodiment in a first stage, the unmodification or de-modification of the mass or the mass-charge ratio This experimentally observed peptides, the screening of a peptide database for peptides, which correspond to the mass or mass-to-charge ratio of the unmodified or demodified peptide to a predetermined tolerance and then the filtering of possible peptides to exclude peptides that are not in capable of supporting the modifications of interest, for generating a selection list of possible peptides having both the correct mass or mass-to-charge ratio and which also theoretically support the modification (s) of interest;

3 zeigt die nachfolgenden Schritte, die gemäß einer bevorzugten Ausführungsform in einer zweiten Stufe unternommen werden, wobei Peptide, die in einer vorangehenden Filterungsstufe in einer Auswahlliste aufgenommen worden sind, mit experimentellen Fragmentationsdaten verglichen werden bzw. bezüglich dieser bewertet werden; 3 Figure 12 shows the subsequent steps taken in a second stage according to a preferred embodiment wherein peptides taken in a selection list in a previous filtering stage are compared with experimental fragmentation data;

4 zeigt eine Anzahl von Kombinationen und Binärsuchen, die durchgeführt werden, wenn 168 Peptide analysiert wurden und unterschiedliche Anzahlen an Modifikationen und modifizierbaren Positionen in Betracht gezogen wurden; 4 Figure 4 shows a number of combinations and binary searches performed when 168 peptides were analyzed and different numbers of modifications and modifiable positions were considered;

5 zeigt in größeren Einzelheiten die Anzahl der gefilterten und anschließend charakterisierten Peptide und die assoziierten Zeiten, die zur Filterung, zum Permutieren und zum Vergleichen bzw. Bewerten der Peptide mit experimentellen Daten bei Betrachtung von zwei Modifikationen benötigt wurde; 5 shows in greater detail the number of peptides filtered and subsequently characterized and the associated times needed to filter, permute and compare the experimental data peptides when considering two modifications;

6 zeigt in größeren Einzelheiten die Anzahl von Peptiden, die gefiltert und anschließend charakterisiert wurden, sowie die assoziierte Zeit, die zur Filterung, zur Permutierung und zum Vergleichen der Peptide mit experimentellen Daten bei Betrachtung von vier Modifikationen benötigt wurde; und 6 shows in greater detail the number of peptides that were filtered and subsequently characterized, and the associated time required for filtering, permuting, and comparing the peptides with experimental data when considering four modifications; and

7 zeigt Vergleichsergebnisse für herkömmliche Suchzeiten mit Suchzeiten, die gemäß der bevorzugten Ausführungsform erzielt wurden und verdeutlicht die Verbesserung in der Gesamtsuchzeit, die gemäß der bevorzugten Ausführungsform erzielbar ist. 7 shows comparison results for conventional seek times with seek times achieved in accordance with the preferred embodiment and illustrates the improvement in overall search time achievable in accordance with the preferred embodiment.

Die schnelle Identifikation von Proteinen unter Verwendung von Massenspektraldaten und Proteindatenbanken ist nun eine Standardtechnik im proteomischen Arbeiten. Mit der Entwicklung dieses Forschungsgebietes ist die Fähigkeit, Proteine zu charakterisieren, und insbesondere die Fähigkeit, die Anwesenheit und die Position irgendwelcher post-translationaler Modifikationen des Proteins zu bestimmen immer wichtiger geworden. Die bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Identifizierung post-translationale modifizierter Proteine in schnellerer Weise, als dies mit herkömmlichen Techniken möglich war.The rapid identification of proteins using mass spectral data and protein databases is now a standard proteomic technique Work. With the development of this research area is the Ability, To characterize proteins, and in particular the ability to the presence and position of any post-translational Modifying the protein has become increasingly important. The preferred embodiment relates to a method for identifying post-translational modified Proteins in a faster way than was possible with conventional techniques.

1 zeigt eine Liste post-translationaler Modifikationen, die ein Protein beeinflussen können, sowie die Peptidpositionen oder Reste, auf welche derartige Modifikationen anwendbar sind. Die Figur zeigt auch die resultierende Veränderung (normalerweise Zunahme) der Masse des Proteins, die durch die Modifikation verursacht ist. 1 Figure 12 shows a list of post-translational modifications that may affect a protein, as well as the peptide positions or residues to which such modifications are applicable. The figure also shows the resulting change (normally increase) in the mass of the protein caused by the modification.

Es ist bekannt, Peptide, die von der Digestierung eines Proteins abgeleitet sind, einer Fragmentation in einer kollisions- oder Fragmentationszelle eines Massenspektrometers zu unterziehen. Die resultierenden Fragmentations- oder MS/MS-Massenspektraldaten können dann analysiert werden durch Suchen bzw. Durchsuchen bezüglich Daten, die in einer Datenbank enthalten sind, oder bezüglich Daten, die von in einer Datenbank enthaltenen Daten abgeleitet sind. Eine oder mehrere variable Modifikationen können während einer derartigen Suche ausgewählt und in Erwägung gezogen werden.It It is known to derive peptides derived from the digestion of a protein are, a fragmentation in a collision or fragmentation cell to undergo a mass spectrometer. The resulting fragmentation or MS / MS mass spectral data then analyzed by searching or searching for data, that are contained in a database, or data that is contained in a database Database data are derived. One or more variable Modifications can while selected such a search and considering to be pulled.

Es wurde jedoch nicht als praktisch möglich erachtet, nach modifizierten Peptiden unter Verwendung einer herkömmlichen vordigestierten Peptiddatenbank, die lediglich unmodifizierte Peptide auflistet, zu suchen. Zur Ermöglichung der Durchführung einer derartigen Suche wurde angenommen, dass die Peptiddatenbank sämtliche möglichen potentiellen Kombinationen von Modifikationen und ihrer Permutationen auf einem Peptid ermöglichen bzw. beinhalten müsse. Als Ergebnis wurde angenommen, dass die Peptiddatenbank stark erweitert werden müßte, mit dem Ergebnis, dass die Datenbank dann so groß und unpraktisch bei der Suche würde, d. h. Suchzeiten sehr langsam bzw. lange dauern würden.It however, was not considered practicable after modified Peptides using a conventional predicted peptide database, which lists only unmodified peptides. To enable the implementation Such a search was assumed to be the peptide database all potential potential combinations of modifications and their permutations enable on a peptide or must include. As a result, it was considered that the peptide database greatly expanded would have to, with The result is that the database will be so large and impractical when searching would, d. H. Search times would be very slow or long.

Aus diesem Grunde bestand der herkömmliche Ansatz darin, nicht zu versuchen, vordigestierte Peptiddatenbanken zu verwenden, sondern vielmehr mit der Verwendung einer Proteindatenbank zu beginnen und dann laufend Proteine, die in der Proteindatenbank gelistet sind, theoretisch zu digestieren. Anschließend können variable Modifikationen auf die Peptide, die bestimmt sind als aus dem Digestierungsprozeß resultierend, angewendet werden. Die resultierenden theoretisch modifizierten Peptide können dann mit den realen experimentellen Peptiddaten verglichen werden. Insbesondere können ausgewählte Peptide in einer Fragmentationszelle eines Massenspektrometers fragmentiert werden und die resultierenden Fragmentationsmassenspektraldaten mit theoretischen Fragmentationsdaten, die durch theoretische Fragmentierung von Peptiden resultierend aus der theoretischen Digestierung eines Proteins, das in der Proteindatenbank aufgelistet ist, verglichen werden. Gemäß diesem herkömmlichen Ansatz wird jedes Protein in der Proteindatenbank nacheinander digestiert, und das Verfahren bzw. der Prozeß wird dann wiederholt.For this reason, the conventional approach has been to not attempt to use pre-established peptide databases, but rather to begin using a protein database and then to theoretically digester proteins listed in the protein database. Subsequently, variable modifications may be applied to the peptides which are determined to result from the digestion process. The resulting theoretically modified peptides can then be compared to the real experimental peptide data. In particular, selected peptides may be fragmented in a fragmentation cell of a mass spectrometer, and the resulting fragmentation mass spectral data compared to theoretical fragmentation data, as compared to theoretical fragmentation of peptides resulting from the theoretical digestion of a protein listed in the protein database. According to this conventional approach, each protein will be in the protein database digested and the process is then repeated.

Im Gegensatz zu dem herkömmlichen Ansatz verwendet die bevorzugte Ausführungsform eine indexierte vordigestierte unmodifizierte Peptiddatenbank bei der Suche bezüglich Peptiden, die von einem Protein abgeleitet sind, von dem angenommen wird, dass es post-translational modifiziert wurde. Ein derartiger Ansatz vermeidet daher die Notwendigkeit der laufenden Digestierung von Proteinen, die in einer Proteindatenbank aufgelistet sind. Variable Modifikationssuchen können nach wir vor relativ schnell ausgeführt werden. Gemäß dem bevorzugten Verfahren ermöglichen genaue Massenspektraldaten, die beispielsweise von einem Quadropol-Flugzeit-Massenspektrometer erhalten sind, die Implementierung eines Hochgeschwindigkeitspeptidfilters. Dies ermöglicht eine signifikante Reduzierung von Suchzeiten und schnellere Möglichkeiten der Proteincharakterisierung.in the Unlike the conventional one Approach, the preferred embodiment uses an indexed predigested unmodified peptide database in the search for peptides, that are derived from a protein that is thought to be that it has been post-translationally modified. Such an approach avoids the need for ongoing digestion of Proteins listed in a protein database. variable Modification searches can after we are done relatively quickly. According to the preferred Allow procedure accurate mass spectral data obtained, for example, from a quadrupole time-of-flight mass spectrometer the implementation of a high speed peptide filter. this makes possible a significant reduction in search times and faster options of protein characterization.

Die unmodifizierten Peptide, die in der Peptiddatenbank aufgelistet sind, gegen die gesucht wird, bzw. mit der verglichen wird, sind vorzugsweise in der Reihenfolge der monoisotopischen Masse angeordnet, um die Datenbanksuche zu erleichtern. Es ist wichtig, dass die bevorzugte Ausführungsform die Suche unmittelbar gegen bzw. bezüglich unmodifizierter Peptide, die in der Peptiddatenbank gespeichert sind, beinhaltet. Daher ist es nicht notwendig, zu versuche, vielfache Eintragungen pro Peptid in der Peptiddatenbank anzustreben, um zahlreiche verschiedene mögliche Modifikationen, die in Betracht zu ziehen sind, abzudecken. Die Verwendung einer Datenbank vordigestierter unmodifizierter Peptide vereinfacht den Suchprozess signifikant.The unmodified peptides listed in the peptide database are against whom is being sought, or compared with, are preferably arranged in the order of the monoisotopic mass, to facilitate the database search. It is important that the preferred embodiment the search directly against or with respect to unmodified peptides, which are stored in the peptide database includes. thats why it is not necessary to try multiple entries per peptide in the peptide database to address many different possible modifications, which are to be considered to cover. The use of a database predigested unmodified peptides simplifies the search process significant.

Das Suchen gegen bzw. bezüglich der Datenbank unmodifizierter Peptide umfaßt vorzugsweise zwei hauptsächliche nachfolgende bzw. sequentielle Stufen

– eine erste Filterungsstufe gefolgt von einer zweiten Charakterisierungsstufe.

Searching against the database of unmodified peptides preferably comprises two major sequential steps

A first filtering stage followed by a second characterizing stage.

In der ersten Stufe wird eine erste Liste möglicher Peptide erzeugt. Sämtliche Peptide in dieser ersten Liste haben eine Masse oder ein Masse-Ladungs-Verhältnis, die bzw. das derjenigen bzw. demjenigen des experimentell beobachteten Peptids innerhalb einer benutzerdefinierten Toleranz entspricht (wie unmodifiziert bzw. entmodifiziert gemäß der bevorzugten Ausführungsform). Diese erste Liste wird dann vorzugsweise gefiltert zur Erzeugung einer Auswahlliste möglicher Kandidatpeptide. Dieser Filterungsprozeß beinhaltet die Entfernung sämtlicher Peptide aus der ersten Liste, die nicht in der Lage sind, die Modifikationen von Interesse zu unterstützen. Sämtliche Peptide in der resultierenden Auswahlliste werden daher vorzugsweise Peptidpositionen aufweisen, die die betrachteten bzw. in Erwägung gezogenen Modifikationen unterstützen.In In the first stage, a first list of possible peptides is generated. All Peptides in this first list have a mass or mass-to-charge ratio that or that of or that of the experimentally observed Peptides within a custom tolerance match (such as unmodified or de-modified according to the preferred embodiment). This first list is then preferably filtered for generation a selection list of possible Candidate peptides. This filtering process involves the removal all peptides from the first list, who are unable to make the modifications of interest. All Peptides in the resulting selection list are therefore preferred Having peptide positions, the considered or considered Support modifications.

Peptide in der Auswahlliste der möglichen Peptide werden dann in einer zweiten Stufe, die sich auf die Peptidcharakterisierung bezieht (Identifikation und Lokalisierung der Modifikationen) bearbeitet, und jedes in die Auswahlliste aufgenommene Peptid wird mit Fragmentationsdaten verglichen, die sich auf das experimentell beobachtete Peptid, das analysiert wird, beziehen.peptides in the selection list of possible peptides are then in a second stage, focusing on the peptide characterization relates (identification and localization of modifications) edited, and each peptide included in the selection list is scanned with fragmentation data referring to the experimentally observed peptide, the is analyzed.

Die erste Hochgeschwindigkeitspeptidfilterungsstufe, wie sie gemäß der bevorzugten Ausführungsform implementiert wird, ist in größeren Einzelheiten unter Bezugnahme auf 2 gezeigt und beschrieben.The first high speed peptide filtering stage as implemented according to the preferred embodiment is described in greater detail with reference to FIG 2 shown and described.

Gemäß der bevorzugten Ausführungsform werden nacheinander verschiedene Kombinationen vom Benutzer ausgewählter Modifizierer genommen bzw. verwendet und auf die Daten, die einem experimentell beobachteten Peptid, das analysiert wird, entsprechen, angewendet.According to the preferred Embodiment will be successively different combinations of user selected modifiers taken or used and on the data, an experimental observed peptide, which is analyzed, applied, applied.

Gemäß der bevorzugten Ausführungsform wird angenommen, dass ein experimentell beobachtetes Peptid von einem Protein abgeleitet ist, das posttranslational modifiziert worden ist. Entsprechend wird die Masse oder das Masse-Ladungs-Verhältnis des experimentell beobachteten Peptids angepaßt oder „entmodifiziert", um die eine oder mehreren angenommenen Modifikationen in Erwägung bzw. Betracht zu ziehen. Wenn beispielsweise eine Phosphorylation eines Serins einer der Modifizierter oder einer der Modifikationen von Ineresse ist, wird ein einzelner Phosphorylmodifizierer (H₂PO₃) berücksichtigt, der durch verschiedene Kombinationen enumeriert wurde. Wenn angenommen wird, dass ein experimentell beobachtetes Peptid ein einzelnes phosphorolatiertes Serin trägt, wird dessen Masse als Ergebnis um 79,9663 erhöht worden sein. Entsprechend wird zur Suche bezüglich der Datenbank vordigestierter unmodifizierter Peptide die Masse des experimentell beobachteten Peptids angepaßt oder entmodifiziert, um die Phosphorylation des Proteins zu berücksichtigen, dies durch Subtraktion des Wertes 79,9663 von der experimentell bestimmten Masse.In the preferred embodiment, it is believed that an experimentally observed peptide is derived from a protein that has been post-translationally modified. Accordingly, the mass or mass-to-charge ratio of the experimentally observed peptide is adjusted or "de-modified" to take into account the one or more assumed modifications, for example, when a phosphorylation of a serine is one of the modified or one of the modifications of As a result, a single phosphoryl modifier (H ₂ PO ₃ ) enumerated by different combinations is considered, assuming that an experimentally observed peptide carries a single phosphorolated serine, its mass will have been increased by 79.9663 as a result. Accordingly, to search for the database of predicted unmodified peptides, the mass of the experimentally observed peptide is adjusted or de-modified to account for the phosphorylation of the protein by subtracting the value of 79.9663 from the experimentally determined mass.

Der oben beschriebene Ansatz der Anpassung oder Entmodifizierung der experimentell bestimmten Masse oder des experimentell bestimmten Masse-Ladungs-Verhältnisses und der Su che gegen die Peptiddatenbank unter Verwendung der angepaßten oder un- bzw. entmodifizierten Peptidmasse bzw. des angepaßten oder unmodifizierten Masse-Ladungs-Verhältnisses ist ein wichtiger Aspekt der bevorzugten Ausführungsform. Dieser Ansatz ermöglicht dann die Durchführung einer Suche bezüglich bzw. gegen eine herkömmliche indexierte vordigestierte Peptiddatenbank, wobei hier variable Modifikationen berücksichtigt werden können. Nach Änderung der Masse oder des Masse-Ladungs-Verhältnisses des experimentell beobachteten Peptids zur Berücksichtigung einer oder mehrerer angenommener Modifikationen kann die indexierte Peptiddatenbank nun unter Verwendung der neuen (unmodifizierten bzw. entmodifizierten) theoretischen Masse des Peptids durchsucht werden. Die Ausgabe einer derartigen Suche der Peptiddatenbank wird eine erste Liste von möglichen Peptiden umfassen, die eine Masse oder ein Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen, das derjenigen bzw. demjenigen des experimentell beobachteten Peptids innerhalb gewisser Toleranzen entspricht (wie entmodifiziert gemäß der bevorzugten Ausführungsform). Diese erste Liste von Peptiden wird dann vorzugsweise gefiltert, um eine Auswahlliste von Kandidatpeptiden bereitzustellen. Sämtliche Peptide in dieser Auswahlliste werden die gewünschte Kombination von Modifizierern unterstützen. Mit anderen Worten wird die Auswahlliste möglicher Peptide eine Liste von Peptiden umfassen, die alle wenigstens die korrekte Anzahl von modifizierbaren Positionen aufweisen, und wobei die modifizierbaren Positionen vom korrekten Typ sein werden. Um mit dem obigen Beispiel, das sich auf einen einzelnen Phosphorylmodifizierer bezieht, fortzufahren, werden nach der Filterungsstufe die Peptide in der Auswahlliste möglicher Peptide alle wenigstens einen Serinrest aufweisen, und werden auch eine Masse oder ein Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen, die bzw. das im Wesent lichen derjenigen bzw. demjenigen des beobachteten Peptids entspricht (unmodifiziert bzw. entmodifiziert gemäß der bevorzugten Ausführungsform).The approach described above of adapting or de-modifying the experimentally determined mass or the experimentally determined mass-to-charge ratio and the search against the peptide database using the matched or unmodified peptide mass or the adapted or unmodified mass-to-charge ratio is an important aspect of the preferred embodiment. This approach then allows you to conduct a search or against a conventional indexed predigested peptide database, where variable modifications can be taken into account. After changing the mass or mass-to-charge ratio of the experimentally observed peptide to account for one or more assumed modifications, the indexed peptide database can now be searched using the new (unmodified or de-modified) theoretical mass of the peptide. The output of such a peptide database search will include a first list of possible peptides having a mass or mass-to-charge ratio corresponding to that of the experimentally observed peptide within certain tolerances (as de-modified according to the preferred embodiment). This first list of peptides is then preferably filtered to provide a selection list of candidate peptides. All peptides in this selection list will support the desired combination of modifiers. In other words, the candidate peptide selection list will comprise a list of peptides, all of which have at least the correct number of modifiable positions, and wherein the modifiable positions will be of the correct type. To proceed with the above example relating to a single phosphoryl modifier, after the filtering step, the peptides in the selection list of possible peptides will all have at least one serine residue, and will also have a mass or mass-to-charge ratio which that substantially corresponds to that of the observed peptide (unmodified or de-modified according to the preferred embodiment).

Da die Peptiddaten in der Peptiddatenbank vorzugsweise sortiert oder angeordnet entsprechend ihrer Masse sind, können sämtliche möglichen Peptide, die ähnliche Massen oder Masse-Ladungs-Verhältnisse zu der Masse bzw. zum Masse-Ladungs-Verhältnis eines experimentell beobachteten Peptids (un- bzw. entmodifiziert gemäß der bevorzugten Ausführungsform) aufweisen, unter Verwendung zweier Binärsuchen aus der Peptiddatenbank erhalten werden. Die zwei Binärsuchen entsprechen der Masse oder dem Masse-Ladungs-Verhältnis der unmodifizierten Peptide zuzüglich oder abzüglich der benutzerdefinierten Toleranz in Massen- oder Masse-Ladungs-Verhältnis-Einheiten. Eine derartige Binärsuche wird daher obere und untere Grenzpeptide ergeben, zwischen denen sämtliche Peptide, die in der Peptiddatenbank aufgelistet sind, der Masse oder dem Masse-Ladungs-Verhältnis des experimentell beobachteten Peptids (wie gemäß der bevorzugten Ausführungsform un- bzw. entmodifiziert) innerhalb einer gewissen Toleranz entsprechen.There preferably sorts the peptide data in the peptide database or are arranged according to their mass, all possible peptides, the similar Masses or mass-to-charge ratios to the mass or mass-to-charge ratio of a experimentally observed peptide (unmodified or de-modified according to the preferred embodiment) obtained using two binary searches from the peptide database become. The two binary searches correspond to the mass or the mass-to-charge ratio of the unmodified Peptides plus or less the user-defined tolerance in mass or mass-to-charge ratio units. Such a binary search will therefore give upper and lower border peptides between which all Peptides listed in the peptide database, bulk or the mass-to-charge ratio of the experimentally observed peptide (as in the preferred embodiment unmodified or de-modified) within a certain tolerance.

Durch genaue Messung des Masse-Ladungs-Verhältnisses von Ionen unter Verwendung beispielsweise eines Quadropol-Flugzeit-Massenspektrometers kann die Anzahl möglicher Peptide, die aus den zwei binären Suchen resultiert, vorteilhaft so klein wie möglich gehalten werden, da die benutzerdefinierte Toleranz klein gehalten werden kann. Diese erste Liste kann dann unmittelbar auf eine Auswahlliste verkürzt werden, da viele der Peptide, die der Masse oder dem Masse Masse-Ladungs-Verhältnis des experimentell beobachteten Peptids (un- bzw. entmodifiziert gemäß der bevorzugten Aus führungsform) die aktuelle Kombination von Modifizierern nicht tatsächlich unterstützen werden, d. h. die Peptide werden die angemessene(n) bzw. geeignete(n) Modifizierbaren Position(en) nicht beinhalten.By accurate measurement of the mass-to-charge ratio of ions using, for example of a quadrupole time-of-flight mass spectrometer can the number of possible Peptides coming from the two binary ones Search results are advantageously kept as small as possible as the custom tolerance can be kept small. This first List can then be shortened immediately to a selection list, as many of the peptides that the mass or mass mass-to-charge ratio of experimentally observed peptide (unmodified or de-modified according to the preferred Out of execution form) will not actually support the current combination of modifiers, d. H. the peptides become the appropriate (s) modifiable Do not include position (s).

Die indexierte Peptiddatenbank, gegen die bzw. bezüglich der bevorzugt gesucht wird, besteht aus einer linearen Anordnung von Aufzeichnungen. Jede Aufzeichnung besteht vorzugsweise aus einer Anzahl von Feldern, die Proteinindexinformationen (d. h. Informationen, die das Peptid mit einem korrespondierenden Protein in einer Proteindatenbank in Verbindung bringen) zusammen mit Einzelheiten der genauen monoisotonischen Masse oder des monoisotonischen Masse-Ladungs-Verhältnisses beinhalten kann. Jeder Peptideintrag umfaßt ferner bevorzugt Informationen bezüglich der Länge und der Position des Peptids innerhalb der bestimmten Proteinsequenz.The indexed peptide database against which or preferred to be sought is, consists of a linear array of records. each Record preferably consists of a number of fields, the protein index information (i.e., information that the peptide with a corresponding protein in a protein database bring) together with details of the exact monoisotonic Mass or monoisotonic mass-to-charge ratio. Everyone Includes peptide entry furthermore, information regarding the length and position of the peptide is preferred within the particular protein sequence.

Die Peptidaufzeichnungen, die in der Peptiddatenbank gespeichert sind, werden bevorzugt in der Reihe bzw. Ordnung der Masse oder des Masse-Ladungs-Verhältnisses sortiert und angeordnet. Daher ist es zum Auffinden von Peptiden, die eine bestimmte Masse oder ein bestimmtes Masse-Ladungs-Verhältnis innerhalb einer benutzerdefinierten Toleranz aufweisen, lediglich notwendig, eine Binärsuche durchzuführen, um obere und untere Grenzen innerhalb der Peptiddatenbank zu finden.The Peptide records stored in the peptide database, are preferred in the order of mass or mass-to-charge ratio sorted and arranged. Therefore, it is for finding peptides, the one particular mass or mass-to-charge ratio within have a custom tolerance, only necessary perform a binary search to find upper and lower bounds within the peptide database.

Wenn es notwendig ist, eine Anzahl von Digests zu unterstützen, kann ein zusätzliches Integerfeld in jeder Peptidaufzeichnung enthalten sein. Jedes Bit in dem zusätzlichen Integerfeld kann als Kennzeichen zur Anzeige, dass ein gegebenes Peptid ein Produkt eines gegebenen Digests ist, verwendet werden. Zusätzliche Felder können auch eine Digestwahrscheinlichkeit, die in einem Protein-Bewertungs- bzw. -Vergleichsschema enthalten ist, umfassen.If it may be necessary to support a number of digests an additional Integer field may be included in each peptide record. Every bit in the additional Integer field can be used as a flag to indicate that a given Peptide is a product of a given digest. additional Fields can also a digest probability, in a protein scoring scheme is included.

Das bevorzugte Suchverfahren kann implementiert werden unter Verwendung eines Software-Codes, der beispielsweise unter Verwendung einer C/C++ Programmiersprache geschrieben ist und zum Ablauf auf einer Microsoft Windows XP (RTM) Plattform unter Verwendung von Microsoft Visual Studio (RTM) Version 6.0, kompiliert ist. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform kann eine indexierte Peptiddatenbank auf der Grundlage eines tryptischen Digestes eines Proteins erzeugt und in den Hauptspeicher eines Computers geladen werden. Die Peptiddatenbank kann dann durchsucht bzw. gegengesucht werden, wobei mögliche Peptide zunächst gefiltert und dann in eine Auswahlliste aufgenommene Peptide gemäß der bevorzugten Ausführungsform charakterisiert werden.The preferred search method may be implemented using software code written using, for example, a C / C ++ programming language and compiled to run on a Microsoft Windows XP (RTM) platform using Microsoft Visual Studio (RTM) version 6.0 , According to the In a preferred embodiment, an indexed peptide database can be generated based on a tryptic digest of a protein and loaded into the main memory of a computer. The peptide database can then be searched, with possible peptides first filtered and then populated into a selection list peptides according to the preferred embodiment.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann ein etwas anderes Indexierungsschema verwendet werden, wobei zwei Indexfiles erzeugt werden. Eines der Indexfiles enthält lediglich Details bzw. Einzelheiten der genauen monoisotopischen Masse oder des genauen monoisotopischen Masse-Ladungs-Verhältnisses der Peptide zusammen mit einer Peptidindexinformation, die auf ein entsprechendes bzw. korrespondierendes zweites File zeigt. Das zweite File kann weitere Informationen bezüglich der Peptide enthalten, d. h. Proteinindexinformationen und Informationen bezüglich der Länge und Position der Peptide innerhalb bestimmter Proteinsequenzen.According to one another embodiment a slightly different indexing scheme can be used, with two Index files are generated. One of the index files contains only Details or details of the exact monoisotopic mass or the exact monoisotopic mass-to-charge ratio the peptides together with a peptide index information based on a corresponding or corresponding second file shows. The second File may contain further information regarding the peptides, d. H. Protein index information and information regarding the Length and Position of the peptides within certain protein sequences.

Die bevorzugte Ausführungsform behandelt individuell tryptische Peptide, die mehrmals auftreten (in der gleichen oder in unterschiedlichen Proteineinträgen) so dass die indexierte Peptiddatenbank viele Kopien des gleichen Peptids (insbesondere für kleine Peptide) enthalten kann. Vorzugsweise kann ein gemeinsames Speichermodell bzw. Shared-Memory-Modell verwendet werden, so dass nur eine einzige Kopie der Datenbank in dem Speicher des Verarbeitungssystems aufrechterhalten wird.The preferred embodiment treats individually tryptic peptides that occur multiple times (in the same or different protein entries) that the indexed peptide database many copies of the same peptide (especially for small peptides). Preferably, a common Memory model or shared memory model be used so that only a single copy of the database in the memory of the processing system is maintained.

Gemäß einer Ausführungsform kann ein Mechanismus zur Behandlung einer Anzahl von Digesten bzw. multipler Digeste implementiert werden. Die Peptidaufzeichnung kann beipielsweise ein Kennzeichen bzw. Flag enthalten, dass die Anzahl von verpaßten oder unberücksichtigten Spaltprodukten bzw. Spaltungen, die mit dem Peptid assoziiert sind, enthält. Unter Bezugnahme auf 2 wird der Vorgang der Peptidfilterung, wie er vorzugsweise implementiert ist, nun in näheren Einzelheiten beschrieben. Zunächst werden sämtliche Kombinationen von benutzerausgewählten Modifizierern vorzugsweise enumeriert bzw. abgezählt. Ein Standardalgorithmus zum Enumerieren durch sämtliche Kombinationen kann verwendet werden, wie etwa der durch Tucker in Applied Combinatorics (John Wiley and Sons Inc. 2001) beschriebene. Dies ist ein Prozeß zum Erhalt sämtlicher Kombinationen (unterschiedlicher Größe) mit Wiederholungen. Für eine gegebene Anzahl an Modifizierern n und eine feste Anzahl an modifizierbaren Positionen k ist die Gesamtanzahl von Kombinationen (d. h. die Größe k) gegeben durch Ck = (n + k – 1)!/(n – 1)1k! According to one embodiment, a mechanism for handling a number of digests or multiple digests may be implemented. For example, the peptide record may contain a flag containing the number of missed or disregarded cleavage products or cleavages associated with the peptide. With reference to 2 For example, the process of peptide filtering, as preferably implemented, will now be described in more detail. First, all combinations of user-selected modifiers are preferably enumerated. A standard algorithm for enumerating through all combinations can be used, such as that described by Tucker in Applied Combinatorics (John Wiley and Sons Inc., 2001). This is a process for obtaining all combinations (of different sizes) with repetitions. For a given number of modifiers n and a fixed number of modifiable positions k, the total number of combinations (ie, size k) is given by C k = (n + k - 1)! / (n - 1) 1k!

Da die Anzahl von Positionen unbekannt ist, ist es notwendig, den Bereich modifizierbarer Positionen von 0 bis zu irgendeiner nutzerspezifizierten Maximalanzahl modifizier barer Positionen zu berücksichtigen. Somit ist die Gesamtanzahl an Kombinationen, die berücksichtigt werden muß, pro Suche gegen die experimentellen Daten gegeben durch:

Since the number of positions is unknown, it is necessary to consider the range of modifiable positions from 0 to any user-specified maximum number of modifiable positions. Thus, the total number of combinations to be considered per search against the experimental data is given by:

Für jede dieser Kombinationen wird eine modifizierte Masse oder ein modifiziertes Masse-Ladungs-Verhältnis berechnet und vorzugsweise von der experimentell bestimmten Masse oder dem experimentell bestimmten Masse-Ladungs-Verhältnis jedes zu analysierenden Peptids subtrahiert. Die Anzahl von Binärsuchen B_S der indexierten Peptiddatenbank, die daher durchzuführen ist, beträgt: BS = 2TqCwobei Tq die Gesamtanzahl der Anfragen ist. Eine Faktor 2 wird berücksichtigt, da sowohl eine Suche nach einer oberen Grenze als auch eine Suche nach einer unteren Grenze notwendig sind. Das Durchsuchen der Datenbank verwendet vorzugsweise eine iterative Binärsuche zum Erhalt der oberen und unteren Peptidgrenzen bzw. Grenzpeptide. Diese massebegrenzten Peptide werden dann gefiltert.For each of these combinations, a modified mass or a modified mass to charge ratio is calculated, and preferably subtracted from the experimentally determined mass or the experimentally determined mass to charge ratio of each peptide to be analyzed. The number of binary searches B _{S of} the indexed peptide database to be performed is therefore: B S = 2T q C where Tq is the total number of queries. A factor of 2 is taken into account because both a search for an upper bound and a search for a lower bound are necessary. Searching the database preferably uses an iterative binary search to obtain the upper and lower peptide boundaries. These mass limited peptides are then filtered.

Die Filterungsstufe gewährleistet vorzugsweise, dass alle möglichen Peptide, die dann anschließend charakterisiert werden, wenigstens die korrekte Anzahl an Resten aufweisen, und dass diese Reste von der richtigen Art sind. Die Filterungsstufe umfaßt daher das Zählen der Reste in den möglichen Peptiden und das Vergleichen der möglichen Peptide mit der aktuellen Kombination von Modifizierern. Es ist wichtig, dass Modifizierer nur einen einzigen Rest betreffen, bzw. auf diesen angewendet werden. Bestimmte Modifizierer, die auf mehrere Reste Anwendung finden können (degenerierte Modifizierer) wurden in mehrere nicht degenerierte Modifizierer refaktoriert.The Ensures filtering level preferably that all possible Peptides, which are then added be characterized, at least the correct number of residues and that these residues are of the correct type. The Filtering stage includes therefore the counting the remains in the possible Peptides and comparing the possible peptides with the current one Combination of modifiers. It is important that modifier concern only a single remainder, or be applied to this. Certain modifiers that can be applied to multiple residues (degenerate Modifiers) were transformed into several non-degenerate modifiers refactored.

Entsprechend ermöglicht das Indexieren von Peptiden in der Datenbank zusammen mit der genauen Messung des Masse-Ladungs-Verhältnisses, dass die erste Stufe der Verarbeitung als Hochgeschwindigkeitsfilter dient zur substantiellen Reduzierung der Anzahl von Peptiden, die dann in einer zweiten Stufe charakterisiert werden müssen.Corresponding allows indexing peptides in the database along with the exact ones Measurement of the mass-to-charge ratio that the first stage of processing as a high-speed filter serves to substantially reduce the number of peptides that then have to be characterized in a second stage.

Wenn eine Auswahlliste an Peptiden gebildet ist, wird eine zweite Charakterisierungsstufe dann bezüglich der Auswahlliste der möglichen Peptide durchgeführt. Diese Charakterisierungsstufe ist in näheren Einzelheiten unter Bezugnahme auf 3 dargestellt und beschrieben. Die Charakterisierungsstufe führt mögliche Permutationen der Modifizierer unter modifizierbaren Positionen des Peptides aus und bewertet bzw. vergleicht jede Permutation bezüglich experimentell beobachteter Fragment-Massenspektraldaten(MS/MS).When a selection list of peptides is formed, a second characterization step is then performed on the selection list of possible peptides. This characterization step is described in more detail with reference to 3 shown and described. The characterization stage performs possible permutations of the modifiers under modifiable positions of the peptide and evaluates or compares each permutation for experimentally observed fragment mass spectral data (MS / MS).

Die Charakterisierungsstufe umfaßt eine Anzahl von Schriften. Zunächst wird für jedes in die Auswahlliste aufgenommene oder gefilterte Peptid bestimmt, ob die modifizierbaren Positionen auf dem fraglichen Peptid genau der aktuellen Auswahl von Modifizierern entsprechen. Wenn dies der Fall ist, wird das Peptid bezüglich der experimentell abgeleiteten Fragmentationsdaten oder MS/MS-Daten abgeleitet, wonach das nächste in die Auswahlliste aufgenommene Peptid berücksichtigt wird.The Characterization level includes a number of writings. First is for each peptide included or filtered in the selection list determines whether the modifiable positions on the peptide in question exactly correspond to the current selection of modifiers. If this is the case Case is, the peptide is re the experimentally derived fragmentation data or MS / MS data derived, after which the next considered in the selection list peptide is taken into account.

Wenn jedoch die modifizierbaren Positionen auf dem Peptid nicht genau der aktuellen Auswahl von Modifizierern entsprechen, wird die ausgewählte Kombination von Modifizierern vorzugsweise erneut gruppiert gemäß dem Rest, auf den sich die Modifizierer beziehen. Dann werden alle Kombinationen modifizierbarer Positionen enumeriert bzw. durchgezählt. Modifizierer unter den Positionen werden dann vorzugsweise mit modifizierten Positionen, die permutiert werden, auf eine gruppenweisen Basis permutiert. Dies liegt daran, dass es mehr modifizierbare Positionen auf dem möglichen Peptid geben kann, als es notwendig ist, zu modifizieren. Mit einer so gegebenen Anzahl von Positionen, die modifiziert werden können und der Anzahl der angewendeten Modifizierer werden sämtliche Kombinationen von Positionen, die die angewendeten Modifikationen aufweisen können, ausgewählt.If however, the modifiable positions on the peptide are not accurate corresponding to the current selection of modifiers, becomes the selected combination of modifiers preferably regrouped according to the remainder, to which the modifiers refer. Then all combinations become more modifiable Items enumerated or counted. Modifier among the Positions are then preferably with modified positions, which are permuted, permuted on a group-by-group basis. This is because there are more modifiable positions on the potential Peptide as it is necessary to modify. With a given number of positions that can be modified and the number of modifiers applied will be all Combinations of positions, the modifications applied can have selected.

Zum Zwecke der Verdeutlichung bzw. Darstellung kann das Peptid PGPCCKDKCECAEGGCKT berücksichtigt werden. Es kann beispielsweise bestimmt werden, dass C und K modifiziert werden können, und eine Beschränkung auf bzw. von 4 modifizierbaren Positionen kann eingesetzt werden. Die 8 Positionen, die somit mit ihrem Erscheinen in Reihenfolge modifiziert werden können sind somit CCKKCCCK. Die verschiedenen Möglichkeiten können somit wie folgt enummeriert bzw. aufgezählt werden: (i) CCKK_ (dargestellt in Software durch ein Array der Größe 4 als 0123); (ii) CCK_C_ (dargestellt in Software durch ein Array der Größe 4 als 0124); (iii) CCK_C_ (dargestellt in Software durch ein Array der Größe 4 als 0125); (iv) CCK_C_ (dargestellt in Software durch ein Array der Größe 4 als 0126); (v) CCK_K (dargestellt in Software durch ein Array der Größe 4 als 0127); (vi) CC_KC_ (dargestellt in Software durch ein Array der Größe 4 als 0134) ... u.s.w. Es kann jedoch sein, dass nur eine K-Modifikation und drei C-Modifikationen zugelassen bzw. zulässig sind, was bedeutet, dass einige der oben enummerierten Möglichkeiten, wie etwa (i) verworfen werden können.To the For purposes of illustration, the peptide PGPCCKDKCECAEGGCKT considered become. For example, it can be determined that C and K are modified can be and a restriction on or from 4 modifiable positions can be used. The 8 positions, thus, with their appearance in order can be modified are thus CCKKCCCK. The different possibilities can thus Numbered or enumerated as follows: (i) CCKK_ (shown in software by a size 4 array as 0123); (ii) CCK_C_ (represented in software by a size 4 array as 0124); (iii) CCK_C_ (represented in software by a size 4 array as 0125); (iv) CCK_C_ (represented in software by a size 4 array as 0126); (v) CCK_K (shown in software by a size 4 array as 0127); (vi) CC_KC_ (shown in software by a size 4 array as 0134) ... and so on. It however, it may be that only one K-modification and three C-modifications are permitted or admissible, which means that some of the above enumerated ways such as (i) can be discarded.

Für jede gültige modifizierbare Positionskombination werden dann die Modifizierer vorzugsweise unter den Positionen, auf welche die Modifizierer zutreffen bzw. angewendet werden (auf einer gruppenweisen Basis) permutiert. Wenn somit M1 auf C zutrifft, M2 auf C zutrifft, M3 auf C zutrifft und M4 auf K zutrifft, dann müssen M1, M2 und M3 in allen drei Positionen angewendet werden, und für jede dieser Positionen muß M4 auf K angewendet werden. Dies wird dann für die nächste Enumerierung wiederholt. Algorithmen zur Durchführung derartige Prozesse können standardmäßige lexikographische Algorithmen verwenden, wie etwa die, die beispielsweise in Knuth „The Art of Computer Programming", Band 4 (Pre-Fascicle 2b: Generating all permutations) offenbart sind.For every valid modifiable Position combination then the modifiers are preferably under the positions to which the modifiers apply are permuted (on a group-by-group basis). So if M1 up C holds, M2 applies to C, M3 applies to C, and M4 applies to K, then have to M1, M2 and M3 are applied in all three positions, and for each of them Positions must be M4 be applied to K. This is then repeated for the next enumeration. Algorithms for implementation such processes can standard lexicographic algorithms such as those in Knuth "The Art of Computer Programming ", volume 4 (Pre-Fascicle 2b: Generating all permutations) are disclosed.

Für jede Permutation von Modifizierern wird das permutierte Peptid bezüglich experimentell erhaltener Fragmentations- oder MS/MS-Daten verglichen bzw. bewertet, wonach die nächste Permutation betrachtet wird. Nachdem sämtliche Permutationen betrachtet wurden, wird das nächste in die Auswahlliste aufgenommene Peptid betrachtet.For every permutation of modifiers, the permuted peptide becomes experimental obtained fragmentation or MS / MS data is compared, after which the next permutation is considered becomes. After all Permutations are considered, the next one added to the selection list Peptide considered.

Experimentelle Ergebnisse werden nun präsentiert werden, die die Verbesserung in der Gesamtsuchzeit, die erfindungsgemäß erzielbar ist, illustrieren. Zwei Sätze von Ergebnissen werden präsentiert. Ein Satz wurde bei Betrachtung von nur zwei Modifizierern erhalten, der andere Satz wurde bei Betrachtung bzw. Berücksichtigung von 4 Modifizierern erhalten.experimental Results will now be presented be that the improvement in the total search time, which can be achieved according to the invention is, illustrate. Two sentences of results are presented. One Sentence was obtained by considering only two modifiers, the other sentence was considered considering 4 modifiers receive.

Fünf zufällig bzw. beliebig ausgewählte Proteine wurden berücksichtigt. Diese fünf Proteine umfaßten TCMO_MEDSA; SNC2_YEAST, DAK2_SCHPO, CSPB_BACGO, und FMT_BOVIN. Die Proteine wurden theoretisch unter Verwendung von Trypsin und einer ausgelassenen bzw. verpaßten Unerbrechung theoretisch digestiert. Resultierende Peptide mit einer Länge kleiner als 8 Reste oder größer als 24 Reste wurden aus der weiteren Betrachtung herausgenommen bzw. verworfen, wodurch eine Gesamtanzahl von 168 zu berücksichtigen Peptiden verblieb.Five at random or arbitrarily selected Proteins were considered. These five Proteins included TCMO_MEDSA; SNC2_YEAST, DAK2_SCHPO, CSPB_BACGO, and FMT_BOVIN. The Proteins were theoretically synthesized using trypsin and a omitted or missed adulteration theoretically digested. Resulting peptides smaller in length as 8 residues or larger than 24 residues were removed from further consideration or discarded, reducing a total of 168 to be considered Peptides remained.

Diese verbleibenden 168 Peptide wurden dann modifiziert. Die Sequenzen der fünf zufällig ausgewählten Proteine wurden gelesen, und dann wurden entweder zwei oder vier Modifikationen auf geeignete bzw. entsprechende Reste in der Sequenz angewendet. Zur Einführung eines weiteren Zufallseffektes wurde nur die Reste, die eine gerade Position innerhalb der Peptidsequenz hatten, modifiziert. Die vier möglichen Modifikationen, die zugelassen wurden, waren Palmitoylation anwendbar für bzw. auf Threonin, Phosphoryl, anwendbar für Serin, Carboxymethyl anwendbar für Cystein, und Hydroxyl anwendbar auf aspartische Säure.These remaining 168 peptides were then modified. The sequences the five fortuitously chosen Proteins were read, and then either two or four Modifications applied to appropriate or corresponding residues in the sequence. For the introduction Another random effect was just the leftovers that one straight Position within the peptide sequence had modified. The four potential Modifications that were approved were palmitoylation applicable for or on Threonine, phosphoryl, applicable to serine, carboxymethyl applicable for cysteine, and hydroxyl applicable to aspartic acid.

4 zeigt die Gesamtanzahl von Kombinationen und Binärsuchen, die zur Suche bezüglich der 168 Peptide für unterschiedliche Anzahlen an Modifikationen und modifizierbaren Positionen benötig werden. 5 zeigt in größeren Einzelheiten die Ergebnisse für zwei Modifizierer und 6 zeigt in größeren Einzelheiten die Ergebnisse für vier Modifizierer. 4 Figure 12 shows the total number of combinations and binary searches needed to search for the 168 peptides for different numbers of modifications and modifiable positions. 5 shows in more detail the results for two modifiers and 6 shows in more detail the results for four modifiers.

Die 5 und 6 zeigen getrennt die Zeit, die genommen bzw. benötigt wurde für die erste Stufe der ersten Filterung möglicher Peptide und auch die zweite Stufe der nachfolgenden Permutierung und Bewertung bzw. des Vergleichs von Peptiden. Die Figuren zeigen auch korrespondierende Ergebnisse, bei denen unterschiedliche Massentoleranzen und eine Maximalanzahl modifizierbarer Positionen berücksichtigt wurden. Die Zeiten wurden erhalten durch Suchen gegen bzw. bezüglich einer Peptiddatenbank, die von der Swiss Prot Datenbank mit 105224 Einträgen erhalten und unter Verwendung eines tryptischen Digestes indexiert wurde, abgeleitet ist. Der Code wurde auf einem Compaq Evo W6000 (RTM) ausgeführt, der bei 1,7 GHz in einem Einzelprozessorbetrieb ausgeführt wird.The 5 and 6 show separately the time taken for the first stage of the first filtering of possible peptides and also the second stage of the subsequent permutation and evaluation or comparison of peptides. The figures also show corresponding results in which different mass tolerances and a maximum number of modifiable positions have been taken into account. The times were obtained by searching against a peptide database derived from the Swiss Prot database with 105224 entries indexed using a tryptic digest. The code was run on a Compaq Evo W6000 (RTM) running at 1.7 GHz in single processor mode.

Die 5 und 6 zeigen die Zeit, die zum Filtern der Peptide und die Zeit, die zum Permutieren und Bewerten bzw. Vergleichen der abschließenden Peptide, d. h. sämtlicher potentieller Kombinationen, genommen bzw. benötigt wurde. Es ist zu sehen, dass mit einer Zunahme der Anzahl an Modifizierern und modifizierbaren Orten bzw. Positionen signifikant mehr Peptide zunächst zurückgegeben werden, die dann gefiltert werden müssen. Wesentlich jedoch steigt die Anzahl der Peptide, die durch den Filterungsvorgang passieren, nicht mit der gleichen Rate, mit der die Gesamtanzahl der Peptide ansteigt. Da die Gesamtanzahl der Peptide, die zu berücksichtigen sind, ansteigt, fängt die Filterzeit an, einen signifikanten Teil der Gesamtsuchzeit auszumachen. Dies liegt in der Tatsache begründet, dass mit einer Zunahme der zu berücksichtigenden Anzahl von Kombinationen die gleichen Peptide wiederholt bewertet werden, um zu bestimmen, ob oder nicht sie die aktuelle Kombination unterstützen können. In ähnlicher Weise werden die gleichen Peptide wiederholt diesen Test nicht bestehen, wodurch eine Bewertung bzw. ein Vergleich für sie nicht notwendig sein wird.The 5 and 6 show the time taken to filter the peptides and the time taken to permute and evaluate the final peptides, ie all potential combinations. It can be seen that with an increase in the number of modifiers and modifiable locations, significantly more peptides are initially returned which must then be filtered. Essentially, however, the number of peptides that pass through the filtering process does not increase at the same rate as increases the total number of peptides. As the total number of peptides to be considered increases, the filter time begins to account for a significant portion of the total search time. This is due to the fact that as the number of combinations to be considered increases, the same peptides are repeatedly evaluated to determine whether or not they can support the current combination. Likewise, the same peptides will repeatedly fail this test, making evaluation unnecessary for them.

Die Erweiterung der Massentoleranz resultiert in der Berücksichtigung zusätzlicher Peptide und ihrem Durchgang durch den Filter. Wenn beispielsweise die Massentoleranz von 0,01 Da auf 0,10 Da erhöht wird, steigt die Gesamtanzahl zu berücksichtigender Peptide um einen Faktor von etwa 10, und dies resultiert in einer korrespondierenden Zunahme der Filterzeit. Es kann daher gesehen werden, dass es besonders vorteilhaft ist, die Masse oder das Masse-Ladungs-Verhältnis der zu analysierenden Peptide genau zu bestimmen, da dies signifikant die Gesamtanzahl von Peptiden, die berücksichtigt werden müssen, reduziert. Weitere Verbesserungen können erhalten werden durch Speicherung von Informationen bezüglich der Anzahl und der Art der Reste, die ein Peptid aufweist. Beispielsweise kann ein Speichercache bzw. Cache-Speicher verwendet werden, um eine wiederholte Rechnung zu verhindern und somit die Filterzeit und somit die gesamte Suchzeit zu reduzieren.The Extension of the mass tolerance results in the consideration additional Peptides and their passage through the filter. If, for example the mass tolerance of 0.01 Since it is increased to 0.10 Da, the total number increases to be considered Peptides by a factor of about 10, and this results in a corresponding increase in filter time. It can therefore be seen be that it is particularly advantageous, the mass or the mass-charge ratio of To accurately determine peptides to be analyzed, as this is significant reduces the total number of peptides that need to be considered. Further improvements can be obtained are stored by storing information regarding the number and type the residues having a peptide. For example, a memory cache or cache memory used to make a repeated bill to prevent and thus the filter time and thus the entire search time to reduce.

7 zeigt Vergleichsergebnisse für herkömmliche Suchzeiten bezüglich Suchzeiten gemäß der bevorzugten Ausführungsform. Es ist zu erkennen, dass die bevorzugte Ausführungsform ermöglicht, dass die Gesamtsuchzeit signifikant abgekürzt wird verglichen mit herkömmlichen Suchzeiten. Die herkömmlichen Suchzeiten wurde erhalten unter Verwendung des Proteinlynx (RTM) Global Server 2.05B19. Die Suchzeiten gemäß der bevorzugten Ausführungsform sind entnommen aus einigen der hervorgehobenen Ergebnisse, die in den 5 und 6 präsentiert sind. Die in 7 aufgelisteten Suchzeiten, die sich auf die bevorzugte Ausführungsform bezie hen, umfassen etwa 2 Sekunden zum Lesen der zu analysierenden Peptiddaten. 7 shows comparison results for conventional search times with respect to search times according to the preferred embodiment. It will be appreciated that the preferred embodiment allows the overall search time to be significantly shortened compared to conventional search times. Traditional search times were obtained using the Proteinlynx (RTM) Global Server 2.05B19. The search times according to the preferred embodiment are taken from some of the highlighted results that appear in the 5 and 6 are presented. In the 7 listed search times relating to the preferred embodiment include about 2 seconds to read the peptide data to be analyzed.

Aus den in 7 dargestellten Ergebnissen ist ersichtlich, dass mit einer Erhöhung der Massentoleranz ein korrespondierender Abfall des Beschleunigungsfaktors (oder der Verbesserung) in der Suchzeit gemäß der bevorzugten Ausführungsform relativ zu der Suchzeit, die unter Verwendung herkömmlicher Techniken benötigt wird, einhergeht. Der Grund für diesen Abfall in der Verbesserung wird zum jetzigen Zeitpunkt nicht vollständig verstanden, da vermutlich die herkömmliche „laufende" Implementierung auch mit einer entsprechend erhöhten Anzahl von Peptiden bei einer erhöhten Massentoleranz zurechtkommen muß. Dennoch zeigen die Ergebnisse, dass die Gesamtsuchzeit, die zur Analyse von Peptiden gemäß der bevorzugten Ausführungsform benötigt wird, signifikant reduziert werden kann, verglichen mit herkömmlichen Suchzeiten, insbesondere wenn die Masse oder das Masse-Ladungs-Verhältnis der Peptide genau bestimmt ist, d. h. die Massentoleranz des bzw. der Vorläuferion(en) oder des bzw. der Ausgangsion(en) klein gehalten wird. Die vorliegende Erfindung stellt daher eine signifikante Verbesserung in der Technik dar.From the in 7 As shown, with an increase in mass tolerance, a corresponding decrease in the acceleration factor (or improvement) in search time according to the preferred embodiment is associated with the search time required using conventional techniques. The reason for this decrease in the improvement is not fully understood at the present time, as presumably the conventional "on-going" implementation will have to cope with a correspondingly increased number of peptides with increased mass tolerance, however, the results show that the total search time associated with Analysis of peptides according to the preferred embodiment can be significantly reduced compared to conventional seek times, especially if the mass or mass-to-charge ratio of the peptides is accurately determined, ie the mass tolerance of the precursor ion (s) or the Thus, the present invention represents a significant improvement in the art.

Die bevorzugte Ausführungsform ist ferner in der Lage, Proteine zu identifizieren, wenn die Anzahl der Modifikationen von Interesse auf Null gesetzt wird.The preferred embodiment is also able to identify proteins when the number of Modifications of interest is set to zero.

Obwohl die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurde, werden Fachleute verstehen, dass verschiedene Veränderungen in Form und Detail ausgeführt werden können, ohne den Umfang der Erfindung, wie er in den beigefügten Ansprüchen angegeben ist, zu verlassen.Although the present invention has been described with reference to preferred embodiments, those skilled in the art will understand that various changes in form and detail may be made without departing from the scope of the Er to leave as specified in the appended claims.

Claims

Method for identifying a modified Protein with the following steps: Digestion or digestion a modified protein for producing a number of peptides; Ionize at least one of the number of peptides for Formation of a or more peptide ions; Mass analyzing one or more Peptidones for determination of mass or mass-to-charge ratio at least one of the peptides or peptide ions; and Identify of the modified protein by: (i) determination of the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio, which would have a peptide or peptide ion would be the protein from which the peptide is or the peptide ion is derived, has not been modified; (Ii) Browse a database of peptides using the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio; and (iii) Determination of peptides in the database containing a Have mass or a mass-charge ratio, the or corresponds to the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified mass-to-charge ratio.

The method of claim 1, wherein the modified Protein was posttranslationally modified.

Method according to one of claims 1 or 2, wherein the modified Protein was modified by methylation, hydroxylation, Oxidation or oxidation, formylation, acetylation, carboxylation, Phosphorylation, sulphation, cysteinylation, glycosylation, Farnesylation, myristoylation, biotinylation, palmitoylation, Stearoylation or stearoylation.

The method of any one of the preceding claims, further comprising the determination, selection and consideration of one or more Modifications of interest.

Method according to claim 4, wherein said or considered or it is assumed that the modified protein by at least one of the modifications of interest is modified.

Method according to one of claims 4 or 5, further comprising the enumeration by at least one or more combination (s) of modifications of interest.

The method of claim 6, further comprising enumerating through all combinations of modifications of interest.

Method according to one of claims 6 or 7, further comprising the determination, selection or consideration a maximum number of modifications.

The method of claim 8, wherein the step of Enumerating by combinations of modifications of interest enumerating by combinations of modifications of interest up to the maximum number of modifications.

Method according to one of claims 4 to 9, wherein the step the determination of the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio, the calculation or Determination of mass or mass-to-charge ratio of a combination of Includes modifications of interest.

The method of claim 10, wherein the step the determination of the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio changing, inverting, Counteract, negate, unmodify or de-modify or Adjusting the mass or mass-to-charge ratio of the peptide or Peptidions with regard to the combination of modifications of Interest includes.

The method of claim 11, wherein the step the determination of the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio, the subtraction of the Mass or mass-to-charge ratio of Combination of modifications of interest from the crowd or the mass-to-charge ratio of the Peptides or peptide ions as determined by the mass analysis step is determined includes.

The method of claim 11, wherein the step the determination of the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified mass-to-charge ratio, the addition of the mass or the mass-to-charge ratio the combination of modifications of interest to the mass or the mass-to-charge ratio of the peptide or peptide ion as determined by the mass analysis step is determined includes.

The method of any one of the preceding claims further comprising determining, selecting, or considering an allowable mass tolerance or mass-to-charge ratio tolerance between the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified mass Se-charge ratio of the peptide or Peptidions and the mass or mass-to-charge ratio of the peptides listed in the database.

The method of claim 14, wherein the mass tolerance falling into an area the selected is from the group consisting of: (i) <0.01 Da; (ii) 0.01-0.02 Da; (iii) 0.02-0.03 There; (iv) 0.03-0.04 There; (v) 0.04 - 0.05 There; (vi) 0.05-0.06 There; (vii) 0.06-0.07 There; (viii) 0.07-0.08 There; (ix) 0.08-0.09 Da; (x) 0.09-0.10 There; and (xi)> 0.10 There.

The method of claim 14, wherein the mass-to-charge ratio tolerance falling into an area the selected is selected from the group consisting of: (i) ≤ 0.1 mass-to-charge ratio units; (ii) ≤ 0.01 mass-to-charge ratio units; (iii) ≤ 0.001 Mass to charge ratio units; (iv) ≤ 0.0001 Mass to charge ratio units; (v) ≤ 0.00001 Mass to charge ratio units; (vi) ≤ 0.000001 Mass to charge ratio units.

Method according to one of claims 14, 15 or 16, in which the step of searching or searching a database of peptides the determination or selection of peptides listed in the database are, and have a mass or a mass-charge ratio, that of the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified mass-to-charge ratio within a mass tolerance or a mass-to-charge ratio tolerance corresponds, includes.

The method of claim 17, further comprising Determination of a peptide in the database of peptides, the one Mass or a mass-charge ratio, that of the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified mass-to-charge ratio within an upper limit of the mass tolerance or the mass-to-charge ratio tolerance equivalent.

The method of any of claims 17 or 18, further comprising the determination of a peptide in the database of peptides, the has a mass or mass-to-charge ratio that is theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified mass-to-charge ratio within a lower limit of the mass tolerance or the mass-to-charge ratio tolerance equivalent.

The method of any of claims 18 or 19, further comprising the selection of peptides in the database of peptides with masses or mass-to-charge ratios between the upper limit and the lower limit.

The method of claim 20, wherein peptides in the Database of peptides with masses or mass-to-charge ratios between the upper limit and the lower limit a first list of peptides.

The method of claim 21, further comprising rejection or rejection of peptides from the first list of peptides, not at least one of the combinations of modifications of Support interest.

The method of claim 22, further comprising Formation of a selection list possible Peptides.

The method of claim 23, wherein at least one Having a plurality of peptides in the selection list of peptides: (i) a mass or a mass-to-charge ratio, that of the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified mass-to-charge ratio of the Peptides or Peptidions within a mass tolerance or a Mass-to-charge ratio tolerance corresponds; and (ii) at least the same number and type of modifiable Positions or sites supporting at least one of Combinations of modifications of interest.

The method of any of claims 23 or 24, further comprising the determination of whether the modifiable positions of a peptide in the selection list possible Peptides of exactly a combination of modifications of interest correspond.

A method according to claim 25, wherein, if the modifiable Positions of a peptide in the selection list of possible Peptides exactly or essentially a combination of modifications of Interest, the peptide in this shortlist for fragmentation or MS / MS mass spectral data, which correspond to the Peptidion, is assessed or compared.

A method according to claim 25, wherein, if the modifiable Positions of a peptide in the selection list of peptides not exactly or essentially a combination of modifications of interest, corresponding to the modifications of interest the rest to which they are applicable.

The method of claim 27, further comprising Enumerating by combinations of modifiable positions.

The method of claim 28, further comprising Permutation of modifications of interest among the modifiable Positions.

The method of claim 29, wherein the Modifications of interest are permuted on a group by group basis.

The method of claim 29 or 30, further comprising the rating of each permuted peptide against fragmentation or MS / MS mass spectral data corresponding to the peptide ion.

Method according to one of the preceding claims, in the database is a database of peptides that are unmodified Proteins are derived.

The method of claim 32, wherein in the database listed peptides in order of mass or mass-to-charge ratio are arranged.

The method of claim 33, wherein the peptides in the order of their monoisotopic mass or their monoisotopic Mass to charge ratio are arranged.

Method according to one of the preceding claims, in the further step of identifying the modified protein repeating steps (i), (ii) and (iii) for a number of different peptides or peptide ions.

Mass spectrometer with an ion source for Ionizing at least a number of peptides resulting from digestion derived from a modified protein, to form a or more peptide ions; a mass analyzer for mass analyzing a or more of the peptide ions for the determination of the mass or the Mass to charge ratio at least one of the peptides or peptide ions; and identifying means for the identification of the modified protein, the identification means in use (i) the theoretical unmodified mass or determine the theoretical unmodified mass-to-charge ratio, that would have a peptide or peptide ion, would be the protein, from which the peptide or peptide ion is derived is not modified been; (ii) a database of peptides using the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified Mass to charge ratio search; and (iii) determine peptides in the database which have a mass or a mass-to-charge ratio, the or the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified Mass-to-charge ratio equivalent.

Method for identifying a modified Protein with the following steps (i) Determination of the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio, that would have a peptide or peptide ion, would be that Protein from which the peptide or Peptidion is derived, not modified; (ii) searching a database of peptides using the theoretical unmodified mass or theoretical unmodified mass-to-charge ratio; and (iii) determination of peptides in the database that have a mass or a mass-to-charge ratio, the or the theoretical unmodified mass or the theoretical corresponds to unmodified mass to charge ratio.

Device for identifying a modified Protein, wherein in use the device (i) the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified Mass-to-charge ratio which had a peptide or peptide ion, would be the protein from which the peptide or peptide ion is derived is not modified been; (ii) searching a database of peptides using the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified Mass to charge ratio; and (iii) Peptides in the database that determines a mass or a mass-to-charge ratio have, that of the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified mass-to-charge ratio.

A method of identifying a modified protein comprising the steps of: (a) determining, selecting or considering one or more modifications of interest; (b) enumerating by one or more combinations of modifications of interest; (c) calculating the mass or mass-to-charge ratio of the one or more combinations of modifications of interest; (d) subtracting the calculated mass or calculated mass-to-charge ratio of one of the combinations of modifications of interest from the experimentally determined mass or the experimentally determined mass-to-charge ratio of a peptide or peptide ion to determine a theoretical unmodified mass or a theoretical unmodified mass Mass-to-charge ratio that would have a peptide or peptide ion, the protein from which the peptide or peptide ion is derived would not have been modified; (e) searching a database of peptides using the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified mass-to-charge ratio to output a first list of peptides; (f) Removal from the first list of peptides Peptides containing the combination of modifications of In can not assist in generating a shortlist of peptides; and (g) evaluating peptides in the selection list of peptides for fragmentation mass spectral data.

Device for identifying a modified Protein, wherein in use the device (a) one or multiple modifications of interest, selects or considered; (B) by one or more combinations of modifications of interest enumerated; (c) the mass or mass-to-charge ratio of a or multiple combinations of modifications of interest; (D) a calculated mass or the calculated mass-to-charge ratio of one of the combinations of Modifications of interest from the experimentally determined mass or the experimentally determined mass-to-charge ratio of a peptide or peptide ion, to determine a theoretical unmodified mass or a theoretical unmodified mass Mass to charge ratio, which would have a peptide, would be the protein from which the peptide or peptide ion is derived is not modified been; (d) searching a database of peptides using the theoretical unmodified mass or the theoretical unmodified Mass to charge ratio for issuing a first list of peptides; (f) from the first List of peptides peptides removed, showing the combination of modifications of interest do not support can, and thus produces a selection list of peptides; and (g) peptides in the selection list of peptides for fragmentation mass spectral data rated or compared.