DE102004043449A1 - Use of degenerated prolapsed intervertebral disc tissue to produce a therapeutic product for treating intervertebral disc defects - Google Patents

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Abstract

Using degenerated prolapsed intervertebral disc tissue to produce a therapeutic product for treating intervertebral disc defects, is new. Independent claims are also included for: (1) producing intervertebral disc (ID) transplants by: (a) isolating ID cells from prolapsed degenerated ID tissue and/or diseases ID tissue; and (b) culturing the cells as 3-dimensional aggregates in the presence of autologous serum; (2) ID regeneration product produced by isolating cells from degenerated ID tissue and culturing and harvesting the cells; and (3) use of the ID regeneration product for drug testing. ACTIVITY : CNS-Gen. No biological data is given. MECHANISM OF ACTION : None given.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Herstellung von Bandscheibenknorpelzelltransplantaten aus erkranktem Bandscheibengewebe von Patienten und dessen Anwendung als Transplantationsmaterial zur Behandlung von erkrankten Bandscheiben. Die Erfindung betrifft weiterhin dreidimensionales, vitales und mechanisch stabiles Bandscheibenknorpelgewebe und dessen Verwendung als Transplantationsmaterial zur Behandlung von erkrankten Bandscheiben sowie zur Testung von Wirkstoffen. Gegenstand der Erfindung sind weiterhin die hergestellten Bandscheibenzelltransplantate und die hergestellten Bandscheibenknorpelgewebe und therapeutische Zubereitungen, z.B. Injektionslösungen, die dieses Gewebe und die Zelltransplantate beinhalten.The The invention relates to a method for the in vitro production of disc cartilage cell transplants from diseased disc tissue of patients and its use as a transplant material for the treatment of diseased intervertebral discs. The invention further relates to three-dimensional, vital and mechanically stable disc cartilage tissue and its use as a transplant material for the treatment of diseased intervertebral discs as well as for the testing of active ingredients. Subject of the invention are Furthermore, the produced intervertebral disc cell transplants and the produced Disc cartilage tissue and therapeutic preparations, e.g. Injection solutions that include this tissue and the cell grafts.

Die Degeneration der Bandscheiben wird während der Alterung oder durch Trauma ausgelöst und induziert akute und chronische Schmerzen und Instabilitäten in der Wirbelsäule. Mehr als 300.000 Patienten in Europa leiden an Bandscheibenerkrankungen. Ungefähr 70 % der Patienten, die einen Bandscheibenvorfall erleiden und mittels Discectomie behahndelt werden, leiden weiterhin an Rückenschmerzen. Anhaltende starke Schmerzen machen bei 10 % dieser Patienten eine weitere operative Behandlung notwendig (Yorimitsu et al, 2001). Grund dafür ist die durch die Operation bedingte Abnahme der Bandscheibenhöhe, die damit verbundene Erhöhung der lokalen Belastund des Bandscheibengewebes (Brinckmann und Grootenboer, 1991) und vor allem die fehlende Heilung und Regeneration des zerstörten und entfernten Bandscheibengewebes (Lundon und Bolton, 2001, Meakin et al., 2001). Mit fortschreitender Zeit resultiert diese Instabilität der betroffenen Bandscheibe in degenerativen Veränderungen angrenzender Bandscheiben, wodurch weitere operative Eingriffe und im schlimmsten Fall eine Fusion der Wirbelkörper oder das Einsetzen einer Prothese notwendig werden. Deshalb ist die biologische Reparatur bzw. Regeneration der Bandscheibe die Zukunft für die Behandlung degenerierter Bandscheiben.The Degeneration of the intervertebral discs is done during aging or through Trauma triggered and induces acute and chronic pain and instability in the Spine. More than 300,000 patients in Europe suffer from disc disease. Approximately 70% of patients who suffer a herniated disc and using Discectomy be persuaded, continue to suffer from back pain. Persistent severe pain accounts for 10% of these patients further surgical treatment is necessary (Yorimitsu et al, 2001). the reason for this is the decrease in disc height due to the surgery, the associated increase the local load and the intervertebral disc tissue (Brinckmann and Grootenboer, 1991) and especially the lack of healing and regeneration of the destroyed and removed disc tissue (Lundon and Bolton, 2001, Meakin et al., 2001). As time progresses, this instability results in those affected Intervertebral disc in degenerative changes adjacent intervertebral discs, causing further surgical interventions and in the worst case a fusion of the vertebral bodies or the insertion of a prosthesis become necessary. That is why the biological repair or regeneration the intervertebral disc the future for the treatment of degenerated discs.

Eine bekannte Methode zur biologischen Regeneration eines Gewebes ist die Knorpelzelltransplantation unter Verwendung von körpereigenen Zellen, die zur Behandlung von Gelenksknorpeldefekten angewandt wird. Dabei wird das Potential der Gelenksknorpelzellen genutzt, um in vivo nach Transplantation der Zellen neues Gewebe aufzubauen. Dazu wird dem Patienten eine Gelenksknorpelbiopsie entnommen, daraus Knorpelzellen isoliert, mittels Zellkultivierung vermehrt und anschließend dem Patienten im Bereich des Gewebedefektes, z.B. durch Einspritzen, transplantiert. Dort bilden sie neues Gewebe und füllen somit den Defekt vollständig auf. Durch diese Verfahren wird erreicht, dass nach Applikation eines Zelltransplantates im Körper Gewebe aufgebaut wird. Prinzipiell ist diese Methodik für die Behandlung der Bandscheibendegeneration nicht anwendbar, da den Patienten aus ethischen Gründen kein Ausgangsmaterial aus einer intakten benachbarten Bandscheibe entnommen werden kann und krankes Gewebe a priori nicht verwendbar ist.A known method for the biological regeneration of a tissue Cartilage cell transplantation using the body's own Cells used to treat articular cartilage defects becomes. The potential of the articular cartilage cells is used to build new tissue in vivo after transplantation of the cells. To a joint cartilage biopsy is taken from the patient Cartilage cells isolated, propagated by cell culture and then the Patients in the area of tissue defect, e.g. by injecting, transplanted. There they form new tissue and thus fill the defect completely on. By these methods it is achieved that after application a cell transplant in the body Tissue is built up. In principle, this methodology is for the treatment the disc degeneration not applicable because the patient ethical reasons no Source material taken from an intact adjacent disc and diseased tissue is not a priori usable.

Erste Ansätze zum biologischen Ersatz der Bandscheibe gehen von der Verwendung von gesundem Bandscheibengewebe aus. So beschreiben Handley ( US 6,080,579 ) und Ferree ( US 6,340,369 B1 ) die Verwendung von normalem Bandscheibengewebe für die Isolation von Bandscheibenzellen und die Kombination dieser Zellen mit einem bioresorbierbaren Träger. Auch viele wissenschaftliche Arbeiten haben die Verwendung von normalem Bandscheibengewebe als Grundlage: Okuma et al., 2000, Gruber et al., 2000, Chelberg et al., 1995. Jedoch kann eine gesunde Bandscheibe eines Patienten nicht als Gewebequelle zur Behandlung einer anderen Bandscheibe dienen, da die Gewebeentfernung zu einer Zerstörung, zur Degeneration und somit zum Verlust der Funktion dieser Bandscheibe führt.Initial approaches to biological replacement of the disc are based on the use of healthy disc tissue. This is how Handley ( US 6,080,579 ) and Ferree ( US 6,340,369 B1 ) the use of normal disc tissue for the isolation of intervertebral disc cells and the combination of these cells with a bioresorbable carrier. Many scientific papers have also been based on the use of normal disc tissue: Okuma et al., 2000, Gruber et al., 2000, Chelberg et al., 1995. However, a healthy disc of a patient may not serve as a tissue source for the treatment of another disc because tissue removal results in destruction, degeneration and thus loss of function of this disc.

Ein anderer Ansatz ist die Verwendung von degeneriertem Nukleus Pulposus Gewebe, welches aus dem Inneren einer degenerierten Bandscheibe entfernt und aufgearbeitet wird. Bei diesem operativen Eingriff wird die ohnehin schon degenerierte und zerstörte Bandscheibe noch weiter zerstört. Die Aufarbeitung des Gewebes wird dabei zum einen vorgeschlagen als Dehydrierung ( US 6,648,918 ) oder die Kombination von darin befindlichen Zellen mit einem Trägermaterial ( US 6,569,442 ; US2001/0020476 A1) und die anschliessende Transplantation zurück in diese degenerierten Bandscheiben. Allerdings enthält das dehydrierte Gewebe keine lebenden Zellen und stellt somit keine Methode der biologischen Regeneration dar. Die vorgeschlagene Kombination der Nukleus Zellen oder anderer Zellen mit einem Trägermaterial stellt ebenfalls keine reine biologische Methode dar und bedingt die Verwendung eines geeigneten Trägermaterials, welches zum Beispiel biomechanisch geeignet sein muss, welches im selben Masse wie neues Gewebe aufgebaut werden soll abgebaut wird, welches die Bildung neuen Gewebes nicht behindern darf oder zum Beispiel keine immunologische Reaktion aufgrund der auf jeden Fall verwendeten synthetischen, allogenen oder xenogenen Materialien auslösen darf.Another approach is the use of degenerated nucleus pulposus tissue, which is removed from the interior of a degenerated disc and processed. In this surgical procedure, the already degenerated and destroyed disc is further destroyed. The workup of the tissue is proposed as dehydration ( US 6,648,918 ) or the combination of cells therein with a carrier material ( US 6,569,442 ; US2001 / 0020476 A1) and the subsequent transplantation back into these degenerated discs. However, the dehydrated tissue does not contain any living cells and thus does not constitute a method of biological regeneration. The proposed combination of nucleus cells or other cells with a support material also does not constitute a pure biological method and requires the use of a suitable support material which is biomechanically suitable, for example must be, which is to be built in the same mass as new tissue, which must not hinder the formation of new tissue or, for example, may not trigger an immunological reaction due to the synthetic, allogenic or xenogeneic materials used in any case.

Eine weitere Behandlungsmöglichkeit wäre die Verwendung von Bandscheiben anderer Patienten, wobei es sich somit um eine allogene Transplantation handelt (6,344,058; Keith DK et al., 2003). Hierbei stellt jedoch die immunologische Reaktion ein Problem dar und durch die alleinige Einbringung einer Spenderbandscheibe wird wahrscheinlich auch keine biologische Regeneration der betroffenen Bandscheibe ausgelöst.Another treatment option would be the use of other patients' discs, which is thus an allogeneic transplant (6,344,058, Keith DK et al., 2003). Here, however, the immunological reaction is a problem and by the sole contribution of a donor disc is likely to no biological regeneration of the affected intervertebral disc triggered.

Aus den genannten Problemen bestehen deshalb für die Behandlung von degenerierten Bandscheiben und zur Bandscheiberegeneration die allgemeinen Ziele darin: medizinisch und ethisch vertretbares Ausgangsgewebe bzw. -zellprobe zu verwenden, keine anderen oder die betroffene, erkrankte Bandscheibe des Patienten zu zerstören, nur patienteneigene Materialien zu verwenden (autologe Therapie), optimale Zellisolationsbedingungen und – kultivierungsbedingungen zur Vermehrung der Bandscheiben zekllen und anschliessender Bandscheibenmatrixbildung zu finden, zur Vermeidung von Immunreaktionen auf Trägermaterialien zu verzichten. Diese Probleme sind lösbar durch die Transplantation eines speziellen autologen Zelltransplantates oder durch Transplantation eines außerhalb des Körpers vorgefertigten 3-dimensionalen Bandscheibenknorpelgewebes.Out Therefore, the problems mentioned exist for the treatment of degenerate Intervertebral discs and to the intervertebral disc regeneration the general objectives therein: medically and ethically acceptable starting tissue or cell sample to use, no other or the affected, ill Destroying patient's disc, only patient-own materials to use (autologous therapy), optimal cell isolation conditions and - culturing conditions for the multiplication of the intervertebral disc cells and subsequent intervertebral disk matrix formation to find, to avoid immune reactions on carrier materials to renounce. These problems are solvable by transplantation a special autologous cell transplant or by transplantation one outside of the body prefabricated 3-dimensional disc cartilage tissue.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, Verfahren zur Herstellung von Bandscheibenknorpelzelltransplantaten und stabilem vitalen Bandscheibenknorpelgewebe bereitzustellen, die zur autologen Transplantation, zum schnellen Wiederaufbau und der Erhaltung der Funktion der Bandscheibe geeignet sind. Dabei ist es essentiell, dass das Ausgangsmaterial zur Herstellung der Zelltransplantate medizinisch und ethisch vertretbar entnommen werden kann sowie, dass die autolog kultivierten Bandscheibenzellen ihre Eigenschaften über den Zeitraum von der Entnahme bis zur Transplantation nicht verändern und eine hohe Proliferations- und Differenzierungskapazität aufweisen.task Therefore, the present invention was to provide methods of preparation of disc cartilage cell transplants and stable vital disc cartilage tissue to be used for autologous transplant, for fast Reconstruction and preservation of the function of the disc suitable are. It is essential that the starting material for the production taken from the cell transplant medically and ethically acceptable as well as that autologous cultured intervertebral disc cells their properties over the period from collection to transplantation does not change and have a high proliferation and differentiation capacity.

Überraschend konnte gezeigt werden, dass als Ausgangsmaterial erkranktes Bandscheibengewebe verwendet werden kann. Bisher wurde angenommen, dass es nicht möglich ist, aus degeneriertem Gewebe, adulte Zellen in ausreichender Anzahl zu isolieren, die vital sind, ausreichend proliferieren und anschließend auch noch in der Lage sind, gewebespezifisch zu differenzieren und Bandscheibengewebe aufzubauen, da in Geweben, die einer Degeneration unterliegen die gewebespezifische Zellen ihre Eigenschaften im Hinblick auf die Matrixsynthese verändern und auch absterben und auch durch andere Zellen mit anderen gewebe-unspezifischen Eigenschaften ersetzt werden.Surprised it could be shown that diseased disc tissue is the starting material can be used. So far, it has been assumed that it is not possible from degenerated tissue, adult cells in sufficient numbers too isolate, which are vital, proliferate sufficiently and then too are still able to differentiate tissue-specific and disc tissue build up in tissues that are subject to degeneration tissue-specific cells their properties in terms of Alter matrix synthesis and also dying off and also by other cells with other tissue-nonspecific Properties are replaced.

Überraschenderweise konnte jedoch aus vorgefallenem degenerierten Bandscheibengewebe eine ausreichende Anzahl an vitalen Zellen isoliert werden. Das vorgefallene degenerierte Bandscheibengewebe besteht aus Bandscheibenteilen des Anulus Fibrosus und Nucleus Pulposus, wobei die aus beiden Gewebebereichen isolierten Zellen (Anulus Fibrosus Zellen und Nucleus Pulposus Zellen) unter den gegebenen autologen Kulturbedingungen dann auch noch proliferieren und gewebespezifisch besonders spezifisch differenzieren. Damit sind diese Gemischzelltransplantate für eine zell-basierte Therapie zur Wiederherstellung der Funktion der Bandscheibe geeignet.Surprisingly However, could from failed degenerated disc tissue a sufficient number of vital cells are isolated. The occurred degenerated disc tissue consists of disc parts of the annulus Fibrosus and nucleus pulposus, with those from both tissue areas isolated cells (annulus fibrosus cells and nucleus pulposus cells) then proliferate under the given autologous culture conditions and specifically differentiate tissue specifically. In order to These are mixed cell transplants for cell-based therapy to restore the function of the disc suitable.

Es ist somit erstmals ein Verfahren beschrieben, durch welches besondere autologe Gemisch-Bandscheibenzelltransplantate hergestellt werden können, die nach Transplantation in eine geschädigte/erkrankte Bandscheibe durch den Aufbau neuen Bandscheibengewebes die Erhaltung der Bandscheibe und damit die Wiederherstellung der neurologischen und mechanischen Funktion der Wirbelsäule bei einer Bandscheibenerkrankung oder nach einem Bandscheibenvorfall erlaubt.It Thus, for the first time a method is described by which particular autologous mixture-disc cell transplants can, after transplantation into a damaged / diseased disc by building new disc tissue preserving the intervertebral disc and thus the restoration of the neurological and mechanical Function of the spine with a disc disease or after a herniated disc allowed.

Auch bei fortgeschrittener Degeneration der Bandscheibe, d.h. auch bei Degeneration oder traumatischer Schädigung der äußeren Schicht der Bandscheibe (Anulus Fibrosus), ist durch die vorliegende Erfindung die Wiederherstellung und Erhaltung der neurologischen, biologischen und mechanischen Funktion der Bandscheibe ermöglicht, wenn aus vorgefallenen, degenerierten Bandscheiben Gemisch-Gewebezellen isoliert werden, die folgend zu einem autologen 3-dimensionalen Gewebe ohne die Verwendung von Trägermatieralien kultiviert werden.Also in advanced disc degeneration, i. also at Degeneration or traumatic damage to the outer layer of the disc (Anulus Fibrosus) is the restoration by the present invention and preservation of the neurological, biological and mechanical Function of the intervertebral disc allows when isolated from discrete, degenerated discs mixture tissue cells The following are an autologous 3-dimensional tissue without the use of Trägermatieralien be cultivated.

Bei der Behandlung mit den erfindungsgemäßen Bandscheibenzelltransplantaten ist es vorteilhaft, wenn vor der Transplantation die äußere Hülle der Bandscheibe, der Anulus Fibrosus, der durch den Austritt des Bandscheibengewebes geschädigt wurde, in der Art heilt, dass keine Flüssigkeit, wie die hergestellten Zelltransplantate, aus dem Inneren der Bandscheibe mehr auslaufen kann. Dieser Zeitraum ist patientenabhängig. Während dieses Zeitraumes werden die Bandscheibenzelltransplantate hergestellt, wobei die Gemisch-Bandscheibenzellen während der Vermehung in der Zellkultur ihre gewebe-spezifischen Eigenschaften im Hinblick auf deren Differenzierungspotential und damit den Erfolg der Transplantation erhalten. Im Gegensatz dazu wird dieses Potential bei der getrennten Kultivierung der Anulus Fibrosus und Nucleus Pulposus Zellen verringert, wobei nach Überführung in die 3-dimensionale Umgebung einige Bandscheiben-spezifische Marker nicht exprimiert werden. Deshalb sind nur die Gemisch-Kulturen besonders geeignet Bandscheibengewebe nach deren Transplantation in eine degenerierte Bandscheibe aufzubauen.at the treatment with the intervertebral disc cell transplants according to the invention It is advantageous if, prior to transplantation, the outer shell of the Intervertebral disc, the annulus fibrosus, caused by the exit of the intervertebral disc tissue damaged became, in the way heals, that no liquid, like that manufactured Cell transplants leak more from the inside of the intervertebral disc can. This period is patient-dependent. During this period will be the intervertebral disc cell transplants are made, with the intervertebral disc cells while the conquest in cell culture their tissue-specific properties in view of their differentiation potential and thus the success received the transplant. In contrast, this potential becomes in the separate cultivation of the annulus fibrosus and nucleus Pulposus cells are reduced, taking after being transferred to the 3-dimensional environment some disc-specific markers are not expressed. Therefore, only the mixture cultures are particularly suitable disc tissue build up after their transplantation into a degenerated disc.

Außerdem sollen die in vitro hergestellten Zell- und Gewebetransplantate keine immunologischen Reaktionen im Organismus, der das Transplantat erhält, auslösen. Es wurde überraschender Weise gefunden, dass diese erfindungsgemäß autolog hergestellten Zellen und Gewebe keine immunologische Reaktionen auslösen.In addition, the in vitro produced cell and tissue grafts should not trigger immunological reactions in the organism receiving the graft. It has surprisingly been found that these invention autologous cells and tissues no immuno trigger logical reactions.

Das entnommene, patienteneigene erkrankte Bandscheibengewebe kann unterschiedlich weiter bearbeitet werden:

  • (a) Aus den Biopsien werden die Gemisch-Bandscheibenzellen mittels enzymatischem Verdau des Gewebes, durch Auswandern oder durch Reagenzien, die Zielzellen erkennen, mit üblichen Methoden isoliert. Diese Zellen werden dann nur nur unter Zusatz von körpereigenem Serum und ohne Zusatz von exogenen wachstumsfördernden Verbindungen und ohne den Zusatz von Antibiotika und mit üblichem Kulturmedium in Zellkulturgefäßen kultiviert und so lange vermehrt, bis eine ausreichende Menge an Zellen zur Verfügung steht. Diese Zeit wird so kurz wie möglich gehalten, um ihre phänotypischen Eigenschaften nicht zu verändern. Nach ausreichender Vermehrung der Zellen werden diese geerntet und das Zelltransplantat bestehend aus einer Bandscheibenzellsuspension ist für therapeutische Verwendungen bereitgestellt. Erfindungsgemäß werden die isolierten Bandscheibenzellen im Gemisch verwendet, d.h. die Zellen werden nicht nach Anulus Fibrosus und Nucleus Pulposus Zellen, deren Gewebeanteile im vorgefallenen Bandscheibengewebe enthalten sind, aufgetrennt und getrennt oder nur als Einzelzellart kultiviert. Genau unter diesen Gemisch-Bedingungen wird eine spätere verbesserte Bandscheiben-spezifische Differenzierung der Zellen erreicht (siehe Bearbeitung b)). Diese autologe Gemisch-Kultiverungstechnik zur Vermehrung der Bandscheibenzellen ermöglicht somit erstmals eine Bandscheiben-spezifische Differenzierung dieser so kultivierten Zellen, nachdem diese in eine 3-dimensionale Umgebung überführt werden.
  • (b) In einem weiteren Verfahren werden die isolierten Bandscheibenzellen vorkultiviert und ohne Passagierung der Zellen nur kurzzeitig vermehrt. Danach werden die vorkultivierten Zellen geerntet und eingefroren und bis zum Zeitpunkt der Transplantation tiefgefroren gelagert. Vor der Transplantation werden die Zellen aufgetaut und bis zum Erreichen einer ausreichenden Zellzahl mit autologem Serum und in herkömmlichem Zellkulturmedium weiterkultiviert. Nach ausreichender Vermehrung der Zellen werden diese geerntet und das Zelltransplantat bestehend aus einer Bandscheibenzellsuspension bereitgestellt. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die Bandscheibenzellen durch das Einfrieren und Auftauen nicht ihre spezifischen Eigenschaften im Hinblick auf die Synthese von spezifischen Marker- und Matrixproteinen verlieren.
  • (c) In einem weiteren bevorzugten Verfahren wird als Ausgangsmaterial ebenfalls patienteneigenes erkranktes Bandscheibengewebe verwendet. Aus den Biopsien werden die gewebeaufbauenden Zellen aus dem Anulus Fibrosus und Nucleus Pulposus mittels enzymatischem Verdau des Gewebes, durch Auswandern oder durch Reagenzien, die Zielzellen erkennen, mit üblichen Methoden isoliert. Diese Gemisch-Zellen werden dann unter autologen Bedingungen und mit üblichem Kulturmedium zunächst in Monolayer kultiviert bis eine ausreichende Zellzahl erreicht ist und anschließend in Zellkulturgefäße mit hydrophober Oberfläche und sich verjüngendem Boden überführt und dort so lange in Suspension kultiviert, bis ein dreidimensionales Zellaggregat entsteht, das zu mindestens 40 Volumen%, vorzugsweise mindestens 60 Volumen% bis maximal 99 Volumen%, extrazelluläre, de novo synthetisierte Matrix (ECM) beinhaltet, in welche differenzierte Zellen eingebettet sind. Der Fachmann kann diese Werte durch Entnahme kleinerer Proben bestimmen. Das entstandene Zellaggregat weist einen äußeren Bereich auf, in welchem proliferations- und migrationsfähige Zellen vorhanden sind (siehe auch 1).
The patient's own diseased disc tissue can be processed in different ways:
  • (a) From the biopsies, the intervertebral disc cells are isolated by enzymatic digestion of the tissue, by migration or by reagents which recognize target cells by conventional methods. These cells are then cultured only in the addition of endogenous serum and without the addition of exogenous growth-promoting compounds and without the addition of antibiotics and with conventional culture medium in cell culture vessels and increased until a sufficient amount of cells is available. This time is kept as short as possible so as not to alter their phenotypic properties. After sufficient proliferation of the cells, they are harvested and the cell graft consisting of a disc cell suspension is provided for therapeutic uses. According to the invention, the isolated intervertebral disc cells are used in a mixture, ie the cells are not separated into Anulus Fibrosus and Nucleus Pulposus cells, whose tissue portions are contained in the prolapsed disc tissue, and separated or cultured only as a single cell. Exactly under these mixture conditions, a subsequent improved disc-specific differentiation of the cells is achieved (see processing b)). This autologous mixture culture technique for propagating the intervertebral disc cells thus allows for the first time an intervertebral disc-specific differentiation of these cells so cultured, after these are converted into a 3-dimensional environment.
  • (B) In a further method, the isolated intervertebral disc cells are pre-cultured and propagated only for a short time without passage of the cells. Thereafter, the pre-cultured cells are harvested and frozen and stored frozen until the time of transplantation. Prior to transplantation, the cells are thawed and further cultured until sufficient cell numbers are obtained with autologous serum and in conventional cell culture medium. After sufficient proliferation of the cells, they are harvested and provided the cell graft consisting of a disc cell suspension. Surprisingly, it has been found that the intervertebral disc cells do not lose their specific properties with respect to the synthesis of specific marker and matrix proteins as a result of freezing and thawing.
  • (c) In another preferred method, the patient's own diseased disc tissue is also used as the starting material. From the biopsies, the tissue-building cells from the annulus fibrosus and nucleus pulposus are isolated by enzymatic digestion of the tissue, by emigration or by reagents that recognize target cells, by conventional methods. These mixture cells are then cultured under autologous conditions and with conventional culture medium, first in monolayer until a sufficient cell count is reached and then transferred into cell culture vessels with hydrophobic surface and tapered bottom and there cultivated in suspension until a three-dimensional cell aggregate is formed at least 40% by volume, preferably at least 60% by volume to at most 99% by volume, of extracellular, de novo synthesized matrix (ECM) in which differentiated cells are embedded. The skilled person can determine these values by taking smaller samples. The resulting cell aggregate has an outer region in which cells capable of proliferation and migration are present (see also 1 ).

Erfindungsgemäß werden die isolierten Bandscheibenzellen im Gemisch verwendet, d.h. die Zellen werden nicht nach Anulus Fibrosus und Nucleus Pulposus Zellen aufgetrennt und getrennt oder nur als Einzelzellart kultiviert. Genau unter diesen Gemisch-Bedingungen wird in der 3-dimensionalen Kultur und damit bei der Bildung der 3-dimensionalen Bandscheibengewebe die Banscheiben-spezifische Differenzierung der Gemischzellen gefördert, wobei die Expression von Bandscheiben-spezifischen Markern nur in diesen Kulturen erreicht werden kann und die Bildung der 3-dimensionalen Bandscheibengewebe bei Verwendung der Gemischkulturen gefördert ist. Diese autologe Gemisch- Kultiverungstechnik ermöglicht somit erstmals die Herstellung und Verwendung eines Bandscheiben-spezifischen Gewebetransplantates, welches autolog aus degenerierem, vorgefallenen Bandscheibengewebe hergestellt wurde.According to the invention the isolated intervertebral disc cells are used in admixture, i. the cells are not separated into Anulus Fibrosus and Nucleus Pulposus cells and cultured separately or only as a single cell type. Just below This mixture conditions is used in 3-dimensional culture and thus in the formation of the 3-dimensional disc tissue the Banscheiben-specific differentiation of the mixture cells promoted, whereby the Expression of disc-specific markers only in these cultures can be achieved and the formation of 3-dimensional disc tissue at Use of the mixture cultures is encouraged. This autologous mixture culture technique thus allows the first time the manufacture and use of an intervertebral disc-specific Tissue graft autologous from degenerate, precipitated Disc tissue was produced.

Die Gemisch-Bandscheibenzellen, die aus erkranktem Bandscheibengewebe isoliert werden und aus denen autologe 3-dimensionale Bandscheibenzellaggregate hergestellt werden, so dass die entnommenen Zellen in einem de novo synthetisierten Gewebe integriert sind, überleben auch mit fortschreitender Kultivierungsdauer, d. h. die Zellen im Inneren der Aggregate sterben nicht ab. Mit fortschreitender Kultivierungsdauer differenzieren die Zellen im Inneren der Aggregate aus und es bilden sich Bandscheibenknorpelgewebe, die aus ECM, differenzierten Zellen und einer Proliferationszone am Rand bestehen. Während der Differenzierung in der autologen Zellkultur wird der Abstand der aggregierten Zellen durch Bildung der gewebespezifischen Matrix immer größer. Es entsteht im Inneren der in vitro hergestellten Bandscheibengewebe eine Gewebehistologie, die dem natürlichen Gewebe sehr ähnlich ist. Während der weiteren Herstellung der Bandscheibenknorpelgewebe bildet sich die "Proliferationszone" am Rand selbiger aus. Diese Zone hat den unschätzbaren Vorteil, dass nach Einbringen der so entstandenen Bandscheibenknorpelgewebe in degenerierte Bandscheiben, die in dieser Randzone befindlichen Zellen in der Lage sind, auszuwandern und aktiv den Kontakt zum umliegenden Gewebe herzustellen bzw. eine Integration des in vitro gebildeten Bandscheibenknorpelgewebes in seine Umgebung ermöglichen. Damit sind die hergestellten gewebespezifischen Zellaggregate hervorragend zur Behandlung von degenerierten Bandscheiben und zum Neuaufbau von Bandscheibengewebes in vivo geeignet.The mixed disc cells, which are isolated from diseased disc tissue and from which autologous 3-dimensional disc cell aggregates are made so that the harvested cells are integrated into a de novo synthesized tissue, also survive as the culture time progresses, ie the cells inside the aggregates die not off. As the culture progresses, the cells inside the aggregates differentiate and disc-cartilaginous tissues are formed, consisting of ECM, differentiated cells, and a peripheral proliferation zone. During differentiation in the autologous cell culture, the distance of the aggregated cells by formation of the tissue-specific matrix becomes larger and larger. It arises inside the in vi a tissue histology very similar to natural tissue. During the further production of the disc cartilage tissue, the "proliferation zone" forms on the edge selbiger. This zone has the incalculable advantage that after introducing the resulting disc tissue into degenerated discs, the cells located in this marginal zone are able to migrate and actively establish contact with the surrounding tissue, or integration of the in vitro formed disc cartilage into its environment enable. Thus, the tissue-specific cell aggregates produced are outstandingly suitable for the treatment of degenerated intervertebral discs and for the reconstruction of intervertebral disc tissue in vivo.

Aufgrund der biomechanischen Belastung der Bandscheiben direkt nach Behandlung sowie dem Ziel die Bandscheibe in ihrer Höhe gleich mit der Transplantation des Bandscheibenknorpelgewebes wiederherzustellen, kann es von Vorteil sein, bereits größere und mechanisch stabile Gewebestücke zu transplantieren. Für diesen Fall werden mindestens zwei, besser aber mehr der erhaltenen in vitro Bandscheibenknorpelgewebe fusioniert, indem sie gemeinsam unter den gleichen Bedingungen und in den gleichen Kulturgefäßen wie oben beschrieben bis zur gewünschten Größe weiterkultiviert werden (siehe auch 4).Due to the biomechanical loading of the intervertebral discs immediately after treatment and the goal of restoring the intervertebral disk in height equal to the transplantation of the intervertebral cartilage tissue, it may be advantageous to transplant larger and mechanically stable tissue pieces. In this case, at least two, but more preferably more, of the in vitro dissecting cartilage tissue obtained are fused together by further cultivating them together to the desired size under the same conditions and in the same culture vessels as described above (see also US Pat 4 ).

Als Zellkulturmedium kann sowohl für die Suspensions- als auch für die Monolayerkultur übliches Medium, z. B. Dulbecco's MEM, unter Zusatz von Serum, verwendet werden. Vorzugsweise wird DMEM und Hams im Verhältnis 1:1 eingesetzt. Um jedoch immunologische Reaktionen des Patienten auf das in vitro hergestellte Gewebe zu vermeiden, wird als Serum vorzugsweise autologes Serum des Patienten eingesetzt. Es ist auch möglich xenogenes oder allogenes Serum zu verwenden.When Cell culture medium can be used both for the suspension as well as for the monolayer culture usual Medium, e.g. B. Dulbecco's MEM, with the addition of serum. Preferably, DMEM and Hams in proportion 1: 1 used. However, in order to immunological reactions of the patient To avoid the tissue produced in vitro is preferred as serum used autologous serum of the patient. It is also possible xenogeneic or to use allogeneic serum.

Dem Kulturmedium werden erfindungsgemäß keine Antibiotika, Fungistatika oder andere Hilfsstoffe zugesetzt. Es hat sich gezeigt, dass nur die autologe oder allogene Kultivierung der Zellen und Zellaggregate sowie die Kultivierung ohne Antibiotika und Fungistatika eine unbeeinflußte Proliferation sowie Differenzierung der Zellen in der Monolayerkultur und eine ungestörte Bildung der spezifischen Matrix in den Zellaggregaten ermöglicht. Weiterhin sind durch den Verzicht von Zusatzstoffen während der Herstellung nach Einbringen des in vitro hergestellten Gewebes in den menschlichen und auch tierischen Organismus immunologische Reaktionen ausgeschlossen.the Culture medium according to the invention no antibiotics, fungistatics or other adjuvants added. It has been shown that only the Autologous or allogeneic cultivation of cells and cell aggregates as well as the cultivation without antibiotics and Fungistatika an uninfluenced proliferation as well as differentiation of the cells in the Monolayerkultur and a undisturbed Formation of the specific matrix in the cell aggregates allows. Furthermore, by eliminating additives during the Production after introduction of the tissue produced in vitro the human and animal organism immunological reactions excluded.

Die Größe der hergestellten Bandscheibengewebe hängt von der eingebrachten Zellzahl pro Volumen Kulturmedium ab. Werden beispielsweise 1 × 107 Zellen in 300 μl Kulturmedium eingebracht, so entstehen innerhalb von 1 Woche dreidimensionale Bandscheibenzellaggregate von ca. 500–700 μm Durchmesser. Die andere Möglichkeit ist die in vitro-Fusion der kleinen Zellaggregate zu größeren – wie oben beschrieben – und das Einbringen dieser in die Bandscheibe. Vorzugsweise werden erfindungsgemäß zwischen 1 x 104 und 1 × 107 Zellen in 300 μl Kulturmedium zur Herstellung der kleinen Zellaggregate verwendet, besonders bevorzugt 1 x 105 Zellen. Die nach einigen Tagen gebildeten in vitro Bandscheibengewebe werden dann für mindestens 2–4 Wochen in Abhängigkeit von der Zellart und den patientenspezifischen Charakteristika in dem geeigneten Kulturmedium kultiviert, um die Ausbildung der gewebespezifischen Matrix zu induzieren. Im besonderen Falle können dann einzelne in vitro Bandscheibengewebe ab ca. einer Woche Kultivierung fusioniert werden, um die Größe des Gewebestückes zu erhöhen.The size of the disc tissue produced depends on the number of cells introduced per volume of culture medium. If, for example, 1 × 10 7 cells are introduced into 300 μl of culture medium, three-dimensional intervertebral disc aggregates of approximately 500-700 μm in diameter are produced within 1 week. The other possibility is the in vitro fusion of the small cell aggregates to larger - as described above - and the introduction of these into the intervertebral disc. Preferably, according to the invention, between 1 × 10 4 and 1 × 10 7 cells are used in 300 μl of culture medium for the preparation of the small cell aggregates, particularly preferably 1 × 10 5 cells. The in vitro disc tissue formed after a few days is then cultured for at least 2-4 weeks depending on cell type and patient-specific characteristics in the appropriate culture medium to induce tissue-specific matrix formation. In particular cases, individual in vitro disc tissue can be fused from about a week of culture to increase the size of the tissue piece.

Als Zellkulturgefäße kommen für die erfindungsgemäße Kultivierung in Suspension bevorzugt solche mit hydrophober, also adhäsionsverhindernder Oberfläche, in Betracht, wie z. B. Polystyrol oder Teflon. Zellkulturgefäße mit nichthydrophober Oberfläche können durch Beschichten mit Agar oder Agarose hydrophobiert werden. Weitere Zusätze sind nicht erforderlich. Vorzugsweise dienen als Zellkulturgefäße Napfplatten. Dabei können für die Herstellung der kleinen Zellaggregate beispielsweise 96-Napfplatten und für die Herstellung der fusionierten Aggregate 24-Napfplatten Verwendung finden.When Cell culture vessels come for the cultivation according to the invention in suspension, preference is given to those having hydrophobic, ie adhesion-preventing Surface, into consideration, such. As polystyrene or Teflon. Cell culture vessels with nichthydrophober surface can be rendered hydrophobic by coating with agar or agarose. Further additions are not required. Preferably, cell plates serve as cell culture vessels. It can for the Production of the small cell aggregates, for example 96-well plates and for the preparation of the fused aggregates 24-well plates use Find.

Gegenstand der Erfindung sind auch therapeutische Zubereitungen, die die erfindungsgemäßen Bandscheibenzelltransplantate und das Bandscheibenknorpelgewebe umfassen, z.B. Injektionslösungen.object The invention also relates to therapeutic preparations comprising the intervertebral disc cell transplants according to the invention and the disc cartilage tissue, e.g. Injectables.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Bandscheibenknorpelgewebe zur Testung von Wirkstoffen, die z. B. die Bildung und Differenzierung von Matrix und Zellen beeinflussen. Dazu werden die Bandscheibenzellaggregate erfindungsgemäß hergestellt und in unterschiedlichen Reifestadien werden die zu testenden Medikamente hinzugegeben und unterschiedlichste Parameter der in vitro Bandscheibengewebeherstellung und -reifung charakterisiert. Diese Tests sind im Vergleich zu den herkömmlichen Medikamententests an Tieren oder Tumorzellsystemen durch die Verwendung von nur autologem Material patientenspezifisch und ermöglichen eine individuelle Diagnose.object The invention also relates to the use of the intervertebral disc cartilage tissue according to the invention for testing of active ingredients, the z. B. the formation and differentiation of matrix and cells influence. These are the disc cell units produced according to the invention and in different stages of maturity are the drugs to be tested added and various parameters of in vitro disc tissue production and maturation characterizes. These tests are compared to the usual Drug testing on animals or tumor cell systems by use of only autologous material patient specific and allow an individual diagnosis.

Nachfolgend soll die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erklärt werden, ohne sie darauf einzuschränken.following the invention is intended to exemplary embodiments be explained in more detail without restricting it.

Ausführungsbeispieleembodiments

Beispiel 1: Herstellung von BandscheibenzelltransplantatenExample 1: Preparation of disc cell transplants

Aus dem erkrankten Bandscheibengewebe werden mittels enzymatischen Verdaus durch Inkubation mit Kollagenaselösung die Bandscheibenknorpelzellen aus dem Anulus Fibrosus und Nucleus Pulposus isoliert. Nach Trennung der isolierten Zellen vom unverdauten Gewebe, werden diese als Gemischzellpopulationen in Zellkulturflaschen überführt und unter Zugabe von DMEM/ Hams F12 Kulturmedium (1/1) und 10% autologem Serum des Patienten bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Zweimal wöchentlich wird ein Mediumwechsel durchgeführt. Nach Erreichen des konfluenten Stadiums wird die Zellayer mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und mittels Trypsin von der Zellkulturoberfläche geerntet. Nach einer weiteren Waschung werden die Bandscheibenzellen in physiologische Kochsalzlösung überführt und zur Transplantation zur Verfügung gestellt.From the diseased disc tissue, the disc nucleus cells from the annulus fibrosus and nucleus pulposus are isolated by enzymatic digestion by incubation with collagenase solution. After separation of the isolated cells from the undigested tissue, they are transferred as a mixture cell populations in cell culture flasks and incubated with the addition of DMEM / Hams F12 culture medium (1/1) and 10% autologous serum of the patient at 37 ° C and 5% CO 2 . Twice weekly, a medium change is performed. After reaching the confluent stage, the cell layer is washed with physiological saline and harvested by trypsin from the cell culture surface. After another wash, the intervertebral disc cells are transferred to physiological saline and provided for transplantation.

In einem in vitro Model konnte das Differenzierungspotential der im Zelltransplantat enthaltenen Bandscheibenzellen aufgezeigt werden. Es werden bandscheibenspezifische Matrixproteine und Markerproteine exprimiert (3) und damit eine bandscheibenspezifische Gewebestruktur aufgebaut.In an in vitro model, the differentiation potential of the intervertebral disc cells contained in the cell transplant could be demonstrated. Ribbon-specific matrix proteins and marker proteins are expressed ( 3 ) and thus a disc-specific tissue structure.

Beispiel 2: Transplantation von BandscheibenknorpelzellenExample 2: Transplantation of intervertebral cartilage cells

Die in Beispiel 1 hergestellten Bandscheibenzelltransplantate (mind. 1.000 Zellen, max. 100 Millionen Zellen) vorzugsweise ca. 1 Million Bandscheibenknorpelzellen wurden in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen und in die erkrankte Bandscheibe eingespritzt. Es wurde unter anderem festgestellt, dass in der behandelten Bandscheibe der Wassergehalt wieder ansteigt, sowie die Höhe des Zwischenwirbelraumes aufrechterhalten werden kann, was beides auf die durch die Bandscheibenknorpelzellen synthetisierten Matrixproteine zurückzuführen ist.The in Example 1 produced disc cell transplants (min. 1,000 cells, max. 100 million cells), preferably about 1 million Disc cartilage cells were taken up in physiological saline and injected into the diseased disc. It was found, among other things, that in the treated disc the water content increases again, as well as the height of the Intervertebral space can be maintained, both on the matrix proteins synthesized by the intervertebral disc cartilage cells is due.

Die erfindungsgemäße in vitro hergestellte Bandscheibenzelltransplantate werden von den Patienten angenommen, gewährleisten eine schnelle Integration der proliferationsfähigen und migrationsfähigen Zellen sowie eine Regeneration des Bandscheibengewebes durch die Differenzierungsfähigkeit der enthaltenen Zellen. Somit erlauben die Bandscheibenzelltransplantate den schnellen Wiederaufbau von Bandscheibengewebe, eine schnelle Genesung der Patienten und die Wiederherstellung der Bandscheibenfunktion.The in vitro according to the invention produced disc cell transplants are from patients Assumed, ensure a rapid integration of proliferation-capable and migratory cells and a regeneration of the disc tissue by the differentiation ability the contained cells. Thus, the intervertebral disc cell transplants allow the rapid reconstruction of disc tissue, a fast Recovery of patients and restoration of disc function.

Beispiel 3: in vitro Herstellung von BandscheibenknorpelgewebeExample 3: in vitro production of disc cartilage tissue

Aus dem vorgefallenen Bandscheibengewebe werden mittels enzymatischen Verdaus durch Inkubation mit Kollagenaselösung die Bandscheibenknorpelzellen aus dem Anulus Fibrosus und Nucleus Pulposus isoliert. Nach Trennung der isolierten Zellen vom unverdauten Gewebe, werden diese als Gemischkultur in Zellkulturflaschen überführt und unter Zugabe von DMEM/Hams F12 Kulturmedium (1/1) und 10% autologem Serum des Patienten bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Zweimal wöchentlich wird ein Mediumwechsel durchgeführt. Nach Erreichen des konfluenten Stadiums wird die Zellayer mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und mittels Trypsin von der Zellkulturoberfläche geerntet. Nach einer weiteren Waschung werden 1 × 105 Zellen in je ein Zellkulturgefäß überführt, das mit Agarose beschichtet ist. Nach einem Tag haben sich die ersten Zellen in Aggegaten angeordnet. Diese Aggregate werden regelmäßig mit frischem Medium versorgt und für mindestens 2 Wochen kultiviert.By means of enzymatic digestion by incubation with collagenase solution, the intervertebral disc cartilage cells from the annulus fibrosus and nucleus pulposus are isolated from the prolapsed disc tissue. After separation of the isolated cells from the undigested tissue, they are transferred as a mixture culture in cell culture flasks and incubated with the addition of DMEM / Ham's F12 culture medium (1/1) and 10% autologous serum of the patient at 37 ° C and 5% CO 2 . Twice weekly, a medium change is performed. After reaching the confluent stage, the cell layer is washed with physiological saline and harvested by trypsin from the cell culture surface. After another wash, 1 × 10 5 cells are transferred into each cell culture vessel which is coated with agarose. After a day, the first cells have settled in Aggegaten. These aggregates are regularly supplied with fresh medium and cultured for at least 2 weeks.

Den Aufbau der erhaltenen Bandscheibenknorpelgewebe verdeutlicht die mikroskopische Aufnahme in 1, die den Querschnitt eines erfindungsgemäß hergestellten Bandscheibengewebes mit M als Zone verminderter Proliferation und Bildung von gewebespezifischen Matrixproteinen und P als äußere Proliferationszone zeigt.The structure of the preserved disc cartilage tissue is illustrated by the micrograph in FIG 1 showing the cross-section of an intervertebral disc tissue produced according to the invention with M as zone of reduced proliferation and formation of tissue-specific matrix proteins and P as outer proliferation zone.

In diesen in vitro Bandscheibengeweben wurde die Expression und Deposition von bandscheibenspezifischen Matrixbestandteile und regulatorische Proteine wie Aggrecan (3a), hyalin-spezifische Proteoglykane (3b), Kollagen Typ I (3c), Kollagen Typ II (3d), Kollagen Typ III (3e) und 5100 (3f) nachgewiesen. Diese sind Bestandteile des nativen Bandscheibenknorpelgewebes in vivo und stellen die wichtigsten Strukturproteine dar, die für die Funktion des Bandscheibenknorpels von entscheidender Bedeutung sind.In these in vitro disc tissues, the expression and deposition of disc-specific matrix components and regulatory proteins such as aggrecan ( 3a ), hyaline-specific proteoglycans ( 3b ), Collagen type I ( 3c ), Collagen type II ( 3d ), Collagen type III ( 3e ) and 5100 ( 3f ). These are constituents of the native disc cartilage tissue in vivo and represent the most important structural proteins that are of crucial importance for the function of the disc cartilage.

Es war überraschend, dass die aus dem erkrankten Bandscheibengewebe isolierten Bandscheibenzellen, wenn diese als Gemisch aus Anulus Fibrosus und Nucleus Pulposus kultiviert werden, eine hohe Proliferationskapazität (2) sowie ein sehr hohes Differenzierungspotential zur Bildung bandscheibenspezifischer Matrixproteine und regulatorischer Proteine aufweisen und ihre Eigenschaften durch das Prozedere des Einfrierens und Auftauens erhalten werden können.It was surprising that the intervertebral disc cells isolated from the diseased intervertebral disc tissue, when they are cultivated as a mixture of annulus fibrosus and nucleus pulposus, have a high proliferation capacity ( 2 ) and a very high differentiation potential for the formation of intervertebral disc-specific matrix proteins and regulatory proteins and their properties can be obtained by the procedure of freezing and thawing.

Beispiel 4: Transplantation von BandscheibenknorpelgewebeExample 4: Transplantation of disc cartilage tissue

Das in Beispiel 3 hergestellte Bandscheibenknorpelgewebe (ca. 10 bis 1000 Gewebestückchen aus je 1·105 Zellen) vorzugsweise 100 Gewebestückchen wurden in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen und in den Zwischenwirbelraum von erkrankten oder geschädigten Bandscheiben eingespritzt. Das erfindungsgemäß in vitro hergestellte Bandscheibenknorpelgewebe wird von den Patienten angenommen und gewährleistet neben der Erfüllung der mechanischen Funktion des hergestellten Gewebes die schnelle Integration der hergestellten Gewebestücke durch die proliferationsfähigen und migrationsfähigen Zellen in der äußeren Schicht der Aggregate sowie eine Regeneration des Bandscheibengewebes durch die Differenzierungsfähigkeit der enthaltenen Zellen. Somit erlaubt die Struktur und Funktion der Gewebestücke den schnellen Wiederaufbau von Bandscheibengewebe, eine schnelle Genesung der Patienten und die Wiederherstellung der Bandscheibenfunktion.The disc cartilage tissue prepared in Example 3 (about 10 to 1000 tissue pieces preferably 1 × 10 5 cells), preferably 100 tissue pieces were taken up in physiological saline solution and injected into the intervertebral space of diseased or damaged intervertebral discs. The intervertebral cartilage tissue produced according to the invention in vitro is accepted by the patients and, in addition to fulfilling the mechanical function of the tissue produced, ensures rapid integration of the tissue pieces produced by the cells capable of proliferation and migration in the outer layer of the aggregates and regeneration of the intervertebral disc tissue by the ability to differentiate them cells. Thus, the structure and function of the tissue pieces allows for the rapid reconstruction of disc tissue, rapid recovery of patients, and restoration of disc function.

4 zeigt fünf fusionierende Bandscheibengewebe. Es ist zu sehen, dass die beiden Gewebekugeln aneinander haften und sozusagen verschmelzen, die Grenze zwischen den beiden Bandscheibengeweben ist nicht mehr zu erkennen. Nach längerer Kultivierungszeit fusionieren die Bandscheibengewebe vollständig und es entsteht ein größeres in vitro Gewebestück. Der Aufbau der so erhaltenen größeren Zellaggregate ist mit dem der zunächst erhaltenen in vitro Bandscheibengewebe identisch. Sie können bis zu maximal 99% ECM beinhalten und die im erhaltenen Gewebestück enthaltenen Zellen sind vital. 4 shows five fusion disc tissues. It can be seen that the two tissue spheres adhere to each other and merge, so to speak, the border between the two intervertebral disc tissues is no longer recognizable. After prolonged culture time, the intervertebral disc tissue completely fuses and a larger in vitro tissue piece is formed. The structure of the larger cell aggregates thus obtained is identical to that of the initially obtained in vitro disc tissue. They can contain up to a maximum of 99% ECM and the cells contained in the tissue piece obtained are vital.

Claims (23)

Verwendung von degeneriertem Bandscheibengewebe zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Behandlung von Bandscheibendefekten.Use of degenerated disc tissue for the preparation of a therapeutic agent for the treatment of Disc defects. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das degenerierte Bandscheibengewebe vorgefallenes degeneriertes Gewebe ist.Use according to claim 1, characterized that the degenerated disc tissue has precipitated degenerate Tissue is. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das isolierte Bandscheibengewebe, insbesondere Bandscheibenzellen, unter autologen Kultivierungsbedingungen nur unter Zusatz von patienteneigenem Serum im Zellkulturmedium vermehrt werden.Use according to claim 2, characterized that the isolated disc tissue, in particular disc nucleus cells, under autologous cultivation conditions only with the addition of the patient's own Serum be propagated in the cell culture medium. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierten Bandscheibenzellen während der Vermehrung in einem Zellkulturmedium, das 1–20% autologen Serumzusatz enthält und dessen Verhältnis von aplha-MEM-Medium und HAM-F12-Medizum zwischen 1:1 beträgt, und bei 36.8–37°C, 5% Kohlendioxid Luftanteil und einer Luftfeuchte von 85–95% kultiviert sind und dadurch ihre Synthese von Matrixproteinen und Markerproteinen nicht verändern.Use according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the isolated intervertebral disc cells during the Propagation in a cell culture medium containing 1-20% autologous serum supplement contains and its relationship of aplha-MEM medium and HAM-F12 medicine is between 1: 1, and at 36.8-37 ° C, 5% carbon dioxide air content and a humidity of 85-95% cultured and thereby their synthesis of matrix proteins and Do not alter marker proteins. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierten Bandscheibenzellen nach ihrer Vermehrung in Monolayer in einem Zellkulturmedium, das 1–20% autologen Serumzusatz enthält und dessen Verhältnis von aplha-MEM-Medium und HAM-F12-Medizum zwischen 1:1 beträgt, und bei 36.8–37°C, 5% Kohlendioxid Luftanteil und einer Luftfeuchte von 85–95% kultiviert und dadurch differenzierungsfähig sind und Matrixstrukturen bilden, die spezifische Bandscheibenmatrixproteine umfassen.Use according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the isolated intervertebral disc cells according to their Multiplication in monolayer in a cell culture medium containing 1-20% autologous Serum supplement contains and its relationship of aplha-MEM medium and HAM-F12 medicine is between 1: 1, and at 36.8-37 ° C, 5% carbon dioxide Air content and a humidity of 85-95% cultivated and thereby differentiation capable are and matrix structures that form specific disc matrix proteins include. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die kultivierten Zellen aus eingefrorenem Material gewonnen werden.Use according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the cultured cells are frozen material be won. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierten Bandscheibenzellen nach deren Vermehrung in Monolayer in einer Lösung aus 10 % DMSO, 20 % Serum und 70 % Kulturmedium eingefroren und wieder aufgetaut werden können und so deren Eigenschaften im Hinblick auf die Synthese von spezifischen Matrixkomponenten und Markern nicht zu verändern.Use according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the isolated intervertebral disc cells according to their Propagation in monolayer in a solution of 10% DMSO, 20% serum and 70% culture medium can be frozen and thawed again and so their properties with regard to the synthesis of specific Matrix components and markers not to change. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierten Bandscheibenzellen nach deren Vermehrung in Monolayer die isolierten Bandscheibenzellen nach deren Vermehrung in Monolayer in einer Lösung aus 10 % DMSO, 20 % Serum und 70 % Kulturmedium eingefroren und wieder aufgetaut werden und so deren Eigenschaften im Hinblick auf die Synthese von spezifischen Matrixkomponenten und Markern nicht verändern und dass die Bandscheibenzellen nach dem Einfrieren und folgendem Auftauen Gewebestrukturen aufbauen, die aus Bandscheiben-spezifischen Matrixproteinen bestehen.Use according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the isolated intervertebral disc cells according to their Multiplication in monolayer the isolated intervertebral disc cells after their Propagation in monolayer in a solution of 10% DMSO, 20% serum and 70% culture medium is frozen and thawed again and so their properties with regard to the synthesis of specific matrix components and do not change markers and that the intervertebral disc cells after freezing and following Thaw tissue structures that build up from disc-specific Matrix proteins exist. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dass die isolierten, spezifisch vermehrten und ggf. spezifisch eingefrorenen und aufgetauten Bandscheibenzellen nach deren Transplantation im Körper eines Patienten Bandscheibengewebe in vitro aufbauen.Use according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the isolated, specifically propagated and possibly specific frozen and thawed intervertebral disc cells their transplant in the body of a patient build up intervertebral disc tissue in vitro. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die aus dem Bandscheibengewebe isolierten Zellen in einem Kulturgefäß mit hydrophober Oberfläche und sich verjüngendem Boden kultiviert und so dreidimensionale Zellaggregate erhalten werden.Use according to one of the preceding claims, characterized in that the cells isolated from the disc tissue in a culture vessel with hydrophobic surface and rejuvenating Cultivated soil and thus obtained three-dimensional cell aggregates become. Verfahren zur Herstellung von Bandscheibenzelltransplantaten, dadurch gekennzeichnet, dass aus vorgefallenem degeneriertem Bandscheibengewebe und/oder erkranktem Bandscheibengewebe, Bandscheibenzellen isoliert und unter Zusatz von körpereigenem Serum als dreidimensionalen Aggregate kultiviert und so Bandscheibenzelltransplantate erhalten werden.A process for the production of intervertebral disc cell transplants, characterized in that isolated from discarded degenerated disc tissue and / or diseased disc tissue, intervertebral disc cells and with the addition of autologous serum are cultivated as three-dimensional aggregates and so obtained intervertebral disc cell transplants. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Bandscheibengewebe nach kurzer Vorkultivierung eingefroren wird.Method according to the preceding claim, characterized characterized in that the disc tissue after a short Vorkultivierung is frozen. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bandscheibenknorpelzelltransplantate und in-vitro-Bandscheibenknorpelgewebe in Gegenwart von wachstumsfördernden Zusätzen kultiviert werden.Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the disc cartilage cell transplants and in vitro disc cartilage tissue in the presence of growth promoting additives be cultivated. Bandscheibengeweberegenerationsmittel erhältlich dadurch, dass aus degeneriertem Bandscheibengewebe Zellen isoliert, kultiviert, geerntet und als Bandscheibenregenerationsmittel verwendet werden.Disc tissue regeneration agent obtainable thereby, that cells isolated, cultured, from degenerated disc tissue, harvested and used as an intervertebral disc regenerant. Mittel nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen nach kurzer Vorkultivierung eingefroren werden.Means according to the preceding claim, characterized characterized in that the cells are frozen after a short pre-cultivation become. Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung im wesentlichen nur unter Zusatz von körpereigenem Serum erfolgt.Agent according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the cultivation is substantially only below Addition of endogenous Serum takes place. Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel ein durch Kultivierung der Zellen in Kulturgefäßen mit hydrophober Oberfläche und sich verjüngendem Boden gewonnenes dreidimensionales Gewebe ist.Agent according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the agent is a by culturing the cells in culture vessels with hydrophobic surface and rejuvenating Soil is obtained three-dimensional tissue. Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Gewebe miteinander fusioniert sind.Agent according to one of the preceding claims, characterized characterized in that a plurality of tissues are fused together. Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel ein Gemisch aus kultivierten Zellen und dem dreidimensionalem Gewebe ist.Agent according to one of the preceding claims, characterized in that the agent is a mixture of cultured cells and the three-dimensional tissue. Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass aus degeneriertem Bandscheibengewebe Zellen isoliert, kultiviert, geerntet und das Bandscheibenregenerationsmittel erhalten wird.Agent according to one of the preceding claims, characterized characterized in that degenerated disc tissue cells isolated, cultured, harvested and the intervertebral disc regenerant is obtained. Verwendung der Mittel nach einem der Ansprüche 15–20 zur Testung von Wirkstoffen.Use of the agents according to any one of claims 15-20 to Testing of active ingredients. Verwendung der Mittel nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel mit den Wirkstoffen in Kontakt gebracht und die Bildung und Differenzierung des Mittels im Vergleich zu einem Mittel, welches nicht mit den Wirkstoffen in Kontakt gebracht wird, bestimmt wird.Use of the means according to the preceding claim, characterized in that the agent in contact with the active ingredients brought and the formation and differentiation of the agent in comparison to an agent that has not been contacted with the active ingredients is determined. Zelltherapeutische Zubereitungen umfassend Bandscheibenregenerationsmittel gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20.Cell therapeutic preparations comprising disc regeneration agents according to one the claims 15 to 20.
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